Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
advertisement
Методы работы с ДНК ПЦР Рестрикция Рестрикция ДНК - Разрезание молекулы ДНК в определенной последовательности Рестриктазы 1. Узнают определенные последовательности в ДНК 2. Разрезают молекулу ДНК в определенных местах Рестрикция ДНК Рестриктазы Type IIR (обнаружено несколько тысяч) Образуются «липкие» или «тупые» концы Рестриктазы Type II Еще есть Type I и Type III Частота встречаемости сайтов рестрикции RsaI (four-base cutter) EcoRI (six-base cutter) NotI (eight-base cutter) Рестрикционные карты Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК Синтез ДНК in vitro Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Polymerase chain reaction (PCR) – метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количества определённых фрагментов ДНК • «Полимеразная» - используется фермент ДНКполимераза • «Цепная» - состоит из повторяющихся циклов, количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии 1983 г, Кэри Муллис ПЦР ПЦР Буфер Компоненты ПЦР Праймеры Определяют амплифицируемый участок Служат «затравкой» для синтеза ДНК dNTP «Строительный материал» KCl Моновалентные катион необходим для оптимальной гибридизации праймеров Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента Полимераза Осуществляет синтез ДНК Матрица Анализируемый образец ДНК Этапы ПЦР 25-50 циклов Предварительная денатурация ~950C 1-10 мин Денатурация ~950C 10-60 сек Отжиг 50-700C 10-60 сек Элонгация 68-720C 10-180 сек Финальная элонгация 68-720C 7-10 мин График диссоциации праймера Cds – концентрация гибридизованного праймера Полимераза Полимераза Процессивность Активности Taq (Thermus aquaticus) 3-5 т.п.н. 5'→3' полимеразная 5'→3' экзонуклеазная Pfu (Pyrococcus furiosus) 1-2 т.п.н. 5'→3' полимеразная 5'→3' экзонуклеазная 3'→5' экзонуклеазная Tth (Thermus thermophilus) 3-5 т.п.н. (800 п.н. для ревертазной активности) 5'→3' полимеразная 5'→3' экзонуклеазная 5'→3' ревертазная Pwo (Pyrococcus woesei) 3 т.п.н. 5'→3' полимеразная 3'→5' экзонуклеазная 5`-3` полимеразная активность Полимераза 3`-5` экзонуклеазная активность 5`-3` экзонуклеазная активность Стадии ПЦР Амплификаторы Термостатирование: • • • твёрдый термоблок (элемент Пельтье) жидкость поток воздуха Применение ПЦР Получение материала • амплификация ДНК Получение информации • поиск ДНК Клонирование ДНК и кДНК Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений Серповидноклеточная анемия RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism ПДРФ – Полиморфизм Длин Рестрикционных Фрагментов Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений Болезнь Хантингтона ДНК-дактилоскопия Применение ПЦР для диагностики генетических нарушений Анализ делеций Анализ транслокаций Разновидности ПЦР • • • • • • • Hot-start PCR – для повышения специфичности реакции Touch-down PCR – для повышения специфичности реакции Allele-specific PCR – для выявления однонуклеотидных различий RT-PCR (reverse transcriptase PCR) – для амплификации РНК Asymmetric PCR – для получения одноцепочечного продукта ДНК Real-time PCR, qPCR Inverse PCR – если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка • Nested PCR – две последовательные реакции (для повышения чувствительности и специфичности) • PCR mutagenesis – две направленного внесения замен в последовательность Allele-specific PCR - анализ однонуклеотидных полиморфизмов Inverse PCR - исследование фланкирующих областей Asymmetric PCR - наработка одноцепочечного продукта Nested PCR - уменьшение числа побочных продуктов реакции PCR mutagenesis Сайт-специфический мутагенез ПЦР для клонирования в вектор ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) • одновременная амплификация и измерение количества продукта • наличие флюоресцентного красителя в смеси • наличие оптического блока в амплификаторе линейный lg 33 Системы детекции 1. Неспецифичные – интеркалирующие красители (SYBR Green и др.) 2. Специфичные – линейные разрушаемые пробы (TaqMan) – «молекулярные маячки» (beacons) – примыкающие пробы SYBR Green Метод TaqMan (линейные разрушаемые зонды) флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции флуоресцентный краситель гаситель флуоресценции зонд специфический фрагмент ДНК FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer Резонансный перенос энергии флуоресценции Принцип метода TaqMan • 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Принцип метода TaqMan • 