Полный текст диссертации - Институт биологии гена РАН
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской Академии Наук На правах рукописи УДК Шелудченков Антон Александрович Исследование механизма цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки специальность 03.01.03 - молекулярная биология Диссертация на соискание учѐной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Д.б.н., профессор Л.П. Сащенко Москва-2014 2 Оглавление СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................................ 4 ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................ 6 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................................................... 8 1.1. Пути клеточной смерти ................................................................................................................ 8 1.1.1. Апоптоз..................................................................................................................................... 8 1.1.2. Некроз: нерегулируемый и программируемый .................................................................. 22 1.1.3. Аутофаговая клеточная смерть ........................................................................................ 29 1.1.4. Другие типы клеточной смерти ........................................................................................ 30 1.1.5. Участие лизосом в механизмах клеточной смерти ....................................................... 32 1.2. Основные лиганды и рецепторы запуска запрограммированной клеточной смерти... 36 1.2.1. Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти ..................................... 36 1.2.2. Общие сигнальные процессы, запускаемые рецепторами смерти ............................... 39 1.2.3. Рецептор TNF-R1 и его лиганд TNF-α ............................................................................... 43 1.2.4. Рецептор Fas и его лиганд FasL.......................................................................................... 49 1.2.5. Рецепторы TRAIL-R и лиганд TRAIL ................................................................................ 50 1.3. Белок Tag7 как представитель семейства PGLYRP ............................................................ 52 1.4. Цитотоксический белковый комплекс Tag7-Hsp70 ............................................................. 54 1.5. Белок-шаперон Hsp70 ................................................................................................................. 55 1.6. Белок HspBP1 – кошаперон Hsp70 ........................................................................................... 60 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .............................................................................................62 2.1. Влияние белка HspBP1 на цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7Hsp70. .................................................................................................................................................... 62 2.2. Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70. .......................... 68 2.3. Выявление рецептора на поверхности клеток L-929, способного взаимодействовать с комплексом Tag7-Hsp70. ................................................................................................................ 79 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................................................87 3.1. Белки, ферменты и реактивы. .................................................................................................. 87 3.2. Получение и очистка белков ..................................................................................................... 87 3 3.3. Получение белковых комплексов. ....................................................................................... 92 3.5. Мечение биотином .................................................................................................................. 94 3.6. Культивирование клеточных линий, использованных в работе. ................................. 95 3.7. Получение отдельных клонов клеток L-929. ..................................................................... 95 3.8. Аффинная хроматография. ................................................................................................... 96 3.9. Элетрофорез и вестерн-блоттинг.......................................................................................... 97 3.11. Иммуноферментный анализ (ИФА) .................................................................................. 100 3.12. Выделение мембранного рецептора................................................................................... 101 3.13. Определение цитотоксической активности. .................................................................... 102 3.14. Микроскопия.......................................................................................................................... 103 ВЫВОДЫ. ......................................................................................................................................... 105 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................. 106 БЛАГОДАРНОСТИ. ....................................................................................................................... 120 4 Список сокращений CAD – каспазо-активируемая ДНКаза (caspase activated DNAse) DISC – индуцирующий смерть сигнальный комплекс (death-inducing signaling complex) FADD – Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (Fas-associated protein with death domain) HLA – человеческий лейкоцитарный антиген (human leucocyte antigen) Hsp70/HSP70-1A – белок теплового шока молекулярной массой 70 кДа (heat shock protein 70 kDa) HspBP1 – Hsp70-связывающий белок 1 (Hsp70 binding protein 1) ICAD – ингибитор каспазо-активируемой ДНКазы (inhibitor of caspase activated DNAse) JNKs – c-Jun-N-терминальные киназы (c-Jun N-terminal kinases) LMP – пермеабилизация лизосомальной мембраны (lysosomal membrane permeabilization) MOMP – пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны (mitochondrial outer membrane permeabilization) NCCD – Комитет по номенклатуре клеточной смерти (Nomenclature Committee on Cell Death) NEF – фактор обмена нуклеотидов (nucleotide-exchange factor) PARP – поли(АДФ-рибоза)-полимераза (poly(ADP-ribose) polymerase) PGRP/PGLYRP – пептидогликан распознающий белок (peptidoglycan recognition protein) SDS – додецил сульфата натрия (sodium dodecil sulfate) TRADD – TNFR-ассоциированный белок с доменом смерти (TNFR-associated death domain protein) TNF – фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor) TNFR – рецептор к фактору некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor) TRAIL – апоптоз-индуцирующий лиганд семейства TNF (TNF-related apoptosisinducing ligand) TRAILR – рецептор к апоптоз-индуцирующему лиганду семейства TNF (TNFrelated apoptosis-inducing ligand receptor) 5 TUNEL – терминальное TdT-опосредованное мечение концов ДНК (terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick end labeling) XIAP – связанный с X-хромосомой белок-ингибитор апоптоза (X-linked inhibitor of apoptosis protein) ЛАК – лимфокин-активированные киллерные клетки 6 Введение Баланс между клеточным делением и клеточной смертью играет важную роль в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов. При этом нарушения в любом из этих процессов могут иметь патологические последствия для организма, вызывая нарушения эмбриогенеза, нейродегенеративные заболевания или же возникновение и развитие опухолей. Именно поэтому критически важную роль играют механизмы регуляции клеточного цикла и, в частности, механизмы запуска программы клеточной смерти. В настоящее время вызывает несомненный интерес исследование регуляции процессов, запускаемых под действием цитотоксических белков в клетках. Охарактеризовано множество цитотоксических белковых факторов, секретируемых клетками иммунной системы и способных запускать программу клеточной смерти, взаимодействуя с рецептором на поверхности клетки. В число этих факторов входят TNF-α, FasL, TRAIL и другие. Описаны случаи, когда стимуляция одного и того же рецептора может, в зависимости от физиологического состояния клетки, приводить к запуску двух альтернативных программ клеточной смерти: апоптоза и некроптоза. Такая ситуация, в частности, имеет место для рецептора TNFR1: стимуляция лигандом TNF-α может приводить как к запуску апоптоза, так и некроптоза. При этом продолжают обнаруживаться всѐ новые цитотоксические факторы, а также новые регуляторные белки. Регуляция механизма цитотоксического действия важна для предотвращения неконтролируемого уничтожения клеток, при этом белки-регуляторы могут проявлять функциональную активность, конкурентно связываясь с цитотоксическим фактором или с рецептором, препятствуя запуску цитотоксического сигнала. В лаборатории «Молекулярной иммуногенетики рака» было показано, что Tag7/PGLYRP1, представляющий собой пептидогликан-распознающий белок, и главный белок теплового шока, шаперон Hsp70/Hsp70-1A, способны взаимодействовать с формированием устойчивого белкового комплекса Tag7Hsp70 – нового цитотоксического агента, проявляющего активность в отношении опухолевых клеток различных линий. Было также показано, что этот же самый 7 комплекс способны секретировать лимфокин-активированные киллерные клетки CD8+–типа, культивируемые в отсутствии клеток-мишеней. Кроме того, было установлено, что в роли белков-регуляторов цитотоксического действия Tag7Hsp70 могут выступать Ca2+-связывающий белок метастазин-1 (Mts1/S100A4), способный взаимодействовать как с Tag7, так и с Hsp70, препятствуя формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70, а также ингибитор АТФазной активности Hsp70, его кошаперон HspBP1. При этом оставались невыясненными механизмы запуска цитотоксических процессов в клеткахмишенях под действием Tag7-Hsp70, а также механизмы самих процессов. Исследование механизма действия новых цитотоксических агентов, как и поиск новых белков-регуляторов их активности, представляют значительный интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Цель настоящей работы состояла в расширении представления о механизмах регуляции цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и выяснении механизмов цитотоксических процессов, запускаемых под действием Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 1) изучить взаимодействие внеклеточного HspBP1 с Tag7 в кондиционной среде опухолевых клеток линии CSML-0 и в сыворотке крови человека; 2) охарактеризовать цитотоксические процессы, индуцируемые комплексом Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках; 3) выявить рецептор на поверхности опухолевых клеток, участвующий в индукции цитотоксических процессов под действием Tag7-Hsp70. 8 1. Обзор литературы 1.1. Пути клеточной смерти Одна из первых попыток дать классификацию клеточной смерти была предпринята в 1973 году: на основе данных, полученных при обработке крысиных эмбрионов токсинами, было описано 3 типа клеточной смерти: тип I, ассоциированный с гетерофагией; тип II, ассоциированный с аутофагией, и тип III, который не был ассоциирован с перевариванием продуктов клеточной деградации (Schweichel and Merker, 1973). В современной терминологии эти типы клеточной смерти соответствуют апоптозу, аутофагии и некрозу. Помимо этих трѐх, ставших классическими, типов клеточной смерти в настоящее время охарактеризовано также много других. Более подробно каждый из трѐх этих типов, а также некоторые другие типы клеточной смерти рассмотрены ниже. 1.1.1. Апоптоз Апоптоз (от греч. «από» – отделение и «πτωσις» – падение) – это процесс запрограммированного уничтожения клетки, вызванный внутренними или внешними физиологическими и патологическими факторами, активирующими генетическую программу гибели клетки и ее удаления из ткани. Термин «апоптоз» происходит от греческого слова «απόπτωσις», обозначающего «опадение лепестков цветка» и «опадение листвы с дерева осенью». Действительно, в процессе старения в листьях растений обнаруживается фрагментация ДНК, характерная для апоптоза, которая не обнаруживается в зелѐных листьях (Cheng-Hung and Chang-Hsien, 1998). Характерными признаками апоптотической клетки являются изменения морфологии ядра, включающие конденсацию ядерного хроматина (кариопикноз) и его фрагментацию (кариорексис), межнуклеосомальные разрывы ДНК, сморщивание и пузырчатая морфология плазматической мембраны, уменьшение клетки в объѐме и еѐ последующая фрагментация на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым, так называемые апоптотические тельца, фагоцитируемые макрофагами и клетками-соседями, в которых они утилизируются при участии 9 лизосом. Характерным признаком апоптотической клетки является также транслокация остатков фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю сторону плазматической мембраны, что служит сигналом для привлечения фагоцитов. Макрофаги выделяют особый гликопротеин MFG-E8, который специфически связывается с фосфатидилсерином на поверхности апоптотических клеток, служа меткой для узнавания и фагоцитоза макрофагами этих клеток (Hanayama et al., 2002). Весь процесс от инициации апоптоза до элиминации апоптотических клеток обладает высокой кинетикой и протекает в течение 1-3 ч (Gavrieli et al., 1992). Апоптоз наблюдается у всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и вплоть до высших организмов. Одной из основных функций апоптоза является уничтожение дефектных (повреждѐнных, мутантных, инфицированных) клеток. На основе генетического анализа, проведѐнного для нематоды Caenorhabditis elegans, была также установлена ключевая роль апоптоза в регуляции клеточной смерти в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов (Ellis and Horvitz, 1986; Metzstein et al., 1998). Апоптоз играет также важную роль в обеспечении развития и функционирования иммунной системы. В клетках позвоночных апоптоз обычно протекает по одному из двух сигнальных каскадов, один из которых запускается при стимуляции рецепторов клеточной поверхности (рецепторный путь), а другой запускается внутриклеточно, при участии митохондрии (митохондриальный путь). В обоих случаях в осуществлении программы апоптоза ключевую роль играют каспазы (за исключением случаев каспазо-независимого апоптоза, которые также рассмотрены ниже). Каспазы (семейство Cys-Asp-протеаз) принадлежат семейству эволюционно консервативных протеаз – ферментов, катализирующих ограниченное расщепление клеточных белков. Слово каспаза произошло от англ. caspase, где буква c соответствует цистеину (cysteine), корень asp – аспартату (aspartate), ase – суффиксу в названиях ферментов. В активном центре каспаз находится остаток цистеина, при этом каспазы узнают тетрапептидные мотивы белков вида X-X-XAsp (X соответствует произвольной аминокислоте) и расщепляют пептидную 10 связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты, отщепляя тетрапептидные мотивы. В настоящее время насчитывают не менее 15 видов каспаз, пронумерованных в порядке их открытия ( Eckhart et al., 2005). Из них в человеческом организме экспрессируются каспазы 1-10, 12 и 14, причѐм каспаза 12 в большинстве человеческих популяций экспрессируется в нефунк циональной укороченной форме (Saleh et al., 2004). В апоптозе, индуцированном цитотоксическим фактором гранзимом B или лигандами TNF-α, FasL или TRAIL, принадлежащими семейству TNF (фактора некроза опухоли), участвуют каспазы 2, 3 и 6-10. Остальные каспазы выполняют иные функции, не связанные с запуском клеточной смерти: каспазы 1, 4 и 5 принимают участие в активации противовоспалительных цитокинов (Martinon and Tschopp, 2004), а прокаспаза 14 активируется при созревании кератиноцитов эпидермиса ( Lippens et al., 2000; Eckhart et al., 2000). Каспазы, принимающие участие в осуществлении программы апоптоза, подразделяют на две группы: инициаторные (каспазы 2, 8, 9 и 10) и эффекторные (каспазы 3, 6 и 7). Инициаторные каспазы присутствуют в клетке в форме неактивных проферментов – прокаспаз (32-56 кДа), представляющих собой мономеры, состоящие из N-концевого продомена, большой (17-21 кДа) и малой (10-13 кДа) субъединиц и коротких связующих областей (Earnshaw et al., 1999). При активации инициаторных каспаз происходит димеризация мономерных прокаспаз, после чего N-концевой продомен и связующие области в составе каждого из мономеров расщепляются, при этом большая и малая субъединицы формируют гетеродимеры (Рис. 1) (Liang and Fesik, 1997). Активная каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух таких гетеродимеров (Kohler et al., 2002). Этот сформированной тетрамер структурно двенадцатью β-листами, состоит из которую центральной окружают части, α-спирали (MacKenzie and Clark, 2012). На примере инициаторных каспазы 8 и каспазы 9 показано, что димеризация прокаспаз является ключевым событием в их активации, после которого происходит ограниченный протеолиз, способствующий стабилизации димеров (Boatright et al., 2003). В случае каспазы- 11 9 ограниченный протеолиз выполняет скорее регуляторную, чем активирующую, роль в каспазной активности (Malladi et al., 2009). Субстратная специфичность инициаторных каспаз ограничивается инициаторными, эффекторными каспазами, а также проапоптотическим белком Bid. Механизм активации эффекторных каспаз отличается от механизма активации инициаторных каспаз. Эффекторные каспазы 3, 6 и 7 присутствуют в клетке в форме стабильных, но неактивных димеров. Эти димерные прокаспазы не обладают активностью, поскольку активные сайты находятся в таком расположении относительно друг друга, которое препятствует эффективному катализу. В результате протеолитической активации происходит расщепление межсубъединичного линкера, что позволяет активным сайтам перестроиться, приняв расположение, обеспечивающее ферментативную активность (MacKenzie and Clark, 2012). Активация эффекторных каспаз в клетке приводит к расщеплению множества белков, необходимых для поддержания жизнеспособности клетки. При этом каспаза-3 вызывает активацию ДНКазы CAD за счѐт протеолитической деградации еѐ специфичного ингибитора ICAD. CAD присутствует в клетке в виде комплекса CAD-ICAD. В результате расщепления ICAD ДНКаза CAD выходит из неактивного комплекса CAD-ICAD и вызывает межнуклеосомальное расщепление ядерной ДНК на короткие фрагменты (Enari et al., 1998). Число нуклеотидов в этих фрагментах кратно числу нуклеотидов, соответствующему одной нуклеосоме. Как уже отмечалось выше, каспазы расщепляют по остатку Asp, узнавая тетрапептидный мотив X-X-X-Asp с аспарагиновой кислотой в положении P1. По субстратной специфичности каспазы можно разделить на 3 группы, при этом для каждой из групп характерны определѐнные аминокислоты в положении P4 узнаваемого тетрапептидного мотива: для группы I, включающей провоспалительные каспазы (1, 4, 5, 11, 12), предпочтение отдаѐтся крупным ароматическим аминокислотным остаткам; для группы II, включающей эффекторные каспазы 3 и 7, а также каспазу 2, критически важен аминокислотный остаток Asp в положении P4; для группы III, включающей инициаторные каспазы 12 8, 9 и 10 и каспазу 6, предпочтительны аминокислотные остатки с большими алифатическими боковыми цепями (Thornberry et al., 1997; Rozman-Pungercar et al., 2003). Были также установлены наиболее характерные тетрапептидные мотивы, узнаваемые каспазами различных групп: каспазы 1, 4, 5 и 14 лучше всего распознают тетрапептидный аминокислотный мотив Trp-Glu-His-Asp; каспазы 2, 3 и 7 – мотив Asp-Glu-X-Asp; каспазы 6, 8, 9 и 10 наиболее специфичны в отношении мотива (Leu/Val)-Glu-X-Asp (Thornberry et al., 1997; MacKenzie and Clark, 2012). Таким образом, обеспечивается специфичность каспаз в отношении узнаваемых и расщепляемых субстратов. Рис. 1. Классификация, строение и процесс активации каспаз двух типов: инициаторной и эффекторной. Рисунок адаптирован из статьи (Tait and Green, 2010). Детекцию апоптотических клеток часто определяют по деградации ДНК на фрагменты, размеры которых кратны размеру ДНК, приходящемуся на одну нуклеосому. Фрагменты ДНК обнаруживаются на электрофорезе в виде характерной «лесенки». Для детекции апоптоза in situ широко используется TUNEL-метод, позволяющий детектировать апоптоз на уровне одной клетки, 13 сохраняя неповреждѐнной еѐ архитектуру (Gavrieli et al., 1992). Этот метод основан на способности фермента терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (TdT) связываться со свободным 3’-OH концом ДНК, катализируя реакцию присоединения дезоксинуклеозид-трифосфатов с образованием цепочки ДНК с экспонированными 3’-гидроксильными концами. В качестве субстрата может выступать как одноцепочечная, так и двуцепочечная цепь ДНК. Использование дезоксиуридин-трифосфата одновременно с экспонированным стрептавидина) 3’-OH, с использование позволяет TdT детектировать используя окраску пероксидазой. dUTP, (dUTP), с биотином, фрагменты конъюгатом Альтернативным конъюгированного меченного ДНК авидина вариантом флуоресцентной с (или является меткой, с последующей детекцией при помощи световой микроскопии. Для устранения влияния конденсации хроматина, белкового окружения на доступ TdT к ДНК и с целью повышения чувствительности метода TUNEL проводится предварительная обработка образца ДНК детергентами, протеазами или воздействием микроволн (Negoescu et al., 1996; Negoescu et al., 1998). На детекции фосфатидилсерина, экспонированного на поверхности апоптотических клеток, основан метод по подсчѐту количества апоптотических клеток при помощи проточной цитометрии с использованием конъюгата аннексин V-FITC в качестве детектирующего агента (Vermes et al., 1995). Аннексин V представляет собой Ca2+-зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладающий высокой аффинностью к фосфатидилсеринам и очень низкой – к другим фосфолипидам: фосфатидилэтаноламину, сфингомиелину и фосфатидилхолину. Поскольку фосфатидилсерин экспонируется на внешней стороне мембраны как при апоптозе, так и при некрозе, используется комбинированное окрашивание конъюгатом аннексин V-FITC и пропидиум иодидом: в результате живые клетки оказываются неокрашенными, апоптотические окрашиваются только аннексином V-FITC, а некротические, целостность мембран которых нарушена – и аннексином V-FITC, и пропидиум иодидом (Vermes et al., 1995). 14 Исследования на клетках прокариот обнаружили, что при адаптации к стрессорным условиям в них протекают процессы, схожие с апоптозом в эукариотах: фрагментация ДНК, уменьшение объѐма клетки, протеолиз и синтез новых белков, а также накопление АФК (Hochman, 1997). Кроме того, у бактерии Streptomyces spp. были обнаружены гомологи каспаз, ключевых протеаз, участвующих в осуществлении апоптоза, однако их роль в осуществлении запрограммированной клеточной смерти в прокариотах до конца не установлена (Гордеева и др., 2004). Как уже отмечалось выше, апоптоз может запускаться по одному из двух сигнальных путей: рецепторному или митохондриальному. Остановимся подробнее на каждом из них. Апоптоз, запускаемый через активацию рецепторов клеточной поверхности. Клеточная смерть по механизму апоптоза может запускаться при стимуляции рецептора клеточной поверхности. В случае запуска через рецептор апоптоз всегда протекает при участии каспаз, при этом известны 3 ключевых сигнальных пути: 1) стимуляция рецептора смерти (death receptor) приводит к активации инициаторной каспазы-8 (или, в некоторых случаях, каспазы-10), которая непосредственно активирует эффекторную каспазу 3, участвующую в каскаде реакций апоптоза; 2) стимуляция рецептора смерти приводит к активации инициаторной каспазы8 (или каспазы-10), которая путѐм протеолиза активирует белок BID, вызывающий проницаемость митохондриальной мембраны, выход цитохрома C и формирование апоптосомы, вызывающей активацию инициаторной каспазы 9, активирующей эффекторную каспазу 3; 3) стимуляция рецептора зависимости (dependence receptor), вызванная снижением концентрации его лигандов, приводит к активации каспазы 9 (либо напрямую, либо вызывая пермеабилизацию внешней мембраны), активирующей каспазу 3 (Galluzzi et al., 2012). митохондриальной 15 В первых двух случаях рецепторного пути сигнал к апоптозу передаѐтся в клетку за счѐт связывания лигандов, таких как FasL/CD95L, TNFα, TRAIL/TNFSF10, с соответствующими рецепторами смерти на поверхности клетки: Fas/CD95, TNFR1, TRAILR1-2, соответственно. Лигирование рецептора смерти привлекает особые адапторные молекулы, которые способны связываться с инициаторной каспазой-8, приводя к еѐ димеризации и активации (Guicciardi and Gores, 2009). Активированная каспаза-8 способна активировать эффекторные каспазы, каспазу-3 и каспазу-7. При этом в так называемых клетках I типа (например, лимфоцитах) активации эффекторных каспаз за счѐт каспазы-8 уже достаточно для запуска апоптоза, который протекает без участия митохондрии (Barnhart et al., 2003; Scaffidi et al., 1998). В клетках же II типа (например, гепатоцитах печени и β-клетках поджелудочной железы) проницаемость митохондриальной мембраны является ключевым событием для осуществления сигнального пути апоптоза, запущенного лигированием рецептора смерти: активированная каспаза-8 вызывает активацию путѐм ограниченного протеолиза белка BID, который в форме tBID вызывает проницаемость митохондриальной мембраны (Barnhart et al., 2003; Scaffidi et al., 1998). Каспаза 10, представляющая собой близкого гомолога каспазы 8, также может активироваться после стимуляции рецепторов TRAIL и Fas при участии адаптерной молекулы FADD (Sprick et al., 2002). При этом показано, что каспаза 10 может участвовать в осуществлении клеточной смерти, запускаемой при лигировании FasL, в присутствии ингибитора каспаз широкого спектра действия zVAD-fmk, а также в клетках Jurkat I9-2d, не экспрессирующих каспазу 8 (Lafont et al., 2010). В третьем случае сигнал к запуску клеточной смерти передаѐтся в клетку другим типом рецепторов, получивших название рецепторов зависимости (dependence receptors). Эти рецепторы не похожи по структуре, но похожи функционально: когда концентрация их лигандов достаточна, они принимают участие в сигнальных путях, обеспечивающих выживаемость, миграцию и дифференцировку клеток. В случае, если концентрация их специфичных лигандов падает ниже критической пороговой величины, рецепторы активируются, 16 запуская сигнал к апоптозу. Каспазный каскад в этом случае протекает при участии инициаторной каспазы 9, активирующей эффекторную каспазу 3. В настоящее время обнаружено 17 таких рецепторов, в число которых входят нетриновые рецепторы прототипа Net-1 DCC и UNC5H, а также неогенин, RET, TrkC, ALK, эфрин А4, Patched, MET, белок-предшественник бета-амилоида (βamyloid precursor protein/APP), p75NTR, андрогеновый рецептор и некоторые интегрины (Mehlen and Bredesen, 2011). Рецепторы зависимости играют важную роль в осуществлении развития организма, онкогенеза, а также в нейродегенеративных процессах. В частности, интегрины, представляющие собой большое семейство гетеродимерных мембранных белков, входящих в состав внеклеточного матрикса и связывающих внутриклеточный цитоскелет с лигандами внеклеточного матрикса, запускают сигнал к апоптозу при нарушении адгезии клеток, препятствуя возникновению метастаз и прогрессированию опухоли (Felding-Habermann, 2003; Ganguly et al., 2013). Такое явление запуска апоптоза в адгезионных клетках, утративших связь с матриксом, получило в литературе даже особое название «аноикис» (Frisch S.M. and Francis H., 1994). Апоптоз, запускаемый внутриклеточным сигналом. Апоптоз может запускаться и без участия рецепторов, под действием внутриклеточных стрессорных факторов, таких как повреждение ДНК, активные формы кислорода (АФК), повышение цитозольной концентрации ионов Ca2+, накопление несвѐрнутых белков в эндоплазматическом ретикулуме и множества других. При этом основным участником сигнального пути апоптоза, запускаемого без участия рецепторов, является митохондрия: выход цитохрома C из митохондриального матрикса в цитозоль способствует формированию апоптосомы, в состав которой входят белок Apaf-1, прокаспаза 9, dATP и цитохром C. После формирования апоптосомы происходит активация инициаторной каспазы 9 и эффекторных каспаз 3, 6 и 7 (Finucane et al., 1999; Acehan et al., 2002). 