оптимизация like-системы экспрессии для получения сериновых
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Специальность: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ОПТИМИЗАЦИЯ LIKE-СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ B. PUMILUS 3-19 Работа завершена: "___"___________ 20__ г. ___________________ (А.О. Тихонова) ___________________ (М.Р. Шарипова) ___________________ (А.А. Тойменцева) ___________________ (О.Н. Ильинская) Работа допущена к защите: Научные руководители д.б.н., профессор "___"___________ 20__ г. к.б.н., н.с "___"___________ 20__ г. Заведующий кафедрой д.б.н., профессор "___"___________ 20__ г. Казань – 2015 СОДЕРЖАНИЕ стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4 ВВЕДЕНИЕ 6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 1.1 Сериновые протеиназы бацилл 8 1.2 Сигнальные пептиды 12 1.3 Экспрессионные системы 15 1.4 Очистка секреторных ферментов 20 1.4.1 Хроматографические методы очистки секреторных белков 23 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 2.1 Штаммы бактерий и вектора 26 2.2 Питательные среды и культивирование 2.2 2.3 Клонирование 2.3 2.4 Трансформация ДНК в клетки бактерий E. coli 30 2.5 Трансформация ДНК в клетки бактерий B. subtilis BG2036 30 2.6 Субстрат – специфическая активность 30 2.7 Определение концентрации белка 31 2.8 Ионообменная хроматография 32 2.9 Белковый электрофорез 33 2.10 Математическая обработка результатов 33 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 34 3.1 Подбор сигнальных пептидов и оценка их секреции с 34 использованием онлайн программы PrediSi 3.2 Клонирование генов сериновых протеиназ в оптимизированную 35 LIKE-систему экспрессии 3.3 Оценка протеолитической активности протеиназ в составе оптимизированной LIKE-системы экспрессии 2 36 Очистка сериновой протеиназы в составе оптимизированной LIKE- 38 системы экспрессии ВЫВОДЫ 41 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 42 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 49 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФ - аденозинтрифосфат БСА - бычий сывороточный альбумин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КМ-целлюлоза - карбоксиметилцеллюлоза МЕС - 2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота об/мин - оборотов в минуту ПЭГ - полиэтиленгликоль ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота Ala - аланин aprBp - ген субтилизиноподобной протеиназы Arg - аргинин Asp - аспарагиновая кислота GFP - зеленый флюоресцентный белок Gly - глицин gseBp - ген глутамилэндопептидазы His - гистидин HPLC - хроматография высокого давления in silico - компьютерное моделирование in vitro - «в пробирке» Leu - лейцин LIKE - от немецкого LIa-Kontrollierte Expression Lys - лизин Met - метионин MQ - деионизованная вода Pro - пролин SDS - додецилсульфат натрия Ser - серин SP - сигнальный пептид 4 Tfh - гидролаза Thermobifida fusca Thr - треонин Trp - триптофан Tyr - тирозин Xaa - остаток любой аминокислоты Z-Ala-Ala-Leu- p-нитроанилид бензилоксикарбонил-L-аланил-L-аланил- pNa L-лейцина Z-Glu-pNa n-нитроанилид бензилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты 5 ВВЕДЕНИЕ В связи с ростом мирового рынка фармацевтических препаратов актуальным становится поиск новых микробных ферментов с высокой протеолитической активностью, специфичностью и низкой токсичностью, способных заменить дорогостоящие медицинские препараты животного происхождения. Получение внеклеточных рекомбинантных белков становится все более актуальным, так как это значительно снижает энергозатраты на производство. В связи с этим, последние достижения в понимании механизмов секреции белка и технологии получения внеклеточных белков приобретают все больший интерес. Секреторные белки имеют неоспоримые преимущества: повышенная стабильность и растворимость белка, правильное формирование дисульфидных связей, что предотвращает формирование включений и облегчает дальнейшую очистку [Papaneophytou et al., 2013]. Для получения препаративного количества рекомбинантного белка часто применяют экспрессионные системы. А в качестве штамма продуцента используют грамположительные бактерии Bacillus subtilis. Высокая секреторная способность (до 1 г/л), недорогие компоненты сред для культивирования бацилл, а также безопасный статус этих микроорганизмов (generally recognized as safe) позволяет их использование в промышленности. Использование эффективность в экспрессии LIKE-системы отношении увеличения ранее показало экспрессии свою модельных внутриклеточных белков (до 1000 раз gfp, до 400 раз lacZ и ydfg) [Toymentseva et al., 2012]. Данная экспрессионная система основана на индуцируемом антибиотиками промоторе (PliaI) B. subtilis. Представляло интерес оптимизировать LIKE-систему путем подбора рекомбинантных сигнальных пептидов Bacillus megaterium, которые показали свою эффективность в отношении продукции гидролазы Thermobifida fusca (Tfh) [Stammen et al., 2010]. В качестве целевых белков были выбраны субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза Bacillus pumilus 6 3-19. Целью работы являлось оптимизировать LIKE-систему экспрессии для получения сериновых протеиназ B. pumilus 3-19. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи: 1) Подобрать сигнальные пептиды и оценить индекс их секреции с использованием онлайн программы PrediSi; 2) Клонировать гены сериновых протеиназ в оптимизированную LIKEсистему экспрессии; 3) Оценить протеолитическую активность протеиназ в составе оптимизированной LIKE-системы экспрессии; 4) Очистка сериновой протеиназы в составе оптимизированной LIKEсистемы экспрессии. 7 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Сериновые протеиназы бацилл Протеазы (пептидгидролазы) – ферменты, осуществляющие гидролиз пептидной связи в белках (класс гидролаз): R-R’ + HOH ↔ R-H + R’-OH Большую группу ферментов, различающихся по свойствам, структуре и субстратной специфичности, представляют собой протеазы. Протеазы делят на две группы: экзопептидазы (пептидазы), гидролизующие связи на N- и Cконцевых участках пептидной цепи и эндопептидазы (протеиназы), расщепляющие в белках внутренние пептидные связи. Эндопептидазы делят на 4 семейства, которые различаются по строению активного центра и механизму действия: аспартатные, сериновые, цистеиновые и металлопротеазы [Rawlings et al.,1993]. Наиболее обширный класс представляют сериновые протеиназы. Сериновые протеиназы содержат в активном центре остатки гистидина, аспарагина и серина. Сериновые протеиназы обычно имеют pH оптимум 7.511 и температурный оптимум +45…+55°С. Все сериновые протеиназы разделяют на 5 кланов (в зависимости от расположения аминокислот в каталитическом центре) - A, B, C, E, F. 1) Представители клана А произошли от общего предка химотрипсина. Сюда относят химотрипсин и химотрипсиноподобные протеиназы. Аминокислоты в каталитическом центре этих белков расположены в порядке His-Asp-Ser. 2) В клан B входят субтилизины и субтилизиноподобные протеиназы. Аминокислоты в каталитическом центре этих белков расположены в порядке Asp-His-Ser. 3) К клану С относятся сериновые карбоксипептидазы. Каталитическая триада имеет вид Ser-Asp-His. 8 4) Клан Е образуют сериновые пептидазы, участвующие в синтезе бактериальных клеточных стенок. Активный центр имеет вид Ser-XaaXaa-Lys. 5) У ферментов клана активный F центр представлен двумя аминокислотами Ser-Lys [Bott et al., 1996]. Рисунок 1 – Схема расположения сериновых протеиназ B. pumilus 3-19 в Международной классификации ферментов [Enzyme Nomenclature, 1992] Среди сериновых протеиназ наиболее хорошо изучены химотрипсиноподобные и субтилизиноподобные протеиназы [Lesk et al., 1996; Grabarec et al., 2002; Mofitt et al., 2012]. Они имеют общий механизм катализа, но у них разные структура и свойства. Субтилизиноподобные протеиназы гидролизуют связи, образованные гидрофобными аминокислотами, и активны по отношению к специфическим хромогенным субстратам [Балабан химотрипсинов с соавт., является 1994]. наличие Отличительной дисульфидных особенностью мостиков, структурирующих белок [Замолодчикова с соавт., 2003]. У субтилизинов такие мостики отсутствуют. Второй отличительной особенностью являются аминокислоты, окружающие каталитический центр. У химотрипсинов это Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro, а у субтилизиноподобных это Gly-Thr-Ser-Met-Ala. 9 Данные последовательности достаточно консервативны [Балабан, 2008]. Ферменты клана химотрипсинов по субстратной специфичности могут быть разделены на 3 группы (или семейства). Группы трипсина и трипсиноподобных ферментов гидролизуют пептидные связи, образованные карбоксильными группами аминокислотных остатков Arg и Lys, химотрипсины и химотрипсиноподобные ферменты (а также субтилизины клана SB) расщепляют пептидные связи, образованные ароматическими аминокислотами Phe, Tyr, Trp, а также Leu и Met [Шамсутдинов, 2009]. Глутамилэндопептидазы – ферменты, обладающие узкой субстратной специфичностью по отношению к пептидным связям, образованным глутаминовой и аспарагиновой аминокислотами. Группа глутамилэндопептидаз менее исследована в функциональном отношении по сравнению с другими группами эндопептидаз семейства химотрипсинов, хотя первый и наиболее известный фермент с такой специфичностью впервые выделен из культуральной жидкости Staphylococcus aureus V8 и охарактеризован более тридцати лет тому назад [Drapeau et al., 1977]. Строгая предпочтительность к гидролизу пептидных связей, определяемая присутствием в субстрате отрицательно заряженных боковых цепей глутаминовой и аспарагиновой кислот, делает эти ферменты удобным инструментом при определении аминокислотной последовательности белков, а также перспективной моделью при изучении субстратной специфичности, активного центра и использования этих белков в ферментативном синтезе пептидов. Глутамилэндопептидазы в соответствии с природой продуцента можно разделить на три группы: группа Staphylococcus, группа Bacillus и группа Streptomyces у которых имеются отличия в аминокислотной последовательности и в физико-химических свойствах [Stennikce et al., 1996]. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов являются секреторными белками и обладают молекулярной массой от 18 до 34 кДa, но большинство имеет молекулярную массу 24-29 кДа. Их изоэлектрические точки варьируют в широком интервале рН – от 4.5 до 7.9. Характерным свойством 10 глутамилэндопептидаз является ингибирование DFP (диизопропилфторфасфатом) – специфическим ингибитором сериновых протеиназ [Ogata et al., 1991]. Другие ингибиторы как белкового, так и химического происхождения не оказывают существенного влияния на активность глутамилэндопептидаз, включая специфический ингибитор – PMSF (фенилметилсульфонилфторид) [Ogata et al., 1991]. Все изученные глутамилэндопептидазы стабильны в интервале рН 6.0-10.0, а температурный оптимум их активности приходится на +55°С. Ионы Са2+ стабилизируют молекулу белка, при этом возрастает активность ферментов, однако глутамилэндопептидазы не являются Са2+-зависимыми. Протеазы широко применяются в пищевой, легкой, кожевенной, фармацевтической промышленности. лекарственных препаратов происхождения является на Разработка основе новых ферментов перспективным направлением эффективных бактериального современной медицины и биотехнологии [Puri et al., 2002; Gupta et al., 2002; Гришин с соавт., 2004; Балабан с соавт., 2008]. В настоящее время интенсивно исследуются ферменты класса сериновых протеиназ, так как они широко используются как лекарственные средства. Особый интерес вызывает семейство глутамилэндопептидаз, обладающих узкой субстратной специфичностью, которые способные гидролизовать пептидные связи по строго определенным аминокислотным остаткам. Это делает их удобным инструментом при изучении аминокислотной последовательности белков и локализации активных центров многофункциональных ферментов. Такие ферменты успешно применяются в молекулярной биологии как высокоточные инструменты для изучения структуры белков и пептидов, а также в качестве катализаторов синтеза пептидных связей. Поэтому получение гомогенных препаратов этих ферментов с последующим изучением их структуры, свойств представляет практический интерес. 11 и субстратной специфичности 1.2 Сигнальные пептиды Общей чертой клеток про- и эукариот является перенос белка с места его синтеза к другим органеллам или во внешнюю среду. Для переноса белка во внешнюю среду синтезируются полипептиды с аминоконцевым «почтовым индексом» (сигнальным пептидом) [Tjalsma et al., 2000], который играет решающую роль в транслокации через мембрану [Heijne et al., 1990]. Поскольку сигнальные пептиды располагаются на N-конце пробелка, то они называются аминоконцевыми. Белок, содержащий аминоконцевой сигнальный пептид называют пробелком. Аминоконцевые (NH3+) сигнальные пептиды содержат три основных домена: 1) Положительно–заряженный N–домен сигнального пептида, содержит остаток Lys или Arg. Положительный конец N–домена взаимодействует с «транслокационной машиной», а отрицательно – заряженный с фосфолипидами мембраны. 2) H–домен сигнального пептида формируется гидрофобными участками аминокислот с образованием шпилечных структур. В гидрофобном ядре содержатся остатки Gly или Pro. Благодаря шпильке сигнальный пептид встраивается в мембрану. 3) C-домен сигнального пептида содержит сайт расщепления для специфических сигнальных пептидаз, которые удаляют сигнальный пептид от зрелого белка вскоре после транслокации (рисунок 1). 12 Рисунок 1 – Модель транслокации белка через цитоплазматическую мембрану. А) встраивание в мембрану сигнального пептида; Б) протаскивание белка через мембрану; В) отщепление зрелого белка от сигнального пептида; Г) деградация сигнального пептида с помощью сигнальных пептидаз [Tjalsma et al., 2000] Тиалзма с соавторами (H. Tjalsma) протестировали с помощью компьютерных программ (SubtiList, SignalP, TopPred2) все белки B. subtilis, содержащие сигнальные пептиды [Tjalsma et al., 2000]. На основании полученных данных сигнальные пептиды были разделены на четыре основных класса: 1) Первый класс присутствующие в составляют пробелках, «типичные» которые сигнальные расщепляются пептиды, сигнальными пептидазами I-типа в клетках B. subtilis (Sec путь секреции). Сигнальные пептиды первого класса также включают подгруппу, которая содержит так называемый двойной аргинин (R-R-мотив), который может направлять белки по другому транслокационному пути - Tat пути секреции. 2) Второй класс сигнальных пептидов обнаружен в пролипидах, которые расщепляются специфической сигнальными пептидазами II типа (LspA пептидаза) в клетках B. subtilis. 3) Третий класс составляют сигнальные пептиды, обнаруженные для препилин–подобных белков, которые в клетках B. subtilis расщепляются препилин-специфичной COMc сигнальной пептидазой. 13 4) Четвертый класс сигнальных пептидов характерен для бактериоцинов и феромонов, которые экспортируются с помощью ABC транспортеров [Tjalsma et al., 2000]. Рисунок 2 - Классификация сигнальных пептидов B. subtilis [Tjalsma et al., 2000] Основной путь секреции белка в клетках B. subtilis это Sec – путь. Клетки B. subtilis выделяют 10% жизненно-важных белков, кодируемых на хромосомах, через Sec-путь. Например, специфическая гидролаза обеспечивает клетки питательными веществами, участвует в синтезе клеточной стенки и клеточного деления [Harwood, Cranenburgh., 2008]. Секреторный аппарат (Sec–транслокон) состоит из порового комплекса, который представлен беками SecY, SecE, SecG и SecA белка, который связывается с сигнальным пептидом и «протаскивает» белок через поры на поверхность мембраны. SecDF белок необходим для поддержания высокого уровня секреции. Клетки B. subtilis способны секретировать большое количество белков долгое время поддерживая достаточный уровень белков секреторного аппарата [Koeberling, Freudl., 2006]. Для получения белков в промышленном масштабе важным параметром является синтез целевого продукта 14 в среду культивирования. Это обеспечивает «секреторная машина», состоящая из множества белков. Понимание механизма регуляции секреции способствует рациональному подбору сигнальных пептидов и сигнальных пептидаз для получения интересующего фермента [Kang et al., 2014]. 1.3 Экспрессионные системы Производство многих ценных белков для медицины и промышленности часто ограничено низким выходом белка в естественных условиях. Благодаря современным методам генной инженерии, протеомики и биоинформатики количество рекомбинантных белков растет в геометрической прогрессии [McLaughkin et al., 1981; Efstathiou, Truffaut., 1986; Habibi et al., 2014; Wyre, Overton., 2014]. Спрос на рекомбинантные белки увеличивается во многих областях деятельности (фармакология, сельское хозяйство). Поэтому создание и совершенствование уже имеющихся экспрессионных систем является важной задачей современной биологии. Экспрессионные системы на основе клеток E. coli являются наиболее известными, так как кишечная палочка генетически хорошо изученный микроорганизм [Blattner et al, 1997]. Однако, экспрессионные системы на основе клеток E. coli имеют ряд недостатков связанных с особенностями строения клеточной стенки грамотрицательных бактерий, а именно - синтезом токсичного липополисахарида, способного необратимо связываться с целевым белком [Jorgensen et al., 2013]. В результате применение таких белков для медицины и пищевой промышленности становится невозможным. Частой проблемой получения белка в клетках E. coli является невозможность производства водорастворимых ферментов (изза формирования гидрофобных агрегатов). В результате такие белки подвергают дополнительной очистке [Papaneophytou et al., 2013]. Напротив, грамположительные бактерии не синтезируют эндотоксинов, имеют хорошо развитую систему секреции, что значительно облегчает производство белков, кроме того, по производительности целевого продукта ничем не уступают клеткам E. coli. В качестве штаммов продуцентов используют бактерии рода 15 Lactococcus и Bacillus [Papaneophytou et al., 2013; Jorgensen et al., 2013]. Использование грамположительной бактерии Lactococcus lactis в процессе получения рекомбинантного белка имеет ряд преимуществ: микроорганизм безопасен (используется в производстве пищевых продуктов), не имеет ассоциированных с клеточной стенкой эндотоксинов, обладает хорошо развитой системой секреции. На основе клеток L. lactis создана Р170-система экспрессии [Jorgensen et al., 2013]. Данная система основана на промоторе PР170, который идентифицирован на хромосоме методом гомологичной