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Принцип метода TaqMan • 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Принцип метода TaqMan • 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Принцип метода TaqMan • 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Принцип метода TaqMan • 5`-3` экзонуклеазная активность Taq-полимеразы Принцип метода TaqMan • нет участка для посадки праймера – нет сигнала Принцип метода TaqMan • нет участка для посадки зонда – нет сигнала Линейные разрушаемые пробы (TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man) «Молекулярные маячки» (molecular beacons) Примыкающие пробы Флюорофоры и гасители флюоресценции Представление результатов ПЦР в реальном времени линейный lg Денатурация Плавление после ПЦР обратная производная Плавление после ПЦР Виды ПЦР-анализа Качественный анализ есть Сравнительный анализ (полуколичественный) нет лечение больше меньше Х раз Количественный анализ 10 000 копий 1000 копий Количественная ПЦР (qPCR) • Подсчёт числа копий генов • Анализ представленности транскриптов • Оценка инфекционной нагрузки Количественная ПЦР серия 10-кратных разведений threshold – пороговая флюоресценция Ct – пороговый цикл Преимущества Real-time PCR • возможность как качественной, так и количественной оценки исходной матрицы • отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез) • большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность • большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7) • возможность постановки Multiplex анализа Применение ПЦР 1. Научные исследования – амплификация ДНК для гибридизации (блоттинг, микрочипы) – амплификация ДНК для секвенирования – клонирование геномной ДНК, кДНК – филогенетическое сравнение геномов – генетическое картирование – анализ уровня транскрипции Применение ПЦР 2. Медицина – – – – генетическое тестирование типирование тканей (для трансплантации) тестирование мутаций в онкогенах диагностика инфекций 3. Судебная медицина – ДНК-дактилоскопия – установление родства 4. Анализ пищевых продуктов, детекция ГМО Применение ПЦР Получение информации • анализ уровня транскрипции • ДНК-диагностика • генотипирование Получение материала • клонирование ДНК • мутагенез • секвенирование Залог успеха ПЦР • • • • высокая чувствительность высокая специфичность высокая устойчивость низкая стоимость, быстрота Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР Н О HО P О– Н Х О 5`CH 2 О Х = урацил: 2` ОН Н О С Н N Н N О Тимин (типичен для ДНК) О 1` 4` 3` Н Н Н N Н N Урацил (типичен для РНК) О дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) – может быть встроен в растущую цепь, как и dTTP, не нарушает комплементарности Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР О Н О О- P О– Н О 5`CH 2 N Н N О О 1` 4` 3` UDG, 45-550С 2` О- Н 1) Урацил ДНК-гликозилаза, присутствующая в ПЦР-смеси, отщепляет урацил от цепи ДНК, оставляя т.н. АР-сайт Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР UDG, 45-550С О О- P О– О 5`CH 2 О 1` 4` AP-сайт 3` 2` О- Н 1) Урацил ДНК-гликозилаза, присутствующая в ПЦР-смеси, отщепляет урацил от цепи ДНК, оставляя т.н. АР-сайт Использование UDG – метод борьбы с контаминацией продуктами ПЦР О О- P О– О 5`CH 2 О 1` 4` 3` 2` О- Н 2) При нагревании до 950С UDG инактивируется, а AP-сайты расщепляются, в результате урацил-содержащая ДНК, попавшая в пробирку до начала ПЦР, деградирует 3) Проводится обычная ПЦР, реакционная смесь очищена от продуктов предыдущей амплификации Digital PCR (dPCR) M ln 1 P R М – среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе распределения Пуассона) Р – доля сегментов, содержащих ПЦР-продукт R – общее кол-во проанализированных сегментов Лимитирующие факторы dPCR: • Количество сегментов реакции • Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце • Реакционный объѐм 65 Коммерчески доступные системы, реализующие dPCR Fluidigm - технология микрофлюидных чипов Bio-Rad (QuantaLife) dPCR в суспензии (Digital Droplet PCR) Life Technologies dPCR в платах OpenArray® 66 Digital droplet PCR (ddPCR) • QX100 Droplet Digital PCR System Подготовка образцов (смешивание ДНК и ПЦР-реагентов) Создание капель (Droplet Generator) Амплификация Регистрация и анализ результатов Сравнение с Real-Time PCR Digital PCR: a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis? Bernhard G. Zimmermann, Simon Grill, Wolfgang Holzgreve. Prenat Diagn 2008; 28: 1087–1093. 68 Применение ПЦР в NGS 69 Спасибо за внимание
