Ковалёва Мария Владимировна ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ
advertisement
На правах рукописи Ковалёва Мария Владимировна ИНДУКЦИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ВНУТРЕННЕЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA Специальность 03.00.04 – «биохимия» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА 2009 Работа выполнена в лаборатории биологического окисления Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.Д. Миронова доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Защита состоится «17» декабря 2009 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33 стр. 1 Автореферат разослан 16.10.2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Исследования последнего десятилетия привели к осознанию того, что митохондрии, по крайней мере, в клетках высших эукариот, помимо их известной роли в энергизации клетки и общем клеточном обмене, играют решающую роль в индукции апоптоза. Изучению апоптоза придается большое значение, так как этот процесс является важнейшей составляющей процессов онтогенеза, морфогенеза, противоопухолевой и противовирусной защиты организма. В ряде случаев, напротив, он лежит в основе патогенетических механизмов, как это происходит при септическом шоке, инфаркте миокарда, инсульте, нейродегенеративных заболеваниях и т.д. До недавнего времени полагали, что апоптоз свойственен лишь многоклеточным организмам, обладающим способностью к цитологической дифференцировке. Первое указание на возможность клеточной смерти дрожжей по механизму, напоминающему апоптоз, пришло из экспериментов, в которых животные про- или анти-апоптотические белки были гетерологически экспрессированы в дрожжах S. cerevisiae и изучено их влияние на клеточную физиологию (Priault, M. et.al., 2003). В этих опытах дрожжевые клетки либо умирали, демонстрируя набор физиологических маркеров апоптоза, либо избегали смерти, в зависимости от присутствия про- или анти-апоптотических белков. В дальнейшем в геноме различных видов дрожжей были обнаружены эндогенные гены-гомологи факторов апоптоза человека и животных. В 2002 г. в дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован и первый белок, участвующий в эффекторной стадии апоптоза у дрожжей – метакаспаза-1 (Madeo, F. et. al., 2002) (Yca1p) - цистеиновая протеаза, функционально аналогичная митохондриальным каспазам животных. С тех пор были получены многочисленные доказательства смерти дрожжевых клеток (в основном, S. cerevisiae) по механизму апоптоза как в ответ на внешние стимулы или повреждения клеточных структур, так и в результате репликативного или хронологического старения (Laun, P. et. al., 2006, 2008; Herker, E. et. al., 2004). При этом наряду с метакаспазой-1 в них доказано участие белков-гомологов факторов апоптоза человека: HtrA2 (Fahrenkrog, B. et. al., 2004), AIF и AMID (Wissing, S. et. al., 2004); Dnm1p (Fannjiang, Y. et. al., 2004), ответственного за дробление митохондрий человека, цитохрома с (Ludovico, P. et. al., 2002; Silva, R.D. et. al., 2005), эндонуклеазы G (Büttner, S. et. al., 2007; Cymerman, I.A. et. al., 2008), Rho5 GTPазы (при апоптозе, запускаемом активными формами кислорода) (Singh, K. et. al., 2008) и пока единственного известного антиапоптотического фактора Bir1p (Owsianowski, E. et. al., 2008). Совокупность этих данных можно рассматривать как веское указание на то, что программа апоптоза дрожжей и животных может иметь общие элементы. Особая роль митохондрий в системе выбора клетки между жизнью и смертью определяется тем, что они являются и основными генераторами активных форм кислорода в клетке, а их межмембранное пространство служит депо проапоптотических факторов. При повреждении внешней мембраны проапоптотические факторы выходят из митохондрий в цитоплазму, запускают и усиливают каскад реакций, приводящий в конечном итоге к гибели клетки. Для митохондрий животных известны два основных пути выхода апоптотических факторов в цитоплазму. Один из них включает активацию, конформационную перестройку и интеграцию во внешнюю мембрану митохондрий проапоптотического белка Bax, члена семейства белков Bcl-2. Другим способом является увеличение проницаемости митохондрий в результате открытия пор. В случае митохондрий дрожжей вопрос о механизмах выхода апоптотических факторов из митохондрий в цитоплазму изучен недостаточно. Твердо установлено лишь, что геном дрожжей не содержит генов белков семейства Bcl-2. Данные же относительно возможности индукции неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий фрагментарны и противоречивы. Поэтому данная работа направлена на поиск и изучение способов (как ранее найденных в митохондрий животных, так и новых) индукции неспецифической проницаемости во внутренней митохондриальной мембране дрожжей. В качестве объекта исследования использовали дрожжи Yarrowia lipolytica, облигатные аэробы, содержащие полностью компетентную дыхательную цепь со всеми тремя пунктами энергетического сопряжения и альтернативой хорошо-структурированные более традиционному кристы, объекту поэтому изучения являющиеся механизмов лучшей апоптоза у одноклеточных – митохондриям дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось систематическое исследование мембраны возможности митохондрий индукции дрожжей неспецифической Y. lipolytica, проницаемости определение условий внутренней индукции проницаемости и изучение её регуляции. