ЭФФЕКТИВНОСТЬ БИОЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОГО

Известия Тульского государственного университета
Естественные науки. 2013. Вып. 1. С. 222–232
Химия
УДК 541.138
Эффективность биоэлектрокаталитического
окисления метанола клетками
метилотрофных бактерий в присутствии
медиаторов электронного транспорта ∗
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов
Аннотация. Проведены амперометрические измерения электрокаталитического окисления метанола целыми клетками
аэробных метилобактерий двух штаммов, иммобилизованных
на графитово-пастовом электроде, в присутствии медиаторов
электронного транспорта (ферроцена, 2,5-дибром-п-бензохинона
и 2,6-дихлорфенолиндофенола) при различных концентрациях
субстрата и медиаторов. Полученные данные интерпретированы
в рамках механизма двухсубстратной ферментативной реакции.
Показано, что биоэлектрокаталитические процессы окисления
метанола проходят более эффективно при применении в качестве
биокатализатора клеток метилобактерий, отобранных в экспоненциальной фазе роста и медиатора электронного транспорта
2,5-дибром-п-бензохинона.
Ключевые слова: биоэлектрокатализ, аэробные метилобактерии,
медиаторы, метанол.
Введение
Биоэлектрохимическое окисление субстратов клетками микроорганизмов
в присутствии медиаторов электронного транспорта широко используется
при создании биосенсоров [1] и разработке микробных топливных элементов
(МТЭ) [2, 3]. Принцип функционирования таких биоэлектрокаталитических
систем основан на регистрации окислительной активности ферментных систем бактерий в присутствии искусственных акцепторов электронов, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод
[4]. Наиболее часто в качестве биокатализаторов в медиаторных биосенсорах
и МТЭ используют уксуснокислые бактерии рода Gluconobacter, имеющие
*
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, соглашения № 14.B37.21.0561,
№ 14.B37.21.1231.
Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола
223
мембранную локализацию основных ферментов катаболизма спиртов и углеводов — пирролохинолинхинон (PQQ)-зависимых альдоз- и алкогольдегидрогеназ, что облегчает их взаимодействие с медиаторами переноса электронов [5,6]. Ключевым фактором внеклеточного переноса электронов являются мембранные дегидрогеназы, связанные с ферментами дыхательной
цепи бактерий. В связи с этим, перспективными биокатализаторами для
разработки биосенсоров могут служить клетки метилотрофных бактерий,
обладающие уникальной способностью строить все клеточные компоненты
из С1 -соединений. Подобно уксуснокислым, аэробные метилотрофные бактерии имеют периплазматическую локализацию PQQ-зависимых дегидрогеназ, связанных с дыхательной цепью бактерий [7]. Главным ферментом
первичного С1 -метаболизма у метилотрофов является периплазматическая
PQQ-метанолдегидрогеназа (МДГ, КФ 1.1.2.7), которая наиболее эффективно катализирует окисление метанола до формальдегида, передавая электроны в клетках на специфический кислый цитохром сL [8–11].
Для количественной характеристики биоэлектрокаталитического окисления субстратов Ikeda с сотрудниками предложили подход, основанный
на использовании значений максимальных генерируемых токов и эффективных констант Михаэлиса при биоэлектрокаталитическом окисления глюкозы бактериальной суспензией [12]. Такой подход в дальнейшем применили для выявления наиболее эффективных медиаторов различных классов в амперометрических биосенсорах на основе иммобилизованных на
графитово-пастовых электродах бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии глюкозы [13] и этанола [14]. Таким образом, изучение эффективности
биоэлектрокаталитического окисления метанола метилобактериями в рамках подхода, ранее примененного для подобных систем, является целесообразным и необходимым этапом при разработке биосенсоров для детекции
С1 -соединений. Следует отметить, что взаимодействие ферментных систем
метилотрофных бактерий с медиаторами электронного транспорта ранее не
изучалось, поэтому является актуальным направлением исследований.
В настоящей работе провели сравнительное исследование биоэлектрокаталитического окисления метанола метилотрофными бактериями двух
штаммов в присутствии медиаторов: ферроцена, 2,5-дибром-п-бензохинона
(ДББХ), 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) и в зависимости от фазы
роста микроорганизмов.
Материалы и методы
Микроорганизмы. Объектом исследования были штаммы аэробных
метилобактерий бактерий Methylovorus mays ВКМ В-2221, Methylobacterium
mesophilicum JCM 2829, которые были любезно предоставлены Дорониной Н.В. (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени
Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино).
