2014-й год, промежуточный - Тверской государственный
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» УДК ( 541.49) Код ГРНТИ «УТВЕРЖДАЮ» Проректор по НИД Тверского государственного университета д.т.н., Каплунов И.А. ___________________________ «25» июня 2014 г. М.П. ОТЧЕТ По программе стратегического развития федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверской государственный университет» на 2012-2014 гг. по проекту № 2.1.2. «Решение комплексных проблем по направлению "Разработка технологий получения и применения новых материалов для микро- и наноэлектроники, медицины и химических производств" на базе НОЦ нанотехнологий и гетероструктур ТвГУ» по НИР № 2.1.2.6. «Разработка и получение новых перспективных металлокомплексов на основе биологически активных лигандов» вид отчета: полугодовой Руководитель НИР: Феофанова М.А. г. Тверь 2014 г. СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ Руководитель НИР подпись, дата Исполнители ФИО Феофанова М.А. РЕФЕРАТ Отчет 48 с., 3 ч., 9 рис., 4 табл., 26 источников, 3 приложения Ключевые слова: комплексы, биометаллы, аминокислоты. Объект исследования: гепарин, биометаллы, аминокислоты. Цель работы: расчет химических равновесий в многокомпонентных системах, включающих гепарин, аминокислоту и биометалл. Методы (методология) проведения работы: pH-метрическое титрование, метод математического моделирования. Результаты работы: Таблица 1 № п.п Индикаторы 1 Характеристика работы: - основные результаты работы; - новизна результатов работы; - описание особенностей проведения работы в отчетном периоде. Результаты 1. Методом математического моделирования химических равновесий и данных рН-метрического титрования получена информация о процессах протонирования и комплексообразования ионов марганца с высокомолекулярным гепарином и рядом аминокислот. 2. В широком интервале рН исследованы химические равновесия в системах Mn2+- гепарин - аминокислота: аргинин, пролин, глицин - H2O . Показано, что в указанных системах в зависимости от рН доминируют либо средние гепаринаты, либо продукты их гидролиза – моно- и дигидроксогепаринаты. По результатам метода математического моделирования химических равновесий данных систем, рассчитанная оценка селективности гепарина по отношению к иону марганца, она характеризует его как неселективный антикоагулянт плазмы крови, влияющий на изменение равновесных концентраций ионов остальных микроэлементов. Поэтому длительное его применение, особенно в высоких дозировках, способно повлиять на дисбаланс этого микроэлемента в плазме крови, что позволяет говорить о необходимости дополнительного введения этих микроэлементов в организм во время гепаринотерапии для предотвращения дисбаланса этих ионов в плазме крови. 2 Области и масштабы использования полученных результатов: - направления использования; - практическое использование полученных результатов; - социально-экономический эффект Полученные данные будут востребованы при создании баз экспертных систем, направленных на моделирование бионеорганических равновесий. Социально-экономический эффект обусловлен широким вовлечением студентов и молодых ученых в научную работу что положительно скажется на рейтинге ТвГУ 3 Ресурсы: - финансовые (сколько и на что); - материально-технические (какие и на что); - трудовые: кол-во ППС, молодых ученых, аспирантов, студентов, затраченные на выполнение поставленных целей и задач 125000 руб. зарплата сотрудников, накладные расходы материально-технические - нет кол-во ППС- 1 привлечено к работе без оплаты: молодых ученых - 1 аспирантов - 2 студентов – 5 4 Проблемы, возникшие при реализации НИР и пути их решения Таблица 2 Показатели 1 2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 Плановый пока- Фактический затель показатель Единица 2014 1 июля 2014 измерения год года Количество заявок на получение охранных докумен2 Подано 3 тов на результаты интеллектуальной деятельности, заявки на ед. полученных в рамках реализации проекта (не менее 2, патент в том числе не менее 2-х заявок на патент) Количество планируемых к защите диссертаций на 0 0 соискание ученой степени кандидата и доктора наук, ед. подготовленных в рамках реализации проекта Количество публикаций: ед. в том числе: монографии ед. 0 0 учебники и учебные пособия ед. 1 4 статьи в зарубежных и российских научных журналах 2 1 в изданиях, индексируемых в базах данных Scopus и ед. Web of Science статьи в российских научных журналах из списка 2 1 ВАК (кроме статей, указанных в п.3.3) (не менее 2-х на каждого исполнителя проекта ед. ежегодно, включая ППС, инженеров, специалистов, научных работников, аспирантов) 3.5 другие статьи, тезисы докладов конференций (не менее 2-х на каждого исполнителя проекта ежегодно, включая ППС, инженеров, специалистов, научных работников, аспирантов) 2 14 ед. Прогнозные предположения о развитии объекта исследования: Дальнейшие исследования систем будут направлены на практическое использование полученных результатов. СОДЕРЖАНИЕ Гепарин – противосвертывающий препарат, по своей химической природе, относящийся к классу гликозамингликанов, мономерное звено которого образовано связанными в α-(1→4) положении остатками L-идуроновой кислоты (IdoA) и D-гликозамина (D-GlcN) – 4-L-IdoA2S-α-4-D-GlcNS,6S-α-1. С другой стороны плазма крови представляет собой многокомпонентный водный раствор, содержащий, кроме многочисленных низко- и высокомолекулярных лигандов, также и широкий спектр ионов биометаллов: макроэлементов, к примеру, кальция и натрия, с концентрациями порядка 10-3 моль/л, а также микроэлементов, таких как медь, цинк никель, кобальт, марганец и железо. Процессы комплексообразования ионов микроэлементов с гепарином в присутствии низкомолекулярных лигандов, таких как аминокислоты, должным образом не изучены. Отсутствие оценок или неточность в определении значений логарифмов констант образования комплексных форм не позволяет решить ряд задач, связанных с оценкой влияния гепарина на снижение равновесной концентрации микроэлементов в плазме крови, определение селективности гепарина по отношению к макро- и микроэлементам, оценки влияния гепарина в кровотоке на баланс неорганических и органических компонентов плазмы крови. Из всего вышенаписанного вытекает цель работы: Изучение химических равновесий в многокомпонентных системах состава Mn2+ – гепарин – аминокислота: пролин,аргинин,глицин – H2O экспериментальным методом pH-метрического титрования с последующей обработкой результатов методами математического моделирования химических равновесий. Для достижения этой цели были поставлены следущие задачи: 1). На основе планируемого эксперимента (pH-метрическое титрование) в системах, соответствующих по значениям параметров плазме крови (темпе- ратура, ионной сила) провести pH-метрическое титрование данных систем для получения данных, необходимых для описания процессов комплексообразования ионов марганца с высокомолекулярным гепарином и рядом аминокислот: аргинин,пролин,глицин. 2). Рассчитать модели равновесий в системах Mn2+ - гепарин – аминокислота: аргинин, пролин, глицин - H2O. По рассчитанным значениям логарифмов констант образования комплексов определить селективность гепарина по отношению к иону марганца, определяющую влияние гепарина на изменение равновесной концентраций данного микроэлемента в кровотоке. 