Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Министерства здравоохранения Российской Федерации
advertisement
1 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Раджкумар Денсинг Самуэл Радж ФАРМАКОТЕРАПИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОПОРОЗА И НАРУШЕНИЙ КОНСОЛИДАЦИИ ПЕРЕЛОМОВ НА ЕГО ФОНЕ L-АРГИНИНОМ И ЕГО КОМБИНАЦИЯМИ С ЭНАЛАПРИЛОМ И ЛОЗАРТАНОМ 14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: Покровский М.В., доктор медицинских наук, профессор Файтельсон А.В., доктор медицинских наук Курск – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 13 1.1 Роль остеопоротических нарушений в процессах регенерации и репарации костной ткани......................................................................................................... 13 1.2 Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование и репаративную регенерацию костной ткани..................................................... 18 1.3 Фармакотерапия нарушений функционирования сосудистого эндотелия L-аргинином, эналаприлом и лозартаном........................................................... 28 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................... 35 2.1 Моделирование экспериментального остеопороза...................................... 35 2.2 Моделирование закрытых остеопоротических переломов бедренных костей и их остеосинтез ........................................................................................ 35 2.3 Измерение уровня микроциркуляции в кости, проведение функциональных сосудистых тестов................................................................... 38 2.4 Гистоморфометрическая оценка развития экспериментального остеопороза и эффективности его коррекции .................................................... 40 2.5 Обоснование доз препаратов и дизайн исследования ................................. 41 2.6 Статистическая обработка первичных данных исследования.................... 42 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ......................................... 48 3.1 Изучение развития экспериментального остеопороза с использованием результатов измерения уровня костной микроциркуляции, функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования ........................... 48 3.2 Изучение остеопротективного действия препарата Кальций-Д3 Никомед при экспериментальном остеопорозе .................................................................. 58 3.3 Изучение остеопротективного действия L-аргинина при экспериментальном остеопорозе ......................................................................... 63 3.4 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе........................................... 68 3 3.5 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с лозартаном при экспериментальном остеопорозе ............................................. 75 3.6 Изучение влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах ........... 84 3.7 Изучение влияния препарата L-аргинин на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах .................................. 92 3.8 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с эналаприлом на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах ............................................................................................................... 96 3.9 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах ............................................................................................................... 99 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 104 ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 113 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..................................................................... 115 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................... 116 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................... 117 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования: Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет остеопороз как «системное заболевание скелета, характеризующееся низкой плотностью костной ткани и нарушением ее микроархитектуры», что приводит к увеличению хрупкости костей и риску возникновения переломов [1, 6, 64, 128, 143]. К модифицируемым факторам развития остеопоротических нарушений относят низкое содержание кальция и витамина D, сидячий образ жизни, курение, чрезмерное потребление алкоголя [22, 106, 142, 152], длительный прием глюкокортикоидов, ревматический артрит [3,54, 60, 64, 67], к немодифицируемым факторам можно отнести преклонный возраст, генетическую предрасположенность, снижение веса и менопаузу [39, 74, 80, 141]. По данным Национального фонда остеопороза (NOF), 10 миллионов человек в США страдают остеопорозом, 80% из них – женщины. Переломы являются одной из основных причин гиподинамии у пожилых женщин, что значительно снижает качество их жизни [40, 82, 85, 163]. В Соединенных Штатах около 40% женщин в возрасте старше 50 лет страдают от переломов бедер, позвонков или костей запястья, причиной этому является остеопороз. Годовая стоимость лечения переломов в США к 2015 году прогнозируется на уровне более 20 млрд. долларов [99]. Отечественные и зарубежные травматологи-ортопеды утверждают, что смертность при характерном для остеопороза осложнении – переломе шейки бедра – в течение первых 6 месяцев после перелома достигает 30% [40, 85, 90, 103, 163]. С каждым годом растет число проводимых оперативных вмешательств по поводу переломов костей с применением разнообразных имплантатов, включая использование эндопротезов крупных суставов. По имеющимся данным, на каждую пятую операцию первичного эндопротезирования приходится одно реэндопротезирование, что чаще всего связано с развитием асептической нестабильности на фоне остеопоротических нарушений [39, 47, 90, 107, 197]. 5 Как известно, пусковой механизм для манифестации остеопороза – это нарушение равновесия между двумя главными процессами ремоделирования костной ткани: резорбцией и остеогенезом [22, 60, 64]. Существенным звеном в патогенезе развития остеопоротических нарушений, в частности связанных с длительной иммобилизацией, является нарушение трофики кости, приводящее к уменьшению активности и количества остеобластов, а также к активации остеокластов [97, 102, 129, 150, 178]. Кровоснабжение кости играет значительную роль в процессах как костного ремоделирования [20, 104], так и репарации повреждений костной ткани [22, 97, 102, 154, 178]. Микрососуды костной ткани представлены монослоем эндотелиоцитов и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев, следовательно, именно эндотелий опосредует гуморальную регуляцию обмена между остеоцитами и кровью [10, 19, 150, 182]. Следовательно, причиной нарушения кровоснабжения костной ткани может быть дисфункция эндотелия сосудов [25, 43, 73], которая таким образом может приводить к нарушениям образования кости и репаративной регенерации, вызывая остеопороз. В свою очередь, современная патогенетическая терапия остеопороза включает препараты, как замедляющие костную резорбцию (эстрогены, кальцитонин) [9, 13, 59, 60, 116] и стимулирующие костеобразование (фториды, анаболические стероиды), так и препараты многопланового действия (например, витамин D) [69, 77, 148, 149, 190]. Это разграничение является условным, так как все препараты, так или иначе, воздействуют на оба процесса ремоделирования. Однако неуклонный рост частоты остеопороза и остеопоротических переломов демонстрирует, что надежных способов терапии и профилактики этого заболевания не существует. В то же время современные фармакологические исследования показали положительное остеопротективное действие препаратов, корригирующих дисфункцию эндотелия. К ним, в первую очередь, относятся ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл, блокатор ангиотензиновых рецепторов лозартан и фитоалексин резвератрол [13, 20, 69, 138]. 6 Это указывает на актуальность дальнейшего поиска фармакологических агентов для воздействия на процессы костного ремоделирования, а также обосновывает избранное нами направление исследования. Цель исследования: сравнительное изучение остеопротективного действия L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном для фармакологической коррекции экспериментального остеопороза и нарушений консолидации переломов на его фоне. Задачи исследования: 1. Изучить антиостеопоротическое действие L-аргинина на модели экспериментального кровоснабжения остеопороза костной с ткани, использованием функциональных результатов сосудистых изучения тестов и морфометрического исследования в сравнении с препаратом Кальций-Д3 Никомед. 2. Изучить антиостеопоротическое действие комбинации L-аргинина с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе с использованием результатов изучения кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и морфометрического исследования в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед. 3. Изучить антиостеопоротическое действие комбинации L-аргинина с лозартаном при экспериментальном остеопорозе с использованием результатов изучения кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и морфометрического исследования в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед. 4. Изучить влияние L-аргинина на репаративную регенерацию кости при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального отдела бедра у крыс в сравнении с препаратом Кальций-Д3 Никомед. 5. Изучить влияние комбинации L-аргинина с эналаприлом на репаративную регенерацию переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед. 7 6. Изучить влияние комбинации L-аргинина с лозартаном на репаративную регенерацию переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед. Научная новизна исследования: впервые показано, что через 12 недель после операции овариэктомии развивается экспериментальный остеопороз, характеризующийся повышением признаками коэффициента дисфункции эндотелиальной сосудистого эндотелия дисфункции, значительным – снижением уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра и отрицательной динамикой морфометрических показателей. В работе впервые продемонстрировано, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии и его комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг, обладая эндотелиопротективной активностью, предотвращали локальное ухудшение микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. Таким образом, L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном способствовали замедлению истончения трабекул в губчатой кости и предотвращению возникновения микроповреждений трабекул, то есть обладали остеопротективным действием. Настоящее исследование впервые показало, что в группах животных, получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг в течение четырех недель по прошествии восьми недель после произведенной билатеральной овариэктомии, не наблюдалось достоверного влияния препарата на функционирование эндотелия сосудов костной ткани и состояние регионарной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра экспериментальных животных. Кроме того, Кальций-Д3 Никомед не оказывал остеопротективного воздействия при экспериментальном остеопорозе, что выражалось в отсутствии статистически значимого влияния препарата на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости. В работе впервые показано, что L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном, вводимые в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов на фоне остеопороза, повышали 8 показатели микроциркуляции в формирующейся костной мозоли проксимального отдела бедра у крыс не только по сравнению с животными с остеопоротическими переломами бедра, а также животными, получавшими Кальций-Д3 Никомед, но также и по сравнению с контрольными животными. Тем самым L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном статистически значимо улучшали частоту консолидации экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне гипоэстрогенного остеопороза. Научная новизна исследования подтверждается подачей двух заявлений на выдачу патентов РФ на изобретения № (заявки 2013143106 и № 2013143107). Научно-практическая значимость в работы: диссертационном исследовании обоснована эффективность L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном для коррекции остеопоротических изменений костей скелета и фармакотерапии остеопоротических переломов. Экспериментально доказано, что использование L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых реакций эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации. L-аргинин в качестве монотерапии и в сочетании с эналаприлом и лозартаном способствует увеличению кровоснабжения костной ткани при экспериментальном остеопорозе, гистоморфометрических замедлению показателей кости отрицательной динамики улучшению процессов и консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза. Результаты работы позволяют рекомендовать проведение клинических испытаний L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при распространенном остеопорозе и переломах на его фоне. Внедрение диссертационной результатов работы клинических исследований исследования: запланировано на проведение основании данных целенаправленных L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и 9 лозартаном в фармакологической коррекции остеопоротических нарушений при переломах костей. Полученные травматологии, результаты ортопедии используются и в военно-полевой курсах хирургии Государственного бюджетного образовательного профессионального образования «Курский университет» и кафедры фармакологии лекций и и фармакологии учреждения государственный кафедр высшего медицинский фармацевтических дисциплин Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования государственный «Белгородский национальный исследовательский университет». Связь диссертационного исследования с темами научно- исследовательских работ организации: работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов лечения и профилактики остеопоротических нарушений с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни пациентов» на 2010-2014 гг., номер государственной регистрации темы – 01201153218. Основные положения, выносимые на защиту: 1. L-аргинин в дозе 200 мг/кг при экспериментальном остеопорозе оказывает эндотелиопротективное действие, предотвращая повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции; позволяет избежать снижения локального кровоснабжения бедренной кости; обладает статистически значимым остеопротективным ширины костных действием, трабекул проявляющимся и замедлением предотвращением уменьшения возникновения их микроповреждений. 2. Комбинированное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг при экспериментальном остеопорозе оказывает более L-аргинином эндотелиальной выраженное эндотелиопротективное дисфункции; по сравнению действие, эффективно с снижая предотвращает монотерапией коэффициент уменьшение кровоснабжения костной ткани бедренной кости; обладает статистически 10 значимым остеопротективным действием, проявляющимся замедлением уменьшения ширины костных трабекул и предотвращением возникновения их микроповреждений. 3. L-аргинин в дозе 200 мг/кг статистически значимо повышает уровень микроциркуляции в зоне экспериментального остеопоротического перелома проксимального отдела бедра по сравнению с крысами с экспериментальными остеопоротическими переломами, что положительно сказывается на процессах репарации костных повреждений. L-аргинин увеличивает число позитивных результатов консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза у крыс. 4. Комбинированная терапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг позволяет предотвратить снижение уровня микроциркуляции в межотломковой области перелома проксимального отдела бедра у крыс, что положительно сказывается на результатах регенерации костни. Исследуемые комбинации препаратов увеличивают число позитивных результатов сращения экспериментальных переломов на фоне остеопороза у животных. Степень достоверности и апробация результатов: достоверность полученных в ходе проведения исследования результатов обеспечивается выбором современных лабораторных и инструментальных методов получения экспериментальной информации, адекватных методов статистической обработки первичных научных данных. Материалы диссертации были доложены на 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (г. Курск, 2011); на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Республика Татарстан, г. Казань, 2012); на X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвященной 10-летию Института последипломного медицинского образования, «Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины» (г. Белгород, 2012); 11 на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием проблемы «Современные медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012); на VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (г. Курск, 2013); на заседаниях Курского отделения ассоциации травматологов-ортопедов Российской Федерации (Курск, 2011, 2012, 2013). Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр фармакологии; клинической фармакологии; травматологии, ортопедии и военнополевой хирургии; гистологии, эмбриологии, цитологии; оперативной хирургии и топографической анатомии им. профессора А.Д. Мясникова; хирургических болезней №2; НИИ Экологической медицины Государственного бюджетного образовательного «Курский учреждения государственный высшего профессионального медицинский образования университет» Министерства диссертационного исследования здравоохранения Российской Федерации. Публикации: по материалам опубликовано 16 работ, в том числе три из них – в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, две – в иностранных изданиях. Поданы два заявления на выдачу патентов РФ на изобретения. Личный вклад автора: автору принадлежит ведущая роль в составлении плана и дизайна исследования, в постановке цели и поиске путей ее достижения. Им проведен подробный анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнялись экспериментальные исследования на 240 самках белых крыс линии Вистар с разделением их на группы: основных, сравнения и контрольных; выбраны критерии рандомизации. Диссертантом самостоятельно производился анализ и обобщение полученных результатов, составление графиков, таблиц и диаграмм, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия 70-90%. 12 Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования. Объем и структура диссертации: работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования развития и фармакологической коррекции экспериментального остеопороза и экспериментальных остеопоротических переломов и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 50 рисунков. Библиографический список включает 199 источников, в том числе 119 – на иностранном языке. 13 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Роль остеопоротических нарушений в процессах регенерации и репарации костной ткани У людей существуют три наиболее распространенные локализации возникновения остеопоротических переломов – это позвонки, кости запястья и проксимальный отдела бедра [128]. По данным некоторых исследований, остеопоротические переломы позвоночника являются наиболее распространенными – до 27% случаев, переломы дистального метаэпифиза лучевой кости – до 22% и повреждения проксимального метафиза бедра – до 15% случаев, оставшиеся 36% приходятся на другие локализации [64, 99]. Переломы проксимального отдела бедренной кости чаще приводят к инвалидизации, потере качества жизни и ранней смерти, чем в любой другой локализации перелома на фоне остеопоротических нарушений [40, 82, 85, 163]. Сращение перелома – физиологический процесс, необходимый для выживания организма. Несращение перелома приводит к тяжелому нарушению функции опорно-двигательного аппарата. Возникающие после переломов деформации сегментов конечностей из-за неправильной адаптации костных фрагментов чаще всего сопровождаются выраженным ограничением функции конечности. Консолидация перелома призвана полностью восстановить в сломанной кости прежнюю прочность, как до перелома, и является достаточно продолжительным по времени биологическим процессом. Короткая фаза эндохондрального образования наружной костной мозоли сменяется длительной фазой перестройки – ремоделирования костной ткани. Во время фазы образования эндохондральной мозоли существует опасность несращения костных отломков и возникновения повторного перелома. Остеопоротические нарушения оказывают отрицательное действие на физиологический процесс консолидации перелома [87, 88, 89, 126, 127]. 14 Репарация костной ткани имеет важное биологическое значение, поскольку направлена на полное восстановление пластинчатых костных структур до исходного состояния с целью возвращения кости первоначальной прочности [125, 126, 127, 148]. Переломы костей обычно определяют как полное или частичное нарушение целостности костных структур в результате травмирующего воздействия. Однако часто в трабекулярной костной ткани у пациентов с остеопорозом могут спонтанно возникать микропереломы, которые самостоятельно восстанавливаются путем образования микромозолей [127]. Сращение поврежденной костной ткани является трехступенчатым процессом [148], состоящим из трех последовательных стадий. 1-я стадия – фаза воспаления – начинается сразу же после травмы. Она характеризуется активацией общих механизмов заживления раны, как обычно происходит после повреждения мягких тканей: кровотечение, появление гематомы с привлечением макрофагов и других воспалительных клеток и постепенное образование кровяного сгустка [129]. Некоторые цитокины и факторы роста, такие как трансформирующий фактор роста β (ТФР-β) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), активируют привлечение дополнительных воспалительных клеток и проникновение мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток из периоста и костного мозга. В течение этой стадии формируется простейшая первичная фиброзная спайка [81, 98, 118, 121, 123], которая несколько ограничивает подвижность костных отломков в зоне перелома [129, 130]. Данная фаза протекает достаточно быстро и завершается в течение недели после перелома [136, 183, 192, 195]. 2-я стадия – фаза восстановления или репарации – начинается обычно после первой через 5-7 дней и продолжается несколько недель. Постепенно формируется твердая мозоль, которая обычно похожа на большое наружное кольцо вокруг места перелома. Микроподвижность костных фрагментов в зоне перелома активирует созревание межотломковой мозоли и ее трансформацию из хрящевой в более твердую костную ткань [125, 126, 127]. В этой фазе из поврежденной области удаляются нежизнеспособные ткани, и формируется новая 15 кость на месте временного хряща при участии дифференцированных остеобластов, сформировавшихся непосредственно из клеток-предшественников. В самой зоне перелома и на ее периферии в избытке образуется хрящевая ткань, примерно так же, как при эндохондральной оссификации во время роста кости [131, 137, 139]. Усиление выработки ряда факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста β2 (ТФР-β2), тромбоцитарный фактор роста (ТФР), инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1), и некоторых костных морфогенетических белков, таких как КМБ-2, -4, -5 и -6, активирует пролиферацию и дифференцировку хондроцитов. В результате этого концы костных фрагментов соединяются с помощью репаративной наружной периостальной мозоли, состоящей из ретикулофиброзной костной ткани, и это обеспечивает некоторую механическую фиксацию в месте перелома [159, 177, 185, 186, 196]. Первые две стадии консолидации перелома позволяют после начала сращения перелома частично восстановить нормальное функционирование кости. Стадия 3 – фаза перестройки или ремоделирования – является процессом непрерывной и постепенной адаптации сломанной кости к обычным нагрузкам в повседневной жизни. Полное восстановление биомеханической целостности достигается в течение длительного периода времени и связано с активацией хорошо известного механизма костного ремоделирования [87, 88, 89]. На этой стадии грубоволокнистая костная ткань в межотломковой мозоли постепенно заменяется на тонковолокнистую ткань или пластинчатую кость с перестройкой трабекулярного рисунка в зоне перелома [125, 126, 127, 148]. Переломы у больных с остеопоротическими изменениями чаще, чем в популяции в целом, сопровождаются осложнениями и нетрудоспособностью в периоде реабилитации [88, 89]. Экспериментальные исследования влияния остеопороза на консолидацию переломов, проведенные на крысах после овариэктомии, выявили замедленную консолидацию переломов и ухудшение механической прочности кости после завершения процесса консолидации, также в некоторых случаях наблюдалось несращение или неполное сращение 16 экспериментальных переломов [13, 20, 158]. Имеются клинические наблюдения, констатирующие, что остеопороз может замедлить консолидацию перелома у человека [88, 89]. Это можно объяснить тем, что у пациентов с остеопорозом рост и дифференцировка остеобластов обычно подавлены. Поэтому у больных сращение костно-травматических повреждений занимает больше времени [163]. Данное обстоятельство подтверждается исследованиями на животной модели остеопороза, индуцированного кортикостероидами [198]. Восстановление костной ткани после перелома является результатом тесного клеточного взаимодействия остеобластов и остеокластов, которые берут начало от предшественников различных клеточных линий, а именно: остеобласты – из мезенхимальных стволовых клеток, остеокласты – из макрофагальномоноцитарных клеток крови. Образование кости превышает резорбцию в течение роста скелета, и наоборот, резорбция превалирует в течение последующего периода жизни человека. Усилению остеокластной активности способствуют нарушения в системе, образуемой остеопротегерином (OPG), поверхностными рецепторами остеокластов, получившими название RANK (Receptor Activator of NF-kB), и их лигандами (RANKL, синоним OPGL), представляющими собой поверхностные рецепторы остеобластов. Известно, что механические и биологические факторы, вовлеченные в процесс заживления кости, подвержены влиянию остеопоротической патологии, примером тому является нарушение костного метаболизма на фоне эстрогендефицитных состояний в организме [80, 88, 152]. OPG-остеопротегерин, гликопротеин, обладает сильной ингибиторной активностью остеокластогенеза, т.