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи: 1. Проанализировать противоречивые литературные данные о существовании неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей. 2. Исследовать возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны классического типа (Са2+-фосфат-зависимый, циклоспорин А- чувствительный механизм). 3. Изучить существование в митохондриях дрожжей Y. lipolytica иных механизмов индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны: а) циклоспорин А-нечувствительного, индуцируемого низкими концентрациями Ca2+ и жирными кислотами; б) запускаемого окислительным стрессом; в) ATP-зависимого К+-специфичного ионного канала. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые на систематической основе исследована возможность индукции проницаемости внутренней митохондриальной мембраны дрожжей Y. lipolytica. Показано, что в исследованных митохондриях не индуцируется Са2+-фосфат-зависимая, циклоспоринчувствительная пора; пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipolytica без образования мегаканала. Обнаружен лишь ATPзависимый К+-канал, “животного” типа, специфически открываемый добавлением ATP. Результаты настоящей диссертационной работы дополняют полученные к настоящему времени данные о возможности индукции неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей и её регуляции, и позволяют приблизиться к пониманию того, каким образом дрожжевые митохондрии могут принимать участие в процессе апоптоза. Обнаруженное нами впервые сходство (митоКАТР) митохондрий животных и дрожжей Y. lipolytica позволяет рассматривать разработанную нами модель в качестве перспективной для изучения регуляции и структуры митохондриального К+-канала, которому в настоящее время отводится важная роль в защите сердечной мышцы от последствий ишемии. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Всероссийской конференции молодых учёных и II школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эммануэля (1 – 3 июня 2006, Москва, РФ); 14-й и 15й Европейских Биоэнергетических Конференциях (EBEC) (22 – 27 июля 2006, Москва, РФ); 32-ом, 33-м и 34-м FEBS Конгрессах (7 – 13 июля 2007, Вена, Австрия; 2008, Афины, Греция; 4 – 9 июля 2009, Прага, Чешская Республика); 24-й конференции «Дрожжевой транспорт и энергетика» (2006, 31 августа – 3 сентября, Прага, Чешская Республика); 2-м Съезде микологов России с международным участием “Современная микология в России” (11 – 15 мая 2008, Москва, РФ). Публикации. По материалам диссертационной работы имеется 1 публикация в J. Bioenerg. Biomembr., международном рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК РФ для защиты по специальности «биохимия», а также 9 тезисов докладов на конференциях. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста, содержит ____ рисунков и ___ таблиц. Список цитируемой литературы включает ____ наименований, в том числе _____ на иностранных языках. Сокращения, принятые в тексте. МитоК+АТР – ATP-зависимый К+-канал митохондрий животных; mPTP – (mitochondrial permeability transition, pore) – неспецифическая проницаемость внутренней митохондриальной мембраны; ΔΨ – электрический трансмембранный потенциал; ЭГТА – этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый эфир)-N`,N`,N`,N`-тетрауксусная кислота; Рн – неорганический фосфат; КЦХФ – карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон; ЕТН129 – специфический кальциевый ионофор; БСАfaf – бычий сывороточный альбумин, свободный от примеси жирных кислот; TEACl – тетраэтиламмоний хлорид; 5-HD – 5-гидроксидекановая кислота. Объект и методы исследования Организм и условия выращивания. В работе использовали дрожжи Yarrowia. lipolytica (Wick.) van der Walt and Arx, полученные из эпифитной микрофлоры листьев пустынных растений (пустыня Негев, Израиль) и идентифицированные на основании совокупности морфологических, физиологических, биохимических, хемотаксономических характеристик и молекулярно-генетического анализа как анаморфа Y. lipolytica (Zvyagilskaya, R, et. al., 2001). Клетки выращивали на 750-мл колбах Эрленмейера (рабочий объем – 100 мл) при 28 oC на роторной качалке (220 об/мин) на полусинтетической среде (Андреищева, Е.