17 Участие митохондрий в апоптозе. Митохондрии представляют собой клеточные органеллы, в составе которых имеются матрикс, окружѐнный внутренней митохондриальной мембраной (IMM), межмембранное пространство и внешняя митохондриальная мембрана (OMM), отделяющая межмембранное пространство митохондрий от цитоплазмы клетки. И внешняя, и внутренняя митохондриальные мембраны состоят из фосфолипидных бислоѐв и белков. За счѐт присутствия в своѐм составе кардиолипина (особого фосфолипида, содержащего сразу 4 жирные кислоты), в норме внутренняя митохондриальная мембрана является практически непроницаемой для воды и для всех ионов, включая протоны. Это делает возможным комплексам I-IV дыхательной цепи митохондрии обеспечение протонного градиента вдоль внутренней митохондриальной мембраны, тем самым создавая трансмембранный потенциал (∆Ψm), необходимый для осуществления окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ. Кроме того, митохондрия является главным источником АФК в клетке, которые генерируются главным образом за счѐт комплексов I и III дыхательной цепи: комплексы генерируют супероксид анион O2–, который выходит как в матрикс, так и в межмембранное пространство, а также диффундирует в цитозоль. Затем за счѐт супероксид дисмутаз супероксид анион O2– конвертируется в перекись водорода H2O2. Внешняя мембрана митохондрий содержит большое количество особых каналообразующих мембранных белков – митохондриальных поринов, называемых также потенциалзависимыми анионными каналами (VDACs, voltage-dependent anion channels), – которые позволяют небольшим молекулам и ионам с массой до ~5 кДа свободно диффундировать в межмембранное пространство митохондрий. Более крупные белки могут проникать внутрь митохондрии в случае, если сигнальная последовательность на их N-конце связывается с большим мультисубъединичным транспортным белком, транслоказой внешней митохондриальной мембраны, который способен посредством активного транспорта доставлять белки внутрь митохондрии. В межмембранном пространстве митохондрии содержится большое количество различных белков, часть из которых, в случае выхода из митохондрии 18 в цитозоль клетки, принимает участие в запуске апоптоза. При этом выход белков из межмембранного пространства митохондрий часто служит индикатором необратимости процесса программируемой клеточной смерти: клетка погибает вне зависимости от каспазной активности (Тейлор и др., 2006; Kroemer et al., 2007). Выход митохондриальных митохондрии может быть белков вызван из как межмембранного пространства пермеабилизацией внешней митохондриальной мембраны (MOMP), так и открытием поры во внутренней митохондриальной мембране. В последнем случае происходит разбухание митохондриального матрикса при неповреждѐнной внешней митохондриальной мембране, что впоследствии приводит к разрыву OMM и активации механизма апоптоза (Haraguchi et al., 2000). Механизмы проницаемости внешней митохондриальной мембраны. В регуляции MOMP важную роль играют белки семейства BCL-2: при апоптотических сигналах активируются проапоптотические белки семейства BCL-2, приводя к проницаемости внешней митохондриальной мембраны, напротив, антиапоптотические члены семейства BCL-2 способны предотвращать этот процесс. Семейство белков BCL-2 (BCL-2-подобные белки) включает в себя представителей, содержащих по меньшей мере один BCL-2-гомологичный домен (BH). Это семейство состоит из двух групп: Bcl-2-подобных белков-ингибиторов апоптоза (BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL1, BCL-B (известный также как BCL2L10) и A1 (BCL-2A1)), содержащих от двух до четырѐх BCL-2-гомологичных доменов и Bcl-2-подобных белков-активаторов апоптоза (BAX, BAK, BOK (MTD), BAD, BIK (BLK), BID, HRK (DP-5), BIM (BOD), BMF, NOXA и PUMA (BBC3)), содержащих от одного до трѐх BCL-2-гомологичных доменов, причѐм в составе второй группы выделяют так называемые белки BH3-only (BAD, BIK, BID, HRK, BIM, BMF, NOXA и PUMA) с единственным BCL-2-гомологичным доменом (BH3) (Youle and Strasser, 2008). Некоторые из представителей каждой из групп имеют дополнительный COOH-концевой трансмембранный домен, 19 способствующий их встраиванию в OMM и в другие внутриклеточные мембраны (напр., эндоплазматическую мембрану). Как правило, представители первой группы белков-ингибиторов апоптоза находятся в OMM, защищая митохондрию от MMP, главным образом за счѐт связывания и нейтрализации других, проапоптотических, белков семейства BCL-2, индуцирующих MMP. Однако некоторые из белков-ингибиторов апоптоза функционируют также и на эндоплазматической мембране. Аналогичная ситуация имеет место и для проапоптотических белков второй группы. Представители группы белков BH3only, обладая консервативным BH3-доменом, способны связываться с антиапоптотическими представителями семейства BCL-2, регулируя активность последних и благоприятствуя апоптозу (Youle and Strasser, 2008). Белки-активаторы апоптоза Bak и Bax играют ключевую роль в активации MOMP. Было показано, что клетки мышей, в которых произведѐн нокдаун генов Bak и Bax, не проявляют MOMP и устойчивы к апоптозу, стимулируемому различными триггерами (Wei et al., 2001). При этом активность белков Bak и Bax регулируется другими представителями семейства Bcl-2: белками BH3-only, а также белками-ингибиторами апоптоза. Предложена модель, подтверждѐнная при помощи мутагенеза, что после активации Bak способен формировать гомодимер за счѐт встраивания BH3-домена одной молекулы в гидрофобную щель ( BH1домен) другой, после чего такие гомодимеры способны формировать олигомеры и встраиваться в митохондриальную мембрану, приводя к еѐ проницаемости (Dewson et al., 2008). Анализ при помощи мутагенеза продемонстрировал, что олигомеризация Bax происходит за счѐт похожего механизма (George et al., 2007). Связывание белков BH3-only семейства Bcl-2 с Bak (или Bax) способствует формированию такого гомодимера (Tait and Green, 2010). Олигомеры Bak или Bax могут содержать 4 и более гомодимеров (Saito et al., 2000; Dussman et al., 2010). Другой белок-активатор апоптоза, Bid, способен встраиваться в митохондриальную мембрану, вызывая еѐ проницаемость. Активированная каспаза-8 вызывает активацию путѐм ограниченного протеолиза белка Bid, в результате чего из COOH-концевой части образуется укороченная форма этого 20 белка, способная встраиваться в митохондрию, приводя к еѐ пермеабилизации и выходу цитохрома C (Luo et al., 1998). Известно также, что Bid способен взаимодействовать с белками Bax и Bcl-2, при этом Bcl-2 выступает в роли антагониста для Bid (Luo et al., 1998). В результате повышения проницаемости митохондриальной мембраны (MOMP) из межмембранного пространства митохондрий выходят различные белки. При этом, в числе прочих, выходят и белки-активаторы апоптоза, такие как цитохром C, SMAC/DIABLO, OMI и другие, о которых будет идти речь ниже. Цитотоксические факторы, выходящие из митохондрии после индукции проницаемости внешней митохондриальной мембраны. Важнейшим митохондриальным фактором, участвующем в запуске апоптоза после индукции MOMP, является цитохром C. Этот белок, обладающий молекулярной массой ~12 кДа, является в то же время первым охарактеризованным и одним из важнейших участников электронного транспорта в процессе окислительного фосфорилирования и в норме локализован в межмембранном пространстве митохондрии. Выход цитохрома C из митохондрии происходит при активации митохондриального апоптозного каскада, вызванного стимуляцией рецептора смерти Fas или TNF, утратой фактора роста, массированным повреждением ДНК или обработкой химиотерапевтическими препаратами (Reed, 1997). При этом выход цитохрома C из митохондрии детектируется уже через 5 мин после инициации апоптоза, как это было показано с использованием меченного флуоресцеином GFP цитохрома C, и предшествует как переходу фосфатидилсериновых остатков на наружную сторону плазматической мембраны, так и потере целостности плазматической мембраны (Goldstein et al., 2000). Выход цитохрома C из митохондрии приводит к двум последствиям: 1) активации каспазного каскада; 2) блокировке процесса переноса электронов между комплексами дыхательной цепи митохондрии. В результате первого процесса, как уже отмечалось выше, цитохром С связывается с белком Apaf-1, прокаспазой 9 и dATP. При этом происходит конформационное изменение 21 и олигомеризация Apaf-1 и формирование особого комплекса, получившего название апоптосома. Апоптосома стимулирует димеризацию и активацию инициаторной каспазы-9, которая, в свою очередь, вызывает протеолитическую активацию каспазы-3 и каспазы-7. Второй процесс, блокировка переноса электронов между комплексами дыхательной цепи митохондрии, приводит к снижению окислительного фосфорилирования и повышению выработки АФК, что приводит к понижению продукции АТФ в клетке (Tait and Green, 2010; Kroemer et al., 2007). Ещѐ одним фактором, выходящим из митохондрии и запускающим механизм клеточной смерти, является эндонуклеаза G. После выхода из митохондрии эта нуклеаза транслоцируется в ядро клетки, где вызывает межнуклеосомальные разрывы ДНК в хроматине независимо от действия каспаз (Li et al., 2001). Митохондриальный белковый фактор AIF также способен участвовать в запуске механизма клеточной смерти независимо от каспазной активности. В клетках млекопитающих при физиологических условиях этот белок массой 62 кДа в мембранно-связанной форме локализован в межмембранном пространстве митохондрии, проявляя NADH-оксидазную активность и участвуя в осуществлении окислительного фосфорилирования и поддержании дыхательной цепи митохондрии (Miramar et al., 2001). Выход из митохондрии сопровождается протеолитическим расщеплением AIF, в результате которого он переходит в растворимую форму, а его масса уменьшается до 57 кДа. При этом в таком расщеплении принимают участие Ca 2+-зависимая протеаза кальпаин и Ca2+независимые катепсины B, L и S (Polster et al., 2005; Yuste et al., 2005). После выхода из митохондрии AIF транслоцируется в клеточное ядро, вызывая конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК в присутствии каспазных ингибиторов (Kroemer, 2000). При этом белок Bcl-2 препятствует транслокации AIF из митохондрии в ядро клетки (Daugas et al., 2000). Выход других митохондриальных белков, SMAC (аналогично с его мышиным гомологом DIABLO) и OMI (известного также как HTRA2) стимулирует апоптоз за счѐт блокирования ингибитора апоптоза XIAP. Белок XIAP способен 22 непосредственно связываться с каспазами 9, 3 и 7, тем самым ингибируя каспазную активность и препятствуя апоптозу (Eckelman et al., 2006). И SMAC, и OMI способны взаимодействовать с ингибитором апоптоза XIAP, блокируя XIAPопосредованное ингибирование каспазной активности и благоприятствуя апоптозу (Suzuki et al., 2001; Verhagen et al., 2000; Du et al., 2000). Кроме того, апоптоз может запускаться через эндоплазматический ретикулум, который в норме участвует в регуляции синтеза белков и поддержании внутриклеточного Ca 2+-гомеостаза. эндоплазматический ретикулум При стрессорном происходит воздействии повышение на цитозольной концентрации Ca2+, что приводит к активации m-кальпаина, Ca2+-зависимой цитозольной протеазы. Активированный m-кальпаин, в свою очередь, расщепляет Bcl-xL и протеолитически активирует каспазу 12, что приводит к активации каспазы 9, активирующей каспазу 3 (Nakagawa et al., 2000; Kadowaki et al., 2004). 1.1.2. Некроз: нерегулируемый и программируемый Термин «некроз» происходит от греческого «νεκρός», обозначающего «мѐртвый». Если апоптоз определяется рядом специфичных морфологических признаков, некроз на протяжении длительного времени определяли не характерными морфологическими признаками, а, наоборот, в основном по отсутствию характерных морфологических признаков двух других типов клеточной смерти: отсутствию апоптозного морфотипа и обширной вакуолизация цитоплазмы, характерной для аутофагии. При этом некрозу приписывают следующие морфологические черты: округление клетки, увеличение еѐ объѐма (известное также как онкоз), разбухание цитоплазмы, механические разрывы цитоплазматической и внутриклеточной мембран, сопровождаемые увеличением в размерах и деградацией цитоплазматических органелл с последующим высвобождением лизосомальных ферментов и просачиванием цитоплазмы в межклеточное пространство (Galluzzi and Kroemer, 2008). Некроз длительное время считался исключительно патологической, нерегулируемой формой клеточной смерти, вызываемой неспецифичным и 23 нефизиологическим стрессорным воздействием. Вопрос о чисто нерегулируемом характере некроза был поднят в 1988 году, когда было обнаружено, что определѐнные типы клеток погибают в ответ на стимуляцию одним и тем же триггером, TNFα, проявляя при этом в одних случаях классические признаки апоптоза, в других же некротическую шароподобную морфологию без явных признаков ядерной дезинтеграции. Начиная с этого момента, в научной литературе накапливалось всѐ больше и больше данных в пользу того, что некроз может быть регулируем, которые, в конечном счѐте, создали благоприятную почву для введения термина «программируемый некроз» в 2003 году (Vandenabeele et al., 2010). Рецепторы смерти, такие как TNFR1, Fas/CD95 и TRAIL-R, а также Tollподобные рецепторы, такие как TLR3 и TLR4, способны принимать участие в запуске программируемого некроза, в особенности, при наличии ингибиторов каспаз. Причѐм для запуска клеточной смерти через TNFR1, Fas/CD95, TRAIL-R и TLR3 необходима киназная активность белка RIP1, которая блокируется химическим ингибированием при помощи молекулы-ингибитора некростатин-1 (Nec-1) (Degterev et al., 2005; Kroemer et al., 2009). В 2005 году в науку вводится неологизм «некроптоз» для описания одного из механизмов протекания программируемого некроза, в котором существенную роль играет киназная активность белка RIP1 (Degterev et al., 2005). За последние годы охарактеризовано большое число молекул и процессов, играющих роль инициаторов, передатчиков сигнала либо эффекторов некроптоза. Они, в частности, включают в себя киназы RIP1 (receptor-interacting protein 1) (другое название RIPK1) и RIP3 (RIPK3), каспазные ингибиторы, кальций-зависимые цитозольные протеазы кальпаины и кальций-зависимую цитозольную фосфолипазу (cPLA2), убиквитин-лигазы E3, деубиквитинилирующие ферменты, активные формы кислорода (АФК), производимые митохондриями или NADPH оксидазой 1 (NOX1), биоэнергетические реакции, такие как гликогенолиз и глутаминолиз, члены семейства проапоптотической B-клеточной лимфомы 2 24 (BCL-2), поли(АДФ-рибоза) полимеразу (PARP), лизосомальные, митохондриальные и цитозольные гидролазы (Vandenabeele et al., 2010). В настоящее время известно, что программируемый некроз может протекать в модельных организмах, не относящихся к млекопитающим; кроме того, этот путь клеточной гибели обнаруживается при протекании человеческих болезней, включая ишемическую болезнь и вирусную инфекцию (Galluzzi et al., 2011). Регулируемый некроз, некроптоз. Классификация. «Комитет по номенклатуре клеточной смерти 2012 года» («Nomenclature Committee on Cell Death 2012», в дальнейшем «NCCD 2012») предлагает классифицировать регулируемый некроз в соответствии с его зависимостью от специфичных сигнальных путей, используя соответствующие названия (Galluzzi L. et al., 2011). В частности, случаи регулируемого некроза, в которых проявляется активация RIP1 (которая может быть измерена ферментативным анализом или путѐм мониторинга фосфорилирования RIP1 в положении S161) и которые супрессируются ингибиторами RIP1, включая Nec-1, рекомендуется называть «RIP1-зависимый регулируемый некроз». Стоит заметить, что RIP3 зависимые, но RIP1-независимые случаи регулируемого некроза были также описаны, при этом в этих случаях осуществление программы клеточной смерти не было нечувствительным к некростатинам. Термин «некроптоз» был первоначально введѐн для описания частно го случая регулируемой некротической смерти, который вызывается лигированием рецептора TNFR1 и ингибируется химическим агентом Nec-1 – молекулой, ингибирующей киназную активность RIP1 (Degterev et al., 2005). В дальнейшем термин «некроптоз» зачастую использовался в различных статьях в качестве синонима «регулируемому некрозу». Тем не менее, NCCD 2012 рекомендует использовать термин «некроптоз» для описания отдельных случаев программируемого некроза, а именно, для RIP1- и/или RIP3-зависимого некроза (Galluzzi L. et al., 2011). В дальнейшем в настоящей работе термин «некроптоз» используется для обозначения разновидности программируемого некроза, зависимой от 25 серин/треониновой киназной активности RIP1 и блокируемой молекулойингибитором Nec-1, что находится в согласии с рекомендациями «Комитета по номенклатуре клеточной смерти 2012 года». Некроптоз может запускаться лигированием так называемых рецепторов смерти, включающих CD95 (другое название: Fas; связывается с лигандом CD95L/FasL), TNF рецептор 1 (TNFR1/CD120a), TNFR2, рецепторы 1 и 2 к вызывающему апоптоз лиганду суперсемейства TNF (TNF-related apoptosisinducing ligand receptor 1 and 2; TRAILR1, TRAILR2). Эти рецепторы известны как типичные активаторы другого, классического, механизма программируемой клеточной смерти, апоптоза, при этом для проявления цитотоксических свойств вышеупомянутыми рецепторами важную роль играет присутствие в среде транскрипционных или трансляционных ингибиторов, что наводит на мысль о существовании короткоживущих белков, непрерывно синтезируемых клеткой и выполняющих защитную функцию. Тем не менее, в некоторых клеточных линиях и первичных клетках при блокирующих наличии ингибиторов каспазо-зависимый путь каспазной активности, апоптоза, обнаруживается альтернативный, каспазо-независимый путь клеточной смерти, запускаемый рецепторами смерти и приводящий к морфологии, типичной для некроза (Vandenabeele et al., 2010). Так, было обнаружено, что в случае блокировки апоптоза за счѐт ингибирования каспазной активности, лигирование рецептора смерти может мприводить к запуску альтернативного механизма клеточной смерти, при этом погибающие клетки проявляют морфологию, типичную для некроза. Например, лиганды FasL, TNFα и TRAIL способны инициировать некротическую гибель клеток Jurkat в присутствии неспецифичного каспазного ингибитора zVAD.fmk. Кроме того, в клетках Jurkat, дефицитных либо по каспазе-8, либо по адаптерной молекуле FADD – двум критическим активаторам сигнального пути апоптоза – стимуляция лигандом TNFα вызывает некротическую клеточную смерть. Ингибирование каспазной активности приводит к запуску альтернативного апоптозу лиганд-зависимого механизма клеточной смерти с характерными 26 признаками некроза и для других типов клеток: NIH3T3, фибробластов мышиных эмбрионов (MEFs), моноцитных клеток U937 и эпителиальных клеток IEC-6 и HT29 (Degterev et al., 2005). Аналогичный эффект запуска клеточной смерти с некротической морфологией был обнаружен и для клеток мышиной фибросаркомы L-929 (Vercammen D. et al., 1998). Молекулярные механизмы осуществления программы некроптоза. После открытия взаимодействия между RIP1 и RIP3 основные усилия исследователей сосредоточились на выяснении, каким образом их комплекс, получивший название некросома, активирует некротическую клеточную смерть. Но, поскольку эта область исследований очень молода, на сегодняшний день открыта лишь небольшая часть полной картины молекулярных механизмов, лежащих в основе осуществления программы некроптоза, запускаемого лигированием рецептора TNF-R1. При этом некоторые из обнаруженных эффекторов некроптоза могут также активироваться и за счѐт других триггеров некроптоза, включая PAMPs и повреждения ДНК (Vandenabeele et al., 2010). Несколько дополнительных штрихов к этой картине дают исследования, проведѐнные ещѐ в то время, когда некроз всѐ ещѐ рассматривался как исключительно нерегулируемый тип клеточной смерти. Так, к примеру, появление высоко реактивных оксидантов, включая активные формы кислорода (АФК) и активные формы азота (АФА), связывали с некротической клеточной смертью задолго до открытия некросомы (Schulze-Osthoff et al., 1992; Galluzzi et al., 2011). Поддержание низких концентраций ионов Ca2+ в клетке чрезвычайно важно для еѐ нормальной поддержанию жизнеспособности концентрации и ионов функционирования. Ca 2+ Внутри способствуют клетки Ca 2+-АТФаза эндоплазматического ретикулума и митохондриальные Ca2+-транспортирующие системы. При этом основным источником ионов Ca 2+ в клетке является эндоплазматический ретикулум. Под действием ионов Ca2+ могут активироваться 27 Ca2+-зависимые фосфолипазы, лизосомальные гидролазы и протеазы (в том числе цитозольные протеазы кальпаины), способствуя деградации клеточных белков, ДНК и РНК. В частности, при этом может происходить активация цитозольных протеаз кальпаинов и цитозольной фосфолипазы (Vandenabeele et al., 2010). Биоэнергетические аспекты протекания некроптоза. Во время апоптоза каспазы стремительно блокируют процессы, протекающие с затратой АТФ, включая активность поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы-1 (Poly (ADP-ribose) polymerase 1 / PARP1), трансляцию и деградацию белков, осуществляемую при участии протеасомы. В противоположность этому, при протекании TNF-индуцированного некроптоза, эти процессы не прекращаются и, следовательно, могут вносить вклад в понижение до летального уровня АТФ внутри клетки. PARP1 представляет собой ядерный фермент, участвующий в репарации ДНК и регуляции транскрипции. Гиперактивация PARP1 (вероятно, вызываемая повреждением ДНК при участии АФК) является критически важной для осуществления некроптоза, запускаемого TNF в клеточной линии L-929 (мышиная фибросаркома) и в конце концов приводит к истощению АТФ и NAD. В ответ на алкилирование ДНК, активация PARP1, а также последующее истощение NAD и/или накопление PAR, способствуют выходу апоптозиндуцирующего фактора (AIF) из межмембранного пространства митохондрий. Последний процесс, как было обнаружено, находится в зависимости от кальпаинов – Ca2+-активируемых некаспазных цистеиновых протеаз. Оказавшись в цитозоле, AIF сразу же мигрирует в ядерный компартмент, где он опосредует каспазо-независимую широкомасштабную фрагментацию ДНК, которая, в свою очередь, способна стимулировать дальнейшую активацию PARP, тем самым зацикливая губительный для клетки процесс. "Мыши-арлекины" (harlequin mice), несущие гипоморфную мутацию в гене Aifm1 и экспрессирующие пониженные уровни AIF, защищены против некоторых некротических триггеров, включая ишемически-реперфузионное повреждение мозга. Сходным образом, 28 фармакологическое или генетическое ингибирование PARP1 приводит к цитопротекторным эффектам (Vandenabeele et al., 2010). Было неожиданным, что и RIP1-, и TRAF2-дефицитные клетки MEFs оказались устойчивыми к PARP1-индуцируемой клеточной смерти, вызываемой агентами, приводящими к алкилированию ДНК, тем самым подчѐркивая, что активация RIP1 может также происходить при участии PARP, по крайней мере при определѐнных экспериментальных условиях. С этим утверждением согласуется тот факт, что гиперактивация PARP1 не только нарушает функционирование митохондрии, но и активирует два процесса JNK, которые, как установлено, усиливают некротическую клеточную смерть в некоторых экспериментальных моделях. Прямая связь между RIP1 и понижением концентраций АТФ (которые происходят при некроптозе) была установлена после того, как было открыто существование RIP1-зависимого сигнала, приводящего к ингибированию адениннуклеотид-транслоказы интегральный белок (ANT). внутренней При физиологических митохондриальной условиях, мембраны, ANT, замещает новосинтезированную митохондриальную АТФ на цитозольную АДФ. Можно ожидать, что ингибирование белка за ANT счѐт RIP1 понижает внутримитохондриальные уровни АДФ, приводя сначала к ингибированию F1-F 0 АТФ-синтазы (поскольку АДФ является еѐ субстратом), а затем к возврату F1-F 0 АТФ-синтазной активности, что приводит к вытеснению протонов из митохондриального матрикса за счѐт энергии гидролиза АТФ и повышению митохондриального трансмембранного потенциала (Δψm). В пользу такой модели выступает и тот факт, что в митохондрии наблюдается временное повышение Δψ m на начальных стадиях некроптоза (Vandenabeele et al., 2010). Есть свидетельства и в пользу того, что ANT взаимодействует с потенциалзависимым анионным каналом (VDAC; присутствует на внешней мембране митохондрий) и циклофилином D (CYPD; присутствует в митохондриальном матриксе), образуя поровый комплекс, меняющий проницаемость митохондрии (mitochondrial permeability transition pore complex, PTPC). В ответ на стимуляцию некоторыми летальными триггерами, включая окислительный стресс и 29 повышенную концентрацию ионов Ca2+, PTPC принимает конформацию с высокой проводимостью, позволяющую растворѐнным веществам и воде нерегулируемо проникать в митохондриальный матрикс. Последнее явление получило название изменение проницаемости митохондрий (mitochondrial permeability transition) (Vandenabeele et al., 2010). 