е. является мощным ингибитором костной резорбции. OPG действует для RANKL как ложный рецептор, блокирует взаимодействие с RANK и таким образом ингибирует формирование зрелых остеокластов, тем самым нарушая процесс остеокластогенеза и резорбцию костной ткани [99]. Баланс между RANKL и OPG фактически определяет количество резорбированной кости. Исследования показали, что отсутствие гена OPG у мышей приводило к развитию раннего остеопороза, переломам позвонков 17 у взрослых особей. Мыши умирали от костных аномалий, кальцификации аорты и почечных артерий [6]. Также лиганды и рецепторы (RANKL-RANK-ОРG) участвуют в формировании, дифференцировке и активности ОК и могут быть молекулярными посредниками многих регуляторов [6]. Схематично межклеточное взаимодействие может быть представлено следующим образом: RANKL – трансмембранный лиганд, экспрессированный на поверхности остеобластов, связывается с RANK-рецептором, экспрессированным на предшественниках остеокластов кроветворных клетках, индуцирует процесс дифференцировки и созревания остеокластов [80]. При потере активности лиганда RANKL возникает дефект в ранней дифференцировке Т- и В-клеток, которые принимают активное участие в регуляции костного метаболизма, это доказывает необходимость RANKL для развития остеокластов [115]. Следует отметить, что местные тканевые факторы тоже стимулируют остеокластную активность: это фактор некроза опухолей α (TNFα), фактор простагландинов Е2 (PGE2), эпидермальный фактор роста (EGF) и интерлейкины 1, 3, 6, 11 (IL-1, 3, 6, 11), трансформирующий ростовой колониестимулирующий фактор фактор β (TGF β), макрофагальный (MCSF) и гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GMCSF). Также усиление резорбции костной ткани может отмечаться и при угнетении образования факторов, стимулирующих остеобласты, – инсулиноподобного фактора роста (IGF-1 и 2), фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), кислотного и основного ростовых факторов фибробластов (FGGS), некоторых костномозговых протеинов (ВМР-2, 4, 7), трансформирующего ростового фактора α (TGFα), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [101, 136, 172, 183, 192]. Все вышесказанное подтверждается экспериментальными исследованиями, которые продемонстрировали, что терапия крыс после овариэктомии остеопротегерином полностью предотвращала потерю костной ткани [6], из чего следует, что OPG играет важную роль в механизме антирезорбтивного действия эстрогенов на кость наряду с другими функциями эстрогенов. На модели адъювантного артрита было выявлено, что после введения OPG у крыс в начале 18 болезни происходила блокировка RANKL, которая предотвращала потерю кости и хряща [6]. Ряд клинических наблюдений показал, что после костной травмы возникает остеопения, которая является результатом высокой активности костного метаболизма, сращение перелома сопровождается повышением уровней биохимических маркеров костного метаболизма, особенно маркеров костной резорбции. У женщин в постменопаузальном периоде после полученного перелома наблюдаются более высокие уровни костных маркеров, в частности сывороточной тартрат-резистентной кислой фосфатазы 5b (sTRAP-5b) и остеокальцина в моче. В течение двух лет после травмы сохраняются повышенные концентрации биохимических маркеров синтеза и резорбции кости (сывороточная костная щелочная фосфатаза и сывороточный С-телопептид коллагена – sCTX), выше, чем до перелома [167]. Этот факт может служить объяснением, почему наличие перенесенного перелома в анамнезе является индикатором высокого риска нового перелома [143]. Таким образом, необходимо отметить, что процесс репарации костных повреждений многогранен, регулируется многими системными гормонами, цитокинами, факторами роста; идентифицированы многие локальные факторы костного ремоделирования [77]. Васкуляризация костной мозоли играет важную роль в ее созревании, способствуя постепенному замещению хрящевой мозоли костной тканью. простагландины, Паракринные вещества инсулиноподобный фактор (факторы роста роста), [142, такие 152, 184] как и тромбоцитарный фактор роста b [96, 97, 100, 129] усиливают ангиогенез, что благоприятно сказывается на консолидации костно-травматических повреждений. 1.2 Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование и репаративную регенерацию костной ткани В последнее время в научной литературе появляется все больше эпидемиологических, экспериментальных и клинических данных, 19 свидетельствующих о взаимосвязи сосудистой патологии и остеопороза [12, 66]. Существует теория, что ухудшение васкуляризации костной ткани может приводить к развитию ряда остеологических заболеваний, таких как остеопороз [103, 176], на фоне которого замедляются процессы регенерации кости при травматических повреждениях [13, 20]. Кровоснабжение костей происходит за счет разветвленных питающих сосудов метафизарных, эпифизарных и периостальных артериальных сетей [105], включающих в себя артериолы, которые, в свою очередь, делятся на анастомозирующую капиллярную сеть и синусоидные сосуды [187]. В костном мозге синусоиды обладают тонкой высокопроницаемой стенкой, состоящей из монослоя эндотелиальных клеток. Эти клетки поддерживаются сосудистой мембраной, периоцитами и ретикулярными клетками [164]. Сами синусоидные сосуды в окружении ретикулярных клеток, продуцируют значительное количество хемокина (SDF-1), требуемого для поддержания сохранности стволовых клеток [154]. Эти микрососуды соединяются с отдельными венулами, следующими параллельно артериолам, возвращаются к перихондральному сплетению [131]. Через сосудистую сеть в костную ткань поступают питательные вещества, необходимые хондроцитам и мезенхимальным клеткам для адекватного течения хондрогенеза и остеогенеза [154, 185, 193]. Травмы костной ткани всегда сопровождаются повреждением сети сосудов, что ведет к прогрессированию гипоксии близлежащих тканей с последующей их гибелью [129]. При нарушении васкуляризации в зоне травматической патологии происходит активация тромботических факторов свертывания крови и формирования гематомы. Продукты распада тканей в области перелома и воспалительная реакция активируют такие факторы, как цитокины и факторы роста, вследствие чего к месту травмы подтягиваются мезенхимальные и остеопрогениторные клетки. Усиление эндостального кровообращения в зоне поврежденной кости дает возможность мезенхимальным клеткам, связанным с растущими капиллярными сосудами, проникать в область перелома со стороны эндоста и костного мозга [176, 193]. При этом в межотломковой области 20 достаточно быстро развивается грануляционная ткань, которая впоследствии замещается фиброзно-хрящевой, тем самым формируется первичная спайка. Впоследствии начинаются процессы интрамембранозного костеобразования в надкостнице, ведущие к образованию внешней костной мозоли [102], во внутренних слоях фиброзно-хрящевая ткань минерализуется и образуется рыхлая губчатая кость [185], которая стабилизирует костные фрагменты. В этот момент в зоне перелома активируются все процессы ремоделирования, при которых лизис некротизированной кости остеокластами сопровождается ангиогенезом с поэтапной заменой массивной костной мозоли на пластинчатую кость. Конечным результатом этих процессов является восстановление нормального кровоснабжения и уменьшение размера межотломковой костной мозоли [143]. В восстановлении костной ткани участвует большое количество медиаторов [187], которые связаны с эмбриональным и постнатальным развитием кости, играющих значительную роль в регенерации кости. К ним можно отнести BMP-2, BMP-4 [93, 136,196], VEGF [172, 179], bFGF, PDGF [96, 98, 101, 177]. Примером этому могут быть исследования, в которых выявлены признаки медиатора VEGF на клетках хрящевого происхождения [186], остеопрогениторных клетках и предшественниках клеток костного ряда в костной мозоли [191]. В свою очередь, остеокласты продуцируют гепариназу, которая способствует выделению активных форм VEGF из гепарина, что приводит не только к усилению ангиогенеза, но и к активизация остеокластов, тем самым стимулируя ремоделирование костной мозоли во время эндохондральной оссификации [133, 140]. Фактор роста эндотелия сосудов – VEGF – является ключевым протагонистом, участвующим в неоангиогенезе. Данное положение подтверждается исследовательскими работами, в которых была выявлена первостепенная роль ингибирования фактора роста эндотелия сосудов при переломах костей задней конечности у мышей в развитии значительного снижения кровоснабжения в зоне повреждений за счет уменьшения прорастания кровеносных сосудов, благодаря чему ухудшается минерализации 21 межотломковой костной мозоли и нарушается перестройка костных трабекул [172, 192, 195, 196]. Также фактор VEGF и его рецепторы имеют функцию основных регуляторов молекулярных и клеточных взаимодействий, которые формируют зрелую сосудистую сеть в поврежденных тканях [123, 170, 179, 183, 192]. Данный фактор, мембранными рецептором-2 влияя на тирозинкиназными VEGF), активирует ангиогенез, взаимодействует рецепторами (рецептором-1 их, при этом запускается с двумя VEGF и механизм, приводящий к усилению роста клеток эндотелия сосудов и их пролиферации. Благодаря этим свойствам медиатор VEGF значительно влияет на рост [170, 178, 194] и репарацию повреждений костной ткани [115, 118, 191]. Морфологическое строение костных микрососудов имеет существенные отличительные особенности от структуры сосудов остальных тканей организма. У них отсутствуют мышечный и соединительнотканый слои, они имеют только эндотелиальный слой, из этого следует, что именно через сосудистый эндотелий происходит вся гуморальная регуляция обменных процессов. Таким образом, эндотелий, будучи неотъемлемой частью костной ткани, играет важную роль во взаимодействиях между клетками эндотелия и клетками костей, направленных на поддержание целостности костных структур [142]. Эндотелий сосудов состоит из эндотелиальных клеток и представляет собой непрерывную однослойную плоскую структуру мезенхимального происхождения, выстилающую всю кровеносную систему [5, 11, 25], а также и лимфатические сосуды [34, 35, 122, 132], является активной динамической структурой, контролирующей множество важных функций [29, 72, 76, 147]. Сосудистый эндотелий обладает функцией барьера между сосудистой стенкой и кровью, реагирует на воздействие тока крови и на напряжение сосудистой стенки, чувствительной к различным нейрогуморальным факторам, также продуцирует большое количество существенных биологически активных веществ: как вазодилататоров (NO, фактор гиперполяризующий эндотелиальный, простациклин), так и вазоконстрикторов (ангиотензин II, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, эндотелин, простагландин F2-α и тромбоксан 22 А2), то есть является гигантским паракринным органом человеческого организма [16, 38, 79]. Основная роль эндотелиальных клеток определяется поддержанием васкулярного гомеостаза посредством регуляции равновесия главенствующих процессов: сосудистого гемоваскулярного тонуса гемостаза и (вазоконстрикция (продуцирование вазодилатация), антикоагулянтных и прокоагулянтных медиаторов), пролиферации клеток в различных тканях, активацией или замедлением действий ростовых факторов, локального воспаления (производство противо- и провоспалительных факторов). Также через эндотелий сосудов окружающие ткани обеспечиваются гормонами, цитокинами, хемокинами и метаболитами. В случае необходимости сосудистый эндотелий является барьером, ограничивающим движение молекул, а также клеток, и обеспечивает взаимодействие с другими слоями сосудистой стенки. Многие факторы-аттрактанты, которые представлены на поверхности сосудистого эндотелия костей, привлекают из кровеносного русла гематопоэтические клетки в костный мозг, где последние, связываясь с различными агентами, принимают активное участие в процессах регенерации кости. В ряде экспериментальных исследований было обнаружено влияние эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) на пролиферацию стромальных клеток костного мозга человека (HBMSC), под воздействием которой происходит дифференциация HBMSC в остеобластах [157]. Из этого было сделано заключение, что эндотелиальные клетки контролируют деление стромальных клеток костного мозга в остеобластах и мобилизуют остеопрогениторные клетки к месту регенерации кости. Благодаря этому механизму предшественники остеобластов способны мигрировать к месту формирования кости из сосудистого русла, затем начинается дифференцирование их в зрелые остеобласты с образованием новой остеоидной ткани [18]. Также существует теория о том, что клетки эндотелия принимают участие в функционировании остеокластов. В область резорбции костной ткани клетки предшественники остеокластов проникают через эндотелий путем трансэндотелиальной миграции, как лейкоциты и моноциты, а эндотелиальные 23 клетки являются регулировщиками данных процессов [170]. Поэтому любые изменения, в структуре капиллярных сосудов могут привести к нарушению тонко сбалансированных последовательных процессов резорбции и костеобразования, что ведет к нарушению восстановления кости и развитию заболеваний костной системы [104, 105, 130, 145, 178]. При альтерации кровоснабжения костной ткани происходит торможение активности остеобластов и усиление деятельности остеокластов, что ведет к потере костной массы и формированию остеопоротических нарушений [60, 66, 178]. Эндотелиальные клетки микрососудов костной ткани обладают и другими свойствами: способностью отвечать на действие регуляторов костного метаболизма, таких как цитокины и эстрогены [95, 182]; вырабатывают значительное количество гормонального натрийуретического пептида типа В [134]; усиливают действие хемоаттрактанта – производного стромальных клеток фактора-1 (SDF-1) [181], который позволяет поддерживать постоянное поступление гемопоэтических клеток-предшественников в костную ткань [98]. Также клетки эндотелия стимулируют макрофагальные колониестимулирующие факторы и остеопротегерин [86, ремоделировании и активность. макрофагальным К остеорепарации участвующие 124,162], и влияющие факторам на можно в костном остеобластическую отнести костные морфогенетические белки (BMP), факторы роста фибробластов, различные простагландины, фактор роста эндотелия сосудов, инсулиноподобный фактор роста-1 и оксид азота [10, 52, 165, 168, 169]. Экспериментально доказано, что остеогенные факторы, такие как BMP-2, стимулируя медиатор VEGF, ингибируют гипоксия-индуцированный апоптоз клеток и тем самым усиливают васкуляризацию. При этом вариации потенциала кислорода и его касательного напряжения могут усиливать выраженность экспрессии BMP-2 в эндотелиоцитах сосудов микроциркуляторного русла [34, 96]. В свою очередь, гипоксические явления вместе с VEGF воздействуют на регуляцию BMP-2 в эндотелиоцитах [136]. Этот стресс-кислород-чувствительный механизм является ответной реакцией клеток эндотелия на механическое повреждение кости, включающей 24 множество факторов, которые впоследствии влияют на качество и скорость регенерации костной ткани. К осложнениям сращения переломов относятся замедленная консолидация костно-травматических повреждений и формирование ложных суставов. У этих последствий переломов может большое количество различных причин. В частности, длительный прием противовоспалительных и стероидных препаратов, глюкокортикодов [3], недостаточность витаминов С и D и кальция [9, 54, 74]. Нарушение васкуляризации в зоне перелома тоже является одним из основных факторов замедления сращения или несращения переломов. Это наглядно показано в некоторых исследованиях, где ангиогенные факторы благотворно влияют на восстановление кости [97], а их взаимодействие с остеогенными факторами значительно активирует регенерационную способность костной ткани [97, 144, 196]. Еще одним фактором роста, стимулирующим ангиогенез, является FGF-2 [81, 91, 93, 113, 139], экспериментально было выявлено, что на ранних стадиях сращения переломов он при введении в организм извне способен усиливать остеорепарацию [83, 114, 120] за счет активации пролиферации и дифференциации остеобластов [113], что в целом позитивно воздействует на заживление костно-травматических повреждений. Исходя из вышеизложенного, очевидна тесная взаимозависимость между сосудистой сетью, эндотелием сосудов и костной тканью. В условиях гипоксии, вызванной травматическими повреждениями тканей, активируются процессы роста сосудов. Основным событием для нормального течение процессов ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия сосудов. В связи с повышением проницаемости сосудов происходит необходимый выход фибриногена, приводящий к формированию фибринового базиса для дальнейшей миграции клеток эндотелия. Базисным регуляторным механизмом новообразования сосудистой сети является освобождение факторов ангиогенеза из эндотелиоцитов, тучных клеток, макрофагов и других. Эти факторы активизируют эндотелиоциты (главным образом в посткапиллярных венулах), при 25 миграции которых через базальную мембрану формируются ответвления сосудов [75]. Следовательно, одна из причин нарушения микроциркуляторного кровоснабжения является эндотелиальная дисфункция (ЭД), которая может приводить к спазму сосудов [5, 35, 73] и усиленному тромбообразованию [76, 111, 122, 132], что, в свою очередь, может вызывать нарушение процессов регенерации кости. Дисфункция эндотелия – это дисбаланс между образованием вазодилатирующих, антипролиферативных, ангиопротективных факторов с одной стороны и протромботических, вазоконстрикторных, пролиферативных факторов со второй стороны, приводящий к возникновению расстройств васкулярного гомеостаза. Также эндотелиальная дисфункция характеризуется патологией эндотелия в сторону уменьшения вазодилатации, провоспалительного состояния и протромботических свойств. Надо отметить участие эндотелия не только в возникновении и развитии различных патологических состояний, связанных с регуляцией тонуса сосудов, но и участие его в процессах тромбообразования, атерогенеза, обеспечения целостности стенки сосудов. Сосудистые эндотелиоциты, вырабатывая локальные медиаторы, ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока. NO является основным гуморальным эндотелиальным модулятором вазодилатации, продуцируемым эндотелиоцитами. В нормальном состоянии эндотелий не только контролирует тонус сосудистой стенки посредством высвобождения ряда факторов, способствующих вазодилатации и вазоконстрикции [111, 122, 132], но и регулирует сократимость гладких миоцитов сосудистой стенки, а также модулирует функцию гемостаза и способствует выработке отдельных медиаторов роста сосудов [5, 11, 35, 73, 76]. NO синтезируется эндотелиоцитами из аминокислоты L-аргинина. Данный процесс представляется комплексной окислительной реакцией, катализируемой ферментом NO-синтазой (NOS) [35, 53, 199], который находится в мембранах аппарата Гольджи, состоящего из присоединенного молекулярного кислорода к 26 конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина [84, 117, 155, 180, 188]. Оксид азота вызывает релаксацию гладких миоцитов сосудистой стенки, оказывает влияние на гемокоагуляцию, снижает тромбоцитарную агрегацию и выраженность экспрессии молекул адгезии на поверхности моноцитов и нейтрофилов, предотвращает перестройку структуры эндотелиоцитов, замедляя рост и пролиферацию гладких миоцитов. Оксид азота также присутствует в клетках эндотелия не зависимо от их локализации, в латентном состоянии эндотелиоциты постоянно вырабатывают NO, нормализуя тонус артериальных сосудов. Некоторые медиаторы, такие как антидиуретический гормон, ацетилхолин, гистамин, брадикинин, тромбин, АТФ, АДФ, а также некоторые факторы и явления (например, движение крови по сосудам и прочие), способны стимулировать выработку NO. Известно, что оксид азота регулирует активность большого количества разнообразных биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, также он выполняет функции межнейронной передачи, принимает участие в мнемонических механизмах, обладает бактерицидными свойствами. Соединение оксида азота является нестабильным химическим веществом, существующим лишь несколько секунд. Данное вещество проникает вовнутрь стенки сосудов и в тромбоциты, которые находятся в тесном контакте с эндотелиоцитами. В крови происходит быстрая инактивация NO растворенным кислородом, гемоглобином и супероксидными анионами. Оксид азота, окисляясь, превращается в пероксинитрат-радикал. Чаще всего пероксинитрат-радикал образуется при стрессах, тяжелых травмах и нарушениях липидного обмена. Этот радикал достаточно агрессивен, способствует оксидации липидов низкой плотности, обладает цитотоксическим и мутагенным действием, способен повреждать ДНК, разрушать мембраны клеток, нарушать деятельность энзимаотческих систем [168]. Увеличение негативных воздействий данного патогенного фактора, находящегося в системном и тканевом кровотоке, вызывает гибель эндотелиоцитов, что, в свою очередь, приводит к развитию эндотелиальной дисфункции [15, 162, 180]. Из всего вышесказанного следует 27 вывод, что дисфункция эндотелия – это патологическое состояние эндотелия, при котором имеется недостаточная продукция оксида азота [31, 34, 73]. Одной из ведущих причин развития дисфункции эндотелия является хроническая гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы. Это положение доказывается рядом иммуногистохимических исследований, выявивших, что основная часть ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) находится на мембранах эндотелиоцитов коронарных сосудов артериальной сети и незначительная часть данного фермента обнаруживается в половине артериальных капилляров, при этом полностью отсутствует в венозных сосудах. Тонус сосудов регулируется синтезом ангиотензина-2 (АТ-2), который оказывает позитивный вазоконстрикторный эффект благодаря активации рецепторов гладкомышечных клеток. Брадикинин, продуцируемый из субстрата кининогена посредством калликреина, обладает сильным вазодилатирующим эффектом, а ангиотензинпревращающий фермент является катализатором распада брадикинина на неактивные фрагменты. Блокада B2-кининовых рецепторов эндотелиоцитов приводит к уменьшению синтеза оксида азота и повышению тонуса гладких миоцитов [7, 8, 41, 44, 76]. Существует мнение: дисбаланс между вазодилататорами и вазоконстрикторами ведет к регионарному повышению тонуса сосудов [21]. Внутриклеточное свободнорадикальное окисление тоже играет большую роль в нарушении эндотелийзависимой вазодилатации. Некоторые экспериментальные исследования обнаружили, что ангиотензин-2, являясь мощным медиатором свободнорадикального окисления, вызывает констрикцию артерий, усиливает продукцию цитокинов, активируя при этом воспаление в сосудистой стенке [21, 63, 65]. Таким образом, функция эндотелия представляется сложным механизмом тесного взаимодействия медиаторов-антагонистов. Строение сосудистого эндотелия гетерогенно, например, эндотелиоциты церебральных, коронарных и легочных сосудов существенно различаются между собой по активности генов и по белковой, ферментативной, медиаторной и рецепторной структуре. Поэтому 28 патологические состояния в клетках эндотелия развиваются по-разному. Некоторые из них более чувствительны к ишемическим воздействиям, а другие реагируют на наличие токсического компонента, на развитие отека в тканях и так далее. Эти свойства имеют существенное значение в патогенезе дисфункции эндотелия. Таким образом, в вышеизложенном материале продемонстрирована первостепенная роль нормального кровоснабжения в процессах остеогенеза и остеорепарации. В свою очередь, из-за эндотелиальной дисфункции ухудшается кровоснабжение костной ткани посредством снижения микроциркуляции, что ведет к расстройству остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым такие остеологические заболевания, как остеопороз, на фоне которого замедляется консолидация костно-травматических повреждений. Данное положение диктует необходимость разработки альтернативных подходов к проблеме нарушения консолидации переломов при остеопоротических изменениях костей скелета. 1.3 Фармакотерапия нарушений функционирования сосудистого эндотелия L-аргинином, эналаприлом и лозартаном В последнее время стало очевидным, что эндотелий сосудов – это активная метаболическая система, которая функционирует как рецепторно-эффекторный орган, реагирующий на любые физические или химические раздражители секрецией веществ, с помощью которых он может поддерживать вазомоторный баланс и сосудисто-тканевый гомеостаз [30, 42, 71, 169]. Также сосудистый эндотелий представляется основным модулятором тонуса сосудистой стенки, вырабатывает различные вазоактивные соединения, наиболее важным из которых является оксид азота (NO). Оксид азота – это лабильная субстанция, высвобождаемая эндотелиоцитами во время катаболизма L-аргинина при активном участии NO-синтазы [26, 55]. Данное вещество является самым мощным из известных в настоящее время вазодилататором [61, 62, 110, 124]. 