Н., et. al., 1997), содержавшей в качестве источника углерода и энергии 1%-ый сукцинат. Выделение митохондрий осуществляли по методу, разработанному в нашей лаборатории и описанному ранее (Zvyagilskaya, R.A. et. al., 2004) с небольшими модификациями. Полученные митохондриальные препараты были полностью активны в течение, по крайней мере, 4 ч после выделения при хранении на льду. Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом в ячейке (рабочий объём 1 мл) c закрытым кислородным электродом типа Кларка. Основная среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 – 7,4, 20 мМ пируват, 5 мМ малат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл). Потенциал, генерируемый на внутренней митохондриальной мембране, регистрировали на спектрофотометре Beckman coulter DU-650, используя двуволновой режим (511 – 533 нм) с сафранином О в качестве потенциал-зависимого зонда (Akerman, K.E.O., and Wikstrom, M.K.F., 1976). Среда инкубации содержала 0,6 М маннит, 0,2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,2 – 7,3, 20 мМ пируват и 5 мМ малат или 20 мМ сукцинат и митохондриальный белок (0,5 мг/мл). Набухание митохондрий регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония), по уменьшению оптической плотности митохондриальной суспензии при 540 нм. Митохондриальный белок определяли по методу Брэдфорд (Bradford, M.M., 1976) с БСА в качестве стандарта. Результаты и их обсуждение Митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены «классической» Са2+-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры В работе использовали прочно-сопряженные митохондриальные препараты, выделенные из дрожжей Y. lipolytica. Они сохраняли регуляцию метаболического состояния, окисляли добавленные субстраты с высокими скоростями, высокими (порядка 4) величинами дыхательного контроля и величинами ADP/O, близкими к теоретически ожидаемым. Митохондриальные препараты в присутствии экзогенных субстратов поддерживали неизменным ∆ψ в течение длительного времени (10 – 15 мин) и не набухали даже в гипотонической среде. Отсутствие набухания не было связано со структурными ограничениями, поскольку добавление аламетицина (который при встраивании в мембраны, образует поры диаметром 1 нм, способные пропускать низкомолекулярные вещества) вызывало высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий. Выделенные препараты митохондрий удовлетворяли и другим известным критериям физиологической интактности. В соответствии с задачами исследования, мы исследовали чувствительность митохондрий Y. lipolytica к факторам, вызывающим образование классической mPTP в митохондриях животных. Об образовании пор(ы) судили, как это принято в литературе, по совокупности двух параметров – снижению мембранного потенциала (∆ψ) и высокоамплитудному набуханию митохондрий. Прежде всего, мы нашли, что прочно-сопряженные митохондрии Y. lipolytica лишены природной системы транспорта Ca2+. Они не транспортировали Ca2+ даже в присутствии спермина, ADP, NADH, которые существенно улучшают кинетические параметры кальциевого унипортера в митохондриях животных. Митохондрии Y. lipolytica оказались устойчивыми к действию повышенных концентраций Ca2+, даже в присутствии микромолярных концентраций ЭГТА (Рис. 1), добавляемых к митохондриям животных для предотвращения обратимой активности Ca2+ унипортера и тем самым для достижения высокой [Ca2+] в митохондриальном матриксе, необходимой для открытия mPTP. Мембранный потенциал (511-533 нм) 2+ 2+ Са 0.16 300 мкМ Са 300 мкМ 2+ Са 400 мкМ КЦХФ 25 нМ 0.12 Рн 2 мМ ЭГТА 25 мкМ 0.08 0.04 0.00 -0.04 Мтх 0 100 200 300 400 Время, сек 500 600 Рис. 1. Влияние Ca2+ на мембранный потенциал митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер рН 7,3 – 7,4, 20 мМ Trisпируват, 5 мМ Tris-малат, 20 мкМ сафранин О, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. Где указано, добавлены ЭГТА, неорганический фосфат (Рн) и КЦХФ. Поэтому в дальнейших исследованиях мы использовали специфический кальциевый ионофор ETH129, который, встраиваясь в мембраны, образует селективный Са2+ канал. Сам ионофор ETH129 не влиял на скорость поглощения кислорода дрожжевыми митохондриями, величину мембранного потенциала и набухание органелл. При одновременном добавлении к митохондриям Y. lipolytica ионофора и умеренных концентраций Са2+ наблюдалось ускорение дыхания в «состоянии 4» до максимально возможного уровня, наблюдаемого в присутствии разобщителя КЦХФ и существенное снижение мембранного потенциала (Рис. 2), свидетельствовавшие о разобщение окисления и фосфорилирования, деполяризации мембраны и об индукции в этих условиях футильного Ca2+-цикла, вероятнее всего, в результате активации Са2+/H+-обмена. 