Автореферат - Институт Нефтехимии и катализа РАН

На правах рукописи
Недопёкина Дарья Александровна
СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
НОВЫХ С(2)-ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
ТРИТЕРПЕНОИДОВ ЛУПАНОВОГО РЯДА
02.00.03  Органическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Уфа  2013
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институт нефтехимии и катализа Российской академии наук.
Научный руководитель:
кандидат химических наук,
старший научный сотрудник
Спивак Анна Юльевна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук,
член-корреспондент РАН
Миронов Владимир Федорович
заведующий лабораторией
ФГБУН Институт органической и
физической химии
им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН (г. Казань)
кандидат химических наук, доцент
Комиссарова Наталия Григорьевна
старший научный сотрудник
ФГБУН Институт органической химии
УНЦ РАН (г. Уфа)
Ведущая организация:
Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки
Новосибирский институт
органической химии
имени Н.Н. Ворожцова СО РАН
Защита диссертации состоится «17» сентября 2013 года в 14:00
часов на
заседании диссертационного совета Д 002.062.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении науки Институт нефтехимии и катализа Российской академии
наук по адресу: 450075, Уфа, проспект Октября, 141. Тел/факс: (347)2842750. E-mail:
ink@anrb.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН Институт нефтехимии и
катализа Российской академии наук и с авторефератом на сайте ВАК Министерства
образования и науки РФ.
Автореферат разослан «
Ученый секретарь
Диссертационного совета
Доктор химических наук
» августа 2013 года
Шарипов Г.Л.
3
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Нативные пентациклические тритерпеноиды лупанового
ряда (бетулин, бетулоновая и бетулиновая кислоты) составляют важный класс
биологически
активных
соединений
с
широким
спектром
биологического
и
фармакологического действия. Особый интерес к этим соединениям вызван их
противоопухолевыми и противовирусными свойствами. В 1995 году было обнаружено,
что бетулиновая кислота проявляет цитотоксичность по отношению к меланоме человека
путем индукции апоптоза раковых клеток (ED50 1.1-4.8 мкг/мл). Впоследствии появились
сообщения о противоопухолевой активности этого природного соединения по отношению
к другим типам злокачественных клеток. На сегодняшний день бетулиновая кислота
находится в стадиях I/II клинического исследования в качестве препарата для лечения
синдрома диспластического невуса.
Бетулиновая кислота и ее некоторые синтетические производные относятся к
группе противораковых веществ  «митоканов», биологической мишенью которых
являются митохондрии. Митоканы дестабилизируют митохондрии и индуцируют апоптоз
раковых клеток (не затрагивая нормальные клетки) независимо от их р53-статуса. В
работах, посвященных изучению механизма противоопухолевого действия бетулиновой
кислоты, убедительно показано, что она способствует накоплению в митохондриях
активных кислородсодержащих частиц. Продуцирование в больших концентрациях
свободных радикалов ведет к увеличению проницаемости или к разрыву мембран
митохондрий с последующим высвобождением в цитозоль проапоптозного медиатора 
цитохрома С, активацией каспаз и фрагментацией ДНК.
Нативные
лупановые
тритерпеноиды
проявляют
низкую
токсичность
по
отношению к животным даже при высоких концентрациях, однако относительно
небольшой потенциал их биологического действия, низкая растворимость в воде и
неблагоприятные параметры по абсорбции и метаболизму являются серьезным
препятствием для использования этих веществ в клинической практике. В связи с этим в
последние несколько десятилетий проводятся интенсивные исследования по синтезу
производных бетулина и бетулиновой кислоты путем модификации функциональных
групп при атомах углерода С(3) и С(17). Исследования привели к получению новых
лекарственных агентов, которые по своей противоопухолевой и противовирусной
активности превзошли бетулиновую кислоту. Не менее перспективными представляются
трансформации, направленные на структурную модификацию кольца А в лупановых
4
тритерпеноидах. В литературе описаны методы получения и биологические свойства
диосфенолов, А-секопроизводных бетулиновой кислоты и их ангидридов, а также группы
соединений с 1,3-еноновым фрагментом в кольце А, в которых атом углерода С(2) связан
со стерически небольшими электроно-акцепторными группами (CN, Cl, СНО). Эти С(2)функционализированные производные бетулиновой кислоты проявили более сильную
цитотоксическую активность по сравнению с бетулиновой кислотой и действовали как
эффективные ингибиторы продуцирования оксида азота в активированных макрофагах.
Работа выполнена в соответствии с планами НИР Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Института нефтехимии и катализа Российской академии
наук по теме «Направленные трансформации природных и синтетических токоферолов,
тритерпеноидов, экдистероидов и полисахаридов» № Госрегистрации 01201168019 в
2011-2013 гг., а также при поддержке грантов РФФИ № 10-03-00105 (2010-2012) «Дизайн
и синтез гетеродимерных и (поли)амидамин (РАМАМ) дендримерных конъюгатов
токоферолов и тритерпеноидов в качестве новых современных лекарственных средств»;
№
12-03-97005-а
(2012)
«Новые
митохондриально-направленные
производные
токоферолов и пентациклических тритерпеноидов: синтез и изучение in vitro их
противовоспалительных и противоопухолевых свойств»; программ фундаментальных
исследований Отделения химии и наук о материалах РАН:
биомолекулярная
химия»,
проект
«Синтез
и
исследование
«Медицинская и
цитотоксических
и
противовоспалительных свойств новых производных лупановых терпеноидов
с
модифицированным кольцом А и их конъюгатов с токоферолами» (2011) и «Медицинская
химия: молекулярный дизайн физиологически активных соединений и лекарственных
преператов», проект «Синтез митохондриально-направленных ионных производных
бетулиновой и урсоловой кислот как новых противоопухолевых агентов» (2012) .
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в получении новых
С-2
функционализированных
производных
лупановых
тритерпеноидов
как
потенциальных противоопухолевых агентов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
 синтезировать ранее неизвестные С-2-аллилзамещенные производные лупановых
тритерпеноидов на основе
реакции
аллильного
-алкилирования
енолятов
или
енокситриэтилборатов калия, генерированных из бетулоновой, дигидробетулоновой
кислот и 3-оксомодифицированного бетулина;
 изучить реакцию спироциклизации 1,6-гексадиенового фрагмента кольца А с целью
синтеза новых потенциально биоактивных спироциклических систем;
5
 разработать эффективные способы введения в молекулы лупановых тритерпеноидов
трифенилфосфониевого фрагмента, способствующего усилению их цитотоксических
свойств и избирательности действия на митохондрии раковых клеток;
 изучить in vitro цитотоксическое действие лупановых тритерпеноидов с фрагментом
трифенилфосфоний-катиона.
