Свойства митохондриальной NADH:убихинон оксидоредуктазы

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
им. М.В. ЛОМОНОСОВА
Биологический факультет
на правах рукописи
КАЛАШНИКОВ Денис Сергеевич
СВОЙСТВА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ
NADH:УБИХИНОН ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (КОМПЛЕКСА I)
В СОСТАВЕ МЕМБРАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МОЗГА
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2011
Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического
факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Виноградов Андрей Дмитриевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Звягильская Рената Александровна
кандидат биологических наук,
Берцова Юлия Васильевна
Ведущая организация:
Научный центр неврологии РАМН
Защита диссертации состоится 23 мая 2011 года в 15 часов 30 минут на
заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Мо сковском
государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991,
Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет
имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, большая биологическая
аудитория (ББА).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета
Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан «___» ____________2011 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Медведева М.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Конечный этап запасания энергии при
окислительном распаде питательных веществ в клетках млекопитающих
происходит в митохондриях, где уровень NAD+, необходимый для поддержания
о к и с л и т е л ь н о го м е т а б ол и зм а , о бе с п еч и ва е т с я N A D H : уб и х и н о н
оксидоредуктазой (дыхательным комплексом I). Митохондриальный комплекс I
и л и е го гом ол о г и п р о ка р и от ( N D H - 1 ) кат а л и з и ру ют о к и с л е н и е
митохондриального или цитоплазматиче ского NADH убихиноном,
сопровождающееся векторным переносом протонов через сопрягающую
мембрану. Комплекс I митохондрий сердца крупного рогатого скота построен
из 45 различных субъединиц и содержит, по меньшей мере, 9 индивидуальных
редокс-кофакторов. Бактериальные опероны, кодирующие NDH-1, содержат
только 13-14 генов, и продукты их транскрипции гомологичны 14 «главным»
субъединицам митохондриального комплекса I. Поскольку каталитические
свойства митохондриального фермента и его прокариотических гомологов почти
одинаковы, можно считать, что только 14 из 45 субъединиц фермента
млекопитающих необходимы для катализа. Функции остальных, более чем
30 дополнительных субъединиц остаются неизвестными. Подавляющее
большинство сведений о каталитических и регуляторных свойствах комплекса I
млекопитающих получено при изучении очищенного фермента или различных
препаратов митохондрий сердца крупного рогатого скота. В последние годы в
литературе широко обсуждаются корреляции между возникновением и
развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний (болезни Паркинсона,
Альцгеймера, ретинопатии) и дефектами функционирования комплекса I.
В обсуждениях используются данные о свойствах фермента или ферментных
Список сокращений: ∆µH+ − трансмембранный электрохимический градиент протонов,
∆ψ − разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней митохондриальной
мембраны, FCCP − п-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон, FMN –
флавинмононуклеотид, HAR – гексааминорутений (III) хлорид, Q1 − водорастворимый
гомолог природного убихинона, содержащий 1 изопреноидный остаток в положении 5 1,4бензохинонового кольца, БСА − бычий сывороточный альбумин, ДТТ − 1,4-дитиотреитол,
ДТНБ − 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота), СМЧ − субмитохондриальные частицы,
М-СМЧ − субмитохондриальные частицы мозга, МТ-СМЧ − субмитохондриальные частицы
мозга, полученные из «тяжелых» митохондрий, МО-СМЧ − субмитохондриальные частицы
мозга, полученные из суммарной фракции митохондрий, С-СМЧ − субмитохондриальные
частицы сердца, СОД − супероксид-дисмутаза.
3
препаратов (митохондрии, субмитохондриальные фрагменты) сердечной мышцы.
Неизвестно, существует ли тканевая или видовая специфичность комплекса I
млекопитающих, отражающаяся в его каталитических или регуляторных
свойствах. В нашей лаборатории показано существование двух медленно
в з а и м о п р е в р а щ а ю щ и хс я ф о р м ко м п л е кс а I : а к т и в н о й ( A ) и
деактивированной (D). Активация комплекса I требует затравочного медленного
каталитического цикла. Активная форма деактивируется (A→D переход) в
условиях, когда каталитические обороты фермента невозможны (нет субстрата –
NADH или нет акцептора – окисленного убихинона) и этот переход имеет такой
высокий активационный барьер, что его наблюдение в минутной шкале
возможно только при температуре >30°С. Такое поведение фермента, повидимому, обеспечивает регулирование суммарной скорости окислительного
фосфорилирования в митохондриях. Показано, что переход от нормоксии к
аноксии интактного изолированного сердца сопровождается синхронным
переходом комплекса I из его активного состояния в деактивированное. Таким
образом, явление, обнаруженное и проанализированное на простых объектах,
удалось проследить в ряду: изолированный фермент – фермент в составе
м е м б р а н ы – ф е рм е н т в и н т а кт н ы х м и тохо н д р и я х – ф е рм е н т в
функционирующем органе. Если переход комплекса I из активного состояния в
деактивированное имеет отношение к регулированию его каталитической
активности, то разумно предположить, что в матриксе митохондрий
присутствуют вещества-регуляторы, влияющие на скорости перехода и
положение равновесия между активной и деактивированной формами фермента.
Свободные жирные кислоты претендуют на роль одного из таких регуляторов. В
нашей лаборатории, недавно было показано, что пальмитиновая кислота снижает
скорость активации деактивированной формы фермента сердца, в
концентрациях, существенно более низких, чем те, которые необходимы для
ингибирования его активности.
Цель работы. Получить препараты митохондрий мозга, пригодные для
изучения каталитических и регуляторных свойств митохондриальной
NADH:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) мозга и сравнить их со
свойствами аналогичных препаратов сердца.