2+ Мембранный потенциал (511-533 нм) Са 1 мМ ETH 10 мкМ ЭГТА 1 мМ КЦХФ 25 нМ 0.16 0.12 N-Ац 5 мM Рн 2 мМ 0.08 0.04 0.00 Мтх -0.04 0 100 200 300 400 Время, сек 500 600 Рис. 2. Влияние Са2+, ЕТН129 (ЕТН), N-ацетилцистеина (N-Aц), Рн и ЭГТА на генерацию мембранного потенциала митохондриями Y. lipolytica. Состав среды инкубации как на рис. 1. Где указано, добавлен КЦФХ. Снижение мембранного потенциала, вызываемое одновременным добавлением к митохондриям Y. lipolytica Са2+ и ETH129, не было чувствительно к действию водорастворимого антиоксиданта N-ацетилцистеина (N-Ац) и частично восстанавливалось добавлением неорганического фосфата (Рис. 2), индуктора mPTP в митохондриях животных. Са2+-ETH-зависимое снижение мембранного потенциала не было чувствительно и к действию циклоспорина А (ЦсА), ADP и Mg2+ – ингибиторам классической ЦсА-зависимой поры животных. Дрожжевые митохондрии не набухали в присутствии ETH129 и увеличивающихся концентраций Са2+ (Рис. 3). Отсутствие набухания не было связано со структурными ограничениями, поскольку в присутствии антибиотика аламетицина наблюдалось высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий. 0.34 2+ ETH 10 мкМ Набухание (540 нм) 0.32 Ca 2+ Ca 300 мкМ 300 мкМ 2+ Рн Ca 400 мкМ 2 мМ 2 1 0.30 Алам 2,6 мкг/мл 0.28 0.26 0.24 0 50 100 150 200 Время, сек 250 3 300 Рис. 3. Влияние Ca2+, Рн, ETH129 (ETH) и аламецитина (Алам) на набухание митохондрий Y. lipolytica. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер рН 7,2 – 7,4, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. (1) – контроль, митохондрии в среде инкубации; (2) – где указано, добавлены ЕTH129, Ca2+ и Рн; (3)- аламетицин. Совокупность полученных данных позволила сделать вывод, что митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены классической Ca2+-зависимой, циклоспорин А-чувствительной поры. Более того, неорганический фосфат, стимулирующий открытие Ca2+-зависимой поры в митохондриях животных, в дрожжевых митохондриях вызывал частичное восстановление мембранного потенциала. В митохондриях дрожжей Y. lipolytica не индуцируется Са2+/пальмитат-зависимая пора Из литературных данных известно (Sultan, A., and Sokolove, P., 2001; Mironova, G.D., et. al., 2001), что низкие концентрации Сa2+ и насыщенных жирных кислот (пальмитата или стеарата) индуцировали в митохондриях животных открытие небелковой поры, характеризующейся нечувствительностью к циклоспорину А и неорганическому фосфату, отсутствием селективности для ионов дивалентных металлов, большей чувствительностью к Сa2+ по сравнению с классической Сa2+/Pн-зависимой порой, и способностью спонтанно закрываться. На дрожжевых митохондриях исследования такого рода не проводились, в том числе не было изучено влияние на них жирных кислот. Мы нашли, что: 1) пальмитиновая кислота (а также стеариновая и пентадекановая) не может использоваться митохондриями Y. lipolytica в качестве субстрата окисления, скорость дыхания в присутствии 50 мкМ пальмитата практически не отличалась от скорости дыхания на эндогенном субстрате (Рис. 4, кривая 1). 2) Как и в митохондриях животных (Mironova, et al. 2001; Sultan and Sokolove, 2001), насыщенные жирные кислоты являются разобщителями добавление их в низких (микромолярных) концентрациях к митохондриям, окисляющим пируват + малат или сукцинат, стимулировало дыхание в «состоянии 4» (Рис. 4, кривая 2) и снижало мембранный потенциал. Более того, атрактилозид, ингибитор транслоказы адениновых нуклеотидов, снимал (Рис. 4, кривая 3) и предотвращал стимуляцию дыхания, вызванную добавлением насыщенной жирной кислоты. Следовательно, в митохондриях Y. lipolytica, как и в митохондриях животных, насыщенные жирные кислоты транспортируются через транслоказу адениновых 2+ нуклеотидов. Однако, в отличие от митохондрий животных, добавление Сa к митохондриям дрожжей, обработанным насыщенными жирными кислотами, не вызывало дополнительных изменений в энергетических параметрах. Лишь в присутствии Сa2+ ионофора ETH129 имело место дополнительное снижение мембранного потенциала (Рис. 5), которое, как мы видели ранее, было вызвано, по всей вероятности, активацией Са2+/Н+-обмена, зависимое от эндогенных жирных кислот, поскольку полностью снималось добавлением БСА (Рис. 5). ЭГТА, хелатор Сa2+, снимал дополнительное снижение мембранного потенциала, вызванное Сa2+ и ETH129. Инкубация митохондрий с Са2+ и пальмитиновой кислотой не вызывала высокоамплитудного набухания митохондрий ни в отсутствие, ни в присутствии ЕТН129. Поглощение кислорода, нА 700 Пальм 50 мкМ Мтх 600 1 Атр 60 мкМ 500 Мтх 400 ПК+М 300 20 мМ Пальм 50 мкМ 200 3 100 2 0 0 1 2 3 Время, мин 4 5 Рис. 4. Влияние пальмитиновой кислоты (Пальм) и атрактилозида (Атр) на дыхание митохондрий дрожжей Y. lipolytica. Состав среды инкубации: 0,6 М маннит, 2 мМ Trisфосфатный буфер рН 7,2 – 7,4, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-пируват, 5 мМ Tris-малат, митохондриальный белок 0,5 мг/мл. (1) – митохондрии в среде без субстрата дыхания, где указано, добавлены пальмитиновая кислота (Пальм); (2) – пируват + малат (ПК+М), пальмитиновая кислота; (3) – пируват + малат, пальмитиновая кислота и атрактилозид (Атр). Следовательно, митохондрии дрожжей Y. lipolytica лишены поры, зависимой от насыщенных жирных кислот и Сa2+. