влияние ионов са2+ на фосфолипидный состав, состояние и

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
"Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарёва"
На правах рукописи
СЮСИН ИЛЬЯ ВЛАДИМИРОВИЧ
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ СА2+ НА ФОСФОЛИПИДНЫЙ СОСТАВ,
СОСТОЯНИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ЭРИТРОЦИТОВ
Специальность 03.01.02 – Биофизика
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук
профессор Ревин В. В.
САРАНСК 2015
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
4
Глава 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
8
1.1 Химический состав и биофизические свойства биологических
мембран эритроцитов
8
1.2 Ионный состав эритроцитов и механизм регуляции ионного состава 17
1.3 Участие ионов Са2+ в регуляции биофизических свойств и состава
мембран эритроцитов
27
1.3.1. Локализация ионов Са2+ в клетке и их участие в процессах
функционирования клетки (в норме и при патологии)
28
1.3.2 Участие фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в
регуляции свободного и связного кальция в крови (эритроцитах)
36
1.4 Механизмы защиты клеток при действии повышенной концентрации
кальция
42
Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИСЛЛЕДОВАНИЯ
48
2.1 Объект исследования и постановка опыта
48
2.2 Методы исследования
48
2.2.1 Экстрагирование фосфолипидов из мембран эритроцитов
голубя
48
2.2.2 Экстрагирование полифосфоинозитидов из мембран
эритроцитов голубя
49
2.2.3 Тонкослойная хроматография фосфолипидов и
полифосфоинозитидов и их идентификация
2.2.4 Количественное определение ФЛ и ФИ
50
53
2.2.5 Исследование морфометрических характеристик эритроцитов
голубя с помощью лазерноого интерференционного микроскопа (ЛИМ)
55
2.2.6 Изучение состояния мембран эритроцитов голубя методом
спектроскопии комбинационного рассеяния
57
3
2.2.7 Изучение повреждений ДНК эритроцитов голубя при помощи
метода «ДНК-комет»
59
2.2.8 Определение внутриклеточной концентрации кальция с
помощью красителя Fura Red
62
2.3 Математическая и статистическая обработка результатов
64
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
65
3.1 Исследование изменений внутриклеточной концентрации Са2+ в
эритроцитах
65
3.2 Исследование фосфолипидного и фосфоинозитидного состава
мембран эритроцитов при действии повышенной концентрации ионов Са2+ 68
3.2.1 Исследование фосфолипидного состава мембран эритроцитов 68
3.2.2 Исследование содержания фосфоинозитидов и их метаболитов
в мембране эритроцитов при действии повышенной концентрации
ионов Са2+
76
3.2.3 Исследование свойств фосфолипидов с помощью спектроскопии
комбинационного рассеяния
79
3.3 Исследование морфологических характеристик эритроцитов и свойств
гемоглобина при действии повышенной концентрации ионов Са2+
83
3.3.1 Исследование морфологических характеристик эритроцитов с
помощью лазерной интерференционной микроскопии
83
3.3.2 Исследование свойств и распределения гемоглобина в
эритроцитах голубя при действии высокой концентрации ионов Са2+
89
3.4 Повреждение клеточного ядра эритроцитов голубя при действии
повышенной концентрации ионов Са2+
93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
100
ВЫВОДЫ
102
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
103
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
104
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Ионы Са2+ играют большую роль во многих
физиологических процессах, в том числе являются универсальными физиологическими агентами, влияющими на многочисленные свойства эритроцитов. Действие Са2+ проявляется на уровне целой клетки (Bruce J.I., Elliott A.C.
Oxidant-impaired intracellular Ca2+ signaling in pancreatic acinar cells: role of the
plasma membrane Ca2+-ATPase // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. Vol. 293. Iss.
3. P. 938-950; Zaidi A. Plasma membrane Ca2+-ATPases: Targets of oxidative
stress in brain aging and neurodegeneration // World J Biol Chem. 2010. Vol. 1.
Iss. 9. P. 271-280; Bogdanova A., Makhro A., Wangetal J. Calcium in Red Blood
Cells – A Perilous Balance // Int. J. Mol. Sci. 2013. Vol. 14. P. 9848-9872; Angka
L., Lee E.A., Rota S.G. [et al.] Glucopsychosine increases cytosolic calcium to induce calpain-mediated apoptosis of acute myeloid leukemia cells // Cancer Letters.
2014. Vol. 348. P. 29-37), влияют на состояние липидного бислоя клеточной
мембраны (Woon L.A., Holland J.W., Kable E.P. [et al.] Ca2+ sensitivity of phospholipid scrambling in human red cell ghosts // Cell Calcium. 1999. 25. P. 313–
320), на уровне мембраносвязных и отдельных ферментных систем (Carafoli
E., Santella L., Branca D., [et al.] Generation, control, and processing of cellular
calcium signals // Biochem. Mol. Biol. 2001. Vol. 36. P. 107– 260; Carafoli E.
Calcium signaling: a tale for all seasons // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002.
Vol. 99. P. 1115– 1122; Garcia C.S.N.B., Prota L.F.M., Morales M.M. [et al.] Understanding the mechanisms of lung mechanical stress // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2006. Vol. 39. P. 697-706). Имеются отдельные
сведения о влиянии ионов Са2+ на структуру эритроцита и гемоглобина (Folk
P., Strunecka A. Calcium affect phosphoinositide turnover in human erythrocytes //
Gen. Physiol. Biophys. 1990. Vol. 9. P. 281-290). Увеличение внутриклеточного
содержания кальция может привести к угнетению активности флипазы и
5
случайному перераспределению фосфолипидов мембран (Костин Д.Г., Козлова Н.М., Слобожанина Е.И. Изменение асимметрии липидов и транспорта
коньюгатов глутатиона в эритроцитах человека под влиянием ионов кальция
// Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 4. С. 685-692). Вследствие этого может происходить нарушение работы клетки и изменение свойств, таких как деформируемость и вязкость мембран. В литературе отмечается участие ионов Са2+
в реализации клеточной гибели (McConkey D.J., Orrenius S. Signal
Transduction Pathways in Apoptosis // Stem Cells. 1996. Vol. 14. Iss. 6. P. 619–
631). Повышение концентрации ионов Са2+ в клетке вызывает не только активацию Са-зависимых ферментов, но и увеличение уровня активных форм
кислорода (АФК) (Voccoli V., Tonazzini I., Signore G., [et al.] Role of extracellular calcium and mitochondrial oxygen species in psychosine-induced oligodendrocyte cell death // Cell Death and Disease. 2014. Vol. 5. P. 1-12).
В качестве защитного механизма от действия повышенных концентраций ионов Са2+ могут выступать вещества, способные связывать свободные
ионы Са2+ и тем самым переводить его в связанное состояние. К таким веществам можно отнести соединения фенольной природы. Флавоноиды могут
хелатировать ионы двух валентных металлов, в частности ионы Ca2+ (Roshal
A.D., Sakhno T.V., Verezubova A.A. Structure stability and spectral properties of
complexes of flavones with metal ions of group II // Functional materials. 2003.
Vol. 10. Iss. 3. P. 419-426).
Не смотря на огромное число работ, посвященных роли кальция, явно
недостаточно освещен вопрос о регуляции состояния гемоглобина, его кислородтранспортных функций, а так же механизма разрушения ядерных эритроцитов. Особый интерес представляет механизм участия липидов и их метаболитов в регуляции перечисленных процессов.
Одним из наиболее удобных объектов для исследования процессов,
происходящих с мембраной, является эритроцит. Особый интерес представляют эритроциты птиц, поскольку содержат ядра. Общность строения плазматических мембран клеток различных органов и тканей позволяет полагать,
6
что процессы, происходящие в эритроцитарной мембране, могут отражать
общие закономерности в мембранах других клеточных структур, вследствие
чего эритроциты представляют удачную модель плазматических мембран.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было
изучение роли Са2+ в регуляции морфологических и функциональных характеристик эритроцитов, и лежащих в их основе изменений в составе фосфолипидов, фосфоинозитидов и их метаболитов, а так же в процессе разрушения
клеточного ядра.
Задачи работы:
•
исследовать влияние ионов Са2+ на состав фосфолипидов и мета-
болизм фосфоинозитидов
•
исследовать физико-химические свойства и состояние мембран
эритроцитов при действии повышенных концентраций Са2+
•
изучить влияние ионов Са2+ на состояние ядра, гемоглобина и
морфологические характеристики эритроцитов.
Научная новизна. Впервые показано, что воздействие высоких концентраций кальция на эритроциты может реализовываться за счет изменения
состава и состояния мембран, морфологических характеристик клетки и разрушения ядра. Показано, что увеличение концентрации кальция приводит к
количественным изменениям в фосфолипидной части мембран эритроцитов.
При увеличении концентрации ионов Са2+ происходит перераспределение молекул гемоглобина в клетке.
Показано, что флавоноиды способны препятствовать процессам, которые инициируются увеличением содержания ионов Са2+.
Практическая значимость. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в медицинской диагностике для обнаружения патологических процессов при солевом стрессе. А также могут быть полезны для
практической спортивной медицины в плане сохранения функциональной
активности гемоглобина эритроцитов при использовании веществ натуральных соединений фенольной природы.
7
Структура и объем диссертации. Материалы диссертационной работы изложены на 122 страницах машинописного текста. Диссертация состоит
из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их
обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Диссертация включает 24 рисунка и 1 таблицу. Список цитируемой литературы
включает 186 источник, в том числе 127 на иностранных языках.
Благодарности. Выражаю особую благодарность и признательность
научному руководителю доктору биологических наук, профессору Ревину Виктору Васильевичу за помощь и внимание в подготовке диссертации, кандидату
биологических наук Громовой Наталье Васильевне и всему коллективу кафедры
биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарёва за поддержку при выполнении диссертационного
исследования.
8
Глава 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1.1 Химический состав и биофизические свойства биологических
мембран эритроцитов
Все клеточные структуры окружены со всех сторон биомембранами,
которые придают клеткам пространственную идентичность и определяют
границу между внутри- и внеклеточным пространством. Эти мембраны в основном состоят из белков и липидов (Demchenko A.P. Modern views on the
structure and dynamics of biological membranes // Biopolimers and cell. 2012.
Vol. 28. Iss. 1. Р. 24-38).
Существует множество моделей биологических мембран, но одной из
наиболее ранних моделей является модель предложенная Даниелли и Давсоном в 1935 году. Они предложили «бутербродную» модель строения биологических мембран. Исходя из этой модели на поверхности липидного бислоя
располагаются белки (Danielli J.F. А сontribution to the theory of permeability
of thin films // J. Cell Comp. Physiol. 1935. Vol. 5. Р. 495-508). Такая модель
успешно существовала на протяжении 40 лет. Однако, в 1972 г. Сингер и Николсон свели воедино все предложенные идеи и в 70-х годах предложили
жидкостно-мозаичную модель. Из этой модели следует, что мембрана представляет собой текучий фосфолипидный бислой, в котором находятся свободно диффундирующие белки, образующие в нем своего рода мозаику (рисунок 1.1). Данная модель так же подверглась изменениям, в частности, было
показано, что не все мембранные белки свободно диффундируют в жидком
липидном бислое (Singer S.J. The fluid mosaic model of the structure of cell
membrane // Science. 1972. Vol. 175. Р. 720-731). Существует мнение, что некоторые участки мембран отличаются по своей структуре от классического
липидного бислоя. Тем не менее, эта модель легла в основу современных
представлений о строении биологических мембран (Kobayashi T. Lipid, lipid
9
domains and lipid-protein interactions in endocytic membrane traffic // Seminars in
cell & developmental biology. 1998. Vol. 9. Iss. 5. Р. 517-526).
Рисунок 1.1 – Структурная схема биологической мембраны (Brown S.B. Biological Membranes / U.K.: The Biological Society. 1996. 49 P.)
Мембрана эритроцита является уникальной по своим физическим свойствам, так как она может противостоять напряжению, которое могло бы
разорвать большинство клеток друг от друга (Svetina S. The cooperative role of
membrane skeleton and bilayer in the mechanical behavior of red blood cells // Bioelectrochem. 2004. Vol. 62. Р. 107-113), однако, мембрана эритроцита соответствуем основным принципам жидкокристаллической модели мембран.
Толщина плазматической мембраны эритроцита составляет около 6 нм.
Таким образом, мембрана эритроцита является очень тонкой структурой по
сравнению с типичными размерами клетки (Чизмадзе Ю.А. Мембранная
биология: от липидных слоев до молекулярных машин // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. Вып. 8. С. 12-17). Мембрана эритроцита состоит из нескольких слоев. Наружный слой содержит в своем составе комплексы концевых отделов антигенов и образован этот слой гликопротеинами.
10
Следующие два слоя состоят из липидов и представляют тем самым классическую мембрану. Четвертый слой, обращенный в цитоплазму, состоит из
белков, которые связывают молекулы гликолитических ферментов и гемоглобин. Фосфолипиды, которые составляют структуру средних двух слоев,
оказывают большое влияние на состояние и функции мембраны и эритроцита
в целом. Мембрана эритроцитов проницаема для катионов – Н+, различных
анионов (ОН-, Сl- и др.). Однако, она трудно проницаема для ионов калия и
натрия, мочевины, глюкозы, а также через нее не возможно пройти белкам
(Ноздрачев А.Д. Начало физиологии / СПб.: Изд. Лань. 2001. 1088 с.)
Как уже было отмечено выше, одним из основных компонентов мембраны являются фосфолипиды. Фосфолипиды принимают активное участие в
поддержание конформации мембранных белков. Мембрана эритроцитов млекопитающих представлена следующими фосфолипидами: фосфотидилхолин
(ФХ) – 23%, сфингомиелин (СМ) – 18%, фосфатидилэтаноламин (ФЭА) –
20%, фосфатидилсерин (ФС) – 8%, также в мембране эритроцитов локализованы
незначительные
компоненты,
такие
как
фосфатидилинозтол-
монофотфат (PI), фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (РIP2), фосфатидная
кислота (ФК), лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭА). В состав липидного
бислоя мембраны входит холестерол, его количество составляет около 30%,
увеличение доли данного компонента мембран приводит к повышению вязкости мембраны, тем самым понижая текучесть и эластичность мембраны.
Около 10% мембраны составляют гликолипиды (Li H., Lykotrafitis G. Erythrocyte Membrane Model with Explicit Description of the Lipid Bilayer and the Spectrin Network // Biophysical Journal. 2014. Vol. 107. Iss. 3. P. 642-653). При физиологическом значении рН большинство содержащихся липидов электрически нейтрально, однако, в мембране так же присутствуют и заряженные липиды – ФС, ФК, ФИ. Эти фосфолипиды заряжены отрицательно. За исключением лизофосфолипидов и СМ.
Все фосфолипиды в своем составе имеют две цепи жирных кислот присоединенных к остатку глицерина. В основном состав жирных кислот мем-
11
бран эритроцитов человека содержит такие кислоты как 16:0, 18:0, 18:1, 18:2
и 20:4. Известно, что остатки сахаров присутствующие в составе гликолипидов несут ответственность за многочисленные функции, в том числе за адгезию клеток. Это объясняется тем, что гликолипиды в основном расположены
на внешней стороне мембраны. Во всех мембранах эукариотических клеток
липиды расположены асимметрично. Такое распределение мембранных фосфолипидов обуславливает важные структурную и функциональную роль
мембранных липидов. ФС и ФЭА в основном расположены на внутренней
поверхности биологической мембраны. Перемещение ФС в наружный слой
мембраны приводит к негативным последствиям для клетки (Chaurio R.A.
Phospholipids: Key Players in Apoptosis and Immune Regulation // Molecules.
2009. Vol. 14. P. 4892-4914).
Деформируемость эритроцитов – одно из наиболее важных свойств
этих клеток. Форма эритроцитов в конечном итоге определяется мембранными белками, особенно спектрином, а также зависит и от содержания липидов
в плазматической мембране. Эритроциты могут поддерживать свою форму,
но проходя через узкие капилляры они перестраивают свой скелет, а затем
снова восстанавливают его. Липиды имеют решающее значение в поддержании формы эритроцита. (Pasini E.M., Kirkegaard M., Mortensen P. [et al.] Indepth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells // Blood.
2006. Vol. 108. Р. 791-801).
Липиды, входящие в состав мембраны, образовывают специальные
мембранные домены. Полярные группы этих доменов взаимодействуют с водой и другими полярными группами, что приводит к стабильности в водной
среде. Липиды в доменах как правило обогащены насыщенными углеводородными цепями (Simons K., Sampaio J.J. Membrane Organization and Lipid
Rafts // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011. Vol. 3. Iss. 10. P. 1-17). Размеры
липидных доменов ниже предела разрешения светового микроскопа и могут
бы зарегистрированы с помощью электронной микроскопии (Pike J.L. Lipid
rafts: bringing order to chaos // Journal of Lipid Research. 2003. Vol. 44. P. 655-
12
667). Данные структуры обладают высоким уровнем организации и обогащены холестерином и гликосфинголипидами с насышенными жирнокислотными остатками (Han B.G., Nunomura W., Takakuwa Y. [et al.] Protein 4.1R core
domain structure and insights into regulation of cytoskeletal organization // Natural
Structural Biology. 2000. Vol. 7. Iss. 10. P. 871-875). В структуру доменов входят белки. Основными мембранными белками в их составе являются стомацин, flotillin-1 и flotillin-2, белки группы 4.1 и 4.2 могут быть частично связанны с мембранными доменами (Pike J.L. Lipid rafts: bringing order to chaos //
Journal of Lipid Research. 2003. Vol. 44. P. 655-667; Salzer U., Prohaska R. Stomatin, flotillin-1 and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts
// Blood. 2001. Vol. 97. Iss. 4. P. 1141-1143).
Липидные домены играют специфическую роль в сигнализации клеток.
В последние годы было показано, что эти домены играют важную роль в регуляции паразитных иинфекций, например, таких как малярийная инфекция
(Samuel B.U., Mohandas N., Harrison T. [et al.] The role of cholesterol and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins of erythrocyte rafts in regulating raft
protein content and malaria infection // The Journal of Biological Chemistry. 2001.
Vol. 276. Iss. 31. P. 29319-29329; Murphy C.S., Hiller L.N., Harrison T. [et al.]
Lipid rafts and malaria parasite infection of erythrocytes // Molecular Membrane
Biology. 2006. Vol. 23. Iss. 1. P. 81-88).
Одним из важных свойств мембраны является её текучесть. Текучесть
мембран зависит от свойств фосфолипидов, а именно таких как класс фосфолипидов, степень насыщенности жирных кислот, длина ацильных цепей, типа
холестерина (свободный или связный), а также от наличия или отсутствия
амфипатичных соединений (Халилов Э.М., Ли В.С., Азизова О.А. [и др.]
Структурно-функциональный анализ мембран эритроцитов с различным содержанием холестерина // Вопр. мед. химии. 1982. Т. 28. Вып. 1. С. 81-86; Ли
В.С., Халилов Э.М., Сабуров В.И. [и др.] Липидный состав и структурнофункциональные свойства мембран эритроцитов разного возраста // Вопр.
мед. химии. 1982. Т. 28. Вып. 6. С. 66-71; Горшинская И.А., Глотина Л.Ю.,
13
Горло Е.И. [и др.] Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных // Вопр. мед. химии. 1999. Т. 45. Вып.
1. С. 53-57; Бордюшков Ю.Н., Горошинская И.А., Франциянц Е.М. [и др.]
Структурно-функциональные изменения мембран лимфоцитов и эритроцитов
под воздействием переменного магнитного поля //Вопр. мед. химии. 2000. Т.
46. Вып. 1. С. 72-80). Например, увеличение коэффициента насыщенности
жирных кислот ведет к нарушению упаковки липидного бислоя, тем самым,
повышая его текучесть. Состав жирных кислот в мембране эритроцитов млекопитающих имеет огромное влияние на клеточную агрегацию.
По мимо липидов в состав мембраны входят белки. Белки плазматической мембраны можно разделить на два вида:
1) белки, которые можно легко отделить от плазматической мембраны,
так называемые периферические белки, например спектрин;
2) вторую группу белков представляет белки полосы 3 (Кленова Н.А.,
Кленов Р.О. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии / Самара.: Изд-во Самарский университет.
2009. 116 с.). Их трудно отделить от мембраны, так как они пронизывают
мембрану насквозь. Данный класс белков называется – интегральными.
Кроме представленной классификации, белки также можно разделить
по функциональности: 1) белки цитоскелета; 2) интегральные структурные
белки; 3) закрепленные белки (Гринштейн С.В., Кост О.А. Структурнофункциональные особености мембранных белков // Успехи биологической
химии. 2001. Т. 41. С. 77-104; Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии / Самара.: Изд-во Самарский университет. 2009. 116 с.).
Как было сказано выше, белок полосы 3 – это интегральный белок, который представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 90-100 кДа.
В мембране этот белок образует анионный канал, по которому происходит
избавление эритроцита от СО2, и обогащение эритроцита Cl-. Полипептидная
цепь данного белка пронизывает мембрану несколько раз. N-конец белка свя-
14
зан с гликолитическими ферментами, гемоглобином, актином. Белок полосы
3, также как и спектрин, имеет олигомерную структуру, которая дает возможность связываться с другими белками. 70% белка полосы 3 в мембране
эритроцитов является димером, около 30% – тетрамером. Тетрамерная форма
белка в основном связывает белок 4.2 (Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. [и др.]
Молекулярная биология клетки / М.: Мир, 1994. 538 с.; Saldanha C., Silva
A.S., Gonçalves S. [et al.] Modulation of erythrocyte hemorheological properties
by band 3 phosphorylation and dephosphorylation // Clinical Hemorheology and
Microcirculation. 2007. Vol. 36. P. 183-194).
Одним из представителей интегральных белков можно считать гликофорины. Данные белки имеют отрицательный заряд, который в основном сосредоточен на сиаловых остатках, присущих гликофорину А. Отрицательный
заряд играет решающее значение в реализации взаимодействия эритроцитэритроцит и в взаимодействии эритроцита с сосудами (Telen M.J. Erythrocyte
adhesion receptors: blood group antigens and related molecules // Transfusion
Medicine Reviews. 2005. Vol. 19. Iss. 1. P. 32-44).
Важную роль в эритроцитарных мембранах играют белки цитоскелета.
Белки цитоскелета прикрепляются к мембране посредством белок-белковых
взаимодействий. Основные мембранные белки, которые отвечают за прикрепление цитоскелета к мембране, это белок полосы 3 и гликофорин С и D.
Важно отметить, что не только белок-белковые взаимодействия влияют на
связывание цитоскелета с мембранным слоем. Определнный влад вносят и
белок-липидные взаимодействия, например, спектрин-липидные взаимодействия в основном с ФЭА (Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение, метаболизм и
функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии / Самара.: Изд-во Самарский университет. 2009. 116 c.).
Мембранный цитоскелет выполняет важную функцию в эритроцитах.
Он поддерживает форму эритроцита и обладает способностью к обратимой
деформации. На деформируемость эритроцита оказывает влияние и фосфолипидный бислой, который обеспечивает мембрану гибкостью (Есауленко
15
Е.Е., Бачко С.С., Ладутько А.А. [и др.] Сравнительная биохимическая характеристика липидного спектра мембран эритроцитов при различных видах
токсического поражения печени // Медицинские науки. Фундаментальные
исследования. 2011. Вып. 7. С. 54-56). Деформируемость эритроцитов связана с качественными изменениями происходящими с гемоглобином (Карабанов Г.Н. Деформируемость эритроцитов // Анестезиология реаниматология.
1984. №1. С. 71-73). Эти изменения зависят от уровня активности АТФ-аз.
При недостаточном количестве АТФ меняется форма клетки, снижается деформируемость и увеличивается проницаемость мембраны для ионов (Мельников А.А., Викулов А.Д., Осетров И.А. Активность Na,K-АТФазы эритроцитов у физически активных лиц // Физиология человека. 2001. Т. 27. № 3. С.
129-132; Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты // Успехи физиологических наук. 2001. Т. 32. №3. С. 66-78).
Деформируемость эритроцитов так же зависит от уровня кальция в
эритроцитах. При увеличение внутриклеточной концентрации кальция эритроцит меняет свою форму на эхиноцит (Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение,
метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и
патологии / Самара.: Изд-во Самарский университет. 2009. 116 c.).
Эритроцитарная мембрана выполнят большой комплекс сложных задач
для поддержания нормальной физиологии. Состояние мембраны обуславливается протеканием различных биохимических реакций. При каких-либо
нарушениях, происходящих в организме, эритроциты незамедлительно реагируют на данные изменения. В частности, при токсическом действии свинца
на эритроциты происходит увеличение внутриклеточной концентрации кальция, которое, в свою очередь, может вызывать изменение формы эритроцита,
изменение жесткости мембраны, гемолиз клетки и апоптоз эритроцитов
(Quintanar-Escorza M.A., Gonzalez-Martinez M.T., del Pilar I.Ma. [et al.] Oxidative damage increases intracellular free calcium [Ca2+]i concentration in human
erythrocytes incubated with lead // Toxicology in Vitro. 2010. Vol. 24. P. 13381346).
16
Стоит заметить, что мембрана эритроцита составляет всего 1% от веса
эритроцита, однако, при этом играет важную роль в жизнедеятельности клетки. Как уже было сказано выше, мембрана эритроцита отвечает за эластичность, прочность, деформацию эритроцита при прохождении через узкие капилляры.
Недавно были установлены несколько процессов, которые разрушают
эритроцитарную мембрану: 1) нехватка продуктов для обеспечения энергией
и развитие процессов свободнорадикального окисления; 2) действие на мембранные фосфолипиды фосфолипаз; 3) нарушение осмотического баланса,
которое приводит к увеличению объема клетки, тем самым к растяжению
мембраны (Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Ткаченко С.Б. [и др.] Эритроцит
при патологии: размышления у электронного микроскопа // Архив патологии.