рекомбинации, с целью найти регулируемый промотор. С помощью промоторного зонда pAK80 установлено, что Р170 регулируется в позднюю стационарную фазу роста при низких значениях pH. Затем было показано, что в таких условиях выделяется молочная кислота, которая действует как индуктор Р170. В клетках L. lactis промотор Р170 контролирует экспрессию гена, кодирующего белок с неизвестной функцией (OrfX, 138 аминокислот). Последовательность Р170 состоит из области -10 и ACD бокса, с которым взаимодействует регулятор транскрипции - RcfB. Считается, что RcfB регулятор участвует в адаптации L. lactis к кислотному стрессу. Авторы [Jorgensen et al., 2013] предполагают, что функции OrfX белка могут быть связаны с кислотным стрессом. Показано, что молочная кислота как произведенная самим микроорганизмом, так и добавленная в среду культивирования индуцирует Р170. Значение pH коррелирует с количеством молочной кислоты, необходимой для индукции промотора Р170: при низких значениях pH требуется небольшое количество молочной кислоты. Для получения целевого рекомбинантного белка авторы применяли плазмиды с разной копийностью: pCT1138A – 10-20 копий на клетку; pAMb1 – 40-80 копий на клетку [Jorgensen et al., 2013]. Авторы [Jorgensen et al., 2013] также подчеркивают, что экспрессионная система должна содержать не только сильный регулируемый промотор, но и сигнальный пептид для эффективной секреции рекомбинантного белка. Выход секретируемого рекомбинантного белка зависит от N-концевого сигнального пептида, который направляет 16 рекомбинантный белок через Sec систему секреции. Были подобраны сигнальные пептиды - Usp45sp, Usp45, SP310 L. lactis. Дополнительно, модифицированный сигнальный пептид SP310mut2 был получен с помощью сайт-направленного мутагенеза аминокислот, близких к сайту расщепления сигнальной пептидазой. Сайт-направленный мутагенез привел к повышению выхода секретируемой нуклеазы на 45% по сравнению с сигнальным пептидом SP310. В зависимости от выбранного вектора экспрессии (pCT1138A или pAMb1) N-конец, секретируемого рекомбинантного продукта содержит либо нативный сигнальный пептид, либо удлинённый сигнальный, состоящий из четырех аминокислот AERS. Применение экспрессионной системы позволило повысить выход таких белков как: внеклеточная βгалактозидаза Bifidobacterium bifidum, амилаза Lactobacillus gasseri, β-1,3глюконаза Pedobacter и другие [Jorgensen et al., 2013]. Для производства различных биомолекул и терапевтических белков часто используют клетки B. subtilis. Эти бактерии с грамположительным морфотипом, имеют статус GRAS-организма, признаны безопасными и непатогенными, не производят эндотоксинов, имеют развитые пути секреции, генетически охарактеризованы (геном бактерии полностью секвенирован) и легко культивируемы [Westers et al., 2004]. Поскольку для биотехнологической промышленности важна дешевизна и высокий выход белков, часто применяют системы экспрессии на основе клеток бацилл [Ho, Lim, 2003; Lee et al., 2010; Wu et al., 2006; Bongers et al., 2005]. Экспрессионные системы могут быть индуцированы индуктором извне или аутоиндуцированы. аутоиндуцированные В последнее системы, время которые становятся могут стать популярными альтернативой индуцибельным системам [Lee et al., 2010; Panahi et al., 2014]. Так, аутоиндукция в клетках B. subtilis достигается, например, с помощью активации сигма фактора B (SigB). SigB зависимые промоторы активируются под действием на клетку стрессовых факторов: тепловой шок, солевой, кислотный шоки, недостаток кислорода, фосфата или глюкозы [Fuangthong et 17 al., 20014; Volker et al., 1998]. Ген ohrB в клетках B. subtilis, который обеспечивает устойчивость к пероксиду, является частью SigB зависимого стрессового регулона. Анализ уровня мРНК гена ohrA показал, что гены стрессового регулона активируются очень быстро во время недостатка глюкозы. В 2014 году Панахи с соавторами (R. Panahi) протестировали систему, основанную на SigB зависимом ohrB промоторе (PohrB) [Panahi et al., 2014]. Многие факторы, такие как переход к стационарной фазе роста или клеточное голодание, активируют SigB регулон за счет уменьшения соотношения АТФ/АДФ. В результате запускается транскрипция SigB генов. В качестве модельного белка авторы получали ксиланазу. Культивирование бактерий проводили с постоянным потоком питательной среды во избежание ингибирования субстрата (глюкозы). Увеличение активности ксиланазы (в 6 раз) в конце ферментации наблюдалось в результате синтеза сигма фактора B, который поддерживал самоиндукцию экспрессионной системы. Рекомбинантный штамм показал повышенный синтез ксиланазы (в 6 раз выше по сравнению с контролем). Контрольный штамм (BRB06) не показал высокой активности, однако из-за присутствия нативной ксиланазы, активность составляла 19%. Ксиланазная активность в рекомбинантном штамме увеличивалась от 14 до 81% (6 раз) в стационарной фазе роста. Уровень экспрессии в рекомбинатной ксиланазы, по данным литаратуры, различен: от 0.06 ед./мг до 2000 ед./мг. В данной работе специфическая ксиланазная активность рекомбинатного и контрольного штаммов составила 38 ед./мг и 7 ед./мг, соответственно [Panahi et al., 2014]. Эффективная секреция белка обеспечивается сигнальным пептидом гена amyQ. Таким образом, авторами предложена новая самоиндуцибельная система, не нуждающаяся в индукторах, как альтернатива индуцибельным системам [Panahi et al., 2014]. На сегодняшний день известно, что определённые двухкомпонентные системы грамположительных бактерий имеют высокий уровень экспрессии собственных генов (в 100-1000 раз) под действием стрессовых факторов 18 (антибиотики, щелочной стресс, детергенты и др.). На этой основе была создана новая LIKE-система экспрессии B. subtilis (от немецкого LIaKontrollierte Expression) позволяющая направленно модулировать экспрессию генов при добавлении антибиотика в среду [Toymentseva et al., 2012]. Модельные эксперименты с использованием репортёных генов lacZ и gfp под контролем промотора PliaI показали высокий уровень экспрессии этих генов (в 400-1000 раз) при воздействии антибиотика уже через 10-15 мин. Более того, эксперименты с делеционными мутантами показали, что Liaсистема не имеет влияния на фенотип бактериальной клетки, в тоже время определены механизмы регулирующие экспрессию промотора PliaI в нормальных промотора условиях. PliaI, где LIKE-система состоит последовательность из оптимизированного Шайна-Дальгарно является оптимальной для клеток B. subtilis, а расстояние от данного бокса до стартового (AUG) кодона составляет 7 нуклеотидов. Такое расположение структур в промоторе повышает эффективность трансляции, что ранее доказано экспериментально in vitro и in vivo [Ma et al., 2002; Vellanoweth et al., 1998]. LIKE-система основана на двух типах векторов, которые позволяют получать экспрессию интересуемого гена в геноме – (интегративная экспрессия - pLIKE-int) и на отдельно реплицирующейся единице (плазмиде) – (репликативная экспрессия - pLIKE-rep). Исследования данной системы на модельном внутриклеточном белке GFP показали отсутствие базального уровня экспрессии интересуемого гена в неиндуцированных условиях. Экспрессия на плазмиде даёт повышенный выход белка, по сравнению с экспрессией в геноме вследствие мультикопийности вектора. Под контролем промотора PliaI уже через 30 мин после добавления индуктора, во всех клетках популяции (на основе репликативного и интегративного векторов) происходит экспрессия gfp гена. При этом, поскольку клетки B. subtilis развили резистентность к большому разнообразию антибиотиков, их присутствие в концентрации достаточной для индукции PliaI промотора не оказывает негативного влияния на 19 клеточную стенку бактерий. Немаловажным также отметить небольшую себестоимость индукторов, что является важным параметром при выборе определённой системы экспрессии. Таким образом, применение экспрессионных систем позволяет получить повышенный выход целевого белка при минимальных затратах. 