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий, без образования мегаканала. Таким образом, мы нашли, что в митохондриях Y. lipolytica не индуцируется Сa2+-зависимая пора даже в присутствии Сa2+-ионофора ЕТН129, обеспечивающего поглощение митхондриями значительных количеств Сa2+. Прооксиданты вызывают лишь снижение мембранного потенциала, но не образование мегаканала. По данным Kowaltowski et al. (2001), сферопласты S. сerevisiae дикого типа были устойчивы к высоким концентрациям Са2+, Pн или t-бутилпероксида, однако мембранный потенциал снижался в присутствии высоких (0,5 мМ) концентраций Ca2+ и гидрофобного дитиолсвязывающего агента фениларсеноксида (ФАО). Это дало основание авторам утверждать, что в митохондриях S. сerevisiae может индуцироваться Са2+-зависимая пора. Однако в работе отсутствовали контроли – как действуют прооксиданты без добавления Ca2+ и происходит ли набухание митохондрий или выход локализованных в митохондриях соединений. Мембранный потенциал (511-533 нм) Пальм 10 мкМ БСА 1 мг/мл КЦХФ 25 нМ 0.16 0.12 ETH 3 мкМ 0.08 2+ Ca 30 мкМ 0.04 0.00 Мтх -0.04 0 200 400 600 Время, сек. Рис. 5. Влияние пальмитата (Пальм), ETH129 (ETH), Сa2+ и бычьего сывороточного альбумина, свободного от жирных кислот (БСА), на генерацию мембранного потенциала митохондриями дрожжей Y. lipolytica. Состав среды инкубации см. рис. 1. Где указано, добавлен КЦХФ. В качестве первого шага в работе было исследовано влияние прооксидантов на энергетические параметры митохондрий. В качестве прооксидантов использовали: фениларзиноксид (гидрофобный бифункциональный SH-агент), менадион (гидрофильный монофункциональный SH-агент), оксалоацетат (окислитель эндогенного пула NADH) и некоторые другие прооксиданты (например, диамид). Было найдено, что прооксиданты по-разному действовали на скорость дыхания дрожжевых митохондрий. Диамид в концентрации до 50 мМ и оксалоацетат в концентрациях 5 – 15 мМ не влияли на скорость дыхания, а также мембранный потенциал митохондрий. Менадион вызывал разобщение митохондрий, его “разобщающее” действие частично снижалось или предотвращалось водорастворимым антиоксидантом N-ацетилцистеином. Фениларсиноксид ингибировал дыхание митохондрий, причем тем больше, чем выше была его концентрация. Было исследовано влияние прооксидантов на мембранный потенциал митохондрий. Оксалоацетат, как указано выше, не вызывал снижения мембранного потенциала в концентрациях 15 – 20 мМ при окислении митохондриями сукцината или пирувата + малата. Менадион и фениларсиноксид, напротив, снижали мембранный потенциал, генерируемый дрожжевыми митохондриями при окислении сукцината или пирувата + малата, однако концентрации, вызывающие деполяризацию мембраны, были по крайней мере на порядок выше тех, которые оказывали аналогичный эффект на митохондрии животных. Для того чтобы избежать заметного разобщения или ингибирующего действия на дыхание, мы эмпирически подобрали такую комбинацию прооксидантов (менадиона, фениларзиноксида и оксалоацетата), которые вместе, но уже в относительно низких Мембранный потенциал (511-533 нм) концентрациях, вызывали деполяризацию дрожжевых митохондрий (Рис. 6). ФАО 30 мкМ Мен 30 мкМ ОА 3 мМ 0,15 КЦХФ 25 нМ 0,10 0,05 0,00 N-Aц 5 мМ Мтх -0,05 0 100 200 300 400 500 600 Время, сек Рис. 6. Совместное действие фениларсиноксида (ФАО), менадиона (Мен) и оксалоацетата (ОА) на величину мембранного потенциала митохондрий дрожжей Y. lipolytica «Ресопрягающий» эффект N-Ацетилцистеина (N-Ац). Среда инкубации как на рис. 1. Где указано, добавлен КЦХФ. Было обнаружено, что деполяризация мембраны, вызванная добавлением одного или нескольких прооксидантов, полностью снималась или предотвращалась N-ацетилцистеином и ATP (Рис. 6 и 7) и частично восстановленным глутатионом (не показано). “Ресопрягающее” действие ATP было специфичным, поскольку снималось карбоксиатрактилозидом, ингибитором транслоказы адениновых нуклеотидов, а также Mg2+. Другие использованные Мембранный потенциал (511-533 нм) нуклеотиды оказывали частичный “ресопрягающий” эффект (Рис. 7). Мен 30 мкМ ОА 3 мМ ФАО 30 мкМ 0.16 ATP 50 мкМ ADP 50 мкМ GTP 50 мкМ 0.12 2 0.08 3 Олиго 20 мкг/мл 0.04 КЦХФ 25 нМ 1 N-Aц 5 мМ 0.00 Мтх -0.04 0 100 200 300 400 Время, сек Рис. 7. «Ресопрягающий» эффект (1) – ATP, (2) – ADP, (3) – GTP на деполяризацию мембраны митохондрий Y. lipolytica, вызванную совместным