1.1.3. Аутофаговая клеточная смерть Аутофагия (от греч. «αὐτός» – сам и «υαγεῖν» – плотный) – это процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь еѐ лизосом (в клетках млекопитающих) или вакуолей (в клетках дрожжей) и подвергаются в них деградации. В большинстве случаев активация аутофагии способствует выживаемости клетки, обеспечивая цитопротекторный сигнал, активируемый в умирающих клетках с целью преодолеть стрессорное воздействие, а ингибирование аутофагии усиливает, а не предотвращает, клеточную смерть (Levine and Yuan 2005). Участие аутофагии в осуществлении клеточной смерти было обнаружено при исследовании морфологии развивающихся эмбрионов: определѐнный тип погибающих клеток характеризовался обширным накоплением везикул. Это явление было названо «аутофаговая клеточная смерть» (Schweichel and Merker, 1973). Морфологическим признаком «аутофаговой клеточной смерти» считается обширная вакуолизация цитоплазмы, зачастую (но не всегда) указывающая на усиление процесса аутофагии. Несмотря на то, что исходно выражение «аутофаговая клеточная смерть» не подразумевало рассмотрения механизмов процесса, эта фраза довольно быстро утвердилась в научной литературе и стала использоваться, как если бы аутофагия в действительности осуществляла уничтожение клеток. Таким образом, с одной стороны, имеются данные, что аутофагия опосредует физиологическую клеточную смерть in vivo, во время осуществления программы развития D. melanogaster, с другой стороны, показано, что аутофагия принимает участие в смерти некоторых опухолевых клеток (особенно если в них отсутствуют 30 основные модуляторы апоптоза, такие как каспазы или белки Bax и Bak), запускаемой рядом химиотерапевтических агентов in vitro (Galluzzi et al., 2011). 1.1.4. Другие типы клеточной смерти В настоящее время в литературе часто встречается информация о существовании других типов клеточной смерти, помимо апоптоза, аутофагии и различных видов некроза. Термин «пироптоз» был впервые введѐн в 2000 году для описания особого типа клеточной смерти, запускаемого в макрофагах, инфицированных бактерией Salmonella typhimurium (Brennan and Cookson, 2000). Позднее было установлено, что этот тип клеточной смерти характерен не только для макрофагов и не только при инфицировании бактериями. В процессе пироптоза происходит активация каспазы 1, которая за счѐт ограниченного протеолиза способствует активации и выходу пирогенных интерлейкина-1β и интерлейкина 18. Кроме того, каспаза 1 участвует в активации эффекторной каспазы 7, приводя к запуску каспазного каскада, который протекает без активного вовлечения каспазы 3. Таким образом, пироптоз представляет собой механизм клеточной смерти, протекаемый при участии каспазы 1 и блокируемый еѐ генетическими или фармакологическими ингибиторами, сопровождаемый выходом из клетки провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β и интерлейкин-18 (Galluzzi et al., 2012). Совсем недавно была установлена важнейшая роль пироптоза в протекании процессов под действием ВИЧ. Было обнаружено, что в организмах, заражѐнных ВИЧ, клеточная смерть CD4 T-лимфоцитов протекает по механизму пироптоза при участии каспазы-1 (Doitsh et al., 2014). Ещѐ одним неклассическим типом клеточной смерти, который протекает при участии каспаз, является «корнификация» - программа клеточной смерти, характерная для клеток внешнего слоя эпидермиса, кератиноцитов, в процессе формирования рогового слоя, который состоит из погибших клеток, содержащих специфические белки (включая кератин, лорикрин, инволюкрин) и липиды (включая жирные кислоты и церамиды). Этот тип клеточной смерти 31 сопровождается синтезом особых ферментов и субстратов. К числу ферментов относятся неапоптотическая каспаза 14 и трансглутаминазы-1, -3 и -5, катализирующие реакции ковалентной сшивки. При этом корнификация протекает без активации классических апоптозных каспазных каскадов. В результате корнификации клетка теряет ядро и другие органеллы, превращаясь в мѐртвый корнеоцит. Несмотря на то, что в некоторых случаях этот тип клеточной смерти рассматривают как этап дифференцировки клеток, по аналогии с потерей ядра клетками роговой оболочки глаза и эритроцитами на конечной стадии дифференцировки, в последних двух случаях клетки сохраняют способность реагировать на стрессорные сигналы к запуску клеточной смерти, в то время как кератиноциты эпидермиса такой способности не сохраняют. По этой причине корнификация всѐ же представляет собой истинный процесс клеточной смерти, а не этап дифференцировки (Denecker et al., 2007; Galluzzi et al., 2012). Термин «энтоз» был введѐн в 2007 году для описания каспазонезависимого механизма клеточной смерти, запускаемого в клетке, поглощенной клеткой того же типа (Overholtzer et al. 2007). Этот термин впервые описан для клеток человеческих опухолей, при этом клетки, участвующие в таком процессе, сами по себе не являются профессиональными фагоцитами. В настоящее время энтоз характеризуют следующими признаками: 1) гомотипическое взаимодействие между клетками, которые сами по себе не являются профессиональными фагоцитами; 2) поглощѐнная клетка не выходит из фагосомы и деградируется при участии лизосом; 3) процесс нечувствителен к блокаторам каспазо-зависимого и каспазо-независимого апоптоза, запускаемого внутриклеточными факторами (Galluzzi et al., 2012). Остаѐтся неясным, что служит сигналом к энтотическому поглощению, поскольку клетки, подвергающиеся энтозу, не экспонируют остатки фосфатидилсерина на внешней поверхности плазматической мембраны, что служило бы сигналом к фагоцитозу. Первоначальное взаимодействие клеток в процессе энтоза происходит при участии адгезионных молекул кадгеринов. Энтоз протекает без участия каспаз, а также не ингибируется гиперэкспрессией Bcl-2. 32 По всей видимости, деградация клетки в процессе энтоза происходит при участии лизосом поглотившей клетки (Overholtzer et al. 2007; Galluzzi et al., 2012). Термином «партанатоз» был введѐн в литературу для описания определѐнного типа клеточной смерти, который протекает при участии ферментов поли(АДФрибоза)-полимераз (PARP), в частности, PARP1, проявляющей наибольшую активность в клетке. В норме эти ферменты отвечают за репарацию ДНК, однако при гиперэкспрессии могут приводить к истощению NAD+ и АТФ, а также накоплению поли(АДФ-рибозы), которая вызывает диссипацию трансмембранного потенциала митохондрии и выход AIF из митохондрии в цитозоль. При этом установлено, что взаимодействие между AIF и поли(АДФрибозой) необходимо для партанатоза как in vitro, так и in vivo (Wang et al., 2011). В настоящее время партанатозом принято считать каспазо-независимый путь клеточной смерти, который характеризуется активацией PARP1 уже на ранних стадиях процесса и сопровождается истощением NAD+ и АТФ и лизисом хроматина при участии АТФ (Galluzzi et al., 2012). Большинство неапоптотических механизмов клеточной смерти описаны в для случаев, когда сигнальный путь апоптоза заблокирован. Однако не исключена возможность, что эти механизмы могут играть первостепенную роль в определѐнных типах клеток и в ответ на определѐнные стимуляторные сигналы. Так, хотя некроптоз в большинстве описанных случаев запускается при стимуляции рецепторов смерти в условиях блокировки классического апоптозного пути клеточной смерти, некроптоз может также играть роль одного из важнейших механизмов, участвующих в регуляции патологической гибели клеток. 1.1.5. Участие лизосом в механизмах клеточной смерти Лизосомы (от греч. «λύσις» – растворяю и «sōma» – тело) представляют собой мембранно-ограниченные клеточные органоиды, способные переваривать макромолекулы, захваченные ими из внешней среды. Эти органоиды были открыты учѐными в середине XX века и первоначально воспринимались как 33 «мешки», окружѐнные мембраной из липопротеинов и заполненные гидролазами (De Duve et al., 1955; De Duve, 1983). Одним из отличительных признаков лизосом является, действительно, наличие в них большого разнообразия гидролаз, которых на сегодняшний день известно более 50 и в число которых входят протеазы, липазы, фосфолипазы, гликозидазы, нуклеазы, рибонуклеазы, фосфатазы и сульфатазы, обычно проявляющие максимум своей ферментативной активности при низких pH (Repnik and Turk, 2010). Для лизосом характерна кислая реакция внутренней среды (pH 4.6-5.0), которая обеспечивается наличием в мембранах лизосом хлоридных ионных каналов, а также активным транспортом протонов за счѐт встроенного в мембраны лизосом белка-насоса протонной АТФазы. Повреждения лизосомальных мембран способны приводить к выходу лизосомальных протеаз, включая катепсины, в цитозоль клетки, вызывая запуск программируемой клеточной смерти. Если массовые повреждения лизосом приводят к некрозу (Kågedal et al., 2001), то контролируемый выход лизосомальных ферментов в цитозоль способен приводить к запуску апоптоза (Turk et al., 2002). Факторы, вызывающие пермеабилизацию лизосомальной мембраны (LMP). На сегодняшний день известно множество факторов, которые способны индуцировать LMP. В их число входят АФК, сфингозин и другие лизосомотропные агенты, липиды, белки семейства Bcl-2, каспазы, катепсины, а также лизосомальный белок LAPF (Boya and Kroemer, 2008). Одним из основных факторов, вызывающих LMP, являются АФК. Под действием АФК происходит перекисное окисление липидов мембран лизосом, что приводит к дестабилизации мембран и выходу лизосомальных протеаз в цитозоль клетки, приводя к клеточной смерти (Vanlangenakker et al., 2008). Показано, что АФК, генерируемые NADPH-оксидазой, могут вызывать выход катепсина D из азурофильных гранул нейтрофилов независимо от активности каспаз (Conus et al., 2008; Blomgran et al., 2007). После выхода из лисосом катепсин D приводит к активации каспазы-8 и инициации апоптоза (Conus et al., 2008). 34 Другим фактором, приводящим к LMP, может выступать молекула сфингозина. Лизосомальный фермент сфингомиелиназа после своей активации расщепляет сфингомиелин, основной сфинголипид клеточных мембран, до церамида. Церамид может быть преобразован в сфингозин за счѐт отщепления жирных кислот ферментом церамидазой. Будучи лизосомотропным агентом, сфингозин накапливается в лизосомах, вызывая дозо-зависимую пермеабилизацию лизосомальных мембран (Vanlangenakker et al., 2008). Стоит отметить, что церамид способен блокировать работу комплекса III дыхательной цепи митохондрии, приводя к повышению выработки АФК. При этом синтетические аналоги церамида вызывают в опухолевых клетках запуск механизмов клеточной смерти (Granot et al., 2006). Накопление церамида наблюдается в случае программируемого некроза, запущенного через рецептор под действием Fas и TNF, при этом в последнем случае накопление церамида является RIP1зависимым (Vanlangenakker et al., 2008). Активация фосфолипазы PLA2 может также способствовать LMP. Было показано, что добавление ингибитора PLA2 4-бромофенацил бромида снижает повреждения лизосомальных мембран и апоптоз в клеточной линии лимфомы мыши J774 (Zhao et al., 2001). При этом сами лизосомальные ферменты способны активировать PLA2, обеспечивая тем самым положительную обратную связь в процессе LMP (Zhao et al., 2001). Таким образом, PLA2 способна воздействовать как на митохондрию, индуцируя MOMP, продукцию АФК и выход цитохрома C, так и на лизосому, стимулируя LMP. LMP может быть также вызвана воздействием кальпаинов – Ca 2+-зависимых цистеиновых протеаз. Известно 2 подсемейства кальпаинов: µ-кальпаины и mкальпаины, для активации которых требуются, соответственно, микромолярные и миллимолярные концентрации ионов Ca 2+. Активация кальпаинов может быть вызвана воздействием АФК, кроме того, кальпаины способны к самоактивации за счѐт протеолитической модуляции Na +/Ca 2+-насоса плазматической мембраны, приводящей к необратимому нарушению Ca2+-гомеостаза. После активации µкальпаин транслоцируется в лизосомальную мембрану, нарушая еѐ целостность и 35 вызывая выход лизосомальных катепсинов в цитозоль клетки, что приводит к запуску клеточной смерти (Vanlangenakker et al., 2008). Белки семейства Bcl-2, регулирующие индукцию MOMP, способны также участвовать в запуске LMP. Так, белок Bax способен транслоцироваться из цитозоля в лизосомальную мембрану, индуцируя LMP (Kågedal et al., 2005; Feldstein et al., 2006). При этом с помощью иммунного окрашивания и с использованием конфокального и электронного микроскопов было показано, что в человеческих фибробластах, культивируемых в присутствии староспорина, тирозинкиназного ингибитора широкого спектра действия, происходит транслокация Bax в мембраны лизосом, что вызывает LMP и выход катепсина D из лизосом в цитозоль (Kågedal et al., 2005). Ингибирование экспрессии Bax методом РНК-интерференции защищает клетки от LMP и апоптоза, вызванных воздействием H2O2, что также подтверждает участие Bax в индукции LMP (Castino R. et al., 2007). Другой член семейства Bcl-2, белок Bid подсемейства BH3-only, также может быть задействован в запуске LMP. Исследование на клетках с генотипом Bid–/– продемонстрировали, что LMP и клеточная смерть в гепатоцитах, вызванные воздействием TNF-α, являются Bid-зависимыми (Guicciardi M.E. et al., 2005). Все эти данные указывают на то, что белки Bax и Bid семейства Bcl-2 способны непосредственно вызывать LMP, независимо от активации MOMP. Каспазы также могут участвовать в индукции LMP. В частности, стимуляция клеток цитокином TNF-α может индуцировать LMP при участии каспазы-8, что вызывает транслокацию катепсина B из лизосом в цитозоль, индуцируя клеточную смерть (Werneburg et al., 2004). При этом активация каспаз может как предшествовать LMP, как это было показано для клеток ME-180, так и происходить после LMP, как в случае клеток WEHI-S (Foghsgaard et al., 2001). Для клеток эмбриональных мышиных фибробластов было показано, что рецепторный путь апоптоза может вызывать активацию каспазы-8, которая участвует в активации каспазы 9, индуцирующей LMP и выход лизосомальных катепсинов в цитозоль, осуществляя программу клеточной смерти (Gyrd-Hansen et al., 2006). 36 Белок Hsp70, ассоциированные с лизосомой мембранные белки LAMP-1 и LAMP-2 и эндогенные глигоаминогликаны могут защищать от LMP (Kirkegaard et al., 2010; Fehrenbacher et al., 2008; Yue et al., 2009). Последствия LMP Нарушение целостности лизосомальной мембраны приводит к выходу лизосомальных катепсинов в цитозоль, что приводит к расщеплению различных белковых субстратов и вызывает апоптоз. Катепсины B, K, L и S не вызывают непосредственной активации каспаз, классических эффекторов апоптоза, а проявляют свой эффект опосредованно, взаимодействуя с белками семейства Bcl2: приводя к протеолитической активации белка BID, а также за счѐт деградации анти-апоптотических членов семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-XL и MCL-1). Кроме того, цистеиновые катепсины могут участвовать и в осуществлении запускаемого митохондрией митохондриального пути апоптоза, вызывая деградацию белка XIAP, а также, возможно, других белков-членов семейства IAP, тем самым способствуя активации эффекторных каспаз (Repnik and Turk, 2010). 1.2. Основные лиганды и рецепторы запуска запрограммированной клеточной смерти 1.2.1. Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти Первое упоминание о токсическом факторе (в дальнейшем названном «лимфотоксин»), секретируемом мышиными лимфоцитами и играющем ключевую роль в лизисе клеток-мишеней линии L (мышиные фибробласты) in vitro, датируется 1968 годом (Granger and Kolb, 1968). Вскоре было продемонстрировано, что лимфоциты различных видов животных, включая человека, способны секретировать лимфотоксин в ответ на стимуляцию in vitro препаратами, вызывающими трансформацию лимфоцитов, фитогемаглютинином и ксеногенными антителами (Granger et al., 1969). Фактор некроза опухоли (TNF) был впервые обнаружен в 1975 году в сыворотке крови мышей, крыс и кроликов как особый агент, секретируемый клетками организма после воздействия на них 37 эндотоксином и приводящий к геморрагическому некрозу саркомальных опухолей – Meth A и L-929, – трансплантированных в организм мыши (Carswell et al., 1975). Было также показано, что TNF из организма мыши способен ингибировать рост опухолевых клеток человеческой меланомы ( Helson et al., 1975; Hehlgans and Pfeffer, 2005). Вскоре после того, как эти две классические молекулы – лимфотоксин и TNF – были обнаружены и их кДНК клонирована, стало ясно, что они являются прототипами суперсемейства генов (впоследствии получившего название «суперсемейство фактора некроза опухоли» / TNFSF), участвующих в регуляции жизненно важных биологических функций у позвоночных ( Hehlgans and Pfeffer, 2005). Начиная с 1980-х годов, в литературе стали накапливаться описания дополнительных членов этого суперсемейства, которые, помимо структурного сходства, проявляли сходную либо перекрывающуюся функциональную активность в отношении клеток различных типов. При этом запуск сигнальных путей происходит при взаимодействии представителя TNFSF со специфичным рецептором «суперсемейства рецептора к фактору некроза опухоли» (TNFRSF). Молекулы суперсемейств TNFSF и TNFRSF обнаружены у всех млекопитающих и являются высоко консервативными. На сегодняшний день эти семейства насчитывают около 50 растворимых и мембранных белков, способных запускать различные механизмы в клетках (Croft et al., 2012). При этом передача сигнала происходит за счѐт специфичного взаимодействия лиганда TNFSF с рецептором TNFRSF. Молекулы суперсемейства TNF обладают каноническими TNF-подобными доменами и, как считается, активны преимущественно в тримерной форме, как на клеточной поверхности, так и в растворимом виде после внеклеточного расщепления. Большая часть этих белков либо экспрессируется клетками иммунной системы, либо способна воздействовать на иммунокомпетентные клетки, проявляя при этом разнообразные эффекты, к примеру, стимулируя пролиферацию, дифференцировку клеток, влияя на их выживаемость либо продуцирование ими воспалительных цитокинов и хемокинов. При этом 38 большинство из них играют важную роль именно в делении и дифференцировке клеток, поддерживая их жизнеспособность, и лишь некоторые представители, получившие название лиганды смерти, стимулируют запуск сигнальных путей, приводящих к программируемой гибели клетки, за счѐт взаимодействия с соответствующими рецепторами смерти. За исключением растворимого, продуцируемого лимфоцитами цитокина LTα, лиганды смерти экспрессируются преимущественно в форме трансмембранных белков II типа и имеют в своѐм составе внутриклеточный N-концевой домен, трансмембранный участок и Cконцевой внеклеточный «хвост». В результате протеолитического расщепления могут также образовываться растворимые формы этих белков (Guicciardi and Gores, 2009; Croft et al., 2012). Молекулы суперсемейства TNFR содержат несколько цистеин-богатых доменов в своих лиганд-связывающих внеклеточных областях и тоже могут как экспрессироваться на клеточной мембране, так и существовать в растворимой форме (Croft et al., 2012). Суперсемейство TNFR (TNFR superfamily; TNFRSF) на сегодняшний день насчитывает 23 рецептора клеточной поверхности (Lu and Walsh, 2012), имеющих значительную гомологию внеклеточных участков, которые могут содержать до 6 богатых цистеином доменов (cystein-rich domains, CRD), определяющих специфичность рецепторов по отношению к лигандам. Члены этого суперсемейства включают в себя TNFR1, TNFR2, Fas, CD40, TRAI L рецепторы, RANK и рецепторы-ловушки (decoy receptors). Эти рецепторы представляют собой трансмембранные белки I типа, содержащие C-концевой внутриклеточный хвост, мембранно-связанный участок и внеклеточный лигандсвязывающий N-концевой домен. Внутри этого суперсемейства есть подкласс рецепторов, известных как рецепторы смерти, отличительная черта которых – наличие цитоплазматического участка из ~80 аминокислот, получившего название домен смерти (death domain, DD), который необходим для запуска апоптоза. Наиболее хорошо исследованными рецепторами смерти являются Fas (CD95/APO-1), TNF-рецептор 1 (TNFR1/TNF-R1/p55/CD120a), рецепторы смерти 4 (DR4/TRAIL-R1) и 5 (DR5/TRAIL-R2/APO-2/KILLER). Куда меньше 39 информации имеется о двух других рецепторах, содержащих домены смерти, а именно, рецепторах смерти 3 (DR3/APO-3/TRAMP/WSL-1/LARD) и 6 (DR6), которые не являются потенциальными инициаторами апоптоза. Активация рецепторов Fas, TRAIL-R1 и TRAIL-R2 часто приводит к запуску клеточной смерти, в то время как стимуляция TNFR1 обычно вызывает продуцирование цитокинов, воспаление и способствует выживаемости клетки, если только эти пути не заблокированы: в противном случае, TNFR1 раскрывает свой цитотоксический потенциал. Передача цитотоксического сигнала рецепторами смерти протекает в 3 этапа: 1) связывание с соответствующим лигандом; 2) привлечение адаптерных/стыковочных белков, которые, в свою очередь, привлекают каспазы 8 и 10; 3) активация отдельных сигнальных путей, зависящих от стехиометрии различных адаптерных белков и каспаз 8 и 10 и от процессов клеточной интернализации. Кроме того, в ряде случаев белковые комплексы рецептор/адаптер способны также приводить к запуску многочисленных сигнальных путей, не связанных с цитотоксичностью, при которых очень часто происходит активация ядерного фактора «каппа-би» (NF-κB) и митогенактивируемой протеинкиназы (MAPK). Молекулярные переключатели между цитотоксическими и нецитотоксическими сигнальными путями рассмотрены ниже (Guicciardi and Gores, 2009). 1.2.2. Общие сигнальные процессы, запускаемые рецепторами смерти Для инициации передачи сигнала требуется олигомеризация (тримеризация) рецептора и сближение внутриклеточных доменов. Первоначально считалось, что тримеризация рецептора запускается связыванием тримерного лиганда с внеклеточным доменом рецептора. Эта концепция существовала до тех пор, пока не были обнаружены олигомеры рецепторов, сформированные на клеточной поверхности в отсутствии лигандов. Формирование таких лиганд-независимых рецепторных комплексов происходит благодаря взаимодействию удалѐнных от мембраны, первых цистеин-богатых доменов внеклеточной части рецепторов, участка, получившего название PLAD. Формирование таких комплексов 40 характерно для рецепторов TNFR1, Fas и TRAIL-рецепторов (Vandenabeele et al., 2010; Clancy et al., 2005; Siegel et al., 2000). Связывание с лигандом вызывает конформационное изменение в предварительно олигомеризованном рецепторе, что привлекает различные адаптерные белки, такие как Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD); TNFR-ассоциированный белок с доменом смерти (TRADD). Эти белки стимулируют активацию эффекторов клеточной смерти, таких как инициаторные каспазы (каспазы 8 и 10) и cFLIPL, запускаемую после лигирования рецептора смерти. Адаптерные молекулы способны ассоциироваться с рецепторами за счѐт гомотипического взаимодействия их собственных доменов смерти с рецепторными. Кроме того, эти молекулы могут включать в себя дополнительные модули белок-белкового взаимодействия, такие как домены смерти (DEDs), участвующие в привлечении каспаз и cFLIPL за счѐт их ассоциации с соответствующим DED. Образующийся комплекс получил название индуцирующий смерть сигнальный комплекс (DISC) или комплекс II. Этот комплекс может инициированный генерировать апоптотический активированными каспазами. При сигнальный каскад, высоких локальных концентрациях инициаторных каспаз происходит их активация на комплексе DISC, однако механизм активации пока до конца не изучен. Имеется несколько моделей, согласно одной из которых кластеризация каспаз на комплексе DISC приводит к их самоактивации за счѐт аутокаталитического процессинга, согласно другой – сборка инициаторных каспаз на DISC благоприятствует их димеризации, что, в свою очередь, приводит к их активации. Согласно второй модели, для активации инициаторной каспазы требуется еѐ димеризация, а не расщепление, однако процессинг каспаз может приводить к повышению стабильности их активных форм. Позднее предложена «индукционно-конформационная модель», предполагающая, что активация инициаторных каспаз достигается за счѐт конформационного изменения в их активном сайте как результата взаимодействия инициаторной каспазы с адаптерным белковым комплексом. Вне зависимости от механизма активации, после аутопротеолитического расщепления фермент выбрасывается в цитозоль в форме активного гетеротетрамера, 41 содержащего 2 больших и 2 малых субъединицы, которые, в свою очередь, запускают протеолитический каскад (Vandenabeele et al., 2010). Активация каспаз 8 и 10 на комплексе DISC может регулироваться при помощи cFLIP. Генерация нескольких вариантов cFLIP возможна за счѐт альтернативного сплайсинга, но только 3 из них экспрессируется на уровне белков: наиболее распространѐнный cFLIPL, cFLIP S и короткий вариант, клонированный из Bклеточной линии Raji, cFLIPR. Все изоформы имеют 2 эффекторных домена и могут привлекаться к комплексу DISC за счѐт взаимодействий DED:DED, однако лишь более длинный вариант содержит также каспазо-подобный домен. cFLIP L структурно очень схож с каспазой 8, однако не содержит каталитического цистеина в составе консервативного пентапептидного мотива QACRG или QACQG, а потому не обладает цистеин-протеазной активностью. Роль cFLIPS в ингибировании апоптоза, запускаемого рецептором смерти, достаточно хорошо исследована. Так, было показано, что cFLIPS блокирует процессинг и активацию каспазы-8 на комплексе DISC, вероятно, конкурируя за связывание и привлечение к FADD. Поскольку cFLIPR и cFLIPS структурно очень похожи, вполне вероятно, что оба этих белка ингибируют апоптоз, запускаемый с участием рецептора смерти, через сходные механизмы. С другой стороны, функция cFLIPL на комплексе DISC остаѐтся дискуссионной. Изначально, cFLIPL, как и cFLIPS, был описан как антиапоптотическая молекула, ингибирующая апоптоз, запускаемый рецептором смерти, препятствующая активации каспазы 8 на комплексе DISC. В самом деле, гиперэкспрессия cFLIPL приводит к привлечению cFLIP L и каспазы 8 к DISC, что сопровождается дефектным процессингом каспазы 8, в результате которого расщеплѐнные молекулы остаются связанными с DISC и не происходит генерация активной гетеродимерной формы. Кроме того, имеются сообщения, что cFLIPL, участвует в активации сигнальных путей, способствующих выживаемости