2004. № 3. С. 53-61). Повышение активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клеточных мембранах приводит к перестройкам липидного бислоя мембраны. Свободнорадикальное окисление липидных и белковых молекул играет роль триггерного механизма, обеспечивающего доступность белково-липидных компонентов мембраны эритроцита для фосфолипаз
и протеаз. Нарушение энергетического обмена стимулирует свободнорадикальные процессы в клетке, а активация свободно-радикального окисления
приводит к повреждению мембраны и усугубляет дефицит энергии. Уменьшение содержания макроэргов в эритроцитах сопровождается накоплением в
клетках ионов Ca2+, активацией фосфолипаз, гидролизом части фосфолипидов, увеличением проницаемости мембраны. Наряду с активацией ПОЛ
накопление в эритроцитах ионов Ca2+ – вторичного мессенджера, переносящего сигнал от поверхности внутрь клетки, запускает совокупность процессов, к которым, в частности, относится активация Ca2+-зависимых фосфолипаз и протеаз, приводящих к нарушению структуры мембраны, метаболизма,
ионного гомеостаза клетки и в дальнейшем её формы и функции (Крыжановский Г.Н., Гольдберг Е.Д. Дизрегуляционная патология системы крови / М.:
МИА, 2009. 432 с.; Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. [и др.]
17
Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010.
№3 (73). С. 334-354).
1.2 Ионный состав эритроцитов и механизм регуляции ионного состава
В течение последних трех десятилетий электрофизиологические исследования показали, что на мембране эритроцитов локализовано большое разнообразие ионных каналов (Dyrda A., Cytlak U., Ciuraszkiewicz A. [et al.] Local membrane deformations activate Ca2+-dependent K+ and anionic currents in intact human red blood cells // Plos One. 2010. Vol. 5. Iss. 2. P. 1-14; Bouyer G.,
Egée S., Thomas S.L. Three types of spontaneously active anionic channels in malaria-infected human red blood cells // Blood Cells, Molecules, and Diseases. 2006.
Vol. 36. Iss. 2. P. 248–254). Эти каналы, в нормальных условиях, в основном
не активны, но есть литературные данные о том, что они играют ключевую
роль во многих заболеваниях, например серповидноклеточной анемии или
малярии (Thomas S.L.Y, Bouyer G., Cuef A. [et al.] Ion channels in human red
blood cell membrane: Actors or relics? // Blood Cells, Molecules, and Diseases.
2011. Vol. 46. P. 261-265).
Ионные каналы клеточной мембраны имеют огромное значение для
жизни клеток. Они обеспечивают обмен клетки с окружающей средой веществом, энергией и информацией, с них начинаются и ими поддерживаются
процессы возбуждения и торможения в нервной системе и мышцах, именно
они (вместе с другими молекулярными рецепторами) обеспечивают восприятие клеткой внешних сигналов. С помощью ионных каналов происходит передача в клетку управляющих сигналов из окружающей её среды. Именно
ионные каналы обеспечивают синаптическую передачу возбуждения от возбуждённого нейрона на другие клетки (Jentsch T.J., Stein V., Weinreich F. [et
al.] Molecular Structure and Physiological Function of Chloride Channels // Physiol. Rev. 2002. Vol. 82. P. 503–568). Обобщая, можно сказать, что почти все
18
важнейшие физиологические процессы в организме начинаются с ионных
каналов и поддерживаются ими.
Следуя определению, ионные каналы мембраны – это маленькие белковые трубочки разного диаметра, вставленные в клеточную мембрану, через
которые внутрь клетки или наружу могут перемещаться ионы (Зефиров А.Л.,
Ситдикова Г.Ф. Ионные каналы возбудимой клетки (структура, функция, патология) / Казань.: Арт-кафе, 2010. 270 с.).
На рисунке 1.2 показан участок мембраны клетки с встроенными в нее
ионными каналами.
Рисунок 1.2 – Участок мембраны клетки с встроенными в нее ионными
каналами
Плотность каналов значительно варьируется в разных живых клетках.
На один квадратный микрометр мембраны приходится от одного до двух тысяч ионных каналов. Ионный канал – это крупный белок, образующий центральную водную пору, которая сообщает наружную и внутреннюю среду
клетки. Канал имеет наружное устье, обращенное в сторону межклеточной
19
среды, и внутреннее, которое обращено в сторону цитоплазмы. Перемещение
ионов через ионные каналы приводит к изменению концентрации ионов
внутри и снаружи клетки, а также к изменению электрического потенциала
мембраны. Перемещение в клетку ионов Са2+ через Са-каналы запускает в
ней различные внутренние биохимические процессы. Существует множество
видов ионных каналов (Сазонов В.Ф. Мембранный потенциал покоя кратко /
Казань.: Кинезиолог, 2009. 128 с.).
С каждым годом число обнаруженных ионных каналов увеличивается,
а количество подтипов одного вида каналов с учетом особенностей их молекулярного строения и фармакологических свойств возрастает многократно
(Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г. Ионные каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами // Сенсорные системы. 2001. Т. 15. № 4. С. 275-287). Можно
предположить, что в ближайшее время число обнаруженных в клетках типов
и подтипов ионных каналов достигнет нескольких сотен.
Существуют несколько классификаций ионных каналов, которые в
разных соотношениях учитывают свойства и характеристики работы каналов,
молекулярную организацию, гены, кодирующие структуру каналов, участие
в определенной клеточной функции, регуляцию, чувствительность к химическим блокаторам и др. (Nemeth E., Scarpa А. Rapid mobilization of cellular Ca2+
in bovinepara thyroid cells by external divalent cations // J. Biol. Chem. 1987. Vol.
202. P. 5188–5196).
Все каналы возбудимых клеток можно разделить на два основных типа.
Первый тип – это каналы покоя, которые спонтанно открываются и закрываются без всяких внешних воздействий. Они важны для генерации мембранного потенциала покоя. Второй тип – это, так называемые, gate-каналы (gate ворота), воротные каналы. В покое эти каналы закрыты и могут открываться
под действием тех или иных раздражителей. Раздражители могут действовать непосредственно на канал или опосредоваенно через систему вторичных
посредников. Некоторые разновидности таких каналов принимают участие в
генерации электрических сигналов возбудимых клеток (ПД, синаптических и
20
рецепторных потенциалов) (Kyle J.A., Duthie G.G. Flavonoids. Chemistry, biochemistry and applications // Flavonoid in food. 2006. Vol. 4. P. 219–262).
По способу активации ионные каналы, обнаруженные к настоящему
времени, можно разделить на четыре группы. Некоторые каналы специфически отвечают на физические изменения в клеточной мембране. Наиболее яркими представителями этой группы являются потенциал-зависимые каналы.
Примером такого вида каналов могут служить потенциал-зависимые K+-,
Na+- каналы, которые отвечают за формирование потенциала действия. Эти
каналы открываются при достижении определенного потенциала на мембране. К группе каналов, активирующихся физическими изменениями, относятся также механо-чувствительные каналы, которые отвечают на механические воздействия (растяжение или деформацию клеточной мембраны) (Xiong
Z., Pignataro G., Li M. [et al.] Acid -sensing ion channels (ASICs) as pharmacological targets for neurodegenerative diseases // Curr. Opin. Pharmacol. 2008. Vol.
8. Iss. 1. P. 25-32).
Ионные каналы другой группы открываются тогда, когда химические
вещества активируют специальные рецепторные связывающие центры на
молекуле канала. Такие лиганд-активируемые каналы подразделяются на две
подгруппы в зависимости от того, являются ли их рецепторные центры внутриклеточными или внеклеточными. Лиганд-активируемые каналы, отвечающие на внеклеточные стимулы, называют также ионотропными рецепторами.
Они включают каналы, чувствительные к нейромедиаторам, принимающие
непосредственное участие в передаче информации в синаптических структурах (Xiong Z., Pignataro G., Li M. [et al.] Acid -sensing ion channels (ASICs) as
pharmacological targets for neurodegenerative diseases // Curr. Opin. Pharmacol.
2008. Vol. 8. Iss. 1. P. 25-32).
Лиганд-активируемые каналы, активирующиеся с цитоплазматической
стороны, чувствительны к изменениям концентрации специфических ионов и
внутриклеточных лигандов. Например, Са2+-активируемые К+-каналы активируются локальным повышением концентрации внутриклеточного кальция
21
(Catterol W.A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels // Annu.
Rev. Cell Dev. Biol. 2000. Vol. 16. P. 521- 555). Такие каналы играют важную
роль в реполяризации клеточной мембраны во время завершения потенциала
действия. Помимо ионов Са2+ типичными представителями внутриклеточных
лигандов являются циклические нуклеотиды (Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г.
Ионные каналы, регулируемые циклическими нуклеотидами // Сенсорные
системы. 2001. Т. 15. № 4. С. 275-287). Циклический ГМФ, например, отвечает за активацию Na+-каналов в палочках сетчатки. Такой тип канала играет
принципиальную роль в работе зрительного анализатора.
Представленная классификация каналов по способу активации в значительной степени условна. Некоторые ионные каналы могут активироваться
только при нескольких воздействиях. Например, Са2+-активируемые K+каналы чувствительны также к изменению потенциала, а некоторые потенциал-активируемые ионные каналы чувствительны к внутриклеточным лигандам (Brown N., Crawford C. Structural modifications associated with the change
in Ca2+ sensitivity on activation of m-calpain // FEBS Letters. 1993. Vol. 322. Iss.
1. P. 65-68; Choi H.S., Trafford A.W., Orchard C.H. [et al.] The effect of acidosis
on systolic Ca2+ and sarcoplasmic reticulum calcium content in isolated rat ventricular myocytes // The Journal Physiology. 2000. Vol. 529. Iss. 3. P. 661–668).
Большинство ионных каналов характеризуются избирательностью (селективностью), то есть через определенный вид каналов проходят только
определенные ионы. По этому признаку различают натриевые (Na+-), калиевые (K+-), кальциевые (Ca2+-), хлорные (Cl--) каналы (Kandel E.R., Schwartz
J.H., Jessel T.M. Principal of neural science / UK: Springer. 2002. 1321 p.). Селективность каналов определяется размерами поры, размерами иона и его
гидратной оболочки, зарядом иона, а также зарядом внутренней поверхности
канала. Однако, встречаются и неселективные каналы, которые могут пропускать сразу несколько различных ионов, например, калий и натрий или
хлор и калий. Есть каналы, через которые могут проходить все ионы и даже
более крупные молекулы.
22
Ещё одним важным свойством ионных каналов является проницаемость. Проницаемость канала определяется особенностями прохождения
ионов через канал. Одним из возможных механизмов движения ионов является диффузия через водную среду, заполняющую пору канала. Представление о диффузии лежало в основе ранних гипотез о процессе ионной проницаемости. Однако, для большинства каналов простая диффузия описывает ионную проницаемость недостаточно адекватно. Главная причина в том, что
проникающие ионы вступают во взаимодействие с белками ионного канала.
Так, в растворе благодаря наличию заряда ионы всегда покрыты гидратной
оболочкой. Если пора ионного канала узкая, необходимо некоторое количество энергии, чтобы освободить ион от ассоциированных молекул воды и
позволить ему проникнуть через этот участок. Кроме этого, ион, в канале,
может быть объектом притяжения или отталкивания зарядами на стенках канала. Взаимодействие иона со стенками ионного канала может приводить к
своеобразным «перескокам» иона с одного центра связывания на другой. Такие взаимодействия иона могут влиять как на ионную избирательность, так и
на проницаемость ионных каналов (Hille B. Ionic channels of excitable membranes / MA: Sinauer, 2001. 814 p.).
В связи с выше изложенным можно сделать вывод, что активность
ионных каналов может регулироваться целым рядом факторов. Изменение
потенциала мембраны будет не только активировать потенциал-зависимые
каналы, а также модулировать работу и других типов ионных каналов. Каналы регулируются химическими лигандами, которые могут связываться с каналами как с внеклеточной, так и с внутриклеточной стороны мембраны.
Инактивация некоторых потенциал-зависимых каналов требует входа ионов
Са2+. Ионы Са2+ могут инактивировать канал различными способами, либо
непосредственно связываясь участком канала, либо активируя внутриклеточные ферменты, которые инактивируют канал посредством белкового дефосфорилирования. Каналы могут также регулироваться давлением или растяжением. При этом энергия, связанная с растяжением мембраны, передается к
23
каналу по цитоскелету или непосредственно путем изменения натяжения липидного бислоя.
Так как липидный бислой мембраны является гидрофобным, то через
него практически не проходят полярные молекулы. Однако, клеткам, в частности эритроцитам, необходимо поддерживать нормальные концентрации
ионов в клетке и получать из вне питательные вещества. Перенос ионов и питательных веществ через мембрану осуществляют белки-переносчики, каждый из которых ответственен за транспортировку конкретных веществ (Wang
D., Lemieux M.J., Boulter J.M. Purification and Characterization of Transporter
Proteins From Human Erythrocyte Membrane // Methods in Molecular Biology.
2003. Vol. 228. P. 239-255; Murphy S.C., Samuel B.U., Harrison T. Erythrocyte
detergent-resistant membrane proteins: their characterization and selective uptake
during malarial infection // Blood. 2004. Vol. 103. Iss. 5. P. 1920-1928). Необходимо также отметить, что часть молекул может дифундировать через липидный бислой без участия транспортных белков. Скорость прохождения таких
молекул сильно зависит от размера и от относительной растворимости. К таким молекулам относится кислород, который быстро дифундирует в липидном слое (Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. [и др.] Структурнофункциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при
патологиях разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. №3 (73). С.
334-354).
В мембране эритроцитов для поддержания ионного транспорта реализованы два вида транспортных белков: белки переносчики и каналобразующие белки (Delaunay J. The enzymes of the red blood cell plasma membrane //
Biomedicine. 1977. Vol. 26. Iss. 6. P. 357-361; Alberts B., Johnson A., Lewis J. [et
al.] Molecular Biology of the Cell / New York.: Garland Science, 2002. P. 512).
Среди данных белков, которые поддерживают ионный гомеостаз, важным
является белок, который способен образовывать анионный канал. Анионный
канал – это интегральный белок, в состав которого входят две субъединицы и
переносят анионы, к такого рода белка можно отнести интегральный белок
24
полосы 3 (Eaton J.W., Branda F.R., Hadland C. [et al.] Anion Channel Blockade:
Effects Upon Erythrocyte Membrane Calcium Response // American Journal of
Hematology. 1980. Vol. 9. P. 391-399; Sabban E., Marchesi V., Adesnik M. [et
al.] Erythrocyte Membrane Protein Band 3: Its Biosynthesis and Incorporation into
Membranes // The Journal of Cell Biology. 1981. Vol. 91. P. 637-646; Merckx A.,
Bouyer G., Thomas S.L.Y. [et al.] Anion channels in Plasmodium-falciparuminfected erythrocytes and protein kinase A // Parasitology. 2009. Vol. 25. Iss. 3. P.
139-144).
Для транспорта Na+ и K+ предназначены белки, которые выполняют
функции катионных насосов против градиента концентраций (Трошкина
Н.А., Циркин В.И., Дворянский С.А. Эритроцит: строение и функции его
мембраны // Вятский медицинский вестник. 2007. № 2-3. С. 32-40). Примером
такого транспорта служит Na+,K+-АТФаза, которая использует гидролиз АТФ
для переноса ионов Na+ наружу, а ионов K+ внутрь клетки. Эта АТФаза
участвует в поддержании объема клетки, она также принимает участие в контроле осмотических сил, которые могут приводести клетку к разбуханию или
сжатию (Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. [и др.] Структурнофункциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при
патологиях разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. №3 (73). С.
334-354).
Особую роль в жизнедеятельности эритроцитов играют ионы K+, от
концентрации которых зависят морфологические особенности клетки и её
свойства (Nelson G.A., Andrews M.L., Karnovsky M.J. Control of Erythrocyte
Shape by Calmodulin // The Journal of Cell Biology. 1983. Vol. 96. P. 730-735;
Rudenko S.V. Erythrocyte morphological states, phases, transitions and trajectories
// Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 2010. Vol. 1798. Iss. 9. P. 1767–1778;
Parka Y., Best C.A., Badizadegan K. [et al.] Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes // PNAS. 2010. Vol. 107. Iss. 15. P. 6731–
6736).
25
Концентрация ионов Са2+ в цитозоле поддерживается на более низком
уровне чем с наружи клетки. Внутриклеточная концентрация ионов Са2+ в
здоровом эритроците находиться в пределах от 30 до 60 нМ. Во внеклеточной среде концентрация ионов Са2+ составляет около 1,8 мМ. Такой градиент
концентраций поддерживается за счет низкой проницаемости мембраны
эритроцита для ионов Са2+ и активной работы Са-насоса. Таким насосом является Са2+-АТФаза (Tiffert T., Bookchin R.M., Lew V.L. Calcium Homeostasis
in Normal and Abnormal Human Red Cells / Germany.: Springer Verlag, 2003.
623 Р.). Активность данной АТФазы контролируется с помощью таких регуляторов как кальмодулин, ФИ, который преимущественно локализован на
внешнем слое мембраны. Также активность Са2+-АТФазы может регулироваться фосфорилированием под действием протеинкиназ А и С (Боровская
М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. [и др.] Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного
генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. №3 (73). С. 334-354).
Повышение уровня свободный ионов Са2+ в цитозоле приводит к активации Са2+-АТФазы. Для защиты от кальциевого стресса в эритроцитах существует и другой механизм, который связан с активацией Са2+-АТФазы
внутриклеточной Са2+-зависимой протеинкиназой – кальпаином. Этот механизм регулирования концентрации ионов Са2+ в клетке реализуется в крайнем случае при повышении концентрации, он активируеться только тогда,
когда концентрация кальция становиться больше 10-6 (Левицкий Д.О. Биохимия мембран. Кальций и биологические мембраны / М.: Высшая школа, 1990.
124 с.).
Известно, что увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ в
эритроцитах приводит к открыванию Са-активируемых K-каналов, посредством чего происходит высвобождение ионов K+ из эритроцитов, такое явление получило название «Гардош-эффект». Активация этих каналов происходит при увеличении концентрации ионов Са2+ в клетке или при нарушении
других путей транспорта Са2+ (Agroyannis B., Paraskevopoulos A., Kopelias I.
26
[et al.] Is Erythrocyte Damage Prevented by Gardos Effect in Hemodialyzed Uremic Patients? // Artificial Organs. 2000. Vol. 24. Iss. 9. P. 743–745; Maher A.D.,
Kuchel P.W. The Gárdos channel: a review of the Ca2+-activated K+ channel in
human erythrocytes // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.
2003. Vol. 35. P. 1182–1197; Lang P.A., Kaiser S., Myssina S. [et al.] Role of
Ca2+-activated K+ channels in human erythrocyte apoptosis // American Journal of
Physiology - Cell Physiology. 2003. Vol. 285. Iss. 6. P. 1553-1560).
Увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ приводит к запуску каскадов ферментативных нарушений. В частности увеличение концентрации ионов Са2+ приводит к активации протеаз и фосфолипаз, что ведет
к агрегации белков мембраны, происходит гидролиз фосфолипидов, увеличивается проницаемость биомембраны. А это в совокупности ведет к нарушению функций эритроцитов и к изменению морфологических характеристик (Bruce J.I., Elliott A.C. Oxidant-impaired intracellular Ca2+ signaling in pancreatic acinar cells: role of the plasma membrane Ca2+-ATPase // Am J Physiol
Cell Physiol. 2007. Vol. 293. Iss. 3. P. 938-950; Woon L.A., Holland J.W., Kable
E.P. [et al.] Ca2+ sensitivity of phospholipid scrambling in human red cell ghosts //
Cell Calcium. 1999. Vol. 25. P. 313–320; Костин Д.Г., Козлова Н.М., Слобожанина Е.И. Изменение асимметрии липидов и транспорта коньюгатов глутатиона в эритроцитах человека под влиянием ионов кальция // Биофизика. 2004.
Т. 49. Вып. 4. С. 685-692).
Таким образом мы можем заключить, что в эритроцитах существует
несколько систем, которые регулируют концентрации ионов в клетке. Особую роль играют ионы Са2+. Нарушение транспорта ионов Са2+ ведет к изменению объема клетки, а так же нарушению свойств биологической мембраны
и как следствие к нарушению функций клетки.
27
1.3 Участие ионов Са2+ в регуляции биофизических свойств и
состава мембран эритроцитов
Роль кальция, как регулятора физиологических процессов, протекающих в клетке, хорошо известна. Нарушение внутриклеточного гомеостаза
этого иона, сопровождается существенным повышением его концентрации в
цитоплазме клетки, лежит, как полагают, в основе механизма клеточной гибели при целом ряде патологических состояний, таких как ишемия, аутоиммунные процессы (Muravyov A., Tikhomirova I. Role Ca2+ in Mechanisms of the
Red Blood Cells Microrheological Changes // Advances in Experimental Medicine
and Biology. 2012. Vol. 740. P. 1017-1038).
В норме низкая концентрация ионов Са2+ в цитоплазме клетки поддерживается механизмами его активного транспорта через биомембраны и оганеллами клетки, которые способны аккумулировать ионы кальция, например
митохондрии (Santo-Domingo J., Demaurex N. Calcium uptake mechanisms of
mitochondria // Biochimica et Biophysica Acta. 2010. Vol. 1797. P. 907–912).
Обычно поступление ионов Са2+ в клетку по градиенту концентрации уравновешивается его активным выведением, осуществляемым при участии Са2+транспортной АТФазы в печени и эритроцитах и Na+/Ca2+обменом в возбудимых тканях. Кроме того, уровень ионов Са2+ регулируется его накоплением в клеточных органеллах (митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме), а также связыванием внутриклеточными белками (Пестов Н.Б., Дмитриев Р.И., Шахпаронов М.И. Регуляция Са2+-АТР-азы плазматических мембран
// Успехи биологической химии. 2003. Т. 43. С. 99-138; Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцита. Влияние патологии. // Биомедицинская
химия. 2005. Т. 51. Вып. 2. С. 118-126).
Нарушение транспорта ионов Са2+ в клетке может вызывать следующие нарушения:
- повреждение биологической мембраны и нарушение её проницаемости для различных ионов (Canoruc N. Cicek R., Atamer A. [et al.] Protective Ef-
28
fects of Vitamin E Selenium and Allopurinol Against Stress-induced Ulcer Formation in Rats // Turkish Journal of Medical Sciences. 2001. Vol. 31. P. 199-203);
- нарушение энергетического баланса клетки, которое приводит к истощению запасов макроэргов (Lodish H., Berk A., Zipursky S.L. Molecular Cell
Biology, 4th edition / New York: W. H. Freeman. 2000. 956 p.);
- изменения конформации белковых молекул (в том числе путем действия на соответствующие рецепторы), которые способны транспортировать
ионы Са2+ (Theobald H.E. Dietary calcium and health // British Nutrition
Foundation. 2005. Vol. 30. P. 237-277).
Перечисленные нарушения, происходящие при увеличении концентрации кальция, способны вызывать необратимые нарушения, которые в конечном итоге могут приводить разрушению клетки. Все эти механизмы направлены на увеличение интенсивности выхода ионов Са2+ из Са-депо, что приводит к увеличению концентрации ионов Са2+ и запуску ферментативных реакций, которые напрямую зависят от концентрации выше указанных ионов
(Monique D.D., Catherine A., Pernollet M.G. [et al.] Control of the Erythrocyte
Free Ca2+ Concentration in Essential Hypertension // Hypertension. 1992. Vol. 19.
Iss. 2. P. 167-174).
1.3.1. Локализация ионов Са2+ в клетке и их участие в процессах
функционирования клетки (в норме и при патологии)
Кальций является вторичным мессенджером, то есть относится к внутриклеточным веществам концентрация которых контролируется гормонами,
нейромедиаторами и внеклеточными сигналами (Авдонин П.В., Ткачук В.А.
Рецепторы и внутриклеточный кальций / М.: Наука, 1994. 288 с.). Низкий
уровень ионов Са2+ в клетках поддерживается Са-насосами (кальциевыми
АТФ-азами) и Na/Ca обменниками (Sauer H., Hescheler J., Wartenberg M. Mechanical strain-induced Ca(2+) waves are propagated via ATP release and puriner-
29
gic receptor activation // American Journal of Physiology. 2000. Vol. 279. Iss. 2.
P.295-307).
О том, что клеточные кальциевые перегрузки высоко токсичны и вызывают массовую активацию фосфолипаз было известно еще в 70-х годах.
Но, тогда токсичную роль кальция связывали с некротической гибелью клеток. По мнению Ткачука В.А. продолжительное увеличение уровня ионов
Са2+ в цитоплазме (от 10-7 до 10-5 Моль и выше) приводит к гибели клетки
(Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций // Соросовский образовательный журнал. 2001. Том 7. № 1. C. 10-15).
Одним из факторов, который способен вызывать нарушение проницаемости мембраны для ионов, в частности для ионов Са2+, является осмотический стресс. Он вызывает перегруппировку цитоскелета, остановку клеточного цикла, что приводит к повреждению белков и ДНК. Для того чтобы выжить, клетки должны реагировать через осмоадаптивный ответ (Бондаренко
О.Г., Кравченко Т.Г., Попов Г.К. Особенности внутриклеточной сигнализации в лейкоцитах периферической крови при лазерном облучении в условиях
in vitro // Вестник ЮУрГУ. 2011. № 39. С. 66–69). Характерной особенностью
которого состоит в повышенной экспрессии органических осмолитов и белков теплового шока. Тем не менее, представляется, что осмотический стресс
модулирует очень широкий ряд функций клеток путем регулирования транскрипции мРНК и трансляции белка. Кроме того, недавние исследования показали, что реакция осмотического стресса абсолютно не ограничивается почечными клетками, а наоборот, влияет на широкий спектр типов клеток (Burg
M.B., Ferraris J.D., Dmitrieva N.I. Cellular response to hyperosmotic stresses //
Physiol Rev. 2007. Vol. 87. Iss. 4. P. 1441–1474).
Осмотический стресс стимулирует высвобождение простагландина Е2,
который в свою очередь активирует катионные каналы. Это приводит к увеличению цитозольного уровня ионов Ca2+, что в последующим сопровождается активацией Ca2+-чувствительных K+-каналов, при этом происходит К+гиперполяризация клеточной мембраны, которая сопровождается потерей
30
клеточного КCl, что приводит к уменьшению размеров клетки (Lang F.,
Gulbins E., Lang P.A. Ceramide in Suicidal Death of Erythrocytes // Cellular
Physiology and biochemistry. 2010. Vol. 26. P. 21-28). Кроме того, ионы Ca2+
активирует кальпаин, цистеин эндопептидазу, которая разрушает белковый
цитоскелет и тем самым приводит к «пузырению» клеточной мембраны.
Увеличение активности цитозольного кальция далее приводит к стимуляции
процесса перегруппировки клеточной мембраны с нарушением асимметрии
фосфолипидного бислоя и выходом фосфатидилсерина на поверхность клетки (Dekkers D.W., Comfurius P., Bevers E.M. [et al.] Comparison between Ca2+induced scrambling of various fluorescently labelled lipid analogues in red blood
cells // Biochem J. 2002. Vol. 362. P.741–747).