действием фениларсиноксида (ФАО), менадиона (Мен) и оксалоацетата (ОА). Среда инкубации см. рис. 1. Где указано, добавлены: олигомицин (Олиго) ко всем, кроме АТР – (1), N-Ацетилцистеин (N-Ац) и КЦХФ. Было исследовано совместное действие прооксидантов и кальция (в присутствии ЕТН129) на митохондрии дрожжей Y. lipolytica. Наблюдалась незначительная стимуляция или ингибирование дыхания митохондрий (в зависимости от используемого прооксиданта), а также связанная с этим деполяризация мембраны. Прооксиданты, порознь, или в комбинации друг с другом, или с Ca2+ и ЕТН129, не вызывали высокоамплитудного набухания дрожжевых митохондрий. Таким образом, в митохондриях дрожжей Y. lipolytica прооксиданты порознь или в комбинации друг с другом и Ca2+ вызывали снижение мембранного потенциала, но не образование мегаканала В митохондриях Y. lipolytica обнаружен К+-канал, закрываемый при добавлении ATP В митохондриях S. cerevisiae была обнаружена неспецифическая пора (названная также YMUC – yeast mitochondrial unspecific channel – дрожжевым митохондриальным неспецифическим каналом), открываемая, в противоположность митоК+ATP каналу митохондрий животных, в ответ на добавление ATP и закрываемая при дефиците ATP. YMUC имеет, по-видимому, те же размеры, что и mPTP животных, и активен in situ (Manon S. et. al., 1998). Поэтому мы попытались установить, содержат ли прочно-сопряженные митохондрии дрожжей Y. lipolytica канал такого типа. Однако, мы обнаружили, что добавление 2 мМ ATP, вызывавшее высокоамплитудное набухание митохондрий S. cerevisiae (Jung, D.W., et al, 1997), не вызывало набухания митохондрий дрожжей Y. lipolytica, напротив, имело место ингибирование спонтанного набухания органелл (Рис. 8, кривая 2). Отсутствие ATP-индуцируемого набухания не было связано со структурными ограничениями, так как добавление каналоформера аламетицина (Рис. 8, кривая 3) или калиевого ионофора валиномицина (Рис. 9, кривые 1 и 2) приводило к высокоамплитудному (максимально возможному) набуханию митохондрий. Это наблюдение побудило нас подробнее исследовать влияние ATP на набухание митохондрий Y. lipolytica. Набухание имело место в KCl-среде (Рис. 9, кривая 1) и ингибировалось добавлением АТР (Рис. 9, кривая 2) c величиной (I50), равной 48 мкМ. Ингибирующий эффект ATP частично предотвращался неорганическим фосфатом (Pн) (Рис. 9, кривая 4) и Mg2+ (Рис. 9, кривая 3) . В присутствии этих реагентов величина I50 для АТР увеличивалась соответственно до 0,4 и 1,8 мМ. Атрактилозид – ингибитор транслоказы адениновых нуклеотидов и олигомицин – ингибитор синтеза АТР частично предотвращали ингибирующий эффект АТР, причем атрактилозид в большей степени, чем олигомицин, что позволяет предположить, что АТР действует главным образом с внешней стороны внутренней митохондриальной мембраны. Амплитуда набухания в KCl-среде была наибольшей при рН 7,5 (она была сопоставима с амплитудой набухания, вызываемой добавлением аламетицина) и уменьшалась примерно на 25-27% при снижении величины рН до 6,4. 0.34 ATP 2 мМ Набухание (540 нм) 0.32 2 1 0.30 0.28 Алам 2,6 мкг/мл 0.26 3 0.24 0 50 100 150 200 250 300 Время, сек Рис. 8. Влияние ATP (2) и аламетицина (Алам) (3) на набухание митохондрий Y. lipolytica в среде [Jung et al., 1997], содержащей 230 мМ маннит, 70 мМ сахарозу, 10 мМ НЕРЕS (К+), рН 7,3, 25 мкМ ЭГТА, 0,5 мг/мл БСА, 10 мкг/мл олигомицина, 0,5 мг/мл митохондриального белка. (1) – митохондрии в среде инкубации. Для того чтобы выяснить, селективен ли канал для ионов калия, мы исследовали набухание митохондрий Y. lipolytica в присутствии эквимолярных концентраций хлоридов K+, Na+, Li+, TEA+, Tris. Амплитуда набухания дрожжевых митохондрий была максимальной в 0,2 М KCl (принята за 100%) и составляла примерно 50% от максимальной в NaCl- и LiClсредах, 25% – в Tris-HCl-среде и около 10-15% в TEA-Cl-среде. Таким образом, можно утверждать, что ATP ингибировал пору (канал), индуцируемую главным образом моновалентными катионами, преимущественно K+. Данные, полученные при измерении набухания, получили подтверждение и при регистрации мембранного потенциала. Добавление к слегка гипотонической среде 50 мМ KCl вызывало снижение мембранного потенциала, последующее добавление ATP способствовало восстановлению величины мембранного потенциала до исходного значения. Концентрация ATP, вызывающая полумаксимальный ресопрягающий эффект, составляла 13,2 мкМ, что хорошо согласуется с данными по ингибирующему действию ATP на набухание митохондрий в KCl-среде. Незначительные различия могут быть связаны с разными условиями инкубации. В присутствии Mg2+, деполяризация мембраны, индуцируемая добавлением 50 мМ KCl, не менялась, но ATP восстанавливал мембранный потенциал лишь частично. Магний в концентрации 2 мМ увеличивал концентрацию ATP (I50 = 174 мкМ), необходимую для полумаксимального ингибирования деполяризации мембраны, вызванной добавлением КСl. Атрактилозид, как и в случае измерения набухания митохондрий, частично ингибировал ресопрягающий эффект АТР. ATP 1 мМ КЦХФ 25 нМ Мембранный потенциал (511-533 нм) КCl 50 мМ 0.16 1 0.12 2 0.08 0.04 0.00 Мтх 0 100 200 300 400 500 600 Время, сек Рис. 9. Влияние KCl и ATP (1) на мембранный потенциал, генерируемый митохондриями Y. lipolytica.