4
Для достижения этой цели требовалось решить следующие задачи:
1. Наладить метод, пригодный для получения митохондрий мозга в
препаративных количествах; 2. Получить и охарактеризовать препарат
«вывернутых» сопряженных субмитохондриальных частиц мозга (М-СМЧ);
3. Охарактеризовать основные свойства комплекса I мозга по сравнению с
известными для фермента сердца; 4. Оценить влияние свободных жирных
кислот и двухвалентных катионов на каталитические характеристики
комплекса I мозга.
Научная новизна и практическое значение работы. Разработана
процедура получения сопряженных инвертированных («inside-out»)
субмитохондриальных частиц мозга и охарактеризованы свойства комплекса I
в составе такого препарата. Показано, что свойства комплекса I митохондрий
мозга, в частности, параметры активации-деактивации, практически не
отличаются от таковых препарата сердечной мышцы. Показано, что
совместное действие Ca 2+ и свободных жирных кислот приводит к
развивающемуся во времени ингибированию каталитической активности
комплекса I в составе М-СМЧ, в условиях (высокие значения pH), которые
могут, по-видимому, реализоваться в функционирующих митохондриях.
Полученный препарат инвертированных субмитохондриальных частиц мозга
может служить в качестве экспериментальной модели, пригодной для изучения
дефектов комплекса I, связанных с различными патологическими состояниями
(ишемическое повреждение, нейродегенеративные заболевания).
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании
кафедры биохимии биологического факультета МГУ, 16-ой Европейской
Конференции по Биоэнергетике (The 16th European Bioenergetics Conference,
Warsaw, 2010), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов
и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), 14-ой Международной
Пущинской школе-конференции «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ,
включая 2 статьи и 3 тезисов научных докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах,
содежит 23 рисунка и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их
обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
5
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Митохондрии мозга получали спо собом, описанным
Ли и сотр. [Lee et al., 1993], с модификациями, обусловленными использованием
большого количества ткани. Принцип метода состоит в том, что измельченную
ткань обрабатывают протеазой (субтилизином А), затем гомогенизируют.
Обработка протеазой позволяет существенно увеличить выход митохондрий.
Гомогенат фильтруют и центрифугируют. Полученный осадок отбрасывают, а из
супенат ант а цент рифугированием о с аждают митохонрии.
Промывка полученного препарата средой, содержащей 0,25 М сахарозу и 10 мМ
Tрис-HCl (pH 7,8) позволяет разделить полученные митохондрии на две равные
фракции. Нижний слой полученного в результате промывки осадка – «тяжелые»
митохондрии – плотный и более темный, а верхний слой – «легкие»
митохондрии – более светлый и рыхлый. «Легкие» и «тяжелые» митохондрии
суспенировали отдельно, замораживали и хранили при температуре –20°С.
В некоторых опытах СМЧ (см. ниже) получали из общей фракции митохондрий
(без деления на «легкие» и «тяжелые»).
М-СМЧ получали способом, принятым в нашей лаборатории для
препаратов из сердца быка [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Принцип метода
заключается в обработке суспензии митохондрий ультразвуком, что приводит к
образованию замкнутых инвертированных (inside-out) мембранных фрагментов.
Полученный препарат хранили в жидком азоте.
Активацию и сопряжение М-СМЧ проводили способом, принятым в нашей
лаборатории [Burbaev et al., 1989]. К суспензии добавляли малонат, конечная
концентрация 1 мМ (для активации сукцинатдегидрогеназы вытеснением прочно
связного оксалоацетата [Kotlyar and Vinogradov, 1984]) и олигомицин 0,5 мкг/мг
белка (искусственное сопряжение блокированием протонных каналов
FO·F1–АТPазы [Lee and Ernster, 1966]). Суспензию инкубировали 30 мин при 30°С
при хорошем перемешивании и разводили стандартной средой до конечной
концентрации 0,5 мг/мл. К суспензии добавляли NADPH (1 мМ), инкубировали 1 ч
при 25°С при постоянном перемешивании (для активации комплекса I
[Burbaev et al., 1989]) и центрифугировали при 26 тыс. g (1 ч, 4°С). Осадки
суспендировали в небольшом объеме 0,25 М сахарозы, содержащем
0,1 мМ малонат, разливали в ампулы и хранили в жидком азоте.
6
Деактивированные М-СМЧ получали прогреванием суспензии активных М-СМЧ
15–20 мин при 30°С.
Получение «препарата белков митохондриального матрикса». Суспензию
митохондрий мозга крысы, полученных описанным выше способом, оттаивали,
разводили холодной водой до концентрации 15 мг/мл и добавляли K+-ЭДТА до
конечной концентрации 1 мМ. Суспензию насыщали аргоном, доводили pH
0,05 М раствором NH4OH до 8,6 и озвучивали 5 раз по 30 сек с перерывами в
1 мин. Суспензию центрифугировали при 26 тыс. g 15 мин. Осадок отбрасывали,
а супернатант центрифугировали при 200 тыс. g (1 час, 6°С). К полученному
супернатанту приливали 1⁄10 часть от его объема 100 мМ Трис-HCl (pH 7,5)
доводили pH до 6,0 уксусной кислотой и центрифугировали 1 ч 200 тыс. g (0оС).
Измеряли объем полученного супернатанта и вносили концентрированный (1 М)
раствор сахарозы до конечной концентрации 0,25 М и доводили pH полученного
раствора до 7,4 добавлением 1М KOH.