29 Широкий диапазон биорегуляторных действий оксида азота в сосудах демонстрирует, что снижение его уровня в эндотелиальных клетках под влиянием разных патогенных факторов вызывает существенные изменения их функций и кровообращения. К ним относятся: снижение свойств эндотелийассоциированных вазодилататоров, увеличение вазоконстрикторных эффектов, рост артериального давления на этом фоне, нарушения системной и регионарной гемодинамики, увеличение активности молекул адгезии эндотелия, тромбоцитарной агрегации, адгезия тромбоцитов и лейкоцитов к стенке сосуда и другие [26, 27, 34, 122]. Отдельные исследовательские работы последних лет показали, что указанные нарушения, определяющие дисфункцию эндотелия [135, 146, 173], имеют место во многих случаях сосудистых заболеваний, таких, например, как артериальная гипертония [2,112], атеросклероз [5, 94, 171], ишемическая болезнь сердца [36], сердечная недостаточность нарушения [189], почечного кровообращения, легочного кровообращения [109], кровообращения в головном мозге, кишечнике, конечностях, а также при остеопоротических нарушениях костей [13, 20]. Патогенетические механизмы постменопаузных состояний являются многофакторными и гораздо более сложными, чем просто влияние сниженного уровня эстрадиола в крови. Очевидно, что один из этих пусковых механизмов связан с нарушением эндотелийзависимой вазодилатации, вызванным снижением биодоступности оксида азота, то есть дисфункцией эндотелия [25, 66, 112]. Это объясняет повышение активности ренина плазмы, стимуляцию окислительного стресса, увеличение соль-чувствительности, ожирение, повышение симпатического тонуса [160, 161, 175]. Коррекция дисфункции эндотелия при гипоэстрогенных состояниях считается важной для восстановления баланса регуляций таких факторов, как: сосудистый тонус, гемостаз, иммунный ответ, миграция кровяных клеток в стенку сосуда, уменьшения выработки факторов воспаления, укрепления барьерных функций эндотелия [161, 162]. К одному из звеньев механизма, ведущего к формированию дефицита оксида азота и провоцируемой дисфункции эндотелия, можно отнести недостаток 30 L-аргинина. В плазме крови уровень L-аргинина оказывается сниженным при многих заболеваниях сердечно-сосудистой системы [36, 84, 188, 199]. Обнаружено, что пероральное и парентеральное введение L-аргинина в организм больных при ряде заболеваний восстанавливает сниженный у них уровень Lаргинина, NO и функции эндотелия, давая соответствующий терапевтический эффект [56, 84, 155]. Это обстоятельство позволило предположить, что эндотелиальная дисфункция у таких больных может быть обусловлена недостатком L-аргинина в качестве субстрата для эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). В эндотелиальных клетках в результате биосинтеза из аминокислоты L-аргинина продуцируется оксид азота при участии фермента эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), обладающей значительным влиянием на регуляцию сердечно-сосудистой системы. Образование оксида азота осуществляется с промежуточным синтезом N-гидрокси-L-аргинина (NHA), который вырабатывается в результате поглощения молекулы кислорода и 2 электронов. Далее NHA преобразовывается в L-цитруллин и оксид азота при участии 1 молекулы кислорода и 1 электрона [56, 188, 199]. Исходя из вышеизложенного, очевидна существенная роль L-аргинина в предотвращении эндотелиальной дисфункции. L-аргинин относится к группе полунезаменимых аминокислот и был впервые обнаружен в 1886 г. [180]. Данный препарат является предшественником оксида азота [169] и имеет широкий диапазон биорегуляторных свойств [36, 84, 188, 199]. Ежедневный прием этого вещества с пищей составляет около пяти грамм [199], при этом до 40% его разрушается аргиназой – ферментом, разрушающим аргинин, а также при абсорбции, его остальное количество попадает в воротную вену [132]. Концентрация L-аргинина в плазме крови у человека варьирует от 95 до 250 мкмоль/л. Количество проходящего в эндотелиоциты аргинина, в первую очередь, зависит от таких факторов, как: активность мембраносвязанной системы транспорта – высокоактивного натрий-независимого транспорта аминокислот; 31 активность аргиназы, прочих факторов. Изолированные клетки эндотелия имеют концентрацию аргинина 1-2 ммоль/л. При недостаточности его в клетках L-аргинин–L-цитролиновый цикл может компенсировать дефицит аргинина. Концентрация аргинина в эндотелиоцитах зависит от активности фермента, который превращает аргинин в мочевину и орнитин, при этом аргиназа-I – конститутивная, а аргиназа-II стимулируется в клетках эндотелия липополисахаридами и интерфероном [132, 199]. Помимо приведенного ранее прямого влияния аргинина на образование оксида азота, существуют и другие его свойств. Он косвенно воздействует на увеличение секреции инсулина [188] и высвобождение гистамина из тучных клеток [117], что, в свою очередь, ведет к дополнительному образованию оксида азота и эндотелийзависимой вазодилатации [155]. В последнее время появились публикации, где экспериментально доказано, что терапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг предотвращает развитие гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота [56]. Помимо L-аргинина, коррекция дисфункции эндотелия может осуществляться и другими лекарственными средствами, например нитратами, которые восстанавливают дефицит NO, ингибиторами АПФ, которые блокируют синтез ангиотензина-2 и предотвращают распад кининов, антагонистами кальция, тормозящими активность ангиотензина-2 и эндотелина в гладких миоцитах сосудов, потенцируя, тем самым, воздействие NO на дилатацию сосудов. Надо отметить, что в настоящее время препаратов для специфической фармакотерапии эндотелиальной дисфункции не существует [2, 29, 42, 71]. Коррекция гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота может осуществляться ингибиторами АПФ, к ним, в частности, относится эналаприл. Препараты этой группы восстанавливают обмен брадикинина, ингибируют тканевой пул ангиотензинпревращающего фермента, следствием чего является ингибирование синтеза ангиотензина-2 и деградации брадикинина. При этом в большей степени эффективны ингибиторы АПФ, которые обладают наибольшим воздействием на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему. Также к 32 предполагаемым механизмам влияния этих веществ можно отнести уменьшение инсулин-индуцированной и базальной выработки эндотелина-1 и рост выработки NO. Данное положение подтверждено исследованиями на крысах со спонтанной артериальной гипертензией (АГ) [25,70]. Например, каптоприл и цилазаприл восстанавливают функцию эндотелия, повышая продукцию оксида азота, в частности NO, помимо этого, цилазаприл способствует выработке эндотелиального гиперполяризующего фактора, что позитивно влияет на функцию эндотелия в целом, а рамиприл предотвращает развитие дисфункции эндотелия, спровоцированной действиями низкой плотности [4, 31, 32, 174]. Также в недоокисленных эксперименте липопротеидов была выявлена положительная способность кандесартана и эналаприла к восстановлению функции эндотелия мезентериальных сосудов у крыс со спонтанной артериальной гипертензией [14, 57, 58, 108, 119]. Надо отметить, что помимо выраженных эндотелиотропных эффектов у эналаприла в дозе 0,5 мг/кг в ряде исследований были обнаружены остеопротективные свойства [13, 20]. Антагонисты ангиотензиновых рецепторов также обладают эндотелиопротективным действием, механизм влияния этих препаратов, скорее всего, опосредован блокадой АТ1-рецепторов, приводящей к ингибированию синтеза и накопления супероксид-радикалов и уменьшению связывания оксида азота. Известно, что стимуляция ангиотензин-1-рецепторов провоцирует выработку супероксидов, инактивирующих оксид азота, тогда как стимуляция ангиотензин-2-рецепторов вызывает вазодилатацию и усиление натрийуреза, обусловленное активированием системы брадикинина, оксида азота и циклоГМФ. Влияние ангиотензина-2 (активация образования или ингибирование оксида азота) обусловлено типом рецепторов, с которыми он в основном взаимодействует. Вот почему при блокаде АТ1-рецепторов формируются позитивные условия для усиления деятельности не блокированных ангиотензин2-рецепторов, приводящие к накоплению оксида азота. Данное положение подтверждается рядом исследователей, которые обнаружили увеличение уровня цГМФ в аорте при приеме лозартана у крыс со спонтанной артериальной 33 гипертензией, что свидетельствует об интенсификации последним синтеза оксида азота. В некоторых экспериментальных работах продемонстрировано, что при моделировании артериальной гипертензии профилактическое использование лозартана позволяет блокировать воздействие ангиотензина-2 на формирование супероксид-радикалов, при этом у крыс с нарушением синтеза оксида азота в надпочечниках способствует возникновению и поддержанию повышенного артериального давления, лозартан же увеличивает концентрацию нейрональной синтазы оксида азота в надпочечниках, тем самым нормализуя синтез оксида азота. При обследовании пациентов с эссенциальной гипертензией было обнаружено улучшение эндотелиальной функции резистивных артерий при лечении лозартаном, что может объясняться стимуляцией синтеза оксида азота [28, 45, 46, 51, 52]. При этом у больных повышается активность синтазы оксида азота как в плазме, так и в эритроцитах, увеличивается концентрация стабильных метаболитов оксида азота, то есть улучшает функция эндотелия, нормализуется активность почечной ксантиноксидазы и увеличивается брадикинин- опосредованная продукция NO в почках [53, 68, 78, 108, 166]. К имеющимся эффектам лозартана в некоторых исследованиях было обнаружено положительное воздействие данного препарата на регенерацию костной ткани [13, 20]. Исследования, выполненные в НИИ экологической медицины КГМУ, доказали, что через 6 недель после двусторонней овариэктомии у самок крыс формируется и в последующем прогрессирует гипоэстрогенная дисфункция сосудистого эндотелия [30], на фоне которой по прошествии восьми недель после удаления яичников у половозрелых самок крыс формируется гипоэстрогенный генерализованный остеопороз [20, 138]. Комплекс патологических изменений после овариэктомии у самок крыс подтверждает концепцию, в которой основным звеном в развитии остеопоротических нарушений является эндотелиальная дисфункция микроциркуляторного русла кости, негативно влияющая посредством ухудшения кровоснабжения кости на процессы костного ремоделирования. Лозартан и эналаприл, оказывая позитивное влияние на регионарную 34 микроциркуляцию, обладают остеопротективными эффектами, что положительно сказывается на сращении переломов [13, 20]. L-аргинин обладает выраженными эндотелиопротективными эффектами, поэтому можно предположить, что данный фармакологический агент имеет остеопротективные свойства. Поэтому не подлежит сомнению актуальность исследования перспектив использования L-аргинина в качестве монотерапии и в комбинациях с другими эндотелиотропными препаратами для коррекции остеопоротических нарушений костей скелета и переломов на фоне остеопороза. РЕЗЮМЕ Васкуляризация играет важную роль в формировании костной ткани и восстановлении ее после травматических повреждений. Появление новых методов исследования постепенно объясняет функции разных остеогенных и ангиогенных факторов, участвующих в развитии костной ткани. Благодаря этим факторам можно объяснить взаимосвязь костной ткани и эндотелиоцитов, а также главенствующую роль локального кровоснабжения в посредничестве между ними. Одной из причин развития остеопоротической патологии на фоне замедления сращения или несращения переломов является ухудшение регионарного кровоснабжения, основой которого является дисфункция эндотелия. Понимание этих процессов создает теоретическую предпосылку для исследования влияния препаратов с доказанными эндотелиопротективными свойствами на костное ремоделирование и остеорепарацию. Все вышеизложенное указывает на актуальность изучения остеопротективных эффектов L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном. 35 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Моделирование экспериментального остеопороза Исследование проводили на 120 белых крысах-самках Вистар с массой тела 200-300 г. Для предварительно моделирования подвергали экспериментального наркотизации посредством остеопороза крыс внутрибрюшинной инъекции водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг, после чего осуществляли операцию двусторонней овариэктомии [138]. По прошествии восьми недель у данных животных развивается системный остеопороз [20]. Исследуемые препараты и комбинации препаратов для коррекции остеопоротических изменений костей применяли с девятой по двенадцатую неделю эксперимента включительно (рис. 2.1). Рисунок 2.1 – Схематическое изображение хода эксперимента на модели экспериментального остеопороза В качестве контроля использовали животных, которым была проведена ложная операция овариэктомии (вскрытие под наркозом брюшной полости без удаления яичников, послойное зашивание раны). Степень выраженности остеопоротических изменений анализировали спустя 12 недель после проведения овариэктомии посредством проведения гистоморфометрии (рис. 2.1). 2.2 Моделирование закрытых остеопоротических переломов бедренных костей и их остеосинтез Исследование было проведено на 120 белых крысах-самках Вистар с массой 36 тела 200-300 г. У всех крыс (за исключением контрольной группы) моделировали экспериментальный остеопороз путем удаления обоих яичников (в соответствии с методикой, описанной в п. 2.1 настоящей диссертации). Далее, по прошествии восьми недель после овариэктомии, на фоне развившегося остеопороза [13, 20] моделировали переломы бедренных костей подопытных животных (остеопоротические переломы) (рис. 2.2). Рисунок 2.2 – Схематическое изображение хода эксперимента на модели экспериментального остеопороза Для этого крыс предварительно наркотизировали (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг). После наркотизации животных без разреза мягких тканей, при помощи крампонов с надетыми на режущие поверхности силиконовыми трубками, производилось внешнее воздействие на проксимальный отдел бедренной кости (между большим и третьим вертелами бедренной кости). Нагрузка осуществлялась перпендикулярно оси кости до появления в ней перелома. В дальнейшем для фиксации и стабилизации переломов производили закрытый миниинвазивный интрамедуллярный остеосинтез следующим способом. Со стороны дистального эпифиза бедренной кости при согнутой в коленном суставе задней конечности животного, вдоль оси кости в асептических условиях через прокол кожи и кортикальный слой, а далее интрамедуллярно, проводили спицу Киршнера, имеющую диаметр, соответствующий ширине внутреннего диаметра костномозгового канала бедра, с помощью струбцины. Во время остеосинтеза спица проходила сквозь ткань дистального метафиза, диафиз, зону 37 перелома и прочно фиксировалась в костномозговом канале и проксимальном метафизе бедренной кости (рис. 2.3). Рисунок 2.3 – Схема интрамедуллярного остеосинтеза бедра. Красным цветом обозначено место перелома, синим – спица Киршнера, введенная в костномозговой канал бедренной кости крысы Контроль прочности фиксации определяли по отсутствию патологической подвижности в области перелома. Фрагмент спицы, выстоящий за пределы эпифиза кости, коротко скусывали и полностью погружали в ткань кости. На прокол кожи в месте введения спицы накладывали один шов капроновой нитью, рану обрабатывали кожным антисептиком. Исследуемые препараты в качестве монотерапии и комбинации препаратов применяли с первой по четвертую неделю после воспроизведения и остеосинтеза переломов включительно (рис. 2.2). 38 Таким образом, результаты консолидации переломов оценивали визуально и рентгенографически по прошествии четырех недель после остеосинтеза переломов или через 12 недель после начала эксперимента. 2.3 Измерение уровня микроциркуляции в кости, проведение функциональных сосудистых тестов Уровень микроциркуляции на модели экспериментального остеопороза оценивали в ткани проксимального отдела бедра, на модели остеопоротических переломов – в ткани формирующейся костной мозоли через 12 недель после начала эксперимента (проведения операции удаления яичников). Для этого после наркотизации (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) производили хирургический доступ к проксимальному отделу бедренной кости крысы. После формирования отверстия в кортикальном слое кости или на поверхности костной мозоли глубиной до 2 мм, вводили в него игольчатый датчик для исследования состояния регионарной микроциркуляции. Уровень микроциркуляции костной ткани или в костной мозоли исследовали с помощью аппаратного комплекса Biopac systems, включающего блок полиграфа MP100, LDF100C – блок лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и датчик TSD144, который после хирургического доступа вводился в ткань проксимального отдела бедра. Метод лазерной допплеровской флоуметрии – это способ диагностики, при котором применяется зондирование тканей лазерным лучом. Обработка отраженного излучения от тканей основана на выделении из зарегистрированного сигнала допплеровского сдвига частоты отраженного сигнала, пропорционального скорости движения эритроцитов. В ходе проводимых исследований обеспечивается регистрация микроциркуляторном русле (рис. 2.4, 2.5) [49]. изменения потока крови в 39 Рисунок 2.4 – Пример ЛДФ-граммы: уровень микроциркуляции в мышечной ткани бедра Рисунок 2.5 – Пример ЛДФ-граммы: уровень микроциркуляции в костной ткани проксимального отдела бедра На модели экспериментального остеопороза после измерения уровня микроциркуляции в кости, проводили функциональные сосудистые тесты эндотелийзависимой (ЭЗВД) и эндотелийнезависимой (ЭНВД) вазодилатации в ответ на одномоментное внутривенное введение растворов ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг и нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг соответственно [30, 31] для оценки степени развития дисфункции сосудистого эндотелия [20]. Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии при исследовании микроциркуляции и проведении функциональных сосудистых 40 тестов осуществляли в программе AcqKnowledge версий 3.8.1-4.2.0, показатели локального кровоснабжения выражались в перфузионных единицах (ПЕ). 2.4 Гистоморфометрическая оценка развития экспериментального остеопороза и эффективности его коррекции1 При изучении экспериментального изменений, остеопороза происходящих и при его в процессе коррекции развития исследуемыми препаратами и комбинациями препаратов, проводили гистоморфометрические исследования костной ткани проксимальных отделов бедренных костей подопытных крыс. После эвтаназирования животных производилось извлечение бедренных костей, которые затем фиксировались в 10% растворе формалина с последующей проводкой и заливкой в парафин. После этого изготавливались гистологические препараты, которые окрашивались гематоксилином и эозином (Г-Э). Гистологические стекла с препаратами микроскопировали на микроскопе Leica CME (увеличение х100: объектив х10, окуляр х10) и фотографировали цифровым фотоаппаратом с фиксированным разрешением. Для морфометрического изучения микроархитектоники костной ткани использовали предварительно откалиброванную программу ImageJ версий 1.391.43. В качестве количественной меры оценки развития остеопороза и эффективности его фармакологической коррекции использовали ширину костных трабекул проксимального отдела бедра, которую измеряли и выражали в микрометрах (мкм) (рис. 2.6). 1 Гистоморфометрические исследования проводились при методической, консультативной и технической поддержке заведующего кафедрой гистологии, эмбриологии, цитологии КГМУ, д.м.н., профессора Иванова Александра Викторовича, за что выражаем ему глубокую благодарность. 41 Рисунок 2.6 – Пример измерения ширины трабекулы при гистоморфометрии костной ткани проксимального отдела бедра у крысы (окр. Г-Э, Х200) 2.5 Обоснование доз препаратов и дизайн исследования Для исследования подобраны препараты антиостеопоротической и комбинации активности препаратов с нами были эндотелиотропной активностью, продемонстрированой в ранее проведенных исследованиях в НИИ Экологической медицины КГМУ: L-аргинин, эналаприла малеат, лозартан калия [20, 56]. В качестве препарата сравнения использовали Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг. L-аргинин, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл («Рениприл», рецепторов «Фармстандарт-Лексредства»), лозартан калия («Блоктран», блокатор ангиотензиновых «Фармстандарт-Лексредства») применяли в дозах 200 мг/кг, 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно, что отвечает данным доступных отечественных и иностранных источников и обнаруживает эффективную эндотелиотропную активность препаратов в ранее проведенных исследованиях. Препараты после тщательного измельчения вводили ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи. 42 Распределение животных по группам осуществляли рандомизацией, стратифицирующими признаками являлись масса тела, условия содержания, питания, проводимые манипуляции и операции. Таблицы 2.1, 2.2 отражают дизайн эксперимента. Во время проведения исследований условия содержания подопытных крыс были следующими: помещения временного содержания, биологически чистые, температура воздуха – 20-24 оС, относительная влажность – 30-70%, условия освещения – светлый/темный цикл (12 ч/12 ч), корм – гранулированный в соответствии с ГОСТ 50258-92, вода – водопроводная, фильтрованная. 2.6 Статистическая обработка первичных данных исследования Данная диссертационная работа является проспективным исследованием. Она проводилась на отобранных случайным образом группах самок белых крыс линии Вистар с использованием рандомизированных контролируемых испытаний. Благодаря использованию рандомизации эта экспериментальная работа дает уверенность в том, что группы различаются только изучаемым признаком, тем самым преодолевается основной недостаток обсервационных исследований. В проспективном исследовании, в отличие от ретроспективных испытаний, до завершения эксперимента нельзя с точностью сказать к чему оно приведет, следовательно, полученные результаты становятся более объективными и независимыми. Поэтому результаты контролируемых исследований нередко могут привести к ложному выводу о неэффективности того или иного применяемого метода, тогда как обсервационное исследование, напротив, доказывает его эффективность. 43 Таблица 2.1 Дизайн исследований на модели экспериментального остеопороза Моделируемые процессы Контроль (ложная операция овариэктомии) Остеопороз Остеопороз + L-аргинин 200 мг/кг Остеопороз + L-аргинин 200 мг/кг + эналаприл 0,5 мг/кг Остеопороз + L-аргинин 200 мг/кг + лозартан 6 мг/кг Остеопороз + Кальций-Д3 Никомед 85,7 мг/кг Ход эксперимента Ложная билатеральная овариэктомия → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 12 недель → измерение уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра, проведение функциональных сосудистых тестов, забор костного биологического материала для морфологических исследований Билатеральная овариэктомия → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 12 недель → измерение уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра, проведение функциональных сосудистых тестов, забор костного биологического материала для морфологических исследований Количество крыс в группе, n 20 20 20 Билатеральная овариэктомия → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 8 недель → введение препаратов или комбинаций препаратов в виде суспензии в 1% крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 4 недель → измерение уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра, проведение функциональных сосудистых тестов, забор костного биологического материала для морфологических исследований 20 20 20 44 Таблица 2.2 Дизайн исследований на модели экспериментальных остеопоротических переломов Моделируемые процессы Перелом бедра у контрольных животных Остеопоротический перелом бедра Остеопоротический перелом бедра + L-аргинин 200 мг/кг Остеопоротический перелом бедра + L-аргинин 200 мг/кг + эналаприл 0,5 мг/кг Остеопоротический перелом бедра + L-аргинин 200 мг/кг + лозартан 6 мг/кг Остеопоротический перелом + Кальций-Д3 Никомед 85,7 мг/кг Ход эксперимента Ложная билатеральная овариэктомия → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 8 недель → перелом бедренной кости и его остеосинтез → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 4 недель → измерение уровня кровоснабжения костной мозоли, рентгенографическое исследование Билатеральная овариэктомия → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 8 недель → перелом бедренной кости и его остеосинтез → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 4 недель → измерение уровня кровоснабжения костной мозоли, рентгенографическое исследование Количество крыс в группе, n 20 20 20 Билатеральная овариэктомия → 1% крахмальная слизь внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 8 недель → перелом бедренной кости и его остеосинтез → введение препаратов или комбинаций препаратов в виде суспензии в 1% крахмальной слизи внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 4 недель → измерение уровня кровоснабжения костной мозоли, рентгенографическое исследование 20 20 20 45 В работе все полученные экспериментальные данные были проанализированы с помощью описательной статистики (пакет анализа Micrоsоft Excel 2003). Для групповых значений определяли средние значения (M) показателей и ошибку среднего (m); если не указано другого, данные в тексте и таблицах представлены в виде M±m. Оценка статистической значимости различий при межгрупповых сравнениях (анализируемой группы с контрольной группой интактных животных или группы животных после овариэктомии) производилась по гетероскедастическому t-тесту (двухвыборочный t-тест Стьюдента с различными дисперсиями). Критерий Стьюдента (t-критерий) является наиболее часто применяемым методом обнаружения различия между средними значениями из двух выборок и используется более чем в половине медицинских публикаций [50]. Критерий Стьюдента с поправкой Ньюмена-Кейлса применяется для сравнения нескольких групп с контрольной. Данная поправка дает возможность анализировать множественные сравнения с увеличением интервала сравнения в зависимости от количества групп и получением критического значения q. Критерий Ньюмена-Кейлса дает более точную оценку вероятности α′; его чувствительность выше, чем критерия Стьюдента. Этот тест используется для больших выборок, как в случаях, приведенных в данной работе (n = 20). Значение критерия сравнивается с табличными показателями. Если значение критерия превышает критическое значение, то можно утверждать, что нулевая гипотеза была справедлива. То есть имеется вероятность, что показатель р – значение критерия, окажется не меньше критического значения при условии справедливости нулевой гипотезы об отсутствии различий между группами [50]. В работе это будет обозначено как р<0,05, как и в принятой системе обозначений. Расчеты производились с использованием пакета анализа Micrоsоft Excel 2003. Для оценки исследований по консолидации межвертельных переломов бедренных костей на фоне остеопороза и терапии данной модели патологии 46 исследуемыми препаратами были составлены таблицы сопряженности 2×2, отображающие частоты сращения костей у подопытных животных. С целью определения достоверности значимости взаимосвязи между двумя переменными в факторной таблице размерности 2×2 (таблице сопряженности признаков) использовался точный критерий Фишера. Однако наиболее известным методом оценки непараметрических исследований на основе таблиц сопряженности в медицине является критерий χ2 [50]. Этот критерий основан на построении таблиц сопряженности. Для таблиц сопряженности размером 2×2 критерий χ2 применим только в случае, когда все математические ожидаемые значения, в любой из ячеек таблицы с заданными границами, оказываются больше 5 и ниже 10. Данные вычисленные выборочные распределения испытуемых статистических величин только приблизительно равны теоретическому распределению χ2, и это приближение неадекватно в этих условиях, которые возникают, когда размеры выборки малы или данные очень неравноценно распределены среди ячеек таблицы. Из-за невозможности использования в представленной работе критерия χ2 для оценки статистической значимости различий между долевыми показателями применяли двусторонний вариант точного критерия Фишера [16]. Критерий Фишера основан на положении о том, что вероятность получения наблюдаемых в таблице частот, исходя из заданных маргинальных показателей, вычисляется точно подсчетом всех таблиц, которые можно построить исходя из маргинальных. Из вышесказанного следует, что критерий Фишера вычисляет точную вероятность появления наблюдаемых частот при нулевой гипотезе (отсутствие связи между табулированными переменными). Точные тесты позволяют получать более аккуратный анализ для маленьких выборок или данных, как в нашем случае. Эти тесты непараметрических исследований являются подходящим статистическим инструментов для работы с неуравновешенными показателями. Неуравновешенные