Научная новизна. Впервые осуществлено селективное -алкилирование енолятов
и
енокситриэтилборатов
калия,
генерированных
из
3-кетолупанов
(бетулоновая,
дигидробетулоновая кислоты, 3-оксомодифицированный бетулин) под действием ButOK
или KN(SiMe3)2Et3B и бромистого аллила. В результате, с высоким выходом получены
новые
С(2)-моноаллил-
и
С(2)-диаллилзамещенные
производные
лупановых
тритерпеноидов, доступные в качестве ключевых строительных блоков для дальнейших
трансформаций.
Впервые
радикальной
циклизацией
1,6-гексадиенового
фрагмента
в
2,2-
диаллилзамещенных метил- или бензилбетулонатах, инициируемой Fe(NO3)3·9H2O,
синтезированы спироциклические соединения, в которых кольцо А лупанового
тритерпеноида в С-2-положении спиросочленено с вицинально замещённым 4нитрометил-3-хлорметилциклопентаном. На основе результатов квантово-химической
оценки энергетических характеристик реакции определена наиболее вероятная 4'R, 3'S,
1'R  конфигурация хиральных атомов спироциклопентанового фрагмента в 4'(нитрометил)-3'-(хлорметил)спиро[лупан-2(1')-циклопентане]  основном диастереомере,
выделенном в индивидуальном виде для каждого из эфиров (метилового и бензилового).
Разработаны эффективные способы синтеза и впервые синтезированы ионные
производные
лупановых
тритерпеноидов,
содержащие
в
качестве
заместителя
липофильный мембранопроникающий трифенилфосфониевый катион. В испытаниях in
vitro на двух видах опухолевых клеток (мастоцитома P-815 и Карцинома Эрлиха) все
синтезированные фосфониевые соли по противоопухолевой активности значительно (4050 раз) превзошли бетулиновую кислоту.
Практическая ценность. Разработаны селективные препаративные методы
синтеза лупановых тритерпеноидов с легко функционализируемыми С(2)-аллильными
фрагментами. Полученные новые соединения могут быть использованы как ключевые
полупродукты для направленного синтеза различных биологически активных веществ в
ряду пентациклических тритерпенов. Ионные производные лупановых тритерпеноидов с
трифенилфосфониевыми фрагментами, проявившие при первичном скрининге высокую
цитотоксическую активность по сранению с бетулиновой кислотой, представляют интерес
6
в качестве потенциальных митохондриально-направленных противоопухолевых агентов и
рекомендованы для углубленных фармакологических исследований.
Апробация работы. Основные результаты исследований
представлены на
Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии. Теория и практика»
(Уфа, 2010), XIV Молодежной конференции по органической химии (Екатеринбург,2011),
Международной конференции «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology,
pharmacology, medicine» (Санкт-Петербург, 2011), XV Молодежной школе-конференции по
органической химии (Уфа, 2012), Всероссийской научной конференции «Органическая
химия: химия и технология» (Екатеринбург, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и тезисы 5 докладов на
конференциях, получен один патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,
литературного обзора на тему «Синтез и изучение противоопухолевых свойств бетулина,
бетулиновой кислоты и ее производных», обсуждения результатов, экспериментальной
части, выводов и списка литературы из 164 наименования. Материал диссертации
изложен на 128 страницах компьютерного набора (формат А4) и включает 30 схем, 2
рисунка и 2 таблицы.
Автор
выражает
глубокую
благодарность
заведующему
лабораторией
органического синтеза ИНК РАН доктору химических наук, профессору Одинокову
Виктору Николаевичу за постоянное внимание, консультации и неоценимую помощь на
всех этапах выполнения данной работы.
Основное содержание работы
1. Синтез новых производных лупановых тритерпеноидов с аллильными
заместителями в кольце А.
В ряду многочисленных полусинтетических аналогов лупановых тритерпеноидов
С-2 функционализированные производные бетулина и бетулиновой кислоты составляют
относительно небольшую группу веществ. К этим соединениям относятся диосфенолы, 2алкилиден разветвленные производные бетулоновой кислоты и лупановые тритерпеноиды
с 1,3-еноновым фрагментом в кольце А, в которых С(2) атом углерода связан с
электронно-акцепторными группами. Большинство из соединений этой группы проявили
более высокую цитотоксическую активность в отношении различных линий опухолевых
клеток по сравнению с бетулиновой кислотой. В связи с этим представляло интерес
получение новых С-2 функционализированных производных тритерпеноидов лупанового
типа с использованием в качестве полифункциональных строительных блоков С(2)-
7
моноаллил и С(2)-диаллил замещенных производных 3-кетолупанов. О синтезе этих
соединений в ряду лупановых тритерпеноидов в литературе не сообщалась.
В данной работе в синтезе новых лупановых тритерпеноидов использовались
реакции аллильного α-алкилирования енолятов или енокситриэтилборатов калия,
генерированных из эфиров бетулоновой, 20,29-дигидробетулоновой кислот и 3оксомодифицированного бетулина.
Как известно из литературы, эффективными интермедиатами в реакциях αалкилирования кетонов являются енокситриэтилбораты калия, которые получают in situ
взаимодействием циклических или ациклических кетонов с реагентами KH—Et3B,
KN(SiMe3)2—Et3B или ButOK—Et3B в эфирных растворителях. Использование таких
енолят-анионов в большинстве случаев позволяет контролировать регио- и стереохимию
реакций и исключает образование побочных продуктов О-алкилирования, ди- и
полиалкилирования. Нами показано, что взаимодействие аллилбромида с енолятанионами А, полученными взаимодействием метил- бетулоната 1, метил- 2 или бензил- 3
дигидробетулонатов или 28-TBS-защищенного 3-оксомодифицированного бетулина 4 с
KN(SiMe3)2 в 1,2-диметоксиэтане (DME), с последующим добавлением в реакционную
среду Et3B (мольное соотношение 1-4 : KN(SiMe3)2 : Et3B : С3Н5Br = 1 : 1.3 : 1.3 : 2)
привело за короткий период времени (4 ч) с выходами 42-71% и с высокой
стериоселективностью (2β:2α=98:2) к 2-аллилзамещенным тритерпеноидам 5-8 (схема 1).
На примере метилбетулоната 1 было исследовано влияние природы депротонирующих
агентов, растворителя и времени реакции на стереоселективность аллильного алкилирования исследуемых кетонов. Так, при увеличении продолжительности реакции
до 24 ч наблюдалось незначительное повышение образования 2α-пропенил эпимера 9
(2β:2α=96:4, данные спектров
1
H и
13
C). При замене растворителя DME на ТГФ
селективность реакции за 4 ч изменялась также незначительно (2β:2α=96:4), однако при
увеличении продолжительности реакции до 24 ч кинетически контролируемый 2β-эпимер
5 претерпевал частичную изомеризацию, по-видимому, в термодинамически более
стабильный 2α-эпимер 9, что привело к смеси эпимеров 5 и 9 (2β : 2α = 60 : 40).