Среда инкубации: 0,5 М маннит, 2 мМ Tris-фосфатный буфер, рН 7,3 – 7,4, 20 мМ Tris-сукцинат, 20 мкМ сафранин О, митохондриальный белок (Мтх) 0,5 мг/мл. (2) – в среду инкубации добавлен 2 мМ Mg2+; где указано, добавлен 25 нМ КЦХФ. “Ресопрягающий” эффект АТР строго зависел от концентрации добавленного KCl: чем выше была концентрация добавленного к митохондриям KCl, тем более высокие концентрации ATP были необходимы для реполяризации мембраны. В присутствии физиологической концентрации KCl, равной 100 мМ, концентрация ATP, вызывающая полное ресопряжение, составляла 300 мкМ. Концентрации маннита и KCl были подобраны таким образом, чтобы вместе они составляли изоосмотический раствор. Далее было исследовано влияние АТР на набухание митохондрий в KCl-среде в зависимости от степени энергизации митохондрий. Для этого подобрали концентрации разобщителя КЦХФ, снижающие мембранный потенциал, но еще не вызывающие дополнительного набухания митохондрий. Было выяснено, что снижение мембранного потенциала под действием разобщителя даже на 10% от максимальной величины (измеренной в отсутствии разобщителя) требовало существенно более высоких, уже не физиологических концентраций ATP для ингибирования набухания митохондрий в KClсреде. Это означает, что ATP-зависимое ингибирование набухания митохондрий (т. е. закрытие канала или поры) – это энергозависимый процесс. Таким образом, нами впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен ATP-зависимый K+-канал, закрывемый добавлением ATP и названный нами по аналогии с ATP-зависимым K+-каналом митохондрий животных – YмитоКАТР. Поскольку действие ATP на дрожжевые митохондрии было очень сходным с тем, что было описано для митохондрий животных (Миронова и др. 2004), нашим следующим шагом было систематическое исследование влияния на дрожжевые митохондрии веществ, известных как регуляторы митоКАТР. Диазоксид, один из самых известных открывателей митоКАТР митохондрий животных, в низких (микромолярных) концентрациях не влиял на величину мембранного потенциала дрожжевых митохондрий, но при этом индуцировал высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в KCl-среде, дополненной 1 мМ ATP (С50 = 20 мкМ). GTP, GDP и UDP (в присутствии 5-HD), другие известные открыватели митоКАТР митохондрий животных, внесенные после добавления ATP, вызывали повторную деполяризацию мембраны и набухание митохондрий в KCl-среде, дополненной 1 мМ ATP. Кромакалим, активатор митоК+АТР митохондрий животных, в низких концентрациях (до 5 мкМ) индуцировал высокоамплитудное набухание дрожжевых митохондрий в КCl-среде, содержащей 1 мМ ATP, а в более высоких концентрациях амплитуда набухания уменьшалась. Добавление 5-HD (5-гидроксидекановой кислоты), ингибитора митоКАТР, приводило к уменьшению амплитуды спонтанного набухания дрожжевых митохондрий в KCl-среде. Максимальный эффект 5-HD достигался в концентрациях 50 мкМ и 5 мМ. Таким образом, в митохондриях Y. lipolytica нами впервые обнаружен ATP-зависимый + К -канал, закрываемый, как и в митохондриях животных, при добавлении ATP. Ингибирующий эффект ATP частично снимался Mg2+ неорганическим фосфатом. 5-HD также ингибировала активность канала. Диазоксид, кромакалим, UDP, GDP и GTP, а также подщелачивание среды и снижение мембранного потенциала активировали YмитоК+ATP канал в митохондриях Y. lipolytica. Поскольку использованные нами вещества, известные как регуляторы митоКАТР, действовали на митохондрии дрожжей Y. lipolytica так же, как и на митохондрии животных (открыватели митоКАТР открывали и YмитоК+ATP, а закрыватели митоКАТР закрывали и YмитоК+ATP) и примерно в тех же концентрациях, можно заключить, что нам впервые удалось обнаружить в дрожжевых митохондриях митоКАТР “животного типа”, ингибируемый ATP. Более того, на основании проведенного ингибиторного анализа можно утверждать, что митоКАТР дрожжей Y. lipolytica содержит не только компоненты, образующие К+-канал, но и сенсор ATP. Поскольку принимается, что концентрация цитоплазматического ATP составляет примерно 1 мМ (большинство ATP-зависимых ферментов имеют величину Км для ATP, лежащую именно в этом диапазоне), это означает что в “нормальных условиях“ ATPзависимый К+-канал митохондрий Y. lipolytica, а возможно и других дрожжей аэробного типа обмена, ингибируемый микромолярными концентрациями ATP, должен находиться в закрытом