данные, проанализированные асимптотическими способами, имеют тенденцию приводить к ненадежным результатам. Для больших и хорошо 47 уравновешенных наборов значений точные и асимптотические оценки вероятностей р очень похожи. Но для маленьких, редких или выведенных из равновесия значений, точные и асимптотические оценки могут быть различными и даже приводить к противоположным заключениям относительно разрабатываемой гипотезы [156]. Так как в представленной работе полученные параметры разделены на две категории двумя отдельными способами, и при этом табулируемые переменные имеют неуравновешенный характер, возникла потребность в тесте Фишера. Примером может служить выборка подопытных животных, которые были разделены на категории по одному признаку проведения эксперимента: первая – животные с переломами без остеопороза; крысы с переломами на фоне остеопороза без лечения и животные, получавшие лечение исследуемыми препаратами, а с другой – по признаку встречаемых частот консолидации переломов в группах животных, получавших лекарственные средства и комбинации средств. В данном случае критерий Фишера дает точную вероятность наблюдения любого специфического набора значений при условии заданных маргинальных итоговых показателей, общем итоге и нулевой гипотезы об отсутствии влияния лекарственных веществ и их комбинаций на консолидацию костнотравматических повреждений у экспериментальных животных. При этом достоверность различий от нулевой гипотезы записывается как р<0,05. Значительное количество современных статистических пакетов вычисляет значение тестов Фишера. Однако фактические вычисления, выполненные различными статистическими пакетами программ, будут, как правило, отличаться от вычислений, выполненных вручную, так как это связано с большими величинами факториалов, используемых в формуле Фишера. В представленной работе для расчета двустороннего варианта использовался статистический пакет SPSS. точного критерия Фишера 48 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Изучение развития экспериментального остеопороза с использованием результатов измерения уровня костной микроциркуляции, функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования В соответствии остеопоротические с дизайном нарушения исследования, моделировали экспериментальные посредством выполнения у половозрелых самок крыс Вистар двусторонней овариэктомии. Всем животным на протяжении двенадцати недель каждый день внутрижелудочно вводили плацебо –1% крахмальную слизь. Через 12 недель после операции овариэктомии под наркозом (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) оценивали уровень микроциркуляции в проксимальном отделе правой бедренной кости. Таким же образом изучали особенности микроциркуляции в проксимальном отделе правого бедра у контрольных (ложно оперированных) крыс, подвергнутым за 12 недель до проведения исследования лапаротомии без удаления яичников. Результаты ЛДФ в кости проксимального отдела бедра указанных групп позволили установить статистически значимое снижение уровня кровоснабжения костной ткани у животных с экспериментальными остеопоротическими изменениями (58,75±3,76 ПЕ) в сравнении с контрольными животными (99,91±3,41 ПЕ) (рис. 3.1). Надо отметить, что средние показатели ЛДФ в тканях передней группы мышц бедра у животных сохранялись на высоких цифрах (у крыс без остеопороза – 567,2±24,3 ПЕ, у животных с остеопорозом – 524±15,3 ПЕ). Полученные параметры микроциркуляции в проксимальном отделе бедра соответствуют экспериментальным данным ряда авторов, которые проводились на модели развивающегося гипоэстрогенного остеопороза [13, 20, 69]. При проведении функциональных сосудистых проб (болюсное внутривенное введение водных растворов ацетилхолина и нитропруссида натрия) 49 наблюдали снижение уровня микроциркуляции с последующей нормализацией. Это можно объяснить тем, что при введении указанных веществ происходит системная вазодилатация, перераспределение кровотока в сторону централизации и, как следствие, уменьшение объемной скорости кровотока костной ткани, принимаемой нами за показатель микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. 120 99,91 100 80 58,75* ПЕ 60 40 20 0 Контроль Остеопороз Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными Рисунок 3.1 – Средний уровень микроциркуляции костной ткани проксимального отдела бедра у крыс Особенностью трактовки результатов проведения данных проб является тот факт, что величина уменьшения значения уровня кровоснабжения главным образом определяется первоначальным уровнем микроциркуляции в проксимальном отделе бедра. Исходя из этого, для снижения субъективизма в оценке адекватности функционирования сосудистого эндотелия при экспериментальном остеопорозе, рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД) на основании результатов измерения уровня микроциркуляции костной ткани при проведении функциональных сосудистых тестов методом, разработанным и апробированным 50 в лаборатории кардиофармакологии НИИ Экологической медицины КГМУ при проведении более ранних исследований [20, 30, 31, 56]. Для этого рассчитывали сформированных проведении кривыми тестов площади восстановления эндотелийзависимой прямоугольных уровня треугольников, микроциркуляции вазодилатации (ЭЗВД) при и эндотелийнезависимой вазодилатации (ЭНВД). За меньший из катетов такого треугольника принималась абсолютная величина максимального падения уровня микроциркуляции, за больший – время до нормализации и стабилизации уровня микроциркуляции. Коэффициент эндотелиальной дисфункции рассчитывали по следующей формуле (1): КЭД = где SНП SНП (1), SАХ – площадь треугольника, формирующегося после введения нитропруссида натрия, SАХ – площадь треугольника, формирующегося в ответ на введение ацетилхолина. Так, у крыс без остеопороза при анализе результатов реакции ЭЗВД было выявлено снижение средних значений кровоснабжения кости на 48,4±9,3 ПЕ, а время нормализации до исходных параметров составило в среднем 25,3±4,1 секунды. Площадь треугольника ЭЗВД (SАХ) в среднем была равна 573,5±126,7 условных единиц (усл. ед.). У интактных животных, в ответ на введение раствора нитропрусида, то есть при проведении пробы ЭНВД, было обнаружено падение показателей микроциркуляции в среднем на 33,6±8,7 ПЕ, а возврат к исходным значениям происходил за 42,3±4,6 секунды. Исходя из этого средняя площадь треугольника ЭЗНД (SНП) равна 681,8±169,2 условных единиц (усл. ед.). Параметры реакции ЭЗВД у крыс с моделью остеопороза составили: снижение уровня микроциркуляции в среднем на 27,4±4,6 ПЕ, время восстановления к начальным данным составило в среднем 21,7±4,6 секунд. Из этого следует, что средняя площадь треугольника эндотелийзависимой 51 вазодилатации составила 262,8±74,3 усл. ед. Результаты проведения реакции эндотелийнезависимой вазодилатации у животных с экспериментальными остеопоротическими изменениями обнаружили уменьшение значений кровоснабжения в среднем на 22,4±3,7 ПЕ, а нормализация показателей микроциркуляторного кровотока происходила за 52,2±5,8 секунд. Площадь треугольника реакции ЭНВД в группе крыс с моделью патологии составила в среднем 596,7±143,5 усл. ед. Используя формулу (1), вычислили значения КЭД на основании результатов измерения уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра при проведении функциональных сосудистых проб. В группе контрольных крыс КЭД равнялся 1,28±0,18, у животных с остеопоротическими изменениями – 2,57±0,23 (рис. 3.2). 3,0 2,57* 2,5 2,0 КЭД 1,5 1,28 1,0 0,5 0,0 Контроль Остеопороз Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными Рисунок 3.2 – Показатели коэффициента эндотелиальной дисфункции в группах контрольных животных и крыс с остеопоротическими нарушениями Анализируя полученные результаты сосудистых функциональных проб можно сделать вывод о том, что эти данные наглядно демонстрируют наличие эндотелиальной дисфункции после овариэктомии. 52 Следовательно, по прошествии 12 недель после операции двусторонней овариэктомии у самок крыс Вистар развивается комплекс патологических изменений, свидетельствующих о нарушении функционирования сосудистого эндотелия, в том числе микрососудистого русла кости, являющимся проявлением системной эндотелиальной дисфункции. После оценки степени кровоснабжения кости проксимального отдела бедра и проведения функциональных сосудистых проб животные эвтаназировались путем передозировки наркозом (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 600 мг/кг). Для дальнейших гистологических и морфометрических исследований производился забор костного биоматериала – бедренных костей, их соответствующая проводка с последующим изготовлением и окрашиванием гематоксилин-эозином гистологических препаратов. Гистологические препараты срезов проксимальных отделов бедренных костей исследовали при помощи микроскопа Leica CME. При проведении морфометрических исследований получали цифровые фотографии препаратов, а затем в программе ImageJ обрабатывали полученные изображения. Рисунки 3.3 и 3.4 иллюстрируют микрофотографии гистологических срезов проксимальных отделов бедренных костей в группах контрольных животных и крыс с остеопорозом. Остеопоротические изменения в бедренных костях крыс были обнаружены у всех животных через 12 недель после двусторонней овариэктомии. В ходе проведения микроскопии нами были обнаружены патологические процессы в бедренных костях у крыс с остеопорозом, заключающиеся в истончении и перфорации костных пластинок губчатой костной ткани; трабекулярная сеть выглядела истонченной и даже частично прерывалась по причине отсутствия горизонтальных трабекул. В ходе исследования в гистологических препаратах проксимальных отделов бедренных костей крыс с остеопорозом были обнаружены травматические микроповреждения в виде переломов отдельных костных трабекул (рис. 3.5). О том, что микропереломы трабекул возникали не по причине повреждения во 53 время забора биоматериала или изготовления микропрепаратов, а прижизненно, можно судить по прорастанию волокон соединительной ткани в месте микроперелома. Рисунок 3.3 – Гистологическая картина проксимального отдела бедра у контрольной крысы (окр. гематоксилин-эозином, Х100) Рисунок 3.4 – Гистологическая картина проксимального отдела бедра у крысы с остеопорозом (окр. Г-Э, Х100) 54 * Примечание * – микроперелом костной трабекулы (окр. гематоксилин-эозином, Х800) Рисунок 3.5 – Гистологическая картина микроархитектоники проксимального отдела бедра у крысы с остеопорозом При программном (в программе ImageJ) изучении микрофотографий гистологических препаратов оценивали среднюю ширину костных трабекул для отдельной крысы, после чего рассчитывали среднюю ширину костных трабекул для каждой группы экспериментальных животных. Таким образом, объективной мерой оценки развития экспериментального остеопороза через 12 недель после овариэктомии стало достоверное снижение ширины трабекул в проксимальном отделе бедренной кости. Средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра у крыс с остеопоротическими изменениями при этом была меньше показателя контрольных животных на 43,4% (рис. 3.6). Следовательно, по прошествии 12 недель после операции двусторонней овариэктомии у крыс развивается остеопороз, характеризующийся уменьшением ширины трабекул, что в свою очередь приводит к уменьшению их прочности и возникновению микроповреждений. 55 120 98,51 100 80 55,77* мкм 60 40 20 0 Контроль Остеопороз Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными Рисунок 3.6 – Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у контрольных крыс и животных с остеопорозом Для большей морфофункциональных наглядности нарушений, степени выраженности развивающихся при комплекса моделировании экспериментального остеопороза, был проведен интегральный векторный анализ микроциркуляторных, функциональных и морфологических показателей. При этом значение каждого показателя было представлено в виде вектора, каждый из которых соответствовал определенному параметру (уровень микроциркуляции в кости бедра, коэффициент эндотелиальной дисфункции, средняя ширина костных трабекул в изучаемой локализации). Векторы были отложены на плоскости, полюсом для них было выбрано начало системы координат. Длина вектора равнялась относительной величине каждого из трех показателей комплексного исследования в изучаемых группах. Векторы имели определенную направленность: 1-й вектор – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра (МБ) совпадал с осью 0у. Два других вектора располагались по часовой стрелке, при этом угол между ними составлял 120°, ими обозначены показатели коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) и средней ширины костных трабекул в проксимальном отделе бедра (ТБ). 56 Значения векторов выбранных показателей были выражены в процентном отношении к соответствующим значениям группы интактных (ложнооперированных) животных, принятым как 100%. Площади диаграмм были выражены условными единицами (рис. 3.7, 3.8). Контрольные (S=12990) 200 МБ 150 100 50 0 ТБ КЭД Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.7 – Векторная диаграмма показателей группы контрольных животных Различия между изучаемыми группами животных при проведении исследований отражаются площадью диаграмм, образованных соединением конечных точек векторов выбранных параметров. При сравнении площадей векторных диаграмм выявлены существенные различия между группой интактных животных и группой крыс с остеопорозом (рис. 3.7, 3.8). Так, площадь векторной диаграммы в группе контроля составила 12990 усл. ед., тогда как в группе животных с остеопорозом указанный параметр был равен 46184 усл. ед. 57 Остеопороз (S=46184) 200 МБ 150 100 50 0 КЭД ТБ Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.8 – Векторная диаграмма показателей группы крыс с остеопорозом РЕЗЮМЕ Результаты, полученные в ходе исследования, говорят о том, что по прошествии 12 недель после двусторонней овариэктомии у белых самок крыс развивается генерализованная дисфункция эндотелия сосудов, и ее частным случаем является микроциркуляторного нарушение русла кости. функционирования Это эндотелиоцитов подтверждается увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции при его расчете на основании результатов проведения лазерной допплеровской флоуметрии костной ткани. Следствием нарушения функционирования эндотелия костных сосудов является снижение показателей регионарной микроциркуляции в кости, что приводит к нарушению баланса между процессами ремоделирования костной ткани и, следовательно, возникновению и развитию остеопоротических изменений, сопровождающихся истончением костных трабекул и возникновением в них микропереломов. 58 Данный факт дал нам основание сделать заключение о значительной роли нарушения функционирования эндотелия микрососудистого русла кости в патогенезе остеопороза. Следовательно, исследование остеопротективного действия препаратов с доказанной эндотелиотропной активностью является актуальным направлением современной экспериментальной и клинической фармакологии и остеологии. 3.2 Изучение остеопротективного действия препарата Кальций-Д3 Никомед при экспериментальном остеопорозе Согласно дизайну эксперимента, путем проведения операции двусторонней овариэктомии у самок крыс Вистар моделировали экспериментальный остеопороз. В течение восьми недель после овариэктомии животные получали ежедневно внутрижелудочно 1% крахмальную слизь, затем еще в течение 4 недель – Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг в виде суспензии в 1% крахмальной слизи в качестве препарата сравнения для фармакологической коррекции сформировавшегося за восемь недель остеопороза [13, 20]. Кальций-Д3 Никомед был выбран в качестве препарата сравнения как наиболее распространенный, доступный конечному потребителю и наиболее часто назначаемый врачами для профилактики возникновения и фармакологической коррекции остеопороза препарат. Результаты проведенного экспериментального исследования продемонстрировали отсутствие у препарата Кальций-Д3 Никомед влияния на показатели кровоснабжения проксимального отдела бедра крыс (рис. 3.9). Значения изученного показателя не отличались статистически значимо от результатов в группе животных с остеопорозом (р=0,675). При проведении фукциональных сосудистых проб у крыс с остеопорозом, получавших терапию препаратом Кальций-Д3 Никомед, было обнаружено следующее: 59 120 99,91 100 80 58,75* ПЕ 60 56,89 40 20 0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными Рисунок 3.9 – Результаты влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на уровень микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра у крыс - при проведении реакции эндотелийзависимой вазодилатации снижение показателей микроциркуляции происходило в среднем на 33,4±2,1 ПЕ, а время восстановления до исходных параметров составило в среднем 13,8±2,4 секунды, площадь треугольника ЭЗВД в среднем была равна 250,46±73,17 усл. ед.; - у животных, которым вводился раствор нитропрусида натрия (реакция ЭНВД), было выявлено падение параметров микроциркуляции в среднем на 28,3±7,6 ПЕ, а возврат к исходным значениям происходил за 43,1±6,2 секунды. Исходя из этого средняя площадь треугольника эндотелийнезависимой вазодилатации равна 587,86±153,4 усл. ед. По результатам расчета коэффициент эндотелиальной дисфункции у крыс, получавших Кальций-Д3 Никомед, равен 2,64±2,7, что позволило констатировать отсутствие эндотелиотропной активности у данного препарата (рис. 3.10). На рисунке 3.11 представлена цифровая фотография гистологического среза проксимального отдела бедра в группе животных, получавших препарат КальцийД3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг. Гистологическая картина очень сильно напоминала таковую у животных с остеопорозом, не получавших лечения: визуально костные трабекулы были истончены, межтрабекулярные пространства расширены, 60 имелись единичные микропереломы костных трабекул, что свидетельствует об отсутствии у препарата Кальций-Д3 Никомед остеопротективной активности на выбранной модели патологии (рис. 3.11). 3,5 3,0 2,64 2,57* 2,5 КЭД 2,0 1,5 1,28 1,0 0,5 0,0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными Рисунок 3.10 – Результаты влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на значение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного на основании данных лазерной допплеровской флоуметрии костной ткани Рисунок 3.11 – Гистологическая картина проксимального отдела бедра у крысы, получавшей Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг (окр. гематоксилин-эозином, Х100) 61 Морфометрическое исследование гистологических препаратов, несмотря на имеющуюся тенденцию к превышению показателя над значением у животных с остеопорозом, подтвердило отсутствие статистически значимого влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на среднюю ширину костных трабекул проксимального отдела бедра крыс (рис. 3.12). Средняя ширина костных трабекул была статистически значимо меньше показателя контрольных животных и не отличалась от значений, зарегистрированных у животных с экспериментальной патологией (р=0,240). По результатам интегрального векторного анализа установили, что КальцийД3 Никомед не усиливал интегральную остеопротективную активность при развившихся и прогрессирующих остеопоротических нарушениях, что выражается в увеличении значения площади диаграммы (46863 усл. ед.) по сравнению со значениями контрольных животных и крыс с остеопорозом (рис. 3.13). 120 100 98,51 80 58,23 55,77* мкм 60 40 20 0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными Рисунок 3.12 – Результаты влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедра у крыс 62 Кальций-Д3 Никомед (S=46863) 200 МБ 150 100 50 0 ТБ КЭД Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.13 – Векторная диаграмма показателей группы крыс с остеопорозом на фоне лечения препаратом Кальций-Д3 Никомед РЕЗЮМЕ Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг, ежедневно вводимый самкам крыс Вистар внутрижелудочно на протяжении четырех недель по прошествии восьми недель после овариэктомии, ожидаемо не обладает эндотелиопротективным действием (что выражается в увеличении КЭД по результатам ЛДФ), а также не предотвращает снижения уровня локальной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. Несмотря на имеющуюся положительную тенденцию, препарат не оказал статистически значимого ремоделирования при влияния развившихся на протекание процессов экспериментальных костного остеопоротических изменениях, подтверждением чему явилось отсутствие достоверного влияния препарата на замедление истончения трабекул в губчатой кости и возникновение микроповреждений трабекул. 63 3.3 Изучение остеопротективного действия L-аргинина при экспериментальном остеопорозе В соответствии с дизайном эксперимента, L-аргинин в дозе 200 мг/кг вводили животным с остеопорозом (по прошествии восьми недель после овариэктомии) внутрижелудочно ежедневно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи в течение четырех недель. Результаты влияния L-аргинина на показатели кровоснабжения в проксимальном отделе бедра у крыс по прошествии 12 недель после операции двусторонней овариэктомии представлены на рисунке 3.14. 120 99,91 100 79,80** 80 58,75* ПЕ 60 56,89 40 20 0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед L-аргинин Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.14 – Результаты влияния L-аргинина на уровень микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра у крыс Было выявлено, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг эффективно предотвращал снижение уровня локальной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. Результаты ЛДФ в группе крыс, получавших L-аргинин, статистически значимо отличались от значений животных с остеопоротическими изменениями, а также крыс, получавших препарат сравнения – Кальций-Д3 Никомед (р<0,0001). 64 При выполнении функциональных сосудистых тестов эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой экспериментальным вазодилатации генерализованным у животных остеопорозом с на развившимся фоне лечения L-аргинином было установлено, что данный препарат нормализовал соотношение площадей треугольников восстановления уровня кровоснабжения кости при болюсном введении растворов нитропруссида натрия и ацетилхолина: - при проведении реакции эндотелийзависимой вазодилатации уменьшение уровня микроциркуляции происходило в среднем на 44,9±3,6 ПЕ, а восстановление кровотока протекало за 20,3±2,7 секунды, SАХ составила 428,28±53,1 усл. ед.; - при проведении реакции эндотелийнезависимой вазодилатации среднее значение микроциркуляции снижалось на 37,8±4,2 ПЕ, нормализация к исходным параметрам происходила за 36,7±5,7 секунд, SНП составила 662,53±71,4 усл. ед. На рисунке 3.15 представлены результаты проведения функциональных проб эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации с последующим расчетом коэффициента эндотелиальной дисфункции у крыс с остеопорозом на фоне лечения в течение четырех недель L-аргинином в дозе 200 мг/кг. Было выявлено, что L-аргинин статистически значимо снижал КЭД до значения 1,63±0,19. Аналогично результатам измерения кровоснабжения костной ткани, значения коэффициента эндотелиальной дисфункции у животных, получавших L-аргинин, статистически значимо отличались от показателей в группе животных с остеопорозом, а также крыс, получавших препарат сравнения – Кальций-Д3 Никомед (р<0,05). Таким образом, можно придти к заключению о том, что существенное значение в сохранении кровоснабжения кости принадлежит сохранению адекватного функционирования эндотелия сосудов, отвечающих за трофику костной ткани. Далее, поддержание уровня микроциркуляции костной ткани на должном уровне способствует благоприятному протеканию процессов костного ремоделирования и способно препятствовать прогрессированию остеопороза. Эти 65 рассуждения подтверждаются результатами морфометрических исследований бедренных костей у экспериментальных животных, получавших в течение четырех недель по прошествии восьми недель после овариэктомии L-аргинин в дозе 200 мг/кг. 3,5 3,0 2,64 2,57* 2,5 КЭД 2,0 1,63** 1,28 1,5 1,0 0,5 0,0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед L-аргинин Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.15 – Результаты влияния L-аргинина на значение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного на основании данных лазерной допплеровской флоуметрии в кости При световой микроскопии срезов проксимальных отделов бедренных костей у крыс, получавших L-аргинин, обнаружили нормальную микроархитектонику и предотвращение уменьшения ширины костных трабекул по сравнению с крысами с остеопоротическими изменениями (рис. 3.16). Результаты морфометрического исследования губчатой костной ткани проксимальных отделов бедренных костей в группе крыс с остеопорозом на фоне лечения L-аргинином представлены на рисунке 3.17. Установили, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг препятствовал уменьшению ширины костных трабекул до показателей крыс с остеопорозом. Тем не менее, в среднем ширина костных трабекул значений контрольных крыс не достигала. 66 Рисунок 3.16 – Гистологическая картина проксимального отдела бедра у крысы, получавшей L-аргинин в дозе 200 мг/кг (окр. гематоксилин-эозином, Х100) 120 100 98,51 80 55,77* мкм 60 60,24** 58,23 40 20 0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед L-аргинин Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.17 – Результаты влияния L-аргинина на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у крыс Значения средней ширины костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у крыс, получавших L-аргинин, статистически значимо 67 отличались от значений животных с остеопорозом (р=0,023), но достоверно не отличались от показателей крыс, получавших Кальций-Д3 Никомед (p=0,281). Таким образом, L-аргинин в дозе 200 мг/кг через 12 недель после овариэктомии у крыс обладал остеопротективной активностью, выражающейся в профилактике уменьшения ширины трабекул, и, хотя полностью не предотвращал, тем не менее, замедлял прогрессирование экспериментального остеопороза. L-аргинин усиливает интегральную остеопротективную активность при развивающихся остеопоротических нарушениях, что выражается в уменьшении значения площади диаграммы (27919 усл. ед.) по сравнению со значением в группе животных с остеопорозом (рис. 3.18). L-аргинин (S=27919) 200 МБ 150 100 50 0 ТБ КЭД Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.18 – Векторная диаграмма показателей группы крыс с остеопорозом на фоне лечения L-аргинином 68 РЕЗЮМЕ L-аргинин в дозе 200 мг/кг, вводимый крысам-самкам Вистар ежедневно внутрижелудочно по прошествии восьми недель после овариэктомии в течение четырех недель, обладая эндотелиотропной активностью, выражающейся в уменьшении КЭД по результатам ЛДФ, статистически значимо предотвращает уменьшение регионарной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. Это позволяет нормализовать нарушенное при остеопорозе протекание процессов костного ремоделирования, свидетельством чего является сохранение микроархитектоники костной ткани проксимального отдела бедра, в том числе замедление истончения трабекул и предотвращение возникновения микропереломов. Учитывая тот факт, что такие препараты, как эналаприл и лозартан, обладая эндотелиотропными свойствами, оказывают профилактическое остеопротективное действие [20], в дальнейших исследованиях нами была изучена остеопротективная активность комбинаций L-аргинина с эналаприлом и лозартаном в качестве препаратов для коррекции уже сформировавшегося экспериментального остеопороза. 