Уменьшение размеров клетки увеличивает Ca2+–индуцированную перегруппировку клеточной мембраны (Gatidis S., Zelenak C., Fajol A. [et. al] p38
MAPK activation and function following osmotic shock of erythrocytes // Cell
Physiol Biochem. 2011. Vol. 28. P. 1279–1286). Церамид, который, также как и
ионы Ca2+, накапливается в клетке, усиливает Са2+-индуцированную перегруппировку клеточной мембраны, что в конечном итоге приводит к гибели
эритроцитов – эриптозу. Церамид образуется при гидролизе сфингомиелина
под действием сфингомиелиназы, этот процесс также приводит к образованию фосфохолина (Gatidis S., Borst O., Föller M. [et al.] Effect of osmotic shock
and urea on phosphatidylserine scrambling in thrombocyte cell membranes // Am J
Physiol Cell Physiol. 2010. Vol. 299. P. 111–11832).
Резкое увеличение содержания ионов Са2+ в клетке происходит при открытии кальциевых каналов или внутриклеточных кальциевых депо (концентрация повышается до 500-1000 нМ при 10-100 нМ в нестимулированной
клетке) (Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия / М.: Мир, 2004. 469 с.).
Открытие каналов может быть вызвано деполяризацией мембран, действием
сигнальных веществ, нейромедиаторов (Augustine G.J. How does calcium
trigger neurotransmitter release? // Current Opinion in Neurobiology. 2001. Vol.
11. P. 320-326), вторичных мессенджеров (инозитол-1,4,5-трифосфат, цАМФ)
31
(Watras J., Bezprozvanny I., Ehrlich B.E. Inositol 1,4,5-trisphosphate-gated channels in cerebellum: presence of multiple conductance states // The Journal of Neuroscience. 1991. Vol. 11. Iss. 10. P. 3239-3245; Gillespie D. Fill M. Intracellular
Calcium Release Channels Mediate Their Own Countercurrent: The Ryanodine
Receptor Case Study // Biophysical Journal. 2008. Vol. 95. P. 3706-3714).
Уровень ионов Са2+ в клетках повышается (в 5-10 раз) в виде кратковременных флуктуаций (Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия / С.Петербург.: Бинорм,2002. 348 с.). В клеточных органеллах и цитоплазме клеток имеется большое количество белков, способных связывать свободные
ионы Са2+ и выполнять роль буфера. Действие ионов Са2+ опосредовано
«кальциевыми сенсорами» – специальными Са-связывающими белками, такими как аннексин, кальмодулин, тропонин. Кальмодулин имеется во всех
клетках и при связывании четырех ионов Са2+ переходит в активную форму,
которая может взаимодействовать с белками. Ионы Са2+ оказывают влияние
на активность внутриклеточных ферментов, работу ионных насосов и на
структуру цитоскелета за счет активации кальмодулина (Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. Структура и механизм функционирования // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 5. С. 10-16; Haeseleer
F., Imanishi Y., Sokal I. [et al.] Calcium-Binding Proteins: Intracellular Sensors
from the Calmodulin Superfamily // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002. Vol. 290. P. 615-623; Ikura M., Osawa M., Ames J.B. The role
of calcium-binding proteins in the control of transcription: structure to function //
BioEssays. 2002. Vol. 24. P. 625-636).
Увеличение концентрации ионов Са2+ является одним из характеристик
суицидальной гибели клетки (Rizzuto R., Pinton P., Ferrari D. [et al.] Calcium
and apoptosis: facts and hypotheses // Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 8619-8627;
Мартынова Е.А. Регуляция активности каспаз в апоптозе // Биоорганическая
химия. 2003. Т. 29. №5. С. 518-543; Lang K.S., Lang P.A., Bauer C. [et al.]
Mechanisms of suicidal erythrocyte death // Cell Physiol Biochem. 2005. Vol. 15.
P. 195-202).
32
Еще в 70-х годах ХХ века было известно, что высокие концентрации
ионов Са2+ высоко токсичны и вызывают массовую активацию фосфолипаз.
Тогда токсичную роль кальция связывали с некротической гибелью клеток.
По мнению Ткачука В.А. продолжительное увеличение уровня кальция в цитоплазме (от 10-7 до 10-5 Моль и выше) приводит к гибели клетки (Ткачук
В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций // Соросовский образовательный журнал. 2001. Том 7. № 1. С. 10-15).
Однако, более поздние исследования показали, что кальций играет роль
в регулировании и других видов клеточной гибели. Есть данные о том, что
увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ происходит как в
ранних, так и в поздних этапах апоптоза. В связи с этим освобождение ионов
Са2+ из эндоплазматического ретикулума и приток кальция через активные
Са-каналы были предложены в качестве апоптогенных факторов (Rizzuto R.,
Pozzan T. Microdomains of intracellular Ca2+: molecular determinants and
functional consequences // Physiol Rev. 2006. Vol. 86. P. 369-408). В работе
Миндукшева показано, что кальциевые ионофоры, вызывают апоптотические
изменения клетки, а именно уменьшение объема клетки, что непосредственно приводит к развитию апоптотической гибели клетки (Миндукшев И.В.,
Кривошлык В.В., Добрылко И.А. [и др.] Нарушение деформационных и
транспортных характеристик эритроцитов при развитии у них апоптоза //
Биологические мембраны. 2010. Том 27. №1. C. 28-38). Данные исследования
были проведены на эритроцитах.
Гибель клеток по пути апоптоза заканчивается конечной стадией фагоцитоза. Перемещение ФС на поверхность плазматической мембраны дает
сигнал макрофагам «ешь меня». Одним из механизмов регуляции распределения ФС между двумя слоями плазматической мембраны является участие
Са-зависимых белков – Scramblase, которые инициируют случайное распределение фосфолипидов и АТФ-зависимых аминофосфолипидтранслоказ, тем
самым опосредованно влияют наперемещение аминофосфолипидов от внешнего слоя к внутреннему. Недавние исследования показывают, что «скрем-
33
блирование» фосфолипидов стимулируется ионами Са2+, и возможно, трансмембранный белок 16F является Са-чувствительным компонентом в плазматической мембране и играет решающее значение для перемещения ФС при
апоптозе клеток (Suzuki J., Umeda M., Sims P.J. [et al.] Calcium-dependent
phospholipid scrambling by TMEM16F // Nature. 2010. Vol. 468. P. 834-838).
Основным кальциевым депо в клетках млекопитающих является эндоплазматический ретикулум, который также участвует в модификации и сортировке вновь синтезированных белков. Нарушение одной из этих функций
приводит, к так называемому, стрессу эндоплазматического ретикулума.
Стресс эндоплазматического ретикулума, вызванный истощением кальция
или изменением в системах транспортировки кальция, приводит к активации
каспазы 12, которая, в свою очередь, действует на эффектроные каспазы, которые запускают программу клеточной гибели (Nakagawa T., Zhu H., Morishima N. [et al.] Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis
and cytotoxicity by amyloid-beta // Nature. 2000. Vol. 403. P. 98-103; Yoneda T.,
Imaizumi K., Oono K. Activation of caspase-12, an endoplastic reticulum (ER)
resident caspase, through tumor necrosis factor receptor-associated factor 2dependent mechanism in response to the ER stress // J. Biol. Chem. 2001. Vol.
276. P. 13935-13940).
Известно, что освобождение кальция из эндоплазматического ретикулума регулируется рецептором инозитол 3-фостфат (InsP3R). Освобожденный кальций поглощается митохондриями, так как он необходим для производства АТФ. Расщепление InsP3R каспазой 3 способствует накоплению
кальция в митохондриях и тем самым приводит клетку к реализации внутреннего пути апоптоза (Berridge M.J., Bootman M.D., Roderick H.L. Calcium
signaling: dynamics, homeostasis and remodeling // Molecular Cell Biology. 2003.
Vol. 4. Iss.7. P. 517-529). Кроме этого связь между митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом может быть продемонстрирована тем, что цитохром C, который выходит из митохондрий, может быть связан не только с
Apaf-1, но и с InsP3R и тем самым способен блокировать его функции, при
34
этом увеличивается внутриклеточная концентрация ионов Са2+. Это приводит
к усилению апоптотического сигнала (Boehning D., Patterson R.L., Sedaghat L.
[et al.] Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate recep-tors, amplifying
calcium-dependent apoptosis // Nat. Cell Biol. 2003. Vol. 5. P. 1051-1061).
Программируемая клеточная гибель, опосредованная InsP3R кальциевой сигнализации, может быть модулирована посредством взаимодействия
белков семейства Bcl-2 с InsP3R (Rong Y.P., Aromolaran A.S., Bultynck G. [et
al.] Targeting Bcl-2-IP3 receptor interaction to reverse Bcl-2’s inhibition of apoptotic calcium signals // Mol. Cell. 2008. Vol. 31. P. 255-265).
Как было сказано выше, кальциевые сигналы регулируют множество
клеточных процессов, которые необходимы для выживания клетки, например
при апоптозе или некротической гибели клеток. Однако, гибель клеток может быть вызвана не только нарушением кальциевого гомеостаза, но также
может быть вызвана более чувствительными изменениями в распределении
ионов Са2+ в пределах клеточных компонент.
Митохондрии являются активными участниками в процессе разделения
внутриклеточного кальция (Carafoli E. Calcium signaling: a tale for all seasons
// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99. P. 1115-1122). При физиологических условиях кальций в митохондриях накапливается в небольшом количестве. Однако, при патологических состояниях в условиях увеличения концентрации кальция, количество кальция, накапливаемого в митохондриях,
увеличивается. В соответствии с этим, накопление кальция митохондриями
рассматривалось как один из механизмов защиты клетки от кальциевой перегрузки. Хотя в 90-е годы это утверждение изменилось, благодаря появлению
новых методов способных регистрировать внутриклеточные колебания кальция в разных органеллах клетки. Используя данный метод было показано,
что поток митохондриального кальция интегрирован во внутриклеточную
сигнализацию. Низкое сродство митохондриального кальция преодолевается
близостью к эндоплазматическому ретикулуму и образованию точек взаимодействия с устьем кальциевого канала эндоплазматического ретикулума, где
35
концентрация кальция достигает больших значений (Hajnoczky G., RobbGaspers L.D., Seitz M.B. [et al.] Decoding of cytosolic calcium oscillations in the
mitochondria // Cell. 1995. Vol. 82. P. 415-424). Дальнейшее поглощение кальция митохондриями активирует матричные Ca2+-чувствительные дегидрогеназы, которые являются основными источниками НАДФ для дыхательной
цепи, следовательно и для митохондриального производства АТФ (Cardenas
C., Miller R.A., Smith I. [et al.] Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria // Cell. 2010. Vol. 142. P. 270283).
При апоптотической гибели клетки по митохондриальному пути увеличивается проницаемость внешней митохондриальной мембраны, в следствии чего наружу выходят мембранные белки, которые участвуют в реализации апоптотического сигнала. Кальций может реализовывать механизм
проницаемости внешней митохондриальной мембраны с помощью образования пор, которые состоят из белкового комплекса. Данные поры локализованы в местах контакта между наружной и внутренней митохондриальной
мембраны и ведут себя как каналы, управляемые напряжением. Открытие таких пор стимулируется высоким уровнем ионов Са2+ в митохондриях, а также
окислительным стрессом. Через открытые поры кальций и митохондриальные белки поступают наружу митохондрий, а вода и растворы из цитозоля
проникают в митохондрии, в результате чего митохондрии набухают и разрываются (Zhivotovsky B., Orreniusa S. Calcium and cell death mechanisms: A
perspective from the cell death community // Cell Calcium. 2011. Vol. 50. P. 211221).
Кальций вносит свой вклад и в другие пути клеточной гибели. Так
например, увеличение проницаемости митохондриальной мембраны под действием перегрузки кальцием может привести как и к реализации апоптотической программы, так и к реализации некроза. Зачастую в клеточных популяциях реализуются несколько программ гибели клеток.
36
Кальций также вносит свой вклад в реализацию гибели клеток по аутофагическому пути. Аутофагия, как и апоптоз может быть вызвана стрессом
эндоплазматического ретикулума, что предполагает связь между кальцием и
аутофагией. Непосредственная роль кальция в аутофагии была показана на
различных клеточных культурах при действии фосфата кальция. Этот случай
аутофогии был Beclin-зависим. Есть данные, что аутофагея регулируеться с
помощью взаимодействия InsP3R с Beclin-1, которые создают связь между
эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями не только в апоптозе, но
и в реализации ауофагеи (Vicencio J.M., Ortiz C., Criollo A. [et al.] The inositol
1,4,5-trisphosphate receptor regulates autophagy through its interaction with Beclin 1 // Cell Death Differ. 2009. Vol. 16. P. 1006-1017).
1.3.2 Участие фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в регуляции
свободного и связного кальция в крови (эритроцитах)
Фософоинозитиды (ФИ) – это минорные компоненты плазматической
мембраны эритроцитов. Они также входят в состав мембран практически
всех эукариотических клеток. В мембране эритроцитов количество ФИ незначительно и составляет всего от 2 до 12 % от общей суммы мембранных
липидов (Казарян П.А., Дагбашян С.С., Исраелян К.И. Метаболизм фосфоинозитидов при хроническом лимфолейкозе и после полихимиотерапии //
Кровь. 2007. Том. 1. № 5. С. 19-22).
Известно, что такие ФИ как фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат
(PI(3,4,5)P3) и фосфатидилинозитол-3,4-бифосфат (PI(3,4)P2) играют не маловажную роль в защите клеток от гибели (Downward J. Mechanisms and
consequences of activation of protein kinase B/Akt // Curr Opin Cell Biol. 1998.
Vol. 10. Iss. 2. P. 262-267). Данные ФИ активируют фосфорилирование Akt/
PKB, а также серин/треонин киназу, что инактивирует несколько компонентов, участвующих в механизме программируемой клеточной гибели (Arsham
A.M., Plas D.R., Thompson C.B. [et al.] Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signal-
37
ing is neither required for hypoxic stabilization of HIF-1 alpha nor sufficient for
HIF-1-dependent target gene transcription // J Biol Chem. 2002. Vol. 277. Iss. 17.
P. 15162-15170).
PI(3,4)P2 является субстратом для фосфоинозитид-3-киназы, которая
способна катализировать перенос фосфатной группы в 3D положение инозитольного кольца ФИ, эти сигнальные молекулы регулируют актин цитоскелета, везикулярный транспорт, деятельность транспортных каналов и ядерные
функции (Downward J. Ras signalling and apoptosis // Curr Opin Genet Dev.
1998. Vol. 8. Iss. 1. P. 49-54). Существуют данные о том, что комплексы
PI(3,4)P2 и PI(4,5)P2 с белком Gelsolin способны тормозить активность каспаз
3 и 9 посредством образования стабильного комплекса с каспазой. PI(4,5)P2
предотвращает развития апоптоза, опосредованного каспазой 3 в бесклеточной системе (Azuma T., Plas D.R., Thompson C.B. et al. Gelsolin in Complex
with Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Inhibits Caspase-3 and -9 to Retard
Apoptotic Progression // The Journal of Biological Chemistry. 2000. Vol. 275. Iss.
6. P. 3761–3766).
Имеются данные о том, что и одиночная молекула PIP2 способна ингибировать каскады каспазы участвующие в апоптотической гибели клетки.
Эти каскады начинаются или с активации рецептора смерти от прокаспазы 8,
или же активацией митохондриальной каспазы 9, оба эти механизма сходятся
на прокаспазе 3. Это доказывает роль PIP2 в апоптозной сигнализации. Фосфатидилинозитол 5-киназа α защищает в обоих случаях от активации апоптотической гибели. Этот механизм защиты заключается в инактивации расщепления каспазы 3 в апоптозе (Mejillano M., Yamamoto M., Rozelle A.L. Regulation of Apoptosis by Phosphatidylinozitol 4,5-Bisphosphate Inhibition of caspases,
and caspase inactivation of phospha-tidilinozitol phosphate 5-kinases // The Journal of Biological Chemistry. 2001. Vol. 276. Iss. 3. P. 1865–1872).
Фосфоинозитид 3-киназа (PI3K) играет важную роль не тольков реализации защитного механизма клеток от апоптотической гибели. Этот фермент
совместно с Akt и mTOR реализует передачу клеточного сигнала от мембра-
38
ны внутрь клетки. Данный путь клеточной сигнализации регулирует не только развитие апоптоза, а также такие клеточные процессы как полиферация
клеток, синтез белка, морфологию, миграцию клеток и является одним из основных путей передачи сигнала в раковых и нормальных клетках (Shaw R.J.,
Cantley L.C. Ras, PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth //
Nature. 2006. Vol. 441. P. 424-430; Laplante M., Sabatini D.M. mTOR signaling
in growth control and disease // Cell. 2012. Vol. 149. P. 274-293).
PI3-киназы катализируют фосфорилирование мембранных липидов
фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат. Образовавшийся при этом фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат
в
свою
очередь
связывается
с
Akt/протеинкиназой В (РКВ), что приводит к перемещению этих киназ к
плазматической мембране (Зубова С.Г., Шитикова Ж.В., Поспелова Т.В.
TOR-центрическая концепция регуляции митогенных, метаболических и
энергетических сигнальных путей // Цитология. 2012. Том. 54. № 8. С. 589602). Особое место в данном механизме клеточной сигнализации отведена
фосфоинозитид-зависимой киназе и семье Akt киназ. Фосфоинозидзависимая киназа фосфорилирует треонин 308 и активирует Akt. Но, для
полной актвации Akt необходимо фосфорилирование серина 473 при участии
mTOR, которые содержат TORC2 комплекс. Затем Akt фосфорилирует некоторые субстраты, что приводит к плеотропным эффектам пролиферации и
апоптоза (Lauring J., Park B.H., Wolff A.C. The Phosphoinositide-3-Kinase-AktmTOR Pathway as a Therapeutic Target in Breast Cancer / Journal of the National
Comprehensive Cancer Network. 2013. Vol. 11. Iss. 6. P. 670-678).
Исследования показали, что ионы Ca2+ обладают свойствами, которые
делают эти ионы уникальными среди всех других участников в передачи
сигнала в клетке. Среди таких свойств следует назвать способность ионов
Ca2+ выполнять функции как первичного, так и вторичного, и даже третичного посредника, способность к авторегуляции (ионы Ca2+ управляют генерацией и регуляцией информации, которую сами же и несут) и, наконец, возможно наиболее важная особенность ионов Ca2+ заключается в том, что сигнал,
39
передаваемый ими, носит яркий амбивалентный характер. Кальций – не
только незаменимый регулятор нормальных функций клеток, но и важный
посредник их смерти. В последние годы появился ряд обзоров, иллюстрирующих отдельные стороны роли кальция в передаче сигналов (Carafoli E. Calcium Signalling and Disease Edited / USA.: Springer, 2007. 59 p.; Manach C., A.
Scalbert, Morand C. [et al.] Polyphenols: food sources and bioavailability //
Am.J.Clin.Nutr. 2004. Vol. 79. P. 727–747).
Как уже было отмеченно, увеличение внутриклеточной концентрации
ионов Са2+ приводит к запуску каскадов ферментативных нарушений. В
частности увеличение концентрации ионов Са2+ приводит к активации протеаз и фосфолипаз, что ведет к агрегации белков мембраны, происходит гидролиз фосфолипидов, увеличивается проницаемость биомембраны. А это в совокупности ведет к нарушению функций эритроцитов и к изменению морфологических характеристик.
Одним из таких нарушений может быть стимуляция фермента сфингомиелиназы включают фактор активации тромбоцитов, который образован
фосфолипаз-зависимым уменьшением липидов клеточной мембраны. Стимулятором фосфолипазы С является гиперосмотический шок (Thomas L.Y. Ion
channels in human red blood cell membrane: Actorsorrelics? //Blood Cells, Molecules, and Diseases. 2011. Vol. 46. P. 261-265). Поступающий извне кальций
активирует фосфолипазу С, которая образует из трифосфоинозитидов (ТФИ)
два активных мессенджера инозитолтрифосфата (ИФ3) и диацилглицерол
(ДАГ). ИФ3 является активным вторичным месседжером, участвующим в динамике изменений концентрации ионов Са2+ в цитоплазме. Это подтверждается наличием рецепторов в эндоплазматическом ретикулуме, внешней и
внутренней мембранах ядра. Авторы при выделении внешней и внутренней
мембран ядра различными морфологическими методами показали, что внутренняя мембрана ядра содержит ИФ3. При культивировании изолированных
ядер гепатоцитов добавление ИФ3 в течение нескольких секунд усиливало
транспорт изотопа 45Са2+. Следует подчеркнуть, что ИФ3 не только запускает
40
выход Са2+ из эндоплазматического ретикулума, но и движение Са2+ между
цитоплазмой и нуклеоплазмой (Бондаренко О.Г., Кравченко Т.Г., Попов Г.К.
Особенности внутриклеточной сигнализации в лейкоцитах периферической
крови при лазерном облучении в условиях in vitro // Вестник ЮУрГУ. 2011.
№ 39. С. 66–69).
Развитие гиперосмотического шока активирует р38–киназу. Ингибиторы р38–киназы SB203580 и р38 Inh III тормозят эриптоз, следующий за осмотическим шоком (Gatidis S., Zelenak C., Fajol A. [et al.] p38 MAPK activation
and function following osmotic shock of erythrocytes // Cell Physiol Biochem.
2011. Vol. 28. P. 1279–1286).
Эриптоз стимулирует в дальнейшем активацию протеинкиназы С
(PKC). PKC активируется во время энергетического истощения, что является
мощным стимулятором эриптоза. Ингибирование PKC притупляет эриптоз,
затем происходит дальнейшая потеря энергии (Li L., Guerini D., Carafoli E.
Calcineurin Controls the Transcription of Na+/Ca2+ Exchanger Isoforms in Developing Cerebellar Neurons // J.Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 20903–20910).
Ни одна клетка не может функционировать должным образом без участия Ca2+-сигнальной системы. Однако, для поддержания жизнедеятельности
клеток чрезвычайно важно строго контролировать уровень ионов Са2+ внутри
клеток. Увеличение уровня свободных ионов Ca2+ выше оптимальной концентрации 100-200 нМоль в цитозоле может быть безвредным и даже необходимым, но только в течение короткого времени. Быстрые колебания уровня Ca2+ удобное средство, к которому обращаются клетки при необходимости
модулировать функции, требующие высоких концентраций свободных ионов
Ca2+. Существует ряд механизмов, позволяющих клетке справиться с перегрузкой кальция при условии непродолжительного повышения его уровня.
Среди таких механизмов важная роль принадлежит митохондриям, которые
могут захватывать довольно большое количество ионов Ca2+ и депонировать
его в форме нерастворимой фосфорнокислой соли (гидроксиапатита). Однако
для переноса кальция митохондрии затрачивают энергию электрохимическо-
41
го градиента, которая обычно используется при синтезе АТФ. Непрерывный
захват ионов Ca2+ митохондриями привел бы к прекращению синтеза АТФ,
необходимого, в том числе, для удаления Ca2+ из цитоплазмы при помощи
Са-насосов. Развитие подобного сценария было бы губительным для клетки,
способствуя развитию некроза, что является крайне нежелательным и отрицательным эффектом. Однако кальций является участником и программируемой смерти клеток – апоптоза. Апоптоз опосредуется семейством протеаз и
каспаз, активность которых хотя и не зависят непосредственно от уровня
свободных ионов Ca2+, но увеличение концентрации данных ионов может активировать ферменты, которые непосредственно влияют на активность протеаз и каспаз. С другой стороны, как это показано недавно (Bano D. Cleavage
of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in excitotoxicity // Cell. 2005. Vol.
120. P. 275–285), активированные каспазы могут способствовать расщеплению PMCA, что приводит к внутриклеточной перегрузке кальцием, а это в с
вою очередь включает названные выше ферменты, которые разрушают клетку.
Изучение роли ионов Са2+, как посредника сигнальных систем, привлекает пристальное внимание исследователей. Первые эксперименты Рингера
породили лавину исследований в этой области. Выяснены основные механизмы, регулирующие уровень ионов Са2+ в крови и в клетке. Нарушения
строения участников этих систем – причина многих заболеваний. Широкое
применение в клинической практике ингибиторов кальциевых сигналов – результат исследований о роли ионов Са2+ в регуляции процессов жизнидеятельности. С другой стороны, более глубокое проникновение в детали механизмов кальциевых регуляторных систем потребует более внимательного отношения к назначению таких препаратов.
Недавние исследования зарубежных авторов показывают решающую
роль ионов Са2+ в регуляции процессов клеточной гибели (Lang P.A., Kempe
D.S., Myssina S. [et al]. PGE(2) in the regulation of programmed erythrocyte death
// Cell Death Differ. 2005. 12. P. 415-428; Lang F., Gulbins E., Lang P.A. [et al.]
42
Ceramide in Suicidal Death of Erythrocytes // Cellular Physiology and biochemistry. 2010. Vol. 26. P. 21-28; Bogdanova A., Makhro A, Wang J. [et al.] Calcium in
Red Blood Cells – A Perilous Balance // International Journal of Molecular Sciences. 2013. 14. P. 9848-9872). Появляются новые методы, которые помогают
понять роль регуляции кальцивой сигнализации с участием митохондрий и
эндоплазматического ретикулума. За последние годы стало ясно что кальций
участвует в реализации программы не только апопотоза, а так же аутофагеи и
некроза.
Таким образом, из всего выше изложенного можно заключить, что ионы Са2+ играют важну роль не только в реализации клеточного ответа, они
также являются непосредственными участниками в реализации программируемой клеточной гибели. В связи с этим актуальным является нахождения
таких веществ, которые, по мимо Са-связывающих белков, были способны
образовывать комплексы с ионами Са2+ и тем самым тормозить развитие патологических процессов.
1.4 Механизмы защиты клеток при действии повышенной
концентрации кальция
Описанные выше патологии, происходящие при повышении концентрации ионов Са2+ оказывают пагубное влияние на организм человека. Встает
вопрос о том, как защитить организм от такого рода влияния. Также известно, что активным является только свободный кальций. Соответственно, для
избежания развития процессов, вызванных высокими концентрациями ионов
Са2+, нужно перевести избыток ионов в неактивное, связанное состояние, то
есть образовать комплекс с ионами. В роли веществ, способных образовывать комплексы с ионами Са2+, можно использовать вещества фенольной
природы – флавоноиды.