Превращение 2β-эпимера 5 в условиях термодинамического равновесия в 2αэпимер 9 было подтверждено нами дополнительным экспериментом. При выдерживании
2β-эпимера 5 в ТГФ в присутствии KN(SiMe3)2—Et3B в течение 48 ч наблюдалось
образование смеси (60 : 40) 2β- и 2α-эпимеров. Смесь (70 : 30) эпимеров 5 и 9 была
получена также при α-аллилировании енолята А, полученного енолизацией метилового
эфира бетулоновой кислоты 1 под действием KН—Et3B в ТГФ (конверсия через 24 ч
составила 21%). При енолизации терпеноида 1 под действием ButOK—Et3B в DME состав
8
продуктов аллильного α-алкилирования енолят-аниона А существенно изменялся в
зависимости от того, как проводилась реакция.
Схема 1
29
30
1'
3'
25 11
H
2
3
2'
O
24
1
A
4
10
5
26
9
B
6
13
E
18
D
C
17
16
14
8
21
19
20
12
22
CO2Me
CO2Me
28
27
7
A
9
5 и 9 (5:9=60:40)
O
23
b, c или d
R
R
O
40-42%
1-4
+
K Et3B O
24
10
A
4
A
5
B
6
23
1
R
a
H
71% (для 6)
65% (для 5, 7)
42% (для 8)
A
3
f
e 20%
1
1
2
15
R
A
R = CO2Me, R1 = CH3CH=CH2 (1, 5, 9);
R = CO2Me, R1 = (CH3)2CH (2, 6);
R = CO2Bn, R1 = (CH3)2CH (3, 7);
R = CH2OTBS, R1 = CH3CH=CH2 (4, 8)
O
5-8
Реагенты и условия: a. 1) KN(SiMe3)2, BEt3, 2) C3H5Br, DME или ТГФ, 20oC, 4ч; b. 1) KN(SiMe3)2,
BEt3, 2) С3H5Br, ТГФ, 20oC, 24 часа; с. 1) ButOK, Et3B, 2) C3H5Br, DME, 20oC, 12 ч; d. 1) KH, Et3B, 2) C3H5Br,
ТГФ, 24ч; е. 1) ButOK, Et3B, 2) C3H5Br, DME, 20oC, 1ч, затем ButOK, 12ч; f. KN(SiMe3)2, BEt3, ТГФ, 20oC,
48ч.
Взаимодействие эфира бетулоновой кислоты 1 с ButOK—Et3B в DME (мольное
соотношение 1: ButOK : Et3B : С3Н5Br = 1 : 1.1 : 1.3 : 1.3) в течение 12 ч дало смесь 2β- и
2α-эпимеров 5 и 9 (2β : 2α = 70 : 30). Общий выход продуктов 5 и 9 из-за низкой
конверсии процесса не превышал 20%. При проведении реакции с повторным
добавлением
в
реакционную
среду
1.1
эквивалента
ButOK
и
последующим
выдерживанием реагентов при избытке основания в течение 12 ч (в условиях
термодинамического равновесия) был получен индивидуальный 2α-эпимер 9. Высокая
стереоселективность реакции аллильного α-алкилирования терпеноидов 1-4 и образование
в качестве кинетически контролируемых продуктов 2β-эпимеров 5-8, по-видимому,
обусловлены тем, что енолизация эфира бетулоновой и дигидробетулоновой кислот 1-3 и
кето-производного бетулина 4 под действием стерически объемного основания
KN(SiMe3)2 в DME приводит к хелатированному енокситриэтилборату калия. Благодаря
наличию метильной ангулярной группы (Ме-25) хелатные комплексы енолятов А с
растворителем ориентируются со стерически более доступной α-стороны, в связи с чем
последующая
стадия
алкилирования
енолят-анионов
аллильным
электрофилом
происходит с β-стороны. При проведении реакции аллильного алкилирования эфира
бетулоновой кислоты 1 в ТГФ стереоселективность процесса существенно снижалась,
9
поскольку ТГФ по сравнению с DME менее склонен к образованию хелатных комплексов
с металлами.
Аллильные геминально замещённые производные бетулоновой кислоты и 3-оксопроизводных бетулина представляют интерес в качестве полифункциональных блоксинтонов для новых производных лупановых тритерпеноидов. Например, лупановые
терпеноиды с 1,6-гексадиеновым фрагментом в кольце А могут быть трансформированы в
структуры, содержащие спироциклопентановые и спироциклогексановые кольца, в
которых в качестве спироатома будет выступать С-2-углеродный атом. Нами было
показано, что реакция аллилбромида с енолятами калия (B), генерированными при
действии на терпеноиды 1, 2, 3 или 4 избытка ButOK в DME (мольное соотношение 1, 2, 3
или 4: ButOK : С3Н5Br = 1 : 2.5 : 2.2), с высокой селективностью и выходом 52-69%
привела к продуктам 2,2-бис-аллилирования – терпеноидам 10-13 соответственно (схема
2). Деблокированием карбоксильной функции в соединении 10 галогенолизом под
действием LiBr в ДМФА была получена 2,2-бисаллил-3-оксолуп-20(29)-ен-28-овая
кислота 14.
Структуры полученных соединений подтверждены данными одномерных ( 1Н,
13
С,
АРТ), двумерных гомо- (COSY, NOESY) и гетероэкспериментов (HSQC, HMBC).
Определение
химических
сдвигов
атомов
водорода
СН2-,
и
СН-групп
колец
тритерпенового остова проведено с использованием метода двумерной гетероядерной
корреляции (HSQC).
Схема 2
1
1
R
12
25 11
2
3
O
24
1
A
10
5
4
23
9
B
6
C
26
13
18
14
8
7
19
27
E
D 17
16
15
R
21
3'
22
2'
R
a
1'
R
3''
2''
52-69%
1''
O
1-4
1
2
+
4
KO
24
10 B
A
B
5
23
6
A
COOH
10
10-13
b
87%
A
O
14
R = CO2Me, R1 = CH3CH=CH2 (1, 10);
R = CO2Me, R1 = (CH3)2CH (2, 11);
R = СO2Bn, R1=(CH3)2CH (3, 12);
R = CH2OTBS, R1 = CH3CH=CH2 (4, 13);
R = CO2H, R1 = CH3CH=CH2 (14);
Реагенты и условия: a. 1) ButOK, 2) C3H5Br, DME, 20oC, 2ч; b. LiBr, ДМФА, кипячение.