клетки, таких как пути, регулируемые NF-κB и MAPK. Такой эффект, в случае обработки рецептора смерти, имеет место благодаря способности cFLIP L привлекать адаптерные белки, участвующие в этих сигнальных процессах. С другой стороны, cFLIPL может также проявлять проапоптотические свойства за 42 счѐт формирования гетеродимеров каспаза 8:cFLIPL, которые приводят к активации каспазы 8 на комплексе DISC. Гипотеза о проапоптотической роли cFLIPL в значительной степени подтверждается данными, что cFLIPL-дефицитные мыши проявляют тот же фенотип, что и мыши, дефицитные по каспазе 8 и по FADD, при этом все три этих белка необходимы для развития эмбриона. Более того, все 3 этих белка необходимы для пролиферации T-лимфоцитов и для выживания T- и B-лимфоцитов. Эти результаты позволяют заключить, что FLIPL имеет две функции: он может выступать как ингибитором, так и промотором активации каспаз, причѐм его роль обуславливается множеством фактором, включая уровень экспрессии и концентрацию в клетке по сравнению с каспазой 8 (Guicciardi and Gores, 2009). Количество активной каспазы 8 и, возможно, каспазы 10 в цитозоле клетки, по всей видимости, определяет сигнальные пути апоптоза, запускаемые комплексом DISC. Большие количества активной каспазы 8 запускают каскадный механизм активации каспаз за счѐт непосредственного эффекторных каспаз (таких как каспазы расщепления 3, 6 и 7), и активации которые, будучи активированными, расщепляют и деградируют важные белки клетки. С другой стороны, в случае малых количеств каспазы 8, запуск механизма клеточной смерти будет зависеть от расщепления проапоптотического белка Bid семейства BH3-only. После отщепления, фрагмент tBid транслоцируется в митохондрию, вызывая олигомеризацию проапоптотических, мультидоменных белков Bax или Bak семейства Bcl-2, которые, в свою очередь, принимают участие в митохондриальном пути клеточной смерти (Guicciardi and Gores, 2009). В последние годы стало очевидным, что череда событий, приводящих к передаче сигнала от рецепторов смерти, определяется формированием различных рецептор-адаптерных комплексов, которые могут быть разнесены в пространственном и временном плане. Внутри этих комплексов, белок RIP1 (receptor-interacting protein 1), представляющий собой серин/треониновую киназу, содержащую домен смерти, играет ключевую роль в переключении между сигналами выживания и смерти. RIP1 связывается как со всеми рецепторами 43 смерти, так и с содержащими домены смерти адаптерными молекулами, такими как FADD и TRADD, за счѐт взаимодействия с их собственными доменами смерти. После пост-трансляционных модификаций, RIP1 может запускать каскад, приводящий к смерти, либо давать сигнал выживания. К примеру, полиубиквитинилированная форма RIP1 требуется для TNF-опосредованной активации NF-κB, а фосфорилирование RIP1 играет существенную роль в активации ERK, но не в активации NF-κB или p38 MAPK. Напротив, деубиквитинилирование RIP1 приводит к усиленному формированию комплексов RIP1/FADD/каспаза 8, сопровождаемому активацией каспазы 8 и апоптозом. В процессе апоптоза, запускаемого рецептором смерти, киназа RIP1 расщепляется и инактивируется каспазой 8, что приводит к подавлению сигнала выживания, активируемого RIP1. центральным В довершении всего, RIP1 может также служить инициатором Fas-опосредованного некроза в клетках с отсутствующей каспазой 8 (Guicciardi and Gores, 2009; Vandenabeele et al., 2010). Все вышеперечисленные молекулы и механизмы являются общими для всех рецепторов смерти, детали процессов уникальны для каждого из рецепторов смерти. Некоторые из них, наиболее изученные, разобраны более детально ниже. 1.2.3. Рецептор TNF-R1 и его лиганд TNF-α Сигнальная система TNF/TNF-рецептор включает в себя два различных рецептора, TNF-R1 (p55/CD120a) и TNF-R2 (p75/CD120b), и 3 различных лиганда: мембранно-связанный TNF-α (mTNF-α), растворимый TNF-α (sTNF-α) и растворимый лимфоцитарный цитокин LTα (TNF-β). Однако лишь TNF-R1 считается классическим рецептором смерти, поскольку рецептор TNF-R2 не обладает внутриклеточным доменом смерти. TNFR1 экспрессируется всеми клетками и контролируется неиндуцируемым промотором, при этом уровень его экспрессии является сравнительно низким. Хотя и TNFR1, и TNFR2 взаимодействуют с обоими (мембранно-связанной и растворимой) формами TNFα, равно как и с лигандом LTα, оказалось, что именно TNFR1 играет важную роль в сигнальном пути, запускаемом TNF, в большинстве типов клеток. Исследования 44 на мышах, дефицитных по TNFR1, показали, что TNFR1 необходим для запуска апоптоза, индуцируемого TNF, в клетках, инфицированных патогенами. Фактор некроза опухоли-α (TNF-α) является классическим представителем суперсемейства TNFSF и играет ключевую роль как в воспалении и запуске иммунного ответа, так и в пролиферации и дифференцировке множества различных клеток-мишеней. Этот лиганд продуцируется, главным образом, макрофагами, моноцитами и T-лимфоцитами в ответ на инфицирование и воспалительные процессы. Помимо этого, он может продуцироваться и другими типами клеток, к примеру, B-лимфоцитами, фибробластами и гепатоцитами. И растворимая, и мембранно-связанная формы TNF-α являются биологически активными. При этом если растворимая форма играет роль эффекторной молекулы удалѐнно от клетки-продуцента, то мембранно-связанная форма скорее играет специфичную роль в локализованных ответах на TNF-α (Guicciardi and Gores, 2009). В зависимости от типа клеток, их состояния и микроокружения, белковый фактор TNF может стимулировать как выживаемость клеток, так и запуск в них двух механизмов запрограммированной клеточной смерти, апоптоза и некроптоза, что хорошо отражает сложную сеть путей и сигналов, которые могут запускаться через рецептор TNFR1 и приводить к различным конечным исходам. В частности, система контроля убиквитинилирования и инициаторные каспазы, такие как каспаза 8, играют роль молекулярных переключателей, определяющих путь протекания биологического ответа на активацию TNFR1 (Guicciardi and Gores, 2009). Нецитотоксический сигнальный путь: активация NF-κB, запускаемая TNF-R1. При отсутствии стимуляции белком TNF, субъединицы рецептора TNFR1 самопроизвольно группируются на плазматической мембране, образуя тримеры благодаря домену PLAD (pre-ligand assembly domain), локализованному во внеклеточном NH2-концевом, цистеин-богатом домене CRD1 (Cys-rich domain 1) рецептора (Chan et al., 2000). Хотя домен PLAD пространственно удалѐн от 45 домена CRD2, принимающего непосредственное участие во взаимодействии лиганда с рецептором, он критически важен для связывания с лигандом и функционирования рецептора. При связывании с лигандом, тримеры TNFR1 претерпевают конформационное изменение, в результате которого к цитозольной части рецептора привлекаются многочисленные белки, включая ассоциированный с TNFR1 домен смерти TRADD (TNFR-associated death domain), RIP1 (известный также как RIPK1), клеточные ингибиторы апоптоза 1 и 2 (cellular inhibitor of apoptosis 1 и 2; cIAP1, 2), TRAF2 (TNFR-associated factor 2) и TRAF5. Эта надмолекулярная структура, формируемая в непосредственной близости от мембраны, получила название «комплекс I». Ферменты cIAP1 и cIAP2, впервые охарактеризованные как партнѐры для связывания с TRAF1 и TRAF2 и выступающие в роли ингибиторов апоптоза, препятствующих активации каспаз, обладают убиквитин-лигазной активностью благодаря имеющемуся в них домену «RING finger» и, помимо того, способны к автоубиквитинилированию (Bertrand et al., 2008). Оба этих белка, и cIAP1, и cIAP2, обладают N-концевым доменом, содержащим бакуловирусные IAP повторы, благодаря которому способны привлекаться к комплексу I за счѐт TRAF2, стабилизирующему их за счѐт предотвращения их полиубиквитинилирования. cIAP1-2 непосредственно катализируют полиубиквитинилирование RIP1 по лизину в 63 положении (Lys63) (Bertrand et al., 2008). Киназа RIP1, убиквитинилированная в положении Lys63, становится платформой для формирования сигнальных комплексов, активирующих сигнальные пути, поддерживающие жизнеспособность клетки: к RIP1 привлекаются белки TAK1 (transforming growth factor-β-activated kinase 1), TAB2 (TAK1-binding protein 2) и TAB3, которые в виде комплекса TAK1-TAB2TAB3 играют роль инициатора стимуляции активационного пути канонического ядерного фактора-κB (NF-κB). NF-κB трансактивирует цитопротекторные гены и способствует выживаемости клетки. Однако не так давно были опубликованы результаты, согласно которым RIP1 не является абсолютно необходимым для активации NF-κB. В некоторых случаях комплекс I играет роль платформы для привлечения к плазматической мембране NADPH оксидазы NOX1, генерирующей 46 активные формы кислорода (ROS), что может служить причиной запуска некроптоза, одного из типов программируемой клеточной смерти. Более подробно механизм запуска некроптоза после стимуляции рецептора TNFR1 будет рассмотрен ниже. Таким образом, в зависимости от типа клеток и летального триггера, комплекс I может проявлять как цитопротекторные, так и цитотоксические свойства (за счѐт активации NF-κB или же привлечения NOX1, соответственно), играя роль регулятора сложной сети сигнальных путей, стимулирующих выживаемость или же вызывающих гибель клетки (Vandenaabeele et al., 2010). Цитотоксический сигнальный путь: активация апоптоза или некроптоза, запускаемая TNF-R1. После связывания рецептора TNFR1 с лигандом происходит интернализация рецептора и формирование цитозольного сигнального комплекса, индуцирующего смерть (death-inducing signaling complex, DISC), известного также как «комплекс II» и включающего в себя, как правило, TRADD, FADD, каспазу 8, RIP1 и RIP3 (известную также как RIPK3). Полиубиквитинилирование RIP1 не только влияет на активацию NF-κB, но и на переход от комплекса I к комплексу II. В случае деубиквитинилирования RIP1 за счѐт деубиквитинилирующего (по положению Lys63) фермента цилиндроматоза (Lys63-deubiquitylating enzyme cylindromatosis, CYLD), RIP1 вместе с родственной ему киназой RIP3 привлекаются к надмолекулярному комплексу, включающему TRADD, FADD (FAS-associated protein with a death domain) и каспазу 8, формируя комплекс II. В подтверждение этой модели служит тот факт, что нокдаун CYLD при помощи РНКинтерференции (RNAi) приводит к ингибированию запуска некроптоза, индуцируемого TNF. Всѐ ещѐ остаѐтся невыясненным, способствуют ли летальной активности киназы RIP1 другие деубиквитинилирующие ферменты, ингибирующие активацию NF-κB, включая A20 (известный также как TNFAIP3), cezanne (OTUD7B) и убиквитин-специфичную пептидазу 21 (USP21). Каспаза 8 в составе комплекса II инактивирует других участников комплекса, RIP1 и RIP3, за 47 счѐт их протеолитического расщепления и служит инициатором активации каспазного каскада, приводящего к апоптозу. При этом генетическое или фармакологическое ингибирование cIAPs предотвращает убиквитинилирование RIP1 и благоприятствует формированию комплекса II, тем самым способствуя RIP1-зависимой активации каспазы 8 и апоптозу. Напротив, в условиях дефицита каспазы 8, как и в случае еѐ ингибирования при помощи CrmA или фармакологических агентов, комплекс II теряет способность к запуску апоптоза, и лигирование TNFR1 приводит, по крайней мере в некоторых типах клеток, к программируемому некрозу. Остаѐтся до конца не выясненным, являются ли FADD или TRADD абсолютно необходимыми для формирования сигнального комплекса некроптоза, называемого также «некросомой». Отсутствие FADD делает некоторые типы клеток, включая лимфоцитарные Jurkat, более подверженными некротической клеточной смерти. В то же время, эмбриональные мышиные фибробласты (MEF), полученные из дефицитной по FADD мыши, оказались устойчивыми к некроптозу, запускаемому под действием TNF. И механизм TNF-индуцируемого апоптоза, и некроптоза (наблюдаемые в присутствии неспецифичного ингибитора каспаз Z-VAD.fmk) оказываются заблокированными в мышах, дефицитных по TRADD. Это свидетельствует, что, по крайней мере в отдельных случаях, TRADD (который, кроме того, участвует и в формировании комплекса I) играет роль незаменимого адаптерного белка, запускающего механизмы клеточной смерти. В то же время есть и примеры формирования комплекса II в отсутствии TRADD. В частности, TRADD не удаѐтся обнаружить в составе комплекса II, формируемого при лигировании TNFR1, в случае присутствия миметиков (химических агентов, блокирующих cIAPs за счѐт имитации активности SMAC, митохондриального ингибитора cIAP) «второго активатора каспаз митохондриального происхождения» (second mitochondria-derived activator of caspase или SMAC, известный также как DIABLO). Более того, нокдаун TRADD при помощи RNAi стимулирует (а не ингибирует) формирование комплекса II в некоторых типах клеток, что 48 свидетельствует в пользу того, что TRADD не является необходимым для сборки и функционирования комплекса II (Vandenabeele et al., 2010). Таким образом, если каспазная активность не заблокирована, то каспаза 8 запускает апоптоз, активируя классический каспазный каскад, в то же время расщепляя и инактивируя RIP1 и RIP3. Если же активность каспазы 8 заблокирована фармакологически или генетически, то RIP1 и RIP3 фосфорилируются и участвуют в запуске альтернативного механизма клеточной смерти, некроптоза (Vandenabeele et al., 2010). Рис. 2. Сигнальные пути, запускаемые при лигировании рецептора TNFR1 лигандом TNFα. a. Формирование комплекса I внутри клетки, на цитозольной части рецептора. b. Запуск апоптоза при участии активной каспазы-8 (caspase 8). c. Запуск некроптоза при наличии ингибиторов каспазы-8 (caspase 8 inhibitor). Рисунок адаптирован из статьи (Vandenabeele et al., 2010). 49 Итак, лигирование рецептора клеточной поверхности TNFR1 способно приводить к запуску трѐх путей: активации NF-κB, запуску апоптоза или запуску некроптоза в опухолевых клетках. 1.2.4. Рецептор Fas и его лиганд FasL Один из наиболее хорошо изученных путей апоптоза запускается при взаимодействии лигандов FasL с рецепторными субъединицами Fas на поверхности клетки. Fas (CD95) представляет собой рецептор клеточной поверхности, принадлежащий суперсемейству TNFR. В отсутствии лиганда рецепторные субъединицы Fas самопроизвольно ассоциируют, формируя тримеры, за счѐт присутствия домена PLAD в их внеклеточной части, что было продемонстрировано с использованием метода резонансного переноса энергии флуоресценции и проточной цитометрии (Siegel et al., 2000). Связывание с лигандом стабилизирует эти тримеры и вызывает в них конформационные изменения, приводя к привлечению цитозольных белков и формированию мультибелкового комплекса в цитозольном участке тримерного рецептора. Этому способствуют домены смерти – консервативные последовательности из 80 аминокислотных остатков, присутствующие во всех рецепторах смерти. Белки, привлекаемые к домену смерти Fas, включают в себя RIP1 (RIPK1), FADD, c-FLIP в различных изоформах, cIAPs, E3 убиквитин лигазы (ингибирующие апоптоз, препятствуя активации каспаз) и прокаспазу 8 (или 10). В результате формируется комплекс DISC, который принимает непосредственное участие в регуляции активности каспазы 8 (или 10) (Galluzzi et al., 2012). Fas экспрессируется в тех или иных количествах на поверхности всех типов клеток, при этом наиболее высоки его уровни экспрессии в клетках печени, сердца, почек, поджелудочной железы, мозга, тимуса, лимфоидных тканей и в активированных зрелых T-лимфоцитах. Несмотря на то что преимущественно Fas обнаруживается в мембрано-связанной форме на поверхности плазматической мембраны, альтернативный сплайсинг может также приводить и к образованию растворимых форм рецептора с отсутствующим трансмембранным доменом 50 (Cascino et al., 1995). При этом in vitro такие растворимые формы подавляют активацию мембрано-связанного Fas, возможно, из-за конкурентного связывания с FasL (Cheng et al., 1994; Guicciardi and Gores, 2009). 1.2.5. Рецепторы TRAIL-R и лиганд TRAIL Апоптоз-индуцирующий лиганд суперсемейства TNF (TNF-related apoptosisinducing ligand), известный также как TRAIL (Apo2L / TNFSF10), представляет собой цитокин, способный приводить к запуску апоптоза за счѐт связывания с одним из двух схожих по строению рецепторов смерти: TRAIL-R1 (DR4 / TNFRSF10A) и TRAIL-R2 (DR5 / TNFRSF10B). Рецептор TRAIL-R1 экспрессируется в клетках большинства тканей человеческого организма, включая селезѐнку, тимус, печень, а также в лейкоцитах периферической крови, активированных T-лимфоцитах, тонком кишечнике и в некоторых опухолевых клеточных линиях. Экспрессия TRAIL-R2 обнаруживается во всех типах клеток нормальных тканей, а также во всех опухолевых клеточных линиях; выше всего уровни его экспрессии в клетках селезѐнки, лейкоцитах периферической крови и активированных лимфоцитах. Исследования, проведѐнные на мышах, дефицитных по одному из TRAIL-рецепторов (в организме экспрессировался только один тип TRAIL-R), подтвердили роль TRAIL-R в качестве супрессора воспаления и метастазирования в различных тканях in vivo. Действительно, мыши с нокаутом по гену TRAIL-R проявляли повышенную чувствительность к метастазам, порождѐнных лимфомой и диэтилнитрозамин ( DEN)-индуцированной опухолью печени (Guicciardi and Gores, 2009). TRAIL способен также связываться с двумя другими рецепторами, так называемыми рецепторами-ловушками (―decoy receptors‖) TRAIL-R3 (DcR1 / TRID / LIT) и TRAIL-R4 (DcR2 / TRUNDD). Рецепторы-ловушки имеют сходство с TRAIL-R1 и TRAIL-R2 во внеклеточном и трансмембранном участках; однако у TRAIL-R3, представляющего собой гликозил-фосфатидил-инозитол-связанный (GPI-linked) рецептор плазматической мембраны, полностью отсутствует внутриклеточный домен, включая домен смерти, в то время как TRAIL-R4 51 содержит в себе усечѐнный, нефункциональный домен смерти. Связывание лиганда TRAIL с рецепторами-ловушками не вызывает апоптоза и, кроме того, может препятствовать апоптотическому сигналу, запускаемому при связывании TRAIL с TRAIL-R1 и TRAIL-R2. В самом деле, временная гиперэкспрессия рецепторов-ловушек TRAIL-R3 или TRAIL-R4 предотвращает апоптоз, запускаемый TRAIL, в некоторых нормальных и опухолевых клетках. Недавние исследования наводят на мысль, что рецепторы TRAIL-R3 и TRAIL-R4 ингибируют TRAIL-зависимый апоптоз за счѐт различных механизмов. Рецептор TRAIL-R3 локализуется внутри липидных рафтов, где он препятствует стимулируемому TRAIL-R2 формированию комплекса II (DISC). В свою очередь, TRAIL-R4 привлекается к комплексу II, сформированному с участием TRAIL-R2, за счѐт связывания с TRAIL, препятствуя тем самым привлечению, процессингу и активации инициаторных каспаз внутри комплекса II. Кроме того, имеется предположение, что TRAIL-R4 ингибирует TRAIL-зависимый апоптоз за счѐт активации NF-κB. TRAIL также способен связываться и ещѐ с одним, 5-ым, рецептором: растворимым рецептором остеопротегерином (OPG). Однако связывание TRAIL с этим рецептором характеризуется слабой аффинностью при физиологических температурах (Guicciardi and Gores, 2009). TRAIL обнаруживается во многих тканях в контексте мРНК, однако экспрессируется преимущественно клетками иммунной системы, в особенности естественными киллерными клетками (NK), естественными киллерными Tклетками (NKT) и макрофагами. Этот лиганд синтезируется в качестве трансмембранного белка II типа, при этом он может подвергаться протеолитическому расщеплению цистеиновыми протеазами с образованием растворимой формы. TRAIL проявляет биологическую активность в форме гомотримера, при этом цистеиновые остатки в положении 230 координируют ион цинка, необходимый для правильного сворачивания, ассоциации тримера и активности самого цитокина. TRAIL играет ключевую роль как в поддержании Tклеточного гомеостаза, так и в уничтожении опухолевых и трансформированных вирусом клеток клетками иммунитета NK и NKT (Guicciardi and Gores, 2009). 52 1.3. Белок Tag7 как представитель семейства PGLYRP Ген tag7 был впервые обнаружен в нашем институте в геноме мышей (Кустикова и др., 1996), а затем в Европе в геноме насекомых ( Kang et al., 1998). Продукт этого гена, белок Tag7 (известный также как PGRP-S/PGLYRP-1), был обнаружен в инкубационных средах клеток опухолевых линий CSML-0 и VMR- L (Kiselev et al., 1998). В результате анализа аминокислотной последовательности было установлено, что Tag7 является представителем семейства PGRPs (позднее переименованного в PGLYRPs) пептидогликан-распознающих белков (Kiselev et al., 1998; Kang et al., 1998). Белки семейства PGRPs имеют структурное сходство с лизоцимом бактериофага T7 и способны специфично узнавать MurNAc-пентапептидный фрагмент пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки практически всех известных бактерий и обеспечивающих структурную целостность, рост и выживаемость бактерий (Dziarski and Gupta, 2006). Узнавание пептидогликанов белками PGRPs приводит к запуску в бактериях механизмов, приводящих к их гибели. При этом PGRPs участвуют в обеспечении врождѐнного иммунитета и обнаружены в насекомых, моллюсках, иглокожих и млекопитающих, но отсутствуют в растениях и нематодах (Dziarski and Gupta, 2006). В насекомых белки семейства PGRPs являются сами по себе сигнальными рецепторами, способными узнавать пептидогликаны, а также способны действовать через Toll-рецепторы (Michel et al., 2001), участвуя в антимикробной активности. В плодовой мушке Drosophila melanogaster сигнальный путь через Toll-рецептор запускается, главным образом, в ответ на инфицирование грибами и грамположительными бактериями (Hoffmann, 2003). В случае инфицирования грамотрицательными бактериями, активируется сигнальный путь Imd (от immune deficiency, по названию гена imd, мутация в котором блокирует сигнальный путь) (Hoffmann, 2003). В млекопитающих представители семейства PGRPs подобной функциональности не обнаруживают. В организме млекопитающих обнаружено 4 белка семейства PGRPs: PGLYRP-1, PGLYRP-2, PGLYRP-3 и PGLYRP-4 53 (изначально названные PGRP-S, PGRP-L, PGRP-Iα и PGRP-Iβ) (Kang et al., 1998; Liu et al., 2001). При этом PGLYRP-1, PGLYRP-3 и PGLYRP-4 проявляют бактерицидное действие, а PGLYRP-2 представляет собой N-ацетилмурамоил-Lаланин амидазу, способную гидролизовать пептидогликан. Эти белки, подобно антибактериальным лектинам, способны распознавать пептидогликаны клеточной стенки бактерий, вызывая их гибель, однако механизм запуска клеточной смерти до недавнего времени оставался неизвестным. Cовсем недавно был установлен механизм запуска клеточной смерти в бактериях под действием PGRPs (Kashyap et al., 2011; Kietzman and Tuomanen, 2011). В случае грамположительных бактерий на примере Bacillius subtilis было показано, что белки PGRPs связываются с клеточной стенкой вблизи участка отделения дочерней клетки, активируя двухкомпонентную сигнальную систему CssR-CssS, способную обнаруживать и ликвидировать неправильно свѐрнутые белки, которые внеклеточное обычно пространство. экспортируются Такая из активация бактериальных приводит клеток во к деполяризации клеточной мембраны, остановке внутриклеточного синтеза пептидогликана, белков, РНК и ДНК и продукции и накоплению гидроксильных радикалов, вызывающих бактериальную смерть. В случае грамотрицательных бактерий на примере Escherichia coli было показано, что белки PGRPs связываются с внешней мембраной клетки, активируя двухкомпонентную сигнальную систему CpxACpxR, которая функционально гомологична системе CssR-CssS. В результате происходит остановка всех ключевых процессов биосинтеза в бактериальной клетке: биосинтеза компонент клеточной стенки, белков, ДНК и РНК. Кроме того, происходит деполяризация бактериальной мембраны, приводящая к потере протондвижущей силы, которая важна для выработки энергии и транспорта. Помимо этого, происходит накопление гидроксильных радикалов, вызывающих интоксикацию клетки. Схематически цитотоксические процессы, запускаемые в грамположительных и грамотрицательных бактериях, представлены на рисунке 3 (Kashyap et al., 2011; Kietzman and Tuomanen, 2011; Dziarski et al., 2012). 54 Рис. 3. Цитотоксические процессы, запускаемые в бактериях под действием PGRPs. Рисунок адаптирован из статьи (Dziarski et al., 2012). В составе Tag7/PGLYRP1 имеется высоко консервативный пептидогликансвязывающий участок, а также более вариабельный участок, участвующий в белок-белковом взаимодействии (Guan et al., 2005). В организме человека Tag7 экспрессируется в костном мозге (Kang et al., 1998), а также присутствует в гранулах полиморфноядерных лейкоцитов (Dziarski and Gupta, 2006). Мыши, не экспрессирующие PGLYRP1, более подвержены инфицированию грамположительными бактериями (Dziarski et al., 2003). 1.4. Цитотоксический белковый комплекс Tag7-Hsp70 При открытии гена Tag7 в мышах было обнаружено, что инкубационная среда клеток опухолевой линии VMR-0, трансфецированных геном tag7, вызывает клеточную смерть в культуре L-929, при этом цитотоксический эффект блокировался при добавлении поликлональных антител к Tag7 (Kiselev et al., 1998). Авторами также была обнаружена корреляция между обнаруженным цитотоксическим эффектом и клеточной смертью, индуцируемой воздействием цитокина TNF на клетки линии L-929, в связи с чем было высказано предположение, что белок Tag7 индуцирует клеточную смерть, действуя по аналогии с цитокинами суперсемейства TNF (Kiselev et al., 1998). Как уже 55 отмечалось выше, после анализа аминокислотной последовательности выяснилось, что белок Tag7 принадлежит семейству PGRP пептидогликанраспознающих белков, обнаруживая сходство с лизоцимом бактериофага T7, при этом практически не обнаруживается гомологии с TNF, а потому представляется удивительным, чтобы этот белок вызывал клеточную смерть аналогично TNF, взаимодействуя с рецептором TNFR1. Ранее в нашей лаборатории было показано, что белок Tag7 способен взаимодействовать с белком теплового шока Hsp70, формируя стабильный белковый комплекс Tag7-Hsp70 in vitro (Sashchenko et al., 2004). Этот комплекс проявляет цитотоксическую активность в отношении различных опухолевых клеточных линий. Добавление Tag7-Hsp70 в концентрации 1 нМ к культуре клеток L-929 приводит к гибели 30% клеток спустя 24 ч инкубации клеток с комплексом. Кроме того, было установлено, что при контакте HLA- отрицательных опухолевых клеток линии K-562 с CD8+ ЛАК-клетками, последние секретируют в зону контакта комплекс Tag7-Hsp70 (Sashchenko et al., 2004). Была также обнаружена субпопуляция цитотоксических лимфоцитов CD4+CD25+, экспрессирующая мембраносвязанные Tag7 и FasL на своей поверхности и способная убивать HLA-отрицательные клетки опухолевых линий CSML-0 и MOLT-4, экспрессирующие Hsp70 и Fas (Dukhanina et al., 2009). 