3.4 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе Согласно дизайну экспериментальных исследований, комбинацию L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг вводили самкам крыс с остеопорозом (по прошествии восьми недель после операции двусторонней овариэктомии) внутрижелудочно ежедневно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи в течение четырех недель. В результате эксперимента установили, что комбинация L-аргинина с эналаприлом эффективно предотвращала снижение уровня локальной 69 микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра при развившемся остеопорозе. Результаты влияния комбинации L-аргинина с эналаприлом на величину среднего уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра у крыс через 12 недель после овариэктомии в сравнении с контрольной группой и группами животных, которым проводилась монотерапия L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед, представлены на рисунке 3.19. 120 99,91 100 79,80** 83,02** L-аргинин L-аргинин +эналаприл 80 58,75* 56,89 Остеопороз Кальций-Д3 Никомед ПЕ 60 40 20 0 Контроль Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.19 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с эналаприлом на уровень микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра у крыс Данные ЛДФ-графии в группе крыс, получавших комбинацию L-аргинина и эналаприла, статистически значимо превышали показатели животных с остеопорозом, а также крыс, получавших препарат сравнения – Кальций-Д3 Никомед (р<0,0001), однако достоверно не отличались от результатов в группе с монотерапией L-аргинином (р=0,557). После определения функциональные сосудистые уровня тесты микроциркуляции на выполнялись эндотелийзависимую и эндотелийнезависимую вазодилатацию у крыс с остеопорозом с применением терапии комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг. 70 Производился расчет КЭД по данным ЛДФ. В таблице 3.1 представлен расчет коэффициентов эндотелиальной дисфункции на основании результатов проведения функциональных проб в группах, получавших комбинированную терапию L-аргинином и эналаприлом. Установили, что комбинация L-аргинина с эналаприлом приближала пропорцию между площадями реакций восстановления кровоснабжения костной ткани при проведении функциональных сосудистых проб к таковым у контрольных животных. Тем самым комбинация L-аргинина с эналаприлом статистически значимо снижала КЭД до значения 1,61±0,18 (табл. 3.1). На рисунке функциональных вазодилатации 3.20 проб с продемонстрированы эндотелийзависимой дальнейшим подсчетом результаты и проведения эндотелийнезависимой коэффициента эндотелиальной дисфункции у крыс с остеопорозом на фоне лечения в течение четырех недель комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг в сравнении с контрольной группой и группой животных, которым проводилась терапия препаратом Калиций-Д3 Никомед. Показатели коэффициента эндотелиальной дисфункции у крыс, получавших комбинированное лечение L-аргинином и эналаприлом, статистически значимо отличались от показателей в группе животных с остеопорозом, а также крыс, получавших препарат сравнения – Кальций-Д3 Никомед (р<0,05). В то же время значение КЭД в группе животных, получавших комбинированную терапию изучаемыми препаратами, не отличалось достоверно от результатов расчета КЭД в группе животных с монотерапией L-аргинином (рис. 3.20). Таким образом, на выбранной модели патологии в результате применения комбинированной терапии L-аргинином в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг формируются благоприятные условия для поддержания регионарной микроциркуляции на адекватном уровне, что позволяет прогнозировать нормализацию процессов ремоделирования костной ткани при экспериментальном остеопорозе у животных. 71 Таблица 3.1 Влияние комбинации L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг на величину коэффициента эндотелиальной дисфункции при генерализованном остеопорозе Группа животных Ложно оперированные Остеопороз Остеопороз + L-аргинин + эналаприл Реакция Показатель уменьшения уровня кровотока, ПЕ ЭЗВД 48,4±9,3 Время восстановления кровоснабжения, секунды 25,3±4,1 ЭНВД 33,6±8,7 42,3±4,6 681,8±169,2 ЭЗВД 27,4±4,6 21,7±4,6 262,8±74,3 ЭНВД 22,4±3,7 52,2±5,8 596,7±143,5 ЭЗВД 39,1±5,3 19,5±3,7 364,9±59,8 ЭНВД 23,2±3,1 49,2±6,2 552,1±89,4 Площадь треугольника над кривой восстановления, условные единицы 573,5±126,7 КЭД 1,28±0,18 2,57±0,23* 1,61±0,18** Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с животными с остеопорозом 72 3,5 3,0 2,64 2,57* 2,5 КЭД 2,0 1,63** 1,61** 1,28 1,5 1,0 0,5 0,0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед L-аргинин L-аргинин +эналаприл Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.20 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с эналаприлом на значение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного на основании данных лазерной допплеровской флоуметрии в кости В результате изучения гистологических препаратов проксимальных отделов бедренных костей у крыс, получавших L-аргинин в комбинации с эналаприлом, обнаружили сохранную микроархитектонику и предотвращение уменьшения ширины костных трабекул по сравнению с крысами с остеопоротическими изменениями (рис. 3.21). Результаты морфометрического исследования костной ткани проксимальных отделов бедренных костей в группе крыс с остеопорозом на фоне лечения комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг продемонстрированы на рисунке 3.22. Установили, что комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг предотвращала снижение средней ширины костных трабекул до показателей животных с остеопорозом, однако ширина костных трабекул не была равна значениям контрольных крыс. 73 Рисунок 3.21 – Гистологическая картина проксимального отдела бедра у крысы, получавшей L-аргинин в дозе 200 мг/кг и эналаприл в дозе 0,5 мг/кг (окр. гематоксилин-эозином, Х100) 120 100 98,51 80 мкм 60 55,77* 58,23 60,24** 61,94** Остеопороз Кальций-Д3 Никомед L-аргинин L-аргинин +эналаприл 40 20 0 Контроль Примечание: * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.22 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с эналаприлом на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у крыс 74 Значения средней ширины костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у крыс, получавших L-аргинин в комбинации с эналаприлом, статистически значимо отличались от значений животных с остеопорозом (р=0,001) и получавших Кальций-Д3 Никомед (р=0,027), но достоверно не отличались от показателей крыс, получавших L-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии (p=0,228). Таким образом, комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг через 12 недель после овариэктомии у крыс обладала остеопротективным действием, выражающимся в предотвращении уменьшения ширины трабекул, то есть замедлении прогрессирования экспериментального остеопороза. Комбинированное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг усиливает интегральную остеопротективную активность при развивающихся остеопоротических нарушениях, что выражается в уменьшении значения площади диаграммы (26500 усл. ед.) по сравнению со значением в группе животных с остеопорозом (рис. 3.23). РЕЗЮМЕ Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, вводимая самкам крыс Вистар ежедневно внутрижелудочно на протяжении четырех недель по прошествии восьми недель после овариэктомии, обладая эндотелиопротективной активностью (что выражалось в снижении КЭД по данным ЛДФ), статистически значимо предотвращает уменьшение уровня локальной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. Это позволяет поддерживать на должном уровне нарушенное при остеопорозе протекание процессов костного ремоделирования, свидетельством чего является сохранение микроархитектоники костной ткани проксимального отдела бедра, а именно замедление истончения костных предотвращение возникновения микропереломов трабекул. трабекул и 75 L-аргинин + Эналаприл (S=26500) 200 МБ 150 100 50 0 ТБ КЭД Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.23 – Векторная диаграмма показателей группы крыс с остеопорозом на фоне комбинированного лечения L-аргинином и эналаприлом 3.5 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с лозартаном при экспериментальном остеопорозе Согласно протоколу исследования, по прошествии восьми недель после операции двусторонней овариэктомии, самкам крыс с остеопорозом вводилась комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг внутрижелудочно ежедневно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи в течение четырех недель. В результате эксперимента выявили, что сочетанное применение L-аргинина и лозартана эффективно предотвращало снижение уровня локальной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра при прогрессирующем остеопорозе. Результаты воздействия комбинации L-аргинина с лозартаном на величину среднего уровня микроциркуляции в губчатой костной ткани проксимального 76 отдела бедра у крыс через 12 недель после овариэктомии в сравнении с контрольной группой, группами животных, которым проводилась монотерапия L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед, и группой животных, получавших комбинированную терапию L-аргинином с эналаприлом, продемонстрированы на рисунке 3.24. 120 99,91 100 79,80** 83,02** L-аргинин L-аргинин +эналаприл 91,60** 80 ПЕ 60 58,75* 56,89 Остеопороз Кальций-Д3 Никомед 40 20 0 Контроль L-аргинин +лозартан Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.24 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с лозартаном на уровень микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра у крыс Данные лазерной допплеровской флоуметрии в группе крыс, которым проводилось сочетанное лечение L-аргинином и лозартаном, статистически значимо превышали показатели животных с остеопорозом, а также крыс, получавших препарат сравнения – Кальций-Д3 Никомед (р<0,0001), кроме того, статистически значимо отличались в большую сторону от значений уровня микроциркуляции в группе с монотерапией L-аргинином (р=0,042). Показатели микроциркуляции у этой группы статистически значимо не отличались от параметров микроциркуляции у группы животных, получавших комбинацию препаратов, состоявшую из L-аргинина и эналаприла. Далее, после определения уровня локальной микроциркуляции производились функциональные сосудистые пробы на эндотелийзависимую и 77 эндотелийнезависимую вазодилатацию у крыс с остеопорозом, которым проводилось комбинированное лечение исследуемой комбинацией препаратов, состоящей из L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг. Производился расчет КЭД по данным ЛДФ. Таблица демонстрирует 3.2 эндотелиальной дисфункции функциональных на сосудистых эндотелийнезависимой результаты расчета основании результатов тестов вазодилатации в коэффициентов проведения эндотелийзависимой группе, получавшей и данную комбинированную терапию, в сравнении с контрольной группой и группой животных с остеопорозом. Установили, что комбинация L-аргинина и лозартана приближала соотношение площадей треугольников восстановления уровня кровоснабжения костной ткани при проведении функциональных сосудистых проб к таковым у контрольных животных. Тем самым комбинация L-аргинина с лозартаном статистически значимо снижала КЭД до значения 1,55±0,16. Значение коэффициента эндотелиальной дисфункции у крыс, получавших комбинированное лечение L-аргинином и лозартаном, статистически значимо отличалось от показателей в группе животных с остеопорозом, а также крыс, получавших препарат сравнения – Кальций-Д3 Никомед (р<0,05). В то же время значение КЭД в группе животных, получавших комбинированную терапию, не отличалось достоверно от результатов расчета КЭД в группе животных с монотерапией L-аргинином. 78 Таблица 3.2 Влияние комбинации L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг на величину коэффициента эндотелиальной дисфункции при генерализованном остеопорозе Группа животных Ложно оперированные Остеопороз Остеопороз + L-аргинин + лозартан Реакция Показатель уменьшения уровня кровотока, ПЕ ЭЗВД 48,4±9,3 Время восстановления кровоснабжения, секунды 25,3±4,1 ЭНВД 33,6±8,7 42,3±4,6 681,8±169,2 ЭЗВД 27,4±4,6 21,7±4,6 262,8±74,3 ЭНВД 22,4±3,7 52,2±5,8 596,7±143,5 ЭЗВД 34,9±8,2 20,8±3,5 347,6±61,7 ЭНВД 25,3±4,8 41,4±8,5 506,8±94,1 Площадь треугольника над кривой восстановления, условные единицы 573,5±126,7 КЭД 1,28±0,18 2,57±0,23* 1,55±0,16** Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с животными с остеопорозом 79 На рисунке 3.25 проиллюстрированы результаты проведения функциональных сосудистых проб эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации с последующим расчетом коэффициента эндотелиальной дисфункции у крыс с остеопорозом на фоне лечения в течение четырех недель комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг в сравнении с другими группами животных при экспериментальном остеопорозе. 3,5 3,0 2,64 2,57* 2,5 КЭД 2,0 1,63** 1,61** 1,55** 1,28 1,5 1,0 0,5 0,0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед L-аргинин L-аргинин +эналаприл L-аргинин +лозартан Примечание * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.25 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с лозартаном на значение коэффициента эндотелиальной дисфункции, рассчитанного на основании данных лазерной допплеровской флоуметрии костной ткани Таким образом, на выбранной модели патологии в результате применения комбинированной терапии L-аргинином в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг формируются благоприятные условия для поддержания регионарной микроциркуляции на адекватном уровне, что позволяет прогнозировать нормализацию процессов костного ремоделирования при экспериментальном остеопорозе у животных. При изучении гистологических препаратов проксимальных отделов бедренных костей у крыс, получавших L-аргинин в комбинации с лозартаном, выявили сохранение микроархитектоники губчатой костной ткани и 80 предотвращение уменьшения ширины костных трабекул по сравнению с крысами с остеопоротическими изменениями (рис. 3.26). Рисунок 3.26 – Гистологическая картина проксимального отдела бедра у крысы, получавшей L-аргинин в дозе 200 мг/кг и лозартан в дозе 6 мг/кг (окр. гематоксилин-эозином, Х100) Результаты гистоморфометрического исследования костной ткани проксимальных отделов бедренных костей в группе крыс с остеопорозом на фоне лечения комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг в сравнении с другими группами животных продемонстрированы на рисунке 3.27. Выявили, что комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг предотвращает снижение средней ширины костных трабекул до показателей животных с остеопорозом. Однако ширина костных трабекул не была равна значениям контрольных крыс. Показатели средней ширины костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у крыс, получавших L-аргинин в комбинации с лозартаном, статистически значимо отличались не только от значений животных с остеопорозом (р<0,001) и крыс, получавших Кальций-Д3 Никомед (р=0,002), но 81 также и от значений в группе крыс, получавших L-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии (p=0,019). 120 98,51 100 80 55,77* мкм 60 58,23 60,24** 61,94** 64,01** L-аргинин L-аргинин +эналаприл L-аргинин +лозартан 40 20 0 Контроль Остеопороз Кальций-Д3 Никомед Примечание: * – p<0,05 в сравнении с контрольными животными; ** – p<0,05 в сравнении с крысами с остеопорозом Рисунок 3.27 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с лозартаном на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости у крыс Таким образом, изучаемая комбинация препаратов, состоящая из L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг через 12 недель после овариэктомии у крыс обладает антиостеопоротическим действием, выражающимся в предотвращении уменьшения ширины трабекул, то есть замедлении прогрессирования экспериментального остеопороза. По совокупности параметров данная комбинация изучаемых препаратом является наиболее эффективной. Это также демонстрируют результаты проведенного интегрального векторного анализа полученных данных. Так, комбинированное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг усиливает интегральную остеопротективную активность при развивающихся остеопоротических нарушениях, что выражается в уменьшении значения площади диаграммы 82 (23301 усл. ед.) по сравнению со значением в группе животных с остеопорозом (рис. 3.28). L-аргинин + Лозартан (S=23301) МБ 200 150 100 50 0 ТБ КЭД Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.28 – Векторная диаграмма показателей группы крыс с остеопорозом на фоне комбинированного лечения L-аргинином и лозартаном На основании интегрального векторного анализа исследованные препараты и комбинации препаратов расположились в следующей последовательности (в порядке увеличения эффективности, в скобках указаны площади лепестковых диаграмм в усл. ед.): Кальций-Д3 Никомед (46863) – L-аргинин (27919) – L-аргинин+Эналаприл (26500) – L-аргинин+Лозартан (23301). Из вышесказанного можно сделать заключение, что комбинации L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг через 12 недель после овариэктомии у крыс имеют более выраженные остеопротективные эффекты, чем монотерапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг. Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг не влияет на уровень микроциркуляции в кости, но в слабой степени задерживает истончение костных трабекул (рис. 3.29). 83 Контрольные (S=12990) 250 200 150 Кальций-Д3 Никомед (S=46863) Остеопороз (S=46184) 100 50 0 L-аргинин + Лозартан (S=23301) L-аргинин (S=27919) L-аргинин + Эналаприл (S=26500) МБ КЭД ТБ Примечание МБ – уровень микроциркуляции в проксимальном отделе бедра; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; ТБ – средняя ширина костных трабекул в проксимальном отделе бедра Рисунок 3.29 – Визуальное отображение результатов интегрального векторного анализа результатов изучения эндотелио- и остеопротективной активности исследованных препаратов и комбинаций РЕЗЮМЕ Комбинированная терапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг, применяемая у самок крыс ежедневно в течение четырех недель по прошествии восьми недель после овариэктомии, обладает выраженной эндотелиопротективной активностью, что подтверждается снижением КЭД по данным ЛДФ, и статистически значимо предотвращает уменьшение уровня локальной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедренной кости. Данное свойство исследуемой комбинации позволяет поддерживать на должном уровне нарушенное при остеопорозе протекание процессов костного ремоделирования, свидетельством чего является сохранение микроархитектоники 84 костной ткани проксимального отдела бедра, а именно замедление истончения костных трабекул и предотвращение возникновения микропереломов трабекул. Основываясь на полученных результатах исследования, свидетельствующих о том, что опосредованно, через предотвращение ухудшения регионарной микроциркуляции в кости, L-аргинин, а также комбинации L-аргинина с эналаприлом и лозартаном благоприятно воздействуют на процессы костного ремоделирования, в дальнейших исследованиях нами проведено сравнительное изучение влияния L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном на качество сращения экспериментальных переломов на фоне остеопороза. 3.6 Изучение влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах В соответствии с дизайном экспериментального исследования, остеопоротические переломы моделировали по прошествии восьми недель после операции двусторонней овариэктомии по причине того, что в течение этого срока формировались остеопоротические изменения костей [13, 20]. У крыс осуществляли моделирование и последующий остеосинтез переломов правого бедра. После этого крыс содержали в стандартных условиях вивария в течение четырех недель. Все эти 12 недель крысам внутрижелудочно один раз в день в виде плацебо вводили 1% крахмальную слизь. На 29 день после воспроизведения и остеосинтеза переломов у экспериментальных животных измеряли уровень микроциркуляции в формирующейся костной мозоли при успешной консолидации перелома, а также визуально и рентгенографически анализировали качество и количественные характеристики сращения экспериментальных переломов на фоне остеопороза. Результаты ЛДФ в группах животных с переломами бедра продемонстрировали, что при консолидации переломов при моделированном гипоэстрогенном остеопорозе средний показатель кровоснабжения костной 85 мозоли был статистически значимо ниже, чем у контрольных животных (рис. 3.30). Это полностью согласуется с результатами, полученными при изучении уровня микроциркуляции в кости у животных на модели экспериментального остеопороза (рис. 3.1). 100 90 80 70 60 ПЕ 50 40 30 20 10 0 89,30 66,59* Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра Примечание * – p<0,05 в сравнении с животными с переломом бедра Рисунок 3.30 – Средний уровень кровоснабжения костной мозоли проксимального отдела бедра по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза перелома Следовательно, сращение экспериментальных переломов при остеопорозе протекает на фоне снижения уровня кровоснабжения костной мозоли, что может негативно сказаться на результатах сращения переломов на фоне остеопороза. При визуальной оценке зон переломов проксимального отдела бедра обнаружили, что у большего числа крыс с переломами как без остеопороза, так и на его фоне по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов присутствовали признаки образования костных мозолей. Тем не менее, отмечались также случаи отсутствия сращения переломов. В группе животных с переломами бедра без остеопороза из 20 крыс в трех случаях имелось отсутствие сращения перелома с развитием ложного сустава (рис. 3.31). Развитие ложных суставов отмечалось у животных, у которых наблюдалось незначительно превышение внутреннего диаметра костномозгового 86 канала бедренной кости над диаметром спицы, применяемой для остеосинтеза (1 мм). Это допускало наличие небольшой подвижности спиц как вдоль оси бедра, так и ротационно, и, следовательно, отломков кости друг относительно друга, что могло стать причиной нарушения сращения переломов у данных животных. Однако опороспособность оперированной конечности у данных крыс не была ограничена. У животных с переломами бедра на фоне остеопороза число неудовлетворительных результатов было более чем вдвое больше (семь против трех из 20) (рис. 3.31). 20 3 7 15 10 17 13 5 0 Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра Сращение Несращение Рисунок 3.31 – Результаты консолидации экспериментальных переломов проксимального отдела бедра по прошествии четырех недель после моделирования У этих крыс наблюдалась существенная подвижность введенной интрамедуллярно спицы, а также отсутствие сращения переломов: наблюдалось свободное перемещение спиц по костномозговым каналам бедренных костей, что приводило к существенной нестабильности в области перелома. Прижизненно у пяти их этих крыс наблюдались признаки нарушения опороспособности задней правой конечности. Подобный факт можно объяснить с позиций того, что наряду с возникающим и прогрессирующим в результате двусторонней овариэктомии 87 остеопорозом на «качество» костной ткани влияет также экзогенно введенный имплантат, что увеличивает интенсивность развития и выраженности остеопоротических изменений в месте его внедрения. Рентгенологические исследования бедренных костей с экспериментальными переломами у крыс обеих групп проводились после визуальной оценки качества консолидации переломов. При оценке рентгенограмм обращали внимание на количественные и качественные характеристики сращения переломов. При положительных результатах сращения переломов наблюдали рентгенографические признаки консолидации, а именно отсутствие расстояния между возникшими в результате перелома отломками бедренной кости, сохранение правильной оси бедра, а также формирование костной мозоли (рис. 3.32). Рисунок 3.32 – Пример рентгенограммы бедра крысы без остеопороза по прошествии четырех недель перелома бедренной кости При отсутствии консолидации переломов у крыс с остеопорозом на рентгенограммах наблюдали деформации сегментов конечностей, вращательные и ангулярные смещения костных отломков друг относительно друга, присутствие 88 расстояния между отломками кости, отсутствие или замедление образования костной мозоли (рис. 3.33). Рисунок 3.33 – Пример рентгенограммы бедренной кости крысы с остеопорозом по прошествии четырех недель перелома бедренной кости У контрольных животных при несращении переломов на рентгенограммах также обнаруживали небольшое расстояние между отломками кости, замедление образования костной мозоли. Тем не менее, при этом ось бедра была правильной, смещения отломков не наблюдалось. Результаты количественной оценки частоты сращения переломов бедренных костей по рентгенологическим данным были аналогичны результатам визуального обследования. Следовательно, консолидация экспериментальных переломов на фоне остеопороза ввиду ухудшения показателей кровоснабжения костной мозоли протекает хуже, о чем свидетельствует большее число неудовлетворительных результатов. В соответствии с протоколом эксперимента, в группе крыс, получавших в качестве монотерапии исследуемый препарат сравнения Кальций-Д3 Никомед в 89 дозе 85,7 мг/кг, животным вводили указанное лекарственное вещество ежедневно внутрижелудочно на протяжении четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра. По прошествии микроциркуляции в четырех костных недель мозолях производили оценку консолидированных уровня переломов, макроскопическую и рентгенологическую оценку количества и качества консолидации экспериментальных переломов. Обнаружили, что Кальций-Д3 Никомед положительного влияния на показатели кровоснабжения костной мозоли экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра не оказывал. У данного препарата статистически достоверных отличий от значений микроциркуляции в группе крыс с остеопоротическими переломами бедра без лечения не было. На рисунке 3.34 отображены уровни микроциркуляции в межотломковой костной мозоли в группах крыс с межвертельными переломами бедренных костей без остеопороза, животных с переломами на фоне остеопороза, не получавших лечение, и крыс, которым вводился Кальций-Д3 Никомед. Таким образом, препарат Кальций-Д3 Никомед, по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов проксимальных отделов бедренных костей на фоне остеопороза у крыс не оказывает положительного влияния на параметры кровоснабжения костной мозоли. При визуальной и рентгенологической оценке результатов сращения остеопоротических переломов выявили, что после введения препарата КальцийД3 Никомед крысам в течение четырех недель после остеотомии и остеосинтеза данной модели патологии в данной неудовлетворительные результаты сращения. группе животных наблюдались 90 100 90 80 70 60 ПЕ 50 40 30 20 10 0 89,30 68,48 66,59* Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) ОПБ+кальций-Д3 Никомед Примечание * – p<0,05 в сравнении с животными с переломом бедра; ** – p<0,05 в сравнении с животными с остеопоротическим переломом бедра Рисунок 3.34 – Результаты влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на уровень кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза перелома У четырех крыс из 20, участвующих в эксперименте, наблюдалось отсутствие сращения переломов с развитием ложного сустава. Частота сращения экспериментальных межвертельных переломов в этой группе животных составила, таким образом, 80 %, что ниже, чем в группе крыс с переломами без остеопороза, но выше, чем у животных с остеопоротическими переломами (рис. 3.35, 3,36). Таким образом, препарат Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг по прошествии четырех недель после воспризведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза увеличивал частоту консолидации данной модели патологии, то есть изучаемый остеорепарации. препарат оказывал позитивное влияние на процессы 91 20 3 15 10 4 7 17 16 13 5 0 Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) Сращение ОПБ+кальций-Д3 Никомед Несращение Рисунок 3.35 – Результаты влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра Рисунок 3.36 – Пример рентгенограммы бедренной кости крысы с остеопорозом, получавшей Кальций-Д3 Никомед в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза остеопоротического перелома 92 РЕЗЮМЕ Учитывая ранее приведенные результаты исследований, можно констатировать, что сращение экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза у самок крыс Вистар через 12 недель после овариэктомии протекает на фоне ухудшения показателей микроциркуляции костной мозоли, что отрицательно сказывается на результатах сращения переломов на фоне остеопороза в виде увеличения числа неудовлетворительных исходов. Ежедневное внутрижелудочное введение препарата Кальций-Д3 Никомед в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза не влияет на показатели кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра, но положительно воздействует на процессы репарации экспериментальных повреждений, увеличивая частоту сращения переломов на фоне остеопороза. 