Набор «ФБиоНуклео» для выделения нуклеиновых кислот из

Набор «ФБиоНуклео»
для выделения нуклеиновых
кислот из биологического
материала
(НК-1-4, НК-1-50)
Содержание
Компоненты набора ........................................................................................................................ 3
Ограничения на использование продукта
.................................................................... 3
Гарантия .................................................................................................................................................... 3
Техника безопасности ................................................................................................................... 3
Описание ................................................................................................................................................... 4
Принцип действия ............................................................................................................................. 4
Необходимое оборудование и материалы ..................................................................... 5
Важные замечания ............................................................................................................................ 6
Предварительная подготовка образцов ........................................................................... 6
Протокол выделения ....................................................................................................................... 7
Решение проблем ............................................................................................................................... 8
Контроль качества............................................................................................................................. 8
Условия и срок хранения ............................................................................................................ 9
Служба технической поддержки........................................................................................... 9
Информация для заказов ............................................................................................................. 9
2
Компоненты набора
Набор «ФБиоНуклео»
на 4
выделения
Центрифужные колонки
4
силикатной мембраной
Буфер ПГ*
3.5 мл
Буфер ПЕ (концентрат)
2х0.7 мл/2.0 мл
Буфер ЕБ
0.5 мл
Собирающие пробирки
4
(2 мл)
Руководство
1
на 50
выделений
50
на 250
выделений
250
2х22 мл
3х68 мл
2х8.75 мл/25 мл 43.75 мл/125 мл
4 мл
20 мл
50
250
1
1
*Буфер ПГ содержит хаотропные соли, которые являются раздражителями.
Соблюдайте необходимые меры безопасности при работе в лаборатории,
используйте перчатки.
Ограничения на использование продукта
Набор «ФБиоНуклео» не может быть использован в медицинских или лечебных
целях.
Гарантия
Фрактал Био гарантирует изготовление всех продуктов согласно описанию в
руководстве. Покупатель должен определить соответствие продукта для
конкретного его использования. Если продукт не дает заявленного результата по
любой причине, за исключением неправильного использования, мы бесплатно
произведем замену продукта или вернем покупателю его полную стоимость. Мы
сохраняем за собой право изменять или модифицировать любой продукт в целях
улучшения его применения и дизайна. Если у вас возникли вопросы по
применению продукта или оценке результата, вы можете обращаться в Службу
технической поддержки (см. на обороте).
Техника безопасности
При работе с реактивами всегда используйте верхнюю лабораторную одежду,
одноразовые перчатки и защитные очки. Необходимо соблюдать осторожность и
быть внимательным при обращении с большинством материалов, описанных в
данном руководстве. Полную информацию о рисках и мерах предосторожности
можно найти в паспорте безопасности вещества.
Буфер ПГ
Содержит гуанидин тиоционат - Xn Вреден для здоровья
Факторы риска:
3
R20/21/22 Вреден при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании
R32 Контакт с кислотами приводит к выделению крайне токсичного газа
Меры предосторожности:
S13 Хранить отдельно от продуктов питания, животного корма
S26 В случае попадания в глаза немедленно промыть большим количеством воды
и обратится к врачу
S36 Использовать соответствующую защитную одежду
S46 При проглатывании немедленно обратится за медицинской помощью и
показать контейнер или этикетку
Описание
Набор «ФБиоНуклео» разработан для выделения до 10 мкг нуклеиновых кислот
(НК) из биологического материала.
Таблица 1. Технические характеристики набора
Максимальная связывающая
10 мкг НК
способность
Минимальный объем элюции
30 мкл
Объем колонки
800 мл
Выделяемая НК
ДНК, РНК
Набор «ФБиоНуклео» обеспечивает эффективное и чистое выделение
нуклеиновых кислот для прямого использования в различных целях (например,
рестрикция, ПЦР, гибридизация и т.д.).
Принцип действия
Система для выделения «ФБиоНуклео» объединяет удобство использования
центрифужных колонок со специфическими связывающими свойствами
силикатной мембраны. Специальные буферы в составе набора являются
оптимальными для эффективного извлечения нуклеиновых кислот и удаления
контаминантов. Нуклеиновые кислоты связываются с силикатной мембраной при
высокой концентрации соли, в то время как контаминанты проходят сквозь
колонку. Нуклеиновые кислоты элюируются буфером, содержащим Трис (рН 8.5)
или водой.
