Комплексное исследование полисахаридов и
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук На правах рукописи Кравченко Анна Олеговна Комплексное исследование полисахаридов и фотосинтетических пигментов красной водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis 02.00.10 – Биоорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: д.х.н. Ермак Ирина Михайловна ВЛАДИВОСТОК – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................................ 6 ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................ 8 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ......................................................................................... 14 1.1. Красные водоросли – источник биологически активных соединений..............14 1.2. Фотосинтетические пигменты красных водорослей .............................................15 1.3. Факторы, влияющие на содержание фотосинтетических пигментов красных водорослей ..............................................................................................................................20 1.4. Химическая структура полисахаридов красных водорослей ..............................23 1.5. Особенности структурного анализа полисахаридов красных водорослей ......27 1.5.1. Химические методы ....................................................................................... 28 1.5.2. Физико-химические методы .......................................................................... 30 1.5.2.1. ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием ..................................... 30 1.5.2.2. Спектроскопия 13С ЯМР ......................................................................... 33 1.5.2.3. Спектроскопия 1Н ЯМР .......................................................................... 36 1.5.3. Ферментативные методы ............................................................................... 37 1.6. Физико-химические свойства полисахаридов красных водорослей .................40 1.7. Факторы, влияющие на качественные и количественные характеристики полисахаридов .......................................................................................................................44 1.8. Области использования полисахаридов красных водорослей ............................51 1.9. Биологическая активность полисахаридов..............................................................53 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................. 57 2.1. Фотосинтетические пигменты красной водоросли A. flabelliformis ..................57 2.1.1. Факторы среды обитания водоросли............................................................ 57 2.1.2. Пигментный состав водоросли A. flabelliformis в зависимости от факторов среды ее обитания ................................................................................... 59 2.2. Полисахаридный состав водоросли A. flabelliformis (карпоспорофит) в зависимости от факторов среды ее обитания .................................................................64 2.2.1. Содержание сухого вещества и общего растворимого белка в талломах A. flabelliformis .............................................................................................................. 65 2.2.2. Количественный и качественный состав полисахаридов .......................... 67 2 2.3. Комплексное выделение фикобилипротеинов и полисахаридов водоросли A. flabelliformis ............................................................................................................................72 2.3.1. Выделение фикобилипротеинов и полисахаридов ..................................... 73 2.3.2. Фракционирование фикобилипротеинов ..................................................... 75 2.3.3. Химический и структурный анализ полисахаридов ................................... 76 2.4. Структура полисахарида, выделенного из стерильной формы A. flabelliformis ................................................................................................................................................... 78 2.4.1. Выделение, фракционирование и химический анализ полисахаридов .... 78 2.4.2. Структурный анализ желирующего полисахарида ..................................... 80 2.4.2.1. ИК-Фурье спектроскопия ....................................................................... 80 2.4.2.2. Спектроскопия 1Н и 13С ЯМР ................................................................. 81 2.4.2.3. МАЛДИ масс-спектрометрия ................................................................. 85 2.5. Структура и свойства полисахарида, выделенного из репродуктивной (карпоспорофит) формы A. flabelliformis .........................................................................91 2.5.1. Выделение и фракционирование полисахаридов ионообменной хроматографией ........................................................................................................ 91 2.5.2. Очистка полисахарида от белка .................................................................... 94 2.5.3. Структурный анализ суммарного полисахарида методом ИК-Фурье спектроскопии .......................................................................................................... 96 2.5.4. Фракционирование и химический анализ полисахаридов из A. flabelliformis .............................................................................................................. 97 2.5.5. Структурный анализ желирующего полисахарида ИК- и ЯМР спектроскопией......................................................................................................... 98 2.5.6. Мягкий кислотный гидролиз полисахарида из A. flabelliformis .............. 101 2.5.7. Масс-спектрометрический анализ продуктов ферментативного гидролиза полисахарида из A. flabelliformis .......................................................................... 106 2.6. Биологическая активность полисахаридов из стерильной и репродуктивной форм A. flabelliformis ..........................................................................................................111 2.6.1. Антикоагулирующая активность полисахаридов A. flabelliformis .......... 111 2.6.2. Влияние полисахаридов A. flabelliformis на образование АФК ............... 113 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ......................................................................... 115 3.1. Водоросли .....................................................................................................................115 3 3.2. Определение сухого вещества водоросли ..............................................................115 3.3. Выделение фотосинтетических пигментов ...........................................................115 3.3.1. Экстракция ФБП 0,1 М фосфатным буфером (метод 1) ........................... 115 3.3.2. Экстракция ФБП 1,5% водным раствором нитрата натрия (метод 2) ..... 116 3.3.3. Выделение хлорофилла а и каротиноидов ................................................ 116 3.3.4. Идентификация фотосинтетических пигментов ....................................... 117 3.4. Выделение и фракционирование полисахаридов ................................................118 3.5. Основные аналитические методы ............................................................................118 3.6. Мягкий кислотный гидролиз ....................................................................................121 3.7. Ферментативный гидролиз ........................................................................................121 3.8. Определение молекулярной массы ..........................................................................122 3.8.1. Вискозиметрический метод......................................................................... 122 3.8.2. Молекулярные массы низкомолекулярных (НМ) производных полисахаридов ........................................................................................................ 122 3.9. Очистка полисахарида от белка ...............................................................................123 3.9.1. Обработка полисахарида протеазой из Streptomyces caespitosus............. 123 3.9.2. Очистка полисахарида от белка по методу Севага ................................... 123 3.10. Хроматографические методы .................................................................................123 3.10.1. Ионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе .............................. 123 3.10.2. Гельпроникающая хроматография на биогеле Р-10 ................................ 124 3.10.3. Адсорбционная хроматография на фосфате кальция ............................. 124 3.10.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) ................... 124 3.10.5. Хромато-масс-спектрометрия ................................................................... 125 3.11. Физические методы анализа ...................................................................................125 3.11.1. ИК-спектроскопия ...................................................................................... 125 3.11.2. Спектроскопия ЯМР .................................................................................. 125 3.11.3. Масс-спектрометрия .................................................................................. 125 3.12. Биологическая активность полисахаридов .........................................................126 3.12.1. Антикоагулирующая активность .............................................................. 126 3.12.2. Влияние полисахаридов на образование активных форм кислорода (АФК) ....................................................................................................................... 127 3.13. Измерение параметров условий обитания водоросли ......................................128 4 3.14. Статистический анализ ............................................................................................128 4. ВЫВОДЫ ................................................................................................................... 130 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................................... 132 5 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ AnGal – 3,6-ангидрогалактоза APF – 2-[6(4-амино)фенокси-3H-ксантен-3-он-9-ил]бензойная кислота CgiA – ι-каррагиназа CglA – λ-каррагиназа COSY – корреляционная спектроскопия D – 1,4-связанная α-D-галактоза D6S – 1,4-связанная α-D-галактоза 6-сульфат DA – 1,4-связанная 3,6-ангидро-α-D-галактоза DA2S – 1,4-связанная 3,6-ангидро-α-D-галактоза 2-сульфат G – 1,3-связанная β-D-галактоза G4S – 1,3-связанная β-D-галактоза 4-сульфат Gal – галактоза Glc – глюкоза HSQC – гетероядерная одноквантовая корреляция LA – 1,4-связанная 3,6-ангидро-α-L-галактоза L – 1,4-связанная α-L-галактоза PBS – фосфатно-солевой буфер ROESY – спектроскопия эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат R-ФЦ – R-фикоцианин R-ФЭ – R-фикоэритрин Xyl – ксилоза АФК – активные формы кислорода АФЦ – аллофикоцианин АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВПГ – вирус простого герпеса ВПЧ – вирус папилломы человека ГЖХ – газо-жидкостная хроматография ГЖХ-МС – хромато-масс-спектрометрия 6 ДЕАЕ-целлюлоза – диэтиламиноэтилцеллюлоза ДМСО – диметилсульфоксид ДСС – 2,2-диметил-2-силапентан-3,3,4,4,5,5-d6-5-сульфонат ИК-спектроскопия – инфракрасная спектроскопия ИЭР – ионизация электрораспылением Кар – каротиноиды МС – моносахарид МАЛДИ – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация ОРБ – общий растворимый белок ПС – полисахарид ПТВ – протромбиновое время СВ – сухое вещество Спектроскопия ЯМР – спектроскопия ядерного магнитного резонанса ТМС – тетраметилсилан ТФУ – трифторуксусная кислота ФАР – фотосинтетически активная радиация ФБП – фикобилипротеины ФУБ – фикоуробилин ФЦБ – фикоцианобилин ФЭБ – фикоэритробилин Хл а – хлорофилл а 7 ВВЕДЕНИЕ Красные водоросли являются источником уникальных по структуре и физико-химическим свойствам биологически активных веществ. Основными структурными компонентами клеточной стенки красных водорослей являются сульфатированные полисахариды – агар и каррагинан, полимерная цепь которых построена из остатков галактозы, соединенных чередующимися β-(1→4) и α-(1→3) гликозидными связями [1, 2]. 4-О-замещенный моносахаридный остаток может быть представлен как галактозой, так и ее 3,6-ангидропроизводным и имеет Lконфигурацию в группе агара (L) и D-конфигурацию (D) в группе каррагинана. Гидроксильные группы могут быть сульфатированы, метилированы или замещены остатками пировиноградной кислоты. Каррагинаны классифицируются согласно местоположению и количеству сульфатных групп в моносахаридных остатках (S) и присутствию 3,6-ангидрогалактозы (DA) в 4-О-связанных остатках [3, 4]. Химическая структура этих биополимеров сложна и разнообразна, что обусловлено видовой принадлежностью водорослей, фазой их жизненного цикла и условиями обитания. В случае каррагинанов сложность структуры связана как с возможным присутствием смеси нескольких типов каррагинанов в водоросли, так и комбинацией различных идеальных каррабиозных звеньев, распределенных вдоль полимерной цепи, что приводит к образованию гибридных структур [1, 5]. Термин DL-гибрид предложен для агар-каррагинановых гибридных структур. В большинстве случаев трудно установить, имеет полисахарид гибридную структуру или представляет собой смесь различных компонентов, каждый из которых проявляет регулярность, типичную для классического агара или каррагинана. Сульфатированные полисахариды красных водорослей обладают гелеобразующими свойствами, внесены в список пищевых добавок и последнее время, благодаря разнообразной биологической активности и физико-химическим свойствам, находят все большее применение в медицинской и фармацевтической промышленности [6, 7, 8, 9, 10]. Физико-химические и биологические свойства этих полисахаридов тесно связаны с их структурой [11, 12]. Наряду с полисахаридами, красные водоросли содержат пигменты светособирающего комплекса – фикобилипротеины (ФБП), количество которых в 8 клетке достаточно велико [1]. ФБП (фикоэритрин (ФЭ), фикоцианин (ФЦ) и аллофикоцианин (АФЦ)) – высокомолекулярные комплексные соединения, в которых хромофорная группа пигмента ковалентно связана с остатком цистеина водорастворимого белка [13, 14]. Они обладают яркой окраской и очень интенсивной флуоресценцией, иммунофлуоресцентной диагностике, поэтому находят цитометрии и применение других в биологических исследованиях. ФБП весьма перспективны для использования в косметической и пищевой промышленности, где преимущество натуральных красителей перед синтетическими достаточно очевидно. В последнее время получены данные о разносторонней биологической активности ФБП [13, 15, 16, 17, 18, 19]. Качественный и количественный состав сульфатированных полисахаридов и пигментов красных водорослей зависит от множества факторов: экзогенных, определяемых условиями произрастания водоросли (соленостью и температурой воды, освещенностью, концентрацией биогенных элементов), и эндогенных, связанных с физиологией макрофита, в частности его видовой принадлежностью и стадией развития [20, 21, 22, 23, 24, 25]. Последний фактор особенно важен, поскольку красные характеризующийся водоросли чередованием имеют сложный вегетативного, жизненный полового и цикл, бесполого размножения. Проводимое в последние годы изучение структурных характеристик полисахаридов водорослей с учетом жизненного цикла макрофитов позволило установить новые структуры этих полимеров. Как известно, высокая степень вариабельности структуры сульфатированных полисахаридов из природных источников часто приводит к невоспроизводимости физико-химических и биологических свойств полимеров, выделенных из разных партий водорослей, собранных в различных условиях. Более того, адаптивные перестройки, происходящие в макрофитах в ответ на изменения параметров окружающей среды (освещение, температура воды), как известно, сопровождаются также нарушением количества и соотношения пигментов светособирающего комплекса [24, 26]. Поэтому при комплексном исследовании водорослей особое внимание должно быть направлено на изучение влияния факторов среды их обитания на количественные и структурно-химические активных соединений – полисахаридов и ФБП. 9 характеристики физиологически- Достаточно широко представленные на российском тихоокеанском побережье макрофиты семейства Phyllophoraceae слабо изучены и, согласно немногочисленным литературным данным, являются источником необычных по структуре и физико-химическим характеристикам полисахаридов, которые содержат и агар, и каррагинан [27]. Сведения о полисахаридном и пигментном составе представителя этого семейства – водоросли Ahnfeltiopsis flabelliformis, обитающей в Дальневосточных морях России, и его зависимости от условий обитания и стадии жизненного цикла макрофита, отсутствуют. Вместе с тем, эта водоросль может оказаться новым потенциальным источником биологически активных соединений. В связи с этим изучение взаимосвязи полисахаридного и пигментного состава водоросли с условиями среды ее обитания и стадией жизненного цикла позволит определить наиболее благоприятные периоды для заготовки сырья и оценить возможность комплексного использования A. flabelliformis. Цель данной работы – структурное исследование сульфатированных полисахаридов из стерильной и репродуктивной форм красной водоросли A. flabelliformis и выяснение факторов, влияющих на количественные и качественные характеристики полисахаридов и фотосинтетических пигментов (фикобилипротеинов). Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. исследовать полисахаридный состав и содержание фотосинтетических пигментов A. flabelliformis в зависимости от таких параметров среды обитания водорослей, как температура воды и уровень фотосинтетически активной радиации (ФАР); 2. подобрать оптимальные условия для комплексного выделения ФБП и полисахаридов водоросли A. flabelliformis; 3. установить структуру полисахаридов из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм A. flabelliformis. Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Работа поддержана грантами: ДВО РАН № 13-III-В-05-085 (руководитель Кравченко А.О.), РФФИ № 14-04000866A (руководитель д.х.н. Ермак 10 И.М.), «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. Рассказов В.А.) и интеграционным грантом ДВО-УрО РАН (руководитель д.х.н. Ермак И.М.). Научная новизна работы. Впервые изучен качественный и количественный полисахаридный и пигментный состав дальневосточной водоросли A. flabelliformis в зависимости от сезона ее сбора и показано, что освещенность и температура воды влияют на накопление в ней ФБП и сульфатированных полисахаридов. Разработан оптимальный метод комплексного выделения полисахаридов и ФБП из водоросли A. flabelliformis. Впервые установлена структура желирующих полисахаридов, выделенных из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм A. flabelliformis. Показано, что полисахарид из стерильной формы A. flabelliformis представляет собой каррагинан с гибридной κ/β структурой с соотношением соответствующих звеньев 3:1, а в состав полимерной цепи полисахарида из карпоспорофита входят преимущественно дисахаридные звенья ι-, κ- и βкаррагинанов, а также минорные количества ν-каррагинана. Установлено, что ксилоза, имеющая фуранозную форму, является заместителем одной из гидроксильных групп галактозы и занимает предположительно положение 6 1,3связанной β-D-галактозы в полимерной цепи каррагинана. Практическая значимость работы. Данные о влиянии факторов окружающей среды и стадии жизненного цикла водоросли на содержание ФБП и полисахаридов A. flabelliformis могут быть использованы при выборе оптимального времени года для заготовки сырья с целью получения максимального выхода целевого продукта. Разработанный метод комплексного выделения основных компонентов клеточной стенки красных водорослей – ФБП и полисахаридов с их максимальным выходом позволит рационально использовать воспроизводимое уникальное сырье Дальневосточного региона и сократить количество отходов производства. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Качественный и количественный пигментный и полисахаридный состав водоросли A. flabelliformis зависит от факторов среды ее обитания: температуры воды и фотосинтетически активной радиации (ФАР). 2. Последовательное выделение из A. flabelliformis ФБП и полисахаридов позволяет увеличить выход полисахаридов. 11 3. Наиболее эффективным методом выделения ФБП является экстракция их водным 1,5% раствором NaNO3. 4. Структура полисахаридов из A. flabelliformis зависит от стадии жизненного цикла макрофита. 5. Желирующий полисахарид из стерильной формы A. flabelliformis представляет собой гибридный κ/β-каррагинан с соотношением κ- и β-звеньев 3:1 и содержит в минорных количествах звенья ι- и γ-каррагинанов (предшественник βкаррагинана). 6. Желирующий полисахарид из карпоспорофита A. flabelliformis представляет собой ι/κ-каррагинан (соотношение ι:κ 1:0,5), содержит звенья βкаррагинана и минорные количества ν-каррагинана (предшественник ι- каррагинана). 7. В результате ферментативного гидролиза ι/κ-каррагинана из A. flabelliformis получены высокомолекулярная фракция полисахарида, устойчивая к действию фермента, и олигосахариды: йота-каррабиоза, йота-карратетраоза, а также гибридные тетра- (DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S) и гексасахариды (DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DAG4S-DA2S-G4S). 8. Ксилоза, присутствующая в полисахаридах из обеих форм водоросли, является заместителем одной из гидроксильных групп галактозы. Данный моносахаридный остаток, имеющий фуранозную форму, занимает предположительно положение 6 1,3-связанного остатка β-D-галактозы. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены лично автором в виде устных докладов на 1st Symposium «Marine Enzymes and Polysaccharides», «Фундаментальная Nha Trang, 2012; гликобиология», II Саратов, Всероссийской 2014; XII конференции Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2009; XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2012; а также в виде стендовых сообщений на XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010; 4th Annual Russian- 12 Korean Conferences «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Novosibirsk, 2012; 2nd International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, 2013. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 9 тезисов докладов в материалах научных конференций. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН «7» апреля 2015 г. Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором при содействии сотрудников ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ЛФАО ИБМ им А.В. Жирмунского ДВО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей. Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Результаты и обсуждение», «Экспериментальная часть», «Выводы» и «Список литературы», включающий 283 наименования. Диссертация изложена на 161 странице. Результаты представлены в 23 таблицах и иллюстрированы 32 рисунками. 13 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Красные водоросли – источник биологически активных соединений В мировом океане насчитывается около 4000 видов красных водорослей, которые являются источниками сульфатированных полисахаридов – агаров и каррагинанов. Из них более 250 видов имеют промышленное значение. В зависимости от типа продуцируемого полисахарида красные водоросли подразделяют на каррагинанофиты (синтезируют каррагинан) и агарофиты (синтезируют агар) [1]. К настоящему времени каррагинаны обнаружены в водорослях семейств Gigartinaceae, Solieriaceae, Hypneaceae, Phyllophoraceae, Petrocelidaceae, Caulacanthaceae, Rhodophyllidaceae, Furcellariaceae, Cystocloniacaeae, Tichocarpaceae и Rhabdoniaceae, Dicranemataceae. Среди водорослей, продуцирующих агар, следует отметить представителей порядков Gelidiales, Cryptonemiales, Ceramiales и Gigartinales [1, 28]. Основными видами водорослей, используемыми для промышленного получения каррагинанов в мире, являются Hypnea musciformis [29], Kappaphycus alvarezii [30], Eucheuma isiforme [31], Chondrus crispus, C. ocellatus, Mastocarpus stellatus [32]. Агар получают из водорослей Gracilaria spp. [33], Gracilariopsis lemaneiformis [34], Gelidium amansii [35] и G. howei [34], Ahnfeltia tobuchiensis [26]. В середине 80-х годов прошлого столетия в Японском море каррагинанофиты были обнаружены среди представителей семейств Gigartinaceae и Solieriaceae (Chondrus pinnulatus, C. armatus, C. yendoi, Gigartina ochotensis, G. unalaskensis, Rhodoglossum hemisphaericum) [36], Tichocarpaceae (Tichocarpus crinitus) [37] и Phyllophoraceae (Ahnfeltiopsis flabelliformis и Mastocarpus pacificus). Водоросль A. flabelliformis широко распространена в Японском и Охотском морях России, однако чистых зарослей не образует, а перемежается с другими красными водорослями. В заливе Петра Великого неприкрепленная форма обитает в пластах A. tobuchiensis [38]. Помимо сульфатированных галактанов в состав клеточной стенки красных водорослей входят и нейтральные структурные полисахариды – целлюлоза, маннаны, ксиланы, резервный полисахарид – флоридный крахмал, гликопротеины, протеогликаны, липиды, разнообразные 14 клеточные белки и пигменты – фикобилипротеины (фикоэритрин, фикоцианин и аллофикоцианин), хлорофилл а и каротиноиды α и β [1, 39]. 