Так, о β-ориентации аллильного заместителя в соединении 5 (2β-эпимер)
свидетельствуют 1,3-стерические взаимодействия этого заместителя с метильными
группами С(24) и С(25), которые обусловливают экранирование и сдвиг сигналов
углеродных атомов метильных групп в сторону более сильных полей (на ~3.9 м.д. и ~2.5
10
м.д. соответственно) по сравнению с сигналами соответствующих метильных групп в 2αэпимере 9. В соединении 9 в результате 1,3-стерического взаимодействия αориентированного аллильного фрагмента с углеродным атомом метильной группы С(23),
последний резонирует в более сильном поле (δ 19.43 м.д.) по сравнению с атомом С(23) в
2β-эпимере (δ 21.72 м.д.). При определении конфигурации аллильных заместителей в 2αили 2β-эпимерах использовали также диагностические протоны в спектрах ЯМР 1Н −
метиновые протоны при атомах С(2) и метиленовые протоны при атомах С(1). Так, в
эксперименте NOESY для соединения 9 сигнал метинового протона при атоме С(2) (δ 2.77
м.д., м) имеет интенсивный кросс-пик с сигналом метильной группы С(24) (δ 1.06 м.д., с),
что свидетельствует об их пространственной близости и, следовательно, о β-ориентации
метинового протона Н(2). Найденная КССВ (3JH(1),H(2) = 10 Гц) аксиального протона Н(1) (δ
1.21 м.д., т, 2J = 3J = 10 Гц), интенсивный кросс-пик с ангулярной метильной группой
С(25) в NOESY однозначно указывает на аксиальное положение протона Н(2).
Следовательно, аллильная группа в соединении 9 находится в экваториальном положении
и имеет α-ориентацию. В эпимере 5 вицинальная КССВ (3JH(1),H(2) =13 Гц) аксиального
протона Н(1) (δ 2.08 м.д., д.д, 2J = 6 Гц, 3J = 13 Гц) свидетельствует об аксиальном
расположении протона Н(2). Следовательно, в эпимере 5 аллильная группа также
находится в экваториальном положении, но имеет β-ориентацию. Спектральные и
стереохимические особенности эфиров 2α- и 2β-аллил-3-оксо-лупанов, по-видимому,
объясняются кардинальными различиями в конформации кольца А.
Таким
образом,
нами
впервые
осуществлено
аллильное
алкилирование
енокситриэтилборатов калия 3-кетолупанов, позволившее в условиях кинетического
контроля получить с высоким выходом 2-аллилзамещенные тритерпеноиды. Разработан
простой и эффективный метод синтеза новых производных лупановых тритерпеноидов с
геминальными аллильными заместителями у атома углерода С(2), доступных для
дальнейших трансформаций.
2. Cинтез спироциклопентильных производных лупановых тритерпеноидов
радикальной нитроциклизацией С-2-диаллильных эфиров бетулоновой кислоты.
Известно, что наличие спиро- группы в молекулах различных природных и
синтетических биологически активных веществ оказывает существенное влияние на их
биологическую активность. При конструировании в молекуле спирогруппы часто
используют субстраты с геминальными диаллильными заместителями, которые легко
вступают в реакцию радикальной циклоизомеризации или циклоизомеризации под
действием комплексов переходных металлов.
11
Представлялось интересным изучить реакцию радикальной циклизации 2,2диаллилзамещенных метил- и бензил- бетулонатов 11 и 12, инициируемую Fe(NO3)3·9H2O
(в условиях его термического разложения) в присутствии FeCl3 или LiCl как ловушек
радикалов по разработанному ранее методу1. Реакция при кратковременном кипячении
реагентов в ТГФ привела с хорошим выходом к смеси диастереомерных спиросоединений
15 и 16 соответственно (схема 3).
Схема 3
NO2
CO2R
CO2R
a
63-65%
O
Cl
11, 12
O
15, 16
11, 15 R=Me; 12, 16 R=Bn
Реагенты и условия: а. Fe(NO3)3.9H2O, FeCl3 или LiCl, ТГФ, 65оС.
В масс-спектрах MALDI TOF смеси соединений 15 и 16 присутствовали
молекулярные ионы, соответствующие их брутто формулам (для 15, m/z 654.98 [M+Na]+,
670.96 [M+K]+; для 16, 730.40 [M+Na]+, 746.37 [M+K]+). В спектрах ЯМР 1H продуктов
циклизации 15 и 16 сигналы групп СH2NO2 и СH2Сl проявлялись в виде широких
мультиплетов, резонирующих при  4.30-4.75 и 3.45-3.65 м.д., соответственно, в спектрах
ЯМР
С этим группам соответствовали характерные триплетные сигналы: для
13
соединений 15 δ 75.81 и 44.45 м.д., для соединений 16 δ 75.83 и 44.46 м.д.
Анализ
спектров
ЯМР
этих
соединений
не
позволил
определить
их
стереоизомерный состав. Методом колоночной хроматографии на силикагеле из
трудноразделимых
диастереоизомерных
смесей
и
15
16
удалось
выделить
в
индивидуальном виде основные изомеры 15а и 16а соответственно. Строение соединений
15а и 16а было частично подтверждено анализом данных одномерных спектров ЯМР 1H и
С, двумерных гомо- (COSY, NOESY) и гетероядерных экспериментов (HSQC, HMBC).
13
NO2
4'
R
Cl
S
C
5'
R
3'
2'
1'
NO2
E
A
D
4'
CO2R
3'
B
Cl
O
R
R
NO2
5'
4'
R
2'
1'
3'
A
Cl
O
15a R=Me
16a R=Bn
1
B
T. Taniguchi, H. Ishibashi. Org. Lett. 2010, 12, № 1, 124.
15b
S
S
NO2
5'
4'
R
2'
1'
3'
A
B
Cl
O
15c
R
S
5'
R
2'
1'
A
B
O
15d
12
Спектры ЯМР 1H и
13
С с небольшими отличиями для соединений 15а и 16а
полностью соответствовали их структуре и содержали по единичному набору
характеристических
сигналов
лупанового,
циклопентанового
соответствующих заместителей. В их спектрах ЯМР
13
фрагментов
и
С наблюдалось сильнопольное
смещение синглетного сигнала четвертичного углеродного атома С-2 в кольце А ( δ 5.7
м.д.) по сравнению с его расположением в спектрах исходных эфиров 11 и 12. Выявленная
в спектрах ЯМР 1H КССВ вицинальных протонов НС-3´ (2.7 м.д.) и НС-4´ (3.0 м.д.),
равная 8 Гц, свидетельствовала об их взаимной цис-ориентации и, следовательно, цисрасположении групп СH2NO2 и СH2Сl в спироциклопентановом фрагменте. Взаимная цисориентация заместителей подтверждалась интенсивными кросс-пиками в спектре NOESY
между протонами группы СH2Сl (3.5 м.д.) и СH2NO2 (4.4 м.д.). Однако спектроскопия
ЯМР не позволяла сделать исчерпывающее заключение о стереохимическом строении
спиросоединений. Для получения информации об абсолютной конфигурации хиральных
атомов углерода циклопентанового кольца был проведен теоретический анализ
стереохимических особенностей исследуемой реакции2.
На
примере
модельного
2,2-диаллилзамещенного
циклогексанона
11′,
конформационное строение которого соответствует строению цикла А исходных
лупановых терпеноидов (11, 12) методами DFT и ab initio исследован механизм реакции
радикальной циклизации, протекающей согласно схеме 3.