224
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов
Условия культивирования. Микроорганизмы выращивали на качалке (180 об/мин) при 29 ◦ С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды Канеда,
содержащей (г/л): KH2 PO4 — 2, (NH4 )2 SO4 — 2, NaCl — 0,5, MgSO4 × 7H2 O
— 0,025, FeSO4 × 7H2 O — 0,002, рН 7,2. Метанол вносили в стерильные среды
до концентрации 0,5 % (по объему). Клетки микроорганизмов отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 20 минут на центрифуге Avanti J-30I
(Beckman Coulter, Inc. США). Биомассу промывали 50 мМ калий фосфатным
буфером, pH 7,2.
Оборудование. Электрохимические измерения проводили при помощи
гальванопотенциостата IPC-Micro («Вольта», Россия), интегрированного с
компьютером. Диапазон регистрируемых токов 1 нА — 10 мА. Ошибка измерения потенциала не больше 0,1 мВ для интервала ±5 В. Регистрацию и
обработку данных проводили с помощью специального программного обеспечения.
Формирование рабочего электрода. Рабочий графитово-пастовый
электрод готовили, наполняя пастой «графитовая пудра — минеральное масло» пластиковый шприц. Носик шприца (диаметром 3 мм и высотой 95 мм)
содержал графитовую пасту с добавлением медиатора ферроцена «Aldrich»
(Германия) или 2,5-дибром-п-бензохинона «Fluka» (Германия). Графитовую
пасту готовили смешиванием 100 мг графитовой пудры «Fluka» (Германия) с
необходимым количеством медиатора и 20 мм3 парафинового масла «Fluka»
(Германия) в агатовой ступке. Шприц содержал платиновую проволоку для
электрического контакта с частицами графита.
Суспензию клеток (200 мг сырого веса в 1 мл 50 мМ калий фосфатного буфера, pH 7,2) иммобилизовали на поверхности рабочего графитово-пастового
электрода, для чего на поверхность электрода наносили 4 мкл суспензии
и подсушивали. Клетки у поверхности удерживали диализной мембраной
(«Sigma», США, размер пор 14 кДа), которую закрепляли на поверхности
электрода с помощью пластикового кольца.
Электрохимические измерения. Амперометрические измерения
проводили в двухэлектродной ячейке при постоянном потенциале (250 мВ
для ферроцена и ДХФИХ; и 220 мВ для 2,5-дибром-п-бензохинона
(ДББХ)). В качестве рабочего электрода использовали графитово-пастовый
электрод с иммобилизованным биоматериалом. Электрод сравнения
— хлоридсеребряный электрод. Электролитическую ячейку заполняли
4 мл 50 мМ калий фосфатного буфера, рН 7,2. Измерения велись при
непрерывном перемешивании (300 об/мин) раствора, находящегося в
электролитической ячейке. После установления постоянного уровня тока
в ячейку микропипеткой вводили необходимый для получения заданной
концентрации объем 1 М или 0,1 М раствора метанола. За отклик сенсора
принимали амплитуду изменения силы тока, определяемую как разность
между начальной и конечной величинами силы тока до и после введения
субстрата в измерительную кювету. После регистрации отклика сенсора
производили промывку ячейки буферным раствором.
Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола
225
Математическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерной программы Sigma Plot 9.0 и Excel 2003.
Результаты и обсуждение
Биоэлектрокаталитическое окисления метанола метилобактериями на
разных стадиях роста в присутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта.
В клетках метилотрофных бактерий метанол окисляется до формальдегида под действием фермента PQQ-МДГ, передавая электроны на специфический кислый цитохром сL . Известно, что in vitro МДГ проявляет
активность с искусственными акцепторами электронов, такими как феназинметосульфат [10, 11, 15]. Эффективный перенос электронов от фермента
in vivo на электрод возможен при использовании природных или синтетических соединений с обратимыми окислительно-восстановительными свойствами, способными диффундировать через клеточную мембрану и взаимодействовать с восстановленными сайтами бактерий. Для изучения электрокаталитического окисления метанола метилобактериями на разных стадиях роста использовали ферроцен, который широко используется в качестве медиатора при разработке электрохимических биосенсоров с биокатализаторами на основе ферментов, представляя собой высоко обратимую
окислительно-восстановительную систему [16, 17].
Процесс, протекающий при электрокаталитическом окислении метанола
мембранлокализованной МДГ метилобактерий в присутствии ФЦ, может
быть представлен следующим образом:
Анод (подается потенциал +250 мВ относительно электрода сравнения):
CH3 OH+PQQ-МДГ → НСОН+PQQH2 -МДГ;
PQQH2 -МДГ+2Fc+ → PQQ-МДГ+2Fc+2H+ ;
Fc-1e−
+250 мВ
→
Fc+ .