3.7 Изучение влияния препарата L-аргинин на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах Согласно протоколу эксперимента, крысам с моделированными остеопоротическими переломами, в качестве монотерапии вводился L-аргинин в дозе 200 мг/кг. Крысы получали указанный препарат ежедневно внутрижелудочно на протяжении четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза проксимального отдела бедра. По прошествии четырех недель производили оценку уровня микроциркуляции в костных мозолях консолидированных переломов и визуальную и рентгенографическую оценку количества и качества консолидации экспериментальных переломов. Установили, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг положительно влиял на показатели кровоснабжения костной мозоли экспериментальных переломов 93 проксимального отдела бедра на фоне остеопороза, в отличие от препарата Кальций-Д3 Никомед, который не обнаруживал такого действия (рис. 3.37). 120 100 93,46** 89,30 80 68,48 66,59* ПЕ 60 40 20 0 Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) ОПБ+кальций-Д3 Никомед ОПБ+L-аргинин Примечание * – p<0,05 в сравнении с животными с переломом бедра; ** – p<0,05 в сравнении с животными с остеопоротическим переломом бедра Рисунок 3.37 – Результаты влияния L-аргинина на уровень кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза перелома в сравнении с другими группами животных При этом у крыс, получавших L-аргинин в дозе 200 мг/кг, средний уровень микроциркуляции остеопоротическими не только переломами превышал бедра без таковой лечения, у животных и у крыс с с остеопоротическими переломами бедра, которым применяли в качестве терапии Кальций-Д3 Никомед (p<0,001), но и имел тенденцию (пусть и не переходящую порога статистической значимости) к превышению показателей кровоснабжения костной мозоли переломов у животных с переломами бедра без остеопороза (р=0,477). Таким образом, L-аргинин, в отличие от препарата сравнения Кальций-Д3 Никомед, по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза у крыс существенно повышал уровень 94 кровоснабжения костной мозоли перелома бедра, обеспечивая тем самым благоприятные условия для сращения экспериментальных переломов. Визуальная и рентгенологическая оценка консолидации экспериментальных остеопоротических переломов выявила, что введение исследуемого препарата крысам в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза способствует улучшению консолидации костнотравматических повреждений на модели межвертельных переломов бедренной кости. Так у крыс, получавших в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов L-аргинин в дозе 200 мг/кг, сращение остеопоротических переломов отмечалось в 100% наблюдений (рис. 3.38, 3.39). 20 3 7 15 10 20 17 13 5 4 16 0 Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) Сращение ОПБ+кальций-Д3 Никомед ОПБ+L-аргинин Несращение Рисунок 3.38 – Результаты влияния L-аргинина на консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра в сравнении с контрольными группами животных и группой крыс, получавших препарат Кальций-Д3 Никомед Таким образом, L-аргинин в дозе 200 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза увеличивал частоту консолидации экспериментальных межвертельных переломов бедренных костей у самок крыс на фоне остеопороза. Изучаемый препарат 95 оказывал значительное позитивное влияние на процессы остеорепарации при экспериментальных переломах на фоне остеопороза. Рисунок 3.39 – Пример рентгенограммы бедренной кости крысы с остеопорозом, получавшей L-аргинин в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза перелома на фоне остеопороза РЕЗЮМЕ Ежедневное внутрижелудочное введение L-аргинина в дозе 200 мг/кг в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза, в отличие от препарата сравнения Кальций-Д3 Никомед, предотвращает ухудшение показателей кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра, поддерживая значения микроциркуляции выше, чем у крыс с экспериментальными переломами как на фоне остеопороза, так и без него. Благодаря этому улучшаются процессы остеорепарации экспериментальных повреждений, что выражается в увеличении моделированных остеопоротических переломов бедра. частоты консолидации 96 3.8 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с эналаприлом на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах В соответствии с протоколом экспериментального исследования, в группе животных, получавших комбинированную терапию L-аргинином в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, указанную комбинацию препаратов вводили экспериментальным животным ежедневно внутрижелудочно на протяжении четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза. Через четыре недели исследовали уровень микроциркуляции в костных мозолях консолидированных рентгенографическую переломов оценку и проводили количества и визуальную качества и сращений экспериментальных остеопоротических переломов. Выявили, что изученная комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг позитивно кровоснабжения мозоли костной влияет на экспериментальных значение уровня остеопоротических переломов проксимального отдела бедра (рис. 3.40). Было установлено, что у крыс, получавших комбинацию L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, средний уровень микроциркуляции достоверно превышал таковой у животных с переломами бедра на фоне остеопороза, не получавших лечения, и у крыс с переломами бедра на фоне остеопороза, получавших в качестве терапии Кальций-Д3 Никомед (p<0,001). Кроме того, абсолютные значения микроциркуляции в группе животных, получавших комбинированную терапию, превышали показатели как контрольных животных с экспериментальными переломами без остеопороза, так и показатели у крыс, получавших монотерапию L-аргинином (рис. 3.40). При этом в группе животных, получавших лечение комбинацией L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг, не наблюдалось статистически значимых отличий от показателей в группе крыс с переломами 97 бедра без остеопороза (р=0,064) и значений у животных, получавших монотерапию остеопоротических переломов L-аргинином (р=0,151). 120 100 93,46** 89,30 80 66,59* 68,48 Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) ОПБ+кальций-Д3 Никомед 100,17** ПЕ60 40 20 0 Перелом бедра ОПБ+L-аргинин ОПБ+L-аргинин +эналаприл Примечание * – p<0,05 в сравнении с животными с переломом бедра; ** – p<0,05 в сравнении с животными с остеопоротическим переломом бедра Рисунок 3.40 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с эналаприлом на уровень кровоснабжения костной мозоли переломов проксимального отдела бедра по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза перелома Таким образом, L-аргинин в дозе 200 мг/кг в комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза у крыс существенно повышал средний уровень кровоснабжения костной мозоли перелома бедра, обеспечивая тем самым благоприятные условия для сращения экспериментальных переломов. При визуальной и рентгенологической оценке результатов сращения остеопоротических переломов выявили, что после введения комбинации L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг крысам в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов на фоне остеопороза неудовлетворительных результатов сращения не наблюдалось: сращение остеопоротических переломов отмечалось в 100% наблюдений (рис. 3.41, 3.42). 98 20 3 4 7 15 20 20 ОПБ+L-аргинин ОПБ+L-аргинин +эналаприл 10 17 16 13 5 0 Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) ОПБ+кальций-Д3 Никомед Сращение Несращение Рисунок 3.41 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с эналаприлом на консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра Рисунок 3.42 – Пример рентгенограммы бедренной кости крысы с остеопорозом, получавшей комбинацию L-аргинина и эналаприла в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза остеопоротического перелома 99 Следовательно, комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза увеличивает частоту консолидации экспериментальных переломов на фоне остеопороза. Изучаемая комбинация препаратов оказывала положительное воздействие на процессы остеорепарации при переломах на фоне остеопороза. РЕЗЮМЕ Ежедневное внутрижелудочное введение L-аргинина в дозе 200 мг/кг в комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза предотвращает ухудшение показателей кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра более выражено, чем терапия препаратом КальцийД3 Никомед или L-аргинином в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии. Изученная воздействует на комбинация протекание L-аргинина процессов с эналаприлом костного положительно ремоделирования при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального отдела бедра у крыс, увеличивая число позитивных результатов консолидации переломов до 100%, при этом отличий в эффективности от L-аргинина в качестве монотерапии не наблюдается. 3.9 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах Согласно протоколу экспериментального исследования, в группе животных, получавших комбинированную терапию L-аргинином в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг, указанная комбинация препаратов вводилась экспериментальным животным ежедневно внутрижелудочно на протяжении 100 четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза. Через четыре недели исследовали уровень микроциркуляции в костных мозолях консолидированных рентгенографическую оценку переломов и количества проводили и визуальную качества и сращений экспериментальных остеопоротических переломов. Выявили, что сочетанное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг позитивно влияет на значение уровня кровоснабжения костной мозоли экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра (рис. 3.43). 120 100 93,46** 89,30 80 66,59* 100,17** 105,28** 68,48 ПЕ60 40 20 0 Перелом бедра Остеопоротический ОПБ+кальций-Д3 перелом бедра Никомед (ОПБ) ОПБ+L-аргинин ОПБ+L-аргинин +эналаприл ОПБ+L-аргинин +лозартан Примечание * – p<0,05 в сравнении с животными с переломом бедра; ** – p<0,05 в сравнении с животными с остеопоротическим переломом бедра Рисунок 3.43 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с лозартаном на уровень кровоснабжения костной мозоли переломов проксимального отдела бедра по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза перелома Было выявлено, что у крыс, которые получали указанную комбинацию препаратов, средний уровень микроциркуляции достоверно превышал таковой у животных с переломами бедра на фоне остеопороза, не получавших лечения, и у крыс с остеопоротическими переломами бедра, получавших в качестве терапии Кальций-Д3 Никомед (p<0,001). 101 Кроме того, абсолютные значения микроциркуляции в группах животных, получавших комбинированную терапию, превышали показатели как контрольных животных с экспериментальными переломами без остеопороза, так и показатели у крыс, получавших монотерапию L-аргинином (рис. 3.43). При этом в группе крыс, получавших комбинированную терапию L-аргинином в дозе 200 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг, наблюдалось достоверное превышение среднего уровня кровоснабжения как над значениями в группе крыс с переломами бедренной кости без остеопороза (р=0,011), так и над показателями у крыс, получавших монотерапию остеопоротических переломов L-аргинином (р=0,023). Таким образом, L-аргинин в дозе 200 мг/кг в комбинации с лозартаном в дозе 6 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза у крыс существенно повышал средний уровень кровоснабжения костной мозоли перелома бедра, обеспечивая тем самым благоприятные условия для успешного сращения переломов на фоне остеопороза. Визуальный осмотр области экспериментальных остеопоротических переломов бедренной кости выявил, что в группе крыс, которым проводилась терапия комбинацией препаратов, состоящей из L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг, в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза модели остеопоротических переломов, неудовлетворительных результатов сращения не наблюдалось, то есть сращение остеопоротических переломов отмечалось в 100% наблюдений. Последующие рентгенологические исследования поврежденных конечностей подтвердили данные визуального осмотра (рис. 3.44). Следовательно, комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг по прошествии четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза увеличивает частоту консолидации экспериментальных переломов на фоне остеопороза. Изучаемая комбинация 102 препаратов оказывали значительное позитивное влияние на процессы остеорепарации при переломах на фоне остеопороза. 20 3 4 7 15 20 20 20 ОПБ+L-аргинин ОПБ+L-аргинин +эналаприл ОПБ+L-аргинин +лозартан 10 17 16 13 5 0 Перелом бедра Остеопоротический перелом бедра (ОПБ) ОПБ+кальций-Д3 Никомед Сращение Несращение Рисунок 3.44 – Результаты влияния комбинации L-аргинина с лозартаном на консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра РЕЗЮМЕ Ежедневное внутрижелудочное введение L-аргинина в дозе 200 мг/кг в комбинациях с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза предотвращает ухудшение показателей кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра более выражено, чем терапия препаратом Кальций-Д3 Никомед или L-аргинином в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии. Изученные комбинации L-аргинина с эналаприлом и лозартаном положительно воздействуют на протекание процессов костного ремоделирования при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального отдела бедра у крыс, увеличивая частоту позитивных результатов консолидации 103 переломов до 100%, при этом отличий в эффективности от L-аргинина в качестве монотерапии не наблюдается. Из всего вышесказанного можно сделать заключение, что L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза переломов на фоне остеопороза у крыс благодаря своим эндотелиопротективным свойствам эффективно улучшают параметры регионарной микроциркуляции в области костной мозоли моделированных повреждений бедра. Наибольшее влияние на данные показатели оказывала комбинация L-аргинина с лозартаном. Вследствие воздействия L-аргинина и его изучаемых комбинаций с эналаприлом и лозартаном происходит улучшение процессов остеорегенерации и остеорепарации в области моделированных межвертельных переломов бедренной кости на фоне развившегося гипоэстрогенного остеопороза, свидетельством этому явилось увеличение частоты позитивных результатов сращения экспериментальных переломов по сравнению с контрольной группой животных и крысами, получавшими терапию препаратом Кальций-Д3 Никомед. Основываясь на полученных результатах данного исследования относительно того, что L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном благотворно влияют на консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов бедра, можно рекомендовать проведение целенаправленных остеологических клинических исследований данных лекарственных средств. 104 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В адекватности протекания процессов костного ремоделирования и репаративной регенерации функционированию ключевая роль микроциркуляторного принадлежит русла кости. правильному При ухудшении кровоснабжения кости наблюдаются различные остеологические заболевания, такие как остеонекроз, остеомиелит или остеопороз. Успешность консолидации костно-травматических повреждений также всецело зависит от качества новообразования сосудистой сети в кости и, в конечном счете, кровоснабжения костных фрагментов, образующихся при переломах. В свою очередь, центральным звеном в обеспечении адекватного функционирования зрелой сосудистой сети костной ткани является эндотелий – основной регуляторный момент межтканевых взаимодействий [35]. Есть мнение, что сосудистый эндотелий осуществляет контроль над тонусом сосудов, ростом гладкомышечных клеток, тромбообразованием, фибринолизом, лейкоцитарным взаимодействием и миграцией моноцитов, а также оказывает антиоксидантное действие [11, 35, 78]. Сосудистый эндотелий является многофункциональным макромолекулярным барьером со значительным количеством качеств, к ним можно отнести: провоспалительные и противовоспалительные эффекты; сосудорасширяющие и сосудосуживающие влияния; антитромботические и протромботические свойства; антиокислительная и проокислительная реакции; воздействие на подавление и стимулирование роста сосудов и т.д. [11, 149]. Следовательно, от полноценности функционирования эндотелиоцитов, в том числе в микроциркуляторном русле костной ткани, зависит как общее состояние регионарной микроциркуляции кости, так и процессы физиологического ремоделирования костной ткани и результаты репаративной регенерации повреждений. Данные рассуждения подтверждаются результатами работ ряда авторов, свидетельствующих, например, о том, что фактор роста эндотелия сосудов 105 (основной регулятор цепи событий, ведущих к образованию и развитию сети сосудов) играет существенную роль в процессах костного ремоделирования [118, 191] и репаративной регенерации повреждений кости [126]. В ходе эксперимента было продемонстрировано, что ингибирование фактора роста эндотелия сосудов приводит к расширению ростковых зон, ухудшению неоангиогенеза в зонах роста, потере трабекулярной метафизарных структуры микрососудов, [118], увеличению замедлению активности формирования остеокластов, приводящей к повышенной резорбции костной ткани [158]. При переломах ингибирование фактора роста эндотелия сосудов приводит к достоверному замедлению прорастания кровеносных сосудов, ухудшению минерализации зоны перелома и нарушению ремоделирования микротрабекул [159, 191]. В то же время стимуляция эндостального кровообращения в поврежденной кости при ее костно-травматических повреждениях обеспечивает проникновение мезенхимальных клеток в зону повреждения с эндостальной стороны кости [121] и их дальнейшую остеобластическую дифференцировку и образование губчатой костной ткани. Также нужно акцентировать внимание на особенной барьерной роли клеток эндотелия между циркулирующей кровью и тканями. В этой пограничной зоне на эдотелиоциты воздействуют различные патогенные факторы, находящиеся в системном и тканевом кровотоке [146]. На эндотелиальные клетки оказывают негативное влияние окисленные липопротеиды низкой плотности, повышенное содержание холестерина и реактивных свободных радикалов, повышенное гидростатическое давление внутри сосудов, которые эдотелиоциты покрывают, при артериальной гипертензии или гипергликемических состояниях на фоне сахарного диабета [79]. Отрицательные эффекты данных факторов приводят к гибели клеток сосудистого эндотелия, то есть к повреждению эндотелиального слоя сосудов, что, в свою очередь, приводит к развитию эндотелиальной дисфункции (ЭД) [152]. Надо отметить, что основным механизмом в формировании дисфункции эндотелия являются каскадные реакции, которые ведут к снижению образования 106 и биодоступности оксида азота (NO). Происходит продукция мощных вазоконстрикторов и увеличение уровня супероксид аниона, и, как следствие этого, возникает дисбаланс медиаторов, обеспечивающих нормальное протекание эндотелийзависимых реакций [10, 15]. Так же происходят регуляторные расстройства противоположно действующих процессов релаксации – и констрикции, прокоагуляции и антикоагуляции, и ингибирование факторов роста, что ведет к ухудшению кровоснабжения тканей, в том числе и костной. Следствием чего остеорепарации является нарушение поврежденной функционирование полноценного процессов костной остеорегенерации ткани [143]. микроциркуляторного и Адекватное сосудистого русла особенно в костной системе являтся базистным фактором в удержании в нормальном состоянии гомеостаза костной ткани. Для поддержания адекватного тонуса кровеносных сосудов и нормального гидростатического давления в них продуцируется оксид азот, который синтезируется из L-аргинина оксид азота-синтазами (NOS). NOS состоит из трех изоферментов: нейрональная (nNOS), эндотелиальная (eNOS) и индуцибельная (iNOS) [23, 62]. Также посредством этих изоферментов NO вовлечен в процессы костного метаболизма. В кости концентрируются преимущественно два изофермента: это eNOS и iNOS. Воздействуют они на кость по-разному: в клетках остеобластной линии отмечается постоянная экспрессия eNOS, а под влиянием медиаторов воспаления iNOS действует как на остеобласты, так и на остеокласты, усиливая, тем самым, резорбцию костной ткани при воспалительных заболеваниях через снижение остеорегенерации за счет уменьшения количества остеобластов [107]. Некоторые клинические исследования наглядно показали, что у пациентов при непостоянном приеме нитратов минеральная плотность костной ткани в бедре и пятке больше, чем у людей, которые этих препаратов не получали. В рандомизированных исследуемых группах была обнаружена способность изосорбида мононитрата повышать маркеры образования костной ткани (например, щелочную фосфатазу) и значительно снижать маркеры резорбции 107 костной ткани (например, экскрецию с мочой N-телопептида) у женщин в постменопаузе [141]. Из приведенных литературных данных можно сделать вывод, что эндотелий сосудов костной ткани является неотъемлемой частью костных структур и выполняет главенствующую регуляторную функцию в обеспечении связей с другими слоями сосудистой стенки, адекватно реагируя посредством выделения медиаторов на их потребности [51, 178]. Эти факторы во многом определяют состояние регионарной микроциркуляции, которая несет ответственность за поддержание гомеостаза костной ткани. Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что эндотелий костных микрососудов является неотъемлемой составляющей кости и играет ключевую роль, обеспечивая взаимодействие с другими слоями сосудистой стенки. Эндотелий адекватно реагирует на различные потребности сосудистой стенки, выделяя разнообразные медиаторы. Это во многом определяет состояние регионарной микроциркуляции, которая влияет на гомеостаз костной ткани [51, 179]. На основании изложенного в ходе выполнения исследования мы придерживались рабочей гипотезы, в соответствии с которой адекватность протекания процессов костного ремоделирования и репарации повреждений напрямую зависит от функционирования сосудистого эндотелия, что определяет степень локального кровоснабжения костной ткани. Следовательно, дисфункция сосудистого эндотелия микроциркуляторного русла кости может быть причиной ухудшения регионарной микроциркуляции в кости и, таким образом, дисбаланса процессов ремоделирования костной ткани и репаративной регенерации повреждений. В последнее время не прекращается поиск и изучение новых препаратов, обладающих эндотелиопротективными свойствами. Стоит отметить, что отдельного класса лекарственных препаратов для целенаправленной коррекции нарушений функционирования эндотелия в настоящее время не выделено, в связи с чем внимание экспериментаторов привлекают представители различных фармакологических групп препаратов, эндотелиопротективной активностью. обладающих плейотропной 108 По нашему мнению, наибольшего внимания заслуживает L-аргинин – аминокислота, являющаяся в организме субстратом для синтеза оксида азота – основного медиатора функционирования эндотелиальной системы [35, 53, 199]. Кроме того, такие препараты, как ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента [14, 30, 43, 54], например, эналаприл, блокаторы АТ-рецепторов [45, 51, 65, 75], например, лозартан, обладающие положительным влиянием на функцию эндотелия, способны, на наш взгляд, вступать с L-аргинином в положительное фармакодинамическое взаимодействие в отношении остеопротективного эффекта. Так, одним из возможных путей протективного влияния эналаприла на эндотелиальную дисфункцию может быть механизм нормализации метаболизма брадикинина: блокада тканевого ангиотензинпревращающего фермента приводит к ингибированию выработки AТ-2 и к торможению деградации брадикинина [73, 138]. Кроме того, под влиянием ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента, в частности эналаприла, возможно уменьшение инсулин- индуцированной и базальной выработки эндотелина-1 и стимулирование образования оксида азота [67, 119]. Эндотелиопротективные эффекты лозартана реализуются посредством блокады АТ1-рецепторов, следствием чего является снижение выработки супероксид-радикалов, уменьшение связывания оксида азота и увеличение его концентрации. Ввиду того, что стимуляция ангиотензин-1-рецепторов индуцирует образование супероксидов, разрушающих оксид азота, а стимуляция ангиотензин2-рецепторов ведет к расширению сосудов и увеличению показателей натрийуреза из-за индукции системы брадикинина, оксида азота и цикло-ГМФ, то эффект ангиотензина-2 (синтеза или разрушение оксида азота) зависит от типа рецепторов, с которыми он главным образом взаимодействует [55, 169]. Очевидно, таким образом, что при блокаде АТ1-рецепторов обеспечиваются хорошие условия для усиления деятельности свободных ангиотензин-2- рецепторов, приводящего к замедлению деградации и увеличению концентрации NO [70, 80, 110]. 