1. Лизис клеток
Лизис клеток происходит за счёт содержащегося в буфере ПГ гуанидин
тиоционата. Клеточные оболочки осаждаются центрифугированием, а
супернатант, содержащий НК, переносится на центрефужную колонку с
силикатной мембраной.
2. Связывание нуклеиновых кислот с силикатной мембраной
Силикатная мембрана колонок предназначена исключительно для очистки НК из
водных растворов и может связывать до 10 мкг НК. Связывающий буфер в наборе
4
«ФБиоНуклео» обеспечивает соответствующую концентрацию соли и pH для
связывания НК с мембраной колонки. Связывание нуклеиновых кислот с
силикатной поверхностью происходит только при наличии высокой концентрации
хаотропных солей.
Связывание НК с силикатной мембраной также зависит от pH. При pH≤7.5
связывается около 95% НК. При более высоких значениях pH связывание резко
снижается.
3. Очистка нуклеиновых кислот
На этапе связывания НК примеси (соли, ферменты, нуклеотиды) не
адсорбируются на силикатной мембране и проходят сквозь колонку. Соли
отмываются буфером ПЕ, содержащим этанол. Остаточные количества буфера
ПЕ, которые могут ингибировать последующие энзиматические реакции,
удаляются дополнительным этапом центрифугирования.
4. Эффективность элюции
Эффективность элюции сильно зависит от pH элюирующего буфера и
концентрации соли в нем. В противоположность связыванию элюция наиболее
эффективна при основном pH и низкой концентрации солей. НК элюируются 50
или 30 мкл буфера ЕБ (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) или воды. Максимальная
эффективность элюции достигается при pH в диапазоне 7.5-8.5. НК,
элюированные водой, должны храниться при -20°C, так как НК могут
деградировать при отсутствии буферного агента. Элюция буфером ТЕ не
рекомендуется, так как ЭДТА может ингибировать последующие энзиматические
реакции.
5. Эффективность выделения НК
Качество и количество выделенных НК зависит от 3х факторов: объем
элюирующего буфера, точность нанесения буфера на колонку и время инкубации
буфера на колонке. 100-200 мкл элюирующего буфера полностью покрывают
мембрану колонки, обеспечивая максимальное извлечение НК, даже если
нанесены не на центр мембраны. Элюция объемом менее 50 мкл требует
добавления буфера ровно на центр мембраны и, если элюция проводиться
минимальным рекомендуемым объемом 30 мкл, дополнительной инкубации в
течение 1 минуты для оптимального извлечения.
Эффективность выделения может быть определена путем проведения
электрофореза проб в агарозном геле.
Необходимое оборудование и материалы
При работе с реактивами всегда используйте лабораторную защитную одежду,
одноразовые перчатки и защитные очки. Более подробную информацию можно
найти в паспорте безопасности веществ.
•
Этанол (96-100%)
•
Микроцентрифуга
5
•
•
Пластиковые микропробирки объёмом 1.5 мл
Дистиллированная вода (при необходимости)
Важные замечания
Прочтите внимательно данный раздел до начала выполнения работ.
Добавьте этанол (96-100%) в буфер ПЕ перед первым использованием (см.
табл. 2)
Центрифугирования в каждом шаге выделения осуществляется при 13000
об/мин (17900хg) в стандартной настольной микроцентрифуге при комнатной
температуре.
Проверьте буферы на наличие осадка перед использованием. Если в
буферах образовался осадок, то необходимо его растворить нагреванием буферов
до 37 оС и перемешиванием непосредственно перед использованием. Убедитесь,
что все буферы и центрифужные колонки имеют при использовании комнатную
температуру.
Рекомендуется проводить отрицательный контроль – выделение из воды,
и использовать его при последующих постановках обратной транскрипции и ПЦР
Выделенные НК следует хранить при -20 оС.
Таблица 2. Расчет количества добавляемого этанола к буферу ПЕ
На 4
На 50
На 250
выделения
выделений
выделений
Буфер ПЕ
1.4 мл
8.75 мл (х2)
43.75 мл (х2)
концентрированный
Этанол 96%
2.6 мл
16.25 мл (х2)
81.25 мл (х2)
Общий объем
4.0 мл
25 мл (х2)
125 мл(х2)
Предварительная подготовка образцов
Ткань
Гомогенизировать в ступке с жидким азотом, с помощью пестика или любым
другим способом. Взять 25-40 мг гомогената и добавить воды до 100 мкл.
Культура клеток
Собрать клетки центрифугированием. На одно выделение взять не более 50 мкл
осадка клеток. К осадку добавить воды до 100 мкл.