Д л я п о л у ч е н и я п р е п а р ат а м и т охо н д р и й , п р о н и ц а е м ы х д л я
низкомолекулярных соединений [Gostimskaya et al., 2003], суспензию
митохондрий мозга крысы, полученных по описанной выше методике (30 мг/
мл), разбавляли (в 20 раз) средой, содержавшей 150 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES,
0,5 мМ ЭГТА (рН 7,4) и БСА (1 мг/мл), добавляли аламетицин и MgCl2 до
конечной концентрации 40 мкг/мл и 2,5 мМ, соответственно. Смесь
инкубировали 5 мин при комнатной температуре, разбавляли в 2,5 раза
охлаждённой средой выделения, не содержащей аламетицина, MgCl2 и БСА и
центрифугировали 15 мин при 30 тыс. g. Осадок суспендировали в минимальном
объеме среды выделения, не содержащей БСА. Суспензию митохондрий хранили
на льду. В ряде опытов аламетицин (20 мкг/мл) и MgCl2 (1 мМ) вносили
непосредственно перед измерением активности.
Поглощение кислорода измеряли амперометрически (закрытый
электрод Кларка) при комнатной температуре. Среда измерения активностей
содержала 0,25 M сахарозу, 10 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ К+-фосфат (pH 7,4)
и субстраты окисления: NADH (1 мМ), при измерении NADH-оксидазной, или
сукцинат (10 мМ), при измерении сукцинат-оксидазной активностей. При
измерении сукцинат-оксидазы СМЧ предварительно преинкубировали в
присутствии 5 мМ сукцината (~5–10 мин), а среда измерения активностей
дополнительно содержала ротенон (5 мкМ).
7
Содержание гема а определяли в солюбилизированных препаратах (5%-ный
дезоксихолат калия (рН 8,5), 30 мин при 25°С). Равные объемы образцов (0,25 мл),
содержащих 10–15 мг белка, добавляли в две кюветы с 0,1 М K+-фосфатным
буфером (рН 7,0). После добавления в одну из кювет дитионита
(гидросульфита Na) и перемешивания регистрировали дифференциальный спектр
«восстановленный образец минус окисленный» в диапазоне 510–630 нм
(спектрофотометр Cintra 20, GBC с интегрирующей сферой). Содержание гема а
рассчитывали, как описано у Ли и сотр. [Lee et al., 1993] (коэффициент молярного
поглощения ε605–630 = 24·103 М−1 см−1).
Количество комплекса I в препарате определяли титрованием NADHоксидазной активности пиерицидином, ротеноном или NADH-OH после
инкубации субмитохондриальных частиц (1 мг/мл) с ингибиторами в течение
15 мин при 25°С.
NADH оксидазную и NADH:акцептор редуктазные активности
СМЧ измеряли фотометрически по убыли NADH (коэффициент молярного
поглощения ε340 = 6,22·103 М−1 см−1 или ε380 = 1,25·103 М−1 см−1) в стандартной
среде при 25°С, содержащей NADH (100 мкМ), грамицидин D (0,2 мкг/мл) и
БСА (2 мг/мл), реакцию начинали внесением СМЧ (20 мкг/мл). NADH:Q1редуктазную активность измеряли в стандартной среде, содержавшей
дополнительно Q1 (80 мкМ) и миксотиазол (5 мкМ). При измерении NADH:HAR
(III) редуктазной активности [Sled and Vinogradov, 1993] стандартная среда
дополнительно содержала HAR, NADH и антимицин А (1 мкг/мл).
Максимальную скорость NADH:HAR редуктазной реакции определяли по
линейным анаморфозам михаэлисовских зависимостей, полученных при
постоянной концентрации HAR (5 мМ) и различных концентрациях NADH или
п р и п о с т о я н н о й ко н ц е н т р а ц и и N A D H ( 1 , 2 м М ) и р а з л и ч н ы х
концентрациях HAR.
Аэробное сукцинат-зависимое восстановление NAD+ (обратный перенос
электронов), осуществляемое за счет работы сукцинат-оксидазы, регистрировали
ф отом е т р и ч е с к и п о у в е л и ч е н и ю п о гл о щ е н и я п р и 3 4 0 н м
(спектрофотометр «Hitachi 557»), используя коэффициент молярного
поглощения ε 340 = 6,22·10 3 М −1 см −1 . Стандартная среда содержала
дополнительно NAD+ (5 мМ) и сукцинат (5 мМ). При измерении аэробного
обратного переноса электронов на феррицианид стандартная среда
8
дополнительно содержала феррицианид (1 мM) и сукцинат (5 мМ). Реакцию
регистрировали по уменьшению оптической плотности при 420 нм
(ε420 = 1,0.103 М−1 см−1), затем добавляли ротенон (5 мкМ). Скорость реакции
рассчитывали как разницу между исходной активностью и активностью в
присутствии ротенона.
Генерацию супероксида измеряли спектрофотометрически в стандартной
среде при 550 нм по чувствительному к СОД (3 ед/мл в среде измерения)
восстановлению 15 мкМ ацетилированного цитохрома с (ε550 = 20·103 М−1 см−1)
[Azzi et al., 1975] при 30°С.
Белок определяли с биуретовым реактивом, используя БСА в качестве
стандарта для построения калибровочной кривой.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
I. Субмитохондриальные фрагменты мозга
На предварительном этапе работы мы опробовали не сколько
о п убл и ко ва н н ы х м е тод о в п ол у ч е н и я м и тохо н д р и й м о з г а к р ы с ы .
Главными критериями при выборе способа получения митохондрий были
относительная простота и быстрота процедуры, позволяющей получить хорошо
сопряженные препараты. Этим критериям лучше всего соответствовала
процедура, описанная Lee и сотр. [Lee et al, 1993] (табл. 1). В дальнейшем мы
пользовались указанным способом получения препаратов из мозга свиньи, не
измеряя характеристик полученных митохондрий.