1.2. Фотосинтетические пигменты красных водорослей Основными фотосинтетическими пигментами красных водорослей являются фикобилипротеины (ФБП), а также хлорофилл а и каротиноиды α и β [40]. Фикобилипротеины – водорастворимые пигменты, которые в клетках красных водорослей организованы в высокомолекулярные комплексы, называемые фикобилисомами. Эти комплексы представляют собой гранулы, расположенные на наружной поверхности тилакоидных мембран [13]. Фикобилисомы содержат три основных типа ФБП: фикоэритрин (ФЭ), фикоцианин (ФЦ) и аллофикоцианин (АФЦ) [41]. Они являются дополнительными пигментами фотосинтеза красных водорослей, поскольку передают поглощенную ими энергию света на фотохимически активные молекулы хлорофилла а [42]. Световая энергия, поглощаемая ФЭ, переносится через ФЦ к АФЦ, а затем к хлорофиллу [13, 41]. Фикобилипротеины представляют собой кислые водорастворимые глобулярные белки, состоящие из α- и β-полипептидных цепей, в которых к остаткам цистеина ковалентно присоединены одна или две хромофорные группы (билины), построенные из четырех линейно связанных пиррольных колец с двумя карбоксильными группами (рис. 1). Их спектральные свойства (поглощение и флуоресценция) обусловлены как наличием у них хромофорных групп, так и третичной и четвертичной структурой белковой глобулы [14]. В пигментах красных водорослей α-субъединица, несущая 1-2 хромофоры, и β-субъединица, несущая 1-4 хромофоры, всегда присутствуют в молярном соотношении 1:1. Несущие хромофоры γ-субъединицы имеют, как правило, больший размер и присутствуют в некоторых АФЦ и ФЭ в определенной стехиометрии (αβ)nγ (n=3-6) [43]. 15 А Б В А — фикоэритробилин; Б — фикоцианобилин; В - фикоуробилин Рисунок 1 – Хромофоры ФБП R-фикоэритрины (R-ФЭ) – белки красного цвета с максимумом поглощения от 498 до 568 нм. В красных водорослях существует два спектральных типа R-ФЭ. Один из них содержит два пика поглощения при 498 и 565 нм и плечо поглощения при 540 нм в видимой области. Другой содержит три пика поглощения при 498, 540 и 565 нм. Первая модель R-ФЭ была названа R-ФЭ типа I, а вторая – R-ФЭ типа II [13]. R-ФЭ состоит из трех типов субъединиц: α (~20 кДа), β (~20 кДа) и γ (~30 кДа) с молекулярной структурой (αβ)6γ и имеет молекулярную массу 240 кДа [44]. α-субъединица R-ФЭ содержит только две хромофорных группы фикоэритробилина (ФЭБ), в то время как β- и γ-субъединицы помимо ФЭБ содержат фикоуробилин (ФУБ) (рис. 1). При этом β-субъединица включает два ФЭБ и один ФУБ, тогда как γ-субъединица – три ФЭБ и два ФУБ. Сравнительные 16 исследования R-ФЭ из 30 видов красных водорослей, принадлежащих семействам Bangiophyceae и Florideophyceae, показали, что R-ФЭ типа I содержится в одноклеточных красных водорослях, тогда как R-ФЭ типа II характерен для многоклеточных красных водорослей [45]. Фикоцианины – сине-голубые белки с максимумами поглощения от 585 до 630 нм. R-фикоцианин (R-ФЦ) имеет основной максимум поглощения при 615 нм, а также второстепенный максимум поглощения при 555 нм. Второстепенный максимум появляется благодаря наличию ФЭБ хромофоров в β-субъединице, в дополнение к фикоцианобилиновым (ФЦБ) хромофорам. Молекулярная структура R-ФЦ – (αβ)3, молекулярная масса составляет 110 кДа. α-субъединица R-ФЦ содержит одну хромофорную группу ФЦБ, тогда как β-субъединица – по одному ФЦБ и ФЭБ. Благодаря присутствию в молекуле R-ФЦ ФЭБ, он обладает более пурпурной окраской, чем чисто голубой C-ФЦ, и флуоресцирует красным цветом [46]. Аллофикоцианины – синие белки с максимумами поглощения от 585 до 650 нм. Известно несколько форм АФЦ. Наиболее схожие из них имеют максимум поглощения при 650 нм. АФЦ несет только ФЦБ хромофор по одному на каждой субъединице. Он сохраняет α- и β-субъединицы с очевидной структурой (αβ)3 и имеет светло-голубую окраску [43, 47]. ФБП обладают яркой окраской и интенсивной флуоресценцией, поэтому находят широкое применение в иммунофлуоресцентной диагностике, проточной цитометрии и других биологических исследованиях. Они весьма перспективны в косметической и пищевой промышленности, где преимущество использования натуральных красителей перед синтетическими достаточно очевидно [13]. Помимо этого, ФБП проявляют разнообразную биологическую активность [48]. Установлено, что ФЦ и АФЦ оказывают разрушительный эффект на свободные радикалы кислорода, а также реагируют с другими видами окислителей [15, 16, 17]. Было показано, что ФЦ, выделенный из спирулины, подавляет процесс перекисного окисления липидов в клетках живых организмов, являющийся одной из причин разрушения мембран, и ингибирует аллергические реакции организмов [19]. Установлено, что ФЦ обладает антикоагулирующей [18] и антивирусной активностями [49] и может применяться в качестве терапевтического средства в 17 лечении заболеваний, вызванных стрессом. В последние годы рассматривается возможность применения ФБП в качестве противоопухолевых препаратов [13]. Хлорофиллы – магнийзамещенные производные порфирина – природные пигменты, которые придают зеленую окраску наземным растениям и водорослям и являются основными компонентами процесса фотосинтеза. По своему химическому строению хлорофилл близок к пигменту крови человека – гемоглобину (рис. 2) [50]. Функциональное значение основных элементов структуры хлорофилла заключается в следующем: сопряженные двойные связи ответственны за избирательное поглощение световой энергии; центральный атом магния стабилизирует структуру молекулы, участвует в образовании ассоциатов молекулы хлорофилла с другими пигментами, белками, липидами, фосфолипидами и другими компонентами хлоропласта; фитол способствует ориентации молекул хлорофилла определенным образом в мембране. Фитол не участвует в поглощении света, но влияет на этот процесс, меняя ориентацию порфиринового ядра хлорофилла [51]. Рисунок 2 – Структура хлорофилла а Хлорофилл а, присутствующий в клетках красных водорослей, имеет максимум поглощения при 664 нм [52] и характеризуется лабильностью к действию различных физических и химических факторов, в том числе повышенной температуры и света [51]. Каротиноиды относятся к числу химических соединений, широко распространенных в растительном и животном мире. По своей химической природе каротиноиды представляют собой изопреноиды – чрезвычайно обширную 18 группу веществ, молекулы которых состоят из различного числа звеньев изопрена C5H8. Каротиноиды содержат 8 звеньев изопрена и являются тетратерпенами. Для соединений этого класса характерна система сопряженных двойных связей, а на каждом конце молекулы наличие замещенного циклогексенового (иононового) кольца (рис. 3). Эти кольца могут быть одинаковыми, как в ликопине, β-каротине, или разными, как в α-каротине, лютеине и эхиненоне [53]. А Б В А— β-каротин, Б — α-каротин, В — лютеин Рисунок 3 – Структуры каротиноидов Каротиноиды участвуют в поглощении света растениями (антенная функция), играют большую защитную роль в процессах фотосинтеза, а также предохраняют реакционный центр от мощных потоков энергии при высоких интенсивностях света и стабилизируют липидную фазу тилакоидных мембран, защищая ее от переокисления (фотопротекторная функция) [50]. Эти пигменты преимущественно поглощают свет в зеленой области спектра, там, где хлорофилл имеет слабое поглощение. В живых организмах каротиноиды действуют как фотопротекторы [54] и антиоксиданты [55], на молекулярном и клеточном уровне предотвращают 19 трансформации, индуцированные окислителями, генотоксическими веществами, рентгеновским и ультрафиолетовым (УФ) излучениями [56, 57]. 1.3. Факторы, влияющие на содержание фотосинтетических пигментов красных водорослей Фотосинтезирующие организмы, в частности красные водоросли, являются динамическими системами, способными реагировать на изменения окружающей среды. Эти изменения затрагивают структуру фикобилисом, их светопоглощающую способность и способность к переносу энергии [43]. Адаптивные перестройки, происходящие в водорослях в ответ на изменение параметров среды обитания (освещение, температура, концентрация биогенных элементов в морской воде) для поддержания жизнеспособности растений, сопровождаются изменениями в количестве и соотношении пигментов светособирающего комплекса [24, 26]. В связи с этим, изучение содержания фотосинтетических пигментов в процессе адаптивных перестроек водорослей позволяет оценить водорослей в возможные течение их механизмы, вегетационного регулирующие периода, и продуктивность представляет как фундаментальный, так и прикладной интерес. Несмотря на то, что накопление пигментов в талломах водоросли определяется целым набором факторов, основными параметрами среды, влияющими на количественный состав пигментов, являются освещение и температура воды. При попадании в условия высокой освещенности растению необходимо акклиматизироваться, избегая при этом ингибирования фотосинтеза и разрушения фотосинтетического аппарата [25], тогда как при низкой освещенности водоросли должны поглотить как можно больше света для сохранения своей жизнеспособности. В регуляции этих процессов участвуют фикобилипротеины и каротиноиды. На данный момент исследования, посвященные влиянию различных факторов на содержание пигментов красных макроводорослей, весьма немногочисленны. В отдельных экспериментах показано, что при увеличении интенсивности света увеличивается содержание некоторых каротиноидов в клетках и талломах водоросли. Показано, что апикальные части талломов Laurencia 20 pinnatifida [58] и Gracilaria compressa [59], подверженные действию ФАР высоких интенсивностей, содержат высокие концентрации каротиноидов. Длительное пребывание водных растений при повышенной интенсивности света (неодинаковой для разных видов) приводит к уменьшению содержания фотосинтетических пигментов [60]. На примере красной водоросли L. pinnatifida показано, что высокие интенсивности падающего света понижают содержание ФБП на единицу ее биомассы [58]. Подобные результаты получены на морской красной водоросли Palmaria palmata [61]. Водоросль Gracilaria lemaneiformis, растущая на глубине, содержит в 2-3 раза больше ФЭ и хлорофилла а, чем водоросль, произрастающая в верхних слоях воды [62]. Предполагается, что у водоросли Gracilaria domingensis, произрастающей в Бразилии, увеличение количества ФБП при уменьшении освещенности связано с оптимизацией поставки световой энергии, а, следовательно, и скорости фотосинтеза [25, 63]. В то же время, высокий уровень ФАР способствует увеличению содержания каротиноидов, что может быть связано с непосредственной их функцией как фотопротекторов фотосинтетического аппарата водоросли [63]. Аналогичная обратно пропорциональная зависимость между содержанием ФБП и освещенностью отмечена и для водорослей P. palmata и Devaleraea ramentacea, произрастающих у берегов Норвегии [24]. Известно, что фотоны УФ излучения, особенно УФ-Б часть спектра, действуют на биологические процессы на всех уровнях их организации от молекулярного до экосистемного, в первую очередь, нарушая функцию белоксинтетического аппарата [64]. В последнее время достаточно большое количество работ показывает, что увеличение УФ радиации вызывает многочисленные повреждения ДНК, белков, замедляет рост растений, а также может снижать фотосинтетическую активность, как водорослей, так и фитопланктона, изменять соотношения фотосинтетических пигментов [64]. Так, было показано, что в результате совместного длительного воздействия ФАР и УФ на водоросли Laurencia catarinensis и Palisada flagellifera происходило значительное снижение ФБП и наблюдались изменения в структуре тилакоидных мембран [65]. При исследовании красной водоросли Corallina elongata [66] было установлено, что интенсивность и спектральный состав света оказывают существенное влияние на содержание фотосинтетических пигментов. 21 Под воздействием высоких интенсивностей освещения и зеленого света отмечалось повышение содержания ФБП, тогда как количество хлорофилла а увеличивалось при красном свете и высоких интенсивностях освещения [66]. Температура воды оказывает большое влияние на сезонное развитие водорослей, на суточную ритмику, а также может изменять потребности растительных организмов в свете, замедлять или активизировать их метаболические процессы [67]. Известно, что изменение в содержании пигментов также происходит при изменении температурного режима в месте обитания растений. При снижении температуры воды количество пигментов уменьшается, а при повышении температуры воды их концентрация увеличивается [68]. Показано, что снижение содержания фикобилинов у красных водорослей умеренных широт происходит при повышении температуры воды до 20°С, в то время как для биосинтеза хлорофилла а такая температура является оптимальной. У красных водорослей Gelidium sesguipedale [69] и Chondracanthus chmissoi [70] максимальное содержание каротиноидов и ФБП зарегистрировано при 18 и 25°С соответственно. Установлено, обесцвечивание что температурный фотосинтетических стресс пигментов может морских вызывать резкое макрофитов. На пресноводных красных водорослях было показано достоверное снижение ФЭ и ФЦ при повышении температуры воды до 20-25ºС [71]. Подобный феномен был также отмечен у красной тропической макроводоросли Corallina officinalis при повышении температуры воды до 30ºС [72]. Недостаток или избыток азота в морской воде и соленость также могут оказывать влияние на процессы синтеза фотосинтетических пигментов у морских красных водорослей [25, 73, 74]. Сведения о влиянии солености на содержание фотосинтетических пигментов ограничены небольшим числом работ. Показано, что снижение солености до 15% вызывает обесцвечивание талломов арктических красных макроводорослей D. ramentacea и P. palmata [75]. Для водоросли Hypnea cervicornis наиболее оптимальными условиями для накопления ФБП являются соленость 25-40‰ и температура воды 20-25°С, тогда как при высоких и низких солености и температуре воды наблюдалось достоверное снижение их количества [76]. В то же время для водоросли Gracilaria crassa максимальное содержание ФЭ 22 отмечено при значениях солености и температуры воды 25‰ и 35°С соответсвенно, а ФЦ – при 30‰ и 30°С соответсвенно [77]. 1.4. Химическая структура полисахаридов красных водорослей Основными структурными компонентами клеточной стенки красных водорослей являются сульфатированные полисахариды – агары и каррагинаны. В основе их структуры лежит повторяющееся дисахаридное звено, состоящее из остатков D-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися β-(1→4) и α-(1→3) гликозидными связями. Большое структурное разнообразие данных полисахаридов обусловлено тем, что 4-О-замещенный моносахаридный остаток может быть представлен как галактозой, так и ее 3,6-ангидропроизводным. Если 1,4-связанные остатки 3,6-ангидропроизводного находятся в L-форме, то полисахариды относятся к группе агара (рис. 4). В каррагинанах 1,4-связанные остатки 3,6-ангидрогалактозы имеют D-конфигурацию [1, 4]. OH HOH2C HOH2C O OH OH O OH O O OH O CH2OH O O O OH OH агаран агароза O Рисунок 4 – Структура основных дисахаридных звеньев агара Гидроксильные группы этих полисахаридов могут быть сульфатированы, метилированы или замещены остатками пировиноградной кислоты [2]. Полисахариды группы агара, как правило, сильнее метоксилированы и менее сульфатированы, чем каррагинаны [1, 78]. В агаре содержание сульфатных групп составляет 6-9% в зависимости от вида водоросли, а в каррагинане количество сульфатов значительно варьирует в зависимости от типа каррагинана. Так, например, в κ-типе каррагинана может содержаться до 20% сульфатов, в то время как в λ-каррагинане их количество достигает 40% [9]. Из водорослей рода Callophycus (Solieraceae) был выделен полисахарид, содержащий высокое количество пировиноградной кислоты [79]. Пировиноградная кислота образует циклические ацетали при С-4 и С-6 остатка галактозы, которые часто встречаются 23 в дисахаридных звеньях α- и θ-каррагинана [79, 80]. Гидроксильные группы агара могут быть замещены моносахаридными остатками, такими как 4-О-метил-Lгалактоза и D-ксилоза [81]. Небольшие количества ксилозы могут присутствовать и в каррагинанах [10]. Наличие остатков ксилозы при С-6 1,3-связанной β-Dгалактозы или при С-3 1,4-связанной α-D-галактозы характерно, как правило, для водорослей семейства Corallinaceae [82, 83, 84] и Solieriaceae [85] соответственно. Регулярные полисахариды, молекулы которых построены из дисахаридных повторяющихся звеньев одного типа, получили собственные названия согласно номенклатуре, предложенной D.A. Ress в 1963 году, где греческими буквами обозначены «предельные» или идеализированные структуры [4]. Так было установлено несколько идеализированных структур каррагинанов, что позволило разделить их на «типы», различающиеся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп [86, 87, 88]. В соответствии со структурными особенностями дисахаридного повторяющегося звена выделяют шесть главных типов каррагинанов, имеющих практическое применение: κ, λ, ι, ν, μ, θ (рис. 5). Каррагинаны μ, ν, λ при ферментативной и щелочной модификации могут быть превращены в κ, ι, θ соответственно в результате образования 3,6ангидромостика из α-галактозы 6-сульфата [20]. Рисунок 5 – Структура основных типов дисахаридных звеньев каррагинана Природные полисахариды редко соответствуют регулярным структурам. Чаще всего они содержат повторяющиеся дисахаридные звенья нескольких типов 24 каррагинанов [1, 5]. В процессе многоступенчатого биосинтеза полисахаридов в клеточной стенке водоросли может образовываться комбинация различных идеализированных каррабиозных звеньев, распределенных вдоль полимерной цепи, что приводит к образованию сложных гибридных структур. Считается, что первым биосинтетическим шагом является формирование главной цепи из остатков галактозы. На втором этапе происходит сульфатирование галактозных остатков и введение других заместителей. На завершающем этапе сульфат при С-6 1,4-связанной α-галактозы ферментативно элиминируется с образованием 3,6ангидро-цикла. Биосинтез может завершиться на любом этапе, поэтому конечным продуктом могут быть полисахариды как с регулярной, так и нерегулярной структурой [20, 89, 90]. Среди галактанов, имеющих так называемую блочную или гибридную структуру, следует выделить полисахарид из водоросли Mastocarpus stellatus, представляющий собой κ/ι-каррагинана с незначительными количествами биосинтетических предшественников – μ- и ν-каррагинанов [91]. Установлено, что водоросль Stenogramme interrupta с цистокарпами продуцирует желирующий ι/αкаррагинан [92], а желирующий полисахарид из дальневосточной водоросли Tichocarpus crinitus представляет собой κ/β-каррагинан [93]. В последние несколько лет в литературе появляется все больше и больше информации о полисахаридах красных водорослей, которые имеют D/L-гибридную структуру, то есть содержат агар и каррагинан одновременно. К таким водорослям относится Grateloupia indica, принадлежащая к порядку Halymeniales (Halymeniaceae) [94], Digenea simplex из порядка Ceramiales (Rhodomelaceae) [95], Lomentaria catenata порядка Rhodymeniales (Lomentariaceae) [96], Callophyllis variegate порядка Gigartinales (Kallymeniaceae) [97], а также представители рода Ahnfeltiopsis, принадлежащие семейству Phyllophoraceae, порядку Gigartinales [98]. При этом в зависимости от того D- или L-конфигурация 3,6-ангидрогалактозы преобладает, D/L-гибриды подразделяются (преобладает D-конфигурация на каррагинан 3,6-ангидрогалактозы) и агар D/L-гибриды D/L-гибриды (преобладает L-конфигурация 3,6-ангидрогалактозы). Так, например, красная водоросль Gymnogongrus torulosus содержит главным образом каррагинан D/Lгибриды с незначительными количествами агара [99]. В то же время в красной 25 водоросли D. simplex был найден полисахарид, представляющий собой агар D/Lгибрид [95]. Кнутсоном с соавторами [3] для обозначения гибридных структур полисахаридов и их соответствующих олигосахаридных фрагментов была предложена новая номенклатура или буквенный код, где 1,3-связанный остаток галактозы обозначается буквой G и 1,4-связанный остаток галактозы и 3,6ангидрогалактозы – D и DA соответственно для каррагинана и L и LA для агара (табл. 1). Таблица 1 – Обозначения по новой номенклатуре и IUPAC Буквенный код Полное название (IUPAC) D 4-α-D-галактопиранозил DA 4-3,6-ангидро-α-D-галактопиранозил L 4-α-L-галактопиранозил LA 4-3,6-ангидро-α-L-галактопиранозил G 3-β-D-галактопираноза S сульфатные группы M О-метил P 4,6-О-(1-карбоксиэтилиден) Помимо сульфатированных галактанов в красных водорослях присутствуют и глюканы, выполняющие роль запасных веществ, а также нейтральные структурные полисахариды – ксиланы [39]. Высокомолекулярный глюкан, построенный из остатков D-глюкопиранозы, соединенных α-(1→4) гликозидной связью с ответвлениями в положении 6, известен как флоридный крахмал [100], хотя позднее был предложен наиболее верный термин «флоридный гликоген» [101]. Считается, что флоридный крахмал структурно идентичен амилопектину и гликогену, но в отличие от них имеет промежуточную степень разветвленности и среднюю длину линейной цепи 14-18 остатков глюкозы [102]. Крахмал красных водорослей отличается от крахмала зеленых водорослей и растений отсутствием амилозы, а также его локализацией в клетке. Установлено, что флоридный 26 крахмал, как и гликоген, биосинтезируется и накапливается в цитозоле, тогда как крахмал растений хранится в пластидах [103]. Ксиланы – это нейтральные структурные полисахариды красных водорослей, линейные цепи которых построены из остатков D-ксилопиранозы, соединенных β(1→4) гликозидной связью, перемежающиеся одиночными остатками D- ксилопиранозы, соединенными β-(1→3) гликозидной связью [104]. Показано, что соотношение между (1→3) и (1→4) связями составляет 1:4, однако менее растворимые фракции, экстрагируемые щелочью, содержат больше 1,4-связанной β-D-ксилозы вплоть до чистого (1→4)-β-D-ксилана. Как правило, содержание ксиланов в клеточной стенке водорослей по сравнению с сульфатированными галактанами оказывается незначительным, за исключением водорослей порядков Palmariales и Nemaliales, у которых ксилан является основным полисахаридом [39]. 1.5. Особенности структурного анализа полисахаридов красных водорослей Еще около 40 лет назад установление структуры полисахаридов представлялось весьма длительной и трудоемкой задачей. Постепенно с развитием и усовершенствованием физико-химических методов анализа исследование структуры полисахаридов значительно облегчилось. В настоящее время для этих целей используют классические методы химии углеводов, комбинирование методов структурной химии и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (спектроскопии ЯМР), методы химической и ферментативной модификации, хроматографические методы (газо-жидкостная высокоэффективная жидкостная хроматография хроматография (ВЭЖХ), (ГЖХ), гельпроникающая хроматография), а также методы световой микроскопии и электрофорез [2, 105, 106, 107, 108, 109]. В последние годы для установления тонкой структуры полисахаридов стали использовать различные виды масс-спектрометрии [110, 111]. Использование тандемной масс-спектрометрии позволило подтвердить гибридную структуру желирующего полисахарида из T. crinitus и уточнить структурные особенности этого полисахарида [112]. 27 1.5.1. Химические методы Для определения содержания моносахаридов (МС), установления моносахаридного состава в образцах полисахаридов, определения местоположения заместителей и вида гликозидных связей используют разнообразные химические методы в сочетании с методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) [113]. Для анализа полисахаридов методом ГЖХ их подвергают гидролизу до МС с последующим получением летучих производных [10]. Как правило, для гидролиза используют серную и трифторуксусную (ТФУ) кислоты, но предпочтение отдают более летучей и легко удаляемой ТФУ. Преимуществом данного метода является его высокая чувствительность и использование небольшого количества вещества. Недостатки связаны, в основном, со стадиями получения производных сахаров, когда восстановление или ацетилирование могут пройти не полностью [113]. Использование химических методов при установлении структуры галактанов красных водорослей имеет ряд особенностей, связанных с присутствием 3,6ангидрогалактозы и сульфатных групп. 