1.5. Белок-шаперон Hsp70 Человеческий белок теплового шока молекулярной массой 70 кДа, Hsp70/HSP70-1A (известный также как HSPA1A/HSP72/HSP70-1/HSP70I/HSPA1, GenBankTM accession number NM_005345) представляет собой широко распространѐнный молекулярный шаперон семейства Hsp70s. Белки этого семейства участвуют во множестве биологических процессов, включая регуляцию укладки полипептидной цепи, деградацию белков, транслокацию белков через мембраны и белок-белковые взаимодействия (Kampinga and Craig, 2010). Hsp70 включает в себя два основных функциональных домена: N-концевой нуклеотидсвязывающий домен, обладающий АТФазной активностью, и C-концевой пептид- 56 связывающий домен. АТФазный и пептид-связывающий домены в составе Hsp70 связаны между собой через короткий и гибкий гидрофобный линкер, который, повидимому, участвует в выборе белка-субстрата (Bertelsen et al., 2009). В АТФсвязанном состоянии два домена в составе Hsp70 сближаются, что, как полагают, приводит к открытию молекулярной «крышки» из α-спиралей в C-концевом домене, упрощая как вход белка-субстрата в пептид-связывающий участок, так и выход из него (Kampinga and Craig, 2010). В клетках E. coli в роли классического белка-шаперона семейства Hsp70 выступает DnaK, играя роль бактериального аналога человеческого Hsp70-1A. Как и другие представители Hsp70, DnaK имеет в своѐм составе два домена: Nконцевой нуклеотид-связывающий домен (Mr = 44 кДа), обладающий АТФазной активностью, и субстрат-связывающий домен (Mr = 25 кДа), содержащий субстрат-связывающий участок. При этом, если для человеческого Hsp70-1A получены лишь отдельные структуры каждого из двух доменов, АТФсвязывающего и пептид-связывающего, в комплексе с соответствующими субстратами, то в случае E. coli совсем недавно опубликована работа, где приводится структура полноразмерного DnaK в комплексе с АДФ и пептидом NRLLLTG, полученная в водном растворе с использованием метода ЯМР на основе имеющихся кристаллических структур изолированных НСД и ССД. На основе данных динамики было установлено, что гибкая связь между НСД и ССД осуществляется за счѐт спирали, позволяющей им перемещаться в пределах конусообразной области на ±35° друг относительно друга ( Bertelsen et al., 2009). Шаперонный цикл с участием Hsp70 В шаперонном цикле белки семейства Hsp70 всегда участвуют вместе с кофакторами: в роли неизменного партнѐра Hsp70 выступает белок из семейства J-белков (известного также как семейство DnaJ/Hsp40), а также в большинстве случаев белок из семейства NEF (GrpE в случае бактериального DnaK; Bag, HspBP1 или Hsp110 в случае эукариотического цитозольного Hsp70). Два этих 57 кофактора являются ключевыми, поскольку они регулируют связывание Hsp70 с белками-субстратами, регулируя взаимодействие между Hsp70 и нуклеотидами. На основе исследований по восстановлению укладки денатурированных белков, проведѐнных in vitro, предложена следующая модель шаперонной реакции при участии Hsp70 (Hartl and Hayer-Hartl, 2009). Сначала белок Hsp40 семейства J-белков связывается с белком-субстратом за счѐт своего пептидсвязывающего домена, после чего привлекает комплекс Hsp70-АТФ за счѐт своего домена J. Белок-субстрат быстро, но кратковременно взаимодействует с «открытым» пептид-связывающим участком Hsp70. Далее происходит гидролиз АТФ с высвобождением фосфатной группы, что приводит к изменению конформационного состояния Hsp70, в результате которого пептид-связывающий участок переходит в «закрытое» состояние за счѐт закрытия в нѐм пептидсвязывающей щели, представляющей собой β-сэндвич, «крышкой» из α-спиралей, при этом усиливается взаимодействие между Hsp70 и белком-субстратом, после чего Hsp40 покидает комплекс. В гидролизе АТФ принимает участие как домен J Hsp40, так и белок-субстрат, в результате образуется комплекс АДФ-Hsp70-белок. После гидролиза АТФ различные белки семейства NEFs (факторы обмена нуклеотидов), имеющие большее сродство к АДФ-Hsp70, чем к АТФ-Hsp70, связываются с АТФазным доменом Hsp70, содержащем молекулу АДФ в своѐм АТФ-связывающем участке, катализируя переход АДФ-АТФ и тем самым приводя к открытию молекулярной «крышки» и высвобождению субстрата на завершающем этапе шаперонного цикла. После этого происходит диссоциация АДФ за счѐт изменения конформации АТФ-связывающего участка, после чего новая молекула АТФ связывается с Hsp70. Белок-субстрат при этом диссоциирует из комплекса, поскольку обладает низким сродством к Hsp70-АТФ. В клетке концентрации АТФ всегда значительно выше, чем концентрации АДФ, что служит благоприятствующим фактором для ко нкурентного связывания именно АТФ с АТФ-связывающим участком Hsp70. В случае, если белок не принял нативное состояние после шаперонного цикла, Hsp40 вновь связывается с его гидрофобными участками и шаперонный цикл повторяется. Схематически 58 шаперонный цикл при участии Hsp70 представлен на рисунке 4 (Kampinga and Craig, 2010; Hartl and Hayer-Hartl, 2009). Рис. 4. Шаперонный цикл с участием Hsp70. ATP – АТФ, ADP – АДФ, NEF – фактор обмена нуклеотидов, N – нативное состояние, chaperonin – шаперон, Pi – фосфат. 1) Доставка белка-субстрата при участии Hsp40 к Hsp70, содержащему АТФ в АТФ-связывающем домене; в результате формируется комплекс АТФ-Hsp70-Hsp40-субстрат. 2) Гидролиз АТФ до АДФ, катализируемый Hsp40, приводит к закрытию «крышки» из α-спиралей и усиливает взаимодействие между Hsp70 и субстратом. Hsp40 диссоциирует из комплекса с Hsp70. 3) Диссоциация АДФ из АТФ-связывающего домена Hsp70, катализируемая NEF. 4) Связывание АТФ с Hsp70 приводит к открытию α-спиральной крышки и высвобождению белка-субстрата. 5) После выхода из комплекса с Hsp70 белок-субстрат либо проходит фолдинг до нативного состояния, либо участвует в дальнейшем цикле шаперонных реакциях с белками - шаперонинами или шапероном Hsp90, либо вновь участвует в шаперонном цикле с Hsp70. Рисунок адаптирован из статьи (Hartl F.U. and Hayer-Hartl M., 2009). Hsp70 присутствует в повышенных концентрациях в опухолевых клетках по сравнению с обычными, защищая опухолевые клетки от широкого диапазона летальных триггеров за счѐт различных механизмов, в частности, участвуя в активации сигнального пути JNK, выходе AIF из митохондрии и транслокации AIF в ядро клетки. Hsp70 локализуется на мембранах лизосомных и эндосомных 59 компартментов опухолевых клеток, способствуя выживанию за счѐт ингибирования проницаемости лизосомальных мембран (Tanimura et al., 2007). Помимо своей роли классического белка-шаперона, Hsp70 может проявлять цитопротекторную функцию, участвуя в ингибировании клеточной смерти. К примеру, клеточная смерть, индуцируемая TNF, может подавляться в опухолевых клетках линии WEHI-S при гиперэкспрессии Hsp70 (Jäättelä M. et al., 1992). Кроме того, для опухолевых клеток линии PEER (T-клеточная лейкемия человека) было показано, что Hsp70 способен ингибировать апоптоз за счѐт блокировки активации Jun N-терминальной киназы что, в свою очередь, препятствует фосфорилированию c-Jun за счѐт JNK и, таким образом, ингибирует передачу сигнала апоптоза по этому пути (Gabai et al., 1997). Было также показано, что в том же самом сигнальном пути гиперэкспрессия Hsp70 приводит к ингибированию протеолитической активации каспазы-3, финального эффектора апоптоза, препятствуя расщеплению неактивной прокаспазы и, таким образом, защищая опухолевые клетки от гибели по пути апоптоза (Mosser et al., 1997). Кошапероны Hsp70 К представителям белков-кошаперонов семейства NEF у эукариот относятся белки Bag, HspBP1 и Hsp110. Как уже было сказано, роль белков NEF заключается в том, что после гидролиза АТФ, на финальном этапе шаперонного цикла, они связываются с АТФазным доменом Hsp70, катализируя переход АДФАТФ, что вызывает открытие α-спиральной «крышки» и выходу субстрата из пептид-связывающего участка Hsp70. Таким образом, белки NEF принимают активное участие в регуляции АТФазной активности Hsp70, тем самым контролируя сродство Hsp70 к белку-субстрату. При этом недавно описанные эукариотические белки-кошапероны семейства Hsp110 сами по себе являются гомологами Hsp70 и, таким образом, помимо участия в роли катализаторов нуклеотидного перехода могут кооперировать с традиционными белками Hsp70 в процессе укладки белков. Такая кооперация может обеспечивать функциональное координирование между многочисленными 60 молекулами, связанными с Hsp70, и упрощать фолдинг белков, обладающих сложной доменной топологией (Hartl and Hayer-Hartl, 2009). В рамках настоящий работы для нас больший интерес представлял другой кошаперон Hsp70, белок HspBP1. 1.6. Белок HspBP1 – кошаперон Hsp70 Первоначально HspBP1 (от Hsp70-binding protein 1) был обнаружен как белок, взаимодействующий с Hsp70, при скрининге библиотеки кДНК человеческого сердца с использованием генетического метода дрожжевой двугибридной системы (Raynes and Guerriero, 1998). Авторами было показано, что HspBP1 способен связываться с АТФазным доменом Hsp70, препятствуя связыванию АТФ с Hsp70. В результате блокируется шаперонный цикл с участием Hsp70 и ингибируется процесс ренатурации неправильно свѐрнутых белков, как это было продемонстрировано на примере белка люциферазы (Raynes and Guerriero, 1998). Связывание HspBP1 с N-концевым доменом Hsp70 ускоряет обмен нуклеотидов в АТФ-связывающем участке и ослабляет взаимодействие пептид-связывающего участка Hsp70 с белком-субстратом (Shomura et al., 2005). За счѐт влияния на функциональность классического белка-шаперона Hsp70, HspBP1 способен препятствовать нормальному сворачиванию вновь синтезированных белков, а также частично денатурированных белков, и понижать устойчивость опухолевой клетки к апоптозу. Белок HspBP1 является весьма распространѐнным в различных клетках. Этот белок обнаруживается в клетках многих опухолевых клеточных линий, в опухолях, в человеческих лимфоцитах и в сыворотке крови, а уровни его экспрессии выше уровней экспрессии Hsp70 как в нормальных, так и в опухолевых клетках. Вместе с тем, опухолевые клетки с высоким молярным соотношением HspBP1/Hsp70 проявляют большую чувствительность к противоопухолевым препаратам, чем клетки с низким соотношением, при этом эктопическая экспрессия HspBP1 усиливает гибель опухолевых клеток под действием противоопухолевых препаратов, в то время как устранение 61 эндогенного HspBP1 методом РНК-интерференции повышает их устойчивость к воздействию этих препаратов (Tanimura et al., 2007). Авторы показали, что эктопическая экспрессия HspBP1 в клетках HeLa S3 способствует проницаемости лизосомальных мембран под действием противоопухолевых препаратов, детектируемой по выходу катепсинов B и L из лизосом в цитозоль, повышая уровень катепсин-опосредованной клеточной смерти (Tanimura et al., 2007). Таким образом, в физиологических условиях HspBP1 способен выступать в роли ингибитора защитной функции Hsp70, делая опухолевые клетки более чувствительными к действию противоопухолевых препаратов. Кроме того, HspBP1 обнаруживается и во внеклеточном пространстве, при этом о его внеклеточной роли ведутся активные дискуссии. Установлено, что HspBP1 может секретироваться в комплексе с Hsp70 клетками, подвергшимися тепловому стрессу либо культивируемыми в присутствии ингибитора фосфолипазы C, однако механизмы, вызывающие появление внеклеточного HspBP1, по-прежнему до конца не выяснены (Evdonin et al., 2009). Имеются данные, что после связывания с поверхностными белками клеток опухоли мозга внеклеточный HspBP1 способен интернализоваться внутрь целевых клеток (Graner et al., 2009). 62 2. Результаты и обсуждение 2.1. Влияние белка HspBP1 на цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp70. 2.1.1. Клетки CSML-0 секретируют и Tag7, и HspBP1. В лаборатории «Молекулярной иммуногенетики рака», где и проводилась настоящая работа, было обнаружено, что белок HspBP1, который является кошапероном Hsp70, способен взаимодействовать не только c Hsp70, но и с Tag7 in vitro. Такое взаимодействие препятствует формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70. При этом для восстановления цитотоксической активности необходимо добавить Hsp70 в концентрации, превышающей в 5 раз концентрацию Tag7-HspBP1. Для выяснения, имеет ли взаимодействие между Tag7 и HspBP1 физиологическую важность, анализировалось взаимодействие между Tag7 и HspBP1, выделяемых клетками. Известно, что Tag7 – это секреторный белок, который может выделяться лимфоцитами и представителями некоторых линий опухолевых клеток. Относительно выделения белков Hsp70 и HspBP1 во внеклеточную среду известно значительно меньше. Сравнительно недавно было показано, что клетки могут выделять эти белки при попадании в стрессовую ситуацию ( Evdonin et al., 2009). Кондиционные среды опухолевых клеток различных линий исследовались на наличие в них экзогенного HspBP1. Клетки культивировались в течение 24 ч в стрессорных условиях голодания в бессывороточной среде. После этого кондиционная среда отбиралась, осаждалась в ТХУ и анализировалась на наличие HspBP1 при помощи вестерн-блоттинга. В результате такого анализа было обнаружено, что в кондиционной среде клеток линии CSML-0 присутствует HspBP1 (рис. 1А). Поскольку ранее было показано, что клетки CSML-0 способны секретировать Tag7 (Коробко и др., 1998), мы выясняли, не могут ли белки Tag7 и HspBP1 образовывать в кондиционной среде клеток CSML-0 комплекс Tag7HspBP1. 63 Кондиционная среда клеток CSML-0 наносилась на колонки с иммобилизованными антителами к Tag7 и к HspBP1, после чего специфично связавшиеся фракции разделялись при помощи SDS-PAGE и анализировались методом вестерн-блоттинга (рис. 1Б). При этом и Tag7, и HspBP1 детектировались в связавшейся фракции каждой из колонок, что свидетельствует о формировании комплекса Tag7-HspBP1 в кондиционной среде клеток CSML-0. В то же время Hsp70 не связывался ни с первой, ни со второй колонкой, указывая на то, что кондиционная среда клеток CSML-0 не содержит ни комплекса Tag7-Hsp70, ни комплекса Hsp70-HspBP1. Рис. 1. Анализ кондиционных сред клеток различных опухолевых линий. А. Кондиционные среды клеток (по 50 мкл) осаждались в 7% ТХУ, после чего анализировались методом вестерн-блоттинга с использованием антител к HspBP1. Б. Кондиционная среда клеток CSML-0 иммунопреципитировалась на колонках с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7 и к HspBP1. Белки связавшейся фракции анализировались методом вестернблоттинга с использованием антител к Tag7, к Hsp70 и к HspBP1. Было интересно выяснить, образуется ли комплекс Tag7-HspBP1 внутри клетки или же клетка выделяет каждый из белков отдельно, а комплекс формируется уже в кондиционной среде. С помощью конфокального микроскопа было установлено, что и Tag7, и HspBP1 равномерно распределены по цитоплазме клетки, при этом 64 мы не обнаружили организованных гранулярных структур с признаками колокализации этих двух белков (Рис. 2). Можно предположить, что белки Tag7 и HspBP1 секретируются отдельно, а комплекс образуется за пределами клетки. Рис. 2. Локализация белков Tag7 и HspBP1 в клетке CSML-0. Tag7 окрашен зелѐным цветом, HspBP1 – красным. Правая картинка соответствует наложению двух сигналов: от Tag7 и от HspBP1. Фотографии получены при помощи конфокального микроскопа фирмы Leica (Wetzlar, Germany) при 100-кратном увеличении. HspBP1 препятствует формированию цитотоксического Tag7-Hsp70. Кондиционная среда клеток CSML-0, полученная при культивировании клеток в отсутствии сыворотки, не проявляла цитотоксической активности по отношению к клеткам опухолевой линии L-929. Мы решили проверить, может ли титрование этой кондиционной среды белком Hsp70 привести к появлению цитотоксичности, как это было показано ранее для рекомбинантного комплекса. Для этого определялась концентрация комплекса Tag7-HspBP1 в кондиционной среде клеток CSML-0 следующим образом. Была приготовлена иммуноадсорбционная колонка с иммобилизованными на сефарозе антителами к белку Tag7, на которой проводилось разделение кондиционной среды, после чего колонка тщательно отмывалась от неспецифично связавшихся белков, а связавшаяся фракция элюировалась триэтиламином, pH 12, после чего концентрация белка измерялась по методу Бредфорд. Поскольку ранее мы установили, что в кондиционной среде CSML-0 белки Tag7 и HspBP1 всегда 65 присутствуют в виде комплекса Tag7-HspBP1 (рис. 1Б), то концентрацию Tag7HspBP1 рассчитывали в предположении эквимолярной концентрации белков в связавшейся фракции. Далее кондиционная среда клеток CSML-0 инкубировалась с двумя различными концентрациями Hsp70: эквимолярной (10 -9 М) и 5-кратной (5×10-9 М) по отношению к концентрации Tag7-HspBP1. При эквимолярной концентрации Tag7-HspBP1 и Hsp70 цитотоксическая активность кондиционной среды оставалась низкой, менее 5%, однако при 5-кратном избытке Hsp70 цитотоксическая активность резко возрастала, превышая 25%. При этом цитотоксическая активность блокировалась при добавлении антител как к Tag7, так и к Hsp70 (рис. 3). Рис. 3. Изменение цитотоксической активности кондиционной среды (супернатанта) клеток CSML-0 при добавлении Hsp70. Слева направо: супернатант CSML-0, содержащий ~10-9 М комплекса Tag7-HspBP1; супернатант, к которому добавлен Hsp70 в эквимолярной концентрации (10-9 М); супернатант, к которому добавлен Hsp70 в 5-кратной концентрации (5×10-9 М); супернатант, к которому добавлены антитела к Hsp70 и Hsp70 в 5-кратной концентрации; супернатант CSML-0, к которому добавлены антитела к Tag7 и Hsp70 в 5кратной концентрации. Антитела к Tag7 и к Hsp70 добавлялись за 30 мин до добавления белков. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. 66 Эти результаты позволяют предположить, что белок Hsp70 способен вытеснять белок HspBP1 из комплекса Tag7-HspBP1 за счѐт конкурентного связывания с белком Tag7, так же, как это было показано ранее для рекомбинантного комплекса, при этом формируется цитотоксически активный комплекс Tag7Hsp70. Сама по себе кондиционная среда CSML-0 в нашем опыте не обладала цитотоксической активностью, поскольку в ней Tag7 присутствовал не в составе цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70, а в составе неактивного комплекса Tag7-HspBP1. Не исключено, что при выращивании клеток CSML-0 в других физиологических условиях – при добавлении сыворотки или в условиях теплового стресса – кондиционная среда этих клеток будет содержать белок Hsp70 в концентрациях, достаточных для формирования комплекса Tag7-Hsp70, проявляющего цитотоксическую активность. HspBP1 связывается с Tag7 в сыворотке крови человека Для выяснения биологической значимости формирования белкового комплекса Tag7-HspBP1 мы решили установить, может ли Tag7-HspBP1 формироваться in vivo. В качестве материала для анализа мы выбрали сыворотку крови человека. Известно, что белки Hsp70 и HspBP1 присутствуют в составе сыворотки человека, при этом концентрация HspBP1 возрастает при повышении мышечной нагрузки (Grebenyuk et al., 2010). О присутствии же Tag7 в сыворотке человека данных не было. Мы выясняли, присутствует ли Tag7 в составе сыворотки и, если присутствует, вступает ли он во взаимодействие с белками Hsp70 и HspBP1. Белки сыворотки адсорбировались на иммуноадсорбционной колонке с иммобилизованными антителами к Tag7, связавшиеся белки анализировались методом вестерн-блоттинга. В результате Tag7 и HspBP1 были обнаружены в сыворотке каждого 3-его из 9 обследованных доноров, при этом Tag7 всегда обнаруживался в комплексе с HspBP1 (рис. 4). Эти же данные были подтверждены хроматографией тех же самых образцов на колонке с иммобилизованными антителами к HspBP1: Tag7 был обнаружен во фракциях, связавшихся с колонкой (рис. 4). 67 Рис. 4. Присутствие комплекса Tag7-HspBP1 в сыворотке человеческой крови. Белки сыворотки наносились на колонки с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7, к HspBP1 и к Hsp70. Белки связавшейся фракции в каждом случае анализировались при помощи вестерн-блоттинга с использованием антител к Tag7, к Hsp70 и к HspBP1. Таким образом, HspBP1 может связываться с Tag7 как in vitro, так и в кондиционных средах опухолевых клеток и в сыворотке крови человека. Tag7 был обнаружен у 30% обследованных доноров, но мы нигде не обнаружили свободного Tag7: он всегда находился в комплексе с HspBP1. В этом можно увидеть ещѐ один механизм ингибиторного действия HspBP1 на цитотоксическую активность комплекса Tag7-Hsp70: связываясь с Tag7, HspBP1 препятствует формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70, и в этом случае только повышенная концентрация Hsp70 может приводить к созданию такого комплекса. Можно предположить, что таким образом контролируется цитотоксическое воздействие Tag7-Hsp70 на клетки организма: несмотря на то, что цитотоксическое действие Tag7-Hsp70 специфично в отношении опухолевых клеток, не исключено, что накопление и длительная циркуляция этого комплекса в крови могут привести к повреждению и гибели лимфоцитов и клеток эпителия сосудов. 68 2.2.Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7Hsp70. Исследование кинетики цитотоксических процессов, запускаемых в клетках L-929 под действием Tag7-Hsp70. Далее мы исследовали, как осуществляется передача цитотоксического сигнала в клетки L-929 при их контакте с белковым комплексом Tag7-Hsp70. Следовало установить: 1) какие процессы, приводящие клетку к гибели, активируются под действием исследуемого комплекса; 2) участвует ли в передаче цитотоксического сигнала рецептор клеточной поверхности или же Tag7-Hsp70 попадает в клетку путѐм эндоцитоза, после чего активирует комплекс реакций, приводящих к клеточной гибели. При исследовании кинетики цитотоксического действия Tag7-Hsp70 мы обнаружили, что добавление Tag7-Hsp70 к инкубационной среде клеток опухолевой линии L-929 приводит к появлению двух пиков гибели в культуре: один из пиков наблюдался через ~3 ч, а другой – через ~18-24 ч после добавления белкового комплекса. Известно, что в клетках L-929 классический цитокин TNF-α способен запускать два альтернативных механизма клеточной смерти: апоптоз и некроптоз. При этом первый механизм развивается очень быстро, в течение 1-3 ч, а второй развивается значительно медленнее. В связи с этим мы решили сравнить цитотоксическое действие нашего комплекса Tag7-Hsp70 с цитотоксическим действием TNF-α на опухолевые клеточные линии по двум параметрам: субстратной специфичности и характеру запускаемых цитотоксических процессов. Для сравнения субстратной специфичности Tag7-Hsp70 и TNF-α исследовался цитотоксический эффект, наблюдаемый при добавлении каждого из этих агентов к клеткам опухолевых линий L-929, Jurkat и HeLa спустя 20 ч инкубации. В результате было обнаружено, что Tag7-Hsp70 проявляет такую же, как и TNF-α, 69 специфичность в отношении различных опухолевых клеток-мишеней: клетки L929 и Jurkat оказались хорошими мишенями, проявляя до 30 % гибели в популяции, а клетки HeLa – плохими, с гибелью менее 5 % спустя 20 ч инкубации с цитотоксическим агентом (рис. 5). Рис. 5. Цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp70 и цитокина TNF-α на различные опухолевые клеточные линии. Каждый из цитотоксических белковых агентов, Tag7-Hsp70 и TNF-α, добавлялся к инкубационным средам клеток линий L-929, Jurkat и HeLa до конечной концентрации 10 -9 М, после чего клетки инкубировались на протяжении 20 ч. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. Сравнение кинетики цитотоксического действия Tag7-Hsp70 и TNF-α на клетки L-929 также обнаружило аналогию: кривые зависимости величины клеточной смерти от времени инкубации клеток с цитотоксическим агентом коррелируют, при этом в каждом случае обнаруживается 2 пика цитотоксической активности: через ~3 ч и через ~18-24 ч (рис. 6). Можно предположить, что и под действием Tag7-Hsp70, и под действием TNF-α в клетках активируются сходные механизмы цитотоксичности. 70 Рис. 6. Кинетика цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и цитокина TNF-α на клетки опухолевой линии L-929. Клетки L-929 инкубировались с Tag7Hsp70 (10-9 М) или с TNF-α (10-9 М). Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. Мы обратили внимание, что в культуре L-929 клеточная смерть под действием Tag7-Hsp70 не превышала 25 %. Этот факт может объясняться гетерогенностью клеток-мишеней по отношению к цитотоксическому действию белкового агента: известно, что генетически гомогенные клеточные линии, выделенные из тканевых культур, могут содержать субпопуляции, обладающие разной чувствительностью к действию цитотоксических агентов. Так, было показано, что культура клеток линии L-929, чувствительная к цитотоксическому действию TNF-α, может содержать в своѐм составе клетки, устойчивые к TNF-α (Vanhaesebroeck et al., 1991). Авторы получили отдельные клоны клеток, которые были названы L929r1 71 и L929r2, устойчивые к цитолизу под действием TNF-α. При этом резистентность клона L929r1 была обусловлена отсутствием на поверхности клеток соответствующего рецептора, а резистентность клона L929r2 – нарушением внутриклеточного пути передачи цитотоксического сигнала. Нелинейный характер кривой, отражающей зависимость величины клеточной смерти от времени инкубации клеток с комплексом Tag7-Hsp70, а также дискретность цитотоксического действия комплекса позволяют предположить, что и в нашем случае в культуре L-929 присутствует по меньшей мере две субпопуляции клеток, в каждой из которых под действием Tag7-Hsp70 запускается свой механизм передачи цитотоксического сигнала, приводя к клеточной гибели через соответствующий временной интервал. Используя метод предельного разведения, нам удалось получить отдельные клоны клеток L-929: был получен клон L-929s1, который проявлял гибель только в течение первых 4 ч, а также клон L-929s2, который проявлял гибель не ранее чем после 16 ч инкубации с Tag7-Hsp70 (рис. 7). Уровни гибели клеток в этих клонах были существенно выше, чем в клетках гетерогенной популяции, как видно из графиков на рисунке 7. Кроме того, некоторые клоны оказались устойчивыми к цитотоксическому действию Tag7-Hsp70 (L-929r на рис. 7). Но при культивировании клонов, высокочувствительных к цитотоксическому действию Tag7-Hsp70, через 7-10 дней их чувствительность по отношению к комплексу снижалась, видимо, отражая возникновение в культуре признаков гетерогенности, что сильно затрудняло воспроизводимости работу результатов. с этими Такое же клонами снижение и препятствовало чувствительности отобранных клонов к цитотоксическому действию цитокина TNF-α можно встретить в литературе (Vanhaesebroeck et al., 1991). В результате в дальнейших исследованиях мы использовали стабильную культуру клеток L-929 с относительно низким цитотоксическим эффектом, наблюдаемым при добавлении Tag7-Hsp70, но с высокой воспроизводимостью результатов. 