Таблица 1. Основные свойства митохондрий мозга крысы *
Реакция
Удельная активность
(2-электрон-эквивалента в мин на мг белка) ×106
малат/глутамат-оксидаза
дыхание в состоянии 4
дыхание в состоянии 3
ADP/O
0,005
0,04
2,6
сукцинат-оксидаза
дыхание в состоянии 4
0,015
дыхание в состоянии 3
0,1
+ FCCP**
0,2
ADP/O
1,9
* Приведены результаты типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в
серии аналогичных опытов не привышал ± 20%.
** Оптимальную для стимуляции дыхания концентрацию FCCP (0,32 мкМ) подбирали
предварительно.
9
В табл. 2 приведены каталитические активности М-СМЧ. Для сравнения
приведены также величины активностей, измеренные в нашей лаборатории в тех
же условиях для СМЧ сердца быка и препарата Кейлина-Хартри – классического
объекта изучения дыхательной цепи [Vinogradov and King, 1979]. Максимальные
удельные NADH-оксидазные активности препаратов из мозга и сердца оказались
примерно одинаковыми (0,82 против 1,0 мкмоль/мин на мг белка, для МТ-СМЧ и
С-СМЧ, соответственно) для препаратов, полученных из «тяжелых»
митохондрий мозга и сердца. NADH-оксидазные (функционирование полной
дыхательной цепи) и ротенон-чувствительные NADH:хинон (Q1) редуктазные
(функционирование собственно комплекса I) активности, также оказались
примерно одинаковыми. Это означает, что лимитирующая стадия суммарной
Та бл и ц а 2 . К ат а л и т и ч е с к и е а к т и в н о с т и с у б м и т охо н д р и а л ь н ы х
фрагментов (30°С, рН 8,0)*
Реакции
Удельная активность
(2-электрон-эквивалента в мин на мг белка) ×106
препарат
МО-СМЧ МТ-СМЧ C(Т)-СМЧ**
Кейлина-Хартри***
NADH оксидаза
– олигомицин,
0,63
0,82
+ грамицидин D
+ олигомицин
0,09
0,16
+ аламетицин****
0,66
0,94
Сукцинат оксидаза
– олигомицин,
0,15
0,17
+ грамицидин D
+ олигомицин
0,05
0,05
NADH:акцептор редуктазы
NADH → Q1
0,65
NADH → ГАР
8,0
Обратный перенос электронов
сукцинат → NAD+
не
0,03
сукцинат → феррицианид детектируем
0,03
Генерация О2•
NADH → О2
0,43 ×10 −3
+ ротенон
не
0,65 ×10 −3
сукцинат → О2
определяли 0,53 ×10 −3
+ ротенон
0,25 ×10 −3
*
1,0
0,62
0,94
0,45
1,0
10,0
0,25
0,46 ×10 −3
0,68 ×10 −3
0,48 ×10 −3
0,16 ×10 −3
не
детектируем
не
определяли
Приведены результаты типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в
серии аналогичных опытов не привышали ± 20%.
** Активности, измеренные при 25°С [Kotlyar and Vinogradov, 1990; Grivennikova and Vinogradov, 2006].
*** Измерено в 50 мМ К+-фосфатном буфере (рН 7,8) при 25°С [Vinogradov and King, 1979].
**** Конечная концентрация аламетицина и MgCl2, соответственно 20 мкг/мл и 1 мМ.
10
полностью разобщенной NADH оксидазной реакции – восстановление
свободного убихинона терминальным железо-серным кластером N2 и дыхание
субмитохондриальных фрагментов в присутствии NADH количественно можно
оценивать как каталитическую активность собственно комплекса I. Комплекс I
к ат а л и з и р о в а л о к и с л е н и е N A D H и с к у с с т в е н н ы м а к ц е п т о р о м –
гексааминорутением (III) со скоростью, более чем в десять раз превышающей
NADH-оксидазную реакцию. NADH:гексааминорутений (III)-редуктазная
реакция не чувствительна к ротенону и пиерицидину – специфическим
ингибиторам восстановления убихинона комплексом I. Аламетицин только
незначительно стимулировал NADH оксидазную активность М-СМЧ (табл. 2),
что позволяет считать что ~90% потенциально активного комплекса I доступно
для NADH. Сукцинат оксидазная активность М-СМЧ оказалась существенно
меньше, чем С-СМЧ или препарата Кейлина-Хартри. Нам не удалось измерить
энергозависимое восстановление NAD+ (или феррицианида) сукцинатом
(обратный перенос электронов) в М-СМЧ, полученных из суммарной фракции
митохондрий мозга; препараты, полученные из «тяжелых» митохондрий мозга,
катализировали эту реакцию с удельными активностями существенно (в 10 раз)
меньшими, чем С-СМЧ (табл. 2).
В табл. 3 приведены результаты измерения содержания цитохромоксидазы и
комплекса I в митохондриях и СМЧ, полученных из мозга и сердца. Содержание
цитохромоксидазы в М-СМЧ существенно ниже, чем в С-СМЧ. Это может быть
обусловлено как истинным различием в содержании фермента в препаратах из
сердца и мозга, так и существенно большими примесями других мембран
немитохондриального происхождения в М-СМЧ. Содержание комплекса I в
МТ-СМЧ оценивали по остаточной активности, измеренной после титрования
NADH-ОН [Kotlyar et al., 2005] и двумя другими специфическими ингибиторами
комплекса I: ротеноном и пиерицидином [Grivennikova et al., 2003]. Оно оказалось
примерно вдвое меньшим, чем в препаратах из сердца. Существенное различие
между препаратами из сердца и мозга обнаруживается при сравнении
относительного содержания цитохромоксидазы и комплекса I (табл. 3). Данные о
содержании комплекса I и его каталитических активностях позволяют оценить
(сравнительно) числа оборотов фермента в полностью разобщенной NADH
оксидазной реакции. Такая оценка дает величины 250 с –1 и 140 с –1 (30°С, рН 8,0)
для комплекса I в мембранах СМЧ мозга и сердца, соответственно. Это различие
11
указывает либо на существование тканеспецифичных изоформ комплекса I, либо,
что более вероятно, на различия в фосфолипидном составе внутренней мембраны
митохондрий мозга и сердца; известно, что каталитическая активность комплекса I
зависит от фосфолипидов [Heron et al., 1977].