β-ориентация
Экваториальное
положение
А
α-ориентация
Фрагмент 2,2-диаллилзамещенного
Метилбетулоната 11
Аксиальное
положение
2,2-диаллилциклогексанон
(модельное соединение) 11′
Автор благодарит д.х.н., проф. С.Л. Хурсана и М.Ю. Овчинникова за выполнение теоретического анализа
стереохимических особенностей реакции и консультации при обсуждении результатов (Институт
органической химии УНЦ РАН).
2
13
При экзо-циклизации 1,6-гексадиенового фрагмента метилбетулоната 11 (или
модельного
соединения
в
11′)
циклопентан
возможно
образование
восьми
диастереомеров: по четыре пары молекул с цис- и транс-расположением вицинальных
групп СH2NO2 и СH2Сl, различающихся расположением последних относительно
плоскости кольца А лупанового остова (изображены диастереомеры модельных
соединений 15а′-d′ с R-конфигурацией спироатома).
NO2
NO2
Cl
O
O
Cl
15a'
NO2
NO2
15b'
Cl
O
O
Cl
15c'
15d'
Результаты расчетов полных энергий оптимизированных структур всех изомеров
модельных
соединений
15а′-d′
в
приближении
В3LYP/6-31G(d)
однозначно
свидетельствовали об энергетической предпочтительности транс-изомеров: разница в
энергии между наименее стабильным транс-изомером 15b′ и наиболее стабильным цисизомером 15а′ (или продуктов реакции 15b и 15а) составила 9 кДж/моль, разница в
энергии наиболее устойчивого транс-изомера 15c′ с изомером 15а′ (или продуктов
реакции 15с и 15а) возрастает до 15 кДж/моль.
Однако из полученных нами экспериментальных данных следовало, что
термодинамически менее устойчивые цис-изомеры образуются в мажорных количествах.
Так, выход цис-изомера 15а составил 37% в расчёте на смесь диастереомеров 15. Для
объяснения данного кажущегося противоречия выдвинуто предположение, что кинетика и
механизм
исследуемой
реакции
обусловливают
избирательное
образование
термодинамически менее стабильного цис-изомера. В пользу выдвинутой гипотезы
свидетельствовали известные факты о преимущественном образовании цис-замещенных
циклопентанов в реакции радикальной циклизации 1,6-гексадиенов3.
В соответствии с гипотетическим механизмом, предложенным для радикальной
нитроциклизации 1,6-диенов в работе1, реакция С-2-диаллилзамещённых эфиров
бетулоновой кислоты, например, метилбетулоната 11 начинается с радикального
присоединения двуокиси азота к одной из двух двойных связей 1,6-диенового фрагмента с
последующей 5-экзо-циклизацией интермедиата 17 в интермедиат 18, содержащий
циклопентилметильный
3
радикал,
спиросочленённый
с
J. C. Tripp, C. H. Schiesser, D. P. Curran. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5518.
кольцом
А
лупанового
14
тритерпеноида. Радикальный интермедиат 18 улавливается атомом хлора, давая продукт
реакции 15 (схема 4).
Схема 4
NO2
NO2
NO2
.
NO2
A
LnFeII
.
O
O
O
11
.
LnFeIII
Cl
18
17
Cl
O
15
Расчёты относительной энергии Гиббса переходных состояний β-TS≠ и α-TS≠ двух
направлений первой стадии процесса циклизации модельного соединения 11′ показали
предпочтительность взаимодействия двуокиси азота с аллильным заместителем в
соединении 11′, имеющим экваториальную конфигурацию (β-ориентация аллильного
фрагмента в 11), что приводит к интермедиату 17′ (схема 5).
Схема 5

-TS
(3.4)

NO2

-TS
(0.0)
O
NO2
...

11' NO2
.
.
NO2
O 
18d'
(15.2) NO2
...
O 
18c'
(6.2)
O
15d'
O
.
NO2
.
NO2
Cl
17'
r≠(C…N) = 1.978 Å, imag = 548i см-1
O

18a'
(0.0)
.
O 
18b'
(12.3)
...
...
NO2
...
NO2
NO2
Cl
O
r≠(C…C) = 2.203 Å, imag = 490i см-1
15c'
Cl
O
15b'
Cl
O
15a'
15
Следовательно, на основании данных, полученных для модельного соединения 11′,
можно предположить, что в ряду изомерных соединений 15 предпочтительно образование
четырёх диастереомеров 15а-d с R-конфигурацией С-2-спироатома. При расчёте
относительной энергии Гиббса переходных состояний 18а′≠-d′≠, ведущих к модельным
соединениям 15а′-d′, переходное состояние 18а′≠, ведущее к изомеру 15а′, отличалось
самым низким энергетическим барьером. Найденное значение G≠c-a составляет 8.1
кДж/моль. Вычисленное из этой величины отношение констант скорости kа/kc = 15 (T =
338 K), то есть константа скорости стадии циклизации, протекающей в направлении
образования модельного соединения 15а′ или продукта реакции 15а на порядок выше
констант
скорости
конкурирующих
каналов.
Следовательно,
экспериментально
наблюдаемое образование цис-изомеров 15а и 16а спироциклопентановых производных
эфиров бетулоновой кислоты находит свое разумное объяснение при анализе данных,
полученных в рамках теоретических исследований, снимающих отмеченное выше
кажущееся
противоречие
между
термодинамикой
изомерии
и
данными
ЯМР-
исследований диастереоизомерной смеси соединений 15 или 16.
Таким образом, радикальной циклизацией 1,6-гексадиенового фрагмента в 2,2диаллилзамещенных метил- или бензилбетулонатах, инициируемой Fe(NO3)3·9H2O в
присутствии FeCl3 или LiCl, синтезированы ранее неизвестные спироциклические
соединения, в которых кольцо А лупанового тритерпеноида в С-2-положении
спиросочленено с вицинально замещённым (нитрометил)-(хлорметил)циклопентаном. На
основе результатов квантово-химической оценки энергетических характеристик реакции с
помощью теоретического анализа механизма реакции установлены наиболее вероятные
структуры выделенных в индивидуальной форме из смеси диастереоизомеров мажорных
продуктов 15а и 16а как метил-3-оксо-3'S-(хлорметил)-4'R-(нитрометил)-спиро[лупан2(1')R-циклопентан]-дигидробетулоната
и
бензил
3-оксо-3'S-(хлорметил)-4'R-
(нитрометил)-спиро[лупан-2(1')R-циклопентан]-дигидробетулоната соответственно.
3.
Синтез
лупановых
тритерпеноидов
с
трифенилфосфониевыми
фрагментами как потенциальных противоопухолевых агентов.