3,6-ангидрогалактоза, найденная в природе только в красных водорослях, отличается большой склонностью к деградации в кислой среде, и поэтому в условиях кислотного гидролиза она разрушается полностью [2]. Для ее сохранения можно использовать восстановительный кислотный гидролиз с добавлением восстановителя – 4-метил-морфолинборана, устойчивого в кислой среде. Хотя этот реагент разрушается при нагревании с кислотой, гидролиз гликозидных связей остатков 3,6-ангидрогалактозы происходит быстрее, и освобождающиеся альдегидные группы успевают восстановиться, давая устойчивый к кислотам 3,6-ангидродульцит [2]. В настоящее время существуют разнообразные методы гидролиза полисахаридов, а также способы получения производных в зависимости от условий проведения (время и температура) [114, 115]. Так, например, Хама с соавторами разработали метод определения компонентов МС галактанов красных водорослей, включая 3,6-ангидрогалактозу, в виде диэтилдитиоацеталей (диэтилмеркапталей) в результате ангидромеркаптолиза. В отличие от ранее использованной HCl в этантиоле, Хама предложил другую систему растворителей для меркаптолиза, содержащую дополнительно метанол в объемном соотношении этантиол:метанол 2:1, что позволяло получить диэтилмеркаптали 28 МС без образования метилгликозидов [115]. Преимуществом разработанного метода является отсутствие в продуктах реакции аномерных и структурных изомеров. Немного позже был предложен достаточно простой метод, включающий последовательное проведение ангидромеркаптолиза. В мягкого результате восстановительного такого гидролиза гидролиза и остатки на МС восстанавливающих и невосстанавливающих концах могут быть определены либо как спирты, либо как диэтилдитиоацетали соответственно [114]. Для определения соотношения энантиомеров 3,6-ангидрогалактозы был разработан метод, включающий окислительный гидролиз для получения соответствующих альдоновых кислот, устойчивых к реакционной среде, с последующим их превращением в ацетилированные диастереомерные третбутиловые эфиры, которые можно разделить с помощью ГЖХ [116]. Однако данный метод является весьма трудоемким и включает большое количество стадий. Позже Наварро предложил другой метод установления конфигурации 3,6ангидрогалактозы, основанный на процессе двойного гидролиза, включая восстановительное аминирование ангидросахара с хиральным амином α- метилбензиламином (МБА) [117]. Полученные в результате пятистадийного процесса производные 3,6-ангидрогалактозы с D- и L-конфигурациями хорошо разделимы с помощью ГЖХ. Кроме того, этим автором был разработан метод для количественного определения энантиомеров, включающий щелочную обработку, мягкий гидролиз, восстановительное аминирование, полный гидролиз и получение производных [117]. Для определения местоположения заместителей и характера связи используют метод метилирования [10]. Данный метод состоит из метилирования полисахаридов метилйодидом в сильноосновной среде с последующим кислотным гидролизом, в результате которого разрушаются гликозидные связи без деградации ангидрокольца. десульфатирования Для предотвращения полисахариды чаще неполного всего метилирования используют в форме и их тетраэтиламмониевых солей [10]. Кроме полного восстановительного гидролиза используют также частичный восстановительный гидролиз, в результате которого получают не МС, а дисахариды и их производные [2, 118]. Этот метод применяют, как правило, для 29 отнесения полисахарида к группе агара или каррагинана, поскольку ацетаты каррабиита и агаробиита хорошо разделяются методом ГЖХ, что позволяет определить абсолютную конфигурацию 3,6-ангидрогалактозы [12]. Высокая чувствительность гликозидных связей 3,6-ангидрогалактозы к действию кислоты позволяет проводить частичный гидролиз галактанов и использовать полученные структурного анализа. значительно влияет в результате Однако на олигосахариды различное стабильность положение гликозидных для дальнейшего сульфатных связей. В групп результате автогидролиза каррагинанов было показано, что связи между 3,6-ангидро-αгалактозой 2-сульфат и β-галактозой 4-сульфат или между α-галактозой 2,6дисульфат и β-галактозой 4-сульфат расщепляются первыми, на следующем этапе происхот потеря сульфатных групп при С-2, тогда как 3,6-ангидро-α-Dгалактозные связи расщепляются гораздо медленнее [119, 120, 121]. Вследствие этого, мягкий гидролиз приводит к образованию сложной смеси фрагментов, в которых сульфатные группы, как правило, сохраняются. Частичный кислотный гидролиз успешно каррабиозы применяют и 4-сульфат для получения карратетраозы агаробиозы, агаротетраозы, 4,4'-дисульфат для масс- спектрометрического анализа [111]. Кроме того, олигосахариды с нечетным числом МС остатков, содержащие галактозу на восстанавливающем и невосстанавливающем концах, могут быть получены в результате частичного кислотного гидролиза агарозы [122]. При отсутствии 3,6-ангидрогалактозы невозможно использовать восстановительный гидролиз для частичной деполимеризации полисахарида [12]. 1.5.2. Физико-химические методы 1.5.2.1. ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием В 1950-х годах инфракрасные спектры (ИК-спектры) большинства углеводов были описаны при попытке соотнести различия в структуре моно-, олиго- и полисахаридов [107]. Обнаружено, что аномерные формы гликозидов легко различимы в ИК-спектрах, а частоты от 1240 до 820 см-1 указывают на распределение сульфатных групп, присутствующих в гиалуроновой кислоте и 30 мукополисахаридах. Позже, данный метод стали применять для анализа сульфатированных полисахаридов красных водорослей. Открытие в 1965 г. метода быстрого Фурье преобразования позволило разработать новое поколение ИК-спектрометров с Фурье-преобразованием, оснащенных программным обеспечением, способным выполнять обработку спектральных данных. Этот метод является быстрым, не требует больших количеств веществ и в результате анализа вещество не разрушается, что, несомненно, является преимуществом метода. В ИК-спектрах углеводов можно выделить пять областей. Область 3600-2800 см-1 соответствует валентным колебаниям O-H и C-H, тогда как область 1500-1200 см-1 относится к области локальной симметрии. Полосы поглощения при 1200-950 см-1 отражают C-O валентные колебания, область 950-700 см-1 называют областью «отпечатков пальцев» или аномерной, область ниже 700 см-1 – скелетная область [107]. Идентификация структур агара и каррагинана в полисахаридах красных водорослей с помощью ИК-спектроскопии основана на присутствии характеристических полос поглощения, связанных с 3,6-ангидрогалактозой и сульфатными группами (вибрации заместителей) (табл. 2) [107]. Таблица 2 – Характеристические полосы поглощения в ИК-спектрах галактанов красных водорослей [107, 123, 124] Группа Частота, см-1 Общее содержание SO42- (-S=O) 1240-1260 С-Н галактозы 970-975 С-О 3,6-ангидрогалактозы 930 С-Н несульфатированной β-D-галактозы 890-900 C-O-S первичной экваториальной SO42- при С-6 β-D-галактозы 867 C-O-S вторичной аксиальной SO42- при С-4 β-D-галактозы 845 C-O-S вторичной экваториальной SO42- при С-2 β-D-галактозы 825-830 C-O-S первичной экваториальной SO42- при С-6 α-D-галактозы 815-820 C-O-S вторичной аксиальной SO42- при С-2 3,6-ангидрогалактозы 31 805 Интенсивная полоса поглощения в ИК-спектре при 1240-1260 см-1 связана с общим содержанием сульфатных групп и характеризует их валентные колебания, тогда как полоса поглощения при 1070 см-1 относится к скелетным колебаниям углеводного кольца. Помимо этого, в ИК-спектрах сульфатированных полисахаридов присутствуют и менее интенсивные полосы поглощения в области 800-850 см-1, более точное положение которых зависит от природы окружения сульфатной группы. Первичный, вторичный экваториальные и вторичный аксиальный сульфаты поглощают при 820, 830 и 850 см-1 соответственно [125]. Полоса поглощения при 930 см-1 указывает на присутствие 3,6-ангидрогалактозы (С-О вибрация), интенсивная полоса поглощения при 845 см-1 связана с присутствием вторичной аксиальной сульфатной группы при С-4 1,3-связанной βD-галактозы, при 820 и 805 см-1 – с наличием первичной экваториальной сульфатной группы при С-6 1,4-связанной α-галактозы, характерной для λкаррагинана, и вторичного аксиального сульфата при С-2 1,4-связанной 3,6ангидро-α-галактозы, характерного для ι-каррагинана, соответственно (табл. 2) [123, 126]. Полоса поглощения при 890-900 см-1 указывает на наличие несульфатированной галактозы (C-H вибрация) и присутствует в ИК-спектрах как агара [124], так и α- и β-типов каррагинана [123]. Наличие в спектре полосы поглощения при 825 см-1 связано с деформационными колебаниями C-O-S вторичной экваториальной сульфатной группы при С-2 галактозы, что характерно для θ-каррагинана. В несульфатированом β-каррагинане отсутствуют полосы поглощения при 1240-1260 см-1. Полоса поглощения при 930 см-1 отсутствует в спектрах μ-, ν-, λ-каррагинанов, поскольку они не содержат 3,6-ангидрогалактозы [123]. Соотношение площадей полос поглощения при 805 и 845 см-1 к 1250 см-1 позволяет рассчитать содержание сульфатных групп [127]. Метод вторых производных в ИК-спектрах дает больше информации о структуре полисахарида за счет увеличения количества и разрешения полос поглощения по сравнению с исходными спектрами [39]. Было установлено, что ИК-спектры вторых производных агара и каррагинана имеют характеристические полосы в области 1600-500 см-1, что может быть использовано для определения принадлежности исследуемого полисахарида к группе агара или каррагинана [107]. Полисахариды группы агара могут быть 32 идентифицированы на основе характеристических полос поглощения в области 1000-650 см-1, особенно по двум полосам поглощения в области 790 и 717 см-1. Агары, в отличие от каррагинанов, не имеют полос поглощения после 680 см-1. Каррагинаны дают характеристические полосы поглощения при 1170, 1140, 1100, 1070, 1040, 1008, 610 и 580 см-1 [107]. Серия полос поглощения в области 1160-1000 см-1 появляется благодаря валентным колебаниям сульфатных групп. Полосы поглощения при 770, 740 и 693 см-1 могут быть связаны со скелетными изменениями пиранозного кольца и присутствуют как в агарах, так и в каррагинанах [128]. 1.5.2.2. Спектроскопия 13С ЯМР Спектры 1Н и 13 С ЯМР дают более полную информацию о составе и строении полисахаридов, чем ИК-спектры. Использование 13С ЯМР спектроскопии для установления первичной структуры галактанов красных водорослей было предложено в 1978 г. [129]. Спектры 13С ЯМР характеризуются довольно большим диапазоном химических сдвигов атомов углерода, и даже небольшие изменения в окружении атомов углерода вызывают ощутимое изменение значений химических сдвигов. В связи с этим, спектроскопия 13С ЯМР, по сравнению со спектроскопией 1 Н ЯМР, явлется наиболее информативным методом при установлении структуры гибридных полисахаридов. Так, например, замещение атома кислорода МС остатка (гликозилирование, метилирование или сульфатирование) приводит к сдвигу сигнала на 6-11 м.д. в область слабого поля для атома углерода, несущего заместитель (α-эффект замещения), и на 2-4 м.д. в область сильного поля для двух соседних атомов (β-эффект) [39]. Образование 3,6-ангидрокольца, которое можно рассматривать как продукт внутримолекулярного замещения одновременно при О3 и О-6 остатка галактозы, вызывает конформационную инверсию пиранозного кольца и значительное изменение в химических сдвигах всех атомов углерода по сравнению с исходным галактопиранозным остатком. Таким образом, спектры ЯМР регулярных полисахаридов соответствуют спектрам дисахаридов 13 С и представляют собой 12 хорошо разрешенных сигналов. В настоящее время спектроскопия 13 С ЯМР широко используется для установления принадлежности полисахарида к группе агара или каррагинана, имеющего характерные резонансы в аномерной области [10]. Аномерные атомы 33 углерода 3,6-ангидро-D-галактозы имеют химические сдвиги при 95-96 м.д., в то время как аномерные атомы углерода 3,6-ангидро-L-галактозы – при 98 м.д. Химические сдвиги в спектрах 13 С ЯМР наиболее распространенных типов каррагинанов [106] и агаранов [130, 131] представлены в таблице 3. Таблица 3 – Химические сдвиги в спектрах 13С ЯМР основных структурных единиц коммерческих каррагинанов и агаранов [106, 131] Полисахарид МС Химические сдвиги (м. д.) остаток С-1 С-2 С-3 С-4 С-5 С-6 κ-каррагинан G4S 102,5 69,6 78,9 74,1 74,8 61,3 DA 95,3 69,9 79,2 78,3 76,8 69,5 ι-каррагинан G4S 102,2 69,3 76,8 72,2 74,8 61,3 DA2S 92,1 75,0 77,8 78,3 77,0 69,8 λ-каррагинан G2S 103,4 77,4 75,8 64,2 74,2 61,3 D2S,6S 91,6 74,8 69,5 80,3 68,7 68,1 агароза G 102,3 70,2 82,2 68,7 75,3 61,4 LA 98,2 69,9 80,0 77,3 75,6 69,3 агар G 103,7 70,0 81,2 68,8 75,9 61,4 L 100,9 69,4 71,0 79,3 72,2 61,2 Примечание: G – β-D-галактоза, DA – 3,6-ангидро-α-D-галактоза, LA – 3,6-ангидро-α-L-галактоза, D – α-D-галактоза, L – α-L-галактоза, S – сульфатная группа Для получения хорошо разрешенного спектра ЯМР образец полисахарида обрабатывают ультразвуком и снимают спектр при повышенной температуре с целью уменьшения вязкости раствора полимера [106]. Значения химических сдвигов рассчитывают относительно таких внутренних стандартов, как диметилсульфоксид (ДМСО), тетраметилсилан (ТМС) и метанол [132]. Недостатком ТМС, затрудняющим его широкое использование, является плохая растворимость в полярных растворителях, даже таких, как вода. В связи с этим, комиссия ИЮПАК предложила использовать 2,2-диметил-2-силапентан3,3,4,4,5,5-d6-5-сульфонат спектроскопии 1Н и 13 натрия (ДСС) в качестве единого эталона для С ЯМР в сильно полярных растворителях [132]. Следует отметить, что химические сдвиги спектров 13 С ЯМР для галактанов относительно ДСС оказываются в среднем на 2,1 м.д. больше, чем сдвиги относительно ТМС, в 34 то время как в спектрах 1Н ЯМР химические сдвиги незначительно отличаются от тех, что были получены ранее. Спектроскопия 13 С ЯМР имеет невысокую чувствительность, поэтому информация о минорных компонентах полисахаридов может быть недоступна. Тем не менее, остатки пировиноградной кислоты, входящие в состав сложных полисахаридов, можно определить по характерным сигналам их атомов углерода вместе с 1,3-связанной D-галактозой [106]. Помимо этого анализ спектров 13 С ЯМР дает информацию о некоторых заместителях, присутствующих в полисахаридах. Так, например, 1,3-связанная 6-Ометил-D-галактоза дает характеристический сигнал при 59,0 м.д., соответствующий ОМе группе. Сигналы при 71,8 и 73,3 м.д. свидетельствуют о присутствии ОН-группы, метилированной при С-6 и С-5 1,3-связанной Dгалактозы соответственно. Резонансный сигнал при 78,7 м.д. указывает на наличие метильной группы при С-2 3,6-ангидрогалактозы [133]. В водорослях присутствует в различных количествах флоридный крахмал, который дает резонанс в аномерной области при 100,2 м.д., соответствующий С-1 глюкозы. Иногда сигнал при 100,0 м.д. появляется в спектре благодаря сульфатированному агару, являющемуся предшественником гелеобразующих полисахаридов [133]. Достоинством спетроскопии информативность [106]. сульфатированных полисахаридов 13 С ЯМР Количественное основано является определение на его высокая состава интенсивности смеси резонансов аномерных атомов углерода обоих колец дисахаридного звена. Спектры 13 С ЯМР гибридов каррагинанов и D/L-гибридов являются очень сложными, и поэтому не могут быть однозначно интерпретированы без проведения дополнительной химической модификации. Так, для структурного анализа сложных галактанов, в молекуле которых встречается несколько различных повторяющихся звеньев, сопоставлении спектров предложен 13 новый подход, заключающийся в С ЯМР нативного полисахарида, продукта его метилирования и продуктов десульфатирования этих двух полимеров [134]. 35 1.5.2.3. Спектроскопия 1Н ЯМР Количественный анализ различных типов каррагинанов с помощью спектроскопии 1Н ЯМР основывается на положении и интенсивности резонансов аномерных атомов водорода чередующихся единиц 1,4-связанной α-D-галактозы и 3,6-ангидро-α-D-галактозы в области 5,1-5,7 м.д. С другой стороны, сигналы аномерных атомов водорода 1,3-связанной β-D-галактозы не подходят для идентификации или количественного анализа, поскольку считается, что 1,3связанная β-галактоза одинакова в κ- и ι-каррагинанах, давая сигналы в схожих областях [10]. Химические сдвиги в спектрах 1 Н ЯМР основных типов каррагинанов приведены в таблице 4. Таблица 4 – Химические сдвиги в спектрах 1Н ЯМР основных типов каррагинанов [106] Каррагинан κ ι λ κ ι λ Остаток 1,3-связанной β-D-галактозы Н-1 Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 Н-6,6' 4,75 3,74 4,10 4,95 3,93 3,93 4,73 3,73 4,07 5,00 3,89 3,92 4,71 4,60 Остаток 1,4-связанной 3,6-ангидро-α-D-галактозы или α-D-галактозы Н-1 Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 Н-6 экзо/Н-6 эндо 5,24 4,12 4,30 4,75 4,65 4,25/4,15 5,42 4,76 4,95 4,76 4,76 4,25/4,15 5,64 4,77 - Для полисахаридов, принадлежащих к группе агара, в спектрах 1Н ЯМР сигналы при 3,28 и 3,37 м.д. относятся к -CH3 6-О-метил-β-D-галактозы и 2-Ометил-3,6-ангидро-α-L-галактозы соответственно. Резонансы аномерных протонов при 4,98-5,13 м.д. принадлежат 1,4-связанной L-галактопиранозе [124]. Преимущество спектроскопии 1 Н ЯМР перед 13 С ЯМР заключается в высокой чувствительности метода, что позволяет анализировать меньшее количество вещества с меньшими затратами времени [106]. В последнее время для анализа сложных полисахаридов используются различные виды двумерной спектроскопии: 36 1 Н-1Н COSY (корреляционная спектроскопия), 1Н-1Н ROESY (спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат), 1H-13C HSQC (гетероядерная одноквантовая корреляция), которые позволяют провести отнесение сигналов протонов МС остатков и осуществить углерод-протонную корреляцию. Данные, полученные при анализе таких двумерных спектров, позволяют определить положение заместителей. Двумерная спектроскопия является важнейшим инструментом при установлении новых структур полисахаридов, не требующим проведения дополнительных химических модификаций. Таким образом, спектроскопия ЯМР позволяет отнести полисахарид к группе агара или каррагинана, идентифицировать различные типы каррагинанов, определить их молярное соотношение и содержание индивидуальных компонентов в смеси. 1.5.3. Ферментативные методы В настоящее время при анализе гибридных структур галактанов красных водорослей широко используют специфические ферменты – агаразы и каррагиназы. Ферментативный анализ является чувствительным методом, с помощью которого можно установить тонкие детали структуры, не идентифицируемые методами спектроскопии и химическими методами. Данный метод позволяет получить фрагменты полимера, состоящие из повторяющихся единиц, которые могут быть структурно целыми, и изучить их распределение вдоль полимерной цепи. Основными продуктами ферментативного гидролиза сульфатированных полисахаридов являются олигосахариды с определенной длиной цепи, для разделения которых используют высокоразрешенную хроматографию [135]. Агаразы – ферменты, катализирующие гидролиз агара [136]. Они подразделяются на α-агаразы, которые расщепляют α-(1→3) связи, образуя агароолигосахариды серии агаробиозы, и β-агаразы, которые специфичны к β(1→4) связям и неоагаробиозы. грамотрицательные приводят Источниками бактерии к получению этих классов неоагароолигосахаридов ферментов являются Gammaproteobacteria, серии морские (Pseudomonas, Alteromonas, Pseudoalteromonas, Vibrio, Alterococcus и другие), Bacteroides, 37 Flavobacteria (Flavobacterium, Cellulophaga и Zobellia), а также бактерии класса Sphingobacteria [137]. Большинство агараз синтезируются внеклеточно, за исключением тех, что продуцируются Pseudomonas atlantica и Thalassomonas sp. Следует отметить, что β-агаразы являются гораздо более распространенными, чем α-агаразы, продуцируемые только Alteromonas agarlyticus GJ1B из морской воды и Thalassomonas sp. JAMB-A33 из морских отложений. α-Агаразы принадлежат семейству гликозид гидролаз GH96, в то время как большинство β-агараз, наряду с каррагиназами, глюканазами, галактозидазами и ламинариназами, входят в семейство GH16 и лишь небольшая их часть составляет семейства GH50 и GH86 [136]. Интересно отметить, что Saccharophagus degradans продуцирует сразу пять β-агараз, принадлежащих к трем различным семействам, которые формируют комплексную агаролитическую систему [138]. Существует несколько способов расщепления агара ферментами. В одном случае, внеклеточная эндо-β-агараза I деполимеризует агарозу до неоагаротетраозы, которая затем расщепляется двумя ферментами периплазмы, βагаразой II и неоагаробиоз-гидролазой, приводя в конечном итоге к получению 3,6ангидро-L-галактозы и D-галактозы. В другом случае, бактерия секретирует две βагаразы, расщепляющие агарозу до неоагаробиозы и неоагаротетраозы соответственно, затем происходит их деградация под действием α-L-галактозидазы периплазмы, которая гидролизует α-(1→3) связи неоагароодигосахаридов с невосстанавливающих концов. Такой способ расщепления характерен для агараз из бактерии Vibrio sp. JT0107 [137]. Каррагиназы продуцируются бактериями, принадлежащими к классам Gammaproteobacteria, Flavobacteria и Sphingobacteria [137]. Несмотря на то, что все каррагиназы классифицируются по типу каррагинана, к которому проявляют специфичность, они расщепляют β-(1→4) связи. Так, κ-каррагиназа из Pseudoalteromonas carrageenovora, принадлежащая семейству GH16, расщепляет κкаррагинан до κ-неокарратетраозы сульфата и κ-неокаррабиозы сульфата, действуя согласно механизму сохранения аномерной конфигурации [139, 140]. Показано, что κ-каррагиназа специфична к дисахаридным звеньям, содержащим сульфатную группу при С-4 1,3-связанной β-D-галактозы [141]. 38 ι-Каррагиназа принадлежит семейству GH82, отличающемуся от семейства GH16, к которому относятся κ-каррагиназы [142]. ι-Каррагиназа (CgiA), выделенная из A. fortis, представляет собой правозакрученную β-спираль и расщепляет β-(1→4) связи согласно механизму инверсии аномерной конфигурации, приводя к образованию ι-неокарратетраозы сульфата и ι-неокаррагексаозы сульфата в качестве конечных продуктов [137, 142]. ι-Каррагинан распознается CgiA через ионное взаимодействие между сульфатными группами полисахарида и некоторыми аргининовыми остатками белка. κ- и ι-Каррагиназы действуют согласно процессивному способу, характер которого зависит от того, растворим ли субстрат или находится в гелевом состоянии. λ-Каррагиназа (CglA), выделенная из P. carrageenovora, является первым представителем нового семейства гликозид-гидролаз [142]. Активность данного фермента обусловлена наличием внеклеточного комплекса, состоящего из трех гидролаз. Позже из этого комплекса была выделена λ-каррагиназа, специфичная к каррагинанам λ-семейства: λ-, ξ- и π-каррагинаны, которая расщепляла β-(1→4) связи [137]. CglA действует согласно эндолитическому способу действия и механизму инверсии аномерной конфигурации [137]. Основными продуктами гидролиза λ-карагинана λ-каррагиназой являются нео-λ-карратетраоза и нео-λкаррагексаоза, которая, в свою очередь, расщепляется до нео-λ-карратетраозы и нео-λ-каррабиозы. Ферменты, гидролизующие α-(1→3) связи в каррагинанах, на данный момент еще не найдены. Следует отметить, что активность ферментов чувствительна к таким параметрам, как рН и температура среды [143]. Так, например, температура гелеобразования агара около 38°С, поэтому большинство агараз проявляют активность при температуре 30°С, за исключением бактерий Vibrio sp. JT0107 [144] и Alteromonas sp. C-1 [145]. Большинство ферментов нестабильны при высоких температурах. Кроме того, большинство агараз проявляют оптимальную активность при нейтральном и слабощелочном рН [136]. На данный момент существует немало работ, посвященных изучению гибридных структур каррагинана с использованием ферментативного гидролиза. Так, κ/ι-каррагинан, выделенный из G. skottsbergii, Chondracanthus chamissoi и C. crispus, был инкубирован с κ-каррагиназой из P. carrageenovora и с ι-каррагиназой 39 из A. fortis. В результате ферментативного гидролиза ι-каррагиназой были получены олигосахариды в незначительных количествах. Это указывает на то, что полимерная цепь κ/ι-каррагинана содержит небольшое количество дисахаридных звеньев ι-каррагинана. В то же время в результате ферментативного гидролиза κкаррагиназой были получены три основных продукта: блок κ-каррабиозы, κ/ιгибрид и фракция, содержащая большое количество ι-каррабиозы [146]. Инкубирование гибрида ι/ν-каррагинана, выделенного из Eucheuma denticulatum, с ι-каррагиназой из A. fortis привело к получению смеси олигосахаридов, состоящей из октасахарида ι-ι-ν-ι, двух декасахаридов – ι-ι-ι-ν-ι и ι[ι/ν]-ι-ι и додекасахарида ι-ι-ι-ι-ν-ι [147]. 