72 Рис. 7. Чувствительность различных клонов клеток опухолевой линии L-929 к цитотоксическому действию белкового комплекса Tag7-Hsp70 в сравнении с чувствительностью клеток гетерогенной культуры. Клоны клеток L-929 были получены методом предельного разведения. Полученные клоны инкубировались с Tag7-Hsp70 (10-9 М) в течение 24 ч. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. В клетках L-929 запускается каспазозависимый апоптоз, приводящий к пику клеточной смерти через 3 ч инкубации с Tag7-Hsp70. Появление двух пиков гибели в культуре L-929, обнаруживаемых после добавления Tag7-Hsp70, позволило предположить, что под действием Tag7-Hsp70 в этих клетках запускаются два цитотоксических процесса, протекающие с различной скоростью. Самой известной программой клеточной смерти является программа апоптоза. При этом все ключевые пути классического апоптоза протекают при непосредственном участии каспаз. В результате ингибиторного анализа мы выяснили, что клеточная смерть, детектируемая через 3 ч после 73 добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, протекает с участием каспаз: добавление каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO полностью блокировало цитотоксическую активность комплекса (рис. 8А). Аналогичный эффект блокирования клеточной смерти был обнаружен и в случае цитокина TNFα (рис. 8Б). Рис. 8. Ингибиторный анализ цитотоксического действия белкового комплекса Tag7Hsp70 (а) и TNF-α (б) при добавлении к клеткам линии L-929. Левые столбцы на диаграммах соответствуют клеточной смерти через 3 ч после добавления цитотоксического агента; правые столбцы – через 20 ч. Ингибиторы каспаз добавлялись в инкубационную среду за 1 ч до добавления Tag7-Hsp70, в конечной концентрации 5 мМ. Nec-1 добавлялся за 30 мин до добавления Tag7-Hsp70 в конечной концентрации 5 мМ. Комплекс Tag7-Hsp70 и цитокин 74 TNF-α добавлялись к клеткам в конечной концентрации 10 -9 М. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. Известно, что сигнал к апоптозу может запускаться за счѐт стимуляции рецептора смерти на клеточной поверхности, что приводит к активации инициаторной каспазы 8 (или, в некоторых случаях, каспазы 10), которая непосредственно активирует эффекторную каспазу 3. Для того чтобы установить, участвует ли рецептор смерти в запуске механизма апоптоза, приводящего к пику клеточной смерти в культуре L-929 через 3 ч после добавления Tag7-Hsp70, мы проанализировали участие каспазы 8 в этом механизме с помощью специфичного ингибитора Ac-IETD-CHO. При добавлении Ac-IETD-CHO к клеткам L-929 наблюдался аналогичный эффект подавления цитотоксической активности комплекса через 3 ч, как и при добавлении каспазного ингибитора Ac-YVADCHO (рис. 8А). Полученные результаты указывают на то, что сигнальный каскад апоптоза, приводящий к клеточной смерти в культуре через 3 ч после добавления Tag7Hsp70, запускается через рецептор смерти. При этом клеточная смерть, детектируемая через 20 ч после добавления каждого из цитотоксических агентов – Tag7-Hsp70 и TNF-α – к клеткам, не блокировалась ингибиторами каспазной активности (рис. 8), указывая на существование ещѐ одного, безкаспазного, механизма клеточной смерти. В клетках L-929 запускается каспазонезависимый некроптоз, приводящий к пику клеточной смерти через ~20 ч инкубации с Tag7-Hsp70. Для установления механизма клеточной смерти, детектируемой через 20 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, мы сначала исследовали участие каспаз. Добавление каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO не только не вызвало снижения цитотоксической активности, но, наоборот, привело к увеличению числа погибших клеток, при этом ~10%-ный прирост погибших клеток был численно равен, с учѐтом погрешности измерений, снижению их гибели, 75 наблюдаемой через 3 ч, что указывало на то, что в этом случае имеет место альтернативный безкаспазный механизм клеточной смерти (рис. 8А). Аналогичный результат был получен и для цитокина TNF-α (рис. 8Б). Такая ситуация возможна в случае, если оба цитотоксических процесса запускаются через один и тот же рецептор клеточной поверхности, который участвует в запуске двух механизмов цитотоксичности. При использовании вместо AcYVAD-CHO специфичного ингибитора каспазы-8 (Ac-IETD-CHO) наблюдался такой же, как и в случае каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO, эффект ингибирования цитотоксической активности Tag7-Hsp70, обнаруживаемой через 3 ч, и еѐ повышения через 20 ч, что указывает на явную роль рецептора смерти в переключении цитотоксических сигналов (рис. 8). Известно, что в случае запуска цитотоксических процессов в клетках L-929 через рецептор смерти каспаза-8 участвует в активации апоптозного каскада, а еѐ ингибирование (за счѐт мутаций или при добавлении ингибиторов) стимулирует фосфорилирование протеинкиназы RIP1 и запуск некроптоза. Известно также, что некроптоз может протекать и без участия RIP1, но с участием еѐ гомолога, протеинкиназы RIP3. Для установления роли RIP1 в осуществлении механизма клеточной смерти, детектируемой через 20 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, мы использовали ингибитор Nec-1, способный специфично блокировать киназную активность RIP1, но не RIP3. Предварительная инкубация клеток L-929 с Nec-1 привела к блокировке цитотоксического действия Tag7-Hsp70, детектируемого через 20 ч (Рис. 8А). Это значит, что комплекс Tag7-Hsp70 вызывает RIP1зависимый некроптоз в клетках L-929, приводящий к клеточной смерти, обнаруживаемой через 20 ч после добавления комплекса. Таким образом, было установлено два механизма клеточной смерти – каспазозависимый апоптоз и каспазонезависимый некроптоз, – запускаемые в клетках L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70. При этом каспаза8 выступает в роли переключателя между двумя этими процессами, что было 76 показано при блокировке еѐ действия за счѐт добавления специфичного ингибитора. В клеточной смерти, детектируемой через 20 ч после добавления Tag7Hsp70 к клеткам L-929, важную роль играют АФК, лизосомальные гидролазы и ионы Ca2+. В настоящее время в литературе нет единого мнения об осуществлении механизма некроптоза после формирования некросомы RIP1-RIP3. При этом известны различные факторы, участвующие в развитии некроптоза после активации RIP1, в число которых входят кислородные радикалы (АФК), лизосомальные гидролазы и ионы Ca 2+. Участие АФК в осуществлении механизмов клеточной смерти, запускаемых в клетках L-929 под действием Tag7-Hsp70, мы исследовали при помощи антиоксиданта ионола представляет собой производное фенола, (бутилгидроскитолуол, липофильное BHT, органическое проявляющее C15H24O), соединение, антиоксидантную который химическое активность и предотвращающее повреждающий эффект от свободных кислородных радикалов в клетке, в частности, за счѐт блокирования активности комплексов дыхательной цепи митохондрии. Добавление ионола полностью блокировало некроптоз, детектируемый спустя 20 ч инкубации клеток с Tag7-Hsp70 (рис. 9). Аналогичный эффект нейтрализации ионолом цитотоксического действия TNF-α на клетки L929 описан в литературе (Festjens et al., 2006). Главным продуцентом АФК в клетке является комплекс I дыхательной цепи митохондрии, при этом ранее было показано, что ионол способен не только нейтрализовать АФК, но и препятствовать их продукции комплексом I дыхательной цепи митохондрии (Festjens et al., 2006). Таким образом, полученный результат указывает на явную роль АФК и митохондрии в осуществлении некроптоза, приводящего к клеточной смерти спустя 20 ч инкубации клеток с Tag7-Hsp70. Участие лизосом в осуществлении некроптоза мы исследовали при помощи ингибитора активности лизосомальных ферментов, хлорохина. Хлорохин 77 представляет собой лизосомотропный агент, способный блокировать ферментативную активность лизосомальных гидролаз, вышедших из лизосомы в цитозоль клетки, препятствуя понижению pH в цитоплазме клетки. Клеточная смерть, обнаруживаемая через 20 ч, полностью блокировалась при добавлении хлорохина, тем самым указывая на явную роль лизосом в осуществлении некроптоза (рис. 9). Как видно на рисунке 9, добавление антиоксиданта ионола и ингибитора активности лизосомальных ферментов хлорохина не влияло на клеточную смерть через 3 ч. Этот результат подтверждает, что как митохондрии, так и лизосомы остаются неповреждѐнными и не участвуют в апоптозе, наблюдаемом через 3 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам. Рис. 9. Анализ участия АФК, лизосом и ионов Ca 2+ в осуществлении цитотоксических процессов, запускаемых в клетках L-929 под действием Tag7-Hsp70. Клетки преинкубировались с ингибитором лизосомальных ферментов хлорохином (5 мкМ) или антиоксидантом ионолом (1 мкМ) в течение 1 часа, или с хелатором кальция EGTA (2 мМ) в течение 30 мин, затем добавлялся Tag7-Hsp70 (10-9 М) и определялась цитотоксическую активность через 3 ч и через 20 ч методом окрашивания трипановым синим, а также MTTтестом через 20 ч. 78 Роль ионов Ca 2+ в запуске клеточной смерти через 20 ч мы исследовали при помощи вещества EGTA – хелатирующего агента, способного специфично связывать ионы Ca 2+. Как видно из рисунка 9, предварительное добавление EGTA в концентрации 2 мМ подавляло цитотоксическое действие Tag7-Hsp70: клеточная смерть снижалась с 27 % до 1 % (рис. 9). Повышение концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме клетки может индуцировать проницаемость лизосомальных мембран, вызывая активацию Ca2+-зависимых цитозольных ферментов, таких как цитозольная фосфолипиза cPLA2 и Ca 2+-зависимые цитозольные протеазы кальпаины. Известно, что оба этих фермента могут принимать участие в индукции некроптоза под действием TNF-α, причѐм их активация предшествует выходу лизосомальных протеаз в цитозоль ( Hayakawa et al., 1993; Vandenabeele et al., 2010). После своего выхода из лизосомы, лизосомальные гидролазы могут принимать участие в индукции пермеабилизации митохондриальной мембраны и способствовать накоплению АФК, благоприятствуя некроптозу. Таким образом, белковый комплекс Tag7-Hsp70 способен запускать два механизма клеточной смерти после его добавления к клеткам L-929: каспазозависимый апоптоз, вызывающий клеточную смерть через 3 ч инкубации клеток с комплексом, и альтернативный, каспазонезависимый некроптоз, вызывающий клеточную смерть через 20 ч инкубации клеток с комплексом. При этом картина гибели клеток L-929 под действием комплекса Tag7-Hsp70 аналогична картине клеточной смерти, запускаемой под действием классического цитокина TNF-α. Через 3 ч клеточная смерть по механизму апоптоза запускается при участии каспазы-8, но без участия митохондрии; через 20 ч клетки погибают по безкаспазному механизму, RIP1-зависимому некроптозу, который блокируется при добавлении молекулы-ингибитора Nec-1. Добавление антиоксиданта ионола и ингибитора лизосомальной активности хлорохина подавляло клеточную гибель через 20 ч, тем самым указывая на участие митохондрий и лизосом в осуществлении клеточной смерти в этом случае. Добавление Ca 2+-связывающего 79 хелатирующего агента EGTA также блокировало клеточную гибель через 20 ч, тем самым указывая на роль ионов Ca 2+ в осуществлении клеточной смерти: возможно, в клеточной смерти через 20 ч задействованы цитозольная Ca2+зависимая фосфолипаза cPLA2 и кальпаины, Ca2+-зависимые нелизосомальные протеазы. 2.3.Выявление рецептора на поверхности клеток L-929, способного взаимодействовать с комплексом Tag7-Hsp70. Поверхностный рецептор TNF-R1 клеток L-929 способен взаимодействовать с белковым комплексом Tag7-Hsp70. После обнаружения, что под действием Tag7-Hsp70 в клетках L-929 могут запускаться два альтернативных механизма клеточной смерти, у нас родилась гипотеза, что Tag7-Hsp70 индуцирует клеточную смерть, взаимодействуя с рецептором клеточной поверхности. Поскольку цитотоксическое действие Tag7Hsp70 и по субстратной специфичности в отношении опухолевых клеток различных линий, и по кинетике цитотоксического действия на клетки мышиной фибросаркомы L-929, и по механизмам запускаемых цитотоксических процессов – апоптоза и некроптоза – в клетках оказалось схожим с цитотоксическим действием классического цитокина TNF-α, это указывало на то, что Tag7-Hsp70, возможно, тоже способен взаимодействовать с рецептором TNF-R1 на поверхности клеток L-929, запуская апоптоз и некроптоз, по аналогии с TNF-α. Поэтому поиск рецептора, участвующего в индукции цитолиза под действием Tag7-Hsp70, был нашей следующей задачей. Для выделения из клетки мембранных белков использовалась описанная в литературе методика солюбилизации рецептора при помощи детергента (Stauber et al., 1988). Сначала мы предприняли попытку выделить рецептор на хроматографической колонке с иммобилизованным на сефарозе белком Tag7. На этой колонке проводилась последовательная адсорбция сначала белка Hsp70, а затем солюбилизованной фракции мембранных белков клеток L-929, после чего специфично связавшиеся белки анализировались при помощи SDS-PAGE. Но в результате нам не удалось 80 обнаружить сигналов от белков с молекулярной массой, отличающейся от 70 кДа. Этот результат указывал на то, что обнаруживалось связывание Hsp70, обладающего молекулярной массой 70 кДа, но не других белков с колонкой. Отсутствие связывания мембранного рецептора с комплексом Tag7-Hsp70 могло быть связано с модификациями амино-групп, произошедшими в результате иммобилизации Tag7 на колонке: возможно, такая модификация препятствовала связыванию рецептора с комплексом. Поскольку не удавалось адсорбировать мембранный рецептор при использовании хроматографической колонки с иммобилизованным Tag7, мы воспользовались иммуноаффинной хроматографией. Рис. 10. Tag7-Hsp70 связывается с рецептором TNFR1, выделенным из мембран клеток L-929. Мембранный рецептор выделялся из клеток L-929 методом солюбилизации мембранных белков, как было описано (Stauber et al., 1988). Солюбилизированный рецептор очищался при помощи иммуноаффинной хроматографии, после чего адсорбировался на колонке с иммобилизованными антителами к Tag7, на которой был предварительно адсорбирован белковый комплекс Tag7-Hsp70. Колонка промывалась, а белки связавшейся фракции разделялись при помощи SDS-PAGE, после чего анализировались методом MALDI. 81 С этой целью солюбилизированные мембранные белки клеток L-929 подвергались аффинной хроматографии на иммуноадсорбционной колонке с иммобилизованными антителами к Tag7, на которой был предварительно преципитирован комплекс Tag7-Hsp70. Среди связавшихся с комплексом белков представлял интерес белок с молекулярной массой 50 кДа, соответствующей молекулярной массе мышиного TNF-R1 (рис. 10). С помощью MALDI-анализа в этой полосе было обнаружено 6 пептидов, характерных для рецептора TNF-R1. Для подтверждения этих результатов через эту же иммуноадсорбционную колонку пропускали солюбилизированные мембранные белки клеток L-929, предварительно очищенные на аффинной колонке с иммобилизованными на сефарозе антителами к TNF-R1. После разделения связавшейся белковой фракции с помощью SDS-PAGE и последующего MALDI-анализа в полосе, соответствующей белку p50 с молекулярной массой 50 кДа, было детектировано 9 пептидов, характерных для мышиного TNF-R1, что соответствует 26% перекрытия аминокислотной последовательности и позволило нам с высокой степенью уверенности утверждать, что комплекс Tag7-Hsp70 может связываться с TNF-R1 (табл. 1). p50 880.52 1002.56 1038.61 1257.74 1658.83 1717.91 1755.95 2174.16 2356.10 TNFR1 880.38 1002.49 1039.56 1256.61 1658.85 1718.79 1754.82 2175.02 2357.00 Delta M 0.14 0.07 -0.95 1.13 -0.02 -0.88 1.13 -0.86 -0.90 пептид 187-193 40-48 251-259 87-97 428-442 62-77 395-408 377-394 108-128 Таблица 1. Детекция пептидов, характерных для TNFR1, после MALDI-TOF-анализа белка p50. Первая слева колонка соответствует пептидам в составе p50, вторая слева – пептидам в составе TNFR1, третья – разницам масс, 4-ая – номерам аминокислот, соответствующих пептидам. Массы пептидов приведены в единицах (а.е.м.). 82 Далее через ту иммунопреципитированным же иммуноадсорбционную Tag7-Hsp70 мы колонку пропускали с s-TNFR1, представляющий собой внеклеточную часть рецептора TNFR1. В связавшейся фракции был обнаружен белок с молекулярной массой, характерной для s-TNFR1, взаимодействующий с антителами к TNFR1 (рис. 11). Таким образом, мы получили прямое подтверждение того, что внеклеточная часть рецептора взаимодействует с комплексом Tag7-Hsp70. Рис. 11. Связывание s-TNFR1 с белковым комплексом Tag7-Hsp70, адсорбированным на сефарозе с иммобилизованными антителами к Tag7. Белковый комплекс Tag7-Hsp70, приготовленный из рекомбинантных белков, преципитировался на хроматографической колонке с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7. Колонка отмывалась от неспецифично связавшихся белков, затем на колонке преципитировался рекомбинантный sTNFR1 (Sigma). Связавшаяся фракция анализировалась методом вестерн-блоттинга с использованием антител к TNFR1. Эти результаты свидетельствуют о том, что Tag7-Hsp70 взаимодействует именно с рецептором TNFR1 на поверхности клеток L-929. Поскольку лигирование TNFR1 может приводить к апоптозу и некроптозу в клетках, полученный результат указывает на то, что мы обнаружили новый лиганд к TNFR1: в роли этого лиганда способен выступать Tag7-Hsp70. Ковалентная сшивка (кросс-сшивка) белкового комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором клеточной поверхности. 83 Для установления стехиометрии связывания комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором TNF-R1 проводилась кросс-сшивка белков на поверхности клеток L929. Белковый комплекс Tag7-Hsp70 метился биотином двумя способами: в одном случае биотином метился Tag7 в составе комплекса, а в другом случае – Hsp70. После мечения, в каждом случае комплекс инкубировался с клетками при 4 ºC, чтобы избежать интернализации рецептора внутрь клетки, затем добавлялся сшивающий BS3. агент использованием Далее детергента мембранные Triton белки X-100. солюбилизировали Полученную с фракцию солюбилизированных мембранных белков мы иммунопреципитировали на хроматографической колонке с иммобилизованными антителами к TNFR1, после чего специфично связавшиеся белки разделяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), затем переносили на мембрану и окрашивали при помощи конъюгата стрептавидина с пероксидазой. В обоих случаях была идентифицирована полоса с молекулярной массой ~140 кДа (рис. 12). Рис. 12. Взаимодействие комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором TNFR1 на поверхности клеток L-929. Левая дорожка соответствует биотинилированному Tag7, правая – Hsp70 в составе комплекса Tag7-Hsp70. Белковый комплекс Tag7-Hsp70 готовился из рекомбинантных белков, после чего Tag7-Hsp70 добавлялся в инкубационную среду клеток L-929 до конечной концентрации 10 нМ. После инкубации в течение 2 ч клетки промывались, затем проводилась сшивка мембранных белков при помощи BS3. После сшивки мембранные белки солюбилизовались, после чего наносились на колонку с иммобилизованными на сефарозе антителами к TNFR1. Колонка промывалась, а специфично связавшаяся фракция 84 анализировалась при помощи вестерн-блоттинга с использованием стрептавидин-пероксидазы для детекции биотина. Поскольку сигналы и в левой, и в правой дорожках геля на плѐнке получены от белковой фракции, которая специфично связывалась с хроматографической колонкой с иммунопреципитированными антителами к TNF-R1, соответствующие полипептиды должны содержать в своѐм составе TNF-R1. Левая дорожка соответствует случаю, когда биотином метился Tag7, правая – случаю, когда метился Hsp70. Так как картины полос на плѐнке для двух этих дорожек геля оказались идентичными, это говорит нам о том, что сигнал ~140 кДа даѐт белковый комплекс, содержащий и Tag7, и Hsp70, и TNFR1. Молекулярная масса соответствует молекулярной массе тройного комплекса Tag7-Hsp70-TNFR1, в котором все 3 белка в составе комплекса присутствуют в стехиометрии 1:1:1 (мол. масса Tag7 составляет 20 кДа, Hsp70 – 70 кДа, TNF-R1 – 50 кДа). Цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp70 блокируется антителами к TNF-R1 Мы сделали попытку «заблокировать» рецептор, через который белковый комплекс Tag7-Hsp70 передаѐт цитотоксический сигнал, за счѐт добавления антител к TNFR1. Антитела добавлялись за 30 мин до внесения комплекса, в различном разведении (рис. 13). При добавлении антител в конечной концентрации ~50 нМ цитотоксический эффект от воздействия комплекса Tag7Hsp70 снижался более, чем в 2 раза. При концентрации антител ~100 нМ наблюдалось практически полное блокирование цитотоксического действия Tag7Hsp70. При этом гибель клеток в контрольных образцах не превышала 2 %. Сами по себе антитела также не были цитотоксичными для клеток в диапазоне исследованных концентраций: при добавлении антител к клеткам L-929 в максимальной использованной концентрации, 200 нМ, клеточная смерть в культуре была такой же, как и в контрольных образцах. 85 Таким образом, полученные данные говорят в пользу того, что нам удалось обнаружить новый лиганд, способный взаимодействовать с рецептором TNFR1: в роли этого лиганда способен выступать белковый комплекс Tag7-Hsp70. Рис. 13. Блокировка цитотоксической активности Tag7-Hsp70 в культуре L-929 антителами к TNFR1. Антитела добавлялись в инкубационную среду клеток в различном разведении, за 30 мин до добавления комплекса Tag7-Hsp70. Tag-Hsp70 добавлялся в конечной концентрации 10-9 М. Цитотоксическая активность измерялась через 20 ч методом окрашивания трипановым синим. Классическим лигандом к рецептору TNFR1 служит TNF-α, при этом специфичность связывания очень высока: Kb ~ 10-9-10-10 M. Наши данные свидетельствуют, что мы обнаружили ещѐ один, не описанный ранее лиганд – белковый комплекс Tag7-Hsp70, – который также взаимодействует с TNFR1. Белки TNF-α и Tag7 обладают похожей молекулярной массой (17,3 кДа и 20 кДа, соответственно), однако аминокислотные последовательности этих белков совершенно различны, что подтверждает анализ при помощи BLAST®. Это отражается и на третичной структуре: в случае TNF-α она формируется из βлистов, которых обнаруживается более 10, в то время как PGLYRP1 состоит из трѐх α-спиралей и четырѐх β-листов. Hsp70 и TNF-α не обнаруживают ни сходства по молекулярной массе, ни сходства в первичной структуре, ни в 86 третичной структуре. При этом выглядит удивительным, что белковый комплекс Tag7-Hsp70, как мы убедились, способен взаимодействовать с TNFR1, аналогично цитокину TNF-α. Это указывает на сложность молекулярных механизмов взаимодействий между белками, способных приводить к формированию белковых комплексов с совершенно новыми свойствами. 87 3. Материалы и методы. 3.1. Белки, ферменты и реактивы. В работе использовались реактивы, производимые фирмами Sigma-Aldrich (США), Amersham (Великобритания), GE Healthcare (Великобритания), Fermentas (Litvenia), Invitrogen (Чехословакия), Gibco (Великобритания), ПанЭко (Россия), Costar, Corning, Имтек (Россия), Merck (Германия), Promega (США). 3.2. Получение и очистка белков. кДНК человеческого белка теплового шока Hsp70 (Hsp70-1A, GenBank TM accession number NM_005345), субклонированную в плазмиду pQE-30 (Qiagen), экспрессировали в штамме M15[pREP4] E. coli (Qiagen). кДНК человеческого HspBP1 (GenBank TM accession number NM_012267), субклонированный в плазмиду pET-28a (Novagen, Madison, WI), экспрессировали в штамме XL-Blue E. Coli. кДНК рекомбинантного белка Tag7 мыши (PGLYRP1, Genbank TM Accession Number AF193843), субклонированную в плазмиду pQE-30 (Qiagen), экспрессировали в штамме M15[pREP4] E. coli (Qiagen). Экспрессия белков в E. coli Штаммы E. coli, содержащие необходимые плазмиды, наращивали в течение ночи при 37 ºC в 20 мл среды LB, содержащей антибиотик: канамицин (25 мкг/мл) в случае Tag7 и HspBP1 или канамицин (25 мкг/мл) и ампицилин (50 мкг/мл) в случае Hsp70. После этого 5 мл среды с клетками переносили в колбы, содержащие 500 мл LB, и наращивали в течение ~3 ч до достижения опт. плотности OD600 = 0.4 – 0.6. После этого добавляли 1 мМ IPTG, после чего клетки растили в течение ещѐ ~3 ч до OD600 = 0.7 – 0.9. После этого проводили центрифугирование на роторе SX4750A (Beckman) при 4000 об/мин в течение 15 мин, затем осадок дважды промывали буфером STE, pH 8.0, центрифугируя 20 мин и 30 мин. После промывки осадок замораживали при -70 ºC. 88 Получение Tag7/PGLYRP1 Используемые растворы: 1 М DTT (154 мг в 1 мл воды, готовим свежий и храним при 4 °C) 1 М cysteaminium chloride (Sigma-Aldrich) (113.6 мг в 1 мл воды, храним при 4 °C) 1 М cystaminium dichloride (Sigma-Aldrich) (225 мг в 1 мл воды, храним при 4 °C) Используемые буферы (все хранили при 4 °C): Буфер WS-T: 50 мМ Tris-HCl pH 8.0, 2 мМ EDTA, 0.5 % Triton X-100. Буфер WS: 50 мМ Tris-HCl pH 8.0, 2 мМ EDTA. Буфер солюбилизирующий: 50 мМ Tris-HCl pH 8.0, 2 мМ EDTA, 8 М мочевины (мочевина полностью растворяется при доводке pH). Буфер ренатурирующий: 50 мМ Tris-HCl pH 8.5, 2 мМ EDTA, 1 М аргинина. Буфер A: 50 мМ MES-NaOH pH 5.8. Буфер B: 50 мМ MES-NaOH pH 5.8, 1 M NaCl. Лизис клеток: 1. Клетки E. coli, осаждѐнные из 1 л культуры, тщательно ресуспендировали в 30 мл буфера WS-T, содержащего протеазные ингибиторы (0.1 мМ PMSF + коктейль ингибиторов протеаз Set V, EDTA-free (Calbiochem) в концентрации, указанной изготовителем), до достижения гомогенной смеси. 2. Проводили обработку ультразвуком: 10 циклов по 25 с, с перерывом между циклами 25 с, при 0 °C (на льду). 3. Центрифугировали 20 мин при 20 000 об/мин (~50 000 g, ротор JA-20, Beckman) при 4 °C. Отмывка телец включения: 1. Устраняли супернатант, сохраняя образец для SDS-PAGE. 2. Ресуспендировали осадок в 30 мл буфера WS-T при 4 °C. 3. Проводили обработку ультразвуком: 5 циклов по 25 с при 0 °C. 89 4. Центрифугировали 20 мин при 20 000 об/мин при 4 °C. 3 раза повторяли этапы 1-4; 3 раза повторяли этапы 1-4, используя буфер WS вместо WS-T. Солюбилизация белка: 1. Ресуспендировали осадок в 10 мл солюбилизирующего буфера. 2. Проводили обработку ультразвуком: 10 циклов по 25 с. 3. Добавляли 1 мМ DTT, свежеприготовленного, и инкубировали 1 ч при 20 °C. 4. Проводили центрифугирование 10 мин при 20 000 об/мин. 5. Супернатант отбирали, сохраняя образец для SDS-PAGE, разделяли на аликвоты, по 1 мл каждая, и хранили при -70 °C. Ренатурация белка: 1. Непосредственно перед началом эксперимента к ренатурирующему буферу добавляли 5 мМ cysteamine hydrochloride и 0.5 мМ cystamine dihydrochloride. 