Бетулиновая кислота и ее некоторые синтетические производные относятся к
группе противоопухолевых веществ  «митоканов», биологической мишенью которых
являются митохондрии. Это соединение избирательно дестабилизирует митохондрии и
индуцирует апоптоз опухолевых клеток независимо от транскрипционного фактора р53.
Бетулиновая
кислота
способствует
накоплению
в
митохондриях
активных
кислородсодержащих частиц. Продуцирование в больших концентрациях свободных
радикалов ведет к увеличению проницаемости или к разрыву мембран митохондрий с
16
последующим высвобождением в цитозоль проапоптозного медиатора  цитохрома С,
активацией каспаз и фрагментацией ДНК. В настоящее время в области медицинской
химии
активно
развиваются
исследования,
посвященные
дизайну
и
синтезу
митохондриально-нацеленных противоопухолевых агентов, поскольку митохондрии
играют ключевую роль в энергетических процессах клетки, в генерировании активных
кислород-содержащих радикалов и регулировании путей клеточной смерти. При создании
новых лекарственных средств учитываются физико-химические и морфологические
особенности митохондрий, в частности уникально большой по сравнению с другими
органеллами и клетками трансмембранный потенциал митохондрий. Кроме того,
митохондриальный мембранный потенциал клеток солидных опухолей существенно
превышает потенциал нормальных клеток, что позволяет надеяться на избирательную
аккумуляцию положительно заряженных молекул в митохондриях трансформированных
клеток. Известно, что некоторые липофильные катионы, такие как родамин-123 и
тетрафенилфосфоний проходят через гидрофобные барьеры плазмы митохондриальных
мембран и накапливаются в митохондриях. Это свойство липофильных катионов можно
использовать для доставки цитотоксического соединения в митохондрию опухолевых
клеток с высокой селективностью. Мы предположили, что ковалентное связывание
бетулиновой кислоты и ее производных с мембранопроникающим трифенилфосфониевым
катионом приведет к облегченному транс-мембранному переносу тритерпеноидов и, как
следствие, к усилению их противоопухолевой активности.
Нами
синтезированы
трифенилфосфониевые
новые
соли
производные
лупановых
20,29-дигидробетулиновой
тритерпеноидов
и

3-эпи-20,29-
дигидробетулиновой кислот, которые значительно превзошли бетулиновую кислоту по
своей противоопухолевой активности. В синтезе целевых фосфониевых солей 33-35, 42,
43, 45 в качестве ключевых интермедиатов использовали 2β-аллилзамещенные метил- и
бензил-дигидробетулонаты 6 и 7, которые получали по разработанному нами методу
(схема 1, стр. 8).
3
+P X
COR
1
R 2
R
33. R1 =OH;
34. R1 =H;
35. R1 =OAc;
42. R1 =OAc;
43. R1 =H;
45. R1 =OAc;
R2 =H;
R2 =OH;
R2 =H;
R2 =H;
R2 =OAc;
R2 =H;
R3 =OMe; X=I
R3 =OMe; X=I
R3 =OBn; X=I
R3 =OMe; X=Br
R3 =OMe; X=Br
R3 =OH; X=Br
Восстановление кетогруппы соединений 6, 7 с помощью NaBH4 или с помощью
L-селектрида дает их 2-гидроксипроизводные 19-21, необходимые для последующих
трансформаций в трифенилфосфониевые соли (схема 6).
17
Изучение этой реакции позволило выявить существенное влияние С-2аллильного фрагмента на стереохимию процесса восстановления 3-кето-группы в кольце
А. Так, в отличие от высоко стереоселективной трансформации бетулоновой кислоты в
бетулиновую кислоту (3-ОН:3-ОН = 94:6) взаимодействие соединений 6 и 7 с NaBH4 в
системе растворителей MeOH-CHCl3 или MeOH-ТГФ привело к смеси эпимеров 19 и 21 с
незначительным преобладанием 3-эпимера
(3-ОН:3-ОН = 68:32). Найденная в
спектрах ЯМР 1Н соединений 19 и 20 КССВ (3JН(2), Н(3) = 10Гц) протона Н(3) с аксиальным
протоном Н(2) (см. выше, стр. 10) свидетельствовала об аксиальном -расположении
протона Н(3) и, следовательно, о β-ориентации 3-ОН-группы. В 3α-эпимере 21 КССВ
3
JН(2), Н(3) = 1.5-2Гц.
Схема 6
29
20
30
12
25
COOR
3'
a
R
1
R
1'
95, 96% c
10
A
3
72,74%
2
1
2
2'
5
4
O
C
9
B
6
14
18
D 17
15
16
R
1
R
COOR
b
6, 7
R
68%
1
R
2
21 c 24
87%
COOR
HO
76-79%
2
28
COOR
27
7
COOR
d
21
E 22
8
23
24
19, 20
22, 23
13
11 26
19
e
R
COOR
i
I
1
R
19, 21-24
2
25-29
R
57-94%
33, 34, 35
78-81%
1
R
2
30-32
87-93% f
COOR
MsO
R= Me: 6; R= Bn: 7
R= Me, R1= OH, R2=H: 19, 25, 30, 33
R= Bn, R1= OH, R2=H: 20
R= Me, R1=H, R2= OH: 21, 26, 31, 34
R= Me, R1=OAc, R2= H: 22, 27, 36, 39, 42
R= Bn, R1=OAc, R2= H: 23, 29, 32, 38, 41, 35
R= Me, R1=H,
R2= OAc: 24, 28, 37, 40, 43
R= H, R1=OAc, R2= H: 44, 45
R
g
1
R
78-81%
2
36-38
COOR
Br
R
i
42, 43
94,89%
1
R
2
39-41
97% h
41 i
45
44 81%
Реагенты и условия: а. NaBH4, CeCl3.7H2O, MeOH-TГФ, -30oC20oC, Ar; b. L-селектрид, TГФ, 78oC20oC, Ar; с. Ac2O, Py, DMAP, 20oC; d. BH3.TГФ, TГФ, 20oC, Ar; e. I2, PPh3, имидазол, ТГФ, 0oC; f. MsCl,
Py, CH2Cl2, DMAP, 20oC; g. LiBr, (CH3)2CO, кипячение, Ar; h. Pd/C, Et2O; i. PPh3, CH3C6H5, кипячение, Ar.