1.6. Физико-химические свойства полисахаридов красных водорослей Широкое применение полисахаридов красных водорослей в различных областях промышленности обусловлено их способностью образовывать гели и повышать вязкость водных растворов, что определяется их химическим строением. Вместе с тем, взаимосвязь между химической структурой и физическими свойствами сульфатированных галактанов сложна и недостаточно изучена ввиду полидисперсности полисахаридов, их способности к самоассоциации. Известно, что вариации в структуре каррагинана и содержании заряженных сульфатных групп в его макромолекуле приводят к значительным изменениям физикохимических свойств полимера. Подобно другим полисахаридам для каррагинана и агара характерно молекулярно-массовое распределение. Большинство каррагинанов имеют молекулярную массу от 500 тыс. до 1 млн. Да, однако при этом они могут содержать до 25% полисахарида с молекулярной массой меньше 100 кДа [32, 148]. Средняя молекулярная масса коммерческого агара составляет от 80 до 140 кДа, в то время как средняя молекулярная масса агара из водорослей рода Gracilaria находится в пределах 176-420 кДа [78]. Вязкость водных растворов каррагинанов зависит от типов и молекулярной массы полисахарида, присутствия некоторых ионов и температуры. Подобно растворам других полиэлектролитов, вязкость растворов каррагинана уменьшается при повышении температуры и увеличении ионной силы раствора. В основном 40 каррагинаны образуют растворы с вязкостью 25-500 Мра, чаще всего 25-100 Мра, а нативный λ-каррагинан может давать растворы с вязкостью до 20 тыс. Мра [8]. Способность полисахаридов красных водорослей, подобно другим фикоколлоидам, образовывать в водных растворах гели является наиболее важным их физико-химическим свойством. По способности образовывать гели каррагинаны делятся на желирующие и нежелирующие. Нежелирующие – µ-, ν- и λкаррагинаны – содержат большое количество сульфатных групп и не содержат 3,6ангидрогалактозу, тогда как желирующие – κ-, ι-каррагинаны – содержат 3,6ангидрогалактозу и мало остатков серной кислоты, поэтому обладают хорошими гелеобразующими свойствами [20]. В зависимости от типа каррагинана конформация его молекул в растворе может быть разной. Нежелирующие полисахариды имеют конформацию хаотичного клубка (random coil), желирующие – конформацию двойной спирали, которая при определенных условиях может переходить в более сложно организованную структуру геля [149]. Переход раствора в гель происходит за счет межмолекулярных взаимодействии, при которых каждая молекула полимера кооперативно ассоциирует с несколькими другими. В результате происходит образование единой трехмерной сетки, состоящей из молекул растворенного полимера и заключенного в ней большого количества растворителя [8]. Главным условием гелеобразования является наличие в молекуле каррагинана остатков 3,6-ангидрогалактозы, которые придают полимерной цепи жесткость и обеспечивают спиральную конформацию, а также вполне определенное расположение сульфатных групп и присутствие специфических катионов. Желирующие свойства полисахаридов тем выше, чем выше содержание 3,6-ангидрогалактозы [1, 8]. Полисахариды с низким содержанием 3,6- ангидрогалактозы, такие как λ-каррагинан, не образуют гелей, но дают очень вязкие растворы и используются как загустители и стабилизаторы суспензий и эмульсий [11]. Наличие 3,6-ангидрогалактозы обуславливает излом линейной полимерной молекулы таким образом, что каждое дисахаридное звено оказывается повернутым относительно предыдущего [150]. «Зонами связывания» спиральных участков являются 1,4-связанный остаток 3,6-ангидрогалактозы, который придает необходимую жесткость, а также сульфатные группы 1,4-связанных остатков 3,641 ангидрогалактозы (сульфат при С-2) и 1,3-связанных остатков β-D-галактозы (сульфат при С-4), так как они проектированы наружу. В тоже время, сульфатные группы остатка 1,4-связанного остатка α-D-галактозы (6-сульфат или 2,6дисульфат) вызывают перекручивание цепи, что препятствует образованию геля. При удалении формирования сульфатов геля. цепь выпрямляется Добавление и специфических происходит катионов активация приводит к стабилизации геля и образованию единой трехмерной сетки [20, 151]. Замещение 3,6-ангидрогалактозы в полимерной цепи ее биологическими предшественниками препятствует образованию спиралей [81]. Можно значительно увеличить содержание 3,6-ангидрогалактозы в агаре или каррагинане путем щелочной обработки превращается в водоросли, в результате 3,6-ангидрогалактозу. При чего галактоза нагревании 6-сульфат полисахарида в сильнощелочной среде свободные ОН группы при С-3 ионизируются, и происходит процесс внутримолекулярного нуклеофильного замещения сульфатных групп в положении 6, вследствие чего гелеобразующая способность полисахарида увеличивается [10, 152]. Щелочную обработку широко используют при производстве агара из Gracilaria tenuistipitata и Gracilaria heteroclada, являющихся основными источниками агара во Вьетнаме [152]. Гелеобразующие свойства каррагинанов зависят не только от их химической структуры, но и концентрации полимера, природы добавляемого катиона, температуры раствора. Для каррагинанов характерна высокая специфичность взаимодействия с катионами, поэтому в присутствии даже близких по химическим характеристикам ионов свойства полимеров резко изменяются. κ-Каррагинан специфичен к ионам К+, а ι-каррагинан — к ионам Са2+. Катионы нейтрализуют отрицательно заряженные сульфатные группы, что уменьшает электростатическое отталкивание между полимерными цепями и способствует стабилизации гелей [10]. Однако для каждого типа каррагинана существует своя критическая концентрация добавляемого катиона и температура гелеобразования. Кроме того, для каждого типа каррагинана характерна определенная концентрация полимера, необходимая для формирования геля. Так, ι-каррагинан образует эластичные и сухие гели при довольно низкой, порядка 0,3%, концентрации полисахарида, а κкаррагинан формирует крепкие и ломкие гели при концентрации 0,5%. 42 Одним из наиболее важных свойств каррагинанов как желирующих, так и нежелирующих является взаимодействие с белками, которое осуществляется за счет ионного взаимодействия сульфатных групп каррагинана с заряженными группами белка. Реакция зависит от соотношения заряда белок:каррагинан, изоэлектрической точки белка, pH и соотношения масс полисахарид:белок [8]. Большинство каррагинанов обладает способностью формировать гели с молочными белками. При охлаждении горячего молока, содержащего каррагинан, гель образуется благодаря присутствию в молоке ионов К+ и Са2+ и взаимодействию сульфатных групп каррагинана с аминокислотными остатками молочных белков [7]. В отличие от ι- и κ-каррагинанов, нерастворимых в холодном молоке и образующих молочные гели только в процессе нагревания-охлаждения, λкаррагинан хорошо растворяется в холодном молоке, и эта его особенность находит широкое применение в молочной и кондитерской промышленностях [151]. В полисахаридах несульфатированная группы агароза [7]. агара наиболее Считают, что прочные гели гелеобразование дает агарозы происходит за счет перехода вытянутой спиральной конформации молекулы в растворе к жесткой упорядоченной двойной спиральной структуре, образующей зоны связывания гелевой сетки. Процесс гелеобразования можно условно разделить на две стадии: уплотнение и удвоение спиралей, называемое переходом «неупорядоченный клубок-спираль», и агрегация спиралей [153]. Образование агарозного геля происходит при нагревании раствора полисахарида до температуры выше температуры гелеобразования и последующем охлаждении. При этом гели наилучшего качества получаются при медленном охлаждении [154]. Температура гелеобразования агара оказывается тем выше, чем больше метоксильных групп содержится в нативном агаре, в то время как для агара, метилированного синтетически, отмечалась обратная взаимосвязь [81, 153]. Вероятно, это связано с тем, что метоксильные группы в нативном агаре находятся в положениях 4 и 6 1,3-связанной β-D-галактозы и в положении 2 1,4-связанной 3,6-ангидро-α-галактозы, тогда как при синтетическом метилировании их положение может быть случайным [81]. Растворимость агара, как и других полимеров, зависит от способности растворителя разрушать образующиеся 43 спирали. Высокое содержание метоксильных групп и 3,6-ангидрогалактозы увеличивает гидрофобные свойства агара, вследствие чего он способен растворяться в горячих водно-этанольных растворах. Напротив, агар, содержащий заряженные группы или небольшое количество 3,6-ангидрогалактозы, способен растворяться в полярных растворителях при относительно невысоких температурах [81, 153]. 1.7. Факторы, влияющие на качественные и количественные характеристики полисахаридов Биосинтез полисахаридов в клеточной стенке водорослей определяется множеством факторов, включающих как стадию жизненного цикла водоросли и ее видовую принадлежность, так и условия ее обитания [1, 20]. Первое особенно важно, поскольку красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий в себя чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Первые работы по структуре полисахаридов красных водорослей проводились на образцах полисахаридов, выделенных из смеси водорослей разных генераций – гаметофитов и спорофитов, что приводило к получению неоднозначных результатов. Исследования, проводимые с учетом стадии развития водоросли, позволяют оценить влияние этого фактора на биосинтез полисахаридов и установить структуру новых типов. Согласно ранним исследованиям, водоросль Phyllophora pseudoceranoides (Phyllophoraceae) синтезирует ι-каррагинан независимо от стадии жизненного цикла [155], тогда как позже было показано, что многие водоросли семейств Phyllophoraceae и Gigartinaceae со спорофитами продуцируют λ-каррагинан, в то время как гаметофиты – κ-каррагинан [156, 157]. В то же время было установлено, что желирующий полисахарид из цистокарпа Stenogramme interrupta (Phyllophoraceae) представляет собой ι/α-каррагинан, тогда как в состав нежелирующего полисахарида из тетраспорофита входят ζ- и λкаррагинаны [92]. Водоросль Gigartina pistillata, находясь на стадии гаметофита, продуцирует κ/ι-каррагинан с небольшим количеством биологического предшественника – ν-каррагинана, а полисахарид из тетраспорофита имеет сложную структуру, включающую звенья λ-, π-, ξ-каррабиозы и сульфатированную каррабиозу, содержащую 1,3-связанную галактопиранозу 2,6-дисульфат [158]. Для 44 другого представителя рода Gigartina Gigartina skottsbergii показано, что цистокарпы и стерильные растения продуцируют каррагинаны κ-семейства (κ/ι- и µ/ν-каррагинаны), тогда как полисахарид из тетраспорофита представляет собой λкаррагинан [159]. Желирующие полисахариды, выделенные из репродуктивной и вегетативной форм водоросли Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae) имеют идентичную гибридную структуру κ/β-каррагинанов, но различаются соотношением κ- и β-звеньев в полимерной цепи [93]. В то же время тетраспорофит T. crinitus продуцирует в основном нежелирующий полисахарид с необычной структурой, характеризующейся как присутствием 3,6-ангидрогалактозы, так и высоким содержанием сульфатных групп [160]. В водоросли Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae) желирующие полисахариды имеют структуру κ/ι-каррагинана [161]. Вместе с тем, показано, что представители семейств Soleriaceae, Hypneaceae и Furcellariaceae синтезируют только κ- и θ-каррагинаны независимо от стадии развития водоросли [157]. В случае агарофитов вопрос о влиянии стадии жизненного цикла на качественные и количественные характеристики агара до сих пор остается открытым [162]. На примере водоросли Gracilaria verrucosa было подробно изучено влияние стадии развития на количество выделяемого агара и прочность его гелей. Установлено, что содержание полисахарида, как и прочность его гелей, уменьшается при смене одной стадии другой в следующем порядке: водоросли с цистокарпами, с тетраспорофитами, вегетативная форма и мужской гаметофит [81]. Было обнаружено, что количество агара из Gelidiella acerosa незначительно зависит от места произрастания водоросли, в то время как прочность геля значительно изменяется в зависимости от места произрастания и стадии жизненного цикла водоросли [162]. Вегетативная форма водоросли G. acerosa [162] характеризуется более высоким содержанием агара с высокой прочностью геля, что может быть связано с биохимическими изменениями полисахаридного состава в клеточном матриксе. Аналогичные результаты были получены и для водоросли Gracilaria multipartita [163]. Уменьшение количества агара у G. acerosa на репродуктивной стадии может быть связано с изменением организации клеточной стенки и увеличением фрагментации таллома [163]. Содержание сульфатных групп в агаре было низким независимо от места произрастания и стадии жизненного 45 цикла водоросли, это указывает на то, что данная водоросль синтезирует небольшое количество L-галактозы 6-сульфата или под действием ферментов этот моносахарид очень быстро превращается в 3,6-ангидроформу. В то же время содержание 3,6-ангидрогалактозы оказалось значительно выше в тетраспорофитах, чем в вегетативной форме. Таким образом, особенность водоросли G. acerosa состоит в том, что увеличение прочности геля не коррелирует с увеличением содержания 3,6-ангидрогалактозы [162], как это характерно, например, для G. verrucosa [81]. Различными группами исследователей особое внимание уделяется условиям произрастания водоросли и влиянию на полисахаридный состав макрофитов таких параметров среды, как температура и соленость воды, освещенность, доступность питательных веществ [11, 21, 22, 23, 29, 164, 165]. Показано, что на количество полисахарида в водоросли влияет освещенность, поскольку она максимизирует скорость фотосинтеза и увеличивают синтез полисахаридов клеточной стенки [166, 167]. Рядом исследователей замечено, что между накоплением полисахаридов и ростовыми процессами макрофитов, обусловленными условиями среды обитания, существует тесная взаимосвязь, которая, однако, неидентична для различных представителей красных водорослей [22, 31, 164, 168]. Довольно часто между скоростью роста водоросли и продукцией ею полисахарида отмечается обратно пропорциональная зависимость. Это объясняется тем, что в периоды активного роста растения, которые, как правило, сопровождаются высокой концентрацией нитратов в морской воде, преобладает синтез белка и других протоплазматических компонентов, тогда как аккумуляция полисахаридов клеточной стенки оказывается минимальной. Подобное явление получило название «эффекта Нейша» [169, 170]. Когда запасы азота ограничены, промежуточные продукты фотосинтетического углеродного цикла переключаются с синтеза белка на синтез полисахарида [171]. Биосинтез полисахаридов в значительной степени зависит от климатического пояса (тропического, субтропического или умеренного), в котором произрастает водоросль. Для водорослей Eucheuma isiforme и E. nudum, обитающих в тропиках, показано, что накопление каррагинана в летне-осенний период сопровождалось снижением скорости роста водоросли и уменьшением содержания белка [172]. При этом максимальный рост водоросли отмечался при невысоких 46 значениях освещенности, температуры воды и доступности питательных веществ. Содержание 3,6-ангидрогалактозы в полисахариде в летние месяцы было высоким, весной – низким. Авторы объясняют этот факт тем, что весенний период характеризуется условиями оптимальными для роста водоросли, тогда как летом высока скорость фотосинтеза. Напротив, накопление полисахарида тропической водорослью Hypnea pannosa происходило в периоды активного роста растения и положительно коррелировало с соленостью воды [173]. Несмотря на то, что между температурой воды и ростом водоросли не наблюдалась достоверная корреляция, активный рост растения отмечался при понижении температуры воды. Однако, другой представитель рода Hypnea, тропическая водоросль Hypnea musciformis продуцировала наибольшее количество каррагинана в летний период при высокой температуре воды и низкой солености. Считают, что именно в этот период условия для роста макрофита были неблагоприятными, поэтому все энергетические ресурсы растения были направлены на синтез полисахарида [29]. Обратно пропорциональная зависимость между количеством полисахарида и соленостью наблюдалась и для Kappaphycus alvarezii из залива Сепетиба, Бразилия, при этом накопление каррагинана не связано со скоростью роста водоросли [174]. Максимальный рост отмечен при высокой температуре воды и низкой солености. В то же время периоды накопления каррагинана водорослью K. alvarezii с Вьетнамского побережья характеризующимися совпадали низкими с периодами температурами воды, роста растения, освещенностью и увеличением доступности неорганического азота в виде NH4+ за счет сильного движения воды и интенсивных дневных приливов [21]. Кроме того, периоды максимального и минимального количества 3,6-ангидрогалактозы в полисахариде совпадали с периодами наибольшей и наименьшей скорости роста водоросли, что, предполагается, связано с синтезом в молодых частях растения желирующих полисахаридов [21]. Обратно пропорциональная зависимость между накоплением каррагинана и освещенностью, скоростью роста и содержанием белка показана для тропической водоросли Eucheuma isiforme [31]. Предполагают, что при высокой освещенности возрастает скорость роста водоросли, и фотоассимиляты расходуются на производство флоридного крахмала, а не на синтез полисахарида клеточной 47 стенки. Для E. isiforme была отмечена прямо пропорциональная зависимость между количеством полисахарида и доступностью питательных веществ, что противоречит отмечаемому для некоторых красных водорослей «эффекту Нейша». Аналогично для водоросли Eucheuma uncinatum из залива Калифорния наблюдалось высокое содержание каррагинана в обогащенной азотом среде при высокой освещенности [23]. Высокое количество 3,6-ангидрогалактозы в полисахариде E. isiforme отмечено в периоды высокой освещенности [31]. Данные о синтезе полисахаридов в агарофитах в зависимости от условий окружающей среды водорослей не так многочисленны. Показано, что Gracilaria salicornia, обитающая в тропиках, продуцирует наибольшее количество агара в периоды, характеризующиеся высокой освещенностью, соленостью, температурой воды и недостатком питательных веществ [165]. В период дождей, характеризующийся снижением солености и освещенности из-за высокой облачности, наблюдалось уменьшение содержания полисахарида. Более того, недостаточное количество CO2, HCO3- и Ca2+ в морской воде, отмечаемое в период дождей, значительно воздействует на биосинтез полисахаридов, препятствуя их накоплению. Для этой водоросли отмечена обратно пропорциональная взаимосвязь между накоплением полисахарида и скоростью роста. Авторы объясняют это тем, что при совместном действии высоких освещенности и температуры воды снижается продуктивность водоросли вследствие фотоингибирования и высушивания растений, обитающих в приливной зоне. Для представителей семейства Phyllophoraceae, обитающих в субтропиках, зависимость содержания полисахаридов от факторов окружающей среды также неоднозначна. Максимальное количество полисахаридов в водоросли Mastocarpus stellatus, обитающей вдоль Атлантического побережья Испании (Лаксе, Могас), наблюдалось при повышенном уровне освещенности и температуры воды [175]. Для водоросли Gymnogongrus griffithsiae из Северной Каролины показано, что количество синтезируемых в ней полисахаридов не зависит от интенсивности света и температуры воды, но в то же время варьирует в сезоне [176]. Однако при культивировании этой водоросли содержание каррагинана увеличивалось при уменьшении доступности питательных веществ и не зависело от температуры и комбинированного действия этих факторов. 48 Было показано, что гаметофиты и тетраспорофиты водоросли Chondrus crispus с побережья Галисии (субтропики) имеют тенденцию к накоплению полисахарида при повышении температуры воды и снижении освещенности [177]. Кроме того, авторы отмечают, что наибольшее количество каррагинана присутствует в водорослях, подверженных более сильному воздействию движения воды и воздуха, чтобы сохранить гибкость талломов и жизнеспособность макрофита. Для агарофитов Gelidium crinale [178], Gelidium robustum [170] и Gracilaria multipartita [163], произрастающих в субтропиках, между скоростью роста растения и количеством продуцируемого полисахарида установлена обратно пропорциональная зависимость, при этом необходимым условием для накопления полисахаридов у G. multipartita являлась высокая освещенность и недостаток питательных веществ, у G. robustum – высокая температура воды, тогда как у G. crinale – низкие освещенность и температура воды. Увеличение количества агара у G. multipartite в зимний период, когда происходит разрушение репродуктивных структур водоросли, авторы связывают с тем, что основная часть гидроколлоида сосредоточена в базальной части таллома макрофита [163]. Кроме того, для полисахарида отмечена обратно пропорциональная взаимосвязь между количеством галактозы и 3,6-ангидрогалактозы, но отсутствует корреляция между 3,6-ангидрогалактозой и сульфатными группами, что может быть связано с тем, что в состав этого агара входит 1,4-связанная несульфатированная L-галактоза. Для водорослей умеренных широт аналогично представителям тропиков и субтропиков наблюдается неоднозначность во взаимосвязи ростовых процессов и аккумуляции полисахаридов. Так, для водоросли Calliblepharis jubata, произрастающей в умеренных широтах, отмечена обратно пропорциональная зависимость между скоростью роста водоросли и накоплением полисахарида [179]. При этом максимальный рост был отмечен в зимние месяцы, характеризующиеся минимальной освещенностью, и совпадал с периодом накопления флоридного крахмала. Накопление полисахаридов у Cystoclonium purpureum происходит при снижении освещенности и темпетаруры воды и сопровождается падением скорости роста [168]. 49 Напротив, было показано, что водоросль T. crinitus из умеренных широт адаптируется к световым условиям обитания через изменения как морфологических и анатомических характеристик, так и через биохимические процессы, связанные с биосинтезом полисахаридов. Наибольшая скорость роста наблюдалась у этой водоросли в августе при температуре воды 24°С и освещенности 10-15% ФАР и совпадала с периодом накопления полисахаридов [180]. Положительная корреляция между ростовыми процессами макрофита и содержанием каррагинана объясняется в данном случае тем, что водоросль T. crinitus является медленно растущей, поэтому скорость ее роста не сказывается отрицательно на накоплении каррагинана. С августа по октябрь с понижением температуры воды с 24 до 11°С отмечалось постепенное уменьшение содержания полисахарида во всех образцах водоросли независимо от количества падающего света [164]. Следует отметить, что с изменением интенсивности падающего света изменяется и качественный состав полисахарида. С августа по октябрь содержание желирующих каррагинанов у водоросли T. crinitus, растущей при низкой освещенности, постоянно, тогда как количество нежелирующего типа постепенно уменьшается. У водоросли, выращенной при 10-15% ФАР, преобладает содержание нежелирующих полисахаридов [180]. Прямо пропорциональная зависимость между скоростью роста и накоплением каррагинана наблюдалась и для водоросли Solieria chordalis, обитающей в умеренных широтах, при этом наиболее благоприятными условиями являются высокие температура воды, соленость и освещенность 100 мкмоль фотонов/м2 с [22]. Важным параметром, определяющим количество и качество синтезируемого в водоросли полисахарида, является возраст макрофита. Было показано, что разные части таллома C. crispus отличаются по полисахаридному составу [181]. Общее содержание каррагинана в апикальной части таллома было значительно меньше по сравнению с другими частями водоросли. Независимо от световых условий более старые части водоросли накапливают больше KCl-растворимого полисахарида, чем молодые. Клеточные стенки всех тканей красных водорослей содержат каррагинан в аморфной, водорастворимой фазе. Различие состоит в количестве и типе каррагинана, присутствующем в данной ткани. Так, в клеточной стенке 50 кортикальной ткани в основном синтезируются λ- и ι-каррагинаны, а в меддулярных клетках – κ-каррагинан [156]. Однако оценить влияние отдельного параметра среды обитания водоросли и факторов, связанных с физиологией, на количественные и качественные характеристики полисахарида представляется весьма трудной задачей. Кроме того, вопрос о том, какие механизмы лежат в основе ответной реакции организма на изменение тех или иных факторов, до сих пор остается открытым. Знание же всех факторов важно с точки зрения фундаментальных аспектов исследования полисахаридного состава водоросли и протекания в них фотосинтетических процессов и при решении вопросов заготовки сырья и культивирования водорослей. 