состоянии. Однако, поскольку нами было найдено, что ингибирующий эффект ATP частично снимался Mg2+ и неорганическим фосфатом, можно предположить, что в физиологических условиях (при внутриклеточных концентрациях Mg2+ и Pн, равных примерно 5 – 10 мМ), ATP может реально выступать в качестве возможного модулятора ATP-зависимого K+-канала. Резкое снижение внутриклеточной концентрации ATP (ниже критического уровня) под действием разных неблагоприятных факторов может служить сигналом для открытия канала и, в конечном итоге, для запуска каскада реакций, ведущих к апоптозу. У факультативных анаэробов снижение внутриклеточного уровня ATP, напротив, будет способствовать закрытию канала, тем самым, обеспечивая возможность перехода на более эффективный – митохондриальный способ запасания энергии. Выводы 1. Митохондрии чувствительной Y. lipolytica поры. В лишены присутствие Са2+-фосфат-зависимой, кальциевого циклоспорин ионофора Са 2+ 2+ А- вызывал + значительную деполяризацию мембраны, за счет, вероятно, активации Са /H -обмена, без образования мегаканала. 2. В митохондриях дрожжей Y. lipolytica не индуцируется пора, открываемая при одновременном добавлении Са2+ и жирных кислот. Жирные кислоты вызывали лишь разобщение митохондрий. 3. Прооксиданты (фениларсеноксид, менадион, оксалоацетат), а также прооксиданты совместно с Са2+ (в присутствие Са2+ ионофора) вызывали лишь снижение мембранного потенциала митохондрий Y. lipolytica без образования мегаканала. 4. Впервые в дрожжевых митохондриях обнаружен АТР-ингибируемый калиевый канал, функционально сходный с аналогичным каналом митохондрий животных: канал содержит не только канальную субъединицу, но и сенсор ATP. Предполагается участие обнаруженного нами канала в запуске апоптоза дрожжевых клеток. Список публикаций Статья в рецензируемых журналах: Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Trendeleva T.A., Zyl'kova M.V., Ural'skaya L.A., Popova K.M., Saris N.E., Zvyagilskaya R.A. (2009) Induction of a non-specific permeability transition in mitochondria from Yarrowia lipolytica and Dipodascus (Endomyces) magnusii yeasts. J Bioenerg. Biomembr. 41(3):239-249. Тезисы докладов: 1. Ковалёва М.В., Суханова Е.И., Зылькова М.В., Романовская М.А. (2006) Окислительный стресс и индукция проницаемости внутренней мембраны митохондрий дрожжей Yarrowia lipolytica. Труды Всероссийской конференции молодых ученых “Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты”, Москва, 1-3 июня, стр. 173-174. 2. Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Ural’skaya L.A., Guseva E.S. and Zvyagilskaya R.A. (2006) Prooxidant-induced low-conductance channel in mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC, Moscow, 21-26 July Short Reports, suppl. V. 14, p. 332. 3. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I. (2006). An mPTP-like pore in yeast mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 14th EBEC, Moscow, 21-26 July Short Reports, suppl. V. 14, p. 336. 4. Zvyagilskaya R.A., Kovaleva M.V., Sukhanova E.I., Uralskaya L.A., Guseva E.S. (2006) Mitochondria from the Yarrowia lipolytica yeast does not undergo a typical permeability transition (mPTP). Prooxidans induced only a low-conductance channel for H+. 24th Small Meeting on Yeast Transport and Energetics. August 31- September 3, Program and Abstracts. p. 38А. 5. Kovaleva M.V. and Zvyagilskaya R.A. (2007) ATP opens a pore in Saccharomyces cerevisiae mitochondria, but closes in Yarrowia lipolytica mitochondria. The FEBS J., Abstracts of 33th FEBS Congress «Molecular Machines”, 7-12 July 2007, Vienna, Austria, 274 (1); p.124. 6. Zvyagilskaya R.A., Zyl’kova M.V., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2008) Mitochondrial permeability transition pore (mPTP) in different yeast species is dissimilarly regulated. Biochim. Biophys. Acta, Bioenergetics, 15th EBEC Shoort Reports, S32. 7. Zvyagilskaya R.A., Sukhanova E.I., Kovaleva M.V., Trendeleva T.A. (2009) Pathways for release of apoptotic factors from yeast mitochondria. The FEBS J. Abstracts of 34th FEBS Congress “life’s Molecular Interactions”, 4-9 July 2009, Prague, Czech Republic, P4-143, p. 229 8. M.V. Zylkova, E.I. Sukhanova, T.A. Trendeleva, M.V. Kovaleva, R.A. Zvyagilskaya. (2008) More on permeability transition in Yarrowia lipolytica mitochondria. Abstr. Bari Intern. Symposium on “Mitochondrial physiology and pathology” IUBMB Sympos. S1. Satellite events of the 33th FEBS Congress and 11th IUBMB, Athens (28 Jun – 3 Jul), SC2.38. 9. Зылькова М.В., Ковалева М.В., Суханова Е.И., Тренделева Т.А., Леин С.А., Звягильская Р.А. (2008) Индукция неспецифической проницаемости дрожжевых митохондрий. Труды 2-го Съезда микологов России с международным участием “Современная микология в России”, т.2, с. 127-128.