109 Пусковым механизмом, ведущим к развитию дефицита оксида азота и вызываемой им эндотелиальной дисфункции, является недостаток L-аргинина. При многих патологических состояний сердечно-сосудистой системы уровень L-аргинина в плазме крови часто оказывается сниженным [36, 84, 188, 199], а дополнительном введении данного вещества в организм пациента способствует восстановлению NO и функции эндотелия [85, 155]. Это обстоятельство можно объяснить тем, что L-аргинин является субстратом для эндотелиальной синтазы оксида азота [56]. В эндотелиоцитах в результате биосинтеза из аминокислоты L-аргинина при участии фермента eNOS продуцируется оксид азота. Эндотелиальной синтазы оксида азота обладает важным влиянием на регуляцию сосудистого русла. Так же образование NO осуществляется с промежуточным синтезом N-гидрокси-L-аргинина (NHA), который образуется в результате поглощения одной молекулы кислорода (O2) и двух электронов. В следствие этого происходит преобразование NHA в L-цитруллин и оксид азота с дополнительным участием еще одной молекулы O2 и одного электрона [56, 188, 199]. Таким образом, очевидна значительная роль L-аргинина в предотвращении эндотелиальной дисфункции. Для проверки истинности принятой гипотезы изучали степень развития эндотелиальной дисфункции, в том числе микроциркуляторного русла кости, и остеопоротических изменений костей скелета у крыс через 12 недель после овариэктомии и оценивали степень кровоснабжения в проксимальном отделе бедра. Выбор указанной модели патологии не случаен. В первую очередь благодаря ранее проведенным исследованиям, в ходе которых было продемонстрировано, что по прошествии шести недель после овариэктомии у крыс развивается дисфункция сосудистого эндотелия [30, 31, 56]. Во вторую очередь, из данных доступных литературных источников известно, что по прошествии восьми недель после операции овариэктомии у самок крыс обнаруживается распространенный остеопороз [13, 20, 138]. В-третьих, данная модель была выбрана нами как наиболее физиологичная (по сравнению с 110 моделями гиперглюкокортикоидного или иммобилизационного остеопороза) для оценки изменений, происходящих при возникновении и прогрессировании остеопороза и его коррекции выбранными препаратами и их комбинациями. Для определения уровня микроциркуляции у крыс в кости проксимального отдела бедра использовали следующее оборудование (Biopac systems, США): полиграф MP100, блок лазерной допплеровской флоуметрии LDF100C, игольчатый датчик TSD144. В целях количественной оценки степени развития дисфункции эндотелия выполняли функциональные сосудистые тесты эндотелийзависимого и эндотелийнезависимого расширения сосудов в ответ на одномоментное внутривенное введение ацетилхолина и нитропруссида натрия соответственно. После этого подсчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции [20, 56], как отношение площади треугольника над кривой нормализации уровня кровоснабжения после введения раствора нитропруссида натрия к площади треугольника над кривой нормализации уровня кровоснабжения после введения раствора ацетилхолина. Степень развития остеопоротических изменений оценивали путем морфометрических исследований срезов бедренных костей с последующим измерением средней ширины костных трабекул в указанной локализации. В результате экспериментальных исследований установили, что через 12 недель после овариэктомии у крыс развивается нарушение функционирования эндотелия сосудов, в том числе микрососудистого русла кости проксимального отдела бедра, выражающееся в статистически значимом увеличении значения коэффициента эндотелиальной дисфункции. При этом наблюдалось статистически значимое уменьшение среднего уровня кровоснабжения костной ткани проксимального отдела бедра. В результате проведения морфометрии костной ткани обнаружили, что у самок крыс Вистар через 12 недель после овариэктомии развивается экспериментальный остеопороз, выражающийся в нарушении микроархитектоники костной ткани, а именно в истончении костных трабекул и появлении микроповреждений костных трабекул. 111 Таким образом, формирующийся в течение двенадцати недель после овариэктомии у самок крыс Вистар комплекс патологических морфо- функциональных изменений подтверждает принятую нами гипотезу патогенеза остеопороза: нарушение нормального функционирования сосудистого эндотелия микроциркуляторного русла кости, ухудшая ее кровоснабжение, играет существенную роль в разобщении процессов ремоделирования кости и, следовательно, развитии остеопоротических изменений. В подтверждение эндотелийзависимое принятой расслабление гипотезы сосудов кости, L-аргинин, усиливая нормализовал значение коэффициента эндотелиальной дисфункции, эффективно предотвращал снижение уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра, а также оказывал статистически значимое положительное воздействие на среднюю ширину костных трабекул, обладая остеопротективной активностью, более выраженной, чем у препарата сравнения Кальций-Д3 Никомед. Изучение комбинированного применения L-аргинина с эналаприлом и L-аргинина с лозартаном позволило обнаружить усиление фармакологической активности по сравнению с монотерапией L-аргинином. Так, обе изученные комбинации препаратов более эффективно снижали коэффициент эндотелиальной дисфункции, рассчитанный по результатам проведения функциональных сосудистых проб при лазерной допплеровской флоуметрии в бедренной кости у крыс; комбинации L-аргинина с эналаприлом и лозартаном оказывали более выраженное по сравнению с монотерапией L-аргинином влияние на значения среднего уровня микроциркуляции и средней ширины костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости. Более выраженной активностью обладала комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг. В ходе дальнейших исследований выяснили, что на модели экспериментальных остеопоротических переломов проксимального отдела бедра у крыс L-аргинин оказывал выраженное положительное воздействие на степень кровоснабжения формирующейся костной мозоли, тем самым L-аргинин 112 предотвращал ухудшение процессов репаративной регенерации при развившемся остеопорозе, приводя к нулю количество неудовлетворительных исходов консолидации экспериментальных переломов. Кальций-Д3 Никомед хоть и не оказывал никакого влияния на уровень микроциркуляции в костных мозолях экспериментальных переломов, но способствовал увеличению количества сращений экспериментальных остеопоротических переломов. При изучении результатов комбинированного использования L-аргинина с эналаприлом и лозартаном обнаружили, что под воздействием указанных комбинаций уровень микроциркуляции в костных мозолях превосходил значения не только животных с остеопоротическими переломами бедренных костей, но даже показатели животных с переломами без остеопороза, что свидетельствует о наличии у данных комбинаций ярко выраженной протективной активности на выбранной модели патологии. Как и в случае с моделью экспериментального остеопороза, более выраженной активностью обладала комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг с лозартаном в дозе 6 мг/кг. Обе изученные комбинации L-аргинина, как с эналаприлом, так и с лозартаном, обеспечивали 100% консолидацию экспериментальных остеопоротических переломов у лабораторных животных. Таким образом, L-аргинин, а также комбинации L-аргинина с эналаприлом и L-аргинина с лозартаном, обладая выраженной эндотелиопротективной активностью в отношении эндотелия микрососудов костной ткани, препятствуют уменьшению степени локального кровоснабжения костной ткани при экспериментальном остеопорозе и в костных мозолях при экспериментальных остеопоротических переломах и, как следствие, обладают остеопротективным действием, выражающимся в положительном влиянии на протекание процессов костного ремоделирования и репаративной регенерации. Более выраженной остеопротективной активностью, превышающей эффективность монотерапии L-аргинином в дозе 200 мг/кг, обладает комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг. 113 ВЫВОДЫ 1. L-аргинин в дозе 200 мг/кг при экспериментальном остеопорозе обладает выраженным эндотелиотропным коэффициента эндотелиальной действием, проявляющимся дисфункции, в предотвращает снижении ухудшение кровоснабжения костной ткани проксимального отдела бедра, поддерживая его на показателях, статистически значимо превышающих показатели в группе крыс с остеопорозом без лечения и получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг, а также, увеличивая среднюю ширину костных трабекул по сравнению с крысами с остеопорозом и, сохраняя микроархитектонику кости, обладает антиостеопоротическим действием. 2. Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и эналаприла в дозе 0,5 мг/кг при экспериментальном остеопорозе, имея выраженную эндотелиотропную активность, предотвращает дисфункции; комбинация повышение препаратов коэффициента эффективно эндотелиальной повышает показатели кровотока в кости проксимального отдела бедра, поддерживая их на уровне, статистически значимо превышающем значения в группах крыс с остеопорозом без лечения и получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг, и обладает выраженным остеопротективным действием, увеличивая среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости. 3. Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг при экспериментальном остеопорозе обладает выраженным эндотелиотропным действием – значительно уменьшает коэффициент эндотелиальной дисфункции; комбинация препаратов эффективно повышает микроциркуляцию в кости проксимального отдела бедра, в большей степени, чем монотерапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг, приближая ее значения к показателям контрольных животных, и имеет более выраженное остеопротективное действие, чем Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг и L-аргинин в дозе 200 мг/кг, достоверно увеличивая среднюю ширину костных трабекул проксимального отдела бедра. 114 4. L-аргинин в дозе 200 мг/кг увеличивает показатели кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра до значений животных с переломами без остеопороза, а также превышающих показатели у крыс с экспериментальными переломами на фоне остеопороза без лечения и получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг, а также увеличивает до 100% число позитивных результатов консолидации остеопоротических переломов. 5. Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и эналаприла в дозе 0,5 мг/кг повышает показатели микроциркуляции в области перелома проксимального отдела бедра до значений, превышающих соответствующие показатели у крыс с переломами на фоне остеопороза как без лечения, так и получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг и у животных с экспериментальными переломами без остеопороза. Указанная комбинация препаратов увеличивает число позитивных результатов консолидации остеопоротических переломов до 100%. Отличий в эффективности от монотерапии L-аргинином в дозе 200 мг/кг обнаружено не было. 6. Комбинация L-аргинина в дозе 200 мг/кг и лозартана в дозе 6 мг/кг существенно увеличивает показатели кровоснабжения костной мозоли перелома проксимального отдела бедра выше, чем в группах с переломами бедренных костей без остеопороза, с переломами на фоне остеопороза без лечения, а также на фоне монотерапии препаратом Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг и Lаргинином в дозе 200 мг/кг, и увеличивает до 100% число позитивных результатов сращения экспериментальных переломов на фоне остеопороза. 115 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Полученные экспериментальные результаты позволяют рекомендовать проведение клинических исследований L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном на добровольцах – лицах с явными остеопоротическими нарушениями различной этиологии. Весьма перспективной выглядит возможность проведения исследований клинической эффективности терапии L-аргинином и его сочетанного применения с эналаприлом и лозартаном у женщин с гипоэстрогенным состоянием в постклимактерическом периоде и у мужчин пожилого возраста. 2. Установленная роль адекватности функционирования эндотелия сосудов, в том числе микроциркуляторного русла кости, в протекании процессов костного ремоделирования и остеорепарации позволяет рекомендовать проведение дальнейшего поиска и изучения лекарственных средств и фармакологических агентов для патогенетически обоснованной остеопоротических нарушений и их осложнений. профилактики и коррекции 116 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ – артериальная гипертензия АПФ – ангиотензинпревращающий фермент АТ – ангиотензин ГМК – гладкомышечные клетки Г-Э – гематоксилин-эозин ИБС – ишемическая болезнь сердца ИФР-1 – инсулиноподобный фактор роста 1 КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции ЛДФ – лазерная допплеровская флоуметрия Мкм – микрометры ОП – остеопороз ПЕ – перфузионные единицы ТФР – тромбоцитарный фактор роста ТФР-β – трансформирующий фактор роста β цГМФ – циклический гуанозин-монофосфат ЭД – эндотелиальная дисфункция ЭЗВД – эндотелийзависимая вазодилатация ЭНВД – эндотелийнезависимая вазодилатация eNOS – фермент эндотелиальной синтазы оксида азота NO – оксид азота NOS – фермент синтазы оксида азота SАХ – площадь треугольника, формирующегося в ответ на введение ацетилхолина SНП – площадь треугольника, формирующегося нитропруссида натрия TGF β – трансформирующий фактор роста β VEGF – фактор роста эндотелия сосудов в ответ на введение 117 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Аврунин, А. С. Формирование остеопоротических сдвигов в структуре костной ткани (Костные органы, структура костной ткани и её ремоделирование, концепция патогенеза остеопороза, его диагностика и лечение) / А. С. Аврунин, Н. В. Корнилов, А. В. Суханов – СПб., 1998. – 68 с. 2. Бажин, М. Н. Уральская кардиологическая концепция: Новое в изучении гипертонической болезни : дайджест / М. Н. Бажин. – В. Пышма, 2000. – 51 с. 3. Баранова, И. А. Глюкокортикоидиндуцированный остеопороз: патогенез, профилактика, лечение / И. А. Баранова // Соврем. ревматология. – 2008. – № 1. – С. 31-39. 4. Беленков, Ю. Н. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента в лечении сердечно-сосудистых заболеваний (Квинаприл и эндотелиальная дисфункция) / Ю. Н. Беленков, В. Ю. Мареев, Ф. Т. Агеев. – М. : Инсайт полиграфик, 2002. – 86 с. 5. Белоусов, Ю. Б. Эндотелиальная дисфункция как причина атеросклеротического поражения артерий при артериальной гипертензии: методы коррекции / Ю. Б. Белоусов, Ж. Н. Намсараев // Фарматека. – 2000. – № 6. – С. 6272. 6. Беневоленская, Л. И. Проблема остеопороза в современной медицине / Л. И. Беневоленская // Consilium Medicum. – 2004. – Т. 6, № 2. – С. 8-11. 7. Блокатор АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартан. Ч. 1. Основы клинической фармакологии / Б. А. Сидоренко, Д. В. Преображенский, Т. М. Стеценко [и др.] // Кардиология. – 2003. – Т. 43, № 1. – С. 90-98. 8. Блокатор использования АТ1-ангиотензиновых для лечения рецепторов гипертонической лозартан. болезни и Ч. 2. Опыт диабетической нефропатии / Б. А. Сидоренко, Д. В. Преображенский, Т. М. Стеценко [и др.] // Кардиология. – 2003. – Т. 43, № 2. – С. 88-95. 118 9. Брикман, А. Нарушение обмена кальция и фосфора у взрослых / А. Брикман // Эндокринология : пер. с англ. / под ред. Н. Лавина. – М. : Практика, 1999. – С. 413-454. 10. Брошусь, В. В. Оксид азота как регулятор защитных и гомеостатических реакций организма / В. В. Брошусь // Укр. ревматол. журн. – 2003. – № 4. – С. 3-11. 11. Бувальцев, В. И. Дисфункция эндотелия как новая концепция профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний / В. И. Бувальцев // Междунар. мед. журн. – 2001. – № 3. – С. 202-208. 12. Верткин, А. Д. Распространенность и течение остеопороза у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями / А. Д. Верткин, А. В. Наумов, В. С. Иванов [и др.] // Соврем. ревматология. – 2008. – № 1. – С. 52-59. 13. Влияние резвератрола на моделирование костной ткани в эксперименте / А. В. Файтельсон, Г. М. Дубровин, О. С. Гудырев [и др.] // Мед. альм. – 2012. – № 1. – С. 160-163. 14. Влияние терапии эналаприла малеатом на функцию сосудистого эндотелия и тромбоцитарно-эндотелиальные взаимосвязи у больных гипертонической болезнью / В. М. Яковлев, А. А. Семенкин, С. М. Юдин [и др.] // Терапевт. арх. – 2000. – № 1. – С. 40-44. 15. Галаган, М. Е. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо- и эндогенных источников / М. Е. Галаган, А. В. Широколова, А. Ф. Ванин // Вопр. мед. химии. – 1991. – Т. 37, № 1. – С. 67-70. 16. Гланц, С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / С. Гланц. – М.: Практика, 1998. – 459 с. 17. Гомазков, О. А. Эндотелин в кардиологии: молекулярные, физиологические и патологические аспекты / О. А. Гомазков // Кардиология. – 2001. – Т. 41, № 2. – С. 50-58. 18. Горская, Ю. Ф. Возрастные изменения в популяции индуцибельных остеогенных клеток-предшественнников / Ю. Ф. Горская, Е. Ю. Шуклина, В. Г. Нестеренко // Бюл. эксперим. биологии. – 2002. – № 2. – С. 180-182. 119 19. Грибкова, И. В. активирует NO Ca2+-активируемый K+ ток гладкомышечных клеток хвостовой артерии крысы через GMP-зависимый механизм / И. В. Грибкова, Р. Шуберт, В. П. Серебряков // Кардиология. – 2002. – № 8. – С. 34-39. 20. Гудырев, О. С. Остеопротективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.00.25 / О. С. Гудырев ; Курск. гос. мед. ун-т. – Курск, 2008. – 22 с. 21. Дворецкий, Д. П. Механогенная регуляция тонуса и реактивности кровеносных сосудов / Д. П. Дворецкий // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. – 1999. – Т. 85, № 9/10. – С. 1267-1277. 22. Дедов, И. И. Остеопороз: патогенез, диагностика, принципы профилактики и лечения : метод. пособие для врачей / И. И. Дедов, Л. Я. Рожинская, Е. И. Марова. – М., 2002. – 60 с. 23. Динамика оксида азота (NOx) и других факторов окислительного стресса в прецеребральных сосудах до и после каротидной эндартерэктомии / П. П. Голиков, В. Л. Леменев, В. В. Ахметов [и др.] // Регионар. кровообращение и микроциркуляция. – 2003. – № 4. – С. 28-33. 24. Динамика показателей эндотелийзависимой вазодилатации и гипотензивная эффективность эналаприла у пациентов с артериальной гипертонией / Р. Ф. Мордовин, Т. М. Рипп, А. А. Соколов [и др.] // Кардиология. – 2001. – Т. 41, № 6. – С. 31-33. 25. Дисфункция эндотелия у больных гипертонической болезнью / А. И. Мартынов, Н. Г. Аветян, Е. В. Акатова [и др.] // Кардиология. – 2005. – Т. 45, № 10. – С. 101-104. 26. Зотова, И. В. Синтез оксида азота и развитие атеросклероза / И. В. Зотова, Д. А. Затейщиков, Б. А. Сидоренко // Кардиология. – 2000. – № 4. – С. 58-67. 27. Карпов, Ю. А. Клиническая гипертензиология: анализ завершённых исследований 2001-2002 гг. / Ю. А. Карпов // Кардиология. – 2002. – Т. 42, № 10. – С. 62-66. 120 28. Клиническая эффективность лозартана калия и его комбинации с гидрохлортиазидом при гипертонической болезни. Влияние на состояние микроциркуляторного русла / В. И. Подзолков, Е. А. Сон, В. А. Булатов, В. И. Маколкин // Кардиология. – 2003. – Т. 43, № 11. – С. 18-22. 29. Комплексная оценка вазомоторной функции сосудистого эндотелия у больных с артериальной гипертонией / Б. И. Гельцер, С. В. Савченко, В. Н. Котельников, И. В. Плотникова // Кардиология. – 2004. – Т. 44, № 4. – С. 24-28. 30. Корокин, М. В. Моделирование гипоэстроген индуцированной эндотелиальной дисфункции / М. В. Корокин, Л. В. Корокина, Т. Г. Покровская // Университетская наука: взгляд в будущее : материалы юбилейн. науч. конф. КГМУ и сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН. – Курск, 2006. – Ч. 2. – С. 231. 31. Кочкаров, В. И. антигипертензивными Резвератрол препаратами и его в комбинации с основными фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции : автореф. дис. … д-ра биол. наук : 14.00.25 / В. И. Кочкаров ; Курск. гос. мед. ун-т. – Курск, 2009. – 46 с. 32. Майчук, Е. Ю. Современные представления об использовании ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента для лечения артериальной гипертензии / Е. Ю. Майчук, И. В. Воеводина // Рус. мед. журн. : Кардиология. – 2005. – Т. 13, № 19. – С. 1287-1291. 33. Маколкин, заболеваний В. И. Новые ингибиторами возможности лечения сердечно-сосудистых ангиотензинпревращающего фермента / В. И. Маколкин // Кардиоваскуляр. терапия и профилактика. – 2005. – № 5. – С. 66-70. 34. Марков, Х. М. Молекулярные механизмы дисфункции сосудистого эндотелия / Х. М. Марков // Кардиология. – 2005. – Т. 45, № 12. – С. 62-80. 35. Марков, Х. М. Оксидантный стресс и дисфункция эндотелия / Х. М. Марков // Патол. физиология и эксперим. терапия. – 2005. – № 4. – С. 72-77. 121 36. Марков, Х. М. L-аргинин — оксид азота в терапии болезней сердца, и сосудов / Х. М. Марков // Кардиология. – 2005. – C. 87-95. 37. Микроциркуляция в кардиологии / под ред. В. И. Маколкина. – М. : Визарт, 2004. – 136 с. 38. Минушкина, Л. О. Генетические аспекты регуляции эндотелиальной функции при гипертонии / Л. О. Минушкина, Д. А. Затейщиков, Б. А. Сидоренко // Кардиология. – 2000. – № 3. – С. 68-76. 39. Миронов, С. П. Остеопороз как медико-социальная проблема / С. П. Миронов // Проблема остеопороза в травматологии и ортопедии : материалы III конф. с междунар. участием (Москва, 14-15 фев. 2006 г.). – М. : ЦИТО им. Н. Н. Приорова, 2006. – С. 4. 40. Михайлов, Е. Е. Частота переломов проксимального отдела бедренной кости и дистального отдела предплечья среди городского населения России / Е. Е. Михайлов, Л. И. Беневоленская, С. Г. Аникин // Остеопороз и остеопатии. – 1999. – № 3. – С. 2-6. 41. Насонов, Е. Л. Маркеры активации эндотелия (тромбомодулин, антиген фактора Виллебранда и ангиотензинпревращающий фермент): клиническое значение / Е. Л. Насонов, А. А. Баранов, Н. П. Шилкина // Клинич. медицина. – 1998. – Т. 70, № 11. – С. 4-10. 42. Небиеридзе, Д. В. Клиническое значение дисфункции эндотелия при артериальной гипертонии / Д. В. Небиеридзе // Consilium medicum: Системные гипертензии (прил.). – 2005. – Т. 7, № 1. – С. 31-38. 43. Небиеридзе, Д. В. Микроциркуляторные расстройства при артериальной гипертонии и перспективы их коррекции / Д. В. Небиеридзе, Е. В. Шилова, С. Н. Толпыгина // Кардиоваскуляр. терапия и профилактика. – 2004. – № 4. – С. 28-32. 44. Небиеридзе, Д. В. Перспективы ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента при лечении артериальной гипертензии / Д. В. Небиеридзе, Е. В. Шилова, С. Н. Толпыгина // Фарматека. – 2004. – № 6. – С. 89-92. 122 45. Ольбинская, Л. И. Блокаторы рецепторов ангиотензина II при лечении артериальной гипертонии / Л. И. Ольбинская // Consilium medicum (прил.). – 2005. – № 2. – С. 27-28. 46. Ольбинская, Л. И. Влияние лозартана на риск сердечно-сосудистых осложнений у больных артериальной гипертензией / Л. И. Ольбинская, Ю. И. Данилогородская // Врач. – 2004. – № 1. – С. 39-42. 47. Остеопороз как фактор риска асептической нестабильности при эндопротезировании тазобедренного сустава / С. С. Родионова, В. И. Нуждин, А. К. Морозов [и др.] // Вестн. травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова. – 2007. – № 2. – С. 35-40. 48. Панюшин, С. К. Горманотропные свойства солнечного света и токсичность солнцезащитной косметики / С. К. Панюшин // Мед. картотека. – 2004. – Режим доступа : http://www.medka.ru/archive/a041104.html, свободный. 49. Перспективы изучения микроциркуляции в костной ткани в поиске новых звеньев патогенеза остеопороза О.С. / Гудырев, А.В. Файтельсон, М.В. Покровский, Г.М. Дубровин // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2007. – № 3. – С. 17-20. 50. Плавинский, С.Л. О людях и цифрах. Обучение статистике: чему, кого и как учить? / С.Л. Плавинский // Междунар. журн. мед. практики. – 2006. – Вып. 2. – С. 9-16. 51. Подзолков, В. И. Антагонисты АТ1 рецепторов и состояние микроциркуляции у больных гипертонической болезнью: еще одна мишень для терапии? / В. И. Подзолков, В. А. Булатов, Е. А. Сон // Артериал. гипертензия. – 2005. – Т. 11, № 3. – С. 207-210. 52. Подзолков, В. И. Эффективность лозартана у больных артериальной гипертензией с высоким риском сердечно-сосудистых осложнений (по материалам исследований LIFE и RENAL) / В. И. Подзолков, В. А. Булатов // Фарматека. – 2004. – № 6. – С. 79-85. 53. Полонский, В. М. Исследование LIFE: новые перспективы применения лозартана / В. М. Полонский // Фарматека. – 2002. – № 7/8. – С. 3-9. 123 54. Применение кальция и витамина D для профилактики остеопороза у женщин в постменопаузе / Л. Я. Рожинская, Л. К. Дзеранова, Е. И. Марова [и др.] // Остеопороз и остеопатии. – 2001. – № 1. – С. 29-33. 55. Покровский, В. И. Оксид азота, его физиологические и патофизиологические свойства / В. И. Покровский, Н. А. Виноградов // Терапевт. арх. – 2005. – № 1. – С. 82-87. 56. Покровская, Т. Г. Комбинированная фармакологическая коррекция метаболического пути L-аргинина/NO при моделировании дефицита оксида азота : автореф. дис. … д-ра мед. наук : 14.00.25 / Т. Г. Покровская ; Курск. гос. мед. ун-т. – Курск, 2009. – 42 с. 57. Поливода, С. Н. Эндотелиопротективные эффекты эналаприла у больных гипертонической болезнью / С. Н. Поливода, А. А. Черепок, Ю. Н. Писанко // Врачеб. дело. – 2001. – № 2. – С. 136-137. 58. Применение эналаприла метаболическими нарушениями у больных / В. С. артериальной Зодионченко, гипертонией С. Б. с Хруленко, Т. В. Адашева, И. В. Погонченкова // Кардиология. – 2000. – № 10. – С. 38-41 59. Рожинская, Л. Я. Бивалос (стронция ранелат) – инновационный препарат в лечении постменопаузального остеопороза / Л. Я. Рожинская // Фарматека. – 2007. – № 12. – С. 10-15. 