1.8. Области использования полисахаридов красных водорослей Полисахариды красных водорослей широко используются в различных областях промышленности. Благодаря своей уникальной способности образовывать прочные гели, агар применяется в кондитерской промышленности при производстве мармелада, желе, при получении мясных и рыбных студней, при изготовлении мороженого, где он предотвращает образование кристалликов льда, а также при осветлении соков. Применение агара в пищевой промышленности не лимитировано, а его количество, добавляемое в пищевые продукты, обусловлено рецептурами и стандартами на эти продукты. Как правило, содержание агара в кондитерских изделиях составляет не более 1-1,2% [7]. Агар среднего качества используется в биологических культуральных средах в качестве гелиевого субстрата. Кроме того, его широко используют в медицине и фармакологии при производстве слабительных, свечей, капсул, таблеток и антикоагулянтов, а также при терапии рака, благодаря его способности стимулировать апоптоз раковых клеток. Агароза применяется в электрофорезе, гель-хроматографии и при иммунодиффузии [9]. Как и для агара, основной сферой использования каррагинана также является пищевая промышленность. Около 70% всего производимого каррагинана используется в молочном (шоколадное молоко, щербет, сыр, взбитые сливки и т. д.) и кондитерском производствах. Полисахарид используется как гелеобразующее 51 вещество и как стабилизатор эмульсий, основанных на молоке и воде, а также для улучшения свойств других гелей [6], что возможно за счет способности каррагинана образовывать комплексы с другими гидроколлоидами. Каррагинан оказывается более предпочтительным, чем агар и альгинаты, в тех случаях, когда требуется высокая вязкость, эмульгирование и суспендирование. Желирующие типы каррагинана способны предотвращать свертывание молока, в связи с чем их используют в качестве добавки к молоку и мороженому. Каррагинаны имеют сравнительно высокую температуру разжижения, благодаря чему их используют для приготовления фруктовых кондитерских изделий при комнатной температуре. Модифицированные каррагинаны препятствуют окислению жиров, поэтому их используют в качестве антиокислителей. Кроме того, их применяют в качестве фиксаторов при производстве мясных консервов, фруктовых гелей и желе [151]. Еще одной областью использования каррагинана является косметическая промышленность, где полисахарид применяется при изготовлении лосьонов, кремов, шампуней, способствуя снятию электростатического напряжения за счет присутствия сульфатных групп [7]. Известно также применение каррагинана в текстильной промышленности, в биотехнологическом производстве для иммобилизации клеток, а также в качестве заменителя бактериологического агара [11]. Каррагинаны, так же как и агары, благодаря своим свойствам образовывать гели, применяются в приготовлении лекарственной таблеточной массы [182, 183]. Кроме того, каррагинаны способны стимулировать регенерацию кожи и рост соединительной ткани, вследсвие чего могут быть использованы для создания гелевой основы различных ранозаживляющих повязок. Однако для каррагинанов важным является стабильность таких показателей, как молекулярная масса, вязкость и рН растворов, поскольку их изменение может привести к изменению медико-биологических свойств полисахаридов, в частности к появлению токсической активности [8]. Помимо этого, каррагинаны относятся к растворимым пищевым волокнам, которые, как было показано, играют важную роль в регулировании гомеостаза и позволяют достаточно эффективно регулировать метаболические и функциональные нарушения, лежащие в основе различных 52 заболеваний, таких как атеросклероз, сахарный диабет, ожирение, ишемическая болезнь сердца [184, 185]. 1.9. Биологическая активность полисахаридов Известно, что каррагинаны обладают широким спектром биологической активности, среди которой следует выделить антивирусную, противоопухолевую, иммуномодулирующую, антиоксидантную, антикоагулирующую [8, 9, 10]. Несмотря на то, что каррагинан входит в список веществ, разрешенных к использованию в качестве пищевых добавок (US FOOD), биологические свойства этого полисахарида до конца не изучены. Наиболее полисахаридов широко являются изученными свойствами антикоагулирующие сульфатированных свойства [186]. Согласно литературным данным, сульфатированные галактаны красных водорослей относят к полисахаридам с Антикоагулирующие высокой свойства антикоагулирующей сульфатированных активностью полисахаридов [187]. обычно оценивают по их способности ингибировать процесс свертывания крови, положительный эффект которой основывается на удлинении активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), характеризующего внутренний путь коагуляции, и протромбинового времени (ПТВ), характеризующего внешний путь коагуляции [188]. Считают, что антикоагулирующие свойства полисахаридов морских макрофитов зависят от молекулярной массы полисахарида, а также количества и местоположения сульфатных групп [189, 190]. Так, например, λ-каррагинан из тетраспорофита Stenogramme interrupta проявляет большую антитромбическую активность, чем κ/ι-каррагинан из растений с цистокарпами, вероятно из-за высокого содержания сульфатных групп [92]. Было показано, что λ-каррагинан из водоросли Corallina проявляет довольно высокую антикоагулирующую активность по сравнению с другими сульфатированными галактанами, выделенными из этой водоросли [191]. При исследовании коммерческих образцов κ-, ι- и λ-каррагинанов было показано, что наибольшей способностью ингибировать процесс свертывания крови обладает λ-каррагинан, тогда как наименьшей – κ-каррагинан [192]. Полисахарид из красной водоросли Botryocladia occidentalis, представляющий 53 собой галактан, соединенный чередующимися β-(1→4) и α-(1→3) гликозидными связями, но с изменчивым характером сульфатирования: 1/3 α-остатков которого представлена галактозой 2,3-дисульфат, а 1/3 – галактозой 2-сульфат, проявляет более высокую антикоагулирующую активность [193] по сравнению с аналогичным по структуре полисахаридом из Gelidium crinale, но содержащим 55% α-галактозы 2-сульфат и только 15% α-галактозы 2,3-дисульфат [194]. Вероятно, это связано с тем, что доля и распределение α-галактозы 2,3-дисульфат вдоль полимерной цепи влияет на связывание полисахарида со специфическими протеазами в системе коагуляции. Cульфатированные полисахариды, в том числе каррагинаны, помимо антикоагулирующей активности обладают также и антиоксидантной активностью, которая зависит от степени сульфатирования, типа основного моносахарида и разветвления углеводной цепи [195, 196, 197]. Так, было показано, что λкаррагинан обладает наибольшей способностью ингибировать супероксид-радикал, вероятно по причине высокой степени сульфатирования [198]. Однако, κ/ιкаррагинан, имеющий более высокую степень сульфатирования, обладает меньшей антиоксидантной активностью, чем κ- и κ/β-каррагинаны, что, вероятно, связано не только с количеством сульфатных групп, но и с их месторасположением и распределением вдоль полимерной цепи [198]. Деполимеризованный продукт полисахарида из Porphyridium cruentum показал большую антиоксидантную активность, чем нативный полисахарид [199]. Показано, что ацетилированные и фосфорилированные олигосахариды κ-каррагинана в экспериментах in vitro проявляют наибольшую радикал-связывающую (супероксид- и гидроксид- радикалов, ДФПГ) способность по сравнению с исходным полисахаридом и продуктами его кислотного гидролиза [200]. Согласно литературным данным, каррагинаны обладают противоопухолевой активностью, которая повышается с уменьшением молекулярной массы и степени сульфатирования полисахарида [201]. Олигосахариды κ-каррагинана с молекулярной массой 1,7 кДа способствуют уменьшению скорости роста опухоли саркома-180 у мышей, увеличению скорости фагоцитоза и индукции факторов иммунного ответа [202]. Показано, что деполимеризованный λ-каррагинан с молекулярной массой 9,3 кДа усиливает 54 in vivo лечебное действие противоопухолевого препарата, снижая при этом его побочные эффекты [203]. Олигосахариды каррагинанов могут оказаться перспективными в создании основы для эффективной доставки противоопухолевых препаратов. Сульфатированные галактаны красных водорослей проявляют антивирусную активность в отношении значительного числа вирусов, подавляя репликацию как не покрытых оболочкой вирусов, так и покрытых оболочкой, включая так называемых условно-патогенных, таких как вирус простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирус и другие, возникающие в организме при ослаблении функции иммунной системы [204]. Антивирусная активность этих полисахаридов определяется как степенью их сульфатирования, так и молекулярной массой. Авторы, исследующие взаимосвязь структурных особенностей каррагинанов и их антивирусного действия, предполагают, что в проявлении ингибирующего эффекта в отношении многих вирусов, в том числе ВПГ, определяющую роль играет наличие 1,4-связанной α-Dгалактозы и сульфатных групп при С-2 и С-6 остатка галактозы в полисахаридах. В случае частичной циклизации 1,4-связанной α-D-галактозы, приводящей к образованию 3,6-ангидро-D-галактозы, активность полисахарида существенно понижается [205, 206]. В основе механизма действия каррагинанов на ВПГ, вероятно, лежит способность сульфатированных полисахаридов блокировать пути проникновения вириона в клетку-хозяина, либо благодаря адгезивным свойствам, либо за счет структурного сродства с некоторыми компонентами вирусной частицы [205]. Показано, что сульфатированный галактан из красной водоросли Grateloupia indica обладает высоким ингибирующим эффектом в отношении вируса простого герпеса типа 1 (ВПГ-1), действуя либо на стадии связывания вируса с клеткой хозяина, либо на стадии их слияния [206]. При сравнении активности исходного сульфатированного галактана из водоросли Gracilaria corticata, продуктов его сульфатирования и десульфатирования против ВПГ-1 и ВПГ-2 было показано, что продукт сульфатирования проявлял наибольшую антивирусную активность, тогда как снижение количества сульфатных групп приводило к практически полной ее потере [207]. κ/ι/υ-Каррагинан из водоросли Gymnogongrus griffithsiae, не обладающий цитотоксичностью, проявлял высокую анти-ВПГ-1 активность в экспериментах in vitro, ингибируя адсорбцию вируса на поверхности клетки55 хозяина [208]. Полисахарид из G. torulosus, представляющий собой D/L-гибрид, обладает высокой активностью не только в отношении ВПГ-2, но и в отношении вируса Денге типа 2, не проявляя цитотоксического эффекта ни к стационарным, ни к активно делящимся клеткам [99]. Механизм действия этого полисахарида заключается в ингибировании связывания гликопротеина на поверхности оболочки вируса с клеточным рецептором. Считают, что сульфатная группа при С-4 1,3связанной β-D-галактозы, которая присутствует в структуре полисахарида из G. torulosus, ответсвена за его антивирусную активность. Сульфатированные полисахариды ингибируют развитие различных штаммов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) на ранних стадиях в очень низких концентрациях (0,01-0,1 мг/мл), не проявляя цитотоксичности. В настоящее время λ- и ι-каррагинаны рассматриваются как перспективные противовирусные средства в отношении ВИЧ 1 и 2 типа. При этом показано, что их ингибирующее действие повышается с увеличением степени сульфатирования и молекулярной массы, но немаловажную роль играют и распределение сульфатных групп, конформационная гибкость и относительное количество 3,6-ангидрогалактозы в молекуле полисахарида [209]. При использовании этих полисахаридов в качестве средств доставки анти-ВИЧ препаратов отмечалось существенное увеличение лечебного действия последних [210]. Каррагинаны проявляют высокую ингибирующую активность в низких концентрациях в отношении вируса папилломы человека (ВПЧ), передача которого осуществляется преимущественно половым путем. В связи с этим, перспективным является использование каррагинанов в качестве компонента различных контрацептивных и других средств интимного назначения местного применения с целью профилактики передачи ВПЧ [211]. Несмотря на высокий ингибирующий эффект вирусной инфекции, высокомолекулярные полисахариды плохо проникают в ткани организма, что ограничивает их использование в качестве потенциальных противовирусных препаратов. В связи с этим, получают олигосахариды каррагинанов методом химической и ферментативной деполимеризации, в результете чего значительно возрастает их биодоступность и активность [212]. 56 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Фотосинтетические пигменты красной водоросли A. flabelliformis Красные водоросли отличаются сложным набором пигментов, входящих в состав их светособирающего комплекса. Помимо хлорофилла и каротиноидов они содержат водорастворимые фикобилиновые пигменты, что является таксономическим признаком отдела Rhodophyta [40]. ФБП находят широкое применение в фармацевтике, биотехнологии и пищевой промышленности [13]. Основными структурными компонентами клеточной стенки красных водорослей являются сульфатированные полисахариды – агар и каррагинан, которые широко используются в пищевой промышленности, в биотехнологии и косметологии, а также проявляют разнообразную биологическую активность [1, 4, 6, 7, 8, 9, 10]. Известно, что динамика факторов среды обитания водорослей (освещение, температура и концентрация биогенных элементов в морской воде) обуславливает адаптивные перестройки в макрофитах, затрагивающие не только структуру и функции фотосинтетического аппарата [24, 26], но и сопровождающиеся изменениями полисахаридного состава растения [21, 22, 29, 164, 165]. Однако, данные о пигментном и полисахаридном составе водорослей рода Ahnfeltiopsis, произрастающих в умеренных широтах, отсутствуют. В связи с возможностью использования A. flabelliformis (род Ahnfeltiopsis) для получения сульфатированных полисахаридов и ФБП одна из задач настоящей работы состояла в изучении качественного и количественного состава фотосинтетических пигментов и полисахаридов этой водоросли в зависимости от основных факторов среды ее обитания в течение года. Анализ сезонной динамики содержания пигментов светособирающего комплекса и полисахаридов A. flabelliformis важен не только для накопления фактического материала о физиологии макрофита, но и для оценки наиболее благоприятного периода заготовки сырья с целью его рационального использования. 2.1.1. Факторы среды обитания водоросли Основными факторами среды, влияющими на синтез пигментов в водорослях, являются освещение и температура воды. В связи с этим, в данной 57 работе были проведены измерения температурного и светового режима в месте обитания A. flabelliformis в течение 2009 г. (табл. 5). Максимальная температура воды была зарегистрирована в августе, а минимальная – с декабря по март. Интенсивность падающего света является одним из важных факторов среды обитания водорослей. Поэтому количество фотосинтетически активной радиации (ФАР), проникающей в толщу воды в месте сбора водоросли, измеряли специальным прибором каждые 3-5 дней, рассчитывая среднесуточные дозы ФАР, как описано в материалах и методах. Как видно из таблицы 5, максимальные среднесуточные интенсивности ФАР, достигающие поверхности талломов водорослей, были отмечены в апреле, что, вероятно, связано с увеличением солнечной активности и таяньем льда в весенний период. Высокая доза ФАР зарегистрирована также в период с июля по сентябрь, что, по-видимому, обусловлено повышением прозрачности атмосферного воздуха и завершением во второй половине лета периода муссонов, характерных для Дальневосточного региона с мая по первую декаду июля. Соленость воды в месте произрастания A. flabelliformis в течение исследуемого периода менялась незначительно и составляла в среднем 32-33‰. 58 Таблица 5 – Среднемесячные значения температуры воды (Т,°С) и среднесуточные значения дозы фотосинтетически активной радиации (ФАР, 400-700 нм), проникающей в толщу воды на месте сбора A. flabelliformis в Амурском заливе (Японское море) с февраля по декабрь 2009 г. Месяц Т,°С Среднесуточная доза ФАР, моль · м-2 · сут-1 февраль* -1,0±0,5 март* 1,1±1,2 начало апреля* 2,8±0,3 конец апреля 5,5±1,3 май 7,6±1,6 июнь 11,6±0,9 июль 18,1±1,8 август 22,7±1,6 сентябрь 20,6±1,7 октябрь 13,6±2,8 ноябрь 2,8±0,4 декабрь* 1,3±1,4 Примечание: * – наблюдался ледовый покров 2,02 4,53 3,33 21,34 10,75 7,21 14,44 19,47 17,24 7,25 3,88 0,78 2.1.2. Пигментный состав водоросли A. flabelliformis в зависимости от факторов среды ее обитания Пигменты были выделены из замороженных в жидком азоте и хранящихся при -80ºС талломов водоросли A. flabelliformis (10 см, однородный цвет), собранной в феврале-декабре 2009 г. в естественных местах обитания в Амурском заливе (мыс Красный) с глубины 2 м. Все собранные водоросли были представлены репродуктивной формой (карпоспорофитами). Экстракцию фикобилиновых пигментов проводили охлажденным 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,8), а хлорофилла а и каротиноидов – охлажденным 90% ацетоном. Идентификацию пигментов проводили спектральным методом по максимумам поглощения, характерным для ФЭ в области 565 нм, ФЦ – 615 нм, АФЦ – 650 нм, хлорофилла а – 664 нм, каротиноидов – 480 нм. Содержание фикобилинов рассчитывали по формуле (1), хлорофилла а и каротиноидов – по формулам (2) и (3) соответственно, представленным в главе «Экспериментальная часть». Все полученные данные были обработаны статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и многорангового LSD-теста, а также расчета коэффициента Спирмена. 59 На протяжении всего периода исследования доминирующим пигментом в ряду фикобилипротеинов у A. flabelliformis был фикоэритрин, содержание которого колебалось от 55 до 70% в зависимости от сезона (рис. 6). Доля аллофикоцианина составляла 20-35% суммы красных пигментов, а фикоцианина – не превышала 15%. В целом диапазон содержания фотосинтетических пигментов A. flabelliformis в течение года был подобен отмеченному ранее для красных водорослей Японского моря [26, 213]. ФЭ ФЦ 12,0 АФЦ 10,0 8,0 6,0 4,0 декабрь ноябрь октябрь сентябрь август июль июнь май март февраль 0,0 конец апреля 2,0 начало апреля Содержание ФБП, мг/г сух. веса водоросли 14,0 Рисунок 6 – Сезонные изменения содержания фикобилипротеинов в талломах A. 3,5 Хл а 3,0 Кар 2,5 2,0 1,5 1,0 декабрь ноябрь октябрь сентябрь август июль июнь май конец апреля начало апреля март 0,5 0,0 февраль Содержание пигмента, мг/г сух. веса водоросли flabelliformis из Японского моря Рисунок 7 – Сезонные изменения содержания хлорофилла а (Хл а) и каротиноидов (Кар) в талломах A. flabelliformis из Японского моря В течение вегетационного периода A. flabelliformis максимальное содержание ФБП зарегистрировано для образцов водоросли, собранных в мае-июне (рис. 6), 60 что связано, по всей вероятности, с резким снижением интенсивности света в период высокой повторяемости пасмурных дней поздней весной и в первую половину лета (табл. 5). Хлорофилл а является одним из основных фотосинтетических пигментов красных водорослей. Повышение содержания хлорофилла а и каротиноидов до максимальных годовых значений наблюдалось в период с декабря до начала апреля, когда было отмечено существенное снижение интенсивности света подо льдом зимой и ранней весной (табл. 5, рис. 7). Подобные данные были получены ранее для красных водорослей черноморского побережья [214, 215]. Такая реакция пигментного аппарата морских растений относится к разряду адаптивных в ответ на понижение интенсивности света [216]. Однако не исключено, что повышенное содержание каротиноидов у A. flabelliformis в холодное время года (рис. 7) является приспособлением не только к низкой интенсивности света, но и к пониженной температуре воды (табл. 5, 6). Накопление каротиноидов, участвующих в защите фотосинтетического аппарата от фотоокисления, показано ранее для некоторых морских макроводорослей и высших растений при акклимации к низким и отрицательным температурам [217, 218]. Таблица 6 – Значения коэффициента корреляции Спирмена, характеризующего связь между содержанием фотосинтетических пигментов у A. flabelliformis и факторами среды в феврале-декабре 2009 г. Пигмент ФЭ ФЦ АФЦ Хл а Кар Кар/Хл а ФЭ/Хл а ФЭ/ФЦ Температура воды 0,305 -0,112 -0,150 -0,308 -0,601*** -0,507*** 0,258 -0,569** ФАР -0,539* -0,799*** -0,373* -0,601** -0,657*** -0,428* 0,071 0,542* Примечание: ФЭ – фикоэритрин, ФЦ – фикоцианин, АФЦ – аллофикоцианин, Хл а – хлорофилл а, Кар – каротиноиды. Достоверные значения влияния факторов среды на содержание пигментов и их соотношение при Р < 0,05 (*), Р < 0,01 (**), Р < 0,001 (***) отмечены жирным шрифтом. Во второй половине апреля, а также в июле-сентябре у A. flabelliformis было зарегистрировано достоверное (LSD-test, P < 0,05) 2-3-кратное уменьшение 61 содержания фотосинтетических пигментов до минимальных годовых значений (рис. 6, 7). По-видимому, это связано с тем, что после длительного периода подо льдом или в условиях пасмурной погоды с мая до второй половины июля водоросли, адаптированные к низкой освещенности, подвергались воздействию высоких интенсивностей солнечной радиации (табл. 5). Рассчитанные коэффициенты корреляции Спирмена, характеризующие взаимосвязь между содержанием пигментов и факторами среды, свидетельствуют о достоверной отрицательной корреляции между ФАР и содержанием пигментов в талломах водоросли (табл. 6). Аналогичное снижение уровней ФБП и хлорофилла а ранее также наблюдали у арктических красных водорослей Palmaria palmata и Devaleraea ramentaceae при попадании макрофитов под воздействие высоких интенсивностей ФАР и ультрафиолетовой (УФ) радиации сразу после таяния льда [24]. Снижение концентрации пигментов под действием высоких интенсивностей света в летний период также отмечали у некоторых зеленых и красных водорослей умеренных широт [219, 220, 221, 222]. Такая реакция пигментного аппарата растений может носить адаптивный характер и быть направленной на защиту реакционных центров и электронно-транспортной цепи от избытка падающего света [223]. Известно, что такие адаптивные перестройки происходят достаточно быстро и занимают от 4 до 6 дней [216, 224]. С другой стороны, высокие интенсивности солнечной повреждающее действие радиации, на особенно пигментный УФ-Б, комплекс могут оказывать водорослей, изменяя соотношения фотосинтетических пигментов или вызывая их обесцвечивание и повреждение мембранных липидов [60]. Действительно, в периоды высокой освещенности в Амурском заливе (июль-сентябрь) наблюдалось снижение соотношения Кар/Хл а (рис. 8), которое является потенциальным биоиндикатором фотоокислительных повреждений в клетках растений при действии сильного света [225]. Отмечена отрицательная корреляция (Спирмен тест, Р < 0,05) между ФАР и соотношением Кар/Хл а (табл. 6). Таким образом, в апреле и с августа по сентябрь наблюдается снижение концентрации ФБП, хлорофилла а и каротиноидов у A. flabelliformis, что, скорее всего, является фотосинтетической активности водорослей. 62 результатом подавления Отношение Кар/Хл а 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 декабрь ноябрь октябрь сентябрь август июль июнь май конец апреля начало апреля март февраль 0 Рисунок 8 – Сезонные изменения отношения каротиноидов (Кар) к хлорофиллу а (Хл а) в талломах A. flabelliformis из Японского моря С наступлением периода пасмурной погоды в мае и снижением солнечной активности в октябре интенсивность и количество света, достигающего талломов, резко уменьшались (табл. 5). В это же время водоросли восстанавливали уровень пигментов до показателей, отмеченных в первую половину года, повышая (LSDtest, P < 0,05) сначала содержание ФБП (рис. 6), а затем накапливая (LSD-test, P < 0,05) хлорофилл а и каротиноиды (рис. 7). В условиях меняющегося светового режима в течение года изменяется соотношение пигментов в светособирающем комплексе красных водорослей. Наблюдаемое у A. flabelliformis повышение отношения ФЭ/Хл а (рис. 9) в периоды снижения солнечной активности (май-июнь и октябрь-ноябрь) рассматривается в литературе как адаптивная реакция к условиям низкой освещенности, которая способствует рациональному использованию падающего света и повышению потенциальных фотосинтетических возможностей растений [216, 223]. Достоверное (LSD-test, P < 0,05) увеличение отношения ФЭ/ФЦ (рис. 9, табл. 6) в периоды действия высоких интенсивностей света весной и летом, а также при понижении температуры аккумулировании воды свободного (0°С) зимой фикоэритрина может свидетельствовать об на периферии фикобилисом анфельтиопсиса [226]. Подобные результаты были получены для Palmaria decipiens из Антарктики [227] и для морских цианобактерий [228]. 