Стереоселективность реакции удалось существенно повысить при использовании
NaBH4, модифицированного CeCl3·7H2O. В этом случае 3-эпимеры 19, 20 получены с
18
селективностью 95-96%. Авторы работ4 объясняют стереоспецифичность реакций
восстановления кетонов реагентом NaBH4-CeCl3·7H2O образованием комплекса иона
церия с карбонильным атомом кислорода, что приводит к увеличению вероятности
«аксиальной»
атаки
гидрид-анионом
на
кетон
с
последующим
получением
экваториального 3-спирта. Влияние аллильного заместителя в соединениях 6 и 7
проявлялось также при использовании объемного восстанавливающего агента три(вторбутил)боргидрида лития (L-селектрида). Взаимодействие дигидробетулоната 6 с
L-
селектридом привело с высокой селективностью (3-ОН:3-ОН = 96:4) к 3-спирту 21,
что существенно отличается от результатов восстановления L-селектридом бетулоновой
кислоты (3-ОН:3-ОН = 62:38). Полученные спирты 19, 21 и их ацетаты 22-24 были
превращены с хорошим выходом в фосфониевые соли 33-35, 42, 43, 45 (схема 6). С этой
целью двойную связь в соединениях 19, 21-24 гидроборировали, первичные спирты 25, 26,
29 превратили в йодиды 30-32 действием йода в присутствии имидазола и
трифенилфосфина, а спирты 27-29 – в бромиды 39-41 через стадию соответствующих
мезилатов
36-38.
Взаимодействие
галогенидов
30-32,
39,
40,
44
с
избытком
трифенилфосфина в кипящем толуоле дало целевые трифенилфосфониевые соли 33-35,
42, 43, 45. Структуры всех полученных соединений подтверждены данными одномерных
(1H,
13
C, APT,
31
P), двумерных гомо-(COSY, NOESY) и гетеро экспериментов (HSQC,
HMBC). В спектрах ЯМР 31P солей 33-35, 42, 43, 45 сигналы атома фосфора наблюдались
в характерной для фосфониевых солей области 23.37 – 24.34 м.д.
Таким образом, нами разработан эффективный подход к синтезу ранее не
описанных фосфониевых солей лупановых тритерпеноидов. Доступность исходных
растительных метаболитов (бетулин, бетулоновая, бетулиновая кислоты) и высокие
выходы промежуточных веществ делают данный подход перспективным для получения
большой группы конъюгатов пентациклических тритерпенов с трифенилфосфониевыми
катионами как потенциальных противоопухолевых агентов.
J.L. Luche, J. Am. Chem. Soс., 1978, 100, 2226; E. St’astna, I.Cerny, V. Pouzar, H. Chodounska, Steroids, 2010,
75, 721.
4
19
4. Исследование цитотоксической активности синтезированных соединений5.
Цитотоксическое действие соединений 6, 11, 15, 33-35, 42, 43, 45 исследовали in
vitro на раковых клеточных линиях карциномы Эрлиха и мастоцитомы Р-815. Препаратом
сравнения служила бетулиновая кислота. У исследуемых соединений 6, 11 и 15
противоопухолевая активность проявилась, как и у бетулиновой кислоты, в концентрации
10 мкг·мл-1 и далее дозозависимо увеличивалась. При этом в концентрациях 10, 25 и 50
мкг·мл-1 действие соединений не превосходило действие бетулиновой кислоты. Все
исследуемые трифенилфосфониевые соли 33-35, 42, 43, 45 по противоопухолевой
активности
значительно
(40-50
раз)
превзошли
бетулиновую
кислоту.
Их
цитотоксическое действие проявлялось, начиная с концентрации 1 мкг·мл–1, а в
концентрации 10 мкг·мл–1 эти соединения вызывали 100%-ную гибель опухолевых клеток.
Бетулиновая
кислота
в
концентрации
10
мкг/мл
только
начинала
проявлять
цитотоксическое действие, которое дозозависимо возрастало при концентрациях 25
мкг·мл–1 и 50 мкг·мл–1. Однако даже в этих высоких концентрациях оставались
жизнеспособные клетки опухоли Р-815 (34.3% и 30.5% соответственно) и опухоли Эрлиха
(50.4% и 40.5%) (Таблица 1).
Таблица 1.
Цитотоксическое действие фосфониевых солей 33-35, 42, 43, 45 и бетулиновой кислоты (БК) на
клетки опухоли Р-815 (в числителе) и Эрлиха (в знаменателе) (% жизнеспособных клеток) (XSE)a
Концентрация
/мкг.мл–1
33
34
35
_b



93.71.7
91.52.0
38.81.7dc
66.23.0cd
0.01.3dc
-0.30.7cd
0.91.0dc
0.80.8cd
-0.71.0dc
3.52.5cd
1.01
1.27
86.13.2
93.83.5
5.32.0dc
60.54.6cd
-1.81.6dc
-2.30.4cd
-0.11.1dc
0.00.4cd
0.41.0dc
-1.30.3cd
0.65
1.21
97.62.3
98.13.8
89.16.1
99.84.8
13.44.4c,d
10.81.1c,d
2.24.2c,d
1.22.3c,d
4.62.2c,d
0.14.0c,d
4.79
4.70
0.1
1
10
25
50
IC50
/мкмоль.л–1
42
100.0 2.2
100.02.4
98,64.2
95,51.2
59.73.7c,d
73.45.02c,d
-6.82.9c,d
-3.94.6c,d
7.86.6c,d
7.24.8c,d
8.32.8c,d
-2.17.9c,d
1.20
1.37
43
45
БК



96.13.8
95.14.9
53.85.0c,d
71.73.6c,d
-3.51.6c,d
-1.32.02c,d
3.81.0c,d
-3.82.2c,d
5.01.6c,d
0.21.9c,d
1.15
1.35
97.54.5
98.62.6
60.04.5c,d
73.42.3c,d
-11.23.7c,d
16.02.2c,d
-2.83.2c,d
5.42.6c,d
7.23.7c,d
-5.25.0c,d
1.10
2.30
89.34.1
93.34.4
102.86.0
96.83.1
62.81.1c
57.34.2c
34.35.0c
50.42.4c
30.52.9c
40.52.6c
41.00
54.00
Автор выражает благодарность д.м.н., проф. Ю.П. Бельскому и д.м.н., проф. В.А. Хазанову за выполнение
экспериментов по определению цитотоксической активности полученных соединений и активное участие
при обсуждении результатов. (ООО «Инновационные фармакологические разработки», ООО «Ифар», г.
Томск).
5
20
а
X – среднее значение экспериментальных данных, SE – стандартная ошибка. Контроль;
c
Различия с контролем достоверны, р < 0.05; d Различия с соответствующей концентрацией
бетулиновой кислоты достоверны, р < 0.05;
е
IC50 – концентрация, вызывающая
полумаксимальную ингибицию жизнеспособных клеток.