Катод:
AgCl+e−
−250 мВ
→
Ag+Cl− .
Активные центры фермента взаимодействуют с ферроцений-ионом (Fc+ ),
восстанавливая его до ферроцена (Fc). При наложенном на рабочий электрод
потенциале ФЦ окисляется до ферроцений-иона и вступает в новый цикл
взаимодействий.
Эффективность биоэлектрохимического окисления метанола метилобактериями в зависимости от фазы роста изучали с помощью амперометрической биосенсорной системы, сравнивая величины отклика сенсора на одну
и ту же концентрацию субстрата. Рабочим электродом в этой системе служил графитово-пастовый электрод, содержащий в составе пасты ФЦ, и на
226
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов
поверхности целые клетки микроорганизмов, отобранные на разных стадиях
роста. Полученные результаты показаны на рис.1.
Рис. 1. Зависимость окислительной активности метилобактерий: а — M.
mays ВКМ В-2221, б — Mb. mesophilicum JCM2829 (отклик сенсора, нА/с)
и оптической плотности OD540 нм от времени культивирования;
1 — лаг-фаза, 2 — фаза ускорения роста, 3 — экспоненциальная фаза,
4 – фаза замедления, 5 — стационарная фаза
Из представленных данных следует, что оба штамма метилобактерий
проявляют наибольшую активность в экспоненциальной фазе роста, когда
количество ферментов и их активность в клетках наибольшие, в то время
как в фазе ускорения и стационарной фазах роста окислительная активность
низкая. Штамм M. mays ВКМ В-2221 характеризуется более высокими значениями окислительной активности по отношению к метанолу практически
на всех стадиях роста. Исходя из полученных результатов, для дальнейшего
изучения взаимодействия ферментных систем метилотрофных бактерий с
искусственными акцепторами электронов использовали биомассу, отобранную в экспоненциальной фазе роста.
Оценка эффективности медиаторов электронного транспорта в процессе биоэлектрокаталитического окисления метанола целыми клетками
метилобактерий.
Для сравнительной оценки эффективности биоэлектрокаталитического
окисления метанола в присутствии медиаторов разных типов использовали
ранее предложенную модель [12], где окисление субстрата суспензированными и иммобилизованными целыми клетками бактерий в присутствии медиаторов переноса электронов рассматривается как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Предположили, что окисление метанола при использовании в качестве биокатализатора
целых клеток метилобактерий будет протекать по аналогичной схеме, в
которой первым субстратом является метанол, вторым — медиатор. Общее
уравнение для тока электрокаталитического окисления метанола фермент-
Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола
227
ными системами бактерий, основанное на механизме «пинг-понг» имеет вид:
I=
Imax
.
1 + KS /[S] + KM /[M ]
(1)
Исходя из предложенной модели, процесс электрокаталического окисления субстратов биокатализаторами можно охарактеризовать тремя параметрами: максимальной силой тока Imax , эффективными константами Михаэлиса по субстрату и медиатору KS и KM . Данные параметры можно
рассчитать, используя уравнение типа Михаэлиса-Ментен, в случае избытка
субстрата (2) или медиатора (3) в системе:
I=
Imax
1 + KM /[M ]
I=
Imax
1 + KS /[S]
(при KS /[S] ≪ 1 — избыток субтракта),
(2)
(при KM /[M ] ≪ 1 — избыток медиатора).
(3)
Значения силы тока при варьировании исходной концентрации метанола
(в условиях избытка медиаторов) и концентрации медиаторов (в условиях
избытка метанола) при использовании в качестве биокатализатора бактерий
M. mays ВКМ В-2221 представлены на рис.2.
Рис. 2. Зависимость силы тока электрокаталитического окисления
метанола бактериями M. mays ВКМ В-2221 от концентрации:
а — в условиях избытка медиаторов, б — в условиях избытка метанола
Аналогичные зависимости, полученные для медиаторных электродов на
основе бактерий Мb. mesophilicum JCM2829, представлены на рис.3.
Полученные зависимости имели гиперболический вид и были аппроксимированы по уравнениям (2) и (3). Параметры биоэлектрокаталитического
окисления метанола: максимальная сила тока Imax , эффективные константы
Михаэлиса для метанола KS и для медиатора KM представлены в таблицах
1 и 2.