1.4 Очистка секреторных ферментов Исследования строения и функций белков предполагают наличие гомогенных препаратов . Получение белка в гомогенном состоянии - сложная задача. Как правило, биологический материал, являющийся источником выделения, содержит большое число сопутствующих белков и конгламератов. Близкие свойства компонентов этой смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний [Сова с соавт., 2006]. Одним из основных свойств клеток бацилл является способность этих бактерий секретировать большое количество внеклеточных белков-ферментов [Simonen, Palva, 1993]. В последние годы наблюдается непрерывный прогресс в расшифровке механизмов секреции и применения этих знаний в различных областях биотехнологии, таких как производство ферментов, кормовых добавок, пищевой и фармацевтической промышленности. Для получения секреторных ферментов микроорганизмы выращивают в колбах или ферментерах. Для выделения внеклеточных ферментов необходимо отделить клетки от культуральной жидкости (супернатанта). Затем из супернатанта выделяют фермент, который очищают до необходимого состояния. Очистка с помощью ПЭГ фракционирования. Наиболее эффективным осадителем белков является полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой от 4000 г/л и выше. Поведение белков в растворах полиэтиленгликоля довольно сходно с их поведением в процессе осаждения органическими растворителями. Молекулу полиэтиленгликоля рассматривают как полимерный органический растворитель, хотя для получения нужной степени осаждения требуются более низкие его концентрации [Сова с соавт., 20 2006]. Тиан с соавторами (F. Tian) проводили очистку внутриклеточной и внеклеточной левансахарозы, продуцируемой бактериями B. amyloliquefaciens по двум методикам: с помощью ПЭГ фракционирования (1) и осаждением сульфатом аммония (2). Способ осаждения белков 60% сульфатом аммония и дальнейшая очистка не привел к успеху. ПЭГ представляет собой неионогенный гидрофильный полимер. Фракционирование белков ПЭГом зависит от его молекулярного веса и концентрации в растворе фермента. ПЭГ низкой молекулярной массы (200, 350, 400 г/л) фракционировал внеклеточную левансахарозу быстрее, чем внутриклеточный фермент. Наибольшая активность (73%) внеклеточного и внутриклеточного фермента была достигнута при использовании низкомолекулярного ПЭГ-200 с концентрацией 30% (v/v). Увеличение концентрации ПЭГ-200 до 40% снижало активность левансахарозы. Применение высокомолекулярного ПЭГ-2000 приводило к низкому фракционированию как внеклеточной так и внутриклеточной левансахарозы. Наивысшая активность внеклеточной левансахарозы (34%) была достигнута при концентрации ПЭГ-4000 30%. Наивысшая активность (53%) внутриклеточной левансахарозы была достигнута при концентрации ПЭГ4000 40%. Очищенные ферменты анализировали с помощью белкового электрофореза для определения гомогенности препарата. Таким образом, авторы оценили селективность ПЭГ для фракционирования левансахарозы из клеток B. amyloliquefaciens. Показано, что все фракции внутриклеточной левансахарозы имеют степень очистки 14.9 – 38.8, тогда как фракции внеклеточной левансахарозы 0.6 – 1.8. Такие различия в степени очистки могут быть из-за состава раствора фермента и/или конформационных изменений внеклеточной левансахарозы во время секреции [Tian et al., 2011]. Осаждение белков. Разделение белков на основе их различной растворимости является классическим методом. Так фракционирование солями основывается на избирательном разделении белков вследствие их различной растворимости в растворах 21 солей. Соль подбирается в соответствии со следующими достаточной растворимостью, требованиями: которая не она должна меняется обладать значительно в зависимости от температуры, при добавлении соли не должен меняться рН раствора, соль должна легко отделяться от белка и не оказывать денатурирующего действия. Часто для фракционирования белков используют сульфат аммония [Chen et al., 2015; Shi et al., 2015; Asha et al., 2015]. Обычно проводят фракционное осаждение белков возрастающими концентрациями сульфата аммония. Осаждение сульфатом аммония зависит от гидрофобности белка. При высокой концентрации соли в белковом растворе ионы соли подвергаются гидратации, т.е. молекулы воды связываются с ионами соли, что приводит к агрегации белка. Агрегация белка происходит тем быстрее, чем больше гидрофобных аминокислот. Фракционирование сульфатом аммония приводит к стабилизации белков, что является важным преимуществом по сравнению с другими методами. Таким образом, дробное фракционирование сульфатом аммония из культуральной жидкости позволяет сконцентрировать фермент и освободить его от сопутствующих белков [Балабан с соавт., 2012]. В 2014 году Афифа с группой соавторов (D. Afifah) выделили новый штамм B. pumilus 2g. Штамм выделял протеазу, обладающую сильной фибринолитической активностью [Afifah et al., 2014]. Фибринолитический фермент с молекулярной массой 20 кДа очищали из 3 литров супернатанта культуральной жидкости B. pumilus 2g путем последовательного применения осаждения гидрофобной сульфатом аммония, хроматографии. ионообменной После хроматографии центрифугирования и супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм и подвергали осаждению сульфатом аммония 80% (w/v) в течение ночи при +4°С. Осадок ресуспендировали в 20 мМ трис-HCl, затем диализовали против 20 объемов того же буфера в течение 24 ч. После диализа образец высушивали и растворяли в том же буфере. Ресуспендированный образец наносили на колонку КМ-Sephadex и ступенчато элюировали (0.1М – 1М NaCl, с шагом 22 0.2 М). Фракции с наибольшей активностью объединяли, диализовали и лиофилизировали. Гидрофобную хроматографию с фенил-сефарозой использовали для дальнейшей очистки белка. Фракции анализировали с помощью SDS-электрофореза и зиммографии в присутствии фибриногена и тромбина. В результате очистки получено 2.4 мг белка с молекулярной массой 20 кДа и степенью очистки 16% [Afifah et al., 2014]. Таким образом, осаждение белков органическими растворителями, ПЭГом или сульфатом аммония позволяет сконцентрировать фермент и освободить от сопутствующих белков. 1.4.1 Хроматографические методы очистки секретируемых белков Белки обычно избирательно адсорбируются на твердых фазах самых различных типов. Поэтому адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография, широко используются для разделения белков. Применение этих методов позволяет получить наибольшую степень очистки белков. Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники, фосфат кальция (гидроксилаппатит) и разнообразные аффинные сорбенты [Сова с соавт., 2006]. Способ очистки зависит от структуры белка. При наличии специфической метки (Strep-tag, His-tag) проводят аффинную хроматографию, при которой происходит специфическое взаимодействие между молекулами (иммобилизованный на адсорбенте лиганд осуществляет специфический отбор белков путем связывания) [Сова с соавт., 2006]. С помощью аффинной хроматографии можно получить целевой белок, который находится в смеси в ничтожно малых количествах [Балабан с соавт., 2012]. Наиболее популярным методом очистки белков является ионная хроматография [Jungbauer, Hahn, 2009; Karlsson; Hirsh, 2011]. Белки связываются ионообменником с помощью электростатических сил между заряженными поверхностями белков и заряженными группами на ионообменнике. Количество белка, которое может связать ионообменник в расчете на единицу объема, может быть очень большим, что является несомненным преимуществом перед другими методами очистки. 23 Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография - это метод разделения веществ по их способности мигрировать по ионообменной колонке или по пластине, покрытой ионообменником. Ионообменная хроматография основана на обратимом обмене содержащихся в растворе ионов, на ионы входящие в состав ионообменника. В ионообменной хроматографии в качестве элюента применяют растворы электролитов. Ионообменники делятся на две группы: неорганические и органические. К органическим относят целлюлозу, фосфоуголь и синтетические высокомолекулярные вещества – ионообменные смолы [Крешков, 1970]. В хроматографии важную роль играют производные целлюлозы, содержащие функциональные группы, способные участвовать в ионном обмене [Балабан с соавт., 2012]. В настоящее время ионообменная хроматография является одним из основных методов очистки белков на первой стадии [Sharouny et al., 2015; Cheng et al., 2015]. Эксклюзионная хроматография. Эксклюзионная (гель-фильтрация) хроматография основана на разделении веществ по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки вещества с большей молекулярной массой, способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры (ссылка). В 2013 году группой ученых (Mohsen с соавт.) из культуральной жидкости бактерий B. megaterium выделены и очищены две термостабильные протеазы – P1 (28 кДа) и P2 (25 кДа). Очистку проводили в три стадии: (1) осаждением сульфатом аммония, (2) ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе и (3) гель-хроматографией на сорбенте Sephadex G-200. На первом этапе очистки выход фермента составил 73%, фермент был очищен в 6 раз. Фракции полученные после ионообменной хроматографии концентрировали и разделяли на колонке Sephadex G-200. В результате были получены две гомогенные фракции – P1 и P2 со степенью 24 очистки 13 и 7, соответственно, и выходом фермента P1 – 30%, P2 – 11% [Mohsen et al., 2013]. Таким образом, для очистки секреторных ферментов, часто применяют несколько подходов, включающих осаждение белков (сульфатом аммония или органическими (катионообменную растворителями), или ионообменную анионообменную) и гель хроматографию фильтрацию (для разделения белков по молекулярной массе). В связи с широким применением сериновых протеинах бацилл, в данной работе в качестве модельных белков были использованы субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза B. pumilus 3-19. 