2. Добавляли 5 мМ свежеприготовленного DTT к раствору белка (чтобы гарантировать, что исходный белок полностью денатурирован), суспендировали и центрифугировали 10 мин при 20 000 g. 3. Супернатант отбирали и очень медленно, при помощи шприца с тонкой иглой, вносили в ренатурирующий буфер, содержащий 5 мМ cysteamine hydrochloride и 0.5 мМ cystamine dihydrochloride при 4 °C на магнитной мешалке при медленном вращении магнита, до конечной концентрации 0.1 мг/мл (при этом раствор должен оставаться прозрачным, процесс останавливали в случае помутнения). 4. Оставляли на магнитной мешалке при плавном помешивании при 4 °C на 3 дня. 5. Проводили центрифугирование 10 мин при 20 000 об/мин, осадок устраняли. 90 6. Проводили концентрирование полученной смеси до 10-20 мл, используя мембрану для ультрафильтрования (Millipore, Диаэм). 7. Проводили диализ против 2 л буфера A (50 мМ MES-NaOH pH 5.8) при 4 °C в течение ночи. 8. Проводили центрифугирование 40 мин при 24 000 об/мин при 4 °C. 9. Сохраняли образец для SDS-PAGE. 10. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд. Очистка Tag7 при помощи ионнообменной хроматографии: 1. Колонку MonoS HR5/5 уравновешивали буфером A. 2. Наносили белок после фильтрации (не более 5 мг белка за одно нанесение). 3. Хроматографию проводили нанесением градиента буфера B: от 1 до 100 %. При этом PGRP-S обнаруживался по пику на хроматограмме, детектируемому при 40 % буфера B. Протокол для получения Hsp70 и HspBP1 Используемые буферы Лизирующий буфер / буфер для нанесения: 20 mM Na 2HPO 4 pH 8.0 (любой Na фосфат) 0.5 M NaCl 30 mM Imidazole* 0.5% Triton X-100 100-200 mg Lysozyme на 25 мл буфера (на 1 л исходной клеточной культуры) * При лизисе клеток имидазол можно не добавлять, но тогда его необходимо добавить перед нанесением на колонку (можно 6% В). Буфер A: 20 mM Na 2HPO 4 pH 8.0 (любой Na фосфат) 0.5 M NaCl 91 Буфер B (буфер А + 500 мМ имидазола + доводка pH): 20 mM Na 2HPO 4 pH 8.0 (любой Na фосфат) 0.5 M NaCl 500 mM Imidazole Все процедуры проводятся как можно быстрее и при 0-4°С, поскольку при лизисе клеток в раствор выделяется большое количество протеаз (при долгой работе возможно добавление ингибиторов протеаз, но не содержащих EDTA). 1. Осадок клеток растворяется в лизирующем буфере (из расчета 25 мл буфера на 1 л исходной клеточной культуры). 2. Клетки лизируются ультразвуком (10 циклов по 25 с) либо оттаиванием/заморозкой (10-15 раз). 3. Клетки откручиваются 20-30 минут при >15 000 x g. 4. Супернатант очень аккуратно отбирается. При необходимости крутку можно и нужно повторить. 5. Образец фильтруется через фильтр 0.22 мкм (Durapore или PES, Millipore). 6. Колонка уравновешивается смесью буферов A + 6% B (чтобы конечный буфер содержал 30 мМ имидазола). 7. Наносится образец при скорости 0.5 мл/мин (оптимальную скорость не проверял). Проскок собирается для контроля связывания всего Hsp70 с колонкой. 8. Колонка промывается большим количеством (>10 объемов колонки) буфера А + 6% B, до тех пор пока поглощение не выйдет на исходный уровень (до нанесения образца). От этой стадии очень сильно зависит чистота белка. Нельзя спешить на этой стадии и укорачивать ее. 9. Элюция белка проводится: a. При очистке белка в 1 стадию 110 мМ имидазола (A + 22 % B). Отбираются первые фракции (максимально чистый белок для одной стадии, но большие потери). b. Если предполагается дальнейшая очистка белка, то элюция проводится 150 мМ имидазола (узкий пик – 3-4 мл, но будет примесь – 50 кДа). 92 Фракции собираются по 1 мл. 10. Колонка промывается 5 мл (5 cv) 100% B. Для контроля полной элюции белка эта фракция также сохраняется. 11. Колонка уравновешивается в буфере А, промывается водой и заполняется 20% спиртом. Фирма Amersham рекомендует проводить регенерацию и полную чистку перед, а не после хранения. Регенерацию можно проводить через 6-7 делений. 3.3. Получение белковых комплексов. Для приготовления белковых комплексов очищенные белки тщательно диализовались против PBS pH 7,4 (100-кратный объѐм PBS, буфер меняли 3-5 раз); затем смешивались в эквимолярных концентрациях и инкубировались в течение 30 мин при 37 °C в PBS pH 7,4. Для очистки полученного комплекса от несвязавшихся белков проводили иммуноаффинную хроматографию на колонках с иммобилизованными антителами к каждому из белков комплекса. 3.3.Антитела Первичные антитела: Антитела к Tag7 и к Hsp70, полученные из сыворотки кролика, использовались в разведении 1: 10 000. Антитела кроличьи к HspBP1 и козлиные к TNFR1, любезно предоставленные профессором Тоневицким А.Г. (Российский исследовательский институт физического образования и спорта), использовались в разведении 1: 10 000. Каждое из антител проверялось на перекрѐстную реактивность с каждым из исследованных белков. Вторичные антитела: Поликлональные козлиные антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, (GE Healthcare) (анти-кроличьи антитела) использовались в разведении 1: 40 000. Поликлональные кроличьи антитела к иммуноглобулинам овцы, конъюгированные с пероксидазой хрена, (Имтек) (анти-овечьи антитела), использовались в разведении 1: 40 000, при этом первичными антителами могли служить иммуноглобулины как овцы, так и козла 93 из-за перекрѐстной реактивности антител по отношению к иммуноглобулинам этих животных. В случае длительного хранения к антителам добавляли 0.025 % азид натрия (NaN3). 3.4. Получение антител. Для получения антител к Tag7 и к Hsp70 проводили иммунизацию кроликов полученными рекомбинантными белками Hsp70 и Tag7. Для первой иммунизации по 200 мкг белка в 0,5 мл 0,15 М NaCl и смешанного с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда в виде стабильной эмульсии вводили подкожно в подушечки стоп и вдоль хребта 4 кроликам (по 2 кролика на исследуемый белок). Повторную иммунизацию тем же раствором проводили через месяц в верхнюю часть бедра. Следующие иммунизации проводили через каждую неделю в течение месяца: по 100 мкг белка в 0,5 мл 0,15 М NaCl и смешанного с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда в виде стабильной эмульсии вводили подкожно вдоль хребта. Через 2 месяца после первой иммунизации провели забор крови из ушной раковины кроликов и провели проверку полученных сывороток методом иммуноферментного анализа (ИФА). По данным использовались проверки были отобраны все сыворотки, которые затем для иммуноадсорбционных выделения специфичных иммуноглобулинов на колонках с иммобилизованными рекомбинантными белками Tag7 и Hsp70. Сыворотки кроликов объединили попарно и осадили фракцию иммуноглобулинов раствором сульфата аммония. Для этого к 100 мл сыворотки добавили 50 мл насыщенного раствора сульфата аммония, центрифугировали при 2 500 g, супернатант устранили, а осадок растворили в 50 мл воды и снова осадили добавлением 25 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Осаждение повторяли 4 раза. Затем препараты растворили в 25 мл PBS и нанесли на соответствующие колонки с иммобилизованными рекомбинантными белками. 94 Количество белка в связавшихся фракциях определяли по методу Bradford (с использованием реактива Bradford, Sigma). Фракции количеством белка объединяли и диализовали против с максимальным PBS в течение ночи. Полученные образцы подвергли электрофорезу в денатурирующих условия х (10 % SDS-PAGE) по Лэммли в камере для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific) для установления чистоты образца. Полученные специфические антитела к белкам Tag7 и Hsp70 анализировались при помощи вестерн-блоттинга. Для этого белки Tag7 и Hsp70 подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях, при этом наносили по 0,2 мкг белка на дорожку. Электроперенос с геля осуществляли на мембрану PVDF (Hibond-P, Amersham Biosciences), после чего проводили вестерн-блоттинг по стандартной методике, рекомендуемой фирмой-изготовителем мембраны, используя набор реагентов для анализа (Amersham Biosciences, код RPN2132 и RPN2133). В качестве блокирующего агента использовали 1-5 % BSA. В качестве первичных антител использовали поликлональные антитела, выделенные из сыворотки кролика, к рекомбинантному Tag7 в разных разведениях (от 1:5 000 до 1:40 000), рекомбинантному белку Hsp70 в разных разведениях (от 1:5 000 до 1:40 000). В качестве вторичных антител использовали поликлональные антитела, выделенные из сыворотки козла, к иммуноглобулинам кролика (разведение 1:40 000), конъюгированные с пероксидазой хрена (GE Healthcare). Для проверки специфичности антител на дорожки геля при электрофорезе также наносили рекомбинантный BSA. В результате было установлено, что детекцию белков можно проводить при разведении антител до 40 000 раз. В дальнейшем в нашей работе использовали разведение 1: 10 000. 3.5. Мечение биотином. NHS-D-Biotin (Sigma) добавлялся к белку, растворѐнному в PBS pH 8.0, в отношении 1: 1000 (по массе). После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением Tris до конечной концентрации 95 20мМ (добавляли из стокового буфера 1 М TrisHCl pH 8.0). После этого проводили тщательный диализ против буфера PBS. 3.6. Культивирование клеточных линий, использованных в работе. В работе использовались следующие клеточные линии: L-929 (фибросаркома мыши), K-562 (эритромиелолейкоз человека), Jurkat HeLa (рак шейки матки (лимфобластома мыши), человека), CSML-0 (неметастазирующая аденокарцинома мыши). Клетки линий K-562 и Jurkat представляют собой суспензионную культуру; клетки L-929, HeLa и CSML-0 сорбируются на пластике. Описание клеточных линий приводится в American Tissue Culture Collection (ATCC, USA). Клетки культивировали в инкубаторе во влажной атмосфере при 37 °C, 5% CO 2. Клетки линий К-562 и Jurkat культивировали в среде RPMI 1640 с 2 мМ Lглутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA) в присутствии 100 мкг/мл канамицина. Клетки линий L-929, HeLa и CSML-0 культивировали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. При пересаживании адгезионных линий клеток на новый матрас клетки промывали 0,25 % раствором трипсина (Gibco BRL) и десорбировали с пластика раствором Версена (Gibco BRL). 3.7. Получение отдельных клонов клеток L-929. Клоны L-929 получали методом предельного разведения. Для этого все лунки 96-луночной плашки заполняли культуральной средой. Затем в лунки первого ряда плашки добавляли по 100 мкл суспензии клеток L-929 (1000 клеток/мл). После этого по 100 мкл клеточной суспензии последовательно переносили из лунок первого ряда в лунки второго, из лунок второго в лунки третьего и т.д. вплоть до 8 ряда. Клетки инкубировали в течение 3 суток, после чего ряды 6, 7 и 8 анализировались под инвертирующим микроскопом для детекции лунок, содержащих единственный клон клеток. Эти клоны культивировали до 96 достижения монослоя, заменяя среду через каждые 3-4 дня, после чего в отношении полученных субпопуляций измеряли цитотоксическую активность комплекса Tag7-Hsp70. 3.8. Аффинная хроматография. Синтез иммуносорбента. 1 г CNBr-активированной сефарозы 4B (Pharmacia Biosciences) после набухания в 1 мМ растворе HCl промывали на плотном стеклянном фильтре небольшими порциями того же раствора. Гель сушили на стеклянном фильтре. Затем к нему добавляли 4.5 мг сорбирующегося белка или антител, предварительно диализованных против 0,1 М NaHCO 3 pH 8.3 c 0,6 М NaCl. Реакцию проводили в течение 17 часов при температуре 4°C. Избыток белка, не связавшийся с гелем, отмывали 0,1 М NaHCO 3 pH 8.3. Оставшиеся активные группы блокировали 1 М моноэтаноламином pH 9.0 при комнатной температуре в течение 2 часов. Блокирующий реагент и адсорбированный белок отмывали тем же карбонатным буферов, а затем 0,1 М ацетатом натрия pH 4.0 и 10 мМ фосфатносолевым буфером (PBS), pH 7.4. Колонки хранили под буфером PBS, pH 7,4, с 20 % этанола. Хроматография. На колонки (10×10 мм) с иммобилизованными на Sepharose 4B (Amersham Biosciences) антителами к Tag7, Hsp70, HspBP1 и TNFR1, предварительно уравновешенные PBS, наносили образцы, растворенные в том же буфере. При нанесении на колонку с Tag7 скорость подбирали из расчета нанесения образца не менее 1 ч. Несвязавшиеся белки устраняли промывкой 10 объемами колонки буфером PBS + 0,5 M NaCl, затем 10 объемами PBS, и 10 объѐмами воды. Элюцию проводили четырьмя объемами колонки 0,25 М триэтиламина, pH 12. Количество белка во фракциях определяли по методу Bradford (с использованием реактива Bradford, Sigma). Фракции с максимальным количеством белка 97 объединялись и лиофилизировались на SpeedVac (Jouan) в течение ночи. Высушенные белки растворялись в нужном объеме воды или PBS. 3.9. Элетрофорез и вестерн-блоттинг. Приготовление образцов для электрофореза: Образцы, подвергшиеся иммунопреципитации, после высушивания наносили на электрофорез в 20-50 мкл буфера для нанесения (0.063 М Tris HCl pH 6.8, 5% β-меркаптоэтанол, 2% SDS, 10% глицерол), использованного для элюции иммунореактивного материала. Образцы, превышающие стандартный объѐм, осаждали в 10 % ТХУ в течение 30 мин при 4°C, после чего центрифугировали 10 мин при 10 000g, затем супернатант отбирался, а осадок дважды промывался ацетоном, с центрифугированием 10 мин при 10 000g после каждой промывки. Далее образцы высушивались от ацетона и растворялись в 20-50 мкл буфера для нанесения. Инкубационные среды клеток осаждали 70% от насыщения сульфатом аммония. После центрифугирования 20 минут при 14 000 об/мин, белковый осадок растворяли в 20-50 мкл буфера для нанесения. Перед нанесением на электрофорез образцы денатурировали кипячением в течение 5 минут. Электрофорез SDS-PAGE и электроперенос: Разделение белков проводилось в денатурирующем 10-15 % SDS- полиакриламидном геле (толщина 0,75 мм) по Лэммли (Laemmli U. K., 1970) в камере для вертикального электрофореза (BIO-RAD). Состав электродного буфера: 25 мМ Tris HCl pH 8.3, 192 мМ глицина, 0.1% SDS. Электрофорез осуществляли при постоянном токе: 20 мА в концентрирующем геле, 25 мА – при разделении белков. Длина разделяющего геля 7 см. Составы гелей: 98 КонцентриРеактивы рующий 30 % акриламид- бисакриламид (19:1) 1.0 М Tris HCl, гель 10% 12% 15% 1,4 мл 4 мл 3,3 мл 2,3 мл 330 мкл 3,3 мл 4 мл 5 мл 250 мкл – – – – 2,5 мл 2,5 мл 2,5 мл 20 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл 20 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл 2 мкл 4 мкл 4 мкл 4 мкл (2 мл) H2 O Разделяющий гель (10 мл) pH 6.8 1.5 М Tris-HCl, pH 8.8 10% SDS 10% аммония TEMED персульфат После окончания гель-электрофореза белки в геле окрашивали либо переносили на мембрану. В качестве стандартов молекулярных весов использовались либо LMW Calibration Kit For SDS Electrophoresis (Amersham Biosciences), либо маркер ECLTM Plex Fluorescent Rainbow TM Marker (RPN850E). Окрашивание осуществляли водным раствором 0.25% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Serva), содержащим 40% этанола, 7% уксусной кислоты в течение 1 часа или в течение ночи, затем гель несколько раз отмывали раствором 40% этанола, 7% уксусной кислоты для выявления полос белков. После отмывки гель хранили в воде. Электроперенос осуществляли на мембрану PVDF Hibond-ECL (Amersham Biosciences), предварительно смоченную в буфере 10 мМ CAPS pH 11, содержащем 10 % метанола. Перенос проводили в аппарате для полусухого электроблоттинга Hoefer SemiPhor (Pharmacia Biotech) при постоянном токе 100 мА в течение 1 часа в буфере 10 мМ CAPS pH 11, содержащим 10% метанола. 99 После электропереноса мембраны либо окрашивали, либо помещали в блокирующий раствор для последующего иммуноблоттинга. Окрашивание осуществляли раствором 0,1% Coomassie G-250, содержащим 50% метанола в течение 5 минут с последующей отмывкой водным раствором, содержащим 50% метанола, 5% уксусной кислоты и промывкой водой; Вестерн-блоттинг Вестерн-блоттинг проводили по стандартной методике, рекомендуемой фирмой изготовителем Biosciences, мембраны коды и набором RPN2132 и реагентов RPN2133). для После анализа (Amersham гель-электрофореза и электропереноса мембраны, содержащие исследуемые образцы, блокировали в буфере PBS/T (PBS + 0,05% Tween-20 (Loba Chemie)), содержащем 1-5% BSA или нежирного молока в течение ночи. После трехкратной пятиминутной отмывки в PBS/T от блокирующего буфера мембраны инкубировали с поликлональными антителами кролика к рекомбинантному Tag7 мыши, рекомбинантному Hsp70 человека (разведение 1:20 000 в буфере PBS/T) в течение 1 часа. После трехкратной промывки мембран в PBS/TWEEN их инкубировали в течение 1 часа со вторичными антителами козла к иммуноглобулинам кролика (разведение 1:40 000), конъюгированными с пероксидазой хрена. После трехкратной промывки мембран PBS/T, и однократной H2O детекцию проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ECL Plus и фотопленку Hyper Film (Amersham Biosciences), согласно рекомендациям фирмыизготовителя. 3.10. Масс-спектрометрический анализ. Необходимые полосы белков вырезались из электрофоретического геля после 20-минутного вымачивания в воде. MALDI-TOF-анализ образцов проводился в ФГБУ "ИБМХ" РАМН им В. Н. Ореховича. Результаты анализа интерпретировались с помощью программы 100 MASCOT Peptide Mass Fingerprint (Matrix Science, http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl) и банка данных NCBInr (Japan). 3.11. Иммуноферментный анализ (ИФА). В лунки 96-луночной плашки добавляли по 100 мкл раствора исследуемых белков в концентрации 0.2 мкг/мл в карбонатном буфере (H2CO 3) рН 9.5. Тщательно перемешивали на шейкере при комнатной температуре в течение 510 сек. Планшет инкубировали при температуре 4 °С в течение 18 ч. По окончании инкубации удаляли содержимое лунок декантированием и промывали лунки три раза. При каждой промывке во все лунки добавляли по 150 мкл раствора PBS + 0.05 % Tween-20 (PBS/T), встряхивали планшет на шейкере в течение 1 мин при комнатной температуре с последующим декантированием. После каждого декантирования тщательно удаляли остатки жидкости из лунок постукиванием планшета в перевернутом положении по фильтровальной бумаге. Для уменьшения неспецифической сорбции пластик в лунках насыщали 0,2% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma) в PBS/T в течение 30 минут при постоянном покачивании при комнатной температуре. Затем в лунки планшета вносили предварительно разведенные в PBS/T сыворотки кроликов и планшет инкубировали при температуре 37 оС в течение 1 ч. По окончании инкубации содержимое лунок удаляли и лунки промывали три раза раствором PBS/T. Во все лунки вносился раствор ослиных антител к иммуноглобулинам кролика, меченных пероксидазой хрена (фирма Amersham Biosciences), в разведении 1: 5000, как предложено фирмой производителем. Планшет инкубировали при температуре 37 оС в течение 1 часа. По окончании инкубации удаляли содержимое лунок и промывали их 3 раза, как описано ранее. Во все лунки вносили по 100 мкл субстрат-хромогенной смеси TMB (Sigma Super Slow), инкубировали при комнатной температуре в темноте и через 10-15 минут добавляли 50 мкл 10% раствора серной кислоты для остановки реакции. Оптическую плотность измеряли на планшетном фотометре. Фоном служили лунки, в которые не добавляли антиген. 101 3.12. Выделение мембранного рецептора. Солюбилизация рецептора Буфер для солюбилизации: 50 мМ Tris, pH 7,5 с добавленными протеазными ингибиторами PMSF (Sigma) (1 мМ), коктейлем ингибиторов протеаз (Calbiochem) в концентрации, указанной изготовителем, и детергентом Triton X100 (Sigma) (1 % по объѐму). Клетки L-929 в количестве ~90 млн. клеток суспендировали в 1,5 мл солюбилизационного буфера. После инкубации на качалке в течение 30 мин, на льду, полученная суспензия разводилась в 10 раз добавлением солюбилизационного буфера, не содержащего детергента, и центрифугировалась при 185 000 g (Beckman L7 Ultracentrifuge) в течение 1 ч при 4 °C. Супернатант аккуратно отбирался и использовался для иммунноаффинной хроматографии. Кросс-сшивка рецептора Tag7-Hsp70 с рецептором TNFR1 на поверхности клеток L-929 Белки Tag и Hsp70 метили биотином, затем готовили комплекс Tag7-Hsp70, используя один из белков с меткой, а другой без метки. Адгезионные клетки L-929 в количестве ~108 наращивали в пластиковых плашках, затем десорбировали с плашек при помощи трипсинолиза и переносили в полипропиленовую пробирку (Corning) объѐмом 50 мл. Далее все процедуры проводили при 4 °C. Клетки трижды промывали в 20 мл PBS pH 7.4, после каждой промывки центрифугировали при 1000 g и супернатант устраняли. Затем клетки суспендировали в 30 мл DMEM, добавляли 10 нМ Tag7-Hsp70 и инкубировали в течение 2 ч на качалке. Клетки дважды промывали в DMEM для устранения несвязавшегося Tag7-Hsp70, затем трижды в PBS pH 7.4. Супернатант устраняли, клетки суспендировали в 1 мл PBS, pH 8.0, после чего добавляли сшивающий агент BS 3 (Pierce) до конечной концентрации 1 мМ. После инкубации в течение 40 мин реакцию останавливали добавлением хлорида аммония (NH4Cl) до конечной концентрации 20 мМ. Клетки инкубировали ещѐ в течение 10 мин, затем дважды промывали в PBS, pH 7.4. Затем клетки суспендировали в 50 мМ Tris, pH 7.5. 102 После этого добавляли ингибиторы протеаз и проводили солюбилизацию рецептора, как описано выше, используя Triton X-100 в качестве детергента. 3.13. Определение цитотоксической активности. Цитотоксическая активность (цитотоксичность) комплексов и инкубационной среды клеток CSML-0 определяли следующим образом. Клетки линии L-929 культивировались в 96-луночной плашке, в среде RPMI 1640 (по 200 мкл среды на лунку). Опыты проводились при концентрации ~30 тысяч клеток в лунке. Перед добавлением образцов супернатант удалялся. Образцы растворялись и добавлялись в 200 мкл среды RPMI 1640. При использовании ингибиторов клетки предварительно инкубировались с ионолом (1 мкМ), хлорохином (5 мкМ), EGTA (2 мМ), Nec-1 (5 мМ), каспазными ингибиторами Z-YVAD-CHO (5 мМ), AcIETD-CHO (5 мМ). При исследовании влияния антител к TNFR1 на цитотоксическую активность Tag7-Hsp70 добавляли поликлональные антитела к TNFR1 в различных разведениях (1:4000, 1:2000, 1:1000, 1:500). После инкубации при 37 °C в атмосфере CO 2 клетки окрашивали 0,0125% раствором трипанового синего. Количество клеток с повреждѐнной мембраной подсчитывалось под микроскопом в камере Фукса-Розенталя. Обрабатывалось минимум 100 клеток для каждого образца. Цитотоксичность вычислялась по следующей формуле: Цитотоксичность St Sp 100% T Sp , где St – количество окрашенных клеток, Sp – количество спонтанно окрашенных клеток (контроль), T – общее количество клеток. При всех измерениях клеточная смерть в контрольных образцах не превышала 3 %. Погрешность в измерении цитотоксической активности измерялась по величине среднеквадратичного отклонения. В отдельных случаях 20-часовая цитотоксичность также проверялась при помощи MTT-теста. Для этого в каждую лунку 96-луночной планшета, содержащую по 200 мкл среды RPMI-1640 или клеток со средой (не менее 5 000 103 клеток на лунку), вносили по 20 мкл раствора MTT (5 г/л). После этого клетки культивировали в инкубаторе во влажной атмосфере при 37 °C, 5% CO 2 в течение 4 ч. По окончании инкубации супернатант аккуратно устраняли, не затрагивая кристаллы формазана, после чего в каждую лунку вносили по 150 мкл DMSO (Sigma). Осадок ресуспендировали, после чего планшет помещали на качалку и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Оптическую плотность определяли, используя ИФА-ридер (iMark Microplate reader, Bio-Rad) при длине волны 490 нм. Цитотоксичность рассчитывали по формуле: Цитотоксичность, % = (1 – ОПО − ОПЭ ОПМ − ОПС ) × 100 % , где ОПО – оптическая плотность в опытных пробах (клетки-мишени с цитотоксическим фактором), ОПЭ – оптическая плотность в контрольных пробах с цитотоксическим фактором, ОПМ – оптическая плотность в контрольных пробах (клетки-мишени без цитотоксического фактора), ОПС – оптическая плотность среды. 3.14. Микроскопия. Клетки CSML-0 культивировались на стеклянных покровных стѐклах и фиксировались раствором 3,7 % формальдегида в 0,9% NaCl, pH 7,4, в течение 20 мин при 37 ºC. Клетки промывались трижды PBS, после чего их мембраны дезинтегрировались 0,2 %-ым раствором сапонина в течение 5 мин при комнатной температуре. После промывки в PBS, образцы помещались в блокирующий раствор (1 % BSA в PBS) на 1 ч при комнатной температуре. Затем добавлялись первичные антитела и проводилась инкубация в течение 30 мин при 4 ºC. После этого проводилась промывка и добавлялись вторичные антитела, меченные флуорохромом, и проводилась инкубация в течение 30-60 мин при комнатной температуре, в темноте. Использовались флуорохромы Alexa 488 (зелѐный) и 104 Alexa 546 (оранжевый). После промывки в PBS, NH4Cl (50 мМ) и H2O, покровные стѐкла фиксировались в реагенте ProLong Gold (Invitrogen). Образцы анализировали на микроскопе Leica TCS SP2 (Wetzlar, Germany). Полученные изображения редактировали в программе Photoshop. 105 Выводы 1. Установлено, что белок Tag7 образует с белком HspBP1 стабильный комплекс в кондиционной среде клеток опухолевой линии CSML-0 и в сыворотке крови человека. Взаимодействие Tag7 с HspBP1 препятствует формированию цитотоксически активного комплекса Tag7-Hsp70 и может служить защитной мерой организма от действия этого комплекса. 2. Показано, что Tag7-Hsp70 индуцирует в опухолевых клетках два альтернативных механизма клеточной смерти: апоптоз и некроптоз. 3. Из гетерогенной культуры L-929 выделены клоны, в которых под действием Tag7-Hsp70 запускается только один механизм клеточной смерти. 4. Установлено, ферментов что хлорохин антиоксидант и хелатор ионол, кальция ингибитор лизосомальных EGTA ингибируют некроптоз, запускаемый под действием комплекса Tag7-Hsp70. 5. Показано, что Tag7-Hsp70, как и классический цитокин TNF-α, индуцирует цитотоксические процессы в опухолевых клетках, взаимодействуя с рецептором TNFR1. 106 Список литературы 1. Гордеева А.В., Лабас Ю.А., Звягильская Р.А. (2004). Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция. Биохимия. 69(10): 1301-1313. 2. Коробко Е.В., Прохорчук Е.Б., Коробко И.В., Георгиев Г.П., Киселев С.Л. (1998). Секреция цитотоксического белка Tag7 в ответ на обработку клеток липополисахаридом. ДАН. 360(6): 838-40. 3. Кустикова О. С., Киселев С. Л., Бородулина О. Р. и др. (1996). Клонирование гена tag7, экспрессирующегося в метастазирующих опухолях мыши. Генетика. 32(5): 621-628. 4. Тейлор Д., Грин Н., Стаут У. (2006). Биология. — М.: МИР. 5. Acehan D., Jiang X., Morgan D.G., Heuser J.E., Wang X., et al. (2002). Threedimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol. Cell. 9: 423–432. 