3). Оценить влияние эффекта комплексообразования данного микроэлемента с гепарином и рядом аминокислот на баланс этих компонентов в плазме крови. Литературныйобзор Гепарин. Общий обзор Гепарин был открыт в 1916 году студентом медицинского факультета Университета Джона Хопкинса Дж. Маклином. Маклин, тогда еще студент, получил задание исследовать тромбопластическую активность сердца. Исследуя липойды-фосфатиты печени (гепар-фосфатиты) он обнаружил, что они обладают антикоагулятивными свойствами. Гепарин из-за своей высокой стоимости и выраженного токсического действия не относился к клинически востребованным препаратам. Первые клинические испытания гепарина были проведены на людях в 1935 году, датой его начала его широкого внедрения в лечебную практику можно считать 1937 год. По мере поступления и накопления данных о гепарине, и благодаря дальнейшему усовершенствованию методики и техники выделения гепарина ряд трудностей, связанных с токсичностью и высокой стоимостью гепарина, удалось преодолеть, это и стало началом повсеместного и широкого использования этого антикоагулянта в клинической медицине, сделав его на долгое время одним из основных антикоагуляционных и антитромботических средств [1-3]. Высокая вариабельность химической структуры этого полисахарида в разных тканях и органах у совершенно разных видов приводит к интересному факту: гепарин являясь, вероятно, одним из наиболее хорошо изученным полисахаридом молекул нашего организма, относится к числу соединений, для которых биологическая роль все еще не выяснена до конца. Гепарин способен вступать во взаимодействие с форменными элементами крови, белками плазмы и тромбоцитарными факторами ингибируя фазы свертывания крови. Комплексы гепарина с тромбином и фибриногеном, которые образуются в кровяном русле, способны растворять нестабилизированный фибрин. Свойства биологически активных веществ, при взаимодействии с гепарином могут изменяться, становясь более или менее активными, то есть можно говорить о модулирующем влиянии гепарина. Например, у комплексов гепарина с аминокислотами обнаруживаются мощный антикоагулянтный эффект, в тоже самое время, компоненты этих комплексов, по отдельности, не обладают такими свойствами. Можно предположить, что химическое строение гепарина и его свойства являются одними из причин модулирующего воздействия этого вещества на другие компоненты комплексных соединений гепарина с биометаллами и аминокислотами. Механизм действия гепарина обусловлен его способностью специфически связываться с антитромбином III, что резко повышает ингибирующее действие последнего по отношению к тромбину и др. протеазам, участвующим в свертывании крови. Для такого связывания необходима вполне определенная комбинация моносахаридных звеньев на достаточно протяженных участках полисахарида. Активному антикоагулянтному центру соответствует последовательность остатков 2-6, среди которых остатки 2, 3 и 4-минорные компоненты молекулы. Мономерное звено гепарина представляет собой дисахарид уроновая кислота–(1→4)-D-глюкозамин. Моносахарид уроновой кислоты может быть либо α-L-идуроновой кислотой (IdoA) ,либо β-D-глюкуроновой кислотой (GlcA), в свою очередь, каждая из которых может быть 2-O-сульфатирована (Ido(2S) , GlcA(2S)). β-D-глюкозамин может быть незамещен (GlcN), сульфатирован (GlcNS) или ацетилирован (GlcNAc) по аминогруппе. Ами- носульфатированный глюкозамин допускает 3-O- и 6-O- сульфатацию (GlcNS(3S), GlcNS(6S), GlcNS(3, 6S)). Аминоацетилированный глюкозамин может быть 6-O-сульфатирован (GlcNAc(6S))[24]. В работе [24] методом жидкостной хроматографии определен количественный состав мукозного гепарина, который перед анализом был практически полностью расщеплен на отдельные дисахариды с помощью ферментов Таблица 1. Дисахаридный состав мукозного гепарина Mr Число Дисахарид сульфогрупп на дисахарид Доля дисахарида(%) Mr дисахарида полностью с учетом ионизованного Na и H в дисахарида анионных узлах ∆UA-[1→4]-GlcN 0 0,1 335,2 354,12 ∆UA-[1→4] –GlcNAc 0 0,2 377,23 396,15 ∆UA(2S) -[1→4] –GlcN 1 0 414,23 452,07 ∆UA(2S) -[1→4] –GlcNAc 1 1,5 456,26 494,10 ∆UA-[1→4] –GlcN (6S) 1 3,5 414,23 452,07 ∆UA-[1→4] –GlcNAc (6S) 1 2,5 456,26 494,10 ∆UA-[1→4] –GlcNS 1 1,2 414,23 452,07 2 2,3 493,26 550,03 ∆UA(2S) -[1→4] –GlcN (6S) ∆UA(2S) -[1→4] –GlcNAc 2 3,9 535,29 592,06 ∆UA(2S) -[1→4] –GlcNS 2 4,7 493,26 550,03 ∆UA-[1→4] –GlcNS (6S) 2 12 493,26 550,03 3 68 572,29 647,98 (6S) ∆UA(2S) -[1→4] –GlcNS (6S) Плазма крови состоит из воды на 90%, в ней гепарин ведет себя как полиэлектролит, обладающий кислотными свойствами. В свою очередь, карбоксильная и сульфогруппы обладают способностью к ионизации в дисахаридных звеньях. Наиболее сильным отрицательным зарядом должно обладать полностью ионизированное и трижды сульфатированное мономерное звено. Высокая плотность отрицательного заряда препятствует сворачиванию полимерной цепи в клубок, анионные узлы остаются доступными для взаимодействия с противоионами. Гепарин вырабатывается в тканях специализированными (т. наз. тучными) клетками. В которых гепарин синтезируется в виде протеогликана, который, в свою очередь, состоит из серглицина, с которым ковалентно связаны многочисленные линейные полисахаридные цепочки гепарина, которые после синтеза могут разрываться, образуя полидисперсную смесь более коротких цепочек полисахаридов с молекулярными весами в интервале 5000-25000 дальтон. В таком виде гепарин обычно содержится в гранулах тучных клеток: в виде комплексов с ферментами (протеазами). В настоящее время гепарин, применяемый в медицине, выделяют из тучных клеток тонкого кишечника свиней. Препарат гепарина получают в виде натриевой соли аморфного продукта, легко растворимого в воде Координационныеспособностигепарина Полимерная цепь гепарина имеет в своем составе достаточно много кислородсодержащих донорных группировок, а именно сульфатные, карбоксильные группы и гликозидные атомы кислорода, а так же гидроксильные группы и сульфамидные группы. Эти группировки наделяют гепарин широкими координационными возможностями. Хотя молекула гепарина содержит амидную группировку, ее участие в комплексообразовании можно считать маловероятной, однако нельзя с уверенностью сказать, что данная группировка не принимает участие в процессах комплексообразования. Можно отметить, что образование хелатных циклов с участием депротонированных гидроксильных групп рибозных колец маловероятно, наоборот, участие гликозидных атомов кислорода в процессе координации является наиболее предпочтительным вариантом. Отметим также, наличие стерических затруднений для карбоксильной и сульфогруппы, и для имеющихся гидроксильных групп. Благодаря этому представляется возможным исключить взаимодействия вида (COO—, OН—) и (ОSO3—, OН—). Вполне вероятна возможность образования хелатных циклов достаточно больших размеров, к появлению которых может привести взаимодействие донорных группировок, которые , в свою очередь, принадлежат разным субъединицам мономерного звена на центральном ионе. В работе [4] показана возможность образования таких хелатных циклов на примере образования комплексов состава гепарин-кальций. Рассматривая структуру мономерного звена гепарина (рис.1) можно предположить, что дентатность такого лиганда должна быть достаточно высокой, и быть, при минимальной оценке, равной четырем. Рис. 1. Структурная формула мономерного дисахаридного звена гепарина Комплексообразование гепарина с ионами металлов Гепарин, являясь, полиэлектролитом взаимодействует с окружающими его противоионами. Это приводит к тому, что противоионы «прилипают» к молекуле полиэлектролита, Согласно теории конденсации Мэннинга, противоионы, окружающие полиион, делятся на два вида: одни из них «налипают, конденсируются» на поверхность полиэлектролита, вторые же образуют вокруг него диффузное облако, состоящее из противоионов. Авторы работы [4] показывают что, все взаимодействия между катионами металлов и гепарином невозможно объяснить, исходя только из теории конденсации. Ввиду вышенаписанного следует отличать процессы «конденсации», которые делокализованный характер, а, следовательно, у нас нет возможности четко определить группировки, участвующие в процессах комплексообразования, и, собственно, специфичные взаимодействия, здесь, используя различные методы исследования можно четко определить место связывания катиона металла, зная какие группы участвуют в процессах комплексообразования. Например, в работе [4] есть сведения о том, что катионы кальция координируются гликозидным атомом кислорода и сульфамидной группировкой Dглюкозаминового фрагмента, а так же карбоксильной группой α-L- идуронового кольца. В литературе по тематике взаимодействия гепарина с катионами кальция присутствуют сведения о том, что группировки, необходимой для связывания кальция гепарином, приводит к существенной потере стабильности образующегося комплекса. Данные по системам «гепарин-ион