Таблица 3. Содержание компонентов дыхательной цепи в митохондриях
и субмитохондриальных фрагментах различных животных
Объект, орган, препарат
комплекс I*
гем a, нмоль/мг белка
гем a /
(титр
ингибитора,
3
−1
−1
(ΔA605–630, ε = 24·10 М см )
комплекс I
нмоль/мг белка)
Свинья
мозг
митохондрии
«суммарная фракция»
0,15
«легкие»
0,10
«тяжелые»
0,19
М-СМЧ
МО-СМЧ
0,17
МТ-СМЧ
0,22
0,06
~3,7
0,64
0,65
0,12
~5,4
Крупный рогатый скот
сердце
митохондрии
«тяжелые»
С (Т)-СМЧ
* Приведены результаты типичных экспериментов. Величины титров для ротенона,
пиерицидина [Grivennikova et al., 2003] и NADH-OH [Kotlyar et al., 2005; Grivennikova et al., 2007]
совпадают с точностью ± 20%.
II. Медленные обратимые изменения каталитической активности
комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга
Как было отмечено в разделе «Общая характеристика работы», необычное
свойство комплекса I сердца [Kotlyar and Vinogradov, 1990] – его существование
в виде двух медленно взаимопревращающихся форм: каталитически
активной (A) и каталитически неактивной – деактивированной (D). Медленный,
спонтанный переход из активного в деактивированное состояние происходит в
отсутствие одного из субстратов (NADH или окисленного убихинона). В
условиях, обеспечивающих каталитический оборот фермента, происходит его
активация. Скорость A/D-перехода сильно зависит от температуры, хорошо
заметная деактивация комплекса I сердца быка четко выражена только при
температуре свыше 30°С [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Переход комплекса I из
12
деактивированной в активную форму замедляется при высоких pH или в
присутствии двухвалентных катионов, в частности Ca2+ [Kotlyar et al., 1992].
D-форма фермента может быть необратимо модифицирована целым рядом
SH-реагентов [Kotlyar et al., 1992; Gavrikova and Vinogradov, 1999;
Gostimskaya et al., 2006], которые предотвращают оборот-зависимую активацию
фермента, в то время как A-форма не чувствительна к их действию. Можно
воспользоваться чувствительностью D-формы к SH-модификаторам
(в частности, ДТНБ) для количественной оценки соотношения A- и D- форм
фермента в любом препарате, содержащем комплекс I [Gostimskaya et al., 2006]:
в условиях, когда SH-реагент быстро реагирует с D-формой, кинетика
необратимого ингибирования двухфазна – доля быстрой фазы пропорциональна
доле D-формы, а медленная фаза отражает кинетику деактивации фермента.
На рис. 1 показана зависимость остаточной активности NADH оксидазы
М-СМЧ от времени инкубации препарата в присутствии ДТНБ при разных
температурах. Полученные данные показывают, что: 1) примерно половина
комплекса I в препарате находится в виде D-формы; 2) процесс деактивации
сильно зависит от температуры (практически отсутствует при 25°С) и 3) как
активная, так и деактивированная формы фермента в указанных условиях
стабильны – ингибирование, вызванное реакцией с ДТНБ полностью обращается
избытком дитиотреитола.
Рис. 1. Кинетика ингибирования
NADH оксидазной активности МО-СМЧ
SH-реагентом (ДТНБ).
МО-СМЧ вносили в среду, содержавшую 1 мМ
ДТНБ, до конечного содержания 1 мг/мл и
инкубировали при разных температурах (кривая 1 –
25°С, кривая – 30°С, кривая 3 – 37°С) в течение
указанного на абциссе времени. За 100% принимали
активно сти, измеренные при указанных
температурах (0,5; 0,6 и 0,74 мкмоль/мин на мг белка
при 25°С, 30°С и 37°С, соответственно). Стрелкой
показано внесение в среду инкубации 5 мМ ДТТ.
Процесс деактивации (медленная фаза ингибирования ДТНБ) примерно
соответствует кинетике первого порядка (рис. 2), энергия активации составляет
230 кДж/моль (практически совпадает со значением ранее определенным для
препаратов комплекса I сердца [Kotlyar and Vinogradov, 1990]).
13
Рис. 2. Линейные анаморфозы кинетики
и н г и б и р ов а н и я N A D H о кс и д а з н о й
активности МО-СМЧ SH-реагентом (ДТНБ).
МО-СМЧ активировали инкубацией в
присутствии NADPH и прослеживали кинетику
ингибирования при разных температурах так, как
указано в подписи к рис. 1 (см. выше). Прямые 1, 2
и 3 – температура инкубации 25°С, 30°С и 37°С,
соответственно. Значения констант скоростей
реакций первого порядка: 0,02 мин−1; 0,1 мин−1 и
0,4 мин−1 при 25°С, 30°С и 37°С, соответственно.
Так же, как было установлено для комплекса I митохондрий сердца, cкорость
активации фермента (длительность наблюдаемой лаг-фазы) в процессе реакции
сильно зависит от рН (рис. 3), тогда как NADH:Q1-редуктазная и NADH
оксидазная активности А-формы оказываются постоянными в интервале рН 7-9.
A
Б
Рис. 3. Кинетика NADH:Q 1 -редуктазной реакции активных и
деактивированных МО-СМЧ при разных pH (А) и линейные анаморфозы
кинетики NADH:Q1-редуктазной реакции деактивированных МО-СМЧ (В).