25 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Штаммы бактерий и вектора Штаммы, использованные в работе, представлены в таблице 1. Плазмиды, использованные в работе, представлены в таблице 2. Таблица 1 – Штаммы бактерий, использованные в работе Название штамма B. subtilis BG2036 Генотип Цель использования Источник Δapr-684, ΔnprE522 [Yang et al., 1984] B. subtilis BG2036 ∆58.21 Δapr-684, ΔnprE522, ClmR, gseBp B. subtilis BG2036 pCS9 Δapr-684, ΔnprE522, ErmR, aprBp B. pumilus 3-19 StrR трансформация рекомбинантных плазмид положительный контроль протеолитической активности глутамилэндопептидазы (GseBp) положительный контроль протеолитической активности субтилизиноподобной протеиназы (AprBp) положительный контроль протеолитической протеолитической активности рекомбинантных протеиназ (AprBp и GseBp) Музей лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов, КФУ Таблица 2 – Векторы, использованные в работе Название вектора/ Генотип Источник штамма pLIKE-rep ori1030, PliaI(opt), colEI, bla, ermR [Toymentseva et al., 2012] pNC3803 pLIKE-rep + SPPac Музей лаборатории «Биосинтеза и pNC3801 pLIKE-rep + SPYngk биоинженерии ферментов» 26 MRE 036 pLIKE-rep + aprBp MRE 035 pLIKE-rep + gseBp pTN 050 pLIKE-rep + SPPac+ aprBp pTN 049 pLIKE-rep + SPPac+ gseBp pTN 093 pLIKE-rep + SPYngk+ aprBp pTN 094 pLIKE-rep + SPYngk+ gseBp Получены в работе Штаммы, полученные в работе MRB044 pLIKE-rep + aprBp MRB045 pLIKE-rep + SPPac+aprBp MRB046 pLIKE-rep + SPYngk+aprBp MRB047 pLIKE-rep + gseBp MRB048 pLIKE-rep + SPPac+gseBp MRB049 pLIKE-rep + SPYngk+gseBp Получены в работе 2.2 Питательные среды и культивирование Культивирование штаммов проводили на среде LB (Лурия-Бертолли) [Sambrook et al., 1989] (%): триптон – 1.0; дрожжевой экстракт – 0.5; NaCl – 0.5; pH 8.5. Агаризованная среда LB включала дополнительно 2% агар (LA). Cолевая основа cреды Спицайзена (100 мл): K2HPO4 х 3H2O – 18.4 г; KH2PO4 (безводный) – 6.0 г; (NH4)2SO4 – 2.0 г; цитрат Na – 1.2 г [Anagnostopolous et al., 1961]. Отдельно готовили растворы: глюкоза – 40%; казаминовые кислоты – 0.2 г/10мл; MgSO4 х 7H2O – 2 г/10 мл, триптофан – 0.05 г/10 мл; дрожжевой экстракт – 0.5 г/10 мл. Среда Спицайзена I: на 4.5 мл: глюкоза – 90 мкл; казаминовые кислоты – 90 мкл; дрожжевой экстракт – 90 мкл; триптофан – 45 мкл; солевая основа – 450 мкл; вода – 3.725 мл. 27 Среда Спицайзена II: на 5 мл: глюкоза – 100 мкл; казаминовые кислоты – 50 мкл; MgSO4 х 7H2O – 80 мкл; триптофан – 10 мкл; солевая основа – 500 мкл; вода – 4.300 мл. Для тестирование протеолитической активности рекомбинантных штаммов использовали питательную среду - 1% молочный агар (1% молоко, 4% агар). Среды стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин. Для приготовления сред использовали дистиллированную воду. 2.3 Клонирование 2.3.1 Полимеразно-цепная реакция Для амплификации генов сериновых протеиназ (aprBp и gseBp) в качестве матрицы использовали геномную ДНК бактерий B. pumilus 3-19. Для клонирования указанных генов амплификацию проводили с использованием Pfu ДНК-полимеразы фирмы «Сибэнзим», г. Москва. Для скрининга рекомбинантных конструкций применяли Taq ДНК-полимеразу фирмы «Сибэнзим», г. Москва. При этом, ДНК-матрицей служила свежая 24 часовая культура бактерий E. coli (трансформанты). Реакции амплификации проводили с помощью термоциклера «MJ mini» производства фирмы «BioRad» (США), согласно прилагаемым к ферментам протоколам. 2.3.2 Рестрикция Для клонирования генов сериновых протеиназ в репликативный вектор (pLIKE–rep), амплификаты генов aprBp и gseBp и вектор pLIKE–rep обрабатывали эндонуклеазами рестрикции SalI и HindIII («Сибэнзим», г. Москва). Реакционную смесь инкубировали при температуре +37С в течение 2 ч. Реакцию рестрикции проводили в две стадии: І стадия рестрикции Компоненты реакции Количество, мкл Концентрация Компонент реакции Количество, мкл Концентрация амплификат 15 10 нг/мкл pLIKE–rep вектор 4 44 10х буфер для 4 1х 10х буфер для 2 1х 28 рестрикции рестрикции стерильная вода 9.5 - стерильная вода 12.5 - эндонуклеаза рестрикции SalI 1.5 5000 ед эндонуклеаза рестрикции SalI 1.5 5000 ед Инактивация фермента SalI при температуре +60°С в течение 20 мин ІІ стадия Компоненты реакции Количество, мкл Концентрация Компонент реакции Количество, мкл Концентрация амплификат 30 10 нг/мкл pLIKE–rep вектор 30 44 нг/мкл 10х буфер для рестрикции 4 1х 10х буфер для рестрикции 4 1х стерильная вода 5.5 - стерильная вода 3.7 - Bsa (5 мкг/мл) 0.8 0.8 мкг/мкл Bsa (5 мкг/мл) 0.8 0.8 мкг/мкл эндонуклеаза рестрикции HindIII 0.5 5000 ед эндонуклеаза рестрикции HindIII 0.5 5000 ед 2.3.3 Лигирование Реакцию лигирования проводили при температуре +16°C в течение 12 ч в конечном объеме 20 мкл. Использовали Т4 ДНК-лигазу фирмы «Сибэнзим», г. Москва. Компоненты реакции Количество, мкл Концентрация 10x лигазный буфер 2 1х 2.5 - 2 23 нг/мкл Т4-лигаза 1.5 5000 ед амплификат 12 6 нг/мкл MQ вода вектор 29 2.4 Трансформация ДНК в клетки бактерий E. coli Трансформирмацию ДНК в компетентные клетки E. сoli DH5α проводили как описано в [Sambrook et al., 1989]. Компетентные клетки E. coli DH5α размораживали во льду. К 100 мкл компетентных клеток добавляли лигазную смесь (1-3 мкг) и выдерживали во льду в течение 30 мин. Смесь компетентных клеток и ДНК подвергали тепловому шоку: выдерживали в течение 90 сек при температуре +42°C, а затем во льду в течение 2 мин. К смеси добавляли 400 мкл среды LB и инкубировали 1 ч с качанием (200 об/мин) при температуре +37°C. Суспензию трансформированных клеток высевали по 100 мкл на чашки с агаризованной средой LB и ампициллином. 2.5 Трансформация ДНК в клетки бактерий B. subtilis BG2036 Трансформацию проводили по методу [Anagnostopolous et al., 1961]. Для трансформации бактерий B. subtilis BG2036 использовали среды Спицайзена. К 4.5 мл раствора Sp I добавляли 700 мкл ночной культуры, инкубировали в течение 3.5 – 4 ч при +37C с аэрацией при 200 об/мин. К 5 мл раствора Sp II добавляли 750 мкл раствора Sp I с клетками и 80 мкл стерильного раствора сульфата магния. Инкубировали при качании 1.5-2 ч при +37С. Далее, в стерильную пробирку вносили 500 мкл раствора Sp II с компетентными клетками и добавляли 1 мкг плазмидной ДНК. Инкубировали 1 ч при +37С, с последующим качанием в течение 1 ч при +37С. 2.6 Субстрат-специфическая активность Специфическую активность субтилизиноподобной протеиназы определяли по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa по методу Люблинской [Люблинская с соавт., 1987]. Реакционная смесь состояла из 500 мкл субстрата (0.5 мг/мл) Z-Ala-Ala-Leu-pNa, растворенного в диметилформамиде, 2 мл 0.05 М Трис-HCl буфера, рН 8.5 и 50 мкл КЖ. Смесь инкубировали при +37°С, от 2 до 60 мин до появления соломенножелтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 200 мкл 50%-й уксусной кислоты. В контрольную пробу, содержащую 500 мкл субстрата и 200 мкл уксусной кислоты, после инкубации при +37°С 30 одновременно с опытной пробой добавляли 50 мкл КЖ, и измеряли оптическую плотность опытной пробы против контрольной при длине волны излучения λ=410 нм. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре xMark (BioRad, США). Определение протеолитической активности глутамилэндопептидазы по гидролизу синтетического субстрата Z-Glu-pNa. Реакционная смесь состояла из 1 мл раствора субстрата (0.5 мг/мл) Z-Glu-pNa растворенного в 0.1 М трисHCI буфере, рН 8.5 и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при +37°C от 2 до 60 мин до появления соломенно-желтого окрашивания, затем реакцию останавливали добавлением 0.5 мл 1 М Na-ацетатного буфера, рН 4.7. Контрольную пробу, содержащую 1 мл субстрата и 0.5 мл 1 М Naацетатного буфера, рН 4.7, инкубировали при +37°C одновременно с опытной пробой. По окончании инкубации в контрольную пробу добавляли 50 мкл фермента и измеряли на спектрофотометре xMark (BioRad, США) оптическую плотность опытной пробы против контрольной при длине волны излучения λ=410 нм [Лещинская с соавт., 1997]. Активность протеиназ (субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы) рассчитывали по формуле: где ПА – активность, мкМ/мин на 1 мл ферментного раствора; D – поглощение раствора при длине волны излучения λ=410 нм; Р = 1000 (расчет на 1 мл раствора фермента); К = 0,37 – коэффициент, учитывающий молярную экстинкцию субстрата; В – объем пробы фермента в реакционной смеси; Т – время инкубации, мин; За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. 2.7 Определение концентрации белка Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорда [Bradford, 1976] и прямым измерением на спектрофотометре при длине волны излучения λ=280. 31 Для измерения концентрации белка по методу Брэдфорда смесь состояла из 5 мкл исследуемого раствора белка, 15 мкл MQ воды и 200 мкл реагента Брэдфорда (10 мг Кумасси (Coomassie Brilliant Blue G-250), растворяли в 5 мл 95% этанола, 10 мл 85% ортофосфорной кислоты и доводили объем до 100 мл MQ водой). Строили калибровочную кривую по БСА. Выбранные концентрации БСА - 1, 2.5, 4, 6, 9, 15 мг/мл. Измерение проводили на спектрофотометре xMark (BioRad, США) при длине волны излучения λ=595 нм. 2.8 Ионообменная хроматография Для ионообменной хроматографии глутамилэндопептидазы использовали КМ-целлюлозу фирмы «Reanal». 