Цитотоксическое действие бетулиновой кислоты (БК) и
солей 33-35,42,43,45 на опухолевые клетки мастоцитомыР-815 и карциномы Эрлиха
60
50
IC50
(мкМ)
40
30
20
10
0
33
34
35
42
мастоцитома Р-815
Из
литературы
известно,
что
43
45
БК
карцинома Эрлиха
трансформация
28-карбоксильной
группы
бетулиновой кислоты в алкоксикарбонильную, как правило, приводит к полной потере
цитотоксических свойств. Противоопухолевая активность бетулиновой кислоты в
отношении клеток меланомы человека выше активности ее 3-эпимера. Вместе с тем,
исследованные нами трифенилфосфониевые соли 33-35, 42, 43, 45, несмотря на различия в
химической структуре, проявили сравнимые цитотоксические свойства. Полученные
факты, по-видимому, свидетельствуют о существенном влиянии трифенилфосфониевого
катиона,
как
новой
фармакофорной
группы,
на
биологическую
активность
тритерпеноидов лупанового ряда. Высокая цитотоксичность фосфониевых солей
лупановых тритерпеноидов по сравнению с бетулиновой кислотой может быть связана с
их облегченным трансмембранным переносом в митохондрии раковых клеток.
Выводы
1. Разработан эффективный подход к синтезу лупановых тритерпеноидов с легко
функционализируемыми
С(2)-аллильными
заместителями.
Новые
тритерпеноиды
использованы в качестве ключевых синтонов в направленном синтезе потенциальных
таргетных противоопухолевых лекарственных средств.
2. Разработаны селективные методы синтеза С(2)-моноаллил и С(2)-диаллилзамещенных
производных лупановых тритерпеноидов на основе взаимодействия с аллильными
21
галогенидами енолятов или енокситриэтилборатов калия, генерированных in situ из 3кетолупанов под действием ButOK или KN(SiMe3)2—Et3B.
3. Установлено, что генерация енолят-анионов с помощью KN(SiMe3)2—Et3B в 1,2диметоксиэтане с последующим взаимодействием с аллилбромидом протекает в условиях
кинетического
контроля
и
с
высокой
стереоселективностью
приводит
к
2β-
аллилпроизводным.
3.
Осуществлен
тритерпеноидов
первый
синтез
радикальной
спироциклопентильных
нитроциклизацией
производных
лупановых
С(2)-диаллилзамещенных
эфиров
бетулоновой кислоты, инициируемой Fe(NO3)3.9H2O. С помощью теоретического анализа
механизма реакции установлена наиболее вероятная структура мажорного продукта
реакции, выделенного в индивидуальной форме из смеси диастереоизомеров и
установлена наиболее вероятная 4'R, 3'S, 1'R  конфигурация хиральных атомов
спироциклопентанового фрагмента  метил- или бензил- 3-оксо-3'-(хлорметил)-4'(нитрометил)спиро[лупан-2(1')-циклопентан]дигидробетулоната.
5. Выявлено существенное влияние С(2)-аллильного заместителя на стереохимию
восстановления 3-кетогруппы 2-аллилзамещенных 3-оксолупанов. Найдены селективные
восстанавливающие реагенты (NaBH4CeCl3.7H2O
и L-селектрид), позволившие с
высокой селективностью (94-96%) получить 3-OH и 3-OH эпимеры 2-аллилзамещенной
бетулиновой кислоты.
6. На основе доступных растительных метаболитов (бетулин, бетулиновая кислота)
впервые синтезированы ионные производные лупановых тритерпеноидов с липофильным
мембранопроникающим трифенилфосфониевым фрагментом. В испытаниях in vitro
фосфониевые
соли
по
бетулиновую
кислоту
противоопухолевой
и
рекомендованы
активности
для
значительно
углубленных
превзошли
фармакологических
исследований в качестве противоопухолевых лекарственных средств.
Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:
1. А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, Д.А. Недопекина, Л.М. Халилов, В.Н. Одиноков. Синтез
новых производных лупановых тритерпеноидов с аллильными заместителями в кольце А
и изучение in vitro их противовоспалительных и цитоксических свойств. // Известия
Академии наук, Серия химическая. 2011.  Т. 60  №4.  С. 694-701.
2. A.Y. Spivak, E.R. Shakurova, D.A. Nedopekina, S.L. Khursan, M.Y. Ovchinnikov, L.M.
Khalilov, V.N. Odinokov. The first synthesis of spirocyclopentyl derivatives of lupane
triterpenoids by radical nitrocyclization of C-2-diallyl substituted betulonates. // Tetrahedron
Letters. 2012.  Т. 53  № 2.  С. 217-221.
22
3. А.Ю. Спивак, Д.А. Недопекина, Э.Р. Шакурова, Р.Р. Халитова, Р.Р. Губайдуллин, В.Н.
Одиноков, У.М. Джемилев, Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, C.А. Станкевич, Е.В. Короткая,
В.А. Хазанов. Синтез лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами
и изучение их противоопухолевой активности. // Известия Академии наук, Серия
химическая. 2013.  №1.  С. 189-200.
4. А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, Д.А. Недопекина, В.Н. Одиноков. Способ получения
метилового эфира 3-оксо-3'-(нитрометил)-4‘(хлорметил)-спиро[лупан-2,1'-циклопентан]28-овой кислоты. // Патент РФ № 2448975. – Б.И. – 2012. – № 12.
5. А.Ю. Спивак, Р.Р. Халитова, Э.Р. Шакурова, Д.А. Недопекина, Р.Р. Губайдуллин, В.Н.
Одиноков, У.М. Джемилев, Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, С.А. Станкевич, В.А. Хазанов.
«Трифенилфосфониевые
соли
лупановых
тритерпеноидов,
способ
получения
и
применение в качестве противоопухолевых веществ». // Заявка № 2012144231
(положительное решение от 18.03.2013).
6. Д.А. Недопекина, Э.Р. Шакурова, А.Ю. Спивак, В.Н. Одиноков. Синтез новых аналогов
бетулоновой
кислоты
содержащих
гемм-диаллильный
и
спироциклопентановый
фрагменты в кольце А. // Всероссийская научная конференция «Актуальные проблемы
химии. Теория и практика».  Уфа.  2010. С. 83.
7. Д.А. Недопекина, А.Ю. Спивак, Р.Р. Халитова, Э.Р. Шакурова. Синтез новых
производных бетулоновой кислоты с аллильными заместителями в кольце А. // XIV
Молодежная конференция по органической химии.  Екатеринбург.  2011.  С. 435.
8. E.R. Shakurova, A.Y. Spivak, D.A. Nedopekina, А.N. Ivanova, N.V. Belska, V.P. Belsky.
Synthesis and avaluation in vitro of antiinflammatori and cytotoxicity activity of new derivatives
lupane triterpenoids with allyl substituents in the A-ring. // International Conference
«Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine». 
Sant-Petersburg  2011.  P. 189.
9. Д.А. Недопекина, А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, Р.Р. Халитова. Первый синтез
фосфониевых солей лупановых тритерпеноидов как потенциальных противоопухолевых
агентов // XV Молодежная школа-конференция по органической химии.  Уфа.  2012.  С.
61.
10. Д.А. Недопекина, А.Ю. Спивак, Э.Р. Шакурова, Р.Р. Халитова. Синтез новых
митохондриально-направленных производных бетулиновой кислоты // Всероссийская
научная конференция «Органическая химия: химия и технология».  Екатеринбург.  2012.
 С. 68.