металла» весьма разнообразны. К примеру, можно отметить цикл работ Гранта с его коллегами. Коллектив авторов этого цикла охарактеризовали степень устойчивости комплексов гепарина с катионами металла. Также с помощью потенциометрического титрования и поляриметрии показано, что гепарин способен координироваться с ионами металлов, что интересно, координация для ряда катионов носила локализованный характер. Согласно этим работам устойчивость комплексов состава гепарин-катион металла можно выстроить в следующем порядке: Cu2+> Ca2+>≈Na+≈ K+≈Mg2+≈Li+. Пармар и его коллеги исследовали взаимодействие гепарина с рядом щелочноземельных и переходных металлов, построив следующий ряд зависимости устойчивости комплексов гепарина с катионом металла: Mn2+ > Cu2+ > Ca2+ > Zn2+ > Co2+ > Na+ > Mg2+ > Fe3+ > Ni2+ > Al3+ > Sr2+. Согласно данным Пармара следует, что комплексы двухвалентного марганца и гепарина обладают наивысшей устойчивостью, в свою очередь комплексы с катионами стронция обладают наименьшей устойчивостью. Так же авторы [6] указывают, что в случае взаимодействия катионов трехвалентого железа с гепарином можно говорить лишь о взаимодействии на уровне простой конденсации противоионов, а не об образовании комплексных соединений. Интерес представляет и работа [7]: в рамках этой работы были получены покрытые гепарином и обработанные треххлористым железом микро- капсулы. Авторами этой работы установлено, что комплексы гепарина с этими ионами достаточно прочны, в качестве доказательства авторы приводят данные ИК-спектроскопических исследований. На ИК-спектрах наблюдалось смещение характеристических частот поглощения донорных групп гепарина – сульфогруппы и карбоксильной группы. Также авторы сообщают, что обработка этих микрокапсул 10%-м раствором гидроксида натрия и раствором хлороводородной кислоты в течение длительного промежутка времени не приводили к деструкции комплекса. В работе [5] сообщается о специфичном взаимодействии гепарина с катионами цинка, процесс комплексообразования в системе гепарин-цинк обнаружен как потенциометрически, и спектральными методами, причем авторы отмечают, что взаимодействие между гепарином и катионами цинка гораздо сильнее, чем этого следовало ожидать, при простом электростатическом эффекте. Следует заметить, что существуют разные точки зрения на проблему комплексообразования гепарина с катионами меди и цинка. Так, к примеру, согласно работе [9] стехиометрия комплексов не подходит под соотношение 1:1 в пересчете на мономерное звено гепарина. Авторы приводят в качестве доказательства данные гель-проникающей хроматографии, и результаты спектрофотометрических исследований. Однако в [8] приводится, что при взаимодействии гепарина с катионами цинка и меди образуются комплексы со стехиометрическим соотношением компонентов 1:1 при пересчете на монономерное звено гепарина. Следует отметить работы [19-21], связанные с исследованием комплексообразования некоторых р-элементов с различными лигандами: аденозинтрифосфатом, аминокислотами, производными нуклеозидов. Данные исследования проводились с использованием метода рН-метрического титрования и математического моделирования равновесий, это позволило авторам рассчитать величины логарифмов констант образования комплексов. После математической обработки полученных данных, авторами определены вклады в общую устойчивость смешаннолигандных комплексов, обусловленные наличием гидрофобных взаимодействий между углеводородными цепями лигандов. Можно предположить, что весомый вклад в общую устойчивость образующихся комплексов гепарина с лигандами низкой молекулярной массы помимо электростатических сил будет вносить и наличие гидрофильных взаимодействий между гетеролигандами в молекулярных и смешаннолигандных металлокомплексах. Взаимодействиегепаринасорганическимилигандами В литературе можно найти сравнительно много информации по исследованию взаимодействий гепарина с веществами органической природы. Работа [18] посвящена исследованию взаимодействия гепарина с рядом орга- нических веществ: гистамином, имидазолом, метиламином, N- ацетилгистамином. Авторы использовали метод ЯМР на протонах и ядрах 13 С и на основании этих данных получены сведения о структуре комплек- сов, функциональных группах, отвечающих за образование данных комплексов гепарин-лиганд: установлено, что стехиометрия комплекса описывается соотношением 1:1 (в расчете на моль мономерного звена гепарина), а полимерная молекула в растворе имеет конформацию спирали со сравнительно большим шагом. При этом одна из карбоксильных групп идуронового фрагмента мономерного звена взаимодействует с протонированной аминогруппой имидазола, в то время как другая карбоксильная группа соседнего идуронового фрагмента мономерного звена взаимодействует с имидазольным кольцом молекулы гистамина. В работе Хомутова [11] утверждается, что гепарин существенно снижает активность многих зоотоксинов, из-за процессов связывания их в малоактивные комплексы. А в работах [12-13] особое внимание уделено исследованию термодинамики процессов образования комплексов гепарина. В ряде работ рассматриваются проблемы образования комплексов гепарина, образующиеся при взаимодействии отрицательно заряженных полимерных цепей с низкомолекулярными продуктами: аденозинтрифосфатом, аминокислотами, красителями и органическими аминами [14-18]. Образование комплекса гепарина с аденозинтрифосфатом доказывалось методом перекрестного электрофореза – подкрашенная азуром область гепарина теряла окраску при пересечении ее с областью, содержащей аденозинтрифосфат [18] . Отдельного внимания заслуживает работа [16], которая посвящена исследованию процессов комплексообразования гепарина с аминокислотами методом калориметрического титрования при постоянной температуре. Авторами этой работы определены термодинамические характеристики полученных комплексов гепарина, по их результатам оказалось, что на три остатка аминокислоты приходится одно мономерное звено гепарина, таким образом, три аминокис- лотных остатка, протонированных по аминогруппе, взаимодействуют с тремя сульфогруппами мономерного звена гепарина. Работа [18] посвящена исследованию взаимодействия гепарина с рядом органических веществ: гистамином, имидазолом, метиламином, N- ацетилгистамином. Авторы использовали метод ЯМР на протонах и ядрах 13 С и на основании этих данных получены сведения о структуре комплек- сов, функциональных группах, отвечающих за образование данных комплексов гепарин-лиганд: установлено, что стехиометрия комплекса описывается соотношением 1:1 (в расчете на моль мономерного звена гепарина), а полимерная молекула в растворе имеет конформацию спирали со сравнительно большим шагом. При этом одна из карбоксильных групп идуронового фрагмента мономерного звена взаимодействует с протонированной аминогруппой имидазола, в то время как другая карбоксильная группа соседнего идуронового фрагмента мономерного звена взаимодействует с имидазольным кольцом молекулы гистамина. Вообще говоря, при определении стехиометрии образующихся плексов можно столкнуться с ком- рядом сложностей. Например, нельзя быть уверенным в том, что с лигандом будет взаимодействовать каждое мономерное звено цепи, возможно образование некой равновесной формы, стехиометрия которой не будет являться соотношением простых целых чисел. Помимо кулоновского взаимодействия, в таких системах достаточно большую роль играет и специфическое взаимодействие, наличие которого можно объяснять рядом причин: сродства центрального иона к тому или иному типу донорных атомов, наличие гидрофобных или гидрофильных взаимодей- ствий, и водородных связей, дополнительно стабилизирующих эти структуры. При введении избыточного количества гепарина в организм вводят антидот – протаминсульфат, его активный центр включает остатки аргинина, которые за счет сил электростатического взаимодействия связывают гепарин, тем самым, предотвращая развитие тяжелых кровотечений [2]. Авторами работы [25] синтетические полипептиды, построенных из поли-L-аргинина и поли-L-лизина, способных инактивировать гепарин. В основе этого эффекта лежат