100 мл культуральной жидкости штамма B. subtilis MRB049 освобождали от клеток центрифугированием (при 10000×g в течение 10 мин). В супернатанте доводили до рН 6.3 и разводили его водой в 10 раз. Полученный раствор объединяли с сорбентом - КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0.02 М Na-ацетатным буфером, рН 6.3. Полученный раствор перемешивали в течение 15-20 мин. Далее сорбент отстаивали, надосадочную жидкость декантировали. КМ-целлюлозу помещали в колонку (1.5×25 см) и после промывки 0.02 М Na-ацетатным буфером элюировали фермент 0.3 М Naацетатным буфером, рН 6.3. В полученных фракциях определяли специфическую активность по гидролизу субстрата Z-Glu-pNa и белок при длине волны излучения λ=280. Фракции с наибольшей активностью объединяли и концентрировали на концентраторах Amicom Ultra 3K «Диа-М». После диализа против буфера 0.02 М МЕС, полученный раствор фермента наносили на колонку UnoS FPLC («BioRad»), уравновешенную 0.02 М МЕС с рН 6.3. Протеиназу элюировали градиентом 0–1 М NaCl в том же буфере со скоростью 3 мл/мин. Во фракциях определяли протеиназную специфического субстрата Z-Glu-pNa. 32 активность по гидролизу 2.9 Белковый электрофорез Степень хроматографии чистоты и белковых определение препаратов после ионообменной молекулярной массы анализировали электрофоретически. Электрофорез проводили в 12% ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли [Laemmli, 1970]. Концентрация акриламида в геле составляла 12%, бисакриламида – 0,1%. Электродный буфер содержал 20,6 мМ трис-HCl и 0.24 М глицина, рН 8.3. Пробы готовили следующим образом: к раствору белка добавляли краситель (10х буфер для внесения (состав на 1 мл: ксилен-цианол - 5.0 мг, бромфеноловый синий – 5 мг, SDS – 250 мкл, ЭДТА pH 8.0 – 0.2 мл, глицерол – 0.5 мл, вода MQ – 0.25 мл) и выдерживали 15 мин при +95°С. На электрофоретическую дорожку наносили образец белка в концентрации 10-15 мкг. Электрофорез проводили в следующем режиме: первые 20 мин сила тока составляла 20 мА/гель, далее силу тока увеличили до 40 мА/гель. Фиксировали гель в растворе, содержащем 20% изопропанола и 10% уксусной кислоты в течение часа. Затем гель окрашивали раствором Кумасси (0.2% Кумасси «Serva», 45% метанола или этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 4 ч, после чего отмывали гель в 10% уксусной кислоте. 2.10 Математическая обработка результатов Обработку результатов активности осуществляли с использованием программы Microsoft Office Excel. Оценка сигнальных пептидов проводилась с использованием онлайн программы PrediSi (http://www.predisi.de/). Эксперимент по определению протеолитической активности проводили в двух биологических и в двух аналитических повторах. 33 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 3.1 Подбор сигнальных пептидов и оценка индекса их секреции с использованием онлайн программы PrediSi Впервые, для продукции сериновых протеиназ (AprBp и GseBp B. pumilus 3-19) нами использована LIKE-система экспрессии. Данная система основана на индуцируемом антибиотиками промоторе PliaI и работает в клетках бацилл [Тойменцева, 2012]. Для получения ферментов в культуральной жидкости (внеклеточных ферментов) были подобраны сигнальные пептиды для оптимизации LIKE-системы экспрессии. Анализ литературы позволил выбрать сигнальные пептиды SPPac и SPYngk, эффективность которых была показана в работе [Stammen et al., 2010]. Так, применение сигнальных пептидов SPPac, SPYngk в сочетании с мультикопийным вектором pSSBm способствовало повышенному выходу модельных белков (GFP и Tfh) в среду культивирования. Эффективность секреции увеличивалась 6-ти кратно. Поскольку протеиназы AprBp и GseBp являются секретоными ферментами, их собственные сигнальные пептиды (SPaprBp, SPgseBp) также были взяты для оптимизации секреторных свойств LIKE-системы экспрессии. Для начала, проводили оценку эффективности сигнальных пептидов в онлайн программе PrediSi (http://www.predisi.de/). Значение, вычисляемое на сервере PrediSi, свидетельствует о том, может ли отдельная аминокислотная последовательность функционировать в качестве сигнального пептида. Если значение (D-score/индекс секреции) составляет 0.8-1.0 – считают, что соответствующая последовательность представляет собой сигнальный пептид. Если значение составляет 0.5-0.7 – говорят о вероятной функции аминокислотной последовательности в качестве сигнального пептида. И, если значение ниже 0.5 – такие последовательности программа не классифицирует как сигнальные пептиды. Результат анализа эффективности собственных сигнальных пептидов сериновых протеиназ B. pumilus 3-19 – SPaprBp, SPgseBp и рекомбиантных сигнальных пептидов SPPac и 34 SPYngk представлен в Таблице 3. Тем не менее, многие авторы заключают, что in silico анализ эффективности сигнальных пептидов не гарантирует увеличения секреции отдельного целевого белка. Таблица 3 - Результат анализа эффективности сигнальных пептидов в онлайн программе PrediSi Сигнальные пептиды B. pumilus 3-19 Название сигнального пептида D-score/индекс секреции SPaprBp 0.67 SPgseBp 0.7 Сигнальные пептиды B. megaterium SPPac 0.7 SPYngk 0.99 Проведенный анализ эффективности сигнальных пептидов в онлайн программе PrediSi показал, что сигнальный пептид SPYngk имеет самый высокий индекс секреции (0.99). Таким образом, сигнальный пептид SPYngk B. megaterium in silico в 1.5 раза эффективнее собственных сигнальных пептидов генов протеиназ B. pumilus 3-19 (SPaprBp, SPgseBp). Нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды (SPaprBp, SPgseBp, SPPac, SPYngk) с помощью метода ПЦР и лигирования были клонированы в вектор pLIKE-rep за промотором PliaI. 3.2 Клонирование генов сериновых протеиназ в оптимизированную LIKE-систему экспрессии Для того, чтобы сравнить эффективность рекомбинантных пептидов B. megaterium (SPPac, SPYngk) и собственных сигнальных пептидов генов протеиназ B. pumilus 3-19 (SPaprBp, SPgseBp), гены протеиназ aprBp и gseBp клонировали в LIKE-систему экспрессии, с разными сигнальными пептидами. Для этого методом ПЦР были амплифицированы гены протеиназ. ПЦР продукты и плазмиды (pLIKE-rep, pNC 3801, pNC 3803) обрабатывали рестриктазами SalІ, HindІІІ и проводили лигирование (плазмида+ампликон). 35 Лигазной смесью трансформировали клетки бактерий E. сoli DH5α. Полученные плазмиды pTN049, pTN050, pTN 093, pTN 094 (таблица 2) секвенировали и трансформировали в беспротеазный штамм B. subtilis BG2036. Колонии выросшие на питательной среде с антибиотиком эритромицином далее тестировали на молочном агаре. Таким образом, гены сериновых протеиназ aprBp и gseBp B. pumilus 319 были эффективно клонированы в оптимизированную LIKE-систему экспрессии. Секвенирование показало отсутствие сдвигов рамок считывания, мутаций. В результате трансформации в беспротеиназный штамм BG2036 получены штаммы: MRB044, MRB045, MRB046, MRB047, MRB048, MRB049 (таблица 2). 3.3 Оценка протеолитической активности протеиназ в составе оптимизированной LIKE-системы экспрессии Для определения экспрессии генов aprBp и gseBp под контролем промотора PliaI (в составе LIKE-системы) и сигнальных пептидов проверяли протеолитическую активность полученных рекомбинантных штаммов на среде, содержащей 1% молоко и индуктор (антибиотик). В качестве индукторов использовали следующие антибиотики: низин в концентрациях 5 и 20 мг/мл, ванкомицин в концентрациях 0.5 и 5 мкг/мл, бацитрацин в концентрациях 10, 20, 30 и 50 мг/мл. Среди перечисленных антибиотиков бацитрацин является самым эффективным индуктором промотора PliaI [Masher et al., 2004]. Протеолитическую активность рекомбинантных штаммов определяли по появлению области просветления на молочном агаре (зоны расщепления белков молока). Зоны гидролиза рекомбинантных штаммов, содержащих гены протеиназ и сигнальные пептиды B. megaterium сравнивали с зонами гидролиза штаммов В. subtilis BG2036 (отрицательный контроль), B. pumilus 3-19 (положительный контроль), B. subtilis pCS9 (положительный контроль протеиназы AprBp) и (положительный контроль протеиназы GseBp). Нами B. subtilis ∆58.21 показано, что добавление антибиотика ванкомицина не приводит к повышению продукции 36 протеиназ AprBp и GseBp. Более того, ванкомицин уже в минимальной концентрации 0.5 мкг/мл ингибирует рост рекомбинантных штаммов. Напротив, антибиотики низин и бацитрацин в концентрациях 10 мг/мл, 30 мг/мл и 50 мг/мл обладают индуцирующим эффектом (рисунок 3). Рисунок 3 - Оценка протеолитической активности бациллярных штаммов на чашках с молочным агаром Из рисунка 3 видно, что бацитрацин часчино оказывает индуцирующее действие на LIKE-систему протеолитическая активность экспрессии. Нами установлено, субтилизиноподобной протеиназы что не отличалась в конструкциях с рекомбинантными сигнальными пептидами B. megaterium (SPPac, SPYngk) и с собственными сигнальными пептидами (рисунок 3). Зона гидролиза штамма MRB049, содержащего глутамилэндопептидазу и рекомбинантный сигнальный пептид SPYngk, была в 2 раза больше (10 мм) при концентрации бацитрацина - 50 мг/мл по сравнению с зоной гидролиза штамма, выращенного без антибиотика. Таким образом, проведенный скрининг сигнальных пептидов и их in silico анализ позволили нам определить наиболее эффективную последовательность сигнального пептида - SPYngk, которая может повысить 37 уровень секреции белков-мишеней [Degering et al., 2010]. Нами показано, что сигнальный пептид влияет SPYngk глутамилэндопептидазы в клетках на эффективность штамма секреции обнаружено MRB049: качественное увеличение протеолитической активности. 