63 декабрь ноябрь октябрь сентябрь август июль июнь май конец апреля начало апреля март февраль Отношение пигментов ФЭ/Хл а ФЭ/ФЦ 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 Рисунок 9 – Сезонные изменения отношений фикоэритрина к хлорофиллу а (ФЭ/Хл а) и фикоэритрина к фикоцианину (ФЭ/ФЦ) в талломах A. flabelliformis из Японского моря Таким образом, полученные нами результаты показывают, что изменения в светособирающем комплексе A. flabelliformis в течение года во многом регулируются сезонной динамикой светового и температурного режимов в месте обитания водоросли. Однако не исключено существование и других факторов (например, наличие внутренних ритмов или влияние скорости ростовых процессов), определяющих характер изменений в содержании пигментов A. flabelliformis в течение его вегетационного цикла, как это было показано ранее для макрофитов северных и умеренных широт [229, 230]. 2.2. Полисахаридный состав водоросли A. flabelliformis (карпоспорофит) в зависимости от факторов среды ее обитания Сезонные изменения качественного и количественного состава полисахаридов A. flabelliformis были изучены на образцах водоросли, собранной с февраля по декабрь 2009 г. в Амурском заливе (мыс Красный, Японское море) на глубине 2 м. В течение года все собранные водоросли были представлены репродуктивной формой (карпоспорофитами), чтобы исключить вероятность влияния стадии жизненного цикла макрофита на его полисахаридный состав. В месте обитания водоросли были измерены соленость, температура воды, а также 64 количество ФАР, достигающей талломов водоросли, значения которых представлены в таблице 5. Известно, что динамика накопления полисахаридов в тканях водорослей в течение года определяется не только прямым действием факторов внешней среды, но опосредованным влиянием скорости роста растений на биосинтетические процессы в клетках. Изменение содержания сухого вещества водоросли может косвенно отражать периоды ее роста, при этом низкие его значения соответствуют активному росту растения и наоборот, увеличение содержания сухого вещества сопровождается пониженной скоростью роста [31]. Кроме того, в периоды активного роста растения преобладает синтез белка, тогда как аккумуляция полисахаридов оказывается минимальной. Подобное явление получило название «эффекта Нейша» [170]. В связи с этим, наряду с содержанием полисахаридов, определено содержание сухого вещества водоросли и общего растворимого белка в зависимости от сезона сбора макрофита, температуры воды и ФАР. 2.2.1. Содержание сухого вещества и общего растворимого белка в талломах A. flabelliformis Согласно результатам анализа содержание сухого вещества (СВ) у A. flabelliformis значительно (ANOVA, F2,3 =45,566; P < 0,05) варьирует в течение года (рис. 10). Максимальное накопление СВ водорослей (28% от сырого веса) зарегистрировано в зимние месяцы (рис. 10), что может быть связано с замедлением скорости роста макрофитов при низких температурах [31]. В весенний и летний периоды отмечено статистически достоверное (LSD-тест, P < 0,05) снижение этого показателя до минимальных значений (16,8% от сырого веса) в сентябре. Значения коэффициента корреляции Спирмена, характеризующего связь между СВ и факторами среды обитания водорослей, свидетельствуют о достоверном (Спирмен тест, Р < 0,001) отрицательном влиянии температуры воды и ФАР на содержание СВ A. flabelliformis в течение года (табл. 7). 65 ПС ОРБ 30 СВ 25 30 20 25 20 15 15 10 10 5 5 декабрь ноябрь сентябрь август июль июнь май апрель 0 март 0 СВ водоросли, % от сырого веса водоросли 35 февраль Выход ПС (Содержание ОРБ в талломах), % от сухого веса водоросли 40 Рисунок 10 – Сезонные изменения содержания сухого вещества (СВ), полисахаридов (ПС) и общего растворимого белка (ОРБ) в талломах водоросли A. flabelliformis Таблица 7 – Коэффициенты корреляции Спирмена, характеризующие связь сухого вещества, общего растворимого белка, полисахаридов, химического состава полисахаридов с факторами среды обитания водоросли A. flabelliformis в февраледекабре 2009 г. Температура воды СВ ПС ОРБ Gal AnGal Glc Xyl SO42- ФАР -0,858*** -0,841*** 0,025 -0,085 0,379 -0,516* -0,774*** 0,297 -0,615*** -0,651*** 0,029 -0,260 0,092 0,012 -0,414 0,544** Примечание: СВ – сухое вещество водоросли, ПС – полисахарид, ОРБ – общий растворимый белок, ФАР – фотосинтетически активная радиация, Gal – галактоза; AnGal – 3,6-ангидрогалактоза; Glc – глюкоза; Xyl – ксилоза. Достоверные значения влияния факторов среды на содержание СВ водоросли, ОРБ, полисахаридов и их химический состав при Р < 0,05 (*), Р < 0,01 (**), Р < 0,001 (***) отмечены жирным шрифтом. Содержание общего растворимого белка (ОРБ) в тканях исследованных водорослей также зависит (ANOVA, F2,3=45,566; P < 0,05) от времени сбора растений в течение года (рис. 10). Уровень ОРБ в тканях A. flabelliformis достигает 66 максимальных показателей в июне, а минимальных – в период с сентября по март (рис. 10). Согласно коэффициенту корреляции Спирмена температура воды и ФАР не оказывают влияния (Спирмен тест, Р > 0,05) на количество белка, синтезируемого в талломах водоросли в течение года (табл. 7). 2.2.2. Количественный и качественный состав полисахаридов Полисахариды были выделены последовательной экстракцией водой при температуре 20 и 80°С из высушенной водоросли A. flabelliformis. Количество полисахаридов, выделенных при 20°С, было незначительным (0,7-4,7%). Содержание полисахаридов (ПС) в экстрактах, полученных при 80°С, варьировало от 5,9 до 26,7% от сухого веса водорослей и зависело (ANOVA, F2,3 =45,566; P < 0,05) от времени сбора макрофита в течение года (рис. 10). Максимальные выходы ПС у A. flabelliformis наблюдались в холодное время года – в ноябре-декабре и феврале (рис. 10, табл. 5), когда температура воды не превышает 3°С, а освещенность минимальная. В этот период статистически достоверных (LSD-тест, P > 0,05) различий в содержании ПС обнаружено не было. В весенние и летние месяцы уровень ПС у водорослей снижается в 1,5 и 2 раза соответственно (LSDтест, Р < 0,05), достигая минимальных показателей в сентябре (рис. 10). Температура воды и среднесуточная доза ФАР оказывают статистически достоверное (Спирмен тест, Р < 0,001) отрицательное влияние на количество продуцируемого водорослью ПС (табл. 7). Вероятно, при высоких освещенности и температуре воды возрастает скорость роста водоросли, и фотоассимиляты расходуются на производство резервных компонентов клеточной стенки, а не на синтез структурных полисахаридов [231]. Наблюдаемая в нашем случае взаимосвязь между количеством полисахарида из A. flabelliformis, температурой воды и освещенностью была отмечена ранее и для водорослей субтропических широт семейств Cystocloniaceae (H. musciformis) [232] и Gelidiaceae (Gelidium crinale) [178], тогда как для субтропического представителя семейства Phyllophoraceae Mastocarpus stellatus максимальное содержание полисахаридов наблюдалось при повышенном уровне освещенности и температуры воды [175]. Как видно из рисунка 10, характер сезонных изменений в содержании полисахаридов A. flabelliformis аналогичен динамике содержания СВ водоросли, 67 тогда как корреляционная взаимосвязь между количеством белка и полисахарида в течение исследуемого периода отсутствует. Однако следует отметить, что в первой половине года (февраль-май) наблюдалось постепенное снижение СВ водоросли и полисахарида и накопление белка, что по-видимому, объясняется так называемым «эффектом Нейша» [170], когда активный рост растений сопровождается усилением синтеза белка, а аккумуляция полисахаридов уходит на второй план. Подобная зависимость между содержанием белка и полисахарида ранее была отмечена для водорослей H. musciformis (Cystocloniaceae) [233], Eucheuma isiforme (Solieriaceae) [31], G. crinale (Gelidiaceae) [178] и Gelidium robustum (Gelidiaceae) [170], произрастающих в субтропических и тропических широтах. У представителей других семейств красных водорослей также отмечена взаимосвязь между скоростью роста водоросли и накоплением полисахаридов. Для красной водоросли Cystoclonium purpureum, произрастающей в умеренных широтах, между содержанием полисахаридов, освещенностью и температурой воды наблюдалась обратно пропорциональная зависимость, как и для исследуемой нами A. flabelliformis, при этом периоды активного роста растения сопровождались снижением количества полисахаридов [168]. Напротив, для двух других представителей умеренных широт Tichocarpus crinitus [164] и Solieria chordalis [22] наибольшее накопление полисахаридов отмечалось в условиях благоприятных для роста водоросли: для первой из них – это высокая температура и низкий уровень ФАР, достигающий талломов водоросли, а для второй – высокие освещенность и соленость. Для красных водорослей субтропических и тропических широт взаимосвязь между скоростью роста водоросли и аккумуляцией полисахаридов так же неоднозначна, как и для водорослей, произрастающих в умеренных широтах. Так, для агарофитов G. crinale и Gracilaria multipartita, произрастающих в субтропиках, между скоростью роста растения и количеством продуцируемого полисахарида установлена обратно пропорциональная зависимость, при этом необходимым условием для накопления полисахаридов у G. multipartita являлась высокая освещенность [163], тогда как у G. crinale – низкие освещенность и температура воды [178]. Подобная взаимосвязь между содержанием полисахарида и ростом водоросли была найдена у H. musciformis, обитающей в тропических широтах, при 68 этом максимальная продукция полисахарида данной водорослью наблюдалась при высокой температуре воды [29]. Обратно пропорциональная зависимость между накоплением каррагинана и освещенностью, скоростью роста и содержанием белка показана и для тропической водоросли Eucheuma isiforme [31]. Напротив, периоды накопления полисахарида водоросли Kappaphycus alvarezii, собранной у берегов Вьетнама, совпадали с периодами активации роста растения (низкие температура воды и освещенность) [21]. Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что корреляция между скоростью роста макрофитов и биосинтезом в них полисахаридов определяется условиями произрастания водорослей. Для исследуемой нами водоросли A. flabelliformis в июле-сентябре наблюдалось снижение количества полисахаридов до минимальных годовых значений (рис. 10). Данное явление, вероятно, связано не с активным ростом растения, а с общей потерей биомассы водоросли в условиях совместного неблагоприятного воздействия высоких интенсивностей света и температуры воды, что косвенно подтверждается падением содержания белка и сухого вещества водоросли (рис. 10), а также процессами фотоингибирования, которые были отмечены у A. flabelliformis в этот период [234]. Высокое содержание ПС в талломах водоросли в апреле, несмотря на резкое повышение уровня ФАР, вероятно, обусловлено таянием льда, в результате чего температура воды, которая в большей степени влияет на накопление полисахарида (табл. 7) (коэффициент Спирмена температуры воды выше, чем ФАР), остается в этот период невысокой (+5,5°С), что в целом благоприятствует биосинтезу полисахаридов, количество которых достоверно не изменяется по сравнению с мартом (рис. 10). В мае-июне содержание полисахаридов в тканях A. flabelliformis было ниже по сравнению с зимними месяцами, что, по-видимому, не связано со снижением синтеза углеводов в этот период, так как условия произрастания водоросли не являются стрессовыми превалированием оказываются (табл. молодой 5). растущей благоприятными. Данное ткани, Таким явление для образом, роста можно объяснить которой скорость условия накопления полисахаридов может оставаться прежней, но количество его на единицу биомассы растения будет меньше. 69 Анализ моносахаридного состава ПС A. flabelliformis показал, что основными моносахаридами являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза – структурные компоненты каррагинана и агара, количество которых незначительно варьировало в течение года (табл. 8). Согласно значениям коэффициента Спирмена статистически достоверно значимой (Спирмен тест, Р > 0,05) корреляционной связи между содержанием галактозы, 3,6-ангидрогалактозы и факторами внешней среды (температура воды, ФАР) в течение года обнаружено не было (табл. 7). Отсутствие влияния факторов окружающей среды на содержание галактозы и 3,6ангидрогалактозы, наблюдаемое нами у A. flabelliformis, было отмечено также и у представителей красных водорослей субтропических широт H. musciformis [235] и E. uncinatum [23]. Напротив, для тропической водоросли E. isiforme установлена прямо пропорциональная взаимосвязь между количеством 3,6-ангидрогалактозы и освещенностью [31]. Таблица 8 – Химический состав полисахаридов, выделенных из высушенной водоросли A. flabelliformis (80°С), собранной с февраля по декабрь 2009 г. в Амурском заливе (мыс Красный, Японское море) Месяц сбора февраль март апрель май июнь июль август сентябрь ноябрь декабрь Содержание (%) от массы навески Gal AnGal Glc Xyl SO3Na 42,2 29,1 28,3 30,2 27,6 32,6 32,2 34,3 28,1 32,5 12,7 12,4 13,1 14,0 17,4 15,6 14,8 11,5 13,0 14,3 4,7 3,5 4,0 3,1 1,2 1,6 2,0 2,1 1,5 2,0 4,3 3,2 2,8 3,5 1,6 1,7 1,6 2,3 2,8 2,7 23,2 25,3 26,7 27,0 25,6 26,6 26,1 21,7 25,1 24,2 Молярное соотношение AnGal:Gal:SO3Na 1,0:2,9:2,6 1,0:2,1:2,9 1,0:1,9:2,8 1,0:1,9:2,7 1,0:1,4:2,1 1,0:1,9:2,4 1,0:1,9:2,5 1,0:2,6:2,6 1,0:1,9:2,7 1,0:2,0:2,4 Примечание: Gal – галактоза; AnGal – 3,6-ангидрогалактоза; Glc – глюкоза; Xyl – ксилоза В то же время химический анализ показывает высокое содержание галактозы в полисахариде, выделенном из водоросли A. flabelliformis, собранной в феврале, а 3,6-ангидрогалактозы – в июне (LSD-тест, P < 0,05) (табл. 8). В летние месяцы наблюдается постепенное снижение содержания СВ водоросли по сравнению с 70 зимне-весенним периодом (рис. 10), что свидетельствует об увеличении скорости роста макрофита. В этот же период увеличивается содержание 3,6- ангидрогалактозы – моносахарида, определяющего в основном гелеобразующие свойства полисахарида (табл. 8). Это может быть связано с тем, что в молодых частях растения синтезируются преимущественно желирующие полисахариды. Подобная зависимость была отмечена ранее у тропической водоросли K. alvarezii [21]. Помимо галактозы и 3,6-ангидрогалактозы в ПС из A. flabelliformis присутствуют незначительные количества глюкозы и ксилозы (табл. 8). Максимальное содержание этих моносахаридов зарегистрировано в период с февраля по май, а минимальное – в летние месяцы. В ноябре-декабре содержание ксилозы частично восстанавливается до уровня (LSD-тест, P < 0,05), отмеченного в весенний период. Температура воды оказывает статистически достоверное отрицательное влияние на содержание как глюкозы (Спирмен тест, Р < 0,05), так и ксилозы (Спирмен тест, Р < 0,001) в ПС A. flabelliformis в течение года (табл. 7). Высокое содержание сульфатных групп в ПС A. flabelliformis наблюдается в апреле-мае (табл. 8). Анализ взаимосвязи между количеством сульфатных групп в ПС водорослей и среднесуточной дозой ФАР в месте обитания растений показывает статистически достоверную (Спирмен тест, Р < 0,01) положительную корреляцию (табл. 5, 7). Подобная зависимость была получена ранее для S. chordalis, обитающей в умеренных широтах [236], и для субтропической водоросли E. uncinatum [23]. Ранее была отмечена защитная роль сульфатированных полисахаридов водоросли при окислительном стрессе и их способность удалять реактивные формы кислорода, образующиеся в клетке растения при высокой освещенности [237, 238]. Считается, что антиоксидантный механизм заключается в том, что сульфатированные полисахариды являются источником водорода, способного связывать активные радикалы, обрывая радикальную цепную реакцию [239]. В апреле и июле-августе при высокой освещенности исследуемая нами водоросль A. свидетельствует flabelliformis высокий подвергалась уровень окислительному малонового диальдегида стрессу, [234]. о чем Можно предположить, что продукция растением высоко сульфатированного полисахарида 71 в периоды высокой освещенности связана с адаптивной реакцией растения к окислительному стрессу с целью сохранения его жизнеспособности. Молярное соотношение основных моносахаридных остатков полисахаридов – каррагинана и агара, а именно, галактозы и 3,6-ангидрогалактозы, и сульфатных групп, приведенное в таблице 8, позволяет сделать предположение о структурных особенностях полисахаридов, синтезируемых в июне и феврале. Так, для полисахарида из A. flabelliformis, собранной в июне, вероятно, характерна более регулярная структура (молярное соотношение AnGal:Gal 1,0:1,4) типичная для желирующих типов каррагинанов, когда в дисахаридном звене на одну галактозу приходится одна 3,6-ангидрогалактоза. В то же время для полимера из водоросли, собранной в зимние месяцы, этой регулярности не наблюдается (молярное соотношение AnGal:Gal 1,0:2,9), что может свидетельствовать о гибридной структуре этого полисахарида. Таким образом, наиболее благоприятным временем сбора водоросли A. flabelliformis, позволяющим получить полисахариды с высоким выходом, является период, характеризующийся низкими температурами воды и ФАР (ноябрьфевраль). В то же время в условиях высокой освещенности среды обитания водоросли (апрель, июль-август) в клеточной стенке макрофита синтезируются галактаны с высокой степенью сульфатирования. 2.3. Комплексное выделение фикобилипротеинов и полисахаридов водоросли A. flabelliformis Перспективы широкого использования компонентов клеточной стенки красных водорослей – ФБП и полисахаридов в различных областях промышленности и медицины [8, 9, 10, 13, 15, 19, 151, 240] обуславливают необходимость разработки методов их комплексного извлечения c максимальным выходом продуктов. Кроме того, получение этих соединений в едином технологическом цикле является основой рационального использования природных ресурсов и позволяет сократить количество отходов производства. 72 2.3.1. Выделение фикобилипротеинов и полисахаридов Известно, что биосинтез полисахаридов в клеточной стенке макрофитов определяется не только видовой принадлежностью водоросли, но и стадией ее жизненного цикла [20]. В связи с этим, водоросли A. flabelliformis, собранные в июле 2012 г. в б. Троицы, были проанализированы по морфологическим признакам и разобраны на две группы – репродуктивную форму (с цистокарпами) и стерильные растения. Для выделения пигментов использовали два метода: экстракцию 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,8) (метод 1) и 1,5% водным раствором нитрата натрия (pH 6,5) (метод 2). ФБП из A. flabelliformis с цистокарпами экстрагировали по методу 1 и 2, а ФБП из стерильных растений – по методу 2. Идентификацию пигментов проводили спектральным методом по максимумам поглощения, характерным для ФЭ в области 565 нм, ФЦ – 615 нм и АФЦ – 650 нм. Содержание ФБП A. flabelliformis, рассчитанное согласно их величинам поглощения 1% раствора вещества в кювете 1 см [241], приведено в таблице 9. Таблица 9 – Содержание ФБП, выделенных из A. flabelliformis, собранной в июле 2012 г. (в мг/г сухой массы водоросли) Пигмент ФЭ ФЦ АФЦ Цистокарпы метод 1 метод 2 0,78±0,08 1,44±0,05* 0,17±0,01 0,27±0,02* 0,17±0,04 0,21±0,02 Стерильное растение метод 2 1,35±0,04* 0,11±0,02*,** 0,33±0,03*,** Примечание: * – P < 0,05 между методами 1 и 2; ** – P < 0,05 между цистокарпами и стерильными растениями метода 2. Количество ФБП, экстрагируемых методом 2, выше, чем методом 1 (табл. 9). При этом экстракция водным раствором нитрата натрия увеличивает выход ФЭ в 2 раза (one-way ANOVA), а ФЦ – в 1,5 раза, по сравнению с фосфатным буфером. Следует отметить, что наряду с этим количество экстрагируемых пигментов определяется и стадией развития водоросли. Выход ФЦ из репродуктивной водоросли (цистокарпы) был в 2,5 раза выше, чем из стерильных растений, тогда как количество АФЦ – в 1,5 раза ниже. 73 После извлечения пигментов из водоросли выделяли полисахариды, проводя их экстракцию водой при 80°С трижды, как описано в главе «Экспериментальная часть». Для сравнения наряду с этим была проведена экстракция полисахаридов из репродуктивной (цистокарпы) формы A. flabelliformis без предварительного выделения пигментов. Выходы полисахаридов представлены в таблице 10. Таблица 10 – Выходы и химический состав полисахаридов (ПС), выделенных при 80°С из A. flabelliformis, собранной в июле 2012 г. SO3Na Xyl Содержание, % от навески ПС Glc Выход ПС, % от сухой массы водоросли AnGal Метод выделения ФБП Gal Стадия жизни Молярное соотношение AnGal:Gal:SO3Na цист. без 31,5±2,7 34,4 13,0 3,7 2,7 22,6 1,0:2,4:2,4 экстракции ФБП метод 1 51,3±4,3*,** 32,8 12,6 2,9 0,9 21,4 1,0:2,3:2,4 *,** метод 2 49,3±1,2 35,8 13,3 2,7 1,4 24,1 1,0:2,4:2,5 ст. р. метод 2 31,8±1,8 30,3 15,2 1,7 1,5 15,8 1,0:1,8:1,5 Примечание: цист. – цистокарпы, ст. р. – стерильные растения, * – P < 0,05 между выходами ПС без экстракции ФБП и с экстракцией ФБП; ** – P < 0,05 между стерильными растениями и цистокарпами после экстракции ФБП. Согласно результатам анализа, в результате последовательной экстракции выход полисахаридов был в 1,6 раз больше, чем без предварительного выделения пигментов, что можно объяснить дополнительным разрушением клеточной стенки водоросли в процессе первоначальной экстракции пигментов. Количество экстрагируемого полисахарида в значительной степени зависит и от стадии развития макрофита [80, 242]. Как видно из таблицы 10, содержание полисахаридов у A. flabelliformis с цистокарпами в 1,5 раза выше, чем у стерильных растений независимо от способа выделения пигментов. Подобная тенденция наблюдалась и для водоросли T. crinitus: водоросль с цистокарпами содержала в 2 раза больше полисахаридов, чем стерильное растение [180]. Напротив, для водорослей Chondrus pinnulatus и C. crispus наибольшее количество полисахаридов было выделено из стерильных растений [161, 177]. В то же время водоросль Gigartina skottbergii, представленная и стерильной, и репродуктивной (с цистокарпами) формами, продуцировала равные количества полисахаридов [159]. 74 Для водоросли Gracilaria verrucosa, структурным компонентом которой является агар, было установлено, что содержание полисахаридов уменьшается при смене одной стадии другой в следующем порядке: водоросли с цистокарпами, с тетраспорофитами, вегетативная форма и мужской гаметофит [81]. Согласно полученным нами данным, водоросль A. flabelliformis, находящаяся на репродуктивной стадии развития (с цистокарпами), продуцирует значительно больше ФБП и полисахаридов, чем стерильные растения. 2.3.2. Фракционирование фикобилипротеинов Фикоэритрин – основной ФБП красных водорослей – может быть использован в качестве необходимой для современных биохимических и иммунологических методов исследования флуоресцентной метки, поэтому важным представляется получение этого пигмента в индивидуальном состоянии. Для очистки и фракционирования смеси ФБП, полученной методом 1 из A. flabelliformis с цистокарпами, использовали адсорбционную хроматографию на колонке со свежеприготовленным фосфатом кальция. Из анализа выходных кривых, представленных на рисунке 11, видно, что в результате хроматографии был получен чистый фикоэритрин. 