взаимодейтсвия между остатками аргинина и лизина. С помощью метода ЯМР авторы показали, что присутсвие гепарина вызывают сдвиг сигналов протонов остатков амнокислот, расположенных в непосредственной близости от катионных узлов этих синтетических полипептидов (гуанидиновые фрагменты у поли-L-аргинина и свободные аминогруппы у поли-L-лизина). Оценив зависимость величин этих сдвигов протонов от величины pD растворов авторы показали, что интерполиэлектролитные комплексы существуют в интервале pD, ограниченным величинами констант диссоциации подвижных протонов при катионных узлах. Кроме того, титриметрические данные чистых полипептидов и их смесей с гепарином не совпадают, имея существенные расхождения. Таким образом, несмотря на достаточно большое разнообразие публикаций, касающихся исследования комплексов гепарина, можно сказать, что, полученные результаты, затрагивают лишь отдельные грани проблемы и не дают глобального представления о сложности и наборе характеристик, описывающих данные равновесия. Биологическаярольобьектовисследования Биологическая роль ионов марганца 2+ 2+ Ион марганца Mn , радиус которого близок к таковому для Mg , образует комплексы с О- и N-донорными биолигандам. Марганец входит в состав активного центра многих ферментов: пируваткарбоксилаза, аргиназа, холинэстераза, фосфоглюкомутаза, перокисдаза, аминофенолоксидаза. В составе ферментов аргиназы и холинэстеразы марганец участвует в свертывании крови; в составе пероксидазы и аминофенолоксидазы регулирует превращение молекулярного кислорода; в составе пируваткарбоксилазы и фосфоглюкодисмутазы влияет на углеводный обмен. Марганец участвует в синтезе витаминов группы В и влияет на синтез гемоглобина. В организме марганец концентрируется в печени, почках и поджелудочной железе. Доказана специфическая роль марганца в синтезе мукополисахаридов хрящевой ткани. В кластерном фрагменте фермента с «кислород-выделяющим центром» содержатся 4 атома Mn с координационными числами 4, 5 и 6 (что позволяет предположить различные степени окисления марганца), связанные с остатками аспарагиновой и глутаминовой кислот, и молекул воды. Лишь одно координационное место во всем кластере занимает донорный атом азота гисти2+ дина. В кластер входит также ион Са . Индикатором содержания марганца в организме являются плазма крови и моча, среднее содержание марганца в этих субстратах (в мкг/л) составляет 0,3-1,0 и 0,1-1,5 соответственно[1- 3]. Соединения марганца являются сильными ядами, поражающими центральную нервную систему, сердечно-сосудистую систему и паренхиматозные органы. Отравление марганцем происходит при вдыхании больших количеств пыли, образующейся при размоле и просеве марганцевой руды, а также при вдыхании аэрозолей при плавке стали и электросварке. В начальной стадии наблюдаются: сильная утомляемость, слабость, сонливость, тупые головные боли в лобно-височных областях, тянущие боли в пояснице, конечностях, реже боли ишиалгического характера, боли в правом подреберье, в подложечной области, понижение аппетита. Рано появлется небольшое увеличение печени, умеренная билирубинемия, наличие уробилина в моче. В нервной системе превалируют процессы торможения. Во второй стадии появляются: медлительность движений, расстройство походки, парестезии, расстройство мочеиспускания, половая слабость, бессонница, подавленное настроение, слезливость. Сильная скованность движений, больние утрачивают способность широко шагать. Третья стадия носит название "марганцевого паркинсонизма". Развиваются глубокие органические изменения в нервной системе. Движения сильно скованы. Больные ходят очень маленькими шагами, движения очень замедлены. Лицо маскообразно, голос глухой, речь монотонна, лишена эмоциональной окраски. Часто резкая гиперрелаксация. Осноным отличием от паркинсонизма является то, что при марганцевой интоксикации не так часто поражаются черепномозговые нервы [23]. Биологическая роль пролина Рис.2. Молекула пролина Проли́н (пирролидин-α-карбоновая кислота) — гетероциклическая аминокислота (точнее, иминокислота). Существует в двух оптически изомерных формах — L и D, а также в виде рацемата. L-пролин — одна из двадцати протеиногенных аминокислот. Считается, что пролин входит в состав всех белков всех организмов. Особенно богат пролином основной белок соединительной ткани — коллаген. Пролин содержит атом азота в связанном виде, соединенный с предыдущим аминокислотным остатком, аминокислотным радикалом, и группой СН. Он очень резко изгибает пептидную цепь. Представляет собой бесцветные легко растворимые в воде кристаллы, плавящиеся при температуре около 220 °C. Также хорошо растворим в этаноле, хуже — в ацетоне и бензоле, не растворим в эфире. В организме пролин синтезируется из глутаминовой кислоты. Пролин, как и гидроксипролин, в отличие от других аминокислот, не образует с нингидрином пурпура Руэмана, а дает желтое окрашивание. Гидроксипролин, как и гидроксилизин, содержится в тканях практически только в составе коллаген а, на долю которого приходится большая часть белка в организме млекопитающих. В коллагене одна треть аминокислотных остатков приходится на глицин и еще одна треть на пролин и гидроксипролин. Гидроксипролин, представленный в коллагене весьма большим числом остатков, стабилизирует тройную спираль коллагена по отношению к действию протеаз. В отличие от гидроксилизина, гидроксильная группа которого служит местом присоединения остатков галактозы и глюкозы, гидроксильные группы гидроксипролина в коллагене остаются незамещенными. Уникальной особенностью метаболизма гидроксипролина и гидроксилизина является то обстоятельство, что эти аминокислоты, входящие в состав белков пищи, не включаются в коллаген. Не существует тРНК, которая могла бы акцептировать гидроксипролин или гидроксилизин и далее включать их в растущую полипептидную цепь. В то же время пищевой пролин является предшественником гидроксипролина, а пищевой лизин - предшественником гидроксилизина в составе коллагена. Гидроксилирование пролина (или лизина) катализируется пролилгидроксила- зой (или лизилгидроксилазой) -ферментами,находящимися вмикросомаль- ной фракции многих тканей (кожи,печени, легких, сердца, скелетной мышцы, гранулирующих раневых поверхостей).Эти ферменты являются пептидилгидроксилазами , поскольку гидроксилирование происходит только после включения пролина или лизина в полипептидную цепь.В составе коллагена пролин при участии аскорбиновой кислоты окисляется в гидроксипролин. Чередующиеся остатки пролина и гидроксипролина способствуют созданию стабильной трёхспиральной структуры коллагена, придающей молекуле прочность. Пролин крайне важен для суставов и для сердца. Это важный компонент коллагенов – белков, которые в высоких концентрациях содержатся в костях и соединительных тканях. Пролин может при длительном недостатке или перенапряжении во время занятий спортом использоваться как источник энергии для мышц. Дефицит этой аминокислоты может заметно повысить утомляемость. Свободный пролин в значительном количестве содержится во фруктовых соках, например до 2,5 грамм на каждый литр апельсинового сока[26]. Биологическая роль глицина Рис.3. Структурная формула молекулы глицина. Глици́н (аминоуксусная кислота, аминоэтановая кислота) — простейшая алифатическая аминокислота, единственная аминокислота, не имеющая оптических изомеров. Название глицина происходит от др.-греч. γλυκύς, glycys — сладкий, из-за сладковатого вкуса аминокислоты. Применяется в медицине в качестве ноотропного лекарственного средства. Глицин входит в состав многих белков и биологически активных соединений. Из глицина в живых клетках синтезируются порфирины и пуриновые основания. Глицин также является нейромедиаторной аминокислотой, проявляющей двоякое действие. Глициновые рецепторы имеются во многих участках головного мозга и спинного мозга. Связываясь с рецепторами (кодируемые генами GLRA1, GLRA2, GLRA3 и GLRB), глицин вызывает «тормозящее» воздействие на нейроны, уменьшают выделение из нейронов «возбуждающих» аминокислот, таких как глутаминовая кислота, и повышают выделение ГАМК. Также глицин связывается со специфическими участками NMDA-рецепторов и, таким образом, способствует передаче сигнала от возбуждающих нейротрансмиттеров глутамата и аспартата. В спинном мозге глицин приводит к торможению мотонейронов, что позволяет использовать глицин в неврологической практике для устранения повышенного мышечного тонуса. Активно участвует в обеспечении кислородом процесса образования новых клеток. Является важным участником выработки гормонов, ответственных за усиление иммунной системы .