3.4 Очистка сериновой протеиназы в составе оптимизированной LIKE-системы экспрессии Проводили очистку глутамилэндопептидазы в составе оптимизированной (сигнальным пептидом SPYngk) LIKE-системы экспрессии. Протеиназу GseBp выделяли из 100 мл культуральной жидкости рекомбинантного штамма MRB049 на 24 ч культвирования бактерий, выращенных без добавления индуктора и в присутствии антибиотика бацитрацина в концентрации 50 мг/мл. В таблице 4 представлены результаты очистки фермента GseBp. Выделение фермента из освобожденной от клеток культуральной жидкости проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ–целлюлозе. Это позволило за одну стадию очистки получить глутамилэндопептидазу со степенью очистки в 25 раз с выходом 11% при выращивании клеток без индуктора. В присутствии бацитрацина степень очистки фермента составила 60, а выход белка 23%. Последующую очистку препаратов проводили на колонке Uno S в системе FPLCхроматографии. Глутамилэндопептидаза получена со степенью очистки 52 и выходом 6% - без индуктора; со степенью очистки 205 и выходом 13%. Таким образом, при добавлении индуктора в среду культивирования выход фермента увеличился в два раза. Чистота очищенных ферментов была исследована с помощью ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях. На рисунке 6 показаны результаты белкового электрофореза. Таблица 4 - Очистка глутамилэндопептидазы B. pumilus 3-19, секретируемой рекомбинантным штаммом MRB049 бацитрацина, без его добавления 38 в присутствии антибиотика Стадии V, мл очистки Белок Активность общ., общ., сф.ед. ед. акт. Уд. Степень Выход, акт. очистки % Культуральная жидкость Без индуктора 200 3240 2200 0.67 1 100 С индуктором 200 16500 10000 0.6 1 100 Хроматография на КМ - целлюлозе Без индуктора 64 14.1 235 16.6 25 11 С индуктором 64 65 2345 36 60 23 Хроматография на колонке Uno S Без индуктора 22.5 3.46 121 35 52 6 С индуктором 24 10 1295 129.5 205 13 0,25 90 А280 80 70 60 А280 0,15 50 0,1 40 30 0,05 Активность, мкМ/мл4 0,2 100 Акт., мкМ/мл 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Номер фракции Рисунок 4 - Хроматография глутамилэндопептидазы B. pumilus 3-19, секретируемой рекомбинантным штаммом MRB049 без индуктора 39 0,25 100 90 80 70 60 А280 0,15 50 0,1 40 30 0,05 Активностьб мкМ/мл 0,2 20 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Номер фракции Рисунок 5 - Хроматография глутамилэндопептидазы B. pumilus 3-19, секретируемой рекомбинантным штаммом MRB049 в присутствии индуктора - бацитрацина (50 мг/мл) Рисунок 6 - Электрофорез в денатурирующих условиях высокоочищенного препарата глутамилэндопептидазы B. pumilus 3-19. 1- высокоочищенный белок GseBp (получен без индуктора); 2 - высокоочищенный белок GseBp (получен в присутствии индуктора); М – маркер (Кат. номер 26632 «Thermo scientific») Таким образом, методом двухстадийной очистки фермента GseBp на КМ-целлюлозе и высокоскоростной жидкостной хроматографии, получены хроматографически высокоочищенные препараты протеиназы. 40 ВЫВОДЫ 1) Подобраны сигнальные пептиды и установлены индексы их секреции. Индекс секреции собственных сигнальных пептидов протеиназ AprBp и GseBp составил 0.7 и 0.67, соответственно. Индекс секреции рекомбинантных сигнальных пептидов B. megaterium составил: 0.99 (SPYngk), и 0.7 (SPPac). 2) Получили оптимизированную LIKE-систему экспрессии, содержащую гены сериновых протеиназ под контролем эффективных гетерологичных сигнальных пептидов. 3) Протеолитическая активность протеиназы GseBp в 2 раза увеличилась под контролем гетерологичного рекомбинантного сигнального пептида гена гликозид гидролазы и концентрации бацитрацина - 50 мг/мл. 4) Провели штаммов очистку на глутамилэндопептидазы основе LIKE-системы из рекомбинантных экспрессии. Индукция антибиотиком позволила увеличить выход фермента в 2.5 раза. 41 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1) Балабан, Н.П. Секретируемая сериновая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius 3-19 [Текст] / Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова, Е.Л. Ицкович, И.Б. Лещинская, Г.Н. Руденская // Биохимия. – 1994. – Т.52. – С.1093-1099. 2) Балабан, Н.П. Сериновые протеиназы: характеристика и применение [Текст] / Н.П. Балабан; Изд. Казан. гос. ун-та, 2008. – 140 с. 3) Марданова, А.М. Внеклеточные протеиназы бактерий: классификация, методы выделения и применение [Текст] / А.М. Марданова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова. – Казань.: Учебное пособие, 2012. – 92 с. 4) Гришин, О.В. Применение тромбовазима для лечения нестабильной стенокардии / О.В. Гришин, Е.И. Верещагин, А.В. Троицкий // [Электронный ресурс]. / 2004. – Режим доступа: http:www.infarctu.net/catalog/articles/148 – Дата доступа: 15.05.2015. 5) Замолодчикова, Т.С. Граспазы – особая группа протеиназ семейства химотрипсинов, утративших дисульфидную связь в активном центре [Текст] / Т.С. Замолодчикова, Е.А. Соколова, Е.В. Смирнова // Биохимия. – 2003. – Т.68, №3. – С.375-383. 6) Крешков, А.П. Основы аналитической химии [Текст] / А.П. Крешков; Акад. наук СССР. – М.: Химия, 1970. – 472 с. 7) Лещинская, И.Б. Глутаминовая эндопептидаза Bacillus intermedius штамма 3-19. Очистка, свойства и кристаллизация [Текст] / И.Б. Лещинская, Е.В. Шакиров, Е.Л. Ицкович, Н.П. Балабан, А.М. Марданова, М.Р. Шарипова, Е.В. Благова, В.М. Левдеков, И.П. Куранова, Г.Н. Руденская, В.М. Степанов // Биохимия. – 1997. – Т.62. – С.1052-1059. 8) Люблинская, Л.А. p-Нитроанилиды пироглутамилпептидов – хромогенные субстраты сериновых пртеинназ [Текст] / Л.А. Люблинская, И. Хайду, Г.Н. Баландина // Биоорган. Химия. – 1987. – Т.13(6). – С. 748-753. 9) Сова, В.В. Выделение и очистка белков [Текст] / В.В. Сова, М.И. Кусайкин. – Владивосток: Специальная литература, 2006. – 42 с. 42 10) Тойменцева, А.А. Расшифровка механизмов регуляции генов сериновых протеиназ бацилл [Текст] : дис. канд. биол. наук 03.02.03. Защищена 27.12.12 / А.А. Тойменцева; Казан. гос. ун-т. – Казань, 2012. – 145 л. 11) Шамсутдинов, Т.Р. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста [Текст] : дис. канд. биол. наук 03.00.07. Защищена 12.04.12 / Т.Р. Шамсутдинов; Казан. гос. ун-т. – Казань, 2009. – 128 л. 12) Afifah, D.N. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Bacillus pumilus 2.g isolated from gembus, an indonesian fermented food [Text] / D.N. Afifah, M. Sulchan, D. Syah, M.T. Suhartono, J.H. Kim // Prev. Nutr. Food Sci. – 2014. – V.19. – P. 213-219. 13) Anagnostopolous, C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis [Text] / C. Anagostopolous, J. Spizizen // Journal of Bacteriology. - 1961. – V.81. – P.741 – 746. 14) Asha, B.M. Isolation and characterization of a novel thermostable βglucosidase from Bacillus subtilis SU40 [Text] / B.M. Asha, J. Pathma, N. Sakthivel // Prikl Biokhim Mikrobiol. – 2015. – V.51. – P. 249-260. 15) Asker, M.S. Purification and characterization of two thermostable protease fractions from Bacillus megaterium [Text] / M.S. Asker, G. Manal, S. Aziz, C.L. Murray, J.C. Rabinjwitz // Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. – 2013. – V.11. – P. 103–109. 16) Bongers, R.S. Development and characterization of a subtilinregulated expression system in B. subtilis: strict control of gene expression by addition of subtilin [Text] / R.S. Bongers, J.W. Veening, M. Van Wieringen, O.P. Kuipers, M. Kleerebezem // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - V.71. - No.12. - P. 8818-8824. 17) Bott, R. Structural changes leading to increased enzymatic activity in an engineered variant of Bacillus lentus subtilisin [Text] / R. Bott, J. Dauberman, 43 L. Wilson, G. Ganshaw, H. Sagar, T. Gaycar, D. Estell // Adv. Exp. Med. Biol. – 1996. – V.379. – P.277-283. 18) Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [Text] / M.M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – V.72. – P. 248-254. 19) Cheng, G. Purification and biochemical characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Streptomyces sp. P3 [Text] / G. Cheng, L. He, Z. Sun, Z. Cui, Y. Du, Y. Kong // J Microbiol Biotechnol. – 2015. – V.46. P. 459-510. 20) Degering, S. Optimization of protease secretion in Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis by screening of homologous and heterologous signal peptides [Text] / S. Degering, T. Eggert, M. Puls, J. Bongaerts, S. Evers, K. Maurer, K. Jaeger // Appl. and Env. Microbiol. – 2010. – V.35. - P. 6370–6376. 21) Drapeau, G. R. Cleavage at glutamic acid with staphylococcal protease [Text] / G.R. Drapeau // Methods enzymol. – 1977. – V.47. – P. 189 – 191. 22) Efstathiou, I. Cloning of Clostridium acetobutylicum genes and their expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis [Text] / I. Efstathiou, Truffaut N. // Mol Gen Genet. – 1986. – V.205. P. 383-390. 23) Fuangthong, M. OhrR is a repressor of ohrA, a key organic hydroperoxide resistance determinant in Bacillus subtilis [Text] / M. Fuangthong, S. Atichartpongkul, S. Mongkolsuk, J. Helmann // J. Bacteriol. – 2001. – V.183. – P. 4134-4141. 24) Grabarek, J. Sequential activation of caspases and serine proteases (serpases) during apoptosis [Text] / J. Grabarec, L. Du, G. Johnson, B. Lee, D. Phelps, Z. Darzynkiewicz // Cell Cycle. – 2002. V.2. – P. 124-131. 25) Gupta, R. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial application / R. Gupta, Q. Beg, P. Lorenz // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2002. - V.59. – P. 15-32. 44 26) Habibi, N. E. coli over expression DB: a database of recombinant protein overexpression in E. coli [Text] / N. Habibi, M.R. Samian, S.Z. Hashim, A. Norouzi // Protein Expr Purif. – 2014. – V.11. – P. 113-128. 