0,14 ФЭ 0,12 ФЦ АФЦ А 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 25 50 75 100 125 150 175 200 V, мл Рисунок 11 – Адсорбционная хроматография смеси ФБП, выделенных методом 1 из A. flabelliformis с цистокарпами 75 2.3.3. Химический и структурный анализ полисахаридов Ранее было показано, что полисахаридный состав водоросли T. crinitus зависит от фазы ее жизненного роста [93], в то время как полисахариды водоросли G. skottbergii, представленной стерильными растениями и репродуктивной формой с цистокарпами, не отличались по своему моносахаридному составу [159]. В связи с этим, нами был проведен сравнительный химический анализ полисахаридов, выделенных из репродуктивной и стерильной форм водоросли A. flabelliformis. Согласно результатам химического анализа, основными моносахаридами выделенных полисахаридов являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза – главные структурные компоненты каррагинана и агара (табл. 10). Как видно из таблицы 10, содержание галактозы во всех исследуемых образцах полисахаридов было достаточно высоким (30-36%) независимо от стадии развития водоросли. В то же время количество 3,6-ангидрогалактозы в полисахаридах из стерильных растений было несколько выше, а содержание сульфатных групп в 1,5 раза ниже, чем у растений с цистокарпами. Помимо основных моносахаридов, в полисахаридах A. flabelliformis также присутствовали в незначительных количествах глюкоза и ксилоза (табл. 10). Наличие глюкозы в исследуемых образцах указывает на присутствие флоридного крахмала, структурным компонентом которого является данный моносахарид [1]. Наибольшее количество глюкозы и ксилозы содержалось в полисахариде, выделенном из водоросли A. flabelliformis без предварительной экстракции ФБП. Следует отметить, что молярные соотношения AnGal:Gal:SO3Na у полисахаридов, выделенных из репродуктивных и стерильных растений A. flabelliformis принципиально отличались, главным образом из-за большего содержания 3,6-ангидрогалактозы и низкого количества сульфатных групп в последнем (табл. 10). Для проведения сравнительного анализа структуры полисахаридов из водорослей с цистокарпами и стерильных растений использовали метод ИКспектроскопии. Полученные спектры полисахаридов были сопоставлены со спектрами каррагинанов с известными предельными структурами. В ИК-спектрах исследуемых полисахаридов наблюдаемая интенсивная полоса поглощения в области 1240-1250 см-1 (рис. 12) указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп (-S=O ассиметричная вибрация) [123]. При этом 76 следует отметить, что эта полоса поглощения для полисахаридов из A. flabelliformis с цистокарпами (рис. 12 А) более интенсивная, чем для полисахаридов из стерильных растений (рис. 12 Б), что указывает на более высокое содержание сульфатных групп в первом образце. Согласно оценке, проведенной из ИКспектров полисахаридов по отношениям интенсивностей полос А1250/А1074, содержание сульфатных групп в полисахариде из репродуктивной водоросли в 1,2 раза выше, что хорошо согласуется с результатами химического анализа (табл. 10). В обоих спектрах наблюдается полоса поглощения при 932 см-1, характерная для 3,6-ангидрогалактозы (C-O вибрация), и полоса поглощения при 849 см-1, относящаяся к вторичной аксиальной сульфатной группе при С-4 1,3-связанного остатка β-D-галактозы, что позволяет предположить, что в структурах обоих полисахаридов присутствуют дисахаридные звенья κ-типа [243]. Кроме того, в спектре полисахарида из A. flabelliformis с цистокарпами, в отличие от полисахарида из стерильных растений, присутствует полоса поглощения при 805 см-1 (рис. 12 А), которая характерна для вторичной аксиальной сульфатной группы при С-2 остатка 3,6-ангидро-D-галактозы, что может указывать на присутствие в структуре полисахарида дисахаридных звеньев ι-типа [126]. Следует отметить, что в ИК-спектре полисахарида из стерильных растений присутствует полоса слабой интенсивности при 890 см-1 (рис. 12 Б), указывающая на наличие несульфатированного остатка галактозы (C-H вибрация), что характерно как для βи α-типов каррагинанов [123], так и для агара [124]. Таким образом, данные ИКспектроскопии свидетельствуют о том, что полисахарид из водоросли с цистокарпами представляет собой в основном κ/ι-каррагинан, а из стерильных растений – κ-каррагинан, содержащий остатки несульфатированной галактозы. 77 Рисунок 12 – ИК-спектры полисахаридов, выделенных из репродуктивной (с цистокарпами) (А) и стерильной (Б) форм A. flabelliformis Таким образом, последовательная экстракция из водоросли ФБП и полисахаридов позволяет увеличить выход последнего в 1,6 раз, при этом более эффективно пигменты экстрагируются из водоросли водным 1,5% раствором NaNO3. Содержание ФБП и полисахаридов в репродуктивной водоросли выше, чем в стерильной. Полисахариды из двух форм водоросли имеют близкие структуры, характерные для κ-каррагинана, но отличаются присутствием ι-типа каррагинана в полисахариде из водоросли с цистокарпами. 2.4. Структура полисахарида, выделенного из стерильной формы A. flabelliformis Известно, что особенности структуры полисахаридов красных водорослей, определяющие физико-химические свойства этих полимеров, а также играющие важную роль в проявлении ими физиологической активности, в значительной степени зависят не только от условий обитания макрофита, но и от стадии его жизненного цикла [1]. В связи с этим, большая часть работы посвящена установлению структуры полисахаридов, выделенных из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм A. flabelliformis. 2.4.1. Выделение, фракционирование и химический анализ полисахаридов Полисахарид, выделенный из стерильной формы A. flabelliformis, разделяли на желирующую (KCl-нерастворимую) и нежелирующую (KCl-растворимую) 78 фракции, выход и состав которых представлен в таблице 11. Как видно из таблицы 11, стерильная форма анфелтиописа накапливает преимущественно желирующую фракцию полисахаридов. Таблица 11 – Выход и химический анализ полисахаридных фракций из стерильной водоросли A. flabelliformis, собранной в б. Троицы в июле 2012 г. Xyl SO3Na 8,1 11,9 11,6 Glc 31,8 25,1 4,1 Содержание, % от навески ПС AnGal Σ А В Выход Содерж ПС, % от ание Б, сухой % массы водоросли Gal Фракция 34,9 35,1 33,6 15,0 21,8 2,3 2,0 2,1 4,2 2,1 1,1 5,1 18,7 21,6 23,4 Молярное соотношение AnGal:Gal:SO3Na 1:2,1:1,7 1:1,4:1,4 1:13,0:14,2 Примечание: А – KCl-нерастворимая фракция, В – KCl-растворимая фракция, ПС – полисахарид, Б – белок. Основными моносахаридами полученных полисахаридов являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза (табл. 11), при этом содержание последнего в KClнерастворимой фракции в 9,5 раз больше, чем в KCl-растворимой. Полисахариды содержат также глюкозу и ксилозу, количество которых в желирующем полисахариде было незначительным. Наличие глюкозы в исследуемых образцах, вероятно, обусловлено присутствием в клеточной стенке водоросли флоридного крахмала [1]. Высокое содержание ксилозы было определено в KCl-растворимом полисахариде из Gymnogongrus griffithsiae [208]. Ксилоза в исследуемых полисахаридах может присутствовать либо за счет ксилана, соэкстрагируемого с галактаном [1], либо в качестве единичных остатков ксилозы, замещающих гидроксильные группы галактана [81, 83]. Наличие остатков ксилозы при С6 1,3связанной β-D-галактозы или при С3 1,4-связанной α-D-галактозы было отмечено для водорослей семейства Corallinaceae [82, 83 84] и Solieriaceae [85] соответственно. Так как согласно литературным данным некоторые водоросли семейства Phyllophoraceae могут быть источником как агара, так и каррагинана [98, 208], то для идентификации и отнесения выделенного полисахарида к группе каррагинана 79 или агара проводили частичный восстановительный гидролиз и анализировали полученный гидролизат с помощью ГЖХ. Согласно полученным результатам желирующий полисахарид из A. flabelliformis включает в себя только дисахаридные звенья 4-О-β-D-галактопиранозил-3,6-ангидро-D-галактозы (каррабиоза). Для регулярных структур каррагинанов молярное соотношение AnGal:Gal должно составлять 1:1, тогда как в случае полисахарида из A. flabelliformis это соотношение составляет 1:1,4 (табл. 11). Молекулярные массы желирующего и нежелирующего полисахаридов из водоросли A. flabelliformis, измеренные вискозиметрически, были невысокими и составили 84 и 90 кДа соответственно. 2.4.2. Структурный анализ желирующего полисахарида 2.4.2.1. ИК-Фурье спектроскопия Для идентификации полисахарида и отнесения его к определенному типу каррагинанов использовали методы ИК-Фурье и ЯМР спектроскопии. Полученные спектры были сопоставлены со спектрами известных структур каррагинанов. ИКспектр желирующего полисахарида (рис. 13) аналогичен спектру суммарной фракции полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis (рис. 12 Б). В ИКспектре исследуемого полисахарида интенсивная полоса поглощения в области 1229 см-1 (рис. 13) указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп (-S=O ассиметричная вибрация) [123], что хорошо согласуется с результатами химического анализа (табл. 11). В этом спектре наблюдается полоса поглощения при 932 см-1, характерная для 3,6-ангидрогалактозы (C-O вибрация) [244], и полоса поглощения при 847 см-1, относящаяся к вторичной аксиальной сульфатной группе при С-4 1,3-связанного остатка β-D-галактозы, что позволяет отнести желирующую фракцию к κ-типу каррагинана [243]. Присутствие полосы слабой интенсивности при 892 см-1 указывает на наличие несульфатированного остатка галактозы (C-H вибрация), что характерно как для β-, так и для α-типов каррагинана [123]. Отсутствие явной полосы поглощения при 805 см-1, характерной для сульфатной группы при С-2 3,6-ангидрогалактозы свидетельствует в пользу β-типа полисахарида (рис. 13). 80 α-каррагинана, Рисунок 13 – ИК-спектр желирующего полисахарида из стерильной формы A. flabelliformis 2.4.2.2. Спектроскопия 1Н и 13С ЯМР В спектре 13 С ЯМР желирующего полисахарида в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдается четыре сигнала разной интенсивности (рис. 14 Б). Плохо разрешенные сигналы двойной интенсивности с химическими сдвигами 103,2 и 103,3 м.д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 1,3-связанных остатков β-D-галактозы, а сигналы при 95,6 и 95,2 м.д. относятся к атомам С-1 1,4-связанных остатков 3,6-ангидро-α-галактозы κ- и β-каррагинанов соответственно [131, 245]. В области резонанса аномерных протонов спектра 1Н ЯМР также присутствуют четыре сигнала различной интенсивности (рис. 14 А). Сигналы при 4,61 и 4,64 м.д. характерны для Н-1 1,3-связанного остатка β-Dгалактозы, а сигналы при 5,10 и 5,12 м.д. – для Н-1 1,4-связанного остатка 3,6ангидро-α-галактозы β- и κ-каррагинанов соответственно [106, 246]. Интегральные интенсивности сигналов при 5,12, 5,10 и 4,87 м.д. имеют соотношение 3:1:3. Присутствующие в спектре 1Н ЯМР (рис. 14 А) сигналы слабой интегральной интенсивности при 5,32 и 5,20 м.д. могут быть отнесены к аномерным протонам остатков 3,6-ангидро-α-галактозы 2-сульфат ι-каррагинана и α-галактозы 6-сульфат γ-каррагинана соответственно [106]. DEPT-135 эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 62,0 и 70,1 м.д., последняя из которых замещена, как видно из значения величины ее химического сдвига. 81 Рисунок 14 – Спектры 1H (А) и 13С (Б) ЯМР желирующего полисахарида, выделенного из стерильной формы водоросли A. flabelliformis Таблица 12 – Таблица величин химических сдвигов углерода и протонов (δ м.д.) в спектрах 1Н и 13 С ЯМР желирующего полисахарида из стерильной формы A. flabelliformis Тип МС каррагинана остаток κ G4S DA β G DA′ Тип МС каррагинана остаток κ G4S DA β G DA′ H химические сдвиги (м.д.) Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 3,60 3,99 4,87 3,80 4,14 4,52 4,62 4,66 3,62 3,86 4,14 3,70 4,08 4,53 4,62 4,66 13 С химические сдвиги (м.д.) С-2 С-3 С-4 С-5 70,0 79,0 74,3 75,5 70,2 79,7 78,7 77,3 70,1 80,6 66,7 76,1 70,6 79,7 78,7 77,3 1 Н-1 4,64 5,12 4,61 5,10 С-1 103,2 95,6 103,3 95,2 Примечание: МС – моносахарид 82 Н-6 3,80-3,70 4,20-3,62 3,80-3,70 4,20-3,62 С-6 62,0 70,1 62,0 70,1 Анализ двумерных спектров 1Н-1Н COSY (рис. 15 А), 1Н-1Н ROESY и 1Н-13С HSQC (рис. 15 Б) позволил провести отнесение сигналов протонов моносахаридных остатков, C/H корреляцию, представленную в таблице 12, и определить порядок моносахаридными и последовательность остатками. В области гликозидных резонанса связей между аномерных атомов гетероядерного 2D спектра 1Н-13С HSQC присутствуют кросс-пики Н-1/С-1 при 5,10/95,2, 5,12/95,6, 4,64/103,2 и 4,61/103,3м.д., соответствующие четырем типам остатков галактозы (рис. 15 Б, табл. 12). Дальнейший анализ спектров показал, что в структуре полисахарида присутствуют два типа дисахаридных звеньев, которые отличаются друг от друга только наличием или отсутствием сульфатной группы при С-4 1,3-связанного остатка β-D-галактопиранозы. Кросс-пики при 4,87/74,3 и 4,14/66,7 м.д. соответствуют Н-4/С-4 сульфатированного (G4S) и несульфатированного (G) 1,3-связанного остатка β-галактозы. На наличие сульфатной группы при С-4 1,3-β-D-галактозы указывает то, что сигнал в спектре 13 С ЯМР оказывается сдвинут на 7,6 м.д. в область слабого поля по сравнению с сигналом С-4 несульфатированной 1,3-β-D-галактозы, что хорошо согласуется с литературными данными [131, 245]. Кросс-пик при 3,8/62,0 м.д. был отнесен к протону при С-6 1,3-связаного остатка как G4S, так и G (рис. 15 Б). Ярко выраженные кросс-пики при 4,53/79,7 и 4,62/ 78,7 м.д. присутствуют в спектре в результате наложения сигналов С-3 и С-4 соответственно остатков DA и DA'. Согласно спектру 1Н-13С HSQC, триплет в области 70,0-70,8 м.д. образуется в результате наложения многочисленных углеродных сигналов G4S-2 и G-2, DA-2 и DA'-2, а также DA-6 и DA'-6 (рис. 15 Б, табл. 12). Эффект гликозилирования галактопиранозного остатка по С-3 свидетельствует о том, что моносахаридные остатки в составе обоих дисахаридных звеньев имеют D-конфигурацию, что хорошо согласуется с результатами частичного восстановительного гидролиза, указывающими на наличие только звеньев каррабиозы. 83 Рисунок 15 – Спектры 1H-1H COSY (А) и 13C-1H HSQC (Б) желирующего полисахарида из A. flabelliformis Спектр 1H-1H ROESY позволил определить порядок и последовательность гликозидных связей между моносахаридными остатками. Согласно данным спектра 1H-1H ROESY (не приведен), кросс-пики между сигналами Н-1 DA и Н-3, Н-4 G4S (5,12/3,99 и 5,12/4,87 соответственно) и Н-1 DA' и Н-3, Н-4 G (5,10/3,86 и 5,10/4,14 соответственно), а также H-1 G4S и H-4,5 DA (4,64/4,62 и 4,64/4,66 соответственно) и H-1 G и H-4,5 DA' (4,61/4,62 и 4,61/4,66 соответственно) указывает на то, что в обоих типах дисахаридных звеньев остатки галактозы и 3,6ангидрогалактозы соединены чередующимися β-(1→4) и α-(1→3)-связями. Таким образом, из данных химического анализа, ИК-, а также 1D и 2D ЯМР спектроскопии следует, что исследуемый желирующий полисахарид из стерильной формы водоросли A. flabelliformis представляет собой κ/β-каррагинан с соотношением звеньев κ- и β-типа 3:1 и содержит минорные количества ι- и γкаррагинанов. В отличие от наших данных, водоросли G. torulosus и G. griffithsiae, принадлежащие так же, как и исследуемая нами водоросль A. flabelliformis, семейству Phyllophoraceae, продуцируют количеством агарановых структур [98, 208]. 84 κ/ι-каррагинан с незначительным 2.4.2.3. МАЛДИ масс-спектрометрия Для изучения особенностей строения полисахарида, включая получение информации о минорных компонентах (γ- и ι-звеньев), был использован метод масс-спектрометрии (МС) с матрично-лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ). Для этого исходный полисахарид был деполимеризован мягким кислотным гидролизом. Согласно данным спектроскопии 13С и 1H ЯМР, в исследуемом полисахариде присутствуют звенья несульфатированного β-каррагинана. Предполагая, что скорость гидролиза несульфатированного полисахарида выше, чем высокосульфатированного, мы провели анализ олигосахаридов, полученных в результате гидролиза полисахарида в течение 2 и 24 ч (0,1 N HCl при 37°C). Уже за 2 ч гидролиза масс-спектр МАЛДИ (не приведен) в режиме регистрации анионов показал наличие как коротких, так и протяженных (до 1,5 кДа) сульфатированных олигосахаридов. Необходимо отметить, что в режиме регистрации катионов, наряду с сульфатированными фрагментами были обнаружены несульфатированные олигосахариды. Факт обнаружения несульфатированных фрагментов (β-звеньев) на ранней стадии гидролиза (2 ч) свидетельствует о том, что полисахарид содержит довольно большое количество таких фрагментов, скорость отщепления которых по сравнению с κ-блоками выше. Анализ продуктов 24-часового гидролиза полисахарида по данным МАЛДИ МС показал, что олигосахаридный состав смеси поменялся незначительно (выросли интенсивности некоторых сигналов). При этом из спектра практически исчезли сигналы-сателлиты (М-18) в результате отрыва воды в источнике ионов масс-спектрометра, что, вероятно, связано с разрушением сильнозаряженных высокомолекулярных фрагментов. Таким образом, фрагменты, обнаруженные в смеси за 24 ч гидролиза, достаточно стабильны для анализа, и их строение вполне может отражать структурные характеристики исходного полисахарида. Состав и строение ключевых фрагментов гидролизатов за 2 и 24 ч (как сульфатированных, так и несульфатированных) были охарактеризованы с помощью МАЛДИ МС с использованием тандемного режима МС/МС, когда исследуемый ион «разбивается» в источнике путем подъема потенциала (“potential LIFT”) (табл. 13). Необходимо отметить, что, согласно полуколичественной оценке 85 методом МАЛДИ МС, основными компонентами смеси является дисахаридное звено κ-каррагинана (рис. 16 А, m/z 449,01 и табл. 13, № 1) и «гибридный» тетрасахарид, содержащий фрагменты как κ-, так и β-звеньев (рис. 16 А, m/z 755,13 и табл. 13, № 6), наличие которых в цепи полисахарида согласуется с данными спектроскопии 13C ЯМР (рис. 14 Б). Рисунок 16 – Масс-спектр МАЛДИ положительных ионов (A) и отрицательных ионов (Б) олигосахаридов, полученных кислотным гидролизом желирующего полисахарида (HCl, 37 °C, 24 ч) из стерильной формы A. flabelliformis 86 Таблица 13 – Структурные характеристики ключевых фрагментов, обнаруженных методом МАЛДИ масс-спектрометрии в смеси олигосахаридов, полученной кислотным гидролизом желирующего полисахарида из A. flabelliformis за 2 и 24 ч № 1 2 Режим регистрации анионов состав/структурные m/z характеристики иона [M*– Na][DA-G4S]403,04 [G4S-DA][DA-G4S-DA]- 547,10 Режим регистрации катионов № m/z состав/структурные характеристики иона [M + Na]+ [G-DA + Na]+ [DA-G + Na]+ [G-D + Na]+ [D-G + Na]+ 17 347,09 18 365,13 19 491,14 [DA-G-DA + Na]+ 509,14 [G-DA-G + Na]+ [DA-G-D + Na]+ 611,09 [D-DA-G4S + Na]+ [G4S-DA-D + Na]+ DA-G4S-D + Na]+ - 3 4 5 565,12 649,03 [DA-G-D6S] [D6S-G-DA][G-G4S-DA][DA-G4S-DA2S][DA2S-G4S-DA]только в спектре за 2 ч гидролиза [DA-G4S-D6S][D6S-G4S-DA]- 667,04 20 21 [G4S-DA-G-DA][G-DA-G-DA + Na]+ 6 709,16 [G-DA-G4S-DA]22 653,18 [DA-G-DA-G + Na]+ [DA-G4S-DA-G][G-DA-G4S-D][DA-G-D-G + Na]+ 7 727,16 23 671,17 [G-D-G4S-DA] [G-D-G-DA + Na]+ [(DA-G4S)2][(G4S-DA)2]8 811,09 24 797,23 [Ac(AnGal)2Gal2(SO3Na) + Na]+ [G-DA-G4S-DA2S][G4S-DA2S-G-DA][G-DA-G4S-D6S]9 829,11 25 899,16 [(AnGal)3Gal2(SO3Na) + Na]+ [G-D6S-G4S-DA]10 853,21 [(AnGal)3Gal(SO3Na)]26 917,18 [(AnGal)2Gal3(SO3Na) + Na]+ 11 871,21 [(AnGal)2Gal3(SO3Na)] 27 959,29 [Ac(AnGal)2Gal3(SO3Na) + Na]+ 12 955,14 [(AnGal)3Gal2(SO3Na)2]- 28 1061,23 [(AnGal)3Gal3(SO3Na) + Na]+ 13 1015,27 [(AnGal)3Gal3(SO3Na)2]- 29 1079,24 [(AnGal)2Gal4(SO3Na) + Na]+ 14 1033,27 [(AnGal)2Gal4(SO3Na)] 30 1103,33 [Ac(AnGal)3Gal3(SO3Na) + Na]+ 15 1117,22 [(AnGal)3Gal3(SO3Na)2]- 31 1163,18 [(AnGal)3Gal3(SO3Na)2 + Na]+ 16 1219,18 [(AnGal)3Gal3(SO3Na)3] 32 1265,43 [(AnGal)3Gal3(SO3Na)3 + Na]+ Примечание: *М представляет собой натриевую соль моно/олигосахарида в случае, если он сульфатирован Тандемный МАЛДИ масс-спектр аниона с m/z 667,04 (рис. 17 А) интересен тем, что он, в отличие от большинства спектров сульфатированных олигосахаридов, полученных из каррагинанов, содержит сигнал, соответствующий фрагментному иону 0,2 А3 с m/z 607,00, образующемуся в результате разрыва 87 гексапиранозного кольца галактозы 6-сульфатированной (D6S) на восстанавливающем конце, что может указывать на присутствие в полимерной цепи γ-звеньев (предшественник β-каррагинана). Это согласуется с данными спектроскопии позволяющие 1 Н ЯМР (табл. 13, № 6, рис. 14 А). Остальные сигналы, определить последовательность сахаров во фрагменте, соответствующем молекулярному иону с m/z 667,04, типичны [110, 247] для тандемного масс-спектра с диссоциацией, индуцированной столкновением, которые получают в основном с помощью масс-спектрометрии с электрораспылением (ИЭР МС/МС). Рисунок 17 – Тандемные масс-спектры МАЛДИ анионов с m/z 667,04 (А) и m/z 811,09 (Б) Тандемный МАЛДИ масс-спектр аниона с m/z 811,09 (рис. 17 Б) интересен наличием сигнала, соответствующего фрагментному иону Y′2 c m/z 505,00, образующемуся в результате разрыва α-(1→3) гликозидной связи и отщеплению фрагмента ι-звена. Необходимо отметить, что в тандемном масс-спектре фрагмента с m/z 811,09, полученного ранее из κ/β-каррагинана с помощью рекомбинантной κ88 каррагиназы из Alteromonas carrageenovora, не наблюдалось указанного фрагментарного иона [112]. Было показано, что олигосахарид, совпадающий по соотношению m/z с фрагментами, построенными из κ-блоков, в данном случае может состоять из фрагментов, содержащих включения остатков β- и ι-звеньев (табл. 13, № 8). Тандемный МАЛДИ масс-спектр положительного иона (рис. 18) с m/z 671,17, имеющего молекулярную массу, превышающую на 18 «идеальный» фрагмент, построенный из β-звеньев, указывает на факт десульфатирования. Данный фрагмент содержит остатки несульфатированной галактозы. Потеря сульфатной группы при С-6 могла произойти либо в результате ионизации при получении спектра, либо при гидролизе, что ранее наблюдалось для x-каррагинана из тетраспорофитов T. crinitus [160]. Положение 1,4-связанной галактозы было установлено, в том числе благодаря наличию фрагментного иона 0,2А3 с m/z 449,10, соответствующего, вероятно, разрыву внутри кольца одного из остатков 1,4связанной галактозы (рис. 18, структурный вариант сверху). Рисунок 18 – Тандемный масс-спектр МАЛДИ катиона с m/z 671,17 Необходимо отметить, что в масс-спектре положительных ионов (рис. 19) олигосахаридов (гидролиз 0,1 N HCl, 24 ч), полученном с помощью массспектрометра с электрораспылением (ИЭР МС), наблюдались сигналы, соответствующие ионам [Xyl+Na]+ c m/z 173,053 и [XylHex+Na]+ c m/z 335,113. Несмотря на низкую интенсивность сигнала, соответсвующего иону с m/z 335,113, анализ тандемного масс-спектра (рис. 20) позволяет предположить, что данный 89 дисахарид построен из остатков ксилозы и гексозы (вероятнее, галактозы), находящейся на восстанавливающем конце. Рисунок 19 – ИЭР масс-спектр положительных ионов олигосахаридов, полученных гидролизом 0,1 N HCl, 24 ч Рисунок 20 – Тандемный масс-спектр МАЛДИ катиона с m/z 335,11 В полисахариде из водоросли Gracilaria corticata, согласно данным МАЛДИ масс-спектрометрии, был найден олигосахарид, в котором остаток ксилозы был связан с двумя остатками галактозы [207]. Помимо этого, ранее для водорослей семейства Corallinaceae [82, 84] и Solieriaceae [85] уже был установлен факт присутствия β-D-ксилозы в качестве заместителя гидроксильной группы при С6 1,3-связанного остатка β-D-галактозы или при С3 1,4-связанного остатка α-Dгалактозы соответственно. Таким образом, согласно данным МАЛДИ, основными звеньями, входящими в полимерную цепь полисахарида, являются каппа-каррабиоза, каппа- карратетраоза, каппа-каррагексаоза, бета-каррабиоза, бета-карратетраоза, тетра- и гекса-олигосахариды с различной последовательностью чередования каппа- и бетазвеньев и минорные количества йота- и гамма-каррагинана. Согласно данным ИЭР 90 МС/МС, ксилоза, определенная химическим анализом (табл. 11), присутствует в полисахариде в качестве заместителя одной из гидроксильных групп галактозы. 2.5. Структура и свойства полисахарида, выделенного из репродуктивной (карпоспорофит) формы A. flabelliformis 2.5.1. Выделение и фракционирование полисахаридов ионообменной хроматографией Водоросли A. flabelliformis, представленные репродуктивной формой (карпоспорофитами), были собраны в апреле 2009 г. у м. Красный (Амурский залив, Японское море). Экстракцию полисахаридов проводили водой при 80°С. Для фракционирования выделенных полисахаридов использовали 4% раствор KCl, который позволил получить желирующий каррагинан из стерильной формы A. flabelliformis. Однако в случае карпоспорофита анфелтиопсиса использование этой соли не приводило к разделению полисахаридов на желирующую и нежелирующую фракции. Согласно химическому анализу, основными компонентами, входящими в состав исследуемого полисахарида, являются галактоза, 3,6-ангидрогалактоза и сульфатные группы (табл. 14). Помимо этого, в минорных количествах обнаружены глюкоза, ксилоза и белок. Таблица 14 – Выход и химический анализ полисахаридных фракций из карпоспорофита A. flabelliformis, собранного у м. Красный (Амурский залив) в апреле 2009 г. Xyl SO3Na 10,5 7,2 - Glc 22,8 18,8 3,0 Содержание, % от навески ПС AnGal Σ А В Выход Содерж ПС, % от ание Б, сухой % массы водоросли Gal Фракция 28,3 31,6 22,1 13,1 15,6 1,7 4,0 н/о 8,1 2,8 3,1 8,4 26,7 32,6 14,9 Молярное соотношение AnGal:Gal:SO3Na 1:1,9:2,8 1:1,8:2,9 1:11,6:12,3 Примечание: А – CaCl2-нерастворимая фракция, В – CaCl2-растворимая фракция, ПС – полисахарид, Б – белок. 91 Поскольку согласно химическому анализу (табл. 14) исследуемый полисахарид содержит незначительные количества глюкозы и ксилозы, которые могут быть структурными соответственно, для их единицами возможного флоридного отделения крахмала проводили и ксилана ионообменную хроматографию суммарной фракции полисахаридов на колонке с ДЕАЕцеллюлозой. Элюцию проводили ступенчатым градиентом концентраций – 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,0 и 4,0 М NaCl в воде. Фракции анализировали на присутствие сульфатированных полисахаридов по реакции сульфогрупп с голубым Тейлора [248], на общее содержание углеводов – фенол-сернокислотным методом [249] и на присутствие белка по поглощению при 280 нм (рис. 21). 