МО-СМЧ активировали инкубацией в присутствии NADPH и прослеживали кинетику
NADH:Q1-редуктазной реакции при pH 7,0 (кривая 1). МО-СМЧ деактивировали прогреванием
15 мин при 30°С, прослеживали кинетику NADH:Q1-редуктазной активности деактивированных
МО-СМЧ при двух различных pH: pH 7,0 (кривая 2) и pH 9,0 (кривая 3). Значения констант
скоростей реакций первого порядка – 0,7 мин−1 (прямая 2) и 0,2 мин−1 (прямая 3).
Наши результаты показали, что существенных различий между свойствами
полной дыхательной цепи и комплекса I в митохондриях нервной ткани и
мышцы сердца нет. Различия, если они существуют, следует искать в
14
механизмах, контролирующих активность комплекса I. Полученный препарат
М-СМЧ вполне пригоден для таких поисков.
III. Ингибирование комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга
жирными кислотами: влияние Ca2+
В настоящее время известно более двух десятков ингибиторов
комплекса I, специфиче ски блокирующих перено с электронов от
терминального железо-серного центра N-2 к убихинону. Химические
структуры этих ингибиторов настолько разнообразны, что сколько-нибудь
оправданных выводов о строении участка их связывания сделать невозможно.
Считают, что существует достаточно объемная гидрофобная полость, где
связываются ротенон, пиерицидин, Тритон X-100, катионные детергенты и пр.
С в о б од н ы е ж и р н ы е к и с л о т ы т а к ж е и н г и б и р у ю т ко м п л е кс I
[Loskovich et al., 2005]. Было показано, что пальмитиовая кислота – ингибитор
NADH: убихинон редуктазной реакции, катализируемой активной формой (A)
комплекса I. Кроме того, пальмитиновая кислота специфически ингибирует
активацию комплекса I (переход D→A).
Содержание свободных жирных кислот в митохондриях (в частности мозга)
может существенно увеличиваться в некоторых патологических состояниях
(например, при аноксии с последующей реоксигенацией), поэтому их можно
рассматривать в качестве факторов, способных нарушать функционирование
дыхательной цепи.
Еще одним возможным регулятором активности комплекса I могут быть ионы
Ca2+ [Kotlyar et al., 1992]. В условиях in vitro дышащие митохондрии способны
аккумулировать большие количества кальция, концентрация которого в
митохондриальном матриксе зависит от многих факторов, таких как природа
проникающего аниона, pH или присутствие нуклеотидов. Мы исследовали
влияние свободных жирных кислот, а также ионов Са2+ на каталитическую
активность комплекса I в инвертированных СМЧ мозга.
На рис. 4 А показано, что добавление высоких концентрации Ca2+ к MO-СМЧ
при щелочном значении pH приводит к развивающемуся во времени
ингибированию NADH-оксидазной активности. Такое торможение обращается при
добавлении избытка ЭГТА (кривая 3). В таких условиях ингибирование сукцинатоксидазной активности МО-СМЧ не происходит (результаты не приведены), а
остаточная NADH-оксидазная активность MO-СМЧ полностью чувствительна к
15
ротенону. Таким образом, ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ
под действием Ca2+ направлено на комплекс I. Катализируемое комплексом I
восстановление искусственного акцептора электронов (HAR) было не
чувствительно к Ca2+, поэтому можно считать, что торможение направлено на
участок связывания убихинона. Для увеличения NADH-оксидазной активности МОСМЧ (связывание свободных жирных кислот), в реакционную смесь вносили БСА,
который незначительно (на ∼20%) увеличивал NADH-оксидазную активность.
Оказалось, что БСА почти полностью предотвращает ингибирование NADHоксидазной активности МО-СМЧ ионами Ca2+(кривая 2). Этот результат указал на то,
что ингибирование комплекса I под действием свободных жирных кислот
[Loskovich et al., 2005] и Са2+ (рис. 4 А) взаимозависимо и это явление потребовало
дальнейшего изучения. Можно было предложить два объяснения роли Ca2+ в
усилении ингибирующего действия жирных кислот. Согласно первому, Ca2+
связываясь с комплексом I, увеличивает доступность (сродство) фермента для
жирной кислоты. Другая возможность состояла в том, что наблюдаемое явление
обусловлено взаимодействием: Ca2+ – жирные кислоты – мембранные
фосфолипиды. Если справедливо первое объяснение, то следовало ожидать, что Ca2+
точно также, или сходным образом будет влиять на торможение активности
A
Б
Рис. 4. Влияние Ca2+ на NADH-оксидазную активность МО-СМЧ.
А. 10 мМ CaCl2 и 15 мМ ЭГТА были добавлены, где указано, к МО-СМЧ (10 мкг белка/мл),
окисляющим 100 мкМ NADH в стандартной среде измерения оксидазной активности при pH
8,9 и 30°С. Кривая 1 – проба содержала БСА (2 мг/мл) без добавления Ca2+; кривая 2 –
Ca2+ добавлен к пробе, содержащей БСА; кривая 3 – в среде нет БСА.
Б. Ингибирование NADH-оксидазной активности ротеноном в присутствии Ca2+ (10 мМ).
Рот е н о н ( 5 · 1 0 – 8 М ) д о б а вл е н к М О - С М Ч ( 2 0 м к г бе л ка / м л ) , о к и с л я ю щ и м
100 мкМ NADH (pH 8,7; 30°С).
16
комплекса I другими, отличными от жирных кислот гидрофобными ингибиторами.
На рис. 4 Б показано, что это не так: Ca2+ не влиял ни на скорость торможения
комплекса I ротеноном, ни на конечный уровень ингибирования.