Флавоноиды принадлежат к классу полифенольных соединений растительного происхождения. Данные вещества участвуют во многих процессах
43
функционирования клетки. Они играют заметную роль в процессах клеточной сигнализации и сами могут служить в качестве мессенджеров химических сигналов, участвуют в процессах репродукции растений и, в частности,
в процессах развития и функционирования пыльцы, накоплении нектара, в
созревании плодов и семян (Tarahovskya S.Y, Kimb Y.A., Yagolnik E.A. [et al.]
Flavonoid–membrane interactions: Involvement of flavonoid–metal complexes in
raft signaling // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 2014. Vol. 1838. Iss. 5. P.
1235–1246). Одной из многочисленный функций, которые выполняют флавоноиды это участие в защите организма от процессов окислительного стресса,
благодаря выраженной антиоксидантной защите (Andersen O.M., Markham
K.R. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications / U.K.: Teylor &
Francis Group, 2005. 1256 p.)
Фенольные соединения относят к естественным гетероароматическим
соединениям, которые являются вторичными продуктами метаболизма растений. Данные вещества состоят из одного и более ароматических колец, к
которым прикреплены гидроксильные группы (Тараховский Ю.С., Ким
Ю.А., Абдрасилов Б.С., Музафаров Е.Н. Флавоноиды: биохимия, биофизика,
медицина / Пущино: Sуnchrobook, 2013. 310 c.).
Классификация фенольных соединения разнообразна, но одним из
наиболее изученных классов являются флавоноиды – вещества, которые присутствуют во всех тканях растений и представленые огромным разнообразием структурных форм. Каркас молекул флавоноидов содержит 15 атомов углерода, образующих два ароматических кольца (A и B), соединенных через
три углеродных атома. Общую формулу флавоноидов можно представить
следующим образом C6–C3–C6 (Williams С. Healthy eating: clarifying advice
about fruit and vegetables // BMJ. 1995. Vol. 310. Iss. 6992. P. 1453–1455; Азарова О.В., Галактионова Л.П. Флавоноиды: механизмы противовоспалительного действия // Химия растительного сырья. 2012. № 4. С. 61-78).
44
Флавоноиды, как уже было сказано, выполняют различные функции в
организме человека и животных. Однако флавоноиды не могут синтезироваться в организме, а поступают с пищей.
Флавоноиды обладают биологической активностью, которая выражается в антиаллергенном, противовирусном, противовоспалительном и сосудорасширяющим действии. Однако наибольший интерес вызывает их способность к антиоксидантной защите, которая проявляется в их способности
снижать образование активных форм кислорода и препятствовать дальнейшему образованию свободных радикалов (Pietta P.G. Flavonoids as
antioxidants // Journal Natural Products. 2000. Vol. 63. Iss. 7. P. 1035-1042). По
общепринятой точке зрения, флавоноиды способны служить ловушками для
свободных радикалов, а также хелатировать ионы металлов, участвующих в
перекисном окислении. Благодаря способности фенольных соединения отдавать свободный электрон, они способны взаимодействовать с радикалами
липидов (Es-Safi N., Ghidouche S., Ducrot P.H. Flavonoids: Hemisynthesis, Reactivity, Characterization and Free Radical Scavenging Activity // Molecules.
2007. Vol. 12. Iss. 9. P. 2228-2258; Тараховский Ю.С., Ким Ю.А., Абдрасилов
Б.С., Музафаров Е.Н. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина / Пущино: Sуnchrobook, 2013. 310 c.). Предполагается, что в молекулах флавоноидов
имеется три области, в наибольшей степени ответственные за свойство связывания с радикалами (рисунок 1.3): (1) –группа из двух соседних гидроксилов на В-кольце, названая катехольной группой; (2) – 2,3-двойная связь,
конъюгированная с 4-оксо группой, которая предположительно способна
инициировать делокализацию электронов В-кольца; (3) – гидроксильные
группы в положениях 3 и 5, которые осуществляют захват радикалов (Terao
J. Dietary flavonoids as antioxidants // Forum Nutr. 2009. Vol. 61. P. 87-94).
45
Рисунок 1.3 – Молекула кверцетина с указанием групп, в наибольшей степени ответственные за связывание свободных радикалов (Terao J. Dietary
flavonoids as antioxidants // Forum Nutr. 2009. Vol. 61. P. 87-94)
К настоящему времени не предложена общая теория, которая позволяет
объединить структуру флавоноидов с их антиоксидантной активностью.
Также, не учитывая условий эксперимента, неверно утверждать, что одни
флавоноиды более эффективны, чем другие.
Еще одним интересным свойством флавоноидов является способность
хелатировать ионы различных металлов. Флавоноиды связываются с металлами переменной валентности и образовывают с ними комплексы. По мнению ряда авторов хелатирование металлов является эффективной защитой от
окислительных процессов (Mira L., Fernandez M.T., Santos M. [et al.] Interactions of flavonoids with iron and copper ions: a mechanism for their antioxidant
activity // Free Radical Research. 2002. Vol. 36. Iss. 11. P.1199-208; de Souza
R.F., De Giovani W.F. Antioxidant properties of complexes of flavonoids with
metal ions // Redox Report. 2004. Vol. 9. Iss. 2. P. 97-104).
Потенциально молекулы флавоноидов могут иметь несколько сайтов
связывания металлов, положение которых определяется наличием пар распо-
46
ложенных рядом гидроксильных или карбонильных групп. Так, в связывании
могут принимать участие пара 3’- и 4’-гидроксильных групп кольца В. Указанную пару гидроксилов часто называют катехольной группой, хотя эта
группа присутствует не только в катехинах, но и в некоторых других флавоноидах, например, в кверцетине, таксифолине. Кроме того, в связывании металлов могут принимать участие 3-гидроксильная и 4-карбонильная группы
кольца С или 5-гидроксильная и 4-карбонильная группы, принадлежащие
кольцам А и С соответственно (Тараховский Ю.С., Ким Ю.А., Абдрасилов
Б.С., Музафаров Е.Н. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина / Пущино: Sуnchrobook, 2013. 310 c.).
Из описанных выше литературных данных можно предположить, что
флавоноиды способны связывать свободные ионы Са2+, тем самым могут
противодействовать эффектам, вызванным повышенной концентрацией
кальция в крови.
47
Анализируя зарубежную и российскую литературу можно сделать вывод о том, что роль кальция в организме огромна. Ионы этого металла выполняют различные функции в клетке и в организме в целом. Одной из важных функций ионов Са2+ является их участие в реализации клеточного ответа
на различного рода возмущения.
Изменение уровня свободных ионов Са2+ в клетке ведет за собой не
только изменения в морфологических характеристиках клетки, а также вызывает изменения в составе фосфолипидов, формирующих клеточную мембрану, что в свою очередь ведет к нарушению клеточных функций и гибели
клетки.
Одним из механизмов защиты клеток от высоких концентраций кальция могут выступать вещества фенольной природы – флавоноиды. Данные
соединения способны связывать ионы металлов. Учитывая тот факт, что увеличение активности Са-зависимых ферментов происходит при увеличении
концентрации только свободных ионов Са2+, можно предположить, что добавление флавоноидов будет препятствовать увеличению активности Сазависимых ферментных систем, что в конечном итоге будет тормозить развите патологических процессов.
Учитывая выше изложенное, вопрос о действии ионов Са2+ на распределение мембранных фосфолипидов эритроцитов и их участие в регуляции
морфологических характеристик и функций клеток остается открытым.
48
Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИСЛЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объект исследования и постановка опыта
Объектом исследования служили эритроциты крови голубя (Columba
livia). Мы использовали эритроциты цельной крови, отмытые физиологическим раствором. Кровь стабилизировали раствором гепарина (5000 ЕД/мл).
Для получения эритроцитарной массы кровь центрифугировали при 1500 g в
течение 15 мин. После чего надосадочную жидкость удаляли, полученную
эритроцитарную массу промывали физиологическим раствором и разливали
в пробирки по 2 мл. Одну пробирку оставляли без изменений, а в остальные
приливали раствор хлорида кальция, так что бы конечная концентрация
кальция в пробе составляла 3,5±0,17 мМоль. Для ингибирования процессов
вызванных ионами Са2+ использовали флавоноиды, выделенные из плодов
черной смородины (Ribеs nigrum). Далее пробирки помещали в термостат и
инкубировали при температуре 37 0С. Отбор аликвот проводили непосредственно после воздействия, а также через 10, 20, 30 и 40 мин инкубирования.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Экстрагирование фосфолипидов из мембран эритроцитов голубя
После инкубации эритроциты трижды промывали физиологическим
раствором с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 1500
g.
Общие липиды экстрагировали смесью растворителей, состоящей из
хлороформа и метанола (2:1 v/v) по методу Фолча (Хефтман Э., Кастер Т.,
Нидервизер А. Хроматография. Практическое приложение метода. М. : Мир.
49
1986. 336 с). К 1 мл эритроцитарной массы добавляли 10 объемов вышеуказанной смеси растворителей и гомогенизировали, после чего полученную
смесь заливали в пробирки и оставляли на экстракцию в течении 1 часа, затем фильтровали. Для разделения нелипидных водорастворимых примесей в
полученную смесь добавляли 1/4 мл хлороформа и 1/4 мл дистиллированной
воды от общего объема, встряхивали и центрифугировали в течение 15 мин
при 1500 g и температуре 4 0С. В этих условиях происходило деление раствора на 2 фазы: верхняя – водно-метанольная, содержала водорастворимые
компоненты, на границе фаз – белая пленка – протеолипиды, и нижняя – хлороформная, содержала липиды. Нижнюю фазу осторожно отделяли и сливали
в предварительно взвешенную выпаривательную колбу.
Конечный экстракт, в выпаривательной колбе, упаривали на ротационном испарителе ИР-1М3 (Химлаборприбор, Россия), затем высушивали в токе охлажденного азота до постоянного веса. Полученные липиды растворяли
в смеси хлороформ – метанол (2:1 v/v) до концентрации 10 мг/мл. Липиды
хранили при низкой температуре (-20 0С) в атмосфере азота.
2.2.2 Экстрагирование полифосфоинозитидов из мембран эритроцитов
голубя
Поскольку кальций является активным участником фосфоинозитидного пути передачи сигнала, представляло интерес проанализировать изменения, происходящие при действии высокой концентрации ионов Са2+ (3,5
мМоль) фосфоинозитидами (ФИ), содержащимися в мембране эритроцитов.
Инкубацию суспензии эритроцитов вели вышеуказанным методом. Выделение ФИ осуществляли двумя способами.
1 способ: по методу Прохоровой. К остатку тканей оставшихся после
экстракции по Фолчу, прибавляли 10 мл смеси хлороформ: метанол: HClконц.
(200:100:1 v/v). Экстракцию вели в полиэтиленовых пробирках при 37 0С в
течение 20 мин, при постоянном перемешивании. Затем смесь центрифуги-
50
ровали в течение 10 мин при 1500 g, надосадочную жидкость фильтровали, а
осадок дважды подвергали повторной обработке для полного извлечения
фосфоинозитидов. Далее экстракт отмывали от нелипидных примесей. Для
этого в экстракт добавляли 0,2 объема 1Н HCl и встряхивали. После этого
смесь центрифугировали 10 мин при 1500 g, верхнюю водно-метанольную
фазу удаляли, а нижнюю фазу и промежуточный слой промывали один раз
0,2 объемами смеси хлороформ: метанол: 1Н HCl. Полученный экстракт ФИ
выпаривали на ротационном испарителе ИР-1М3 (Химлаборприбор, Россия)
при температуре не выше 37 0С (Ревин В.В., Ревина Э.С., Девяткин А.А.,
Громова Н.В. Роль липидов в функционировании возбудимых биологических
мембран. Саранск. : Изд-во Мордов. ун-та. 2012. 220 с.).
2 способ: экстракция в кислой среде. Так как жирные кислоты и полифосфоинозитиды не удается извлечь полностью смесью хлороформ : метанол, для полной экстракции этих липидов к смеси растворителей добавляли
HClконц до концентрации 0,25 % (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.). Экстракцию проводили аналогично
экстракции фосфолипидов.
2.2.3 Тонкослойная хроматография фосфолипидов и
полифосфоинозитидов и их идентификация
Тонкослойная хроматография (ТСХ) является превосходным методом
для микроаналитического исследования мембран. При правильном подборе
смеси растворителей и определенных условиях с помощью ТСХ разделяются
практически все классы липидов, а специальные реагенты, применяемые после хроматографии, позволяют идентифицировать липиды. Еще одной особенность данного метода является то, что с помощью ТСХ можно разделить
от нескольких микрограммов до нескольких граммов исследуемого вещества.
Для хроматографического разделения ФЛ и ФИ использовали готовые
пластинки HPTLC Silikagel 60 F254 (Merck, Германия) размером 20х10 см. Пе-
51
ред использованием пластинки помещали в камеру со смесью растворителя
хлороформ : метанол (2:1, v/v), и извлекали из камеры когда от фронта растворителя до верхнего края пластины оставалось 0,3 см. После чего пластинки сушили до исчезновения запаха растворителя и прогревали в течение 20
мин при температуре 110–120 0С.
Образцы ФЛ, предназначенные для разделения наносили в виде полосы
по 15 мкл на расстоянии 1 см от нижнего края пластины с помощью автоматического автосемплера Automatic TLC – Sampler 4 (Gamag, Швейцария). На
одной пластине размещали до 8 образцов. Для одномерного разделения ФЛ
хроматографию проводили в системе растворителей следующего состава:
хлороформ : метанол : ледяная уксусная кислота : вода (50:25:8:4, v/v) (Сикорская А.С., Назарова А.А., Селеменев В.Ф. Подбор условий разделения
фосфолипидных комплексов, полученных из семян подсолнечника // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. Вып. 2. С. 215-220).
Разделение проводили в хроматографической камере 20х20 см. Стенки камеры выстилали изнутри фильтровальной бумагой, которую пропитывали растворителем для ускорения насыщения камеры. Систему растворителей в камере готовили, по крайней мере, за 1 час до проведения хроматографии, для
чего в нее заливали достаточное количество растворителя. Обязательным
условием хроматографирования является герметичность камеры. В одну камеру одновременно помещали не более двух пластинок, причем так, чтобы
поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга.
Разделение заканчивали, когда от фронта растворителя до верхнего края пластины оставалось 0,5 см. Пластину вынимали из камеры и высушивали до
исчезновения запаха растворителей.
Для разделения ФИ использовали систему растворителей состоящую из
следующих растворителей: хлороформ : метанол : аммиак : вода (48:40:5:10,
v/v) (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир.
1990. 424 с.).
52
Образцы ФИ наносили в количестве 20 мкл на пластинки в виде полосы длинной 1 см, разделение проводили аналогично с разделением ФЛ.
Основным компонентом метаболизма ПФИ является диацилглицерол
(ДАГ). Накопление ДАГ анализировали методом ТСХ анализа в системе растворителей гептан : диэтиловый эфир : ледяная уксусная кислота (60:40:2 v/v)
(Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990.
424 с.).
Для обнаружения ФЛ и ФИ использовали метод, основанный на окрашивании их парами йода, он удобен благодаря своей быстроте, универсальности и отсутствию разрушающего действия на липиды (Финдлей Дж., Эванз
Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.).
Высушенные пластины помещали в эксикатор, содержащий кристаллы
йода, который заранее готовили и держали в теплом месте для насыщения
его парами йода. Окрашивание длилось от нескольких минут до нескольких
часов в зависимости от количества ФЛ. ФЛ и ФИ обнаруживались в виде коричнево-желтых пятен или полос, которые осторожно очерчивали мягким
карандашем или обкалывали иглой.
Также обнаружение разделенных ФЛ и ФИ проводили, используя универсальный реактив Васьковского (Васьковский В.Е. Состав и обмен полярных липидов морских организмов : дис. … д-р. биол. наук : Владивасток.,
1984. 323 с.; Кадималиев Д.А. Изучение липидного состава в соматических
нервах при возбуждении : дис. … канд. биол. наук : Москва, 1985. 155 с.; Ревин В.В., Ревина Э.С., Девяткин А.А., Громова Н.В. Роль липидов в функционировании возбудимых биологических мембран. Саранск. : Изд-во Мордов.
ун-та. 2012. 220 с.). Для этого получали исходный реагент А: к 10 г натрия
молибденовокислого в 60 мл 4Н HCI добавляли 0,4 г солянокислого гидразина в 14 мл 4Н HCl. Смесь нагревали на водяной бане в течение 20 мин, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Используемый для количественного
определения ФЛ реагент В готовили следующим образом: к 4 мл исходного
53
реагента А добавляли 26 мл 1Н серной кислоты. Доводили объем до 100 мл
дистиллированной водой. Для опрыскивания пластин готовили реагент С,
добавляя к 1 объему исходного реагента А 7 объемов 7Н серной кислоты.
Пятна ФЛ и ФИ на пластинке окрашивались в голубой цвет.
Для обнаружения аминосодержащих ФЛ использовали нингидриновый
реактив (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. :
Мир. 1990. 424 с.). Хроматографические пластинки опрыскивали 0,25 % раствором нингидрина в ацетоне. Аминосодержащие липиды обнаруживались в
виде розово-фиолетовых пятен через 1-2 часа при комнатной температуре и
через 15 мин при нагревании до 100 0С.
Холинсодержащие ФЛ обнаруживали с помощью реагента Драгендорфа, который готовили следующим образом (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.): раствор 1: 1,72 г нитрата
висмута растворяли в 100 мл 20% ледяной уксусной кислоты; раствор 2: 10 г
йодистого калия растворяли в 25 мл воды; 20 мл раствора 1 и 5 мл раствора 2
смешивали с 70 мл дистиллированной воды.
Пластинки перед опрыскиванием тщательно сушили. Пятна после
опрыскивания пластин окрашивались в оранжевый цвет. Для ускорения
окрашивания пластинку нагревали до температуры 100 0С.
2.2.4 Количественное определение ФЛ и ФИ
Для количественной оценки ФЛ использовали денситометрический метод (Handloser D., Widmer V., Reich E. Separation of Phospholipids by HPTLC –
An Investigation of Important Parameters // Journal of Liquid Chromatography &
Related Technologies. 2008. Vol. 31. P. 1857-1870). Реактив для окрашивания
готовили следующим образом: 20 г сульфата меди растворяли в 200 мл дистиллированной воды. Добавляли 8 мл серной кислоты 98 % и 8 мл ортофосфорной кислоты 85 %. Пластинку с помощью прибора для иммерсии опуска-
54
ли в краситель на 6 секунд, после чего сушили на воздухе, а затем нагревали
на плитке при 120 0С в течение 30 мин.
Детектирование проводили с помощью денситометра TCL Scaner 3
(Gamag, Щвейцария) в режиме поглощения при 360 нм с дейтериевой лампой
и программным обеспечением winCATS.
Также для количественного определения ФЛ и ФИ использовали метод
Васьковского (Васьковский В.Е. Состав и обмен полярных липидов морских
организмов : дис. … д-р. биол. наук : Владивасток., 1984. 323 с.). Для определения количества индивидуальных ФЛ проявившиеся пятно каждого
ФЛ соскабливали с пластинки и помещали в отдельную стеклянную пробирку, куда добавляли 0,062 мл 72 % хлорной кислоты. Помещали пробирки
в дюралевый блок и сжигали при 180–190 0С в течение 50 минут. После
охлаждения добавляли по 0,45 мл универсального реагента Васьковского
(реагент В) способ приготовления которого описан выше.
Пробы тщательно перемешивали и нагревали в течение 15 минут на
кипящей водяной бане. Силикагель удаляли центрифугированием, затем
определяли оптическую плотность растворов при длине волны 815 нм на
спектрофотометре UVmini-1240 (Shimadzu, Япония).
Используя стандартные растворы КН2РО4, содержащие фосфат в интервале от 0 до 3,0 мкг, строили калибровочную кривую. При определении
содержания фосфора стандартные образцы сжигали без центрифугирования.
Количество ФЛ (в мкг), содержащееся в сожженном образце, определяли с
помощью калибровочной кривой непосредственно по результатам измерений оптической плотности. Для определения количества фосфора в суммарном липидном экстракте отбирали аликвоту липидного раствора с известной
концентрацией, испаряли растворитель, определяли фосфор аналогично
описанной выше методике, исключая стадию центрифугирования.
55
2.2.5 Исследование морфометрических характеристик эритроцитов
голубя с помощью лазерного интерференционного микроскопа (ЛИМ)
Метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) основан на
явлении интерференции лазерного излучения. На рисунке 2.1 показана принципиальная схема приборов для исследования объектов методом ЛИМ.
Рисунок 2.1 – Принципиальная схема интерферометра: L – источник света,
лазер; S – полупрозрачное зеркало; D – детектор; M1 – зеркало с объектом;
M2 – эталонное зеркало (Nadiya A. Brazhe, Liudmila A. Erokhova The relation
of different-scale membrane processes under nitric oxide influence // Journal of
Biological Phisics. 2005. Vol. 31. Р. 533-546).
В данной схеме луч лазера, являющегося источником освещения, проходя через полупрозрачное зеркало (S) разделяется на два луча. Первый луч
(1) отражается от эталонного зеркала (М2) и проходит на детектор (1′). Второй луч, отражаясь от полупрозрачного зеркала направляется на объект (2),
после чего отражается от зеркала (М1) и направляется в детектор (2′). В детекторе эти два луча интерферируют между собой. Поскольку лучи проходят
через разные оптические среды, они имеют разную скорость продвижения, т.
56
е. происходит сдвиг фазы. Таким образом, за одно и то же время лучи проходят различный оптический путь.
Прибор, построенный по данной схеме, позволяет регистрировать оптическую разность хода лучей, тем самым это позволяет нам получить значение фазовой высоты в точке по уравнению 1:
(1)
где Ф – фазовая высота в точке;
Ф0 – постоянный фазовый сдвиг;
λ – длина волны лазера (в нашем случае 650 нм);
ϕо – сдвиг фазы лазерного луча;
ϕobj – сдвиг фаз возникающий, в результате прохождения лазерного луча
через объект.
С другой стороны фазовая высота зависит от показателя преломления
и высоты объекта. Тем самым фазовая высота может быть описана следующей формулой (2):
(2)
где ns – показатель преломления раствора;
nobj (x,y,z) – показатель преломления объекта в точке с координатами (х,
у) и высотой z.
Как видно из формулы 2 значение фазовой высоты зависит только от
показателя преломления объекта в данной его точке. Это означает, что по изменению фазовой высоты мы можем судить о различных физиологических
процессах, происходящих в биологическом объекте (Brazhe A.R. Brazhe N.A.
57
Non-invasive study of nerve fibres using laser interference microscopy // Phil.
Trans. R. Soc. A. 2008. Vol. 366. Р. 3463-3481).
Помимо увеличения контраста и разрешения лазерная интерференционная микроскопия позволяет количественно и качественно оценить изменения показателя преломления и толщины биологических объектов, пропорциональные оптической плотности образцов, то есть, используя ЛИМ, можно
получать функциональные изображения объектов, аналогично атомносиловой микроскопии.
Изучение морфометрических характеристик эритроцитов голубя проводили с помощью лазерного интерференционного микроскопа МИИ-4М,
разработанный компанией «Лаборатории Амфора» (Москва, Россия). В работе мы использовали лазер с длинной волны 650 нм, объектив с увеличением
х33,4 и числовой апертурой 0,65.
После инкубации с раствором CaCl2, пробы отмывали от остатков раствора. Исследуемые образцы, разбавленные в 10 раз, наносили на специальное предметное стекло с зеркальной поверхностью и помещали под объектив
микроскопа. Обработку интерференционных изображений проводили с помощью программы fiji-win32. С помощью данной программы проводили регистрацию значений площади эритроцитов и максимальную разность хода.
Дальнейший анализ результатов производили с помощью программ Microsoft
Office Excel 2013 и OriginPro 8.1.
2.2.6 Изучение состояния мембран эритроцитов голубя методом
спектроскопии комбинационного рассеяния
Спектроскопия комбинационного рассеяния или Рамановская спектроскопия – это вид спектроскопии, в основе которого лежит явление неупругого рассеяния света. Данное явление было экспериментально открыто
индийским физиком Чандрасекхара Венката Раман в 1928 году. Суть данного
явления заключается в том, что при облучении объекта лазерным, монохро-
58
матическим излучением происходит рассеяние света, причем в спектре рассеянного излучения будут появляться спектральные линии, которых не было
в возбуждающем свете.
Данный вид спектроскопии получил большое распространение в аналитических лабораториях для анализа структуры объектов. Рамановская
спектроскопия имеет ряд преимуществ по сравнению с другими аналитическими методами – это простота пробоподготовки и большой объем получаемой информации. Отличительной способностью данного метода является не
разрушаемость образца.
Метод комбинационного рассеяния (КР) широко применяется для
анализа биологических объектов. По данным спектров и по отношениям интенсивностей полос при определенных частотах можно судить как о характеристиках вещества, так и об изменениях происходящих в структуре исследуемого образца.
В нашей работе мы исследовали КР-спектры полученные от мембран
эритроцитов голубя и от целых клеток.
Исследуемые образцы наносили тонким слоем на предметное стекло и
помещали на столик микроскопа. КР-спектр снимали с помощью микроскопа
in Via Raman Microscope (Renishaw, Англия), с использованием лазера с длиной волны излучения 532 нм, мощность излучения 5 мВт, объектив х5.
КР-спектр липидов имеет характеристические частоты, которые отображают свойства мембраны. Так пики области 2800 – 2885 см-1 характеризуют симметричные и ассиметричные колебания алкильной цепи липидов. Для
анализа мы использовали отношение интенсивностей при 2885 см-1 и 2845
см-1, так как это отношение показывает меру чувствительности к количеству
гош перегибов в алкильных цепях и сопутствующие уменьшения латеральных взаимодействий цепь-цепь (т.е. их текучесть) (Rinia H.A., Buger N.J.
Koert, Bonn M. Quantitative label – free imaging of lipid composition and packing
of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy // Biophysical Journal. 2008. Vol. 95. Р. 4908-4914; Fu Y. Paranodal myelin retraction in re-
59
lapsing experimental autoimmune encephalomyelitis visualized by coherent antiStokes Raman scattering microscopy // Journal of Biomedical Optics. 2011. Vol.