0,45 Af1 0,40 5,0 А535 А490 А280 Af2 0,35 4,5 4,0 3,5 3,0 Af5 0,25 СNaCl, моль/л А 0,30 2,5 0,20 Af6 2,0 Af3 0,15 1,5 Af4 0,10 1,0 0,05 0,5 0,0 0,00 0 100 200 300 400 500 V, мл 600 700 800 900 Рисунок 21 – Ионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе полисахаридов, выделенных их карпоспорофита A. flabelliformis. А535 – реакция сульфогрупп с голубым Тейлора, А490 – фенол-сернокислотный метод, А280 – белок В результате ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе было получено шесть фракций: Af1, Af2, Af3, Af4, Af5, Af6. Графики выходных кривых, построенных для белка, полисахарида и сульфатных групп, свидетельствуют о чрезвычайной гетерогенности полисахарида по заряду. Наибольшее количество вещества содержится во фракциях Af2 и Af6, выход которых составил 23,5 и 20,1% соответсвенно (табл. 15). Согласно результатам химического анализа все полученные анионообменной хроматографией 92 фракции полисахаридов представляют собой сульфатированные галактаны. Наименьшей степенью сульфатирования (2,8-10,0%) характеризуются фракции Af1 и Af2, элюированные раствором NaCl невысокой концентрации (0,25 и 0,5 M), тогда как высокосульфатированными являются фракции Af5 и Af6 (19,2-20,6%) (табл. 15). Наибольшее содержание глюкозы наблюдается в первых двух фракциях (Af1 и Af2), тогда как количество ксилозы, сопровождающееся снижением галактозы в полисахариде, увеличивается с возрастанием концентрации NaCl, за исключением фракции Af2. Интересно отметить, что фракции Af1 и Af2 характеризуются отсутствием 3,6-ангидрогалактозы, тогда как наибольшее количество данного моносахарида присутствует во фракции Af5 (табл. 15). Во фракции Af6 количество галактозы и 3,6-ангидрогалактозы снижалось, а ксилозы – увеличивалось. Таким образом, в процессе ионообменной хроматографии не происходит отделения ксилозы от галактана. Постепенное накопление этого моносахарида с увеличением концентрации соли связано с тем, что либо ксилоза является заместителем одной из гидроксильных групп галактозы, либо полисахарид в растворе образует сложные ассоциаты, в которые встроены полимерные цепи галактана и ксилана, что затрудняет их отделение. Таблица 15 – Выход и химический анализ полисахаридов A. flabelliformis после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе Фракция Элюент [NaCl], M Af1 0,25 Af2 0,5 Af5 2,0 Af6 4,0 Выход, Белок*, % % 17,2 23,5 12,0 20,1 11,5 10,5 5,4 4,0 Содержание, % от навески ПС Gal AnGal Glc Xyl SO3Na 34,3 23,4 25,1 18,2 н/о н/о 12,6 10,5 Примечание: * – содержание белка определяли по методу Лоури 5,6 3,6 2,2 2,8 11,5 8,1 16,6 20,3 2,8 10,0 20,6 19,2 Как видно из рисунка 21 и таблицы 15, с увеличением концентрации соли снижается количество белка во фракциях полисахаридов. Так, фракции Af5 и Af6 содержат 5,4 и 4,0% белка соответственно, тогда как в первых двух фракциях (Af1 и Af2) его количество оказывается в 2 раза выше. Таким образом, в процессе ионообменной хроматографии не удалось отделить ксилозу и белок от галактана. 93 2.5.2. Очистка полисахарида от белка Согласно литературным данным, при выделении полисахаридов из клеточной стенки красных водорослей также соэкстрагируется белок, содержание которого в экстракте может составлять 15% и выше [1]. Считают, что данный белок может быть ассоциирован с полисахаридом за счет ковалентных взаимодействий аминокислот гидроксипролина, серина и треонина с моносахаридным остатком, в основном ксилозой, что делает невозможным их разделение хроматографическим методом [1]. Для возможной очистки полисахарида от белка была проведена последовательная обработка исследуемого галактана методами, основанными на денатурации белка: протеазой из Streptomyces caespitosus и по методу Севага. В результате ферментативной обработки протеазой содержание белка снизилось в 1,5 раза, что видно из увеличения соотношения МС:белок (табл. 16). При последующей обработке полисахарида по методу Севага удалось уменьшить количество белка по сравнению с исходным образцом в 2 раза. Таблица 16 – Содержание моносахаридов и белка в исходном и обработанном полисахаридах из карпоспорофита A. flabelliformis Название образца Суммарная фракция Обработка протеазой из Streptomyces caespitosus Обработка по методу Севага Содержание, % от массы навески МС белок 67,8 10,5 59,0 5,6 56,8 4,2 Соотношение МС:белок 7:1 11:1 14:1 Для качественной характеристики белкового компонента полисахарида был проведен аминокислотный анализ, результаты которого представлены в таблице 17. Как видно из таблицы 17, белок в полисахариде характеризуется высоким содержанием кислых аминокислот – аспарагиновой (Asp) и глутаминовой (Glu) (11,2 и 7,5% соответственно) кислот, фосфосерина (Phser) (6,3%), а также нейтральной аминокислоты – глицина (Gly) (11,5%). Минорными аминокислотами, присутствующими в белке, являются гистидин (His), 1-метилгистидин (1-MeHis) и орнитин (Orn). Содержание остальных аминокислот варьирует в пределах 2-5%. Следует отметить, что данный белок содержит значительное количество 94 незаменимых аминокислот: Val, Leu, Phe и Lys, что может быть полезно при возможном использовании полисахарида, содержащего такой белок, в качестве биологически активной добавки. Как следует из результатов аминокислотного анализа, большинство входящих в состав белка аминокислот являются нейтральными. Основными аминокислотами являются лизин, гистидин и аргинин, кислыми – аспаргиновая и глутаминовая кислоты (табл. 17). Таблица 17 – Аминокислотный (АК) состав белкового компонента желирующего полисахарида из A. flabelliformis АК Phser Asp Thr Ser Glu Sar Gly Ala Cit Val Ile Leu Tyr Phe Orn Lys 1-MeHis His Arg Концентрация, нм/мл 48,9 121,3 43,6 72,3 73,7 3,9 220,5 84,6 13,9 62,8 26,1 43,5 16,2 31,2 7,7 45,8 8,2 7,9 38,9 Согласно литературным Масса, нг 4523,3 8072,5 2596,4 3799,4 5420,6 173,7 8279,8 3768,9 1217,6 3676,9 1712,2 2853,6 1467,7 2577,1 509,0 3348,0 693,7 613,0 3388,2 данным % от общего содержания белка 6,3 11,2 3,6 5,3 7,5 0,2 11,5 5,2 1,7 5,1 2,4 4,0 2,0 3,6 0,7 4,6 1,0 0,9 4,7 пролин и гистидин – основные аминокислоты белка, выделенного из красной водоросли Porphyra tenera, могут участвовать в образовании пептид-О-гликозидной связи [1]. Кроме того, известно, что серин и треонин участвуют в образовании ковалентной связи между белком и полисахаридом в клеточной стенке красной водоросли Porphyridium cruentum [250], а белок из водоросли Furcellaria fastigiata связан с полисахаридом за счет остатков серина [251]. В то же время, для водорослей рода Phyllophora было показано, что β-карбоксильная группа аспарагиновой кислоты образует эфирную 95 связь с разветвленными цепями полисахарида [252]. В нашем случае аспарагиновая кислота является одной из основных аминокислот белка, количества серина и фосфосерина составляют 5,3 и 6,3% соответственно, что позволяет предположить, что белок ковалентно связан с исследуемым полисахаридом посредством этих аминокислотных остатков. Таким образом, последовательная обработка полисахарида протеазой из S. caespitosus и по методу Севага не приводит к полному отделению белка, количество которого уменьшается в 2 раза. 2.5.3. Структурный анализ суммарного полисахарида методом ИК-Фурье спектроскопии Для получения предварительных данных о структуре полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis был использован метод ИК-Фурье спектроскопии. Полученный спектр полисахарида был сопоставлен со спектрами каррагинанов с известными предельными структурами. В ИК-спектре исследуемого полисахарида наблюдаемая интенсивная полоса поглощения в области 1240-1250 см-1 (рис. 22) указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп (-S=O ассиметричная вибрация) [123]. Полоса поглощения при 932 см-1 характерна для 3,6-ангидрогалактозы (C-O вибрация), а при 849 см-1 относится к вторичной аксиальной сульфатной группе при С-4 1,3-связанного остатка β-D-галактозы, что позволяет предположить присутствие в полисахариде звеньев κ-каррагинана [243]. Полоса поглощения при 805 см-1 (рис. 22), характерная для вторичной аксиальной сульфатной группы при С-2 1,4-связанного остатка 3,6-ангидро-α-D-галактозы, может указывать на наличие в структуре полисахарида дисахаридных звеньев ιтипа [126]. Кроме того, в ИК-спектре сульфатированного галактана наблюдается небольшое плечо при 890 см-1, относящееся к несульфатированным остаткам галактозы (C-H вибрация), что характерно для β- и α-типов каррагинанов [123]. 96 Рисунок 22 – ИК-спектр суммарной фракции полисахарида, выделенного из карпоспорофита A. flabelliformis Таким образом, согласно данным ИК-спектроскопии, выделенный полисахарид может содержать дисахаридные звенья как κ-, так и ι-типов каррагинана. 2.5.4. Фракционирование и химический анализ полисахаридов из A. flabelliformis Известно, что разные типы каррагинанов образуют гели при добавлении к ним солей определенных металлов, проявляя при этом высокую специфичность к ним. Согласно литературным данным κ-каррагинан обладает специфичностью к ионам калия, тогда как ι-каррагинан – к ионам кальция [8]. В связи с этим исследуемый галактан, который, как показано выше, содержит звенья κ- и ιкаррагинанов, фракционировали на желирующий (CaCl2-нерастворимый) и нежелирующий (CaCl2-растворимые) полисахариды 4% CaCl2, как описано в экспериментальной части [37]. Выход и состав этих фракций представлен в таблице 14. Как видно из таблицы 14, исследуемый полисахарид представлен в основном желирующей фракцией, выход которой составил около 19%. Молекулярная масса этого полисахарида, рассчитанная на основании данных вискозиметрии, составила 250 кДа. Согласно химическому анализу, основными моносахаридами желирующего полисахарида являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза, а ксилоза и глюкоза 97 присутствуют в незначительных количествах (табл. 14). Интересно отметить, что желирующий полисахарид содержит в 2 раза больше сульфатных групп, чем нежелирующий. Подобные результаты ранее были получены для других представителей семейства Phyllophoraceae. Так, количество сульфатных групп в желирующих полисахаридах из водорослей Gymnogongrus griffithsiae [208] и G. torulosus [27] было в 3,2 и 1,8 раз больше, чем в нежелирующих соответственно. В то же время в случае галактана, выделенного из T. crinitus (Tichocarpaceae), нежелирующий полисахарид имел большую степень сульфатирования, чем желирующий [93]. Как видно из таблицы 14, нежелирующий полисахарид из A. flabelliformis характеризуется высоким содержанием глюкозы и ксилозы. Наличие глюкозы в исследуемых образцах может быть обусловлено присутствием в клеточной стенке водоросли флоридного крахмала [1]. Высокое содержание ксилозы было также определено в нежелирующих полисахаридах из G. griffithsiae [208] и G. torulosus [27]. Предполагается, что ксилоза в полисахаридах может присутствовать либо за счет ксилана, соэкстрагируемого с галактаном [1], либо в качестве единичных остатков ксилозы, замещающих гидроксильные группы галактана [81, 83]. 2.5.5. Структурный анализ желирующего полисахарида ИК- и ЯМР спектроскопией Для идентификации желирующего полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis и отнесения его к определенному типу каррагинанов использовали методы ИК-Фурье и ЯМР спектроскопии. Полученный спектр был сопоставлен со спектрами известных структур каррагинанов. ИК-спектр желирующего полисахарида (рис. 23) аналогичен спектру суммарной фракции полисахаридов (рис. 22), согласно которому исследуемый полисахарид представляет собой в основном ι/κ-каррагинан и содержит остатки несульфатированной галактозы. 98 Рисунок 23 – ИК-спектр желирующего полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis Анализ спектров ЯМР исследуемого полисахарида подтверждает данные ИК-спектроскопии (рис. 24, табл. 18). Химические сдвиги соотнесенных сигналов в спектрах 1 H и 13 С ЯМР желирующего полисахарида были сопоставлены с сигналами известных предельных структур каррагинанов [106, 131, 245, 246, 253]. В спектре 13С ЯМР полисахарида в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдается шесть сигналов разной интенсивности при 92,9, 95,9 96,2, 102,9, 103,1 и 103,2 м.д., что может указывать на присутствие трех типов дисахаридных звеньев (рис. 24 Б). Сигнал с δ 92,9 м.д. относится к атому С-1 1,4-связанного остатка 3,6ангидро- α-D-галактозы 2-сульфат ι-типа каррагинана, а сигналы с δ 96,2 и 95,9 м.д. соответствуют атому С-1 1,4-связанных остатков 3,6-ангидро-α-D-галактозы κ- и βкаррагинанов соответственно (табл. 18). Плохо разрешенные сигналы с δ 102,9, 103,1 и 103,2 м.д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 1,3связанных остатков β-D-галактозы ι-, κ- и β-каррагинанов [253]. Спектр 13С ЯМР в области относительно сильного поля имеет типичный для ι-, κ- и β-типов полисахарида вид. DEPT-135 эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 62,0 и 70,1 м.д., последняя из которых замещена, как видно из значения величины ее химического сдвига. 99 Рисунок 24 – Спектры 1H (А) и 13С (Б) ЯМР желирующего полисахарида, выделенного из карпоспорофита A. flabelliformis Спектр спектроскопией 1 Н 13 ЯМР хорошо согласуется с данными, полученными С ЯМР. В области резонанса аномерных протонов спектра 1Н ЯМР присутствуют пять аномерных сигналов различной интенсивности при 4,61, 4,64, 5,07, 5,09 и 5,3 м.д. (рис. 24 А). Сигнал с δ 5,3 м.д. относится к атому Н-1 1,4связанного остатка 3,6-ангидро-α-D-галактозы 2-сульфат ι-каррагинана, а сигналы с δ 5,09 и 5,07 м.д. соответствуют атому Н-1 1,4-связанных остатков 3,6-ангидро-αD-галактозы κ- и β-каррагинанов соответственно (табл. 18). Сигнал при 4,61 м.д. может быть отнесен к атому Н-1 1,3-связанного остатка несульфатированной β-Dгалактозы β-каррагинана, а сигнал с δ 4,64 м.д. присутствует с спектре благодаря 1,3-связанному остатку β-D-галактозы 4-сульфат, входящему в состав дисахаридного звена как κ-, так и ι-каррагинанов. Помимо этого, в спектре 1Н ЯМР (рис. 24 А) присутствует сигнал слабой интегральной интенсивности при 5,5 м.д., который может быть отнесен к аномерному протону остатка α-галактозы 2,6100 дисульфат ν-каррагинана, который является биосинтетическим предшественником ι-каррагинана [132]. Согласно данным спектроскопии ЯМР, содержание дисахаридных звеньев ι-типа в полимерной цепи является преобладающим, и соотношение ι- и κ-звеньев составляет 1:0,5. Таблица 18 – Таблица величин химических сдвигов углерода и протонов (δ м.д.) в спектрах 1 Н и 13 С ЯМР желирующего полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis Тип МС каррагинана остаток ι G4S′ DA2S κ G4S DA β G DA′ Тип МС каррагинана остаток ι G4S′ DA2S κ G4S DA β G DA′ H химические сдвиги (м.д.) Н-2 Н-3 Н-4 Н-5 3,60 3,99 4,89 3,79 4,65 4,82 4,76 4,75 3,60 3,99 4,87 3,80 4,14 4,52 4,62 4,66 3,62 3,86 4,14 3,70 4,08 4,53 4,62 4,66 13 С химические сдвиги (м.д.) С-2 С-3 С-4 С-5 70,3 77,8 72,9 75,8 77,9 78,8 77,9 76,9 70,0 79,0 74,3 75,8 70,3 79,7 78,7 77,3 70,1 80,6 66,7 76,1 70,8 79,3 78,7 77,3 1 Н-1 4,64 5,3 4,64 5,09 4,61 5,07 С-1 102,9 92,9 103,1 96,2 103,2 95,9 Примечание: МС – моносахарид Н-6 3,80-3,70 4,12-4,27 3,80-3,70 4,20-3,62 3,80-3,70 4,20-3,62 С-6 62,3 70,1 62,3 70,1 62,3 70,1 Таким образом, из данных химического анализа, ИК- и ЯМР спектроскопии следует, что исследуемый желирующий полисахарид из карпоспорофита A. flabelliformis представляет собой ι/κ-каррагинан с соотношением звеньев ι- и κ-типа 1:0,5, содержит звенья β-каррагинана и минорные количества ν-каррагинана. 2.5.6. Мягкий кислотный гидролиз полисахарида из A. flabelliformis Для установления особенностей структуры полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis был проведен тщательный анализ суммарного полисахарида. Как показано выше, в составе этого полимера обнаружены ксилоза и глюкоза, которые 101 содержатся в незначительных количествах в желирующем ι/κ-каррагинане. В связи с этим, был проведен кислотный гидролиз суммарного полисахарида. В настоящее время при изучении полисахаридов со сложной структурой, содержащих 3,6-ангидрогалактозу, часто используется метод мягкого кислотного гидролиза, протекающий без разрушения 3,6-ангидрогалактозы и приводящий к образованию олигосахаридов с четным и нечетным количеством моносахаридных остатков. При этом, чем более сульфатированным является полисахарид, тем труднее он подвергается гидролизу [254]. Ранее нами было показано, что благоприятными условиями гидролиза κ-каррагинана, содержащего 22% сульфатных групп, 0,1 N соляной кислотой являются 37°С и 24 ч, поскольку при этих условиях 3,6-ангидрогалактоза разрушается в меньшей степени по сравнению со стандартными условиями (60°С и 4 ч) [255]. Исследуемый нами полисахарид представляет собой ι/κ-каррагинан и содержит 32% сульфатов, поэтому он был гидролизован при 37°С в течение 50 ч. Фракционирование смеси продуктов гидролиза проводили гельпроникающей хроматографией на колонке с биогелем P-10, используя в качестве элюента воду. Как видно из анализа выходных кривых, в результате кислотной деполимеризации полисахарида получаются две фракции олигосахаридов с выходом 24,0 и 39,8% соответственно (рис. 25, табл. 19). Молекулярная масса фракции II, рассчитанная по методу, основанному на реакции восстанавливающих сахаров с ферроцианидом [256], составила 5,3 кДа. Как видно из таблицы 19, фракция II характеризуется невысоким содержанием белка (3,0%) по сравнению с фракцией I. Рисунок 25 – Гель-хроматография на колонке с биогелем P-10 смеси продуктов кислотного гидролиза (0,1 N HCl, 37°С, 50 ч) полисахарида из A. flabelliformis 102 Таблица 19 – Характеристика фракций олигосахаридов, полученных гельхроматографией на биогеле P-10 смеси продуктов кислотного гидролиза (0,1 N HCl, 37°С, 50 ч) полисахарида из A. flabelliformis Образец фракция I фракция II Выход, % от массы навески 24,0 39,8 Белок, % М, кДа 10,8 3,0 5,3 Содержание (%) от массы навески Gal AnGal Glc Xyl SO3Na 37,2 31,9 1,0 17,8 10,9 1,5 12,3 0,2 9,2 26,3 Согласно результатам химического анализа основными моносахаридами фракции II являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза, тогда как фракция I содержит очень мало 3,6-ангидрогалактозы (1,0%) и значительное количество глюкозы и ксилозы (10,9 и 12,3% соответственно) (табл. 19). Количество сульфатных групп во фракции II сравнимо с исходным полисахаридом (табл. 14, 19), а во фракции I их содержание в 3 раза ниже (табл. 19). Спектр 13 С ЯМР фракции II (рис. 26) был идентичен спектру желирующего полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis (рис. 24 Б). Химические сдвиги соотнесенных сигналов в спектре 13 С ЯМР фракции II были сопоставлены с сигналами известных предельных структур каррагинанов [106, 131, 253]. В спектре 13 С ЯМР фракции II в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдается шесть сигналов разной интенсивности при 92,7, 95,9, 96,2, 102,9, 103,2 и 103,3 м.д., что может указывать на присутствие трех типов дисахаридных звеньев (рис. 26). Сигнал с δ 92,7 м.д. относится к атому С-1 1,4-связанного остатка 3,6-ангидро-α-Dгалактозы 2-сульфат ι-типа каррагинана, а сигналы с δ 96,2 и 95,9 м.д. соответствуют атому С-1 1,4-связанных остатков 3,6-ангидро-α-D-галактозы κ- и βкаррагинанов соответственно (табл. 20). Плохо разрешенные сигналы с δ 102,9, 103,2 и 103,3 м.д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 1,3связанных остатков β-D-галактозы ι-, κ- и β-каррагинанов [253]. Спектр 13С ЯМР в области относительно сильного поля имеет типичный для ι-, κ- и β-типов полисахарида вид. DEPT-135 эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 62,0 и 70,1 м.д., последняя из которых замещена, как видно из значения величины ее химического сдвига. 103 Рисунок 26 – Спектр 13С ЯМР фракции II, полученной мягким кислотным гидролизом (0,1 N HCl, 37°С, 50 ч) полисахарида из A. flabelliformis Таблица 20 – Таблица величин химических сдвигов углерода (δ м.д.) в спектре 13С ЯМР фракции II, полученной мягким кислотным гидролизом (0,1 N HCl, 37°С, 50 ч) полисахарида из A. flabelliformis Тип МС каррагинана остаток ι G4S′ DA2S κ G4S DA β G DA′ 13 С-1 102,9 92,7 103,3 96,2 103,2 95,9 С-2 70,1 77,9 70,0 70,3 70,1 70,8 С химические сдвиги (м.д.) С-3 С-4 С-5 77,4 72,8 75,6 78,8 77,9 76,9 79,0 74,3 75,8 79,7 78,7 77,3 80,6 66,7 76,1 79,3 78,7 77,3 С-6 62,1 70,1 62,3 70,1 62,3 70,1 Таким образом, из данных химического анализа и спектроскопии ЯМР следует, что фракция II олигосахаридов, полученных мягким кислотным гидролизом (0,1 N HCl, 37°С, 50 ч) полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis представляет собой ι/κ/β-каррагинан с преобладанием дисахаридных звеньев ι-типа каррагинана. Так как фракция I характеризуется высоким содержанием ксилозы и глюкозы (табл. 19), структурный анализ этой фракции может дать информацию о местоположении данных моносахаридов в исследуемом полисахариде. Спектр 13 С ЯМР фракции I оказался плохо разрешенным и сложным для интерпретации. В связи с этим для определения характера замещения моносахаридных остатков в 104 полимерной цепи фракции I ее подвергали метилированию и последующему анализу частично метилированных ацетатов полиолов с помощью ГЖХ-МС. Согласно полученным результатам основными компонентами фракции I являются 2,4-ди-О-метилгалактоза, 4-О-метилгалактоза и 2,3,6-три-О-метилгалактоза в соотношении 1:1,6:2,4, две из которых соответствуют 1,3-связанной галактозе, содержащей заместители при С-6 и при С-2 и С-6 соответственно, а третья – незамещенной 1,4-связанной галактозе. Помимо этого во фракции I присутствуют 1,4-ди-О-метилгалактоза и 2,3,4-три-О-метилгалактоза, первую из которых можно отнести к 1,3-связанной галактозе, расположенной на восстанавливающем конце и замещенной при С-2 и С-6, а вторую – к галактозе на невосстанавливающем конце, замещенной при С-6. Минорные количества 3,4-ди-О-метилгалактозы образуются, скорее всего, в результате неполного метилирования при С-2, и, вероятно, этот моносахарид, как и 2,3,4-три-О-метилгалактоза, относится к галактозе на невосстанавливающем конце, замещенной при С-6. Наличие такого моносахаридного остатка в продуктах метилирования в минорных количествах было отмечено ранее при изучении структуры полисахарида из Bossiella cretacea [83]. Таким образом, можно предположить, что основная углеводная цепь фракции I построена из остатков галактозы, соединенных чередующимися β-(1→4) и α(1→3)-гликозидными связями, в которой 1,3-связанная галактоза в большинстве своем имеет заместители при С-6. Согласно химическому анализу, фракция I содержит 12,3% ксилозы (табл. 19), которая может присутствовать либо за счет ксилана [1], либо в качестве единичных остатков ксилозы, замещающих гидроксильные группы галактана при С4 или С6 1,3-связанного остатка β-D-галактозы или при С3 1,4-связанного остатка α-D-галактозы [82, 83, 84, 85, 257]. По данным метилирования, в состав фракции I входит 2,3,5-три-О-метилксилоза. Данный моносахаридный остаток указывает на то, что ксилоза находится на невосстанавливающем конце, поэтому, скорее всего, она является заместителем одной из гидроксильных групп галактана. Это подтверждается данными МАЛДИ, полученными для желирующего полисахарида из стерильной формы A. flabelliformis, приведенными выше. Тот факт, что ксилоза присутствует в качестве заместителя гидроксильной группы галактана, объясняет невозможность отделения этого моносахарида при ионообменной хроматографии 105 (табл. 15). Интересно отметить, что до настоящего момента остатки ксилозы в галактанах встречались исключительно в пиранозной форме, о чем свидетельствует наличие в продуктах метилирования 2,3,4-три-О-метилксилозы [83, 84, 257, 258]. Однако в нашем случае присутствие в продуктах метилирования 2,3,5-три-Ометилксилозы позволяет предположить, что этот моносахарид имеет фуранозную форму. Анализ продуктов метилирования указывает на то, что в состав фракции I в небольших количествах входит и глюкоза: 2,3-ди-О-метилглюкоза, 2,3,6-три-Ометилглюкоза и 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкоза. Известно, что глюкоза является структурной единицей флоридного крахмала – α-(1→4)-D-глюкана с боковым ответвлением в положении 6 [100]. В нашем случае 2,3-ди-О-метилглюкоза и 2,3,6три-О-метилглюкоза соответствуют 1,4-связанной глюкозе, первая из которых имеет точку ветвления в положении 6. 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкоза указывает на присутствие невосстанавливающего сахарного остатка, который может относиться либо к терминальной глюкозе α-(1→4)-глюкана, либо к моносахариду, отвечающему за точку ветвления основной цепи глюкана при С-6. Полученные результаты позволяют предположить, что исследуемый полисахарид содержит в незначительных количествах α-(1→4)-D