Мы оценили pH-зависимость ингибирования NADH-оксидазной активности
СМЧ под действием Ca2+ (при некотором, по-видимому, постоянном уровне
эндогенных свободных жирных кислот) (рис. 5). Как скорость Ca2+ индуцированного ингибирования, так и остаточная NADH-оксидазная активность
сильно зависели от pH, с кажущейся pKa около 8,5 (рис. 5 А). Следует отметить,
что величины остаточной NADH-оксидазной активности являются условными, а
кривую pH-зависимости (рис. 5, Б) следует рассматривать только как
ориентировочную, поскольку Ca2+-зависимое ингибирование NADH-оксидазной
активности МО-СМЧ развивается во времени.
A
Б
Рис. 5. Зависимость альбумин-чувствительного торможения NADHоксидазной активности МО-СМЧ ионами Ca2+ от pH.
А. Кривая регистрации NADH-оксидазной активности (концентрации NADH и CaCl2 – 100 мкМ
и 10 мМ, соответственно; 10 мкг белка МО-СМЧ / мл, 30°С); значения pH указаны на кривых.
Б. Степень ингибирования дыхания, наблюдаемая через 10 мин после добавки Ca2+, выраженная в
процентах по отношению к контролю (без добавления Ca2+). Контрольные значения (0,5 мкмоль
окисленного NADH в мин на мг белка МО-СМЧ) практически не зависели от pH.
На рис. 6 показано, что 10 мМ Ca2+, в уменьшенном, по сравнению с
рис. 1, временном диапазоне очень незначительно ингибирует NADHоксидазную активность (рис. 6, кривая 1), так же как и пальмитат, который
вызывает медленно развивающееся торможение (рис. 6, кривая 2). Когда к
СМЧ, дышащим в присутствии пальмитиновой кислоты, по крайней мере, в
течение 1 мин, был добавлен Ca 2+ , наблюдалось почти мгновенное
ингибирование NADH-оксидазной активно сти (рис. 6, кривая 3).
17
Если пальмитиновую кислоту вносили после добавления Са2+, то торможения
не происходило (если жирные кислоты оказываются в растворе, содержащем
Са2+, то образуется выпадающая в осадок нерастворимая соль и ингибирование
не происходит.), и активность оставалась такой же, как в присутствии только
Са2+ (рис. 6, кривые 4 и 1, соответственно). Результаты, представленные на рис.
6, показывают, что Са2+ значительно усиливает ингибирующее действие
мембрано-связанных жирных кислот.
Рис. 6. Ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ ионами
и пальмитиновой кислотой.
Ca2+
10 мМ CaCl 2 и 50 мкМ пальмитат добавляли (где указано) к пробам М О СМЧ (10 мкг белка/мл), окисляющим 100 мкМ NADH (pH 8,9; 30°С). Удельная активность
МО-СМЧ в отсутствие ингибиторов – 0,6 мкмоль/мин на мг белка.
Мы сравнили Ca2+-зависимое ингибирование активности комплекса I в
присутствии четырех других жирных кислот: лауриловой, миристиновой,
стеариновой и пальмитолеиновой. Наиболее эффективным ингибитором
оказалась пальмитиновая кислота (рис. 7).
Рис. 7. Специфичность действия жирных
кислот на Ca2+-зависимое ингибирование
NADH-оксидазной активности МО-СМЧ.
Условия опыта, как на рис. 6 (кривая 3); остаточная
активность измерена после добавления Ca 2+ .
Концентрация добавленных жирных кислот – 50 мкМ.
18
Несмотря на то, что приведенные выше данные показали синергизм
ингибирующего действия Ca2+ и свободных жирных кислот, они с трудом могли
быть оценены количественно из-за того, что торможение развивается во времени.
Чтобы преодолеть эту трудность, ингибирующий эффект Ca2+ определяли в
условиях, когда СМЧ инкубировали 30 мин (время, предположительно
необходимое для уравновешивания реакционной смеси) в присутствии
пальмитиновой кислоты и измеряли остаточную NADH-оксидазную активность в
присутствии возрастающей концентрации Ca2+. В этом случае кажущееся сродство
к Ca2+ возрастало и полумаксимальное ингибирование происходило уже при
0,3 мМ Ca2+. Дальнейшее увеличение времени инкубации (с жирными кислотами)
не влияло на характер кривой титрования (рис. 8 А). Полумаксимальное
ингибирование NADH-оксидазной активности, при «равновесном» титровании
пальмитиновой кислотой в присутствии высокой концентрации Ca2+ (10 мМ)
происходило при 0,5 мкмоль жирной кислоты на мг белка (рис. 8 Б).
А
Б
Рис. 8. Титрование ингибирующего эффекта Ca2+ (А) и пальмитата (Б) на
NADH-оксидазную активность МО-СМЧ.
А. МО-СМЧ преинкубировали 30 мин (pH 8,7; 22°С) в присутствии пальмитата (1 мкмоль на мг
белка) и измеряли остаточную активность в присутствии указанной концентрации Ca2+.
Б. МО-СМЧ преинкубировали 30 мин (pH 8,7; 22°С) с указанной концентрацией пальмитата и
измеряли остаточную NADH-оксидазную активность в присутствии 1,5 мМ CaCl2.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что, с одной стороны,
активация комплекса I замедляется при щелочных значениях pH и (или) в
присутствии двухвалентных катионов [Kotlyar et al., 1992], а с другой –
блокируется пальмитиновой кислотой [Loskovich et al., 2005]. Сопоставление
этих фактов с результатами, представленными выше, позволило предположить,
19
что влияние Ca2+ и щелочных значений pH на D→A переход на самом деле
обусловлено присутствием эндогенных жирных кислот в мембранах СМЧ.
Мы подтвердили это предположение (рис. 9).