16. Iss. 10. Р. 1-10).
Методом КР-спектроскопии была исследована степень насыщенности
липидов мембран. Степень насыщенности анализировали с помощью отношения интенсивностей при 1650 см-1 и 1450 см-1. Интенсивность при частоте
1650 см-1 прямо пропорциональна количеству двойных связей С=С, а интенсивность при частоте 1450 см-1 может быть использована в качестве меры количества суммарных жирных кислот в образце (Rinia H.A., Buger N.J. Koert,
Bonn M. Quantitative label – free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy // Biophysical
Journal. 2008. Vol. 95. Р. 4908-4914; Fu Y. Paranodal myelin retraction in relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis visualized by coherent antiStokes Raman scattering microscopy // Journal of Biomedical Optics. 2011. Vol.
16. Iss. 10. Р. 1-10).
Полученные спектры обрабатывали с помощью программы OriginPro
8.1.
2.2.7 Изучение повреждений ДНК эритроцитов голубя при помощи
метода «ДНК-комет»
В первые метод «ДНК-комет» (DNA-comet assay) был описан Ostling и
Johansson в 1984 г. (Ostling O. Microelectrophoretic study of radiation-induced
DNA damage in individual mammalian cells // Biochem Biophys Res Commun.
1984. Vol. 123. Р. 291–298). Преимуществами данного метода является быстрота и высока чувствительность к регистрации повреждений ДНК и изучения
репарации ДНК на уровне одиночных клеток. Усовершенствования и модификации метода «ДНК-комет» позволили значительно повысить его чувствительность и расширить сферу применения, однако практически не затронули
основные принципы, положенные в его основу.
60
Данный метод применим для регистрации апоптотических клеток. Известно, что в клетках, гибнущих по механизму апоптоза, ДНК, как правило,
претерпевает межнуклеосомную деградацию, являющуюся характерным
маркером процесса. Апоптотические клетки имеют вид слабо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой» (Сорочинская У.Б. Применение метода ДНК-комет для
оценки повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей
среды // Онкология. 2008. Том. 10. № 3. С. 303-309). Использование метода
«ДНК-комет» для регистрации апоптотических клеток в популяциях особенно актуален в случае, когда доступным является только небольшое количество образца. С помощью метода «ДНК-комет» удается получать информацию не только о содержании ДНК в апоптотических клетках, но и о размерах
фрагментов ДНК, вышедших из клетки при действии электрического поля
(Сорочинская У.Б. Применение метода ДНК-комет для оценки повреждений
ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды // Онкология.
2008. Том. 10, № 3. С. 303-309; Мороз В.В., Мягкова Е.А., Жанатаев А.К. [и
др.] Повреждение ДНК и процессы клеточной гибели лейкоцитов у пострадавших с тяжелой травмой // Общая реаниматология. 2014. Том. 10. Вып. 4.
С. 11-36).
Эксперимент по регистрации повреждений молекул ДНК ядер эритроцитов голубя вели следующим образом. Суспензию эритроцитов разводили до концентрации 500 тыс. клеток/мл, затем смешивали с нормоплавкой
агарозой 1:1, наносили на предметное стекло со слоем легкоплавкой агарозы,
накрывали покровным стеклом и помещали на 10 мин в холодильник. Готовили лизирующий раствор: 2.5 Mоль NaCl, 100 мMоль ЭДТА, 20 мMоль
Трис-HCl, NaOH до pH 10,0 добавляли 0,5 мл Triton X-100 и 5 мл диметил
сульфоксида (DMSO), который перед использованием хранили в холодильнике.
Через 10 мин стекла извлекали из холодильника, снимали покровные
стекла и помещали в лизирующий раствор. После этого стекла помещали в
61
камеру для горизонтального электрофореза, заполненную щелочным буфером (300 мМоль NaOH, 1 мMоль ЭДТА, рН 13.0).
Электрофорез проводили в течение 15 мин при 21 В (300 мА) (Christofoletti1 C.A. Application of the comet assay in erythrocytes of Oreochromis niloticus (Pisces): A methodological comparison // Genetics and Molecular Biology.
2009. Vol. 32 Iss. 1. P. 155-158). После электрофореза стекла сушили на фильтровальной бумаге, обрабатывали 0,4 Моль Трис-HCl (рН 7,7), затем промывали Н2Одис. и обрабатывали спиртом.
Визуализацию полученных «комет» проводили при помощи красителя
акридинового оранжевого (Sigma Aldrich, США). Микроскопический анализ
«комет» проводили с использованием люминесцентного микроскопа Axio
Imager 2.0 (Carl Zeiss, Германия) при зеленом светофильтре. Количественные
расчеты параметров «комет» проводили при помощи компьютерной программы Comet Imager 2.0.
Дополнительно повреждения клеточного ядра исследовали с помощью красителя Хехст 3342 (Sigma Aldrich, США). Данный краситель накапливается в клетках с поврежденной мембраной и интенсивность его флуоресценции будет больше относительно клеток с неразрушенной мембраной.
Микрофотографии получали с помощью флуоресцентного микроскопа Axio
Imager 2.0 (Carl Zeiss, Германия). Для количественной оценки клеток с поврежденной ДНК использовали апоптотический индекс (АИ), который рассчитывали по формуле 3 (Залесский В.Н. Методы ранней диагностики
апоптоза in vitro и in vivo для оценки хронических эффектов токсикантов //
Современные проблемы токсикологии. 2006. Том. 1. C. 78-82; Longsdon M.D.,
Meyn R.E., Besa P.S. [et al.] Apoptosis and BcI-2 gene family patterns of expression and prognostic value in stage I and II follicular center lymphoma // Int. J. Radiat. Oncol, Biol. Phys. 1999. Vol. 44. Iss. 2. P. 19-29):
(3)
62
где n – количество клеток с поврежденной ДНК;
N – общее количество клеток.
2.2.8 Определение внутриклеточной концентрации кальция с помощью
красителя Fura Red
Для исследования внутриклеточной концентрации ионов Са2+ широко
применяются специфичные кальциевые индикаторы. Применение данных
индикаторов основано на том, что они способны изменять характер флуоресценции в присутствии специфичных к этому индикатору молекул или ионов,
в данном случае ионов Са2+ (Захаров Ю.Н., Ершова А.В. Количественное
определение содержания ионов кальция по изменениям флуоресценции одноволновых красителей с помощью лазерной сканирующей микроскопии //
Оптический журнал. 2011. Том 78. Вып. 10. С. 36-37).
Все имеющиеся кальциевые красители можно разделить на две группы. К первой группе красителей можно отнести те красители, спектр эмиссии
которых способен изменяться в зависимости от концентрации ионов Са 2+
(например, Indo-1 и Fura-2). Ко второй группе красителей относят красители,
которые имеют в своем составе флуоресцеин или родамин. Красители второй
группы возбуждаются источником видимого света и интенсивность флюоресценции возрастает или снижается пропорционально увеличению или снижению концентрации свободных ионов Са2+ (например, Fluo-3, Fluo-4 и
Rhod-2) (Кудрявцев И.В., Зурочка А.В., Хайдуков С.В. [и др.] Современные
методы оценки фагоцитов в экспериментальной биологии // Российский иммунологический журнал. 2012. Том 6 (14). № 3 (1). С. 3-20).
В нашей работе мы использовали краситель Fura Red (Sigma Aldrich,
США), который возбуждается видимым светом и по своей структуре и химическому составу схож с красителем Fura-2 (Takahashi A., Camacho P., Lechleiter J.D. [et al.] Measurement of intracellular calcium // Physiological Reviews.
63
1999. Vol. 79. Iss. 4. P. 1089-1125). Данный краситель применяется при ратиометрических измерениях внутриклеточной концентрации ионов Са2+.
Возбуждается светом с длинной волны 436 и 473 нм, максимум эмиссии
наблюдается при 655 и 670 нм, в присутствии ионов Са2+ и в безкальциевой
среде соответственно (Кудрявцев И.В., Зурочка А.В., Хайдуков С.В. [и др.]
Современные методы оценки фагоцитов в экспериментальной биологии //
Российский иммунологический журнал. 2012. Т. 6 (14). № 3 (1). С. 3-20).
В эритроцитах проинкубированных с хлоридом кальция изучали содержание внутриклеточного кальция с использованием красителя Fura Red
(Sigma Aldrich, США). Полученные образцы отмывали от остатков инкубационного раствора центрифугированием при 1500 g. После центрифугирования эритроциты разводили до 1% гематокрита при 37 0С, в суспензию эритроцитов добавляли 0,5 мМоль Fura red, затем инкубировали в течение 45 мин
при 37 0С. После инкубации добавляли по 3 мл в кварцевую кювету для флуоресцентных измерений. Для получение флуоресцентных спектров использовали спектрофлюорофотометр RF-5301 PC (Shimadzu, Япония). Концентрация Са2+ определялась по формуле 4 (Kucherenko Y.V., Weiss E., Bernhardt I.
Effect of the ionic strength and prostaglandin E2 on the free Ca2+ concentration
and the Ca2+ influx in human red blood cells // Bioelectrochemistry. 2004. Vol. 62.
Iss. 2. P. 127-133; Бережнов А.В., Зинченко В.П., Федотова Е.И. [и др.] Применение флуоресцентной микроскопии в исследованиях динамики Са2+ в
клетках / Пущино, 2007. 65 с.; Хазиев Э.Ф. Изменение кальциевого транзиента в двигательном нервном окончании под действием холинергических агентов : дис. … канд. биол. наук : Казань, 2015. 130 с.):
(4)
где Kd – константа диссоциации Ca2+-индикатора;
64
R – экспериментально измеренные интенсивности флуоресценции при
420 нм и 460 нм;
Rmin – измеренные интенсивности флуоресценции в отсутствии Ca2+;
Rmax – измеренные интенсивности флуоресценции в присутствии насыщающего красителя концентрации ионов Са2+.
2.3 Математическая и статистическая обработка результатов
Все результаты получены не менее чем в трёх последовательных опытах, каждый из которых состоял из 3–5 повторностей. Результаты обрабатывали статистически по общепринятым методам в биологических исследованиях (Härdle W., Mori Y., Vieu Ph. Statistical methods for biostatistics and related
fields. Germany : Berlin Springer–Verlag, 2007. 372 p.). Полученные экспериментальные данные подвергали статистической обработке с использованием
электронных таблиц Microsoft Excel 2013, Statistica 8 и OroginPro 8.1. Сравнение вариантов опытов проводили при 5% уровне значимости по tкритерию Стьюдента. Далее в главах представлены средние значения из всех
опытов со стандартными ошибками.
65
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1 Исследование изменений внутриклеточной концентрации Са2+ в
эритроцитах
Ионы Са2+ играют важную роль в регуляции многих физиологических
процессов. Кальций в крови может находиться в двух основных состояниях:
связанном с белками плазмы и свободном. Связанный кальций не участвует в
реакциях, свободный, наоборот принимает активное участие в реализации
многих клеточных функций (Bogdanova A., Makhro A, Wang J. [et al.] Calcium
in Red Blood Cells – A Perilous Balance // International Journal of Molecular Sciences. 2013. 14. P. 9848-9872). Повышение концентрации свободного кальция
может активировать различного рода ферменты, например увеличение концентрации до 10-5 Моль может приводить к ингибированию Na+K+-АТФазы
(Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцита. Влияние патологии. // Биомедицинская химия. 2005. Т. 51. Вып. 2. С. 118-126) или к увеличение активности фосфолипазы С (Ruwhof C., van Wamel J.E.T., Noordzij
L.A.W. Mechanical stress stimulates phospholipase C activity and intracellular
calcium ion levels in neonatal rat cardiomyocytes // Cell Calcium. 2001. Vol. 29.
Iss. 2. Р. 73-83). Это одни из некоторых изменений в работе клетки, к которым приводит повышение уровня свободных ионов Са2+.
Общий уровень ионов Са2+ в эритроцитах может достигать 5,7
мкМоль, а базальный уровень свободного кальция у здоровых людей колеблется в пределах от 30 до 60 нМоль (Bogdanova A., Makhro A, Wang J. [et al.]
Calcium in Red Blood Cells – A Perilous Balance // International Journal of Molecular Sciences. 2013. Vol. 14. P. 9848-9872). Концентрацию свободного кальция можно измерить разными методами, наиболее удобный и чувствительный метод основан на использовании различного рода Са-специфических
66
красителей. Такой метод определения концентрации кальция очень популярень в исследовательских лабораториях.
Для исследования динамики содержания кальция в эритроцитах голубя при действии повышенной концентрации ионов Са2+ в инкубационной
среде мы использовали флуоресцентный краситель Fura Red (Sigma Aldrich,
США).
Результаты, полученные в ходе эксперимента, представлены на рисунке 3.1. Как можно видеть из полученных данных начальная внутриклеточная концентрация ионов Са2+ ([Ca2+]i) в контрольном образце составляла
62,4±3,32 нМоль. При увеличении времени инкубирования в контрольном
образце происходит снижение уровня [Ca2+]I. Наиболее интенсивный выход
ионов Са2+ происходит в течение 10 мин. В этом случае потери ионов Са2+
составляют 46 % от первоначальной величины и данная тенденция сохраняется в последующие 20 и 30 мин (рисунок 3.1).
Рисунок 3.1 – Изменение внутриклеточной концентрации свободных ионов
Са2+ в эритроцитах
67
Из литературных данных известно, что концентрация ионов Са 2+ внутри клетки очень мала по сравнению с внеклеточной средой (Ruwhof C., van
Wamel J.E.T., Noordzij L.A.W. Mechanical stress stimulates phospholipase C activity and intracellular calcium ion levels in neonatal rat cardiomyocytes // Cell
Calcium. 2001. Vol. 29. Iss. 2. Р. 73-83; Bogdanova A., Makhro A, Wang J. [et
al.] Calcium in Red Blood Cells – A Perilous Balance // International Journal of
Molecular Sciences. 2013. Vol. 14. P. 9848-9872). Исходя из этого, можно
предположить, что такое изменение концентрации ионов Са 2+ в контрольном
образце происходит из-за выхода свободных ионов Са2+ во внеклеточную
среду по градиенту концентрации для поддержания физиологически нормального состояния эритроцитов.
В следующей серии экспериментов эритроциты инкубировали в аналогичной среде, но с добавлением такого количества раствора СаCl2, чтобы конечная концентрация ионов Са2+ в среде составила 3,5 мМоль. Результаты
эксперимента показали, что в первые 10 мин инкубации эритроцитов в среде,
содержащей повышенную концентрацию ионов Са2+, также происходят потери внутриклеточного кальция. Однако выход Са2+ в этом варианте опыта на
16% меньше в сравнении с аналогичным временным интервалом в первом
эксперименте (рисунок 3.1).
При увеличении времени инкубации до 20 мин мы наблюдали рост концентрации кальция в опытной пробе. Наибольшее увеличение внутриклеточной концентрации кальция наблюдалось по истечении 30 мин инкубации. Так
значение концентрации в опытной пробе превысело в 2,8 раз контрольное
значение.
Мы предполагаем, что такой характер зависимости содержания ионов
Са2+ в эритроцитах в опытных образцах объясняется тем, что происходит
насыщенние Са-связывающих белков и ферментных систем.
Полученные результаты свидетельствую о том, что внутриклеточная
концентрация ионов Са2+ зависит от внеклеточного содержания кальция,
68
причем процесс увеличения внутриклеточной концентрации кальция является нелинейным процессом.
3.2 Исследование фосфолипидного и фосфоинозитидного состава
мембран эритроцитов при действии повышенной концентрации ионов
Са2+
3.2.1 Исследование фосфолипидного состава мембран эритроцитов
Ионы Са2+ участвуют в реализации многих физиологических процессов. В работе Berridge M.J. показано, что изменения внеклеточной концентрации кальция могут влиять на метаболизм полифосфоинозитидов и фосфатидной кислоты, тем самым изменяя свойства плазматической мембраны
эритроцитов (Berridge M.J., Bootman M.D., Roderick H.L. Calcium signaling:
dynamics, homeostasis and remodeling // Molecular Cell Biology. 2003. Vol. 4.
Iss.7. P. 517-529). В литературе имеются данные о том, что ионы Са2+ влияют
на асимметричное расположение мембранных фосфолипидов через ингибирование различных фосфолипид-транспортных ферментов (Bevers E.M.,
Comfurius P., Zwaal R.F.A. Changes in membrane phospholipid distribution during platelet activation // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 1983. Vol. 736. P.
57-66; Bitbol M., Fellmann P. Zachowski A. [et al.] Ion regulation of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine outside-inside translocation in human
erythrocytes // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 1987. Vol. 904. P. 268-282;
Comfurius P., Senden J.M.G., Roland H.J.T. [et al.] Loss of membrane phospholipid asymmetry in platelets and red cells may be associated with calcium-induced
shedding of plasma membrane and inhibition of aminophospholipid translocase //
Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 1990. Vol. 1026. P. 153-160; Костин Д.Г.,
Козлова Н.М., Слобожанина Е.И. [и др.] Изменение асимметрии липидов и
транспорта коньюгатов глутатиона в эритроцитах человека под влиянием
ионов кальция // Биофизика. 2004. Т. 49. Вып. 4. С. 685-691). Ионы Са2+ вли-
69
яют и на работу Са-зависимых фосфолипаз (Smith S.K., Farnbach A.R., Harris
F.M. [et al.] Mechanisms by which intracellular calcium induces susceptibility to
secretory phospholipase A2 in human erythrocytes // The journal of biological
chemistry. 2001. Vol. 276. Iss. 25. P. 22732–22741; Vest R.S., Gonzales L.J.,
Permann S.A. [et al.] Divalent Cations Increase Lipid Order in Erythrocytes and
Susceptibility to Secretory Phospholipase A2 // Biophysical Journal. 2004. Vol. 86.
P. 2251-2260).
В связи с этим можно утверждать, что колебание уровня ионов Са2+ является одним из механизмов регуляции ФЛ состава мембран эритроцитов.
Для выяснения роли ионов Са2+ в изменении состава ФЛ мы провели серию опытов, в которых анализировали количественное распределение липидов методом ТСХ. Идентификацию ФЛ проводили с помощью литературных
значений Rf и по специфическим реакциям.
В контрольной пробе нам удалось идентифицировать такие ФЛ как:
ЛФХ (Rf=0.17), СМ (Rf=0.37), ФХ (Rf=0.57), ФЭА (Rf=0.87). Поскольку пятна
ФИ и ФС находились на хроматограмме вместе, мы считали сумму этих
фракций (Rf=0.65) (рисунок 3.2).
а
б
Рисунок 3.2 – Хроматограмма (а) и денситонограмма (б) фосфолипидов
контрольного образца
70
В контрольной пробе содержание ЛФХ практически не изменялось с
течением времени и составляло 0,27±0,01 мкг Р/ мг ФЛ (рисунок 3.3). Лишь к
30 мин инкубирования содержание ЛФХ в контрольной пробе увеличилось
на 7% по сравнению с начальным значением.
В пробе, инкубируемой в присутствии повышенной концентрации
кальция, содержание ЛФХ в начальный момент времени составило 0,3±0,015
мкг Р/ мг ФЛ, что на 11% превышало контрольное значение. При увеличении
времени инкубации до 10 мин происходило дальнейшее увеличение содержания ЛФХ, которое стало больше на 19% относительно контрольного значения. Дальнейшее увеличение времени инкубирования приводило к продолжающемуся росту содержания данной фракции, который достиг максимального значения через 40 мин инкубации. (Количество ЛФХ в опытной
пробе было на 48 % больше относительно контрольной пробы.)
Можно предположить, что увеличение содержания ЛФХ в пробе, инкубируемой в присутствии высокой концентрации ионов Са2+, обусловлено
активацией Са-зависимых фосфолипаз.
Рисунок 3.3 – Изменение содержания фракции ЛФХ при действии
повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
71
Также в нашем эксперименте мы наблюдали увеличение содержания
СМ (рисунок 3.4).
Рисунок 3.4 – Изменение содержания фракции СМ при действии
повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
В контрольном образце содержание СМ в начальный момент времени
инкубирования составляло 0,91±0,02 мкг Р/ мг ФЛ. В течение всего времени
инкубирования содержание СМ в контрольном образце практически не изменялось (рисунок 3.4). В опытной пробе содержание СМ в начальный момент
времени было больше контрольного значения на 8 % и составляло 0,98±0,03
мкг Р/ мг ФЛ. Увеличение времени инкубирования суспензии эритроцитов в
среде с повышенным содержанием кальция приводит к дальнейшему увеличению содержания СМ. Максимальное увеличение СМ было зафиксировано
через 40 мин инкубирования. При этом содержание СМ на 21% превышало
контрольное значение.
По литературным данным, увеличение содержания СМ в мембранах
клеток может свидетельствовать об увеличении микровязкости мембранного
бислоя (т.е. уменьшению его текучести) (Ли В.С., Халилов Э.М., Сабуров
В.И. [и др.] Липидный состав и структурно- функциональные свойства мем-
72
бран эритроцитов разного возраста // Вопр. мед. химии. – 1982. – Т.28. Вып.
6. – С. 66-71; Al-Makdissy N., Younsi M., Pierre S. [et al.] Sphingomyelin/cholesterol ratio: an important determinant of glucose transport mediated by
GLUT-1 in 3T3-L1 preadipocytes // Cell Signal. 2003. Vol. 15. Iss. 11. P. 10191030; Ишутина Н.А. Зависимость микровязкости мембран эритроцитов от
фосфолипидного состава при беременности, осложненной герпес-вирусной
инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2008. Вып. 28. С.
25-28). Соответственно, можно сделать вывод о том, что увеличение в среде
инкубирования концентрации свободных ионов Са2+ приводит не только к
изменению состава ФЛ мембран, а также к изменению свойств мембранного
бислоя, а именно к увеличению микровязкости.
Следующая фракция, которую нам удалось идентифицировать была
фракция ФХ. Содержание ФХ в контрольной пробе составляло 1,0±0,05 мкг
Р/ мг ФЛ (рисунок 3.5).
Рисунок 3.5 – Изменение содержания фракции ФХ при действии
повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
73
В контрольном образце содержание ФХ в течение эксперимента незначительно уменьшалось. По прошествии 40 мин инкубации содержание
ФХ в контрольной пробе составляло 0,92±0,02 мкг Р/ мг ФЛ, что на 7 %
меньше относительно начального значения.
Инкубация эритроцитов в среде с повышенным содержанием кальция
приводила к снежению уровня ФХ до 0,84±0,04 мкг Р/ мг ФЛ (на 13 % меньше контрольного значения в начальный момент времени инкубирования)
(рисунок 3.5). Увеличение времени инкубирования приводило к дальнейшему уменьшению содержания ФХ. Максимальное уменьшение содержания
ФХ в пробе инкубируемой в среде с повышенным содержанием кальция было зафиксировано при 40 мин инкубации. При этом содержание ФХ уменьшалось на 37% по сравнению с контрольным значением.
Можно предположить, что уменьшение доли ФХ свидетельствует о
том, что высокая концентрация ионов Са2+ активирует Са-зависимые фосфолипазы. Об этом так же говорит и увеличение содержания лизоформ ФХ.
На следующем этапе мы проводили анализ содержания ФЭА в опытной и контрольной пробах (рисунок 3.6).
Рисунок 3.6 – Изменение содержания фракции ФЭА при действии
повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
74
Содержание ФЭА в контрольном образце в начальный момент времени инкубирования составляло 0,83±0,03 мкг Р/ мг ФЛ. Во время эксперимента количество данной фракции незначительно уменьшалось и в конечный
момент времени инкубирования составило 0,77±0,03 мкг Р/ мг ФЛ, то есть
93% от начального значения (рисунок 3.6).
В опытной пробе при добавлении высокой концентрации кальция в
среду инкубирования количество ФЭА составило 0,74±0,02 мкг Р/ мг ФЛ, то
есть в начлаьный момент времени инкубирования было меньше значения количества ФЭА контрольного образца на 11 %. При дальнейшем увеличении
времени инкубирования происходило дальнейшее уменьшение данной фракции в опытной пробе. При инкубации суспензии эритроцитов в среде с повышенной концентрацией кальция в течение 20 мин содержание ФЭА
уменьшалось относительно контрольного значения на 17 %. Наибольшее
уменьшение количества ФЭА было зарегистрировано при 30 мин инкубации
и составило 75% от контрольного значения при этом же времени инкубирования. Увеличение времени инкубирования до 40 мин не приводит к дальнейшему уменьшению количества ФЭА и остается на таком же уровне, что и
при 30 мин инкубации.
Так как пятна таких ФЛ как ФС и ФИ находились на хроматограмме
вместе, считали сумму этих фракций. Количественные изменения, происходящие с данными фракциями ФЛ в течении эксперимента, представлены на
рисунке 3.7.
В контрольном образце содержание суммы фракций ФС+ФИ составляло 0,7±0,04 мкг Р/ мг ФЛ и в течении всего времени эксперимента не изменялось.
В образце с повышенным содержанием кальция количество фракции
ФС+ФИ уменьшалось, так в начальный момент времени инкубирования количество данной фракции составило 0,6±0,03 мкг Р/ мг ФЛ, что было на 14 %
75
меньше контрольного значения (рисунок 3.7). Увеличение времени инкубирования приводит к дальнейшему уменьшению данной фракции.
Рисунок 3.7 – Изменение содержания фракций ФС+ФИ при действии
повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
Так после 10 мин инкубации количество ФС+ФИ в опытной пробе
уменьшилось на 36% по сравнению с контрольным значением. Максимальное уменьшение количества фракции ФС+ФИ было зафиксировано при 30
мин инкубации. Содержание данной фракции в пробе, инкубируемой в среде
с высоким содержанием кальция, после 30 мин инкубации уменьшилось на
58 % относительно контрольного значения. Однако, увеличение времени инкубирования до 40 мин оказывало обратный эффект, то есть приводило к
увеличению содержания фракции ФС+ФИ.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение в
среде инкубирования концентрации кальция приводит к количественным изменениям в содержании мембранных ФЛ. Из полученных данных можно
следать вывод о том, что увеличение концентрации ионов Са 2+ активирует
Са-зависимые ферменты, в частности фосфолипазы, о чем свидетельствует
76
накопление ЛФХ, что приводит к иземенениям не только состава мембранных ФЛ, а также к изменению свойств мембранного бислоя. Об этом можно
судить по накоплению СМ в мембранах эритроцитов.
Наибольшие изменения произошли во фракции ФС+ФИ. Можно
предположить, что такого рода изменения связаны с активным участием ФИ
в реализации клеточного ответа на повышенное содержание кальция в среде
инкубирования.