Биологические жидкости
Не требуют предварительной подготовки
6
Протокол выделения
Данный протокол разработан для выделения тотальных НК из биологического
материала. На одной колонке может обрабатываться до 100 мкл пробы.
1
Действия
Добавьте 800 мкл буфера ПГ к 100 мкл пробы.
2
Инкубируйте микропробирки со смесью 5 минут при комнатной
температуре периодически встряхивая на вортексе
3
Проведите центрифугирование в течение 5 минут при 13000 об/мин
(17900хg), чтобы осадить оболочки клеток.
4
Перенесите с помощью пипетки 800 мкл супернатанта на прилагаемую
к набору центрифужную колонку. Избегайте взбалтывания и переноса
осадка. Проведите центрифугирование в течение 60 с.
5
Удалите сток и поместите колонку обратно в собирающую пробирку.
6
Для отмывки добавьте 450 мкл буфера ПЕ на центрифужную колонку и
проведите центрифугирование в течение 60 с.
7
Повторите процедуру отмывки еще раз.
8
Удалите сток и проведите дополнительное центрифугирование в
течение 1 мин для удаления остатков буфера ПЕ. Этот этап необходим
для удаления остаточного этанола с мембраны колонки.
9
Перенесите центрифужную колонку в чистую микропробирку объемом
1.5 мл. Для элюирования НК добавьте необходимое количество буфера
ЕБ или воды (30 - 50 мкл) в центр мембраны колонки и проведите
центрифугирование в течение 1 мин.
При последующей постановке обратной транскрипции с помощью
наборов компании Фрактал Био, НК рекомендуется элюировать 15 мкл
буфера ЕБ или воды. Таким образом, для приготовления смеси для
обратной транскрипции следует использовать весь элюат (10 мкл).
Важно: Убедитесь, что буфер ЕБ наносится точно на мембрану для
полной элюции связанной НК.
Замечания: Избегайте контакта наконечника пипетки с мембраной.
10
НК хранить при -20 оС.
7
Решение проблем
Проблема
Малое количество выделяемых НК
Применение выделенных НК в
последующих
процедурах
неэффективно
Комментарий
Буфер ПЕ не содержал этанол:
Перед
использованием
в
концентрированный
буфер
ПЕ
необходимо добавить этанол.
Неэффективное элюирование НК:
Буфер ЕБ должен наноситься по центру
мембраны для более эффективного
элюирования;
Элюирование должно осуществляться
безсолевым буфером, pH которого
составляет 7.5-8.5.
В
элюате
слишком
высокая
концентрация солей:
Модифицируйте
этап
отмывки,
инкубируя колонку в течение 5 мин. при
комнатной
температуре
после
добавления буфера ПЕ. Затем проведите
центрифугирование.
В элюате содержатся остатки этанола:
Убедитесь, что весь сток буфера ПЕ
после отмывки удален из собирающей
пробирки перед тем, как проводить
дополнительный
осушающий
этап
центрифугирования в течение 1 мин.
Также можно провести дополнительный
этап
подсушки
мембраны
перед
добавлением буфера ЕБ. Для этого
инкубируйте колонку в течение 5 мин.
при комнатной температуре после
осушающего этапа центрифугирования.
Контроль качества
Набор тестируется выделением РНК из биологической жидкости в соответствии с
протоколом, описанным выше. Качество выделяемой РНК оценивается
проведением обратной транскрипции и постановкой ПЦР в реальном времени.
8
Условия и срок хранения
Набор «ФБиоНуклео» следует хранить в сухом месте при комнатной температуре
(15-25 оС). Набор может храниться до 12 месяцев без изменения качественных
характеристик. Для более длительного хранения набор можно держать при 2-8 оС.
Служба технической поддержки
В случае появления вопросов обращайтесь в службу технической поддержки:
technic@fractalbio.co
Информация для заказов
Название
Набор
«ФБиоНуклео»
4
Набор
«ФБиоНуклео»
50
Состав
Кат.номер
Для 4 выделений:
НК-1-4
4 центрифужных колонки, реактивы,
буферы, собирающие пробирки (2 мл)
Для 50 выделений:
НК-1-50
50 центрифужных колонок, реактивы,
буферы, собирающие пробирки (2 мл)
9
Произведено: ООО “Фрактал Био”,
190020, г. Санкт-Петербург, ул. Бумажная, д. 17
сайт: fractalbio.com
E-mail: info@fractalbio.com
Контактный телефон/факс: (812) 495-96-95
Дата изготовления: 2011
10