6. Barnhart B.C., Alappat E.C., Peter M.E. (2003). The CD95 type I/type II model. Semin. Immunol. 15: 185–193. 7. Bertelsen E.B., Chang L., Gestwicki J.E., Zuiderweg E.R. (2009). Solution conformation of wild-type E. coli Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(21): 8471-8476. 8. Bertrand M. et al. (2008). cIAP1 and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol. Cell 30, 689–700. 9. Blomgran R., Zheng L., Stendahl O. (2007). Cathepsin-cleaved BID promotes apoptosis in human neutrophils via oxidative stress-induced lysosomal membrane permeabilization. J. Leukoc. Biol. 81: 1213–1223. 10. Boatright K.M., Renatus M., Scott F.L., Sperandio S., Shin H., Pedersen I.M., Ricci J.E., Edris W.A., Sutherlin D.P., Green D.R., Salvesen G.S. (2003). A unified model for apical caspase activation. Mol. Cell. 11(2): 529-541. 11. Boya P., Kroemer G. (2008). Lysosomal membrane permeabilization in cell death. Oncogene. 27(50): 6434-6451. 12. Brennan M.A., Cookson B.T. (2000). Salmonella induces macrophage death by caspase-1-dependent necrosis. Mol. Microbiol. 38: 31–40. 107 13. Carswell E. et al. (1975) An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. PNAS USA 72(9): 3666-3670. 14. Cascino I., Fiucci G., Papoff G., Ruberti G. (1995). Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing. J. Immunol. 154: 2706 –2713. 15. Castino R., Bellio N., Nicotra G., Follo C., Trincheri N.F., Isidoro C. (2007). Cathepsin D-Bax death pathway in oxidative stressed neuroblastoma cells. Free Radic. Biol. Med. 42: 1305–1316. 16. Chan F.K., Chun H.J., Zheng L., Siegel R.M., Bui K.L., Lenardo M.J. (2000). A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling. Science. 288(5475): 2351-2354. 17. Cheng, J., Zhou, T., Liu, C., Shapiro, J. P., Brauer, M. J., Kiefer, M. C., Barr, P. J., and Mountz, J. D. (1994). Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science 263: 1759 –1762. 18. Cheng-Hung Yen and Chang-Hsien Yang. (1998). Evidence for Programmed Cell Death during Leaf Senescence in Plants. Plant Cell Physiol. 39(9): 922-927. 19. Clancy L., Mruk K., Archer K., Woelfel M., Mongkolsapaya J., Screaton G., Lenardo M.J. and Chan F.K. (2005). Preligand assembly domain-mediated ligandindependent association between TRAIL receptor 4 (TR4) and TR2 regulates TRAILinduced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 18099–18104. 20. Conus S., Perozzo R., Reinheckel T., Peters C., Scapozza L., Yousefi S., Simon H.U. (2008). Caspase-8 is activated by cathepsin D initiating neutrophil apoptosis during the resolution of inflammation. J. Exp. Med. 205: 685–698. 21. Croft M., Duan W., Choi H., Eun S.Y., Madireddi S., Mehta A. (2012). TNF superfamily in inflammatory disease: translating basic insights. Trends Immunol. 33(3): 144-152. 22. Daugas E., Susin S.A., Zamzami N., Ferri K.F., Irinopoulou T., Larochette N., Prévost M.C., Leber B., Andrews D., Penninger J., Kroemer G. (2000). Mitochondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. FASEB J. 14(5): 729-739. 108 23. De Duve C., Pressman B.C., Gianetto R., Wattiaux R., Appelmans F. (1955). Tissue fractionation studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue. Biochem. J. 60(4): 604-917. 24. Degterev A., Huang Z., Boyce M., Li Y., Jagtap P., Mizushima N., Cuny G.D., Mitchison T.J., Moskowitz M.A., Yuan J. (2005). Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nat. Chem. Biol. 1(2): 112-119. 25. Denecker G., Hoste E., Gilbert B., Hochepied T., Ovaere P., Lippens S., Van den Broecke C., Van Damme P., D'Herde K., Hachem J.P., et al. (2007). Caspase-14 protects against epidermal UVB photodamage and water loss. Nat. Cell Biol. 9: 666– 674. 26. Dewson G., Kratina T., Sim H.W., Puthalakath H., Adams J.M., Colman P.M., Kluck R.M. (2008). To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell 30: 369–380. 27. Doitsh G., Galloway N.L., Geng X., Yang Z., Monroe K.M., Zepeda O., Hunt P.W., Hatano H., Sowinski S., Muñoz-Arias I., Greene W.C. (2014). Cell death by pyroptosis drives CD4 T-cell depletion in HIV-1 infection. Nature. 505(7484): 509-14. 28. Du C., Fang M., Li Y., Li L. and Wang X. (2000). Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102: 33–42. 29. Dukhanina E.A., Kabanova O.D., Lukyanova T.I., Shatalov Y.V., Yashin D.V., Romanova E.A., Gnuchev N.V., Galkin A.V., Georgiev G.P., Sashchenko L.P. (2009). Opposite roles of metastasin (S100A4) in two potentially tumoricidal mechanisms involving human lymphocyte protein Tag7 and Hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(33): 13963-13967. 30. Düssmann H., Rehm M., Concannon C.G., Anguissola S., Würstle M., Kacmar S., Völler P., Huber H.J., Prehn J.H. (2010). Single-cell quantification of Bax activation and mathematical modelling suggest pore formation on minimal mitochondrial Bax accumulation. Cell Death Differ. 17: 278–290. 109 31. Dziarski R., Gupta D. (2006). The peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). Genome Biol. 7: 232.1–232.13. 32. Dziarski R., Kashyap D.R., Gupta D. (2012). Mammalian peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating two-component systems and modulate microbiome and inflammation. Microb. Drug Resist. 18(3): 280-285. 33. Dziarski R., Platt K.A., Gelius E., Steiner H. and Gupta D. (2003). Defect in neutrophil killing and increased susceptibility to infection with non-pathogenic Grampositive bacteria in peptidoglycan recognition protein-S (PGRP-S)-deficient mice. Blood, 102: 689-697. 34. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. (1999). Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis. Ann. Rev. Biochem. 68: 383-424. 35. Eckelman B.P., Salvesen G.S. and Scott F.L. (2006). Human inhibitor of apoptosis proteins: why XIAP is the black sheep of the family. EMBO Rep. 7: 988–994. 36. Eckhart L., Ballaun C., Uthman A., Kittel C., Stichenwirth M., Buchberger M., Fischer H., Sipos W., Tschachler E. (2005). J. Biol. Chem. 280: 35077-35080. 37. Eckhart L., Ban J., Fischer H., Tschachler E. (2000). Caspase-14: analysis of gene structure and mRNA expression during keratinocyte differentiation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(3): 655-659. 38. Ellis H.M, Horvitz H.R. (1986). Genetic Control of Programmed Cell Death in the Nematode C. elegans. Cell. 44, 817-829. 39. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. (1998). A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD. Nature. 391: 43-50. 40. Evdonin A., Kinev A., Tsupkina N., Guerriero V., Raynes D.A., Medvedeva N. (2009). Extracellular HspBP1 and Hsp72 synergistically activate epidermal growth factor receptor. Biol. Cell. 101(6): 351-360. 41. Fehrenbacher N., Bastholm L., Kirkegaard-Sorensen T., Rafn B., Bottzauw T., Nielsen C., Weber E., Shirasawa S., Kallunki T., Jäättelä M. (2008). Sensitization to the 110 lysosomal cell death pathway by oncogene-induced down-regulation of lysosomeassociated membrane proteins 1 and 2. Cancer Res. 68: 6623–6633. 42. Felding-Habermann B. (2003). Integrin adhesion receptors in tumor metastasis. Clin. Exp. Metastasis 20: 203-213. 43. Feldstein A.E., Werneburg N.W., Li Z., Bronk S.F., Gores G.J. (2006). Bax inhibition protects against free fatty acid-induced lysosomal permeabilization. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290: G1339–G1346. 44. Festjens N., Kalai M., Smet J., Meeus A., Van Coster R., Saelens X., Vandenabeele P. (2006). Butylated hydroxyanisole is more than a reactive oxygen species scavenger. Cell Death Differ. 13(1): 166-169. 45. Finucane D.M., Bossy-Wetzel E., Waterhouse N.J., Cotter T.G., Green D.R. (1999). Bax-induced caspase activation and apoptosis via cytochrome c release from mitochondria is inhibitable by Bcl-xL. J. Biol. Chem. 274, 2225–2233. 46. Foghsgaard L., Wissing D., Mauch D., Lademann U., Bastholm L., Boes M., Elling F., Leist M., Jäättelä M. (2001). Cathepsin B acts as a dominant execution protease in tumor cell apoptosis induced by tumor necrosis factor. J. Cell Biol. 153 : 999–1010. 47. Frisch S.M. and Francis H. (1994). Disruption of epithelial cell–matrix interactions induces apoptosis. J. Cell Biol. 124: 619–626. 48. Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D., Caron A.W., Rits S., et al. (1997). Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J. Biol. Chem. 272: 18033–18037. 49. Galluzzi L., Kroemer G. (2008). Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis. Cell 135(7): 1161-1163. 50. Galluzzi L., Vanden Berghe T., Vanlangenakker N., Buettner S., Eisenberg T., Vandenabeele P., Madeo F., Kroemer G. (2011). Programmed Necrosis: From Molecules to Health and Disease. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 289: 1-35. 51. Galluzzi L., Vitale I., Abrams J.M., Alnemri E.S., Baehrecke E.H. et al. (2012). Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19: 107-120. 111 52. Ganguly K.K., Pal S., Moulik S., Chatterjee A. (2013). Integrins and metastasis. Cell Adh. Migr. 7(3): 251-261. 53. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A. (1992). Identification of Programmed Cell Death In Situ via Specific Labeling of Nuclear DNA Fragmentation. J. Cell Biol. 119(3): 493-501. 54. George N.M., Evans J.J., Luo X. (2007). A three-helix homo-oligomerization domain containing BH3 and BH1 is responsible for the apoptotic activity of Bax. Genes Dev. 21: 1937–1948. 55. Goldstein J., Waterhouse N., Juin P., Evan G., Green D. (2000). The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nat. Cell Biol. 2: 156–162. 56. Graner M.W., Raynes D.A., Bigner D.D. Guerriero V. (2009). Heat shock protein 70-binding protein 1 is highly expressed in high-grade gliomas, interacts with multiple heat shock protein 70 family members, and specifically binds brain tumor cell surfaces. Cancer Science 100: 1871–1879. 57. Granger G., Kolb W. (1968). Lymphocyte in vitro cytotoxicity: mechanisms of immune and non-immune small lymphocyte mediated target L cell destruction. Journal of Immunology 101: 111-120. 58. Granger G.A., Shacks S.J., Williams T.W., Kolb W.P. (1969). Lymphocyte in vitro cytotoxicity: Specific release of Lymphotoxin-like materials from tuberculin sensitive lymphocyte cells. Nature 221(5186): 1155-1157. 59. Granot T., Milhas D., Carpentier S., Dagan A., Ségui B., Gatt S., Levade T. (2006). Caspase-dependent and -independent cell death of Jurkat human leukemia cells induced by novel synthetic ceramide analogs. Leukemia. 20(3): 392-399. 60. Grebenyuk E.S., Stupnikova T.V., Sakharov D.A., Shleptsova V.A., Sashchenko L.P., Tonevitsky E.A. (2010). Long-term exercises increase the concentration of HspBP1, a co-chaperone of 70-KDa heat shock protein. Bull. Exp. Biol. Med. 149: 640e644. 112 61. Guan R., Wang Q., Sundberg E.J. & Mariuzza R.A. (2005). Crystal structure of human peptidoglycan recognition protein S (PGRP-S) at 1.70 A resolution. J. Mol. Biol. 347(4), 683-691. 62. Guicciardi M.E., Bronk S.F., Werneburg N.W., Yin X.M., Gores G.J. (2005). Bid is upstream of lysosome-mediated caspase 2 activation in tumor necrosis factor alphainduced hepatocyte apoptosis. Gastroenterology 129: 269–284. 63. Guicciardi M., Gores G. (2009). Life and death by death receptors. FASEB J. 23(6): 1625-1637. 64. Gyrd-Hansen M., Farkas T., Fehrenbacher N., Bastholm L., Hoyer-Hansen M., Elling F., Wallach D., Flavell R., Kroemer G., Nylandsted J., Jäättelä M. (2006). Apoptosome-independent activation of the lysosomal cell death pathway by caspase-9. Mol. Cell. Biol. 26: 7880–7891. 65. Hanayama R., Tanaka M., Miwa K., Shinohara A., Iwamatsu A. and Nagata S. (2002). Nature 417: 182–187. 66. Haraguchi M., Torii S., Matsuzawa Si, Xie Z., Kitada S., Krajewski S., Yoshida H., Mak T.W., Reed J.C. (2000). Apoptotic protease activating factor 1 (Apaf-1)independent cell death suppression by Bcl-2. J. Exp. Med. 191: 1709–1720. 67. Hartl F.U. and Hayer-Hartl M. (2009). Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct. Mol. Biol. 16(6): 574-581. 68. Hayakawa M., Ishida N., Takeuchi K., Shibamoto S., Hori T., Oku N., Ito F., Tsujimoto M. (1993). Arachidonic acid-selective cytosolic phospholipase A2 is crucial in the cytotoxic action of tumor necrosis factor. J. Biol. Chem. 268(15): 11290-11295. 69. Hehlgans T., Pfeffer G. (2005). The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology 115(1): 1-20. 70. Helson L., Green S., Carswell E., Old L.J. (1975). Effect of tumour necrosis factor on cultured human melanoma cells. Nature 258(5537): 731-732. 71. Hochman A. (1997). Programmed cell death in prokariotes. Crit. Rev. Microbiol. 23(3), 207-214. 113 72. Hoffmann J.A. (2003). The immune response of Drosophila. Nature. 426(6962): 33-38. 73. Jäättelä M., Wissing D., Bauer P.A., Li G.C. (1992). Major heat shock protein hsp70 protects tumor cells from tumor necrosis factor cytotoxicity. EMBO J. 11(10): 3507–3512. 74. Kadowaki H., Nishitoh H., Ichijo H. (2004). Survival and apoptosis signals in ER stress: the role of protein kinases. J. Chem. Neuroanat. 28: 93–100. 75. Kågedal K., Zhao M., Svensson I., Brunk U.T. (2001). Sphingosine-induced apoptosis is dependent on lysosomal proteases. Biochem. J. 359(Pt 2): 335–343. 76. Kågedal K., Johansson A.C., Johansson U., Heimlich G., Roberg K., Wang N.S., Jürgensmeier J.M., Öllinger K. (2005). Lysosomal membrane permeabilization during apoptosis – involvement of Bax? Int. J. Exp. Pathol. 86: 309–321. 77. Kampinga H.H., Craig E.A. (2010). The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11(8): 579-592. 78. Kang D., Liu G., Lundström A., Gelius E., Steiner H. (1998). A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans. PNAS USA. 95(17): 10078-10082. 79. Kashyap D.R., Wang M., Liu L.H., Boons G.J., Gupta D., Dziarski R. (2011). Peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating protein-sensing twocomponent systems. Nat. Med. 17(6): 676-683. 80. Kietzman C., Tuomanen E. (2011). PGRPs kill with an ancient weapon. Nat. Med. 17(6): 665-666. 81. Kirkegaard T., Roth A.G., Petersen N.H., Mahalka A.K., Olsen O.D., Moilanen I., Zylicz A., Knudsen, J., Sandhoff, K., Arenz, C., Kinnunen, P.K., Nylandsted, J., Jäättelä M. (2010). Hsp70 stabilizes lysosomes and reverts Niemann–Pick diseaseassociated lysosomal pathology. Nature. 463: 549–553. 82. Kiselev S.L., Kustikova O.S., Korobko E.V., Prokhortchouk E.B., Kabishev A.A., Lukanidin E.M., Georgiev G.P. (1998). Molecular Cloning and Characterization of the Mouse tag7 Gene Encoding a Novel Cytokine. J. Biol. Chem. 273: 18633-18639. 114 83. Kroemer G. (2000). Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. FASEB J. 14: 729–739. 84. Kroemer G., Galluzzi L., Brenner C. (2007). Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87(1): 99-163. 85. Kroemer G. et al. (2009). Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death Differ. 16: 3–11. 86. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. 87. Lafont E., Milhas D., Teissié J., Therville N., Andrieu-Abadie N., Levade T., Beoist H., Ségui B. (2010). Caspase-10-Dependent Cell Death in Fas/CD95 Signalling Is Not Abrogated by Caspase Inhibitor zVAD-fmk. PloS One. 5(10): e13638. 88. Levine B., Yuan J. (2005). Autophagy in cell death: An innocent convict? J. Clin. Invest. 115: 2679–2688. 89. Li L.Y., Luo X., Wang X. (2001). Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature. 412(6842): 95-99. 90. Liang H., Fesik S.W. (1997). Three-dimensional structures of proteins involved in programmed cell death. J. Mol. Biol. 274(3): 291–302. 91. Lippens S., Kockx M., Knaapen M., Mortier L., Polakowska R., Verheyen A., Garmyn M., Zwijsen A., Formstecher P., Huylebroeck D., Vandenabeele P., Declercq W. (2000). Epidermal differentiation does not involve the pro-apoptotic executioner caspases, but is associated with caspase-14 induction and processing. Cell Death Differ. 7(12): 1218-1224. 92. Liu C., Xu Z., Gupta D., Dziarski R. (2001). Peptidoglycan recognition proteins: a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules. J. Biol. Chem. 276: 34686–34694. 93. Lu G., Walsh C. (2012). Programmed necrosis and autophagy in immune function. Immunol. Rev. 249(1): 205-217. 94. Luo X., Budihardjo I., Zou H., Slau ghter C., Wang X. (1998). Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell. 94(4): 481-490. 115 95. MacKenzie S.H., Clark A.C. (2012). Death by caspase dimerization. Adv. Exp. Med. Biol. 747: 55-73. 96. Malladi S., Challa-Malladi M., Fearnhead H.O. and Bratton S.B. (2009). The Apaf-1•procaspase-9 apoptosome complex functions as a proteolytic-based molecular timer. EMBO J. 28: 1916–1925. 97. Martinon F., Tschopp J. (2004). Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases. Cell. 117(5): 561-574. 98. Mehlen P., Bredesen D. (2011). Patched dependence receptor triggers apoptosis through ubiquitination of caspase-9. Sci. Signal. 4(157): mr2. 99. Metzstein M.M., Stanfield G.M., Horvitz H.R. (1998). Genetics of programmed cell death in C. elegans: past, present and future. Trends Genet. 14(10): 410-416. 100. Michel T., Reichhart J.M., Hoffmann J.A., Royet J. (2001). Drosophila Toll is activated by Gram-positive bacteria through a circulating peptidoglycan recognition protein. Nature. 414(6865): 756-759. 101. Miramar M.D., Costantini P., Ravagnan L., Saraiva L.M., Haouzi D., Brothers G., Penninger J.M., Peleato M.L., Kroemer G., Susin S.A. (2001). NADH oxidase activity of mitochondrial apoptosis-inducing factor. J. Biol. Chem. 276: 16391– 16398. 102. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L., Denis-Larose C., Massie B. (1997). Mol. Cell Biol. 17(9): 5317-5327. 103. Nakagawa T., Zhu H., Morishima N., Li E., Xu J., et al. (2000). Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta. Nature 403, 98–103. 104. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F., Drouet C., Robert C., Guillermet C., Brambilla C., Brambilla E. (1996). In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations. J. Histochem. Cytochem. 44(9), 959-68. 105. Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F. (1998). Importance of DNA fragmentation in apoptosis with regard to TUNEL specificity. Biomed Pharmacother. 52(6), 252-258. 116 106. Overholtzer M., Mailleux A.A., Mouneimne G., Normand G., Schnitt S.J., King R.W., Cibas E.S., Brugge J.S. (2007). A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell, 131: 966–979. 107. Polster B.M., Basañez G., Etxebarria A., Hardwick J.M., Nicholls D.G. (2005). Calpain I induces cleavage and release of apoptosis-inducing factor from isolated mitochondria. J. Biol. Chem. 280(8): 6447-6454. 108. Raynes D.A., Guerriero V. Jr. (1998). Inhibition of Hsp70 ATPase activity and protein renaturation by a novel Hsp70-binding protein. J. Biol. Chem. 273(49): 32883-32888. 109. Reed J.C. (1997). Cytochrome c: Can't Live with It—Can't Live without It. Cell 91: 559–562. 110. Repnik U., Turk B. (2010). Lysosomal–mitochondrial cross-talk during cell death. Mitochondrion 10: 662–669. 111. Rozman-Pungercar J., Kopitar-Jerala N., Bogyo M., Turk D., Vasiljeva O., Stefe I., Vandenabeele P., Brömme D., Puizdar V., Fonović M., Trstenjak-Prebanda M., Dolenc I., Turk V., Turk B. (2003). Inhibition of papain-like cysteine proteases and legumain by caspase-specific inhibitors: when reaction mechanism is more important than specificity. Cell Death Differ. 10(8), 881-888. 112. Saito M., Korsmeyer S.J. and Schlesinger P.H. (2000). BAX-dependent transport of cytochrome c reconstituted in pure liposomes. Nature Cell Biol. 2, 553– 555. 113. Saleh M., Vaillancourt J.P., Graham R.K., Huyck M., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Steinberg M.H., Nolan V., Baldwin C.T., Hotchkiss R.S., Buchman T. G., Zehnbauer B.A., Hayden M.R., Farrer L.A., Roy S., Nicholson D.W. (2004). Differential modulation of endotoxin responsiveness by human caspase-12 polymorphisms. Nature. 429 (6987): 75-79. 114. Sashchenko L.P., Dukhanina E.A., Yashin D.V., Shatalov Y.V., Romanova E.A., Korobko E.V., Demin A.V., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Khaidukov S.V., Kiselev S.L., Gabibov A.G., Gnuchev N.V., Georgiev G.P. (2004). Peptidoglycan 117 recognition protein tag7 forms a cytotoxic complex with heat shock protein 70 in solution and in lymphocytes. J. Biol. Chem. 279(3): 2117-2124. 115. Scaffidi C. et al. (1998). Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. EMBO J. 17: 1675-1687. 116. Schulze-Osthoff K., Bakker A.C., Vanhaesebroeck B., Beyaert R., Jacob W.A., Fiers W. (1992). Cytotoxic activity of tumor necrosis factor is mediated by early damage of mitochondrial functions. Evidence for the involvement of mitochondrial radical generation. J. Biol. Chem. 267: 5317-5323. 117. Schweichel J.-U., Merker H.-J. (1973). The morphology of various types of cell death in prenatal tissues. Teratology 7: 253-266. 118. Shomura Y., Dragovic Z., Chang H.C., Tzvetkov N., Young J.C., Brodsky J.L., Guerriero V., Hartl F.U., Bracher A. (2005). Regulation of Hsp70 function by HspBP1: structural analysis reveals an alternate mechanism for Hsp70 nucleotide exchange. Mol. Cell 17: 367–379. 119. Siegel R.M., Frederiksen J.K., Zacharias D.A., Chan F.K., Johnson M., Lynch D., Tsien R.Y., Lenardo M.J. (2000). Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science 288(5475): 23542357. 120. Sprick M.R., Rieser E., Stahl H., Grosse-Wilde A., Weigand M.A., Walczak H. (2002). Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO J. 21: 4520–4530. 121. Stauber G.B., Aiyer R.A., Aggarwal B.B. (1988). Human tumor necrosis factor-a receptor. J. Biol. Chem. 263, 19098-19104. 122. Suzuki Y. et al. (2001). A serine protease, HtrA2, is released from the mitochondria and interacts with XIAP, inducing cell death. Mol. Cell 8: 613–621. 123. Tait W.G., Green D.R. (2010). Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11(9): 621-632. 118 124. Tanimura S., Hirano A.I., Hashizume J., Yasunaga M., Kawabata T., Ozaki K., Kohno M. (2007). Anticancer drugs up-regulate HspBP1 and thereby antagonize the prosurvival function of Hsp70 in tumor cells. J. Biol. Chem. 282(49): 35430-35439. 125. Thornberry N.A., Rano T.A., Peterson E.P., Rasper D.M., Timkey T., Garcia-Calvo M., Houtzager V.M., Nordstrom P.A., Roy S., Vaillancourt J.P., Chapman K.T., Nicholson D.W. (1997). A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J. Biol. Chem. 272(29): 17907-17911. 126. Turk B., Stoka V., Rozman-Pungercar J., Cirman T., Droga-Mazovec G., Oresić K., Turk V. (2002). Apoptotic pathways: involvement of lysosomal proteases. Biol. Chem. 383(7-8): 1035-1044. 127. Vandenabeele P., Galluzzi L., Berghe T.V., Kroemer G. (2010). Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11(10): 700-714. 128. Vanhaesebroeck B., Bladel S.V., Leanarts A., Suffys P., Beyaert R., Lucas R., Roy F.V., Fiers W. Two discrete types of tumor necrosis factor-resistant cells derived from the same cell line. (1991). Cancer research. 51: 2469-2477. 129. Vanlangenakker N., Vanden Berghe T., Krysko D.V., Festjens N., Vandenabeele P. (2008). Molecular mechanisms and pathophysiology of necrotic cell death. Curr. Mol. Med. 8(3): 207-220. 130. Vercammen D., Beyaert R., Denecker G., Goossens V., Van Loo G., Declercq W., Grooten J., Fiers W., Vandenabeele P. (1998). Inhibition of caspases increases the sensitivity of L929 cells to necrosis mediated by tumor necrosis factor. J. Exp. Med. 187(9): 1477-1485. 131. Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M., Silke J., Connolly L.M., Reid G.E., Moritz R.L., Simpson R.J., Vaux D.L. (2000). Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell 102: 43–53. 132. Vermes I., Haanen C., Steffens-Nakken H., Reutelingsperger C. (1995). A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression 119 on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods 184(1), 39-51. 133. Wang Y., Kim N.S., Haince J.F., Kang H.C., David K.K., Andrabi S.A. Poirier G.G., Dawson V.L., Dawson T.M. (2011). Poly(ADP-ribose) (PAR) binding to apoptosis-inducing factor is critical for PAR polymerase-1-dependent cell death (parthanatos). Sci. Signal 4: ra20. 134. Wei M.C., Zong W.X., Cheng E.H., Lindsten T., Panoutsakopoulou V., Ross A.J., Roth K.A., MacGregor G.R., Thompson C.B., Korsmeyer S.J. (2001). Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292, 727–730. 135. Werneburg N., Guicciardi M.E., Yin X.M., Gores G.J. (2004). TNF-alpha- mediated lysosomal permeabilization is FAN and caspase 8/BID dependent. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 287, G436–G443. 136. Youle R.J. and Strasser A. (2008). The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9(1): 47-59. 137. Yue X.L., Lehri S., Li P., Barbier-Chassefiere V., Petit E., Huang Q.F., Albanese P., Barritault D., Caruelle J.P., Papy-Garcia D., Morin C. (2009). Insights on a new path of pre-mitochondrial apoptosis regulation by a glycosaminoglycan mimetic. Cell Death Differ. 16: 770–781. 138. Yuste R., MacLean J.N., Smith J., Lansner A. (2005). The cortex as a central pattern generator. Nat. Rev. Neurosci. 6(6): 477-483. 139. Zhao M., Brunk U.T., Eaton J.W. (2001). Delayed oxidant-induced cell death involves activation of phospholipase A2. FEBS Lett. 509: 399–404. 120 Благодарности Автор выражает глубокую признательность доктору биологических наук, профессору Сащенко Лидии Павловне за чуткое и всестороннее руководство на всех этапах исследования. Автор искренне благодарен к.б.н. Яшину Денису Владимировичу за руководство исследованиями, помощь в планировании и постановке экспериментов. Автор благодарит сотрудников лаборатории «Молекулярной иммуногенетики рака» за помощь и поддержку на всех этапах работы и создание тѐплой доброжелательной атмосферы в лаборатории, способствующей научному процессу: к.б.н. Кабанову Ольгу Дмитриевну, к.б.н. Лукьянову Тамару Ивановну, к.б.н. Духанину Елену Анатольевну, к.б.н. Романову Елену Анатольевну, Лупкину Наталью Ивановну и чл.-корр. РАН Гнучева Николая Васильевича. Автор благодарит чл.-корр. РАН Тоневицкого Александра Григорьевича и сотрудников Всероссийского НИИ физической культуры и спорта за предоставление антител и сыворотки крови для исследований. Автор признателен сотрудникам д.б.н. Шидловскому Юлию Валерьевичу и всем лаборатории «Регуляции экспрессии генов в развитии» за доброжелательное отношение и моральную поддержку. Отдельно хочется выразить благодарность дирекции и администрации ИБГ РАН за создание исследований. благоприятных условий и атмосферы для научных