3.2.2 Исследование содержания фосфоинозитидов и их метаболитов в
мембране эритроцитов при действии повышенной концентрации
ионов Са2+
В результате реализации клеточного ответа на какое-либо возмущение
стимулируется гидролиз фосфатидилинозитол(4,5)-бифосфат (PIP2) под действием фосфолипазы С. В результате этого процесса образуются два вторичных сигнальных мессенджера – это ДАГ и инозитол(1,3,4)-трифосфат
(Ruwhof C., van Wamel J.E.T., Noordzij L.A.W. [et al.] Mechanical stress stimulates phospholipase C activity and intracellular calcium ion levels in neonatal rat
cardiomyocytes // Cell Calcium. 2001. Vol. 29. Iss. 2. P. 73-83; Garcia C.S.N.B.,
Prota L.F.M., Morales M.M. [et al.] Understanding the mechanisms of lung mechanical stress // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2006. Vol.
39. P. 697-706). В дополнение к этому регуляция содержания PIP2 может также влиять на клеточную сигнализацию, так как некоторые белки могут быть
связаны с PIP2 (Katan M., Williams R.L. Phosphoinositide-specific phospholipase
C: structural basis for catalysis and regulatory interactions // Cell & Developmental
Biology. 1997. Vol 8. P. 287–296; Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова
В.Г. [и др.] Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО
РАМН. 2010. № 3 (73). С. 334-354).
77
Поэтому на следующем этапе нашего исследования проводили количественный анализ ФИ и ДАГ методом ТСХ.
На рисунке 3.8 показано количественное содержание различных фракций ФИ мембран эритроцитов при действии высокой концентрации ионов
Са2+. Как видно из полученных данных, по истечении 10 мин инкубации содержание PIP2 было наименьшым и составило 1,11±0,05 мкг Р/ мг ФИ. При
увеличение времени инкубирования до 20 мин наблюдали увеличение содержания всех фракций ФИ (рисунок 3.8).
Рисунок 3.8 – Количество различных фракций ФИ мембран эритроцитов при
действии высокой концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
Так концентрация PI возросла относительно значения при 10 мин инкубации в 2 раза. Содержание PIP2 и PIP3 увеличилось в 1,7 и 1,2 раза, соответственно, относительно начального значения. Дальнейшее увеличение
времени инкубирования до 30 мин характеризовалось уменьшением содержания всех фракций ФИ.
78
Полученные данные свидетельствуют о том, что при увеличении концентрации кальция в пробе происходит прирост содержания фракций ФИ к
20 мин инкубирования. Скорее всего это связано с тем, что повышенное содержание ионов Са2+ влияет на метаболизм ФИ за счет активации Сазависимой фосфолипазы С, которая непосредственно участвует в гидролизе
ФИ, тем самым происходит накопление продуктов их метаболизма – ДАГ.
ДАГ является одним из главных продуктов распада PIP2 под действием
фосфолипазы С. Поэтому следующий шаг нашего исследования заключался в
исследовании количественных изменений ДАГ в мембране эритроцитов.
На рисунке 3.9 представлена диаграмма, отражающая количественные
изменения содержания ДАГ под действием высокой концентрации ионов
Са2+.
В контрольном образце в начальный момент времени инкубирования
содержание ДАГ составляло 4,2±0,21 мкг/ мг ОЛ.
Рисунок 3.9 – Изменение содержания ДАГ в мембранах эритроцитов при
действии повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМоль)
79
Как видно из рисунка 3.9 количество ДАГ в образце с повышенной
концентрацией ионов Са2+ незначительно превышало контрольное значение в
начальный момент времени инкубирования. При увеличении времени инкубирования до 10 мин концентрация ДАГ в опытной пробе увеличивалась на
42% относительно контрольного значения. 20 и 30-минутная инкубация приводила к снижению количества ДАГ практически до контрольного уровня,
однако 40 мин инкубация привела к тому, что содержание ДАГ в пробе с повышенным содержанием кальция стало больше контрольного значения в 2,5
раза.
Полученные данные о накоплении ДАГ свидетельствуют о том, что в
мембране эритроцита при увеличении концентрации кальция происходит активация систем, которые ответственны за гидролиз PIP2, продуктом такого
гидролиза как раз выступает ДАГ. По полученным данным можно косвенно
судить об активации фосфолипазы С.
3.2.3 Исследование свойств фосфолипидов с помощью спектроскопии
комбинационного рассеяния
В предыдущих сериях опытов нами показано изменение состава ФЛ.
Известно, что эти изменения зачастую меняют и состояние липидного бислоя
(Berridge M.J., Bootman M.D., Roderick H.L. Calcium signaling: dynamics, homeostasis and remodeling // Molecular Cell Biology. 2003. Vol. 4. Iss.7. P517529). Для того чтобы убедиться в этом, мы провели серию опытов, в которых
получили спектры комбинационного рассеяния мембран эритроцитов, анализ
которых позволил судить об изменениях свойств липидного бислоя.
КР спектр липидов имеет характеристические частоты, которые отображают свойства мембраны. Так пики области 2885 – 2800 см-1 характеризуют симметричные и асимметричные колебания алкильной цепи липидов. В
области 2950 – 2900 см-1 повышение интенсивности поглощения обусловлено
колебанием группы –СН2.
80
Для анализа использовали отношение интенсивностей при 2885 см-1 и
2845 см-1, так как это отношение показывает меру чувствительности к количеству гош-перегибов в алкильных цепях и сопутствующие уменьшение латеральных взаимодействий цепь-цепь (т.е. их текучесть) (Rinia H.A., Burger
K.N.J., Bonn M. [et al.] Quantitative Label-Free Imaging of Lipid Composition
and Packing of Individual Cellular Lipid Droplets Using Multiplex CARS Microscopy // Biophysical Journal. 2008. Vol. 95. P. 4908–4914). Результаты полученные в ходе эксперимента представлены на рисунке 3.10.
В контрольном варианте опыта значение отношения интенсивностей
при 2885 см-1 и 2845 см-1 практически не изменялось с течением времени (рисунок 3.10). При увеличении в среде инкубации концентрации кальция происходили изменения данного отношения. В начальный момент времени инкубирования значение отношения интенсивности при 2885 см -1 и 2845 см-1
превышало на 6 % значение в контрольном варианте опыта. Дальнейшее увеличение времени инкубирования в условиях повышенной концентрации
кальция приводило к уменьшению данного отношения. Наибольшее изменение происходило при 20 мин инкубации, значение отношения интенсивностей при 2885 см-1 и 2845 см-1 было меньше контрольного значения на 8 %.
Рисунок 3.10 – Значение отношения интенсивностей симметричных и асимметричных колебаний алкильной цепи липидов (I2885/I2845) при различном
времени инкубирования
81
С увеличением длительности воздействия кальция до 30 мин величина
отношения интенсивностей становиться сравнима со значением контроля и
остается на том же уровне и при максимальном времени инкубирования.
Полученные данные показали, что действие повышенной концентрации
кальция приводит к изменению свойств мембраны и изменению конформации молекул ФЛ.
Происходят изменения не только в составе различных фракций ФЛ, а
также изменяются и свойства мембраны, а именно текучесть липидного
бислоя.
С помощью данного метода можно также оценить микровязкость липидного бислоя. Для этого проводят анализ отношения интенсивностей при
1650 см-1 и 1450 см-1, которое показывает количественную меру степени
насыщенности ЖК (Rinia H.A., Burger K.N.J., Bonn M., [et al.] Quantitative Label-Free Imaging of Lipid Composition and Packing of Individual Cellular Lipid
Droplets Using Multiplex CARS Microscopy // Biophysical Journal. 2008. Vol.
95. P. 4908–4914). Расчеты данного отношения интенсивностей приведены на
рисунке 3.11.
Рисунок 3.11 – Значение отношения интенсивностей колебаний связей С=С
(1650 см-1) и деформационных колебаний СН2 (1450 см-1) (I1650/I1450) при различном времени инкубирования
82
В контрольном варианте опыта значение данного показателя практически не изменялось с течением времени (рисунок 3.11). В опыте с повышенной концентрацией кальция в среде инкубирования значение данного параметра в начальный момент времени инкубирования было на 7 % больше относительно контрольного значения.
10 мин инкубация приводила к увеличению данного отношения на
14% по сравнению со значением в контрольном образце. Однако, при увеличении времени инкубации до 20 мин значение отношения интенсивности при
1650 см-1 и 1450 см-1 уменьшается и становится меньше на 12 % относительно контроля. При максимальном времени инкубирования значение данного
показателя практически соответствует контрольному уровню.
Как известно, ионы Са2+ могут связываться с двумя соседними отрицательными головками фосфолипидов и образовывать «некий» кластер, тем
самым ионы Са2+ инактивируют процессы флип-флоп перехода и делают
мембрану менее подвижной (Bogdanova A., Makhro A, Wang J. [et al.] Calcium
in Red Blood Cells – A Perilous Balance // International Journal of Molecular Sciences. 2013. Vol. 14. P. 9848-9872). В результате этого процесса мембрана
эритроцитов становиться менее эластична и вязкость липидного бислоя увеличивается, о чем свидетельствует уменьшение отношения интенсивностей
при 2885 и 2845 см-1, то есть происходит уменьшение латеральных взаимодействий.
Из полученных данных можно утверждать, что при увеличении времени инкубации эритроцитов в среде с повышенной концентрацией ионов
Са2+ в клетке меняется степень насыщенности жирных кислот мембраны. Из
литературы известно, что от количества насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в структуре мембраны зависит текучесть липидного бислоя (Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. [и др.] Структурнофункциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при
патологиях разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. №3 (73). С.
334-354) и исходя из полученных результатов можно сделать вывод о том,
83
что мембрана клетки становиться менее текучей, то есть вязкость липидного
бислоя увеличивается. Можно предположить, что такой характер изменений
зависит прежде всего от концентрации свободных ионов Са2+. Поскольку при
увеличении времени инкубирования содержание ионов Са2+, находящихся в
свободном состоянии, уменьшается, что ведет за собой уменьшение активности процессов, которые были вызваны свободными ионами Са2+. Тем самым
снижается действие Са-зависимых ферментов, которые вызывают изменения
структуры и свойств фосфолипидного бислоя.
3.3 Исследование морфологических характеристик эритроцитов и
свойств гемоглобина при действии повышенной концентрации ионов
Са2+
3.3.1 Исследование морфологических характеристик эритроцитов с
помощью лазерной интерференционной микроскопии
Полученные ранее результаты свидетельствуют о том, что действие
высоких концентраций ионов Са2+ приводит к изменению состава ФЛ. Такие
изменения не могут не влиять на морфологические характеристики эритроцита. Поэтому необходимо было также выяснить, насколько действие высокой концентрации кальция может влиять на морфологические показатели
эритроцитарных клеток.
Анализ морфометрических показателей проводили с помощью метода
ЛИМ. Данный метод позволяет получать высококонтрастные изображения
эритроцитов без обработки их красителем. Другие разновидности микроскопии, например, различные фазово-контрастные методы обладают сходными
возможностями, однако ЛИМ позволяет также количественно с высокой точностью оценивать фазовую высоту (параметр пропорциональный произведению толщины образца на его показатель преломления) объектов. Такие возможности позволяют считать ЛИМ некоторым «бесконтактным» аналогом
84
зондовых микроскопов. Оценив фазовую высоту можно, дополнительно, при
выполнении ряда условий, рассчитать такие характеристики клетки как объем, концентрацию и количество вещества в клетке (Brazhe A.R. Brazhe N.A.
Non-invasive study of nerve fibres using laser interference microscopy // Phil.
Trans. R. Soc. A. 2008. Vol. 366. Р. 3463-3481).
Мы изучали влияние высокой концентрации кальция в среде инкубирования и действие флавоноидов на такие морфологические параметры эритроцитов как площадь и ОРХ (рисуноки 3.12 и 3.13). На графиках представлен
средний результат обсчета более 100 клеток.
Как можно видеть из представленных графиков, площадь эритроцитов
контрольного образца составляет 360 мкм2 (рисунок 3.12). При добавлении в
суспензию эритроцитов раствора СаCl2 10 мин приводила к незначительному
уменьшению площади эритроцитов в пределах погрешности. При увеличении времени инкубации до 20 мин происходит дальнейшее уменьшение
площади, которое составило 84,6% от контрольного значения. Значение площади при увеличение времени инкубации до 30 мин возрастало и становилось сравнимым с контрольным значением.
В варианте опытов с флавоноидами также происходило изменение
площади эритроцитов, однако они были менее значительными. Так по истечении 20 минутной инкубации значение площади в опыте с кальцием и флавоноидами было на 8,4% меньше относительно данного параметра в контрольном образце. При увеличении времени инкубации до 30 минут площадь
в опыте с флавоноидами и кальцием не изменялась.
На следующем этапе определяли ОРХ, значение которого позволяет
судить о распределении внутриклеточного вещества и говорить о толщине
эритроцита, так как этот параметр прямо пропорционален произведению показателя преломления и толщины объекта.
Результаты исследования представлены на рисунке 3.13.
85
Рисунок 3.12 – Площадь эритроцитов, рассчитанная с помощью ЛИМ
Как можно видеть из полученных данных с увеличением времени инкубации в контрольном образце происходят изменение данного параметра,
что возможно связанно с недостатком питательных веществ в клетке.
При нахождении эритроцитов в среде с повышенным содержанием
ионов Са2+ данный показатель уменьшается, особенно при 20 и 30 минутной
инкубации (на 13,6% и 22,3% соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при увеличении в среде инкубирования концентрации ионов Са2+ происходят процессы, вызывающие изменение геометрических параметров клетки.
Добавление в среду инкубации флавоноидов приводило к незначительному повышению данного параметра. Однако даже в результате 30 мин инкубации эритроцитов их значение ОРХ в опыте с флавоноидами и кальцием
всего на 4,5% превышало значение в пробах, инкубируемых только с раствором кальция. Опытные значения не достигали контрольного уровня.
С помощью метода ЛИМ можно не только оценить морфологические
характеристики клеток, но и построить 3D модель эритроцита, по которой
можно судить о распределении внутриклеточного вещества в клетке.
86
Рисунок 3.13 – Максимальное значение оптической разности хода луча в
эритроцитах, рассчитанное с помощью ЛИМ
На следующем этапе нашей работы было изученно распределение
структур в цитоплазме и поперечный профиль эритроцитов (рисунок 3.14).
Эритроциты контрольного образца имели овальную форму, внутриклеточные структуры были равномерно распределены (рисунок 3.14 а). Мембрана эритроцитов имела ровную поверхность. Профиль контрольного образца
клеток имел два плеча и один пик, характерный для ядра (рисунок 3.14 в).
При увеличении концентрации Са2+ в среде инкубирования форма эритроцита менялась (рисунок 3.14 б). Равномерное распределение структур цитоплазмы клетки нарушалось. Мембрана эритроцита опытного образца имела
неоднородную фазовую высоту по периметру клетки. График поперечного
сечения эритроцита опытного образца имел 3 четких пика, два из которых
характерны для мембраны эритроцита, а большой – центральный пик – характерен ядру. При сравнении профилей эритроцитов контрольного и опытного образцов видно, что фазовая высота эритроцита и ширина опытного образца меньше контрольного значения.
87
а, с – 3D модель и профиль эритроцита контрольного образца; b, d – 3D
модель и профиль эритроцитов при действии повышенной концентрации
кальция
Рисунок 3.14 – 3D модели и профили эритроцитов
Увеличение концентрации ионов Са2+ в среде приводит к нарушеиям
морфологических характеристик эритроцитов. Можно полагать, что это связано с изменением состава мембраны эритроцита и активацией Са-зависимых
ферментов, действие которых направлено на изменение состава и свойств
мембран. В литературе имеются данные о том, что увеличение концентрации
ионов Са2+ может приводить к гиперполяризации мембран, за счет активации
Са-зависимых К+-каналов, что приводит к выходу КСl (Thomas S.L.Y., Bouy-
88
er G., Cueff A. [et al]. Ion channels in human red blood cell membrane: Actors or
relics? // Blood Cell, Molecules, and Diseases. 2011. Vol. 46. P. 261-265). Эти
процессы приводят к тому, что происходит активация Scramblase-белков, работа которых направлена на уменьшение объема клетки (Lang K.S., Myssina
S., Brand V. [et al]. Involvement of ceramide in hyperosmotic shock-induced death
of erythrocytes // Cell Death Differ. 2004. Vol. 11. P. 231-243; Lang P.A., Kempe
D.S., Myssina S. [et al]. PGE(2) in the regulation of programmed erythrocyte death
// Cell Death Differ. 2005. Vol. 12. P. 415-428). Добавление флавоноидов в
пробы, инкубируемые в присутствии повышенной концентрации кальция,
приводит к ингибированию данных процессов.
В основе структуры флавоноидов лежат три углеродных кольца (С 6-С3С6), которые принято обозначать А, В, С (Щекатихина А.С., Курченко В.П.
Спектрофотометрическая характеристика квертетина, морина, таксифолина и
силибинина с ионами меди (II) // Труды БГУ. 2011. Т. 6. Вып. 1. С. 76-85).
Особенность строения молекул флавоноидов позволяет участвовать в процессах хелатирования металлов и эта способность зависит от числа и расположения гидроксильных групп в кольцах флавоноидов (Ягольник Е.А., Махмутов Б.Б., Тараховский Ю.С. Влияние комплекса квертетин-железо на
фосфолипиды мембран // Известия Тульского государственного университета. 2010. Вып. 2. С. 289-299). Также учитывая амфильность молекул флавоноидов предполагается, что они способны легко встраиваться в биологические мебмраны (Ефимова С.С. Влияние флавоноидов на каналообразующую
активность токсинов и антимикробных агентов в липидных бислоях: автореф. дис. канд. биол. наук: С.-П., 2013. 20 с.) и располагаться в мембране или
на её поверхности, или в глубоких гидрофобных областях бислоя фосфолипидов (Klymchenko A.S. [et al.] Bimodal distribution and fluorescence response
of environment-sensitive probes in lipid bilayers // Biophys. J. 2004. Vol. 86. P.
2929-2941). Можно предположить, что такое расположение флавоноидов на
мембране клетки способствует перехвату свободных ионов и тем самым концентрация ионов в клетке не повышается и не активируются патологические
89
процессы в клетке. Флавоноиды связывают свободные ионы Са2+, в результате чего не происходит активация Са-зависимых ферментов.
3.3.2 Исследование свойств и распределения гемоглобина в эритроцитах
голубя при действии высокой концентрации ионов Са2+
Одной из основных функций эритроцитов является транспорт кислорода. Кислород переноситься от легких к тканям посредством образования связи между молекулой кислорода и гемоглобином, который находится внутри
эритроцита (Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии. Самара.:
Изд-во Самарский ун-т, 2009.116 с.).
На основании результатов, полученных с помощью ЛИМ, мы предположили, что изменения морфологических характеристик эритроцитов способны повлиять на физико-химические и функциональные параметры, и в
первую очередь на распределение Гб ассоциированного со структурой эритроцитарной клетки и, соответственно на его кислородтранспортную функцию.
На рисунке 3.15 представлен КР спектр гемоглобина. Для анализа конформации и О2-связывающих свойств гемоглобина используют следующие
полосы спектров КР спектров крови (указаны положения максимумов): 1355,
1375, 1548-1552, 1580-1588см-1.
Полосы 1355 и 1375 см-1 связаны с симметричными колебаниями пиррольных колец (связи Са Сb, СaN и СaNСa) в молекулах дезоксигемоглобина и
гемоглобина, связанного с лигандами, соответственно. Соотношение интенсивностей I1375/(I1355+I1375) является характеристикой относительного количества о-Гб в суспензии эритроцитов (Федяшкина А.Н., Максимов Г.В. Влияние гипоксии на молекулярное состояние гемоглобина эритроцитов крыс при
физиологических нагрузках // Вестник Мордовского университета. 2013. №
3-4. С. 141-144). Полоса 1172 см-1 появляется в результате асимметричных
90
колебаний колец пирролов в о-Гб (связи СаСb, СaN и СaNСa). Отношение
I1375/I1172 несет информацию о выраженности симметричных и асимметричных колебания пиррольных колец, а его изменение может быть связано с
конформационными изменениями пирролов.
Полосы при 1548 – 1552 см-1 и 1580 – 1588 см-1 характеризуют колебания метиновых мостиков между пирролами (связи CaCm, CaCmH) в молекулах
Гб, в одних из которых гемопорфирин растянут и деформирован (1548 – 1552
см-1), а в других имеет более компактную недеформированную конформацию
(1580 – 1588 см-1). Отношение интенсивностей I1355/I1550 отражает относительную способность всего Гб в пробе связывать лиганды (в том числе О2), а
соотношение I1375/I1580 – относительную способность Гб выделять лиганды
(Кэри П. Применения спектроскопии КР и РКР в биохимии М.: Мир, 1985.
272 с.; Абатурова А.М., Багров Д.В., Байжуманов А.А. [и др.] Нанобиотехнологии: практикум. М.: БИНОМ. – Лаб. знаний, 2012. 384 с.; Федяшкина А.Н.,
Максимов Г.В. Влияние гипоксии на молекулярное состояние гемоглобина
эритроцитов крыс при физиологических нагрузках // Вестник Мордовского
университета. 2013. № 3-4. С. 141-144).
Рисунок 3.15 – КР спектр гемопорфирина гемоглобина
91
Расчет отношений интенсивностей при определенных частотах представлен в таблице 3.1.
Как видно из полученных данных в эритроцитах, подверженных действию высокой концентрации ионов Са2+, происходит изменение конформации Гб. Однако при этом не происходит существенных изменений способности Гб переносить кислород (см. табл. 3.1). Действительно, в течение 30 минутной инкубации не изменились параметры сродства и характеристики
комплексов Гб с лигандами. Полученный результат свидетельствует о том,
что увеличение концентрации ионов Са2+ в среде инкубации не приводит к
существенным изменениям свойств Гб, тем самым сохраняется его способность переносить кислород.
Таблица 3.1 – Отношение интенсивностей характерных частот спектра Гб
(р<0,05 по t-критерию Стьюдента)
Контроль, 0
мин
Контроль, 10
мин
Контроль, 20
мин
Контроль, 30
мин
2+
Са , 3,5 мМ, 0
мин
2+
Са , 3,5 мМ,
10 мин
2+
Са , 3,5 мМ,
20 мин
2+
Са , 3,5 мМ,
30 мин
Выраженность
симметричных и
асимметричных
колебания пиррольных колец
I1375/I1172
Относительная
способность Гб в
пробе связывать лиганды (в
том числе
О2)
I1355/ I1550
Относительная
способность Гб
выделять
лиганды
I1375/I1580
Относительное
количество оГб в суспензии
эритроцитов
I1375/(I1355+I1375)
1,035±0,048
0,878±0,035 *
0,698±0,012
0,493±0,016 *
1,046±0,035
0,870±0,019 *
0,709±0,021
0,511±0,021
1,055±0,028
0,865±0,025 *
1,245±0,023 *
0,801±0,016
1,114±0,028
0,716±0,032 *
1,121±0,031
0,724±0,028 *
1,126±0,014
0,728±0,047 *
1,138±0,004 *
0,873±0,001
0,714±0,002
*
0,707±0,001
*
0,700±0,034
0,7250±0,01
9
0,740±0,007
*
0,759±0,001
*
0,523±0,006 *
0,542±0,006 *
0,548±0,012
0,558±0,031
0,563±0,002 *
0,525±0,001 *
92
С помощью метода КР микроскопии возможно построение диаграммы
распределения Гб по клетке (рисунок 3.16).
а
б
в
а – контрольный образец; б – образец инкубируемый
с раствором СаCl2; в – образец инкубируемыйс раствором СаCl2 и флавоноидами
Рисунок 3.16 – Распределение гемоглобина, полученное при помощи КР микроскопии (время инкубации 20 минут)
Как можно видеть из полученных рисунков, в контрольном образце гемоглобин распределен равномерно по всему объему клетки. При увеличение
концентрации кальция в среде инкубации эритроцитов происходит наруше-
93
ние распределения Гб по клетке, о чем свидетельствует красная область на
рисунке 3.16 б. Присутствие в среде инкубации, с повышенным содержанием
ионов Са2+, флавоноидов препятствует нарушению распределения Гб в эритроцитах.
Из полученных результатом можно сделать вывод о том, что флавоноиды способны противодействовать процессам, которые инициируются присутствием свободных ионов Са2+. Можно предположить, что флавоноиды
способны связывать ионы Са2+, это приводит к тому, что ионы Са2+ теряют
реакционную способность.
3.4 Повреждение клеточного ядра эритроцитов голубя при действии
повышенной концентрации ионов Са2+
В предыдущих сериях опытов нами установлено, что кальций вызывает
изменения состава, состояния и морфологических характеристик эритроцитов. Известно, что ионы Са2+ принимают активное участие в реализации программируемой гибели клетки, при которой происходит разрушение клеточного ядра (Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть у растений //
Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 10. С. 12-17; Манских
В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение // Цитология. 2007. Т.
49. № 11. С. 909-915; Tirodkar T.S., Voelkel-Johnson C. Sphingolipids in apoptosis // Experimental Oncology. 2012. Vol. 34. Iss. 3. P. 231-241). Поэтому следующим шагом нашего исследования явилось изучение состояния клеточного
ядра при действии ионов Са2+ методом флуоресцентной микроскопии. Для
наших исследований мы использовали краситель Хекст 3342 (Sigma Aldrich,
США), который хорошо подходит для анализа повреждений клеточного ядра.
При клеточной гибели нарушается проницаемость плазматической мембраны
и данный краситель без проблем проникает в клетку и накапливается в ней,
тем самым в клетках, подверженных клеточной гибели, интенсивность флуо-
94
ресценции данного красителя будет выше по сравнению с клетками, в которых программа клеточной гибели не запущена.
Микрофотография ядер эритроцитов, окрашенных при помощи флуоресцентного красителя, которые подверглись действию высокой концентрации ионов Са2+, представлена на рисунке 3.17.
Рисунок 3.17 – Микрофотография эритроцитов голубя подверженных
действию ионов Са2+ (3,5 мМ), окрашивание Хехстом 3342, увеличение х40
Можно видеть, что ядра эритроцитов голубя имеют овальную форму.
При инкубации в условиях повышенной концентрации кальция запускаются
процессы, связанные с деструкцией мембранного слоя, что способствует
накоплению красителя в клетке. В клетках, мембрана которых повреждена,
ядра эритроцитов имеют более интенсивную флуоресценцию по сравнению с
клетками, мембрана которых осталась целой.
Ядра эритроцитов под действием высоких концентраций ионов Са2+
изменяют свою форму, становятся более округлыми, кроме того ядра могут
фрагментироваться.