228
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов
Рис. 3. Зависимость силы тока электрокаталитического окисления
метанола бактериями Мb. mesophilicum JCM2829 от концентрации:
а — в условиях избытка медиаторов, б — в условиях избытка метанола
Таблица 1
Параметры электрокаталитического окисления метанола целыми клетками
M. mays ВКМ В-2221 в присутствии медиаторов электронного транспорта
Медиатор
ДХФИФ
ФЦ
ДББХ
Условия
∆Imax , мкА
метанол
6,25 мМ
ДХФИФ
0,25 мМ
метанол
6,25 мМ
ФЦ
0,54 мМ/г
метанол
6,25 мМ
ДББХ
0,13 мМ/г
2,40±0,05
2,0±0,1
К′s , мМ
0,5±0,1
4,0±1
0,33±
±0,02
34±1
2,2±0,1
0,025±
±0,004
1,8±0,2
∆Imax /К′M
80±1
0,036±
±0,002
2,8±0,1
1,3±0,1
∆Imax /К′s
0,030±
±0,001
1,21±0,02
0,74±0,02
К′M , мМ
110±10
0,7±0,1
Отношение Imax /KS характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с субстратом и не зависит от типа электронного акцептора. Полученные значения этого параметра весьма близки для трех медиаторов, что согласуется с принятой моделью. Однако, при использовании в качестве биокатализаторов метилобактерий M. mays ВКМ В-2221 значения индексов Imax /KS
в 2–7 раза выше, чем при использовании целых клеток Мb. mesophilicum
JCM2829, что свидетельствует о более эффективном биоэлектрокаталитическом окислении метанола ферментными системами клеток этого штамма.
Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола
229
Таблица 2
Параметры электрокаталитического окисления метанола целыми клетками
Мb. mesophilicum JCM2829 в присутствии медиаторов электронного
транспорта
Медиатор
Условия
1
ДХФИФ метанол
6,25 мМ
ДХФИФ
0,25 мМ
1
ФЦ
метанол
6,25 мМ
ФЦ
0,54 мМ/г
метанол
ДББХ
6,25 мМ
ДББХ
0,13 мМ/г
∆Imax , мкА
К′s , мМ
К′M , мМ
∆Imax /К′s
∆Imax /К′M
2
0,05±0,01
3
4
0,11±
±0,01
5
6
0,5±0,3
0,47±0,03
0,9±0,1
2
0,22±0,01
3
0,15±0,01
0,18±
±0,02
0,46±0,03
0,27±0,02
0,55±0,04
4
0,044±
±0,003
5
6
5,0±0,1
0,81±0,07
0,017±
±0,004
0,9±0,1
27±4
0,32±0,01
Отношение Imax /KM — характеризует взаимодействие медиатора с ферментом и является индексом эффективности медиатора электронного транспорта. Индексы эффективности медиаторов в системе на основе бактерий M.
mays ВКМ В-2221выше, чем при использовании в качестве биокатализатора
бактерий Мb. mesophilicum JCM2829.
Сравнительный анализ индексов эффективности медиаторов электронного транспорта в биосенсорах на основе метилотрофных бактерий с ранее
полученными рядами эффективности для подобных сенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans (табл.3) позволил выявить, что ДББХ способен
взаимодействовать с ферментными системами бактерий in vivo лучше других
медиаторов.
Таблица 3
Значение ∆Imax /К′M , показывающее индекс эффективности медиаторов
электронного транспорта для систем на основе метилобактерий и
уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans
медиатор
биокатализатор
M. mays ВКМ В-2221
Мb. mesophilicum JCM2829
Gluconobacter oxydans
ДХФИФ
ФЦ
ДББХ
80±1
0,5±0,3
3,3±0,8[13]
34±1
5,0±0,1
120±20[13]
35±1[14]
110±10
27±4
370±70[13]
230
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов
Следует отметить, что природный мобильный компонент дыхательной
цепи — убихинон (кофермент Q) относится к хиноновым соединениям. Схожесть структур ДББХ и убихинона позволяет предположить, что механизмы
их восстановления в дыхательной цепи близки, однако галоген-производные
хинонов имеют более высокие окислительно-восстановительные потенциалы.
Эти особенности строения ДББХ могут определять его медиаторные свойства в биосенсорных системах на основе бактерий.
Заключение
Таким образом, аэробные метилобактерии являются перспективными
биокатализаторами для создания амперометрических медиаторных биосенсоров. В качестве биокатализатора предпочтительно использование метилотрофных бактерий M. mays ВКМ В-2221. Процесс биоэлектрокаталитического окисления метанола более эффективно протекает при использовании в качестве медиатора 2,5-дибром-п-бензохинона.
Список литературы
1. Microbial biosensors: a review / L. Su [et al.] // Biosens Bioelectron. 2011. V.26.
P.1788–1799.