NADH-оксидаза активированных МО-СМЧ была не чувствительна к Ca2+
(рис. 9, кривая 1). Деактивация комплекса I (преинкубация при 37°С)
приводила к появлению лаг-фазы окисления NADH (рис. 9 А, кривая 2),
длительность которой существенно увеличивалась в присутствии Ca 2+
(рис. 9 А, кривая 3). В присутствии БСА (рис. 9 Б) картина существенно
изменилась: Ca2+ только незначительно увеличивал лаг-фазу при окислении
NADH деактивированным препаратом (рис. 9 Б, кривые 2 и 3).
А
Б
Рис. 9. Влияние альбумина на активацию деактивированной NADHоксидазы.
МО-СМЧ (4 мг белка/мл) деактивировали преинкубацией при 37°С в течение 15 мин.
Окисление NADH при 30°С и начинали внесением 20 мкг белка МО-СМЧ/мл. А – среда не
содержала альбумина, Б – к среде добавлен БСА (2 мг/мл). Кривая: 1 – активированный
препарат МО-СМЧ, 2 – деактивированные СМЧ, 3 – в пробу добавлен 0,5 мМ CaCl2.
IV. Влияние белков митохондриального матрикса на ингибирование NADHоксидазной активности МO-СМЧ пальмитиновой кислотой
Препараты СМЧ и интактных митохондрий отличаются тем, что активный
нуклеотид-связывающий центр комплекса I в составе СМЧ ориентирован в
окружающий раствор. В митохондриях периферическая часть комплекса I
экспонирована в матрикс и находится в окружении «концентрированного»
раствора белков матрикса. Такие белки могут, с одной стороны,
взаимодействовать с комплексом I, влияя на его каталитическую активность, а, с
другой стороны, могут связывать свободные жирные кислоты. Чтобы выяснить
20
может ли содержимое матрикса повлиять на характер ингибирования
комплекса I под действием жирных кислот, мы оценили влияние белков матрикса
митохондрий на ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ под
действием пальмитиновой кислоты.
Полученные результаты представлены на рис. 10. Добавление БСА (0,1–0,2 мг
в мл, что соответствует возможному связыванию не менее 10 и 20 нмоль
пальмитиновой кислоты) приводит к появлению отчетливой лаг-фазы на графике
зависимости ингибирования комплекса I под действием жирной кислоты
(кривые 2 и 3 на рис. 10, А), по сравнению с той же зависимостью в
отсутствие БСА (кривая 1 на рис. 10, А). Характер зависимости, представленной
на рис. 10, Б (кривые 2 и 3) свидетельствует о том, что белки митохондриального
матрикса потенциально могут связывать свободные жирные кислоты и защищать
комплекс I от ингибирования жирными кислотами.
А
Б
пальмитат, мкмоль/мг белка МО-СМЧ
пальмитат, мкмоль/мг белка МО-СМЧ
Рис. 10. Влияние альбумина и белков митохондриального матрикса на
торможение NADH-оксидазной активности МO-СМЧ пальмитиновой
кислотой (pH 7,0; 25°С).
А. Ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ (10 мкг/мл) под действием
пальмитиновой кислоты в присутствии БСА. Кривая 1 – в отсутствии добавленного БСА
(контроль), кривые 2 и 3 – в присутствии БСА (0,1 и 0,2 мг/мл, соответственно).
Б. Ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ (10 мкг/мл) под действием
пальмитиновой кислоты в присутствии белков митохондриального матрикса. Кривая 1 – в
отсутствии белков митохондриального матрикса (контроль), кривые 2 и 3 – в присутствии белков
митохондриального матрикса (0,05 и 0,25 мг/мл, соответственно).
За 100% принимали значение NADH-оксидазной активности в отсутствии пальмитиновой
кислоты. NADH-оксидазная активность собственно «препарата белков митохондриального
матрикса» отсутствовала.
21
ВЫВОДЫ
1. Получены сопряженные СМЧ мозга и охарактеризованы основные
свойства комплекса I в их составе.
2. Каталитические активности и параметры A/D-перехода комплекса I в
субмитохондриальных фрагментах мозга практически не отличаются от
таковых, ранее описанных для препаратов сердца.
3. Торможение активации комплекса I ионами двухвалентных металлов при
щелочных значениях pH обусловлено эндогенными жирными кислотами.
4. Ионы Ca2+ pH-зависимо увеличивают скорость и степень ингибирования
комплекса I эндогенными и добавленными жирными кислотами. В ряду
проанализированных жирных кислот – пальмитиновая кислота наиболее
эффективный ингибитор комплекса I.
5. Белки митохондриального матрикса частично защищают комплекс I от
ингибирующего действия пальмитиновой кислоты.
22
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Калашников Д.С., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2011)
Субмитохондриальные фрагменты митохондрий мозга: общие характеристики
и каталитические свойства NADH:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I).
Биохимия, 76, 253–263.
2. Калашников Д.С., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2011)
Ингибирование митохондриальной NADH:убихинон оксидоредуктазы
(комплекса I) мозга жирными кислотами: влияние Сa2+. Биохимия,
(принято к публикации).
3. Калашников Д.С. (2010) NADH: убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из
митохондрий мозга. XVII международной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010», секция «Биология»,
Тезисы докладов, Москва, МАКС Пресс, 52–53.
4. Калашников Д.C. (2010) NADH:убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из
митохондрий мозга свиньи. 14-я Пущинская международная школаконференция молодых ученых «Биология – наука ХХI века»,
Сборник тезисов, Пущино, 30.
5. Kalashnikov D.S., and Vinogradov A.D. (2010) NADH:ubiquinone
oxidoreductase (complex I) of brain mitochondria. Biochim. Biophys. Acta , 1797,
16th European Bioenergetics Conference Short Reports. p. 17.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ
(Гранты № 05-04-48809, 06-04-48931, 08-04-00594, 09-04-00505) и
NIH Fogarty International Research grant 5R03TW007825.
23