95
Для количественной оценки поврежденных клеток использовали расчет
апоптотического индекса (АИ), который показывает отношение поврежденных клеток к общему числу клеток (Logsdon M.D., Raymond E.M., Besa P.C.
[et al.] Apoptosis and the BCL-2 gene family - patterns of expression and prognostic value in STAGE I and II follicular center lymphoma // International Journal of
Radiation Oncology. 1999. Vol. 44. Iss. 1. P. 19–29; Залесский В.Н., Великая
Н.В. Методы ранней диагностики апоптоза in vitro и in vivo для оценки хронических эффектов токсикантов // Современные проблемы токсикологии.
2006. 1. С. 78-82). Расчеты апоптотического индекса представлены на рисунке 3.18.
Рисунок 3.18 – Расчет апоптотического индекса эритроцитов при действии
повышенной концентрации ионов Са2+ (3,5 мМ)
Как видно из расчета АИ, в контрольном образце практически не
наблюдаются поврежденные клетки, причем увеличение числа поврежденных клеток не превышало 15%.
96
В опытном образце количество поврежденных клеток увеличивалось,
максимальное увеличение количества поврежденных клеток наблюдалось
при 30 мин инкубации. Однако дальнейшее увеличение времени инкубирования приводило к уменьшению количества поврежденных клеток. Это можно объяснить тем, что только свободные ионы Са2+ могут участвовать в запуске ферментативных реакций, которые способствуют разрушению мембраны. При увеличении времени инкубирования, концентрация ионов Са2+,
способных участвовать в реакциях, уменьшается из-за того, что ионы Са2+
будут вовлекаться в реакцию и переходить в связанное состояние. Соответственно будет уменьшаться количество поврежденных клеток, что мы и
наблюдали.
Из литературы известно, что при реализации программируемой клеточной гибели эритроциты голубя избавляются от ядра (Девяткин А.А., Ревин В.В., Юданов М.А. [и др.] Выброс клеточного ядра из эритроцитов голубя и состояние мембранных липидов при воздействии пероксидом водорода
// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141. № 2. С.
225-228). Поэтому на следующем этапе нашей работы мы исследовали повреждения клеточного ядра методом «ДНК-комет» (Comet Assay), который
хорошо подходит для изучения повреждений ДНК одиночных клеток.
На рисунке 3.19 представлены фотографии «комет», полученных от
ядер эритроцитов контрольного образца и образца, инкубируемого в среде с
повышенной концентрацией ионов Са2+.
Из полученных фотографий «комет» видно, что «кометы», полученные
из контрольной пробы практически не имеют «хвоста» и у них крупная «голова» (рисунок 3.19 а).
«Кометы», полученные из проб, инкубируемых в условиях повышенной концентрации ионов Са2+, имеют каплеобразный вид (рисунок 3.19 б). У
них практически отсутствует «голова» и наблюдается широкий диффузный
«хвост». Такой вид кометы наблюдается из-за того, что клеточное ядро разрушилось на мелкие фрагменты, составляющие «хвост». Данный вид «ко-
97
мет» характерен для апоптотических клеток (Сорочинская У.Б., Михайленко
В.М. Применение метода ДНК-комет для оценки повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды // Онкология. 2008. Т. 10. № 3.
С. 303-309).
а
б
а – контроль, б – эритроцит подверженный действию раствора
кальция (3,5 мМ)
Рисунок 3.19 – Изображения комет полученные с помощью метода ДНКкомет, краситель акредин оранжевый, увеличение х40
Для количественной оценки повреждений молекул ДНК в ядрах эритроцитов использовали такой параметр как %ДНК (процент ДНК в «хвосте»
кометы). Результаты расчета данного параметра представлены на рисунке
3.20.
В пробах, инкубируемых с раствором кальция, при 10 мин инкубации
процент ДНК в хвосте «кометы» превышал контрольное значение на 21,3%
(рисунок 3.20). Наибольшее изменение было зарегистрировано при 20 мин
инкубации. При 20 мин инкубации %ДНК в опытной пробе был 23,8 % выше
контрольного уровня. После 30 мин инкубации значение процентного содержания ДНК в хвосте «кометы» уменьшалось и приближалось к контрольному
значению.
98
Такую зависимость можно объяснить тем, что в начальный момент инкубации концентрация свободных ионов Са2+ в растворе была максимальна и,
соответственно, активация процессов гибели клеток шла более интенсивно.
Однако, при увеличении времени инкубации все большее количество свободного кальция, возможно, переходит в связанное состояние, тем самым активная концентрация кальция снижается и процесс разрушения клеток затормаживается.
Рисунок 3.20 – %ДНК в «хвосте» «кометы»
Каплеобразный вид комет, полученный в ходе эксперимента, указывает
на то, что клетки инкубируемые с раствором кальция погибают за счет активации программируемой клеточной гибели. На существование подобного механизма указывает дальнейшая активация Са-зависимых ферментов, играющих ключевую роль в реализации программы клеточной гибели (Suzuki J.,
Umeda M., Sim P.J. [et al.] Calcium-dependent phospholipid scrambling by
TMEM16F // Nature. 2010. Vol. 468. P. 834-838; Hivotovsky B., Orrenius S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective form the cell death community //
Cell Calcium. 2011. Vol. 50. P. 211-221).
99
Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что повышенное содержание ионов Ca2+ оказывает негативное влияние на эритроциты и приводит к разрушению клеточного ядра эритроцитов голубя, что характерно для клеток, погибших в результате программируемой клеточной
гибели.
100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты позволяют расширить фундаментальные положения о механизмах действия повышенной концентрации ионов Са2+ на
метаболизм мембранных ФЛ и физико-химические свойства мембран.
Повышение внеклеточной концентрации ионов Са2+ приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов Са2+, что в свою очередь
инициирует количественные и качественные изменения в ФЛ части мембран.
Происходит увеличение СМ и лизоформы ФХ, уменьшение доли фракций
ФХ, ФИ, ФС, ФЭА. Эти изменения связаны с активацией Са-зависимых фосфолипаз, результатом работы которых является гидролиз ФЛ, входящих в состав плазматической мембраны. Уменьшение доли ФИ является результатом
активации сигнального пути в клетке. Методом КР-спектроскопии показано,
что изменения, происходящие с ФЛ составом мембран эритроцитов, влияют
на физико-химические свойства мембран. При действии ионов Са 2+ уменьшается упорядочность ФЛ слоя мембран и текучесть липидного слоя.
Ионы Са2+ влияют не только на состав мембраны эритроцита, они
также способны вызывать морфологические изменения всей клетки. Можно
предположить, что данные процессы инициируются изменениями, происходящими в составе ФЛ мембраны. Методом ЛИМ показано, что повышенные
концентрации ионы Са2+ приводят к перераспределению гемоглобина и ядра
в эритроцитах. Добавление флавоноидов в пробы, инкубируемые в присутствии повышенной концентрации ионов Са2+, приводит к замедлению процессов, вызванных ионами Са2+. Можно полагать, что флавоноиды инактивируют развитие патологических процессов за счет образования комплексов с
ионами Са2+, в результате чего свободные ионы Са2+ образовывают комплекс
с молекулами флавоноидов и тем самым переходят в неактивное состояние.
101
Увеличение концентрации ионов Са2+ приводит к разрушению клеточного ядра эритроцитов голубя. Эти изменения зарегистрированы с помощью метода «ДНК-комет» и окраски флуоресцентным красителем Хехкст
3342. Вид «комет», полученных в ходе эксперимента свидетельствуют о том,
что клетки погибли по апоптозному пути.
Схема влияния высокой концентрации ионов Са2+ и флавоноидов на эритроциты голубя
102
ВЫВОДЫ
1) Установлено, что при инкубировании эритроцитов в физиологическом растворе происходит снижение внутриклеточной концентрации ионов
Са2+, тогда как их выдерживание в среде с повышенным содержанием ионов
Са2+ динамика выхода отлична только лишь в первые 20 минут и дальше
наблюдается резкое увеличение внутриклеточного пула исследованных
ионов.
2) В состоянии нормы (контроль) в эритроцитах обнаружены и идентифицированы следующие ФЛ – ЛФХ, СМ, ФХ, ФЭА и ФИ+ФС. При действии повышенных концентраций ионов Са2+ (3,5 мМоль) происходит изменение состава ФЛ практически во всех исследованных фракциях.
3) При повышении концентрации ионов Са2+ наблюдается активация
фосфоинозитидного цикла. Происходит значительное уменьшение количественного содержания ФИ, о чем свидетельствует резкое накопление ДАГ.
4) Методом КР-спектроскопии показано, что действие повышенных
концентраций ионов Са2+ вызывает изменение степени насыщенности жирных кислот, входящих в состав ФЛ, и соответственно микровязкости мембран эритроцитов.
5) Установлено, что повышение содержания ионов Са2+ в среде инкубирования приводит к изменению морфологических характеристик клетки:
уменьшается и площадь, и фазовая толщина. В этих же условиях наблюдается перераспределение внутриклеточных компонентов эритроцитов. В присутствии флавоноидов происходит торможение морфологических изменений.
6) Повышение концентрации ионов кальция до 3,5 мМоль в среде инкубирования эритроцитов вызывают фрагментацию и полное разрушение
ядер, а также увеличение количества повреждений в ДНК.
103
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АИ – апоптотический индекс
ДНК – дизоксирибонуклеиновая кислота;
КР – комбинационное рассеяние;
ЛИМ – лазерно-интерференционная микроскопия;
о-Гб – окси-гемоглобин;
ОРХ – оптическая разность хода;
ПГК – программируемая клеточная гибели;
СМ – сфингомиелин;
ТСХ – тонкослойная хроматография
ФИ – фосфоинозитид;
ФК – фосфатидная кислота;
ФЛ – фосфолипиды;
ФС – фосфатидилсерин;
ФХ – фосфатидилхолин:
ФЭА – фосфатидилэтаноламин;
FADD – Fas-associated protein with death domain –
InsP3R – инозитол 3-фосфат рецептор
PI(3,4)P2 – фосфатидилинозитол-3,4-бифосфат;
PI(3,4,5)P3 – фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат;
PI3K – фосфатидилинозитол 3-киназа;
PKB – протеинкиназа В;
PTP – фосфатирозинфосфатаза;
S1P – сфингозин -1-фосфат;
TNF – Tumor Necrosis Factor – фактор некроза опухоли;
104
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.
Абатурова А.М. Нанобиотехнологии: практикум / А.М. Абатуро-
ва, Д.Б. Багров, А.А. Байжуманов А.А. [и др.]. – М.: БИНОМ. – Лаб. Знаний,
2012. – 384 с.
2.
Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный каль-
ций / П.В. Авдонин, В.А. Ткачук. – М.: Наука, 1994. – 288 с.
3.
Азарова О.В. Флавоноиды: механизмы противовоспалительного
действия / О.В. Азарова, Л.П. Галактионова // Химия растительного сырья. –
2012. – № 4. – С. 61-78
4.
Албертс Б. Молекулярная биология клетки / Б. Албертс, Д. Брей,
Дж. Льюис [и др.]. – М.: Мир, 1994. – 538 с.
5.
Бережнов А.В. Применение флуоресцентной микроскопии в ис-
следованиях динамики Са2+ в клетках / А.В. Бережнов, В.П. Зинченко, Е.И.
Федотова [и др.]. – Пущино, 2007. – 65 с.
6.
Бондаренко О.Г. Особенности внутриклеточной сигнализации в
лейкоцитах периферической крови при лазерном облучении в условиях in
vitro / О.Г. Бондаренко, Т.Г. Кравченко, Г.К. Попов // Вестник ЮУрГУ. –
2011. – № 39. – С. 66–69
7.
Бордюшков Ю.Н. Структурно-функциональные изменения мем-
бран лимфоцитов и эритроцитов под воздействием переменного магнитного
поля / Ю.Н. Бордюшков, И.А. Горошинская, Е.М. Франциянц [и др.] //Вопр.
мед. химии. – 2000. – Т.46. Вып. 1. – С.72-80
8.
Боровская М.К. Структурно-функциональная характеристика
мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза / М.К.
Боровская, Э.Э. Кузнецова, В.Г. Горохова В.Г. [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО
РАМН. – 2010. – №3 (73). – С. 334-354
105
9.
Васильева Е.М. Биохимические особенности эритроцита. Влия-
ние патологии / Е.М. Васильева // Биомедицинская химия. – 2005. – Т. 51.
Вып. 2. – С. 118-126
10.
Васьковский В.Е. Состав и обмен полярных липидов морских ор-
ганизмов : дис. … д-р. биол. Наук / В.Е. Васьковский. – Владивасток., 1984. –
323 с.
11.
Горшинская И.А. Изменение микровязкости мембран лимфоци-
тов и эритроцитов крови у онкологических больных / И.А. Горшинская, Л.Ю.
Глотина, Е.И. Горло [и др.] // Вопр. мед. химии. – 1999. – Т.45. Вып. 1. – С.
53-57
12.
Гринштейн С.В. Структурно-функциональные особености мем-
бранных белков / С.В. Гринштейн, О.А. Кост // Успехи биологической химии. – 2001. – Т. 41. – С. 77-104;
13.
Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки. Часть 2.
Структура и механизм функционирования / Н.Б. Гусев // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – № 5. – С. 10-16
14.
Девяткин А.А. Выброс клеточного ядра из эритроцитов голубя и
состояние мембранных липидов при воздействии пероксидом водорода /
А.А. Девяткин, В.В. Ревин, М.А. Юданов [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – Т. 141. № 2. – С. 225-228
15.
Есауленко Е.Е. Сравнительная биохимическая характеристика
липидного спектра мембран эритроцитов при различных видах токсического
поражения печени / Е.Е. Есауленко, С.С. Бачко, А.А. Ладутько [и др.] // Медицинские науки. Фундаментальные исследования. – 2011. – Вып. 7. – С. 5456
16.
Ефимова С.С. Влияние флавоноидов на каналообразующую ак-
тивность токсинов и антимикробных агентов в липидных бислоях: автореф.
дис. канд. биол. наук: С.-П., 2013. 20 с.
106
17.
Залесский В.Н. Методы ранней диагностики апоптоза in vitro и in
vivo для оценки хронических эффектов токсикантов / В.Н. Залесский, Н.В.
Великая // Современные проблемы токсикологии. – 2006. – Вып. 1. – С. 78-82
18.
Захаров Ю.Н. Количественное определение содержания ионов
кальция по изменениям флуоресценции одноволновых красителей с помощью лазерной сканирующей микроскопии / Ю.Н. Захаров, А.В. Ершова //
Оптический журнал. – 2011. – 78 (10). – С. 36-37
19.
Зефиров А.Л. Ионные каналы возбудимой клетки (структура,
функция, патология) / А.Л. Зефиров, Г.Ф. Ситдикова. – Казань.: Арт-кафе,
2010. – 270 с.
20.
Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические
аспекты / Зинчу В.В. // Успехи физиологических наук. – 2001. – Т. 32. №3. –
С. 66-78
21.
Зубова С.Г. TOR-центрическая концепция регуляции митоген-
ных, метаболических и энергетических сигнальных путей / С.Г. Зубова, Ж.В.
Шитикова, Т.В. Поспелова // Цитология. – 2012. – Т. 54. №8. – С. 589-602
22.
Ишутина Н.А. Зависимость микровязкости мембран эритроцитов
от фосфолипидного состава при беременности, осложненной герпесвирусной инфекцией / Н.А. Ишутина // Бюллетень физиологии и патологии
дыхания. 2008. Вып. 28. С. 25-28
23.
Кадималиев Д.А. Изучение липидного состава в соматических
нервах при возбуждении : дис. … канд. биол. наук / Д.А. Кадималиев. – М.,
1985. – 155 с.
24.
Казарян П.А. Метаболизм фосфоинозитидов при хроническом
лимфолейкозе и после полихимиотерапии / П.А. Казарян, С.С. Дагбашян,
К.И. Исраелян // Кровь. – 2007. – Т. 1. № 5. – С. 19-22.
25.
Каламкаров Г.Р. Ионные каналы, регулируемые циклическими
нуклеотидами / Г.Р. Каламкаров, О.Г. Лунгина // Сенсорные системы. – 2001.
– Т. 15. № 4. – С. 275-287
107
26.
Карабанов Г.Н. Дефформируемость эритроцитов / Г.Н. Карабанов
// Анестезиология реаниматология. – 1984. – №1. – С. 71-73
27.
Кленова Н.А. Строение, метаболизм и функциональная актив-
ность эритроцитов человека в норме и патологии / Н.А. Кленова, Р.О. Кленов. – Самара.: Изд-во Самарский университет, 2009. – 116 С.
28.
Кольман Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём. – М.:
Мир, 2004. – 469 с.
29.
Костин Д.Г. Изменение ассиметрии липидов и транспорта конью-
гатов глутатиона в эритроцитах человека под влиянием ионов кальция / Д.Г.
Костин, Н.М. Козлова, Е.И. Слобожанина [и др.] // Биофизика. – 2004. – Т.
49. Вып. 4. – С. 685-691
30.
Крыжановский Г.Н. Дизрегуляционная патология системы крови
/ Г.Н. Крыжановский, Е.Д. Гольдберг. – М.: МИА, 2009. – 432 с.
31.
Кудрявцев И.В. Современные методы оценки фагоцитов в экспе-
риментальной биологии / И.В. Кудрявцев, А.В. Зурочка, С.В. Хайдуков [и
др.] // Российский иммунологический журнал. – 2012. – Т. 6 (14). № 3 (1). – С.
3-20
32.
Кэри П. Применения спектроскопии КР и РКР в биохимии / П.
Кери. – М.: Мир, 1985. – 272 с.
33.
Левицкий Д.О. Биохимия мембран. Кальций и биологические
мембраны / Д.О. Левицкий. – М.: Высшая школа, 1990. – 124 с.
34.
Ли В.С. Липидный состав и структурно- функциональные свой-
ства мембран эритроцитов разного возраста / В.С. Ли, Э.М. Халилов, В.И.
Сабуров [и др.] // Вопр. мед. химии. – 1982. – Т.28. Вып. 6. – С. 66-71
35.
Манских В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение /
В. Н. Манских // Цитология. – 2007. – Т. 49. № 11. – С. 909-915
36.
Мартынова Е.А. Регуляция активности каспаз в апоптозе / Е.А.
Мартынова // Биоорганическая химия. – 2003. – Т. 29. №5. – С. 518-543
37.
Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия / В.Дж. Маршал. – С.-
Петербург.: Бинорм, 2002. – 348 с.
108
38.
Мельников А.А. Активность Na,K-АТФазы эритроцитов у физи-
чески активных лиц / А.А. Мельников, А.Д. Викулов, И.А. Осетров // Физиология человека. – 2001. – Т. 27. № 3. – С. 129-132
39.
Миндукшев И.В. Нарушение деформационных и транспортных
характеристик эритроцитов при развитии у них апоптоза / И.В. Миндукшев,
В.В. Кривошлык, И.А. Добрылко [и др.] // Биологические мембраны. – 2010.
– Том 27. №1. – C. 28-38
40.
Мороз В.В. Повреждение ДНК и процессы клеточной гибели
лейкоцитов у пострадавших с тяжелой травмой / В.В. Мороз, Е.А. Мягкова,
А.К. Жанатаев [и др.] // Общая реаниматология. – 2014. – 10 (4). – С. 11-36
41.
Ноздрачев А.Д. Начало физиологии / А.Д. Ноздрачев. – СПб.:
Изд. Лань, 2001. – 1088 с.
42.
Пестов Н.Б. Регуляция Са2+-АТР-азы плазматических мембран /
Н.Б. Пестов, Р.И. Дмитриев, М.И. Шахпаронов // Успехи биологической химии. – 2003. – Т. 43. – С. 99-138
43.
Ревин В.В., Ревина Э.С., Девяткин А.А., Громова Н.В. Роль липи-
дов в функционировании возбудимых биологических мембран / В.В. Ревин,
Э.С. Ревина, А.А. Девяткин, Н.В. Громова. – Саранск. : Изд-во Мордов. унта, 2012. – 220 с.
44.
Рязанцева Н.В. Эритроцит при патологии: размышления у элек-
тронного микроскопа / Н.В. Рязанцева, Е.А. Степовая, С.Б. Ткаченко [и др.] //
Архив патологии. – 2004. – № 3. – С. 53-61
45.
Сазонов В.Ф. Мембранный потенциал покоя кратко / В.Ф. Сазо-
нов. – Казань.: Кинезиолог, 2009. – 128 с.
46.
Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть у растений /
В.Д. Самуилов // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7. № 10.
– С. 12-17
47.
Сикорская А.С. Подбор условий разделения фосфолипидных
комплексов, полученных из семян подсолнечника / А.С. Сикорская, А.А.
109
Назарова, В.Ф. Селеменев // Сорбционные и хроматографические процессы.
– 2009. – Т. 9. Вып. 2. – С. 215-220
48.
Сорочинская У.Б. Применение метода ДНК-комет для оценки по-
вреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды /
У.Б. Сорочинская // Онкология. – 2008. – Т. 10. № 3. – С. 303-309
49.
Тараховский Ю.С. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина
/ Ю.С. Тараховский, Ю.А. Ким, Б.С. Абдрасилов, Е.Н. Музафаров. – Пущино:
Sуnchrobook, 2013. – 310 c.
50.
Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций
/ В.А. Ткачук // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Том 7. № 1.
– C. 10-15
51.
Трошкина Н.А. Эритроцит: строение и функции его мембраны /
Н.А. Трошкина, В.И. Циркин, С.А. Дворянский // Вятский медицинский
вестник. – 2007. – № 2-3. – С. 32-40
52.
Федяшкина А.Н. Влияние гипоксии на молекулярное состояние
гемоглобина эритроцитов крыс при физиологических нагрузках / А.Н. Федяшкина, Г.В. Максимов // Вестник Мордовского университета. – 2013. – №
3-4. – С. 141-144
53.
Финдлей Дж. Биологические мембраны. Методы. / Дж. Финдлей,
Э. Эванз. – М. : Мир, 1990. – 424 с.
54.
Хазиев Э.Ф. Изменение кальциевого транзиента в двигательном
нервном окончании под действием холинергических агентов : дис. … канд.
биол. наук / Э.Ф. Хазиев. – Казань, 2015. – 130 с.
55.
Халилов Э.М. Структурно-функциональный анализ мембран
эритроцитов с различным содержанием холестерина / Э.М. Халилов, В.С. Ли,
О.А. Азизова [и др.] // Вопр. мед. химии. – 1982. – Т. 28. Вып. 1. – С. 81-86
56.
Хефтман Э. Хроматография. Практическое приложение метода /
Э. Хефтман, Т. Кастер, А. Нидервизер. – М. : Мир, 1986. – 336 с
110
57.
Чизмадзе Ю.А. Мембранная биология: от липидных слоев до мо-
лекулярных машин / Ю.А. Чизмадзе // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. № 8. – С. 12-17
58.
Щекатихина А.С., Курченко В.П. Спектрофотометрическая ха-
рактеристика квертетина, морина, таксифолина и силибинина с ионами меди
(II) // Труды БГУ. 2011. Т. 6. Вып. 1. С. 76-85
59.
Ягольник Е.А., Махмутов Б.Б., Тараховский Ю.С. Влияние ком-
плекса квертетин-железо на фосфолипиды мембран // Известия Тульского
государственного университета. 2010. Вып. 2. С. 289-299
60.
Agroyannis B. Is Erythrocyte Damage Prevented by Gardos Effect in
Hemodialyzed Uremic Patients? / B. Agroyannis, A. Paraskevopoulos, I. Kopelias
[et al.] // Artificial Organs. – 2000. – Vol. 24. Iss. 9. – P. 743–745
61.
Alberts B. Molecular Biology of the Cell / B. Alberts, A. Johnson, J.
Lewis [et al.]. – New York.: Garland Science, 2002. – P. 512
62.
Al-Makdissy N. Sphingomyelin/cholesterol ratio: an important deter-
minant of glucose transport mediated by GLUT-1 in 3T3-L1 preadipocytes / N. AlMakdissy, M. Younsi, S. Pierre [et al.] // Cell Signal. – 2003. – Vol. 15. Iss. 11. –
P. 1019-1030
63.
Andersen O.M. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applica-
tions / O.M. Andersen, K.R. Markham. – U.K.: Teylor & Francis Group, 2005. –
1256 p.
64.
Angka L. Glucopsychosine increases cytosolic calcium to induce cal-
pain-mediated apoptosis of acute myeloid leukemia cells / L. Angka, E.A. Lee,
S.G. Rota [et al.] // Cancer Letters. – 2014. – Vol. 348. – P. 29-37
65.
Arsham A.M. Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling is neither
required for hypoxic stabilization of HIF-1 alpha nor sufficient for HIF-1dependent target gene transcription / A.M. Arsham, D.R. Plas, C.B. Thompson [et
al.] // The Journal of Biological Chemistry. – 2002. – Vol. 277. Iss. 17. – P. 1516215170
111
66.
Augustine G.J. How does calcium trigger neurotransmitter release? /
C.J. Augustine // Current Opinion in Neurobiology. – 2001. – Vol. 11. – P. 320326
67.
Azuma T. Gelsolin in Complex with Phosphatidylinositol 4,5-
Bisphosphate Inhibits Caspase-3 and -9 to Retard Apoptotic Progression / T.
Azuma,
D.R. Plas, C.B. Thompson [et al.] // The Journal of Biological
Chemistry. – 2000. – Vol. 275. Iss. 6. – P. 3761–3766
68.
Bano D. Cleavage of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in ex-
citotoxicity / D. Bano // Cell. – 2005. – Vol. 120. – P. 275–285
69.
Berridge M.J. Calcium signaling: dynamics, homeostasis and remod-
eling / M.J. Berridge, M.D. Bootman, H.L. Roderick // Molecular Cell Biology. –
2003. – Vol. 4. Iss.7. – P517-529
70.
Bevers E.M. Changes in membrane phospholipid distribution during
platelet activation / E.M. Bevers, P. Comfurius, R.F.A. Zwaal // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). – 1983. – Vol.736. – P. 57-66
71.
Bitbol M. Ion regulation of phosphatidylserine and phosphatidyleth-
anolamine outside-inside translocation in human erythrocytes / M. Bitbol, P. Fellmann, A. Zachowski [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). – 1987. –
Vol. 904. – P. 268-282
72.