27) Harwood, C.R. Bacillus protein secretion: an unfolding story [Text] / Cranenburgh R // Trends. Microbiol. – 2008. – V.16. – P. 73-79. 28) Heijne, G. Protein targeting signals [Text] / G. Heijne // Curr. Opin. Cell Biol. - 1990. – V.2. – P. 604–608. 29) Ho K.M. Co-expression of a prophage system and a plasmid system in B. subtilis [Text] / K.M. Ho, B.L. Lim // Protein Expr. Purif. - 2003. -V.32. No.2. – P. 293-301. 30) Jorgensen, C.M. Recombinant protein expression in Lactococcus lactis using the P170 expression system [Text] / C.M. Jorgensen, A. Vrang, S.M. Madsen // Bacterial Expression Group. – 2013. – V.12. – P. 149-168. 31) Jungbauer, A. Ion-exchange chromatography [Text] / A. Jungbauer, R. Hahn // Methods Enzymol. – 2009. – V.463. – P. 349-371. 32) Kang, Z. Molecular engineering of secretory machinery components for high‑level secretion of proteins in Bacillus species [Text] / Z. Kang, S. Yang, G. Du, J. Chen // J Ind Microbiol Biotechnol. – 2014. V.41. - P. 1599–1607. 33) Karlsson, E. Ion exchange chromatography [Text] / E. Karlsson, I. Hirsh // Methods Biochem Anal. – 2011. – V.54. – P. 93-133. 34) Lee, S.J. Development of a stationary phase-specific autoinducible expression system in Bacillus subtilis [Text] / S.J. Lee, J.G. Pan, S.H. Park, S.K. Choi // J Biotechnol. – 2010. – V.149. – P. 16-20. 35) Lesk, A.M. Conservation and viability in the atructure of serine proteinases of the chymotrypsin family / A.M. Lesk, W.D. Fordman // J. Mol. Biol. – 1996. – V. 258. – P. 501-537. 36) Ma J. Correlations between Shine-Dalgarno sequences and gene features such as predicted expression levels and operon structures [Text] / J. Ma, A. Campbell, S.J. Karlin // Bacteriol. - 2002. - V. 184. - №. 20. - P. 5733-5745. 45 37) McLaughlin, J.R. Plasmid-directed expression of Staphylococcus aureus beta-lactamase by Bacillus subtilis in vitro [Text] / J.R. McLaughlin, C.L. Murray, J.C. Rabinowiyz // J Biol Chem. – 1981. – V.10. – P.11272-11283. 38) Nijland R. Optimization of Protein Secretion by Bacillus subtilis [Text] / R. Nijland, O.P. Kuipers // Recent Patents on Biotechnology. – 2008. – V.2. – P. 79-87. 39) Ogata, F. Purification and amino acid sequence of a bitter gourd inhibitor against on acidic amino acid-specific endopeptidase of Streptomyces griseus [Text] / F. Ogata, T. Miyata, N. Fujii et al. // J. Biol. Chem. – 1991. – V. 266. - № 25. – P. 16715 - 16721. 40) Panahi, R. Auto-inducible expression system based on the SigB dependent ohrB promoter in Bacillus subtilis [Text] / R. Panahi, E. Vasheghani – Farahani, S. A. Shojaosadati, B. Bambai // Molecular Biology. – 2014. - V.48. – P. 852–857. 41) Papaneophytou, C. P. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review [Text] / C.P. Papaneophytou, G. Kontopidis // Protein Expression and Purification. – 2014. – V.94. P. 22–32. 42) Puri, S. Optimization of alkaline protease production from Bacillus sp. using response surface methodology / S. Puri, Q.K. Beg, R. Gupta // Curr. microbial. – 2002. - V.44. – P. 286-290. 43) Rawlings, N. D. Evolutionary families of peptidases [Text] / N.D. Rawlings, A. J. Barrett // J. Biochem. – 1993. – V. 290. – P. 205-218. 44) Sambrook J. Molecular Cloning - a laboratory manual [Text] / J. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold. - 2001. 45) Sharouny, E.E. Optimization and purification of mannanase produced by an alkaliphilic-thermotolerant Bacillus cereus N1 isolated from Bani Salama Lake in Wadi El-Natron [Text] / E.E. Sharouny, N.M. Toukhy, N.A. Sersy, A.A. Gayar // Biotechnol Biotechnol Equip. – 2015. - V.29. – P. 315-323. 46 46) Simonen, M. Protein secretion in Bacillus species [Text] / M. Simonen, I. Palva // Microbiol. – 1993. V.57. – P. 109– 137. 47) Stammen, S. High-yield intra- and extracellular protein production using Bacillus megaterium [Text] / S. Stammen, B.K. Müller, C. Korneli, R. Biedendieck, M. Gamer, E. Franco-Lara, D. Jahn // Appl. Environ. Microbiol. – 2010. - V.76. – P. 4037-4046. 48) Stennicke, H. R. Characterization of the S1 binding site of the glutamic acid-specific protease from Streptomyces griseus [Text] / H.R. Stennicke, J.J. Birktoft, K. Breddam // Protein Science. – 1996. – V. 78. – P. 2266 - 2275. 49) Shi, B. Purification and partial characterization of a thermostable antimicrobial protein from Bacillus subtilis FB123 [Text] / B. Shi, H. Zheng, J. Huang, X. Luo // World J Microbiol Biotechnol. – 2015. – V.12. – P. 192-205. 50) Tian, F. Purification and characterization of levansucrases from Bacillus amyloliquefaciens in intra- and extracellular forms useful for the synthesis of levan and fructooligosaccharides [Text] / F. Tian, L. Inthanavong, S. Karboune // Molecular Biology. – 2014. - V.48. – P. 852–857. 51) Toymentseva, A.A. The LIKE system, a novel protein expression toolbox for based on the promoter [Text] / A.A. Toymentseva, K. Schrecke, M.R. Sharipova, T. Mascher // Microbal Cell Factories. – 2012. V. 11. – P. 143-156. 52) Vellanoweth, R.L. The influence of ribosome-binding-site elements on translational efficiency in Bacillus subtilis and Escherichia coli in vivo [Text] / R.L. Vellanoweth, J.C. Rabinowitz // Mol. Microbiol. – 1992. –V. 6. – No. 9. –P. 1105-1114. 53) Volker U. One of two OsmC homologs in Bacillus subtilis is part of the SigBdependent general stress regulon [Text] / U. Volker, K.K. Andersen, H. Antelmann, K.M. Devine, M. Hecker // J. Bacteriol. – 1998. – V.180. – P. 4212– 4218. 54) Westers, L. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism [Text] / L. 47 Westers, H. Westers, W.J. Quax // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. –V. 1694. – No. 1-3. – P. 299-310. 55) Wyre, C. Use of a stress-minimisation paradigm in high cell density fed-batch Escherichia coli fermentations to optimise recombinant protein production [Text] / C. Wyre, T.W. Overton // J Ind Microbiol Biotechnol. – 2014. – V.41. – P. 1391-1404. 56) Wu C.M. Construction and characterization of nisin-controlled expression vectors for use in Lactobacillus reuteri [Text] / C.M .Wu, C.F. Lin, Y.C. Chang, T.C. Chung // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2006. - V. 70. - No. 4. P. 757-767. 57) Yang, J.K. Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes [Text] / J.K. Yang, I.L. Shihb, Y.M. Tzengc, S.L. Wang // Enzyme and Microbial Technology. – 2000. V.26. – P. 406–413. 48 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1) 1)Получение рекомбинантных протеаз Bacillus pumilus, расщепляющих β-амилоидный пептид, [Текст] / А.А. Тойменцева, Ю.В. Данилова, А.О. Тихонова, М.Р. Шарипова // Спецвыпуск жунала «Биоорганическая химия», 2015. 2) Новая система продукции рекомбинантных белков как основа для получения фармацевтических препаратов, [Тезисы докладов] / А.А. Тойменцева., А.О. Тихонова, М.Р. Шарипова // 6-я республиканская конференция «Молодежь и инновации Татарстана», 13-14 ноября 2014 – с.89 – 93. 3) Тестирование различных сигнальных пептидов для эффективной гетерологичной секреции бациллярных протеиназ, [Тезисы докладов] / Тихонова А.О., Тойменцева А.А., Шарипова М.Р // Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2014» 7-11 апреля 2014. 4) Скрининг сигнальных пептидов для эффективной гетерологичной секреции бациллярных протеиназ, [Тезисы докладов] / Тихонова А.О., Тойменцева А.А., Шарипова М.Р // Сборник материалов «Вестник Казанского университета - 2014». 5) Создание суперпродуцента бациллярных протеиназ на основе LIKEсистемы экспрессии, [Тезисы докладов] / Тихонова А.О., Тойменцева А.А., Шарипова М.Р // IV Международная научно-практическая конференция «Постеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицины» 29.10-1.11.2014. 6) Поиск оптимального сигнального пептида для гетерологичной секреции бациллярных протеиназ, [Тезисы доклада] / Тихонова А.О, Нямсурэн Ч., Тойменцева А.А // XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2013». 49 7) Подбор сигнальных пептидов для эффективной гетерологичной секреции бациллярных протеиназ, [Тезисы докладов] / Тихонова А.О., Тойменцева А.А., Шарипова М.Р // Площадка открытых коммуникаций «Openbio 2014», Наукоград Кольцово, 7-8 октября, Новосибирск. 8) 7.Повышение экспрессии гена бактериальной протеиназы путем модификации его промотора, [Тезисы докладов] / Черемин А.М., Тихонова А.О., Шарипова М.Р // IV Международная научнопрактическая конференция «Постеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицины» 29.10-1.11.2014. 9) Скрининг сигнальных пептидов для эффективной гетерологичной секреции бациллярных протеиназ, [Тезисы докладов] / Тихонова А.О., Тойменцева А.А., Шарипова М.Р // Научно-практический журнал «Клинико-лабораторный консилиум №2 (49)» июнь 2014, СПб ГМУ им. Павлова, Санкт-Петербург, с.44-45. 10) Создание высокоэффективных продуцентов сериновых протеиназ бацилл на основе LIKE-системы экспрессии, [Тезисы докладов] / Тихонова А.О., Тойменцева А.А., Шарипова М.Р // Всероссийская школа-конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Материалы и технологии XXI века", Казань, 11-12 декабря 2014 год. 11) Особенности регуляции генной экспрессии гидролитических ферментов бацилл, [статья] / Митрофанова О. С., Дудкина Е.В., Тихонова А. О., Гилязева А. Г., Тойменцева А. А., Шарипова М. Р. // Журнал «Грани науки», Казань, 2014 50