2. Bioelectrochemical systems: an outlook for practical applications / T.H. Sleutels [et
al.] // ChemSusChem. 2012. V.5. P.1012–1019.
3. Logan B.E., Rabaey K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals by
using microbial electrochemical technologies // Science. 2012. V.337. P.686–690.
4. Сhaubey A., Malholtra B.D. Mediated biosensors // Biosens. Bioelectron. 2002. V.17.
P.441.
5. Membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter sp
.: interfacial
electrochemistry and direct bioelectrocatalysis / J. Tkac [et al.] //
Bioelectrochemistry. 2009. V.76. P.53–62.
6. Инджгия Е., Алферов С., Алферов В. Микроорганизмы рода Gluconobacter в
процессах биоэлектрокатализа. LAP Lambert Academic Publishing Gmbh & Co.
2011. 196 с.
7. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии.
Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 2010. 325 с.
8. Anthony C., Ghosh M., Blake C.F. The structure and function of methanol
dehydrogenase and related quinoproteins containing pyrrolo-quinoline quinine //
Biochem. J. 1994. V.304. P.675–674.
9. Anthony C., Williams P. The structure and mechanism of methanol
dehydro-genase // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V.1647. P.18–23.
10. Anthony C. Bacterial oxidation of methane and methanol // Adv. Microb. Physiol.
1986. V.27. P.113–210.
11. Anthony C. The quinoprotein dehydrogenases for methanol and glucose // Arch.
Biochem. Biophys. 2004. V.428. P.2–9.
Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола
231
12. Measurements of oxidoreductase-like activity of intact bacterial cells by an
amperometric method using a membrane-coated electrode / T. Tkeda [et al.] //
Anal. Chem. 1996. V.68. P.192.
13. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter
oxydans . Evaluation of water-insoluble mediator efficiency / E. Babkina [et al.] //
Electroanalysis. 2006. V.18. P.2023–2029.
14. Понаморева О.Н., Инджгия Е.Ю., Алферов В.А., Решетилов А.Н.
Эффективность биоэлектрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии
медиаторов ферроценового ряда / О.Н. Понаморева [и др.] // Электрохимия.
2010. Т.46, №12. C.1503–1508.
15. Очистка и свойства метанолдегидрогеназы ризосферного фитосимбионта
Methylobacterium nodulans / Т.А. Кузнецова [и др.] // Прикл. биохим.
микробиол. 2012. Т.48, №6. С.606–611.
16. Влияние электронных эффектов заместителей в молекулах ферроценов на их
медиаторные свойства в биосенсоных системах на основе бактерий Gluconobacter
oxydans / Е.Ю. Чигринова [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2008.
Вып.2. С.238–245.
17. Микробные сенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов / Е.Ю. Чигринова [и др.] // Сенсорные системы.
2007. Т.21. С.263–269.
Кузнецова Татьяна Александровна (tatulyakuz@mail.ru), ассистент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Понаморева Ольга Николаевна (olga@tsu.tula.ru), к.х.н, доцент, кафедра
химии, Тульский государственный университет.
Алферов Валерий Анатольевич (chem@tsu.tula.ru), к.х.н., профессор, зав.
кафедрой химии, декан ЕН-факультета, Тульский государственный университет.
Efficiency of bioelectrocatalytic oxidation of methanol by
methylobacteria in the presence of electron transport mediators
T. A. Kuznetsova, O. N. Ponamoreva, V. A. Alferov
Abstract. Amperometric measurements of electrocatalytic oxidation
of methanol by two strains of aerobic methylobacteria immobilized on
graphite-paste electrodes in the presence of electron transport mediators have
been carried out. The obtained data are interpreted in the terms of the mechanism
of two-substrate enzymatic reaction. It was shown that bioelectrocatalytic
processes of methanol oxidation on graphite paste electrodes proceed more
efficiently when the bacterial cells, taken at the exponential growth phase, is
232
Т. А. Кузнецова, О. Н. Понаморева, В. А. Алферов
used as a biocatalyst in composition with 2,5-dibromo-1,4-benzoquinone as a
mediator.
Keywords: bioelectrocatalysis, aerobic methylobacteria, mediators, methanol.
Kuznetsova Tatiana (tatulyakuz@mail.ru),
biotechnology, Tula State University.
assistant,
department
of
Ponamoreva Olga (olga@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences,
associated professor, department of chemistry, Tula State University.
Alferov Valeriy (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, professor,
head of the department of chemistry, dean of faculty, Tula State University.
Поступила 21.01.2013