Boehning D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate re-
cep-tors, amplifying calcium-dependent apoptosis / D. Boehning, R.L. Patterson,
L. Sedaghat [et al.] // Nat. Cell Biol. – 2003. – Vol. 5. – P. 1051-1061
73.
Bogdanova A. Calcium in Red Blood Cells – A Perilous Balance / A.
Bogdanova, A. Makhro, J. Wang [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. – 2013. – Vol. 14. – P. 9848-9872
74.
Bouyer G. Three types of spontaneously active anionic channels in
malaria-infected human red blood cells / G. Bouyer, S. Egée, S.L. Thomas // Blood
Cells, Molecules, and Diseases. – 2006. – Vol. 36. Iss.2. – P. 248–254
112
75.
Brazhe A.R. Non-invasive study of nerve fibres using laser interfer-
ence microscopy / A.R. Brazhe, N.A.Brazhe // Phil. Trans. R. Soc. A. – 2008. –
Vol. 366. – Р. 3463-3481
76.
Brazhe N.A. The relation of different-scale membrane processes under
nitric oxide influence / N.A. Brazhe, L.A. Erokhova // Journal of Biological
Phisics. – 2005. – Vol. 31. – Р. 533-546
77.
Brown N. Structural modifications associated with the change in Ca2+
sensitivity on activation of m-calpain / N. Brown, C. Crawford // FEBS Letters. –
1993. – Vol. 322. Iss. 1. – P. 65-68
78.
Brown S.B. Biological Membranes / S.B. Brown. – U.K.: The Biolog-
ical Society, 1996. – 49 P.
79.
Bruce J.I. Oxidant-impaired intracellular Ca2+ signaling in pancreatic
acinar cells: role of the plasma membrane Ca2+-ATPase / J.I. Bruce, A.C. Elliott //
Am J Physiol Cell Physiol. – 2007. – Vol. 293. Iss. 3. – P. 938-950
80.
Burg M.B. Cellular response to hyperosmotic stresses / M.B. Burg,
J.D. Ferraris, N.I. Dmitrieva // Physiol Rev. – 2007. – Vol. 87. Iss. 4. – P. 1441–
1474
81.
Canoruc N. Protective Effects of Vitamin E Selenium and Allopurinol
Against Stress-induced Ulcer Formation in Rats / N. Canoruc, R. Cicek, A. Atamer
[et al.] // Turkish Journal of Medical Sciences. – 2001. – Vol. 31. – P. 199-203
82.
Carafoli E. Calcium signaling: a tale for all seasons / E. Carafoli //
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2002. – Vol. 99. – P. 1115– 1122
83.
Carafoli E. Calcium Signalling and Disease Edited / E. Carafoli. –
USA.: Springer, 2007. – 59 p.
84.
Carafoli E. Generation, control, and processing of cellular calcium
signals / E. Carafoli, L. Santella, D. Branca [et al.] // Biochem. Mol. Biol. – 2001.
– Vol. 36. – P. 107– 260
85.
Cardenas C., Miller R.A., Smith I. [et al.] Essential regulation of cell
bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria / C. Cardenas, R.A. Miller, I. Smith [et al.] // Cell. – 2010. – Vol. 142. – P. 270-283
113
86.
Catterol W.A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels
/ W.A. Catterol // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. – 2000. – Vol. 16. – P. 521- 555
87.
Chaurio R.A. Phospholipids: Key Players in Apoptosis and Immune
Regulation / R.A. Chaurio // Molecules. – 2009. – Vol. 14. – P. 4892-4914
88.
Choi H.S. The effect of acidosis on systolic Ca2+ and sarcoplasmic re-
ticulum calcium content in isolated rat ventricular myocytes / H.S. Choi, A.W.
Trafford, C.H. Orchard [et al.] // The Journal Physiology. – 2000. – Vol. 529. Iss.
3. – P. 661–668
89.
Christofoletti C.A. Application of the comet assay in erythrocytes of
Oreochromis niloticus (Pisces): A methodological comparison / C.A. Christofoletti
// Genetics and Molecular Biology. – 2009. – Vol. 32 Iss. 1. – P. 155-158
90.
Comfurius P. Loss of membrane phospholipid asymmetry in platelets
and red cells may be associated with calcium-induced shedding of plasma membrane and inhibition of aminophospholipid translocase / P. Comfurius, J.M.G.
Senden, H.J.T. Roland [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). – 1990. –
Vol. 1026. – P. 153-160
91.
/
Danielli J.F. А сontribution to the theory of permeability of thin films
J.F. Danielli // J. Cell Comp. Physiol. – 1935. – Vol. 5. – Р. 495-508
92.
de Souza R.F. Antioxidant properties of complexes of flavonoids with
metal ions / R.F. de Souza, W.F. De Giovani // Redox Report. – 2004. – Vol. 9.
Iss. 2. – P. 97-104
93.
Dekkers D.W. Comparison between Ca2+-induced scrambling of vari-
ous fluorescently labelled lipid analogues in red blood cells / D.W. Dekkers, P.
Comfurius, E.M. Bevers [et al.] // Biochem J. – 2002. – Vol. 362. – P.741–747
94.
Delaunay J. The enzymes of the red blood cell plasma membrane / J.
Delaunay // Biomedicine. – 1977. – Vol. 26. Iss. 6. – P. 357-361
95.
Demchenko A.P. Modern views on the structure and dynamics of bio-
logical membranes / A.P. Demchenko // Biopolimers and cell. – 2012. – Vol. 28.
Iss. 1. – Р. 24-38
114
96.
Downward J. Mechanisms and consequences of activation of protein
kinase B/Akt / J. Downward // Curr Opin Cell Biol. – 1998. – Vol. 10. Iss. 2. – P.
262-267
97.
Downward J. Ras signalling and apoptosis / J. Downward // Curr Opin
Genet Dev. – 1998. – Vol. 8. Iss. 1. – P. 49-54
98.
Dyrda A. Local membrane deformations activate Ca2+-dependent K+
and anionic currents in intact human red blood cells / A. Dyrda, U. Cytlak, A. Ciuraszkiewicz // Plos One. – 2010. – Vol. 5. Iss. 2. – P. 1-14
99.
Eaton J.W. Anion Channel Blockade: Effects Upon Erythrocyte
Membrane Calcium Response / J.W. Eaton, F.R. Branda, C. Hadland [et al.] //
American Journal of Hematology. – 1980. – Vol. 9. – P. 391-399
100. Es-Safi N. Flavonoids: Hemisynthesis, Reactivity, Characterization
and Free Radical Scavenging Activity / N. Es-Safi, S. Ghidouche, P.H. Ducrot //
Molecules. – 2007. – Vol. 12. Iss. 9. – P. 2228-2258
101. Folk P. Calcium affect phosphoinositide turnover in human erythrocytes / P. Folk, A. Strunecka // Gen. Physiol. Biophys. – 1990. – Vol. 9. – P. 281290
102. Fu Y. Paranodal myelin retraction in relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis visualized by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy / Y. Fu // Journal of Biomedical Optics. – 2011. – Vol. 16. Iss. 10. – Р. 110
103. Garcia C.S.N.B. Understanding the mechanisms of lung mechanical
stress / C.S.N.B. Garcia, L.F.M. Prota, M.M. Morales [et al.] // Brazilian Journal of
Medical and Biological Research. – 2006. – Vol. 39. – P. 697-706
104. Gatidis S., Borst O., Föller M. [et al.] Effect of osmotic shock and
urea on phosphatidylserine scrambling in thrombocyte cell membranes / S. Gatidis,
O. Borst, M. Föller [et al.] // Am J Physiol Cell Physiol. – 2010. – Vol. 299. – P.
11824–11832
115
105. Gatidis S. p38 MAPK activation and function following osmotic
shock of erythrocytes / S. Gatidis, C. Zelenak, A. Fajol [et. al] // Cell Physiol Biochem. – 2011. – Vol. 28. – P. 1279–1286
106. Gillespie D. Intracellular Calcium Release Channels Mediate Their
Own Countercurrent: The Ryanodine Receptor Case Study / D. Gillespie, M. Fill //
Biophysical Journal. – 2008. – Vol. 95. – P. 3706-3714
107. Haeseleer F. Calcium-Binding Proteins: Intracellular Sensors from the
Calmodulin Superfamily / F. Haeseleer, Y. Imanishi, I. Sokal [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2002. – Vol. 290. – P. 615-623
108. Hajnoczky G. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria / G. Hajnoczky, L.D. Robb-Gaspers, M.B. Seitz [et al.] // Cell. – 1995. –
Vol. 82. – P. 415-424
109. Han B.G. Protein 4.1R core domain structure and insights into regulation of cytoskeletal organization / B.G. Han, W. Nunomura, Y. Takakuwa [et al.] //
Natural Structural Biology. – 2000. – Vol. 7. Iss. 10. – P. 871-875
110. Handloser D. Separation of Phospholipids by HPTLC – An Investigation of Important Parameters / D. Handloser, V. Widmer, E. Reich // Journal of
Liquid Chromatography & Related Technologies. 2008. Vol. 31. P. 1857-1870
111. Härdle W. Statistical methods for biostatistics and related fields /
W. Härdle, Y. Mori, Ph. Vieu. – Germany : Berlin Springer–Verlag, 2007. – 372 p.
112. Hille B. Ionic channels of excitable membranes / B. Hille. – MA:
Sinauer, 2001. – 814 p.
113. Hivotovsky B. Calcium and cell death mechanisms: A perspective
form the cell death community / B. Hivotovsky, S. Orrenius // Cell Calcium. –
2011. – Vol. 50. – P. 211-221
114. Ikura M. The role of calcium-binding proteins in the control of transcription: structure to function / M. Ikura, M. Osawa, J.B. Ames // BioEssays. –
2002. – Vol. 24. – P. 625-636
116
115. Jentsch T.J. Molecular Structure and Physiological Function of Chloride Channels / T.J. Jentsch, V. Stein, F. Weinreich [et al.] // Physiol. Rev. – 2002.
– Vol. 82. – P. 503–568
116. Kandel E.R. Principal of neural science / E.R. Kandel, J.H. Schwartz,
T.M. Jessel. – UK: Springer, 2002. – 1321 p.
117. Katan M. Phosphoinositide-specific phospholipase C: structural basis
for catalysis and regulatory interactions / M. Katan, R.L. Williams // Cell & Developmental Biology. – 1997. – Vol 8. – P. 287–296
118. Klymchenko A.S. [et al.] Bimodal distribution and fluorescence response of environment-sensitive probes in lipid bilayers // Biophys. J. 2004. Vol.
86. P. 2929-2941
119. Kobayashi T. Lipid, lipid domains and lipid-protein interactions in
endocytic membrane traffic / T. Kobayashi // Seminars in cell & developmental
biology. 1998. – Vol. 9. Iss. 5. – Р. 517-526
120. Kucherenko Y.V. Effect of the ionic strength and prostaglandin E2 on
the free Ca2+ concentration and the Ca2+ influx in human red blood cells / Y.V. Kucherenko, E. Weiss, I. Bernhardt // Bioelectrochemistry. – 2004. – Vol. 62. Iss. 2. –
P. 127-133
121. Kyle J.A. Flavonoids. Chemistry, biochemistry and applications /
J.A. Kyle, G.G. Duthie // Flavonoid in food. – 2006. – Vol. 4. – P. 219–262
122. Lang F. Ceramide in Suicidal Death of Erythrocytes / F. Lang, E.
Gulbins, P.A. Lang et al. // Cellular Physiology and biochemistry. – 2010. – Vol.
26. – P. 21-28
123. Lang K.S. Mechanisms of suicidal erythrocyte death / K.S. Lang,
P.A. Lang, C. Bauer [et al.] // Cell Physiol Biochem. – 2005. – Vol. 15. – P. 195202
124. Lang K.S. Involvement of ceramide in hyperosmotic shock-induced
death of erythrocytes / K.S. Lang, S. Myssina, V. Brand [et al]. // Cell Death Differ. – 2004. – Vol. 11. – P. 231-243
117
125. Lang P.A. Role of Ca2+-activated K+ channels in human erythrocyte
apoptosis / P.A. Lang, S. Kaiser, S. Myssina [et al.] // American Journal of Physiology - Cell Physiology. – 2003. – Vol. 285. Iss. 6. – P. 1553-1560
126. Lang P.A. PGE(2) in the regulation of programmed erythrocyte death
/ P.A. Lang, D.S. Kempe, S. Myssina [et al] // Cell Death Differ. – 2005. – Vol. 12.
– P. 415-428
127. Laplante M. mTOR signaling in growth control and disease /
M. Laplante, D.M. Sabatini // Cell. – 2012. – Vol. 149. – P. 274-293
128. Li H. Erythrocyte Membrane Model with Explicit Description of the
Lipid Bilayer and the Spectrin Network / H. Li, G. Lykotrafitis // Biophysical
Journal. – 2014. – Vol. 107. Iss. 3. – P. 642-653
129. Li L. Calcineurin Controls the Transcription of Na+/Ca2+ Exchanger
Isoforms in Developing Cerebellar Neurons / L. Li, D. Guerini, E. Carafoli //
J.Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275. – P. 20903–20910
130. Lodish H. Molecular Cell Biology, 4th edition / H. Lodish, A. Berk,
S.L. Zipursky. – New York: W. H. Freeman, 2000. – 956 p.
131. Logsdon M.D. Apoptosis and the BCL-2 gene family - patterns of expression and prognostic value in STAGE I and II follicular center lymphoma /
M.D. Logsdon, E.M. Raymond, P.C. Besa [et al.] // International Journal of Radiation Oncology. – 1999. – Vol. 44. Iss. 1. – P. 19–29
132. Maher A.D. The Gárdos channel: a review of the Ca2+-activated K+
channel in human erythrocytes / A.D. Maher, P.W. Kuchel // The International
Journal of Biochemistry & Cell Biology. – 2003. – Vol. 35. – P. 1182–1197
133. Manach C. Polyphenols: food sources and bioavailability / C. Manach,
A. Scalbert, C. Morand [et al.] // Am.J.Clin.Nutr. – 2004. – Vol. 79. – P. 727–747
134. McConkey D.J. Signal Transduction Pathways in Apoptosis /
D.J. McConkey, S. Orrenius // Stem Cells. – 1996. – Vol. 14. Iss. 6. – P. 619–631
135. Mejillano M. Regulation of Apoptosis by Phosphatidylinozitol 4,5Bisphosphate Inhibition of caspases, and caspase inactivation of phospha-
118
tidilinozitol phosphate 5-kinases / M. Mejillano, M. Yamamoto, A.L. Rozelle //
The Journal of Biological Chemistry. – 2001. – Vol. 276. Iss. 3. – P. 1865–1872
136. Merckx A. Anion channels in Plasmodium-falciparum-infected erythrocytes and protein kinase A / A. Merckx, G. Bouyer, S.L.Y. Thomas [et al.] //
Parasitology. – 2009. – Vol. 25. Iss. 3. – P. 139-144
137. Mira L. Interactions of flavonoids with iron and copper ions: a mechanism for their antioxidant activity / L. Mira, M.T. Fernandez, M. Santos [et al.] //
Free Radical Research. – 2002. – Vol. 36. Iss. 11. – P.1199-208
138. Monique D.D. Control of the Erythrocyte Free Ca2+ Concentration in
Essential Hypertension / D.D. Monique, A. Catherine, M.G. Pernollet [et al.] //
Hypertension. – 1992. – Vol. 19. Iss. 2. – P. 167-174
139. Muravyov A. Role Ca2+ in Mechanisms of the Red Blood Cells Microrheological Changes / A. Muravyov, I. Tikhomirova // Advances in Experimental
Medicine and Biology. – 2012. – Vol. 740. – P. 1017-1038
140. Murphy C.S. Lipid rafts and malaria parasite infection of erythrocytes
/ C.S. Murphy, L.H. Hiller, T. Harrison [et al.] // Molecular Membrane Biology. –
2006. – Vol. 23. Iss. 1. – P. 81-88
141. Murphy S.C. Erythrocyte detergent-resistant membrane proteins: their
characterization and selective uptake during malarial infection / S.C. Murphy, B.U.
Samuel, T. Harrison // Blood. – 2004. – Vol. 103. Iss. 5. – P. 1920-1928
142. Nakagawa T. Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific
apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta / T. Nakagawa, H. Zhu, N. Morishima
[et al.] // Nature. – 2000. – Vol. 403. – P. 98-103
143. Nelson G.A. Control of Erythrocyte Shape by Calmodulin / G.A. Nelson, M.L. Andrews, M.J. Karnovsky // The Journal of Cell Biology. – 1983. – Vol.
96. – P. 730-735
144. Nemeth E. Rapid mobilization of cellular Ca2+ in bovinepara thyroid
cells by external divalent cations / E. Nemeth, A. Scarpa // J Biol Chem. – 1987. –
Vol. 202. – P. 5188–5196
119
145. Ostling O. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA
damage in individual mammalian cells / O. Ostling // Biochem Biophys Res
Commun. – 1984. – Vol. 123. – Р. 291–298
146. Parka Y. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes / Y. Parka, C.A. Best, K. Badizadegan [et al.] // PNAS. – 2010. – Vol.
107. Iss. 15. – P. 6731–6736
147. Pasini E.M. In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells / E.M. Pasini, M. Kirkegaard, P. Mortensen [et al.] // Blood.
– 2006. – Vol. 108. – Р. 791-801
148. Pietta P.G. Flavonoids as antioxidants / P.G. Pietta // Journal Natural
Products. – 2000. – Vol. 63. Iss. 7. – P. 1035-1042
149. Pike J.L. Lipid rafts: bringing order to chaos / J.L. Pike // Journal of
Lipid Research. – 2003. – Vol 44. – P. 655-667
150. Quintanar-Escorza M.A. Oxidative damage increases intracellular free
calcium [Ca2+]i concentration in human erythrocytes incubated with lead / M.A.
Quintanar-Escorza, M.T. Gonzalez-Martinez, I. Ma. del Pilar [et al.] // Toxicology
in Vitro. – 2010. – Vol. 24. – P. 1338-1346
151. Rinia H.A. Quantitative label – free imaging of lipid composition and
packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy /
H.A. Rinia., B.N.J. Koert, M. Bonn // Biophysical Journal. – 2008. – Vol. 95. – Р.
4908-4914
152. Rizzuto R. Microdomains of intracellular Ca2+: molecular determinants and functional consequences / R. Rizzuto, T. Pozzan // Physiol Rev. – 2006.
– Vol. 86. – P. 369-408
153. Rong Y.P. Targeting Bcl-2-IP3 receptor interaction to reverse Bcl-2’s
inhibition of apoptotic calcium signals / Y.P. Rong, A.S. Aromolaran, G. Bultynck
[et al.] // Mol. Cell. – 2008. – Vol. 31. – P. 255-265
154. Roshal A.D. Structure stability and spectral properties of complexes
of flavones with metal ions of group II / A.D. Roshal, T.V. Sakhno, A.A. Verezubova // Functional materials. – 2003. – Vol. 10. Iss. 3. – P. 419-426
120
155. Rudenko S.V. Erythrocyte morphological states, phases, transitions
and trajectories / S.V. Rudenko // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). – 2010. –
Vol. 1798. Iss. 9. – P. 1767–1778
156. Ruwhof C. Mechanical stress stimulates phospholipase C activity and
intracellular calcium ion levels in neonatal rat cardiomyocytes / C. Ruwhof, J.E.T.
van Wamel, L.A.W. Noordzij [et al.] // Cell Calcium. – 2001. – Vol. 29. Iss. 2. – P.
73-83
157. Sabban E. Erythrocyte Membrane Protein Band 3: Its Biosynthesis
and Incorporation into Membranes / E. Sabban, V. Marchesi, M. Adesnik [et al.] //
The Journal of Cell Biology. – 1981. – Vol. 91. – P. 637-646
158. Saldanha C. Modulation of erythrocyte hemorheological properties by
band 3 phosphorylation and dephosphorylation / C. Saldanha, A.S. Silva, S. Gonçalves [et al.] // Clinical Hemorheology and Microcirculation. – 2007. – Vol. 36. –
P. 183-194
159. Salzer U. Stomatin, flotillin-1 and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts / U. Salzer, R. Prohaska // Blood. – 2001. – Vol. 97.
Iss. 4. – P. 1141-1143
160. Samuel B.U. The role of cholesterol and glycosylphosphatidylinositolanchored proteins of erythrocyte rafts in regulating raft protein content and malaria
infection / B.U. Samuel, N. Mohandas, T. Harrison [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. – 2001. – Vol. 276. Iss. 31. – P. 29319-29329
161. Santo-Domingo J. Calcium uptake mechanisms of mitochondria /
J. Santo-Domingo, N. Demaurex // Biochimica et Biophysica Acta. – 2010. – Vol.
1797. – P. 907–912
162. Sauer H. Mechanical strain-induced Ca(2+) waves are propagated via
ATP release and purinergic receptor activation / H. Sauer, J. Hescheler, M. Wartenberg // American Journal of Physiology. – 2000. – Vol. 279. Iss. 2. – P.295-307
163. Shaw R.J. Ras, PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell
growth / R.J. Shaw, L.C. Cantley// Nature. – 2006. – Vol. 441. – P. 424-430
121
164. Simons K. Membrane Organization and Lipid Rafts / K. Simons,
J.J. Sam, Singer S.J. The fluid mosaic model of the structure of cell membrane /
S.J. Singer // Science. – 1972. – Vol. 175. – Р. 720-731
165. Smith S.K. Mechanisms by which intracellular calcium induces susceptibility to secretory phospholipase A2 in human erythrocytes / S.K. Smith, A.R.
Farnbach, F.M. Harris [et al.] // The journal of biological chemistry. – 2001. – Vol.
276. Iss. 25. – P. 22732–22741
166. Suzuki J. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F
/ J. Suzuki, M. Umeda, P.J. Sim [et al.] // Nature. – 2010. – Vol. 468. – P. 834-838
167. Svetina S. The cooperative role of membrane skeleton and bilayer in
the mechanical behavior of red blood cells / S. Svetina // Bioelectrochem. – 2004.
– Vol. 62. – Р. 107-113
168. Takahashi A. Measurement of intracellular calcium / A. Takahashi,
P. Camacho, J.D. Lechleiter [et al.] // Physiological Reviews. – 1999. – Vol. 79.
Iss. 4. – P. 1089-1125
169. Tarahovskya S.Y. Flavonoid–membrane interactions: Involvement of
flavonoid–metal complexes in raft signaling / S.Y. Tarahovskya, Y.A. Kimb,
E.A. Yagolnik [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). – 2014. – Vol.
1838. Iss. 5. – P. 1235–1246
170. Telen M.J. Erythrocyte adhesion receptors: blood group antigens and
related molecules / M.J. Telen // Transfusion Medicine Reviews. – 2005. – Vol. 19.
Iss. 1. – P. 32-44
171. Terao J. Dietary flavonoids as antioxidants / J. Terao // Forum Nutr. –
2009. – Vol. 61. – P. 87-94
172. Theobald H.E. Dietary calcium and health / H.E. Theabald // British
Nutrition Foundation. – 2005. – Vol. 30. – P. 237-277
173. Thomas S.L.Y. Ion channels in human red blood cell membrane: Actors or relics? / S.L.Y. Thomas, G. Bouyer, A. Cueff [et al]. // Blood Cell, Molecules, and Diseases. – 2011. – Vol. 46. – P. 261-265
122
174. Tiffert T., Bookchin R.M., Lew V.L. Calcium Homeostasis in Normal
and Abnormal Human Red Cells / T. Tiffert, R.M. Bookchin, V.L. Lew. – Germany.: Springer Verlag, 2003. – 623 Р.
175. Tirodkar T.S. Sphingolipids in apoptosis /T.S. Tirodkar, C. VoelkelJohnson // Experimental Oncology. – 2012. – Vol. 34. Iss. 3. – P. 231-241
176. Vest R.S. Divalent Cations Increase Lipid Order in Erythrocytes and
Susceptibility to Secretory Phospholipase A2 / R.S. Vest, L.J. Gonzales, S.A. Permann [et al.] // Biophysical Journal. – 2004. – Vol. 86. – P. 2251-2260
177. Vicencio J.M. The inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates autophagy through its interaction with Beclin 1 / J.M. Vicencio, C. Ortiz, A. Criollo
[et al.] // Cell Death Differ. – 2009. – Vol. 16. – P. 1006-1017
178. Voccoli V. Role of extracellular calcium and mitochondrial oxygen
species in psychosine-induced oligodendrocyte cell death / V. Voccoli, I. Tonazzini,
G. Signore [et al.] // Cell Death and Disease. – 2014. – Vol. 5. – P. 1-12
179. Wang D. Purification and Characterization of Transporter Proteins
From Human Erythrocyte Membrane / D. Wang, M.J. Lemieux, J.M. Boulter //
Methods in Molecular Biology. – 2003. – Vol. 228. – P. 239-255
180. Watras J. Inositol 1,4,5-trisphosphate-gated channels in cerebellum:
presence of multiple conductance states / J. Watras, I. Bezprozvanny, B.E. Ehrlich
// The Journal of Neuroscience. – 1991. – Vol. 11. Iss. 10. – P. 3239-3245
181. Williams С. Healthy eating: clarifying advice about fruit and vegetables / C. Williams // BMJ. – 1995. – Vol. 310. Iss. 6992. – P. 1453–1455
182. Woon L.A. Ca2+ sensitivity of phospholipid scrambling in human red
cell ghosts / L.A. Woon, J.W. Holland, E.P. Kable [et al.] // Cell Calcium. – 1999.
– Vol. 25. – P. 313–320
183. Xiong Z. Acid -sensing ion channels (ASICs) as pharmacological targets for neurodegenerative diseases / Z. Xiong, G. Pignataro, M. Li [et al.] // Curr.
Opin. Pharmacol. – 2008. – Vol. 8. Iss. 1. – P. 25-32
184. Yoneda T. Activation of caspase-12, an endoplastic reticulum (ER)
resident caspase, through tumor necrosis factor receptor-associated factor 2-
123
dependent mechanism in response to the ER stress / T. Yoneda, K. Imaizumi, K.
Oono // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276. – P. 13935-13940
185. Zaidi A. Plasma membrane Ca2+-ATPases: Targets of oxidative stress
in brain aging and neurodegeneration / A. Zaidi // World J Biol Chem. – 2010. –
Vol. 1. Iss. 9. – P. 271-280
186. Zhivotovsky B. Calcium and cell death mechanisms: A perspective
from the cell death community / B. Zhivotovsky, S. Orreniusa // Cell Calcium. –
2011. Vol. 50. – P. 211-221