Эта аминокислота является исходным веществом для синтеза других аминокислот, а также донором аминогруппы при синтезе гемоглобина и других веществ. Глицин очень важен для создания соединительных тканей; в анаболической фазе потребность в этой аминокислоте повышается. Недостаток ее вызывает нарушение структуры соединительной ткани. Повышенное потребление глицина снижает содержание фермента катепсина D и в катаболической ситуации препятствует распаду белков. Он способствует мобилизации гликогена из печени и является исходным сырьем в синтезе креатина, важнейшего энергоносителя, без которого невозможна эффективная работа мышц. Глицин необходим для синтеза иммуноглобулинов и антител, а следовательно, имеет особое значение для работы иммунной системы. Недостаток этой аминокислоты ведет к снижению уровня энергии в организме. Глицин также способствует ускоренному синтезу гипофизом гормона роста[26]. Биологическая роль аргинина Рис.4. Структурная формула молекула аргинина Аргинин (2-амино-5-гуанидинпентановая кислота) — алифатическая основная α-аминокислота. Оптически активна, существует в виде L- и Dизомеров. L-Аргинин входит в состав пептидов и белков, особенно высоко содержание аргинина в основных белках — гистонах и протаминах (до 85 %). Аргинин является основной аминокислотой, несущей два основных центра: аминогруппу в α-положении и гуанидиновую в δ-положении. Гуанидиновая группа благодаря резонансной делокализации заряда при протонировании является сильно основной (pKa 12.48), находится в протонированной катионной форме при pH < 10 и способна образовывать множественные водородные связи. В слабощелочных и нейтральных растворах аргинин образует цвиттер-ион. Рис.5. Цвиттер-ионная форма аргинина. Высокая основность аргинина и, соответственно, способность образовывать ионные связи с фосфатными группами ДНК, обуславливает образование нуклеопротеидов — комплексов гистон-ДНК хроматина и прота- мин-ДНК гетерохроматина сперматозоидов. Аргинин — условно- незаменимая аминокислота. У взрослого и здорового человека аргинин вырабатывается организмом в достаточном количестве. Аргинин широко рекламируется как компонент БАД для бодибилдеров и спортс менов - тяжелоатлетов целью улучшения питания мышц, и пожилых людей дляулучшения эректильной функции. Так же массово применяется аргинини в пищевых добавках, рекламируемых «в целях стимулированияиммунитета». А также аргинин стимулирует выбросгормона роста, который, в свою очередь, влияет на омоложение всего организма, уменьшает количество подкожного жира, увеличивает анаболизм. Аргинин является донором оксида азота, открытие биологических эффектов которого было удостоено Нобелевской премии в медицине. Однако, многочисленные исследования, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, указывают на неэффективность аргинина для бодибилдинга (аргинин не влияет на продукцию оксида азота, не расширяет сосуды, таким образом, применение аргинина в спортивном питании бессмысленно). В то же время, у детей и подростков, у пожилых и больных людей уровень синтеза аргинина часто недостаточен. Биосинтез аргинина осуществляется из цитруллина под действием аргининсукцинатсинтазы и аргининсукцинатлиазы. Аргинин является одним из ключевых метаболитов в процессах азотистого обмена (орнитиновом цикле млекопитающих и рыб). Орнитиновый цикл (цикл Кребса-Хензелейта) — последовательность биохимических реакций млекопитающих и некоторых рыб, в результате которой азотсодержащие продукты распада преобразуются в мочевину, которая в свою очередь выделяется почками. В большинстве случаев таким образом происходит превращение аммиака. Рис.6. Схема орнитинового цикла 1-цитруллин, 2-аргининосукцинат, 3-аргинин, 4-орнитин, 5- карбамоилфосфат, 6-аспарагиновая кислота, 7-фумаровая кислота, 8-вода, 9мочевина ОТС-орнитинтранскарбомоилаза, ASS аргининосукцинатсинтетаза, ASL-аргининосукцинатлиаза, ARG1-аргиназа. У птиц и рептилий конечным продуктом выделения является не мочевина, а мочевая кислота. Земноводные и большинство рыб не преобразуют аммиак в другие соединения, поскольку вследствие постоянного контакта водой происходит быстрый вывод аммиака из организма через жабры или поверхность кожи в результате осмоса. Необходимость в данном цикле реакций возникает вследствие того, что высокие концентрации аммиака, образующиеся в больших количествах в результате деградации нуклеотидов, оказывают угнетающее воздействие на нейроны. Мочевина же, являясь нейтральным соединением с небольшими размерами и высокой растворяемостью в физиологических жидкостях, способна легко проникать через биологиче- ские мембраны, легко переноситься кровью и выделяться с мочой. Аргинин вызывает замедление развития опухолей и раковых образований. Очищает печень. Помогает выделению гормона роста, укрепляет иммунную систему, способствует выработке спермы и полезна при лечении расстройств и травм почек. Необходим для синтеза протеина и оптимального роста. Наличие аргинина в организме способствует приросту мышечной массы и снижению жировых запасов организма. Также полезен при расстройствах печени, таких, как цирроз печени, например. Известно, что аргинин участвует в связывании аммиака, ускоряя восстанавливаемость после больших нагрузок. Наличием аргинина обусловлена высокая биологическая ценность молочного белка. В организме из аргинина быстро получается орнитин, и наоборот. Он ускоряет метаболизм жиров и снижает концентрацию холестерина в крови. Большие дозы аргинина могут вызывать потерю воды, поэтому лучше его принимать небольшими дозами в течение дня. Не рекомендуется к приему беременными и кормящими женщинами. Методыматематическогомоделированияхимическихравновесий Метод математического моделирования химических равновесий дает нам целый ряд преимуществ – простота и быстрота получения информации о составе и устойчивости образующихся комплексных форм, выявление условий при которых надо проводить синтез и выделение требуемой формы из раствора, оценка зависимости равновесной концентрации комплексной формы от параметра системы (например от рН среды). Однако, необходимо применение физико-химических методов, направленных на получение необходимой информации о данной системе. Исходя из того, что исследуемые системы имеют довольно сложную структуру, и того факта, что наше понимание процессов происходящих в системе неполно предпочтение следует отдавать «прямым» методам исследования. Прямая и обратная задача расчета химических равновесий Введем понятие «прямой задачи», а именно, необходимо определить равновесный состав некой системы (x) по заданному вектору исходных концентраций b, если, известна стехиометрической матрица и определенный набор оценок констант реакций K1, …. Kk=m-n ,для этого необходимо решить систему нелинейных алгебраических уравнений [22]: 1) 2) (1) 3) Где n – число компонент системы; m – число всех составляющих молекулярных форм, рассматриваемых в данной модели; A – компонентная матрица размерности m×n из стехиометрических коэффициентов aij; b – вектор начальных количеств компонент V – диагональная матрица объемов фаз, в которых существуют молекулярные формы с индексом i. При равных объемах фаз матрицу V из уравнения (2) системы можно опустить. В этом случае вектор b – вектор исходных концентраций компонент. В нашем случае можно принять, что V=const. Зная вектор равновесного состава системы, мы можем определить любой измеряемый выходной параметр или свойство системы y, которая описывается уравнением связи y=F(x, b). Решение прямой задачи осуществляется в двойственном пространстве химических потенциалов системы uj, в котором совокупность уравнений записывается в следущей эквивалентной форме: (2) Численная процедура решения этой системы представляет собой итерационную схему метода Ньютона-Рафсона, с линеаризацией уравнений на каждом шаге итераций. Применение аналогичных итерационных процессов и их сходимость связаны с удачным методом выбора начальных приближений для вектора химических потенциалов компонентов [22]. В свою очередь «обратной» задачей математического моделирования химических равновесий называется нахождение оценок констант равновесий К модели (1) или (2) по значениям зависимых переменных yi , измеренным в N экспериментальных точках bi , в предположении, что стехиометрическая матрица A и функция связи параметров F(x,b) известны [22]. В качестве оценок (м.н.к. - оценки), т.е. значения выбраны метода наименьших квадратов , которые соответствуют минимуму суммы взвешенных квадратичных отклонений на множестве допустимых значений где весовая матрица В качестве дисперсионной матрицы оценок принята дисперсионная матрица линеаризованной в окрестности θ модели: Дисперсионная матрица есть произведение матриц: , - структурная матрица размерности sN×k , элементы которой это частные производные функции отклика по параметрам в точках экспери- мента - весовая матрица размерности sN×sN . Производные отклика по параметрам для модели определяются по формуле: r = 1, 2,…..s. (2.8.7) Суммирование выполняется по тем компонентам u, от которых отклик зависит явно. Производные находятся из решения системы линейных алгебраических уравнений методом Гаусса: Экспериментальнаячасть Для проведения исследования был использован стандартный фармакологический раствор высокомолекулярного гепарина производства «Московский эндокринный завод», упакованный во флаконы по 5 мл. Каждый миллилитр такого раствора содержит 5000 ЕД, каждая единица действия соответствует 0.0077 мг гепарина. Растворы хлоридов металлов готовили по навеске сухих солей («ч.д.а») с последующей стандартизацией комплексонометрическим титрованием. Раствор фонового электролита – NaCl – также готовили по навеске сухой соли («ч.д.а»). Также использовали стандартный раствор хлороводородной кислоты, приготовленный из фиксанала. Титрант – бескарбонатный раствор гидроксида натрия готовили растворением необходимого количества твердого NaOH («ч.д.а») в предварительно прокипяченной воде с последующей стандартизацией путем титрования им стандартного раствора хлороводородной кислоты, приготовленного из фиксанала. Растворы аминокислот готовили по навеске сухого вещества («ч.д.а»). Рабочие растворы для титрования готовили следующим образом: в мерную колбу на 100 мл помещали аликвоты растворов тетранатриевой соли гепарина, хлорида соответствующего металла, амнокислоты а также четыре эквивалента хлороводородной кислоты на каждый эквивалент Na4Hep для переведения последней в форму кислоты и расширения рабочего диапазона рН, добавляли 10 мл 1.50 М раствора NaCl для поддержания постоянства ионной силы, после чего доводили содержимое колбы до метки дистиллированной водой. Полученный раствор термостатировали в ультратермостате UTU 2/77 при температуре 37º с точностью поддержания заданной температуры 0.1º. Затем, по прошествии 30 мин содержимое колбы переносили в термостатируемую ячейку и титровали, регистрируя величину рН. Измерения проведены на универсальном иономере с цифровой индикацией с использованием в качестве измерительного электрода комбинированный электрод. Прибор калибровали по стандартным буферным растворам со значениями рН, равными 1.65 и 9.18, введя поправку на температуру, при которой проводился эксперимент. Титрование проводили в защитной атмосфере аргона высокой чистоты. Математическое моделирование химических равновесий осуществляли с использованием универсальной компьютерной программы NewDALSFEK. Нами было сделано следующее допущение: благодаря высокой плотности отрицательного заряда макромолекула гепарина в растворе будет находиться в вытянутом, палочкообразном состоянии, поэтому анионные узлы должны оставаться доступными для взаимодействия с противоионами; макромолекула гепарина представляется нами как совокупность отдельных мономерных звеньев – дисахаридов, концентрация которых в растворе и принимается за концентрацию самого гепарина, а монозвено – за базисный термодинамический компонент раствора. При составлении модели, помимо возможности образования средних монолигандных комплексов, а также смешаннолигандных гидроксокомплексов, учитывали равновесия, отвечающие образованию протонированой формы мономерного звена гепарина, а также образование гидроксокомплексов ионов металлов. Для систем гомогенность сохраняется во всем рабочем интервале рН, следовательно, ограничений при применении метода математического моделирования нет. Следует отметить, что область рН>8 для нас не информативна, тогда как область 6.8≤pH≤7.4 ед., т.е. область рН плазмы крови, имеет практический интерес. Ниже представлены компонентные матрицы исследуемых систем и их концентрационные диаграммы распределения. Таблица 1. Компонентная матрица стехиометрических коэффициентов возможных молекулярных форм раствора MnCl2 – Hep – Pro – H2O. Базис: H, Hep, Mn, Pro Молекулярная lgK H Hep Mn Pro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 форма H Hep Mn Pro OH MnOH H2 Pro MnPro MnOHPro HHep HepPro 0,00 0,00 0,00 0,00 -13,40 -8,77 11,85 6,40 -3,00 3,79 5,12 1 0 0 0 -1 -1 2 0 -1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 12 MnHHepPro 17,76 1 1 1 1 № Mn Pro Hep OH MnOH H2Pro MnPro MnOHPro HHep HepPro MnHHepPro 1,0x10-3 -4 8,0x10 C( ︶ л / ь л о м 6,0x10-4 -4 4,0x10 2,0x10-4 0,0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH Рис.7. Концентрационная диаграмма распределения системы Таблица 2. Компонентная матрица стехиометрических коэффициентов возможных молекулярных форм раствора MnCl2 – Hep –Gly – H2O. Базис: H, Hep, Mn, Gly № Молекулярная lgK H Hep Mn Gly 1 2 3 4 фH Hep Mn Pro 0,00 0,00 0,00 0,00 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 OH -13,40 -1 0 0 0 6 MnOH -8,77 -1 1 0 0 7 H2Gly 9,58 2 0 0 1 8 MnGly 5,38 0 0 1 1 9 MnOHGly -4,23 -1 0 1 1 10 HepGly 6,02 0 1 0 1 11 HHepGly 10,80 1 1 0 1 12 HHep 3,79 1 1 0 0 13 MnHHepGly 15,03 1 1 1 1 y l G H y H y l O l O G n n p y n G n l H M M e G 2 O H H M M 9,0x10-4 8,0x10-4 7,0x10-4 6,0x10-4 y l G p e H H 4,0x10-4 p e H H y l G p e H H n M ) C( 5,0x10-4 y l G p e H л / ь л о м 3,0x10-4 2,0x10-4 1,0x10-4 0,0 2 4 6 8 10 pH Рис.8. Концентрационная диаграмма распределения системы Таблица 3. Компонентная матрица стехиометрических коэффициентов возможных молекулярных форм раствора MnCl2 – Hep –Arg – H2O. Базис: H, Hep, Mn, Arg № Молекулярная форма lgK H Hep Mn Arg 1 H 0,00 1 0 0 0 2 Hep 0,00 0 1 0 0 3 Mn 0,00 0 0 1 0 4 Pro 0,00 0 0 0 1 5 OH -13,40 -1 0 0 0 6 MnOH -8,77 -1 1 0 0 7 HArg 8,94 1 0 0 1 8 HHep 3,79 1 1 0 0 9 MnArg 4,43 0 0 1 1 10 HepArg 2,54 0 1 0 1 11 H2HepArg 15,23 2 1 0 1 12 H3ArgHep 19,18 3 1 0 1 13 MnHHepArg 16,11 1 1 1 1 Mn Arg Hep OH MnOH HArg HHep MnArg HepArg H2HepArg 1,0x10-3 -4 8,0x10 C( ) л / ь л о м H3HepArg 6,0x10-4 MnHHepArg -4 4,0x10 2,0x10-4 0,0 2 4 6 8 10 pH Рис.9. Концентрационная диаграмма распределения системы Как видно из представленных диаграмм распределения и приведенных значений логарифмов констант устойчивости смешаннолигандные комплексы обладают значительной устойчивостью во всем интервале измерения pH системы. Ввиду их значительной устойчивости можно предположить, что образование данных смешаннолигандных форм вызвано специфическими взаимодействиями между ионом комплексообразователя и лигандами. Однако, данные системы различаются по составу в области физиологического pH, так например, составе системы MnCl2 – Hep – Pro при pH среды около 7 помимо тройного смешаннолигандного комплекса присутствует и более «простые формы» такие как MnPro, HepPro, что говорит нам о процессах деструкции, происходящих в системе, следует отметить, что эта общая тенденция для всех трех систем, боле пестрая картина наблюдается в системе MnCl2 – Hep – Gly, здесь при физиологическом значении pH среды концентрация тройной смешанно лигандной формы меньше чем концентрации двойных систем MnGly и HepGly, очевидно, что искомый тройной комплекс распадается на две формы. Аналогичная ситуация наблюдается и в системе MnCl2 – Hep – Arg Как видно из данных диаграмм распределения, в физиологически значимом интервале рН доминируют либо средние гепаринаты, либо моногидроксогепаринаты, причем устойчивость этих комплексных форм значительно высока. Следовательно, гепарин способен оказывать влияние на баланс бионеорганических компонентов плазмы крови. Выводы 3. Методом математического моделирования химических равновесий и данных рН-метрического титрования получена информация о процессах протонирования и комплексообразования ионов марганца с высокомолекулярным гепарином и рядом аминокислот. 4. В широком интервале рН исследованы химические равновесия в системах Mn2+- гепарин - аминокислота: аргинин, пролин, глицин - H2O . Показано, что в указанных системах в зависимости от рН доминируют либо средние гепаринаты, либо продукты их гидролиза – моно- и дигидроксогепаринаты. По результатам метода математического моделирования химических равновесий данных систем, рассчитанная оценка селективности гепарина по отношению к иону марганца, она характеризует его как неселективный антикоагулянт плазмы крови, влияющий на изменение равновесных концентраций ионов остальных микроэлементов. Поэтому длительное его применение, особенно в высоких дозировках, способно повлиять на дисбаланс этого микроэлемента в плазме крови, что позволяет говорить о необходимости дополнительного введения этих микроэлементов в организм во время гепаринотерапии для предотвращения дисбаланса этих ионов в плазме крови. Списоклитературы 1. Эйхгорн, Г. Неорганическая биохимия. Т. 1 / Г. Эйхгорн. – М.: Мир. 1978. 2. Хьюз, М. Неорганическая химия биологических процессов / М. Хьюз. – М.: Мир. - 1983. 3. Теппермен, Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы / Дж. Теппермен, Х. Теппермен. – М.: Мир. – 1989 4. Rabenstein, D.L. Multinuclear magnetic resonance studies of the interaction of inorganic cations with heparin / D.L. Rabenstein, J.M. Robert, J. Peng // Carbohydrate Res. – 1995, Vol. 278, p. 239 - 256. 5. Grant, D. Zn2+-heparin interaction studied by potentiometric titration / D. Grant, W.F.Long, F.B. Williamson // Biochem. J. – 1992, Vol. 287, No. 3, p. 849 - 853. 6. Parmar, N. Binding of heparin to alkaline earth and transition metals / N. Parmar, N. Paredes, L.R. Berry, E. Kim , A.K.C. Chan // Journal of Thromb. and Haemost. – 2003, Vol. 1, Suppl. 1. Abstract number, p. 1105. 7. Lu, Yu. Novel Hollow Microcapsules Based on Iron-Heparin Complex Multilayers / Lu Yu, Yanguang Gao, Xiuli Yue, Shaoqin Liu, Zhifei Dai // Langmuir. – 2008, Vol. 24, No. 23, p. 13723 - 13729. 8. Rudd, T. R. Site-specific interactions of copper(II) ions with heparin revealed with complementary (SRCD, NMR, FTIR and EPR) spectroscopic techniques / T.R. Rudd, M. A. Skidmore et al. // Carbohydrate Res. – 2008, Vol. 343, p. 2184 - 2193. 9. Grushka, E. The Binding of Cu (II) and Zn (II) Ions by Heparin / E. Grushka, A.S. Cohen // Analytical Letters. – 1982, Vol. 15, No. 16, p. 1277 1288. 10. Manning, G.S. Limiting laws and counterion condensation in polyelectrolyte solutions. I. Colligative properties / G.S. Manning // The Journal of Chemical Physics. – 1969, Vol. 51, No. 3, p. 924 - 933. 11. Хомутов, А.Е. Физиологическая роль гепарина / А.Е. Хомутов, Б.Н. Орлов. – Горький: Изд-во Горьк. Ун-та. - 1987. 12. Mascotti, D.P. Thermodynamics of Charged Oligopeptide-Heparin Inter- actions / D.P. Mascotti, T.M. Lohman // Biochemistry. – 1995, Vol. 34, No. 9, p. 2908 – 2915. 13. Al-Ali, A.K. Thermodynamic Parameters Associated with the Binding of Adrenalin and Norephedrine to Heparin / A.K. Al-Ali, J.D. Buchanan, D.M. Power et al. // Int. J. Radiat. Biol. – 1983, Vol. 43, No. 4, p. 433 – 444. 14. Ульянов, А.М. Антидиабетогенные и противосвертывающие свойства соединений гепарина с глутаминовой кислотой // А.М. Ульянов, Л.А. Ляпина, В.Е. Пасторова, Т.Ю. Смолина // Изв. РАН. Сер. биол. – 2004, № 3, с. 1 – 4. 15. Ляпина Л.А. Комплекс гепарин–лизин и его противосвертывающие свойства / Л.А. Ляпина, В.Е. Пасторова, Т.Ю. Смолина и др. // Тромбоз 16. Fromm, J.R. Pattern and Spacing of Basic Amino Acids in Heparin Binding sites / J.R. Fromm, R.E. Hileman, E.E.O. Caldwell // Archives of Biochemistry and Biophysics. – 1997, Vol. 343, No. 1, p. 92 – 100. 17. Оберган, Т.Ю. Антитромботическая активность комплекса гепарина с АТФ / Т.Ю. Оберган, Л.А. Ляпина, В.Е. Пасторова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007, Т. 143, №. 3, с. 229 – 301. 18. Rabenstein, D.L. The interaction of biological molecules with heparinand related glycosaminoglycans. 1. Identificationof a specific heparin binding site for histamine / D.L. Rabenstein, P. Bratt, T.D. Schierling // J. Am. Chem. Soc. – 1992, Vol. 114, No. 9, p. 3278 – 3285. 19. Sigel, H. Comparison of the stabilities of monomeric metal ion complexes formed with adenosine 5'-triphosphate (ATP) and pyrimidine-nucleoside 5'triphosphate (CTP, UTP, TTP) and evaluation of the isomeric equilibria in the complexes of ATP and CTP / H. Sigel, R. Tribolet, R. MaliniBalakrishnan et al. // Inorg. Chem. – 1987, Vol. 26, No. 13, p. 2149 – 2157. 20. Mitchel, P.R. Ternary complexes in solution. 28. Enhanced stability of ternarymetal ion/adenosine 5'-triphosphate complexes. Cooperative effectscaused by stacking interactions in complexes containing adenosinetriphosphate, phenanthroline, and magnesium, calcium, or zinc ions / P.R. Mitchel, H. Sigel // J. Am. Chem. Soc. – 1978, Vol. 100, No. 5, p. 1564 – 1570. 21. Sigel, H. Ternary complexes in solution. XXIII. Influence of alkyl side chains on the stability of binary and ternary copper (II)-dipeptide complexes / H. Sigel // Inorg. Chem. – 1975, Vol. 14, No. 7, p. 1535 – 1540. 22. Евсеев, А.М. Математическое моделирование химических равновесий / А.М. Евсеев, Л.С. Николаева. – М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1988. 23. Компания PharmaMed [Офиц.сайт]. URL:http://www.pharmamed.ru/library_15.h tm (дата обращения: 22.06.2014). 24. Nikos K. Karamanos. Ion-pair high-performance liquid chromatography for determining disaccharide composition in heparin and heparan sulphate / Nikos K. Karamanos // J. of Chromatography A.- 1997, Vol. 765, No.6, p. 169 - 179. 25. Rabenstein, D.L. Interaction of Heparin with Two Synthetic Peptides that Neutralize the Anticoagulant Activity of Heparin / D.L. Rabenstein, Wang Jing // Biochemistry. – 2006, Vol. 45, No. 51, p. 15740 – 15747. 26. Сайт Tarefer [Офиц.сайт]. URL:http://works.tarefer.ru/94/100107/index.ht ml (дата обращения: 22.06.2014). ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ПЕРЕЧЕНЬ ПУБЛИКАЦИЙ, ИЗДАННЫХ В РАМКАХ РЕАЛИЗАЦИИ ПРОЕКТА I. Монографии 1. 2. II. Учебники и учебные пособия 1. Андреева Г.И., Баранова Н.В., Рясенский С.С. , Феофанова М.А. « Учебнометодические указания по написанию курсовой работы по дисциплине «Неорганическая химия» 17 января 2014 г. ТвГУ. 2. Баранова Н.В., Рясенский С.С., Феофанова М.А, «Количественный анализ. Метод гравиметрического анализа: учебно-методические материалы по аналитической химии» 17 января 2014 г. ТвГУ. 3. Андреева Г.И., Баранова Н.В., Рясенский С.С., Феофанова М.А. «Количественный анализ. Метод кислотно-основного титрования: учебно-методические материалы по аналитической химии» 17 января 2014 г. ТвГУ. 4. Алексеев В.Г., Андреева Г.И., Баранова Н.В., Феофанова М.А., Никольский В.М., Щербакова Т.А. «Химические свойства элементов Ι-ΙV групп: учебнометодические материалы по неорганической химии. Часть 1» 17 января 2014 г. ТвГУ. III. Статьи в российских журналах из списка ВАК 1. М.А. Феофанова, Ю.В. Францева, Е.В. Журавлев, Н.В. Баранова Химические равновесия в системе ион Co2+ - гепарин-пролин//Вестник ТвГУ. Серия «Химия». 2014. № 2. с. 14-19. 2. 3. IV. Статьи в рецензируемых зарубежных журналах 1. M.A Feofanova,Yu.V. Frantseva,A.N. Semenov, N.V. Baranova, and E.V. Zhuravlev. «Effect of Acidity on the Equilibria of Formation of Mixed Co2+ Complexes with Heparin and Arginine in Aqueous Solutions at 370C» Russian Journal of Physical Chemistry A, 2014, Vol. 88, No. 2, pp. 349-350. 2. 3. V. Другие статьи, тезисы докладов конференций 1. Е.В. Журавлев, Е.В. Потеха «Исследование процессов комплексообразования в системе гепарин-оксациллин-кальций» Тезисы докладов на XXI Каргинские чтения Всероссийская научно-техническая конференция молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» Тверь 2014, с. 37. 2. М.И. Скобин, Т.В. Крюков, Е.В. Потеха «Металлокомплексы высокомолекулярного гепарина с микроионами d-элементов (Zn2+, Fe3+, Mn2+) и аминокислотами (глицин, аргинин) Тезисы докладов на XXI Каргинские чтения Всероссийская научно-техническая конференция молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» Тверь 2014 г., с. 93. 3. Е.В. Журавлев, Е.В. Потеха «Исследование процессов комплексообразования в системе гепарин-оксациллин-кальций в среде физиологического раствора» Тезисы докладов на XXIV Российской молодежной научной конференции, посвященной 170-летия химического элемента «Проблемы теоретической химии» Екатеринбург 2014 г., с. 73-74. 4. Скобин М.И, Крюков Т.В., Потеха Е.В. ««Металлокомплексы высокомолекулярного гепарина с микроионами d-элементов (Zn2+, Fe3+, Mn2+) и аминокислотами (глицин, аргинин, пролин) Тезисы докладов международного молодёжного научного форума «Ломоносов» Москва 2014г. 5. Е.В. Журавлев, Е.В. Потеха «Комплексообразование в системе Ca2+ - гепарин – оксациллин в среде физиологического раствора» Тезисы докладов международного молодёжного научного форума «Ломоносов» Москва 2014г. 6. Саакян А.А. «Метод тонкослойной хроматографии для количественного определения антибиотиков при совместном присутствии» Тезисы докладов международного молодёжного научного форума «Ломоносов» Москва 2014г. 7. А.А. Саакян «Метод тонкослойной хроматографии для количественного определения антибиотиков при совместном присутствии» Тезисы докладов на VIII Всероссийскую конференцию с международным участием молодых учёных по химии «Менделеев-2014» Санкт-Петербург 2014 г., с. 325-326. 8. Журавлев Е.В. «Изучение процессов комплексообразования гепарина с антибиотиками пенициллинового ряда потенциометрическим методом анализа» Тезисы докладов на XIII научную конференцию аспирантов и студентов химикотехнологического факультета Тверь 2014 г., с. 36-37. 9. Крюков Т.В., Скобин М.И. «Исследование систем содержащих ионы металлов (Mn2+, Fe3+, Zn2+), гепарин (ВМС) и аминокислоты (глицин, аргинин, пролин) Тезисы докладов на XIII научную конференцию аспирантов и студентов химико-технологического факультета Тверь 2014 г., с. 41. 10. Потеха Е.В., Францева Ю.В. «Физико-химическое исследование твердого комплекса гепарината меди(II) Тезисы докладов на XIII научную конференцию аспирантов и студентов химико-технологического факультета Тверь 2014 г., с. 47-48. 11. Скобин М.И. «Комплексообразование в системах гепарин - ион металла (Zn(II), Fe(III), Mn(II)) – аминокислота (глицин, аргинин)» VI Международная студенческая электронная научная конференция «СТУДЕНЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ 2014». 12. Цветкова И.С., Феофанова М.А. «Процессы комплексообразования кальция и магния с анаприлином» VI Международная студенческая электронная научная конференция «СТУДЕНЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ 2014». 13. Новикова В.В., Феофанова М.А. «Исследование кислотно-основных и комплексообразующих свойств соталола» VI Международная студенческая электронная научная конференция «СТУДЕНЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ 2014». 14. Журавлев Е.В. «Расчет химических равновесий в системе Ca2+ - гепарин – оксациллин в среде физиологического раствора» VI Международная студенческая электронная научная конференция «СТУДЕНЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ 2014». ПРИЛОЖЕНИЕ 2 ЗАЯВКИ, ОХРАННЫЕ ДОКУМЕНТЫ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, ПОЛУЧЕННЫЕ В РАМКАХ РЕАЛИЗАЦИИ ПРОЕКТА 1. Заявка на патент «Сенсор для определения антибиотиков пенициллинового ряда». 2. Заявка на патент «Ионоселективный электрод для определения меди». 3. Заявка на патент «Сенсор для анализа глицина в водных растворах». ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Справка по результатам деятельности НИР за период с 01.01.2012 г. по 20.06.2014 г. 1. Наиболее значимые достижения за весь период реализации НИР: достигнутые результаты, их соответствие мировому уровню, новизна, актуальность (объем до 700 знаков; кроме перечисления статистических данных из п. 2-8). Гепарин – противосвертывающий препарат, по своей химической природе, относящийся к классу гликозамингликанов, мономерное звено которого образовано связанными в α-(1→4) положении остатками Lидуроновой кислоты (IdoA) и D-гликозамина (D-GlcN) – 4-L-IdoA2S-α-4D-GlcNS,6S-α-1. С другой стороны плазма крови представляет собой многокомпонентный водный раствор, содержащий, кроме многочисленных низко- и высокомолекулярных лигандов, также и широкий спектр ионов биометаллов: макроэлементов, к примеру, кальция и натрия, с концентрациями порядка 10-3 моль/л, а также микроэлементов, таких как медь, цинк никель, кобальт, марганец и железо. Процессы комплексообразования ионов микроэлементов с гепарином в присутствии низкомолекулярных лигандов, таких как аминокислоты, должным образом не изучены. Отсутствие оценок или неточность в определении значений логарифмов констант образования комплексных форм не позволяет решить ряд задач, связанных с оценкой влияния гепарина на снижение равновесной концентрации микроэлементов в плазме крови, определение селективности гепарина по отношению к макро- и микроэлементам, оценки влияния гепарина в кровотоке на баланс неорганических и органических компонентов плазмы крови. В работе были решены следующие задачи: 1). На основе планируемого эксперимента (pH-метрическое титрова- ние) в системах, соответствующих по значениям параметров плазме крови (температура, ионной сила) проведено pH-метрическое титрование данных систем для получения данных, необходимых для описания процессов комплексообразования ионов марганца с высокомолекулярным гепарином и рядом аминокислот: аргинин,пролин,глицин. 2). Рассчитаны модели равновесий в системах Mn2+ - гепарин – аминокислота: аргинин, пролин, глицин - H2O. По рассчитанным значениям логарифмов констант образования комплексов определена селективность гепарина по отношению к иону марганца. 3). Оценено влияние эффекта комплексообразования данного микроэлемента с гепарином и рядом аминокислот на баланс этих компонентов в плазме крови. 2. Количество задействованных в реализации: - ППС; 1 - аспирантов; 2 - студентов 5. 3. Количество публикаций в рецензируемых российских и зарубежных научных изданиях, индексируемых в базах данных: 2 - РИНЦ; 1 - Scopus; 1 - Web of science. 4. Участие в значимых международных и всероссийских форумах, конференциях, семинарах и др. мероприятиях в рамках реализуемой проектной деятельности (перечислить). 1) XXI Каргинские чтения Всероссийская научно-техническая конференция молодых ученых «Физика, химия и новые технологии» 2) XXIV Российская молодежная научная конференция, посвященная 170-летия химического элемента «Проблемы теоретической химии» Екатеринбург. 3) Международный молодёжный научный форум «Ломоносов» Москва 2014г. 4) VIII Всероссийская конференция с международным участием молодых учёных по химии «Менделеев-2014» Санкт-Петербург. 5) Итоговая научно-техническая конференция по программе «У.М.Н.И.К.» (победитель Новикова В.В.) 5. Наименования выставок и конференций, где были представлены результаты проектной деятельности, с указанием полученных наград. 6. Перечень зарегистрированных объектов интеллектуальной собственности (подано 3 заявки на патенты) 7. Материально техническое обеспечение: - наименование созданных и существующих лабораторий, НОЦ, центров и др. (фотоотчет); - существующее и приобретенное в рамках ПСР оборудование (перечислить и представить фотоотчет). 8. Взаимодействие с реальным сектором экономики в рамках проектной деятельности: - наименование организации; - форма взаимодействия; - результаты взаимодействия.