60. Рожинская, Л. Я. Системный остеопороз : практ. рук. для врачей / Л. Я. Рожинская. – 2-е изд., перераб. и доп. – М. : Издатель Мокеев, 2000. – 195 с. 61. Роль коррекции метаболизма оксида азота в организме при профилактике гипертонического ремоделирования сердечно-сосудистой системы / В. И. Бувальцев, С. Ю. Машина, Д. А. Подкидышев [и др.] // Рос. кардиол. журн. – 2002. – № 5. – С. 74-81. 62. Роль оксида азота в регуляции растяжимости артериальных сосудов у нормои гипертензивных крыс / Д. Л. Сонин, А. В. Сыренский, М. М. Галагудза [и др.] // Артериал. гипертензия. – 2002. – № 6. – C. 57-64. 124 63. Роль оксида азота и свободных радикалов в патогенезе артериальной гипертензии / Е. Б. Манухина, Н. П. Лямина, П. В. Долотовская [и др.] // Кардиология. – 2002. – Т. 42, № 11. – С. 73-84. 64. Руководство по остеопорозу / под ред. Л. И. Беневоленской. – М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. – 524 с. 65. Саприн, А. Н. Окислительный стресс и его роль в механизмах апоптоза и развития патологических процессов / А. Н. Саприн, Е. В. Калинина // Успехи биологии и химии. – 1999. – Т. 39. – С. 289-326. 66. Скрипникова, И. А. Взаимосвязь сердечно-сосудистых заболеваний, обусловленных атеросклерозом, и остеопороза у женщин в постменопаузе / И. А. Скрипникова // Соврем. ревматология. – 2008. – № 1. – С. 41-47. 67. Скрипникова, И. А. Остеопороз и ревматические заболевания / И. А. Скрипникова, Е. Л. Насонов // Мед. новости. – 1997. – № 2. – С. 9-10. 68. Сравнительная оценка антигипертензивного и кардиопротективного эффектов лозартана и его фиксированной комбинации с гидрохлортиазидом / Л. Г. Ратова, Д. М. Атауллаханова, С. Н. Толпыгина, И. Е. Чазова // Consilium medicum: Системные гипертензии (прил.). – 2004. – № 2. – С. 26-32. 69. Стабровская, Н. В. Исследование эндотелио- и остеопротективных эффектов некоторых антиоксидантов : автореф. дис. … канд. мед. наук : 14.03.06 / Н. В. Стабровская ; Курск. гос. мед. ун-т. – Курск, 2011. – 22 с. 70. Суточные профили артериального давления и функции эндотелия при длительном лечении ангиотензинпревращающего артериальной фермента гипертонии / В. Б. Симоненко, ингибиторами А. Я. Фисун, А. А. Михайлов [и др.] // Клинич. медицина. – 2004. – № 7. – С. 48-55. 71. Фармакологическая регуляция тонуса сосудов / под ред. П. А. ГаленкоЯрошевского. – М. : Изд-во РАМН, 1999. – 608 с. 72. Функциональное состояние эндотелия у больных артериальной гипертонией и ишемической болезнью сердца / Д. А. Затейщиков, Л. О. Минушкина, О. Н. Кудряшова [и др.] // Кардиология. – 2000. – Т. 40, № 6. – С. 14-17. 125 73. Шестакова, М. В. Дисфункция эндотелия – причина или следствие метаболического синдрома? / М. В. Шестакова // Рус. мед. журн. – 2001. – Т. 9, № 2. – С. 88-90. 74. Шилин, Д. Е. Кальций, Витамин D и формирование здорового скелета : учеб. пособие для врачей, клинич. ординаторов, интернов, студентов / Д. Е. Шилин. – М., 2008. – 60 с. 75. Шляхто, Е. В. Клеточные артериальной гипертензии / аспекты ремоделирования Е. В. Шляхто, О. М. Моисеева сосудов // при Артериал. гипертензия. – 2002. – Т. 8, № 2. – С. 45-49. 76. Эндотелиальная дисфункция и сердечная недостаточность: патогенетическая связь и возможности терапии ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента / Ф. Т. Агеев, А. Т. Овчинников, В. Ю. Мареев, Ю. Н. Беленков // Consilium medicum. –2001. – Т. 3, № 2. – С. 61-65. 77. Эффективность бивалоса (стронция ранелата) у больных Постменопаузальным остеопорозом, не принимающих добавки кальция и витамин D / Л. А. Марченкова, А. В. Древаль, И. В. Крюкова [и др.] // Проблемы эндокринологии. – 2010. – № 1. – С. 35-41. 78. Эффективность и переносимость лозартана и гизаара при лечении гипертонической болезни у пациентов с высоким риском осложнений / А. Я. Ивлева, О. К. Максименко, Е. Б. Сивкова [и др.] // Кардиология. – 2001. – Т. 41, № 1. – С. 34-38. 79. Эффекты центрального спонтанногипертензивных крыс эндотелина-1 / у нормотензивных Т. И. Пономарева, и О. Н. Хохлова, Е. А. Туховская, А. Н. Мурашев // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 2003. – № 3. – С. 275-278. 80. Юренева, С. В. Постменопаузальный остеопороз. Лечение и профилактика постменопаузального остеопороза / С. В. Юренева // Consilium Medicum. – 2004. – Т. 6, № 9. 126 81. Abnormal bone growth and selective translational regulation in basic fibroblast growth factor (FGF-2) transgenic mice / J. D. Coffin, R. Z. Florkiewicz, J. Neumann [et al.] // Mol. Biol. Cell. – 1995. – Vol. 6. – P. 1861-1873. 82. Abrahamsen, B. Excess mortality following hip fracture: a systematic epidemiological review / B. Abrahamsen // Osteoporos Int. – 2009. – Vol. 20, N 10. – P. 1633-1650. 83. Acceleration of fracture healing in nonhuman primates by fibroblast growth factor2 / H. Kawaguchi, K. Nakamura, Y. Tabata [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2001. – Vol. 86. – P. 875-880. 84. Acute intravenous L-arginine infusion decreases endothelin-1 levels and improves endothelial function in patients with angina pectoris and normal coronary arteriograms: Correlation with asymmetric dimethy-largininc / P. Piatti, G. Fragasso, L. D. Monti [et al.] // Circulation. – 2003. – Vol. 107. – P. 429-436. 85. Adachi, J. D. Impact of prevalent fractures on quality of life: baseline results from the global longitudinal study of osteoporosis in women / J. D. Adachi // Mayo Clin. Proc. – 2010. – Vol. 85, N 9. – P. 806-813. 86. Alderton W. K. Nitric oxide synthases:structure, function and inhibition / W. K. Alderton, C. E. Cooper, R. G. Knowles // Biochem. J. – 2001. – Vol. 357. – P. 593-615. 87. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis // Z. S. Al-Aql, A. S. Alagi, D. T. Graves, I. C. Gerstenfeld // J. Dent. Res. – 2008. – Vol. 87. – P. 107-118. 88. Mechanics and mechano-biology of fracture heaing in normal and osteoporotic bone / P. Augat, U. Simon, A. Liedert, L. Claes // Osteoporos. Int. – 2005. – Vol. 16, Suppl. 2. – P. S36-S43. 89. Healing of the musculoskeletal tissues / J. A. Backwalter, Т. А. Einhorn, M. E. Bolander, R. L. Cruess // Fractures in adults / ed. Heckman J. D. – 4th ed. – Philadelphia, NY : Lippincott-Raven; 1996. – P. 261-304. 127 90. Healing complications after internal fixation of trochanteric hip fractures: the prognostic values of osteoporosis / C. Barrios, L. A. Brostrom, A. Stark, G. Walheim // J. Orthop. Trauma. – 1993. – Vol. 7. – P. 438-442. 91. Basic fibroblast growth factor induces angiogenesis in vitro / R. Montesano, J. D. Vassalli, A. Baird [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1986. –Vol. 83. – P. 7297-7301. 92. Basic fibroblast growth factor stimulates osteoclast recruitment, development, and bone pit resorption in association with angiogenesis in vivo on the chick chorioallantoic membrane and activates isolated avian osteoclast resorption in vitro / P. Collin-Osdoby, L. Rothe, S. Bekker [et al.] // J. Bone Miner. Res. – 2002. – Vol. 17. – P. 1859-1871. 93. BMP signaling components are expressed in human fracture callus / P. Kloen, P. M. Di, O. Borens [et al.] // Bone. – 2003. – Vol. 33. – P. 362-371. 94. Is asymmetric dimethylarginine a novel marker of atherosclerosis? / R. H. Boger, S. M. Bode-Boger, H. Matsuoka [et al.] // Circulation. – 2000. – Vol. 101. – P. 160-161. 95. Bone endothelial cells as estrogen targets / M. L. Brandi, C. Crescioli, A. Tanini [et al.] // Calcif. Tissue Int. – 1993. – Vol. 53. – P. 312-317. 96. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor A / M. M. Deckers, R. L. van Bezooijen, G. van der Horst [et al.] // Endocrinology. – 2002. –Vol. 143. – P. 1545-1553. 97. Bone regeneration via a mineral substrate and induced angiogenesis / W. L. Murphy, C. A. Simmons, D. Kaigler, D. J. Mooney // J. Dent. Res. – 2004. – Vol. 83. – P. 204-210. 98. Bostrom, M. P. Transforming growth factor beta in fracture repair / M. P. Bostom, P. Asnis // Clin. Orthop. Relat. Res. – 1998. – Vol. 355. – P. 124-131. 99. Burge, R. Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States, 2005-2025 / R. Burge // J. Bone Miner. Res. – 2007. – Vol. 22, N 3. – Р. 465-75. 100. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease / P. Carmeliet // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 653-660. 128 101. Carmeliet, P. Molecular basis of angiogenesis. Role of VEGF and VE-cadherin / P. Carmeliet, D. Collen // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2000. – Vol. 902. – P. 249-262. 102. Carano, R. A. Angiogenesis and bone repair / R. A. Carano, E. H. Filvaroff // Drug Discov. Today. – 2003. – Vol. 8. – P. 980-989. 103. Center, J. R. Risk of subsequent fracture after low-trauma fracture in men and women / J. R. Center // JAMA. – 2007. – Vol. 297, N 4. – P. 387-394. 104. Changes in trabecular bone, hematopoiesis and bone marrow vessels in aplastic anemia, primary osteoporosis, and old age: a comparative histomorphometric study / R. Burkhardt, G. Kettner, W. Bohm [et al.] // Bone. – 1987. – Vol. 8. – P. 157-164. 105. Childs, S. G. Osteonecrosis: death of bone cells / S. G. Childs // Orthop. Nurs. – 2005. – Vol. 24. – P. 295-301 106. Clemens, T. L. Principles of bone biology / T. L. Clemens. – San Diego : Academic Press, 1996. – 605 p. 107. Clinical evaluation of medicinal products for acceleration of fracture healing in patients with osteoporosis / J. Goldhahn, W. H. Scheele, B. H. Mitlak [et al.] // Bone. – 2008. – Vol. 43. – P. 343-347. 108. Comparative study of ACE-Inhibition, angiotensin II antagonism, and calcium channel blockade on flow mediated vasodilatation in patients with coronary disease (BANFF Study) / T.J. Anderson, E. Elstein, H. Haber [еt al.] // Am. J. Cardiol. – 2000. – Vol. 35. – P. 60-66. 109. Cooke, J. P. A novel mechanism for pulmonary arterial hypertension? / J. P. Cooke // Circulation. – 2003. – Vol. 108. – P. 1420-1421. 110. Cooke, J. P. Flow, NO and atherogenesis / J. P. Cooke // Proc. Nat. Acad. Sci. – 2003. – Vol.100. – P. 768-770. 111. Coronary vasodilation and improvement in endothelial dysfunction with endothelin ETA receptor blockade / J. P. J. Halcox, K. R. A. Nour, G. Zalos [et al.] // Circ. Res. – 2001. – Vol. 89. – P. 969-976. 112. Coylewright, M. Menopause and Hypertension / M. Coylewright, J. F. Reckelhoff, P. Ouyang // Hypertension. – 2008. – Vol. 51. – P. 952-959. 129 113. Decreased bone anabolic effect of basic fibroblast growth factor at fatty marrow sites in ovariectomized rats / S. Pun, R. L. Dearden, A. M. Ratkus [et al.] // Bone. – 2001. – Vol. 28. – P. 220-226. 114. Disruption of the fibroblast growth factor-2 gene results in decreased bone mass and bone formation / A. Montero, Y. Okada, M. Tomita [et al.] // J. Clin. Invest. – 2000. – Vol. 105. – P. 1085-1093. 115. Ducy, P. Science / P. Ducy, Th. Schrimke, G. Karsenty // Science. – 2000 – Vol. 289. – P. 1501-1504. 116. Effect of alendronate on fracture healing and bone remodeling in dogs / C. Peter, W. Cook, D. Nunamaker [et al.] // J. Orthop. Res. – 1996. – Vol. 14. – P. 74-79. 117. Effect of arginine analogues on rat hind paw oedema and mast cell activation in vitro / C. M. Giraldelo, A. Zappellini, M. N. Muscara [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 1994. – Vol. 257. – P. 87-93. 118. Effect of human endothelial cells on human bone marrow stromal cell phenotype: role of VEGF? / F. Villars, L. Bordenave, R. Bareille, J. Amedee // J. Cell. Biochem. – 2000. – Vol. 79. – P. 672-685. 119. Effects of candesartan cilexetil and enalapril on structural alterations and endothelial function in small resistance arteries of spontaneously hypertensive rats / D. Rizzoni, E. Ported, G. Bettoni [et al.] // J. Cardiovasc. Pharmacol. – 1998. – Vol. 32. – P. 798-806. 120. Effects of FGF-2 on metaphyseal fracture repair in rabbit tibiae / W. J. Chen, S. Jingushi, I. Aoyama [et al.] // J. Bone Miner. Metab. – 2004. – Vol. 22. – P. 303-309. 121. Expression of vascular endothelial growth factors and their receptors during osteoblast differentiation / M. M. Deckers, M. Karperien, C. van der Bent [et al.] // Endocrinology. – 2000. – Vol. 141. – P. 1667-1674. 122. Feletou, M. Endothelial dysfunction: a multifaceted disorder / M. Feletou, P. M. Vanhoutte // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2006. – Vol. 21. – P.377-385. 123. Ferrara, N. The biology of VEGF and its receptors / N. Ferrara, H. P. Gerber, J. LeCouter // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 669-676. 130 124. Forstermann, U. Endothelial nitric oxide synthase in vascular disease: from marvel to menace / U. Forstermann, T. Munzel // Circulation. – 2006. – Vol. 113, N 13. – P. 1708-1714. 125. Fracture healing as a post-natal developmental process: molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation / I. C. Gerstenfeld, D. M. Cullinane, G. L. Barnes [et al.] // J. Cell Biochem. – 2003. – Vol. 88. – P. 873-884. 126. Frost, H. M. The biology of fracture healing. An overview for clinicians. Part I / H. M. Frost // Clin Orthop. – 1989. ––Vol. 248. – P.150-162. 127. Frost, H. M. The Microdamage (MDx) Connection // Frost H. M. The Utah Paradigm of Skeletal Physiology. – Athens, Greece ; ISMNI. – 2004. –Vol. 1, N 4. – P. 208-219. 128. Genant H. K. Interim report and recommendations of the World Health Organization Task-Force for Osteoporosis / H. R. Genant // Osteoporos Int. – 1999. – Vol. 10, N 4. – P. 259-264. 129. Glowacki, J. Angiogenesis in fracture repair / J. Glowacki // Clin. Orthop. Relat. Res. – 1998. – Vol. 355. – P. 82-89. 130. Growth factor regulation of fracture repair / G. L. Barnes, P. J. Kostenuik, L. C. Gerstenfeld, T. A. Einhorn // J. Bone Miner. Res. – 1999. – Vol. 14. – P. 18051815. 131. Hayashi, K. Three-dimensional organization of the cartilage canal-a scanning electron-microscopic study by vascular cast of the rabbit's femoral head / K. Hayashi // Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi. – 1992. – Vol. 66. – P. 548-559. 132. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction / D. G. Harrison // Clin. Invest. – 1997. – Vol. 2. – P. 2153-2157. 133. Heparanase mRNA expression during fracture repair in mice / M. Saijo, R. Kitazawa, M. Nakajima [et al.] // Histochem. Cell. Biol. – 2003. – Vol. 120. – P. 493-503. 134. Human bone marrow endothelial cells: a new identified source of B-type natriuretic peptide / L. Bordenave, A. Georges, R. Bareille [et al.] // Peptides. – 2002. – Vol. 23. – P. 935-940. 131 135. Hydroxy-methylglutarylconezyme A reductase inhibition promotes endothelial nitric oxide synthase activation through a decrease in caveolin abundance / O. Feron, C. Dessy, J. P. Desager [et al.] // Circulation. – 2001. – Vol. 103. – P. 113-118. 136. Hypoxia and VEGF up-regulate BMP-2 mRNA and protein expression in microvascular endothelial cells: implications for fracture healing / P. J. Bouletreau, S. M. Warren, J. A. Spector [et al.] // Plast. Reconstr. Surg. – 2002. – Vol. 109. – P. 2384-2397. 137. Imhof, B. A. Basic mechanism of leukocyte migration / B. A. Imhof, D. Dunon // Horm. Metab. Res. – 1997. – Vol. 29. – P. 614-621. 138. Impact of antihypertensive therapy on postmenopausal osteoporosis: effects of the angiotensin converting enzyme inhibitor moexipril, 17beta-estradiol and their combination on the ovariectomy-induced cancellous bone loss in young rats / M. Stimpel, W. S. Jee, Y. Ma [et al.] // J. Hypertens. – 1995. – Vol. 13. – P. 1852-1856. 139. Induction of growth plate cartilage ossification by basic fibroblast growth factor / J. Baron, K. O. Klein, J. A. Yanovski [et al.] // Endocrinology. – 1994. – Vol. 135. – P. 2790-2793. 140. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation / R. K. Jain // Nat. Med. – 2003. – Vol. 9. – P. 685-693. 141. Johnell, O. Epidemiology of osteoporotic fractures. /O. Johnell, J. Kanis // Osteoporos Int. – 2005. – Vol. 16, suppl. 2. – P. 3-7. 142. Kanczler, J. M. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone / J. M. Kanczler, R. O. C. Oreffo // Eur. Cell. Mater. – 2008. – Vol. 15. – P. 100-114. 143. Kanis, J. A. Diagnosis of osteoporosis and assessment of fracture risk. / J. A. Kanis. // Lancet. – 2002. – Vol. 359. – P. 1929-1936. 144. Konttimen, Y. Neuropeptides and the puzzle of bone remodeling. State of the art / Y. Konttimen, S. Imai, A. Suda // Acta Orthop. Scand. – 1996. – Vol. 67, N 6. – P. 632639. 145. Lazzarini, L. Long Bone Osteomyelitis / L. Lazzarini, F. De Lalla, J. T. Mader // Curr. Infect. Dis. Rep. – 2002. – Vol. 4. – P. 439-445. 132 146. Impaired nitric oxide synthase pathway in diabetes mellitus: role of asymmetric dimethylarginine dimethylaminohydrolase / K. Y. Lin, A. Ito, T. Asagami [et al.] // Circulation. – 2002. – Vol. 106. – P. 987-992. 147. Lusher, T. E. Biology of the endothelium / T. E. Lusher, M. Barton // Clin. Cardiol. – 1997. – Vol. 10. – P. 3-10. 148. Lyritis, G. P. Fracture healing and antiosteoporotic treatments / G. P. Lyritis // Medicographia. – 2010. – Vol. 32, N 1. – P. 79-85. 149. Long-term effect of incadronate disodium (YM-175) on fracture healing of femoral shaft in growing rats / J. Li, S. Mori, Y. Kaji [et al.] // J. Bone Miner. Res. – 2001. – Vol. 16. – P. 429-436. 150. Madeddu, P. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration / P. Madeddu // Exp. Physiol. – 2005. – Vol. 90. – P. 315-326. 151. Maintenance of the hematopoietic stem cell pool by CXCL12-CXCR4 chemokine signaling in bone marrow stromal cell niches / T. Sugiyama, H. Kohara, M. Noda, T. Nagasawa // Immunity. – 2006. – Vol. 25. – P. 977-988 152. Management of osteoporosis in postmenopausal women: 2010 position statement of the North American Menopause Society // Menopause. – 2010. – Vol. 17, N 1. – P. 25-54. 153. Mandracchia, V. J. Current concepts of bone healing / V. J. Mandracchia, S. C. Nelson, E. A. Barp // Clin. Podiatr. Med. Surg. – 2001. – Vol. 18. – P. 55-77. 154. Marotti, G. Changes in the vascular network during the formation of Haversian systems / G. Marotti, A. Z. Zallone // Acta. Anat. (Basel). – 1980. – Vol. 106. – P. 84100. 155. Maxwell, A. J. Cardiovascular effects of L-arginine / A. J. Maxwell, J. P. Cooke // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. – I998. – Vol. 7. – P. 63-70. 156. Mehta, C. R. Exact significance testing to establish treatment equivalence equivalence with ordered categorical data / C.R. A.A. Tsiatis // Biometrics. – 1984. – Vol. 40, № 3. – P. 819-825. Mehta, N.R. Patel, 133 157. Meury, T. Human endothelial cells inhibit BMSC differentiation into mature osteoblasts in vitro by interfering with osterix expression / T. Meury, S. Verrier, M. Alini // J. Cell. Biochem. – 2006. – Vol. 98. – P. 992-1006. 158. Meyer R. A. Age and ovariectomy impair both the normalization of mechanical properties and the accretion of mineral by the fracture callus in rats. / R. A. Meyer, P. J. Tsahakis, D. F. Martin [et al.] // J. Orthop Res. – 2001. – Vol. 19. – P. 428-435. 159. Midy, V. Vasculotropin/vascular endothelial growth factor induces differentiation in cultured osteoblasts / V. Midy, J. Plouet // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1994. – Vol. 199. – P. 380-386. 160. Miller, V. M. Ageing, oestrogen, platelets and thrombotic risk / V. M. Miller, M. Jayachandran, W. G. Owen // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2007. – Vol. 34. – P. 814-821. 161. Minkin, M. J. Clinical application of antialdosterone-containing hormone therapy for postmenopausal women / J. M. Minkin // J. Reprod. Med. – 2007. – Vol. 52. – P. 165-168. 162. Napoli, C. Nitric oxide and atherosclerosis / C. Napoli, L. J. Ignarro // Nitric Oxide. – 2001. – Vol. 5. – P. 88-97. 163. Nieminen, S. Healing of femoral neck fractures; influence of fracture reduction and age / S. Nieminen, M. Nurmi, K. Satokari // Ann Chir. Gynaecol. – 1981. – Vol. 70. – P. 26-31. 164. Nikolova, G. The vascular niche and its basement membrane / G. Nikolova, B. Strilic, E. Lammert // Trends. Cell. Biol. – 2006. – Vol. 17. – P. 19-25. 165. Nitric oxide as a signaling molecule in the vascular system: an overview / L. J. Ignarro, G. Clrino, A. Casini, C. Napoli // J. Cardiolvasc. Pharmacol. – 1999. – Vol. 34. – P.879-886. 166. Novel angiotensin II AT(1) receptor antagonist irbesartan prevents thromboxane A(2)induced vasoconstriction in canine coronary arteries and human platelet aggregation / P. Li, M. Fukuhara, D. I. Diz [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 2000. – Vol. 292. – P. 238-246. 167. Biochemical markers of bone turnover are influenced by recently sustained 134 fracture / K. J. Obrant, K. K. Ivaska, P. Gerdhem [et al.] // Bone. – 2005. – Vol. 36. – P. 786-792. 168. Pacher, P. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease / P. Pacher, J. S. Beckman, L. Liaudet // Physiol. Rev. – 2007. – Vol. 87. – P. 315-424. 169. Palmer, R. M. J. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor / R. M. J. Palmer, A. G. Ferringe, S. Moncada // Nature. – 1987. – Vol. 327. – P. 524-526. 170. Parfitt, A. M. The mechanism of coupling: a role for the vasculature / A. M. Parfitt // Bone. – 2000. – Vol. 26. – P. 319-323. 171. Pravastatin has cholesterol-lowering independent effects on the artery wall of atherosclerotic monkeys / J. K. Williams, G. K. Sukhova, D. M. Herrmgton [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 1998. – Vol. 31. – P. 684-691. 172. Preclinical safety evaluation of rhuMAbVEGF, an antiangiogenic humanized monoclonal antibody / A. M. Ryan, D. B. Eppler, K. E. Hagler [et al.] // Toxicol. Pathol. – 1999. – Vol. 27. – P. 78-86. 173. Prevention of first stroke. A review of guidelines and a multidisciplinary consensus statement from the National Stroke Assotiation / P. B. Gorelick, R. L. Sacco, D. B. Smith [et al.] // JAMA. – 1999. – Vol. 31. – P. 1112-1120. 174. Ramipril prevents endothelial dysfunction induced by oxidized low-density lipoproteins: a bradykinin-dependent mechanism / G. Berkenboom, I. Langer, Y. Carpentier [et al.] // Hypertension. – 1997. – Vol. 30, N 3, Pt. 1. – P. 371-376. 175. Resveratrol increases vascular oxidative stress resistance / Z. Ungvari, Z. Orosz, A. Rivera [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. – 2007. – Vol. 292. – P. 24172424. 176. Rhinelander, F. W. Tibial blood supply in relation to fracture healing / F. W. Rhinelander // Clin. Orthop. Relat. Res. – 1974. – Vol. 105. – P. 34-81. 177. Role of bone morphogenetic protein 2 in the crosstalk between endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells / M. Raida, A. C. Heymann, C. Gunther, D. Niederwieser // Int. J. Mol. Med. – 2006. – Vol. 18. – P. 735-739. 178. Role of vascular factors in osteoporosis / K. Alagiakrishnan, A. Juby, D. Hanley 135 [et al.] // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. – 2003. – Vol. 58. – P. 362-366. 179. Rossant, J. Signaling pathways in vascular development / J. Rossant, L. Howard // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. – 2002. – Vol. 18. – P. 541-573. 180. Schultz, E. Uber das arginin / E. Schultz, E. Steuger // Z. Physiol. Chem. – 1886. – Vol. 11. – P. 43-65. 181. Selective secretion of chemoattractants for haemopoietic progenitor cells by bone marrow endothelial cells: a possible role in homing of haemopoietic progenitor cells to bone marrow / K. Imai, M. Kobayashi, J. Wang [et al.] // Br. J. Haematol. – 1999. – Vol. 106. – P. 905-911. 182. Streeten, E. A. Biology of bone endothelial cells / E. A. Streeten, M. L. Brandi // Bone Miner. – 1990. – Vol. 10. – P. 85-94. 183. Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell-expressed VEGF and bone morphogenetic protein-4 / H. Peng, V. Wright, Usas [et al.] // J. Clin. Invest. – 2002. – Vol. 110. – P. 751-759. 184. The HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin activates the protein kinase Akt and promotes angiogenesis in normocholesterolemic animals / Y. Kureishi, Z. Luo, I. Shiojima [et al.] // Nat. Med. – 2000. – Vol. 6. – P. 1004-1010. 185. The role of cartilage canals in the formation of secondary centres of ossification / J. H. Kugler, A. Tomlinson, A. Wagstaff, S. M. Ward // J. Anat. – 1979. – Vol. 129. – P. 493-506. 186. The splice variants VEGF 121 and VEGF 189 of the angiogenic peptide vascular endothelial growth factor are expressed in osteoarthritic cartilage / T. Pufe, W. Petersen, B. Tillmann, R. Mentlein // Arthritis Rheum. – 2001. – Vol. 44. – P. 1082-1088. 187. The vascular supply of the chondro-epiphyses of the elbow joint in young swine / D. M. Visco, S. Van, M. A. Hill, S. A. Kincaid // J. Anat. – 1989. – Vol. 163. – P. 215229. 188. The vascular effects of L-Arginine in humans. The role of endogenous insulin / D. Giugliano, R. Marfella, G. Verazzo [et al.] // J. Clin. Invest. – 1997. – Vol. 99. – P. 433-438. 136 189. Thompson, L. P. Chronic hypoxia decreases endothelial nitric oxide synthease protein expression in fetal guinea pig hearts / L. P. Thompson, Y. Dong // Reprod. Sci. – 2005. – Vol. 12, N 6. – P. 388-395. 190. Use of a bisphosphonate (pamidronate) to modulate fracture repair in ovine bone / A. Goodship, P. Walker, D. McNally [et. al.] // Ann. Oncol. – 1994. –Vol. 5, supp. l7. – P. 553-555. 191. Vascular endothelial growth factor is expressed along with its receptors during the healing process of bone and bone marrow after drill-hole injury in rats / S. Uchida, A. Sakai, H. Kudo [et al.] // Bone. – 2003. – Vol. 32. – P. 491-501. 192. Vascular endothelial growth factor stimulates bone repair by promoting angiogenesis and bone turnover / J. Street, M. Bao, L. deGuzman [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 2002. – Vol. 99. – P. 9656-9661. 193. Vascularisation and osteochondrosis of the epiphyseal growth cartilage of the distal femur in pigs-development with age, growth rate, weight and joint shape / B. Ytrehus, C. S. Carlson, N. Lundeheim [et al.] // Bone. – 2004. – Vol. 34. – P. 454465. 194. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation / G. D. Yancopoulos, S. Davis, N. W. Gale [et al.] // Nature. – 2000. – Vol. 407. – P. 242-248. 195. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation / H. P. Gerber, T. H. Vu, A. M. Ryan [et al.] // Nat. Med. – 1999. – Vol. 5. – P. 623-628. 196. VEGF improves, whereas sFlt1 inhibits, BMP2-induced bone formation and bone healing through modulation of angiogenesis / H. Peng, A. Usas, A. Olshanski [et al.] // J. Bone. Miner. Res. – 2005. – Vol. 20. – P. 2017-2027. 197. Walsh, D.A. Joint physiology and synovial cell proliferation / D. A. Walsh, P. I. Mapp // Br. J. Rheumatol. – 1998. – Vol. 37. – P. 1032-1033. 198. Systemic corticosteroids inhibit bone healing in a rabbit ulnar osteotomymodel. / R. V. Waters, S. C. Gamradt, P. Asnis [et al]. // Acta Orthop. Scand. – 2000. – Vol. 71. – P. 316-321. 137 199. Wu, G. Arginine metabolism: nitric oxide and beyond / G. Wu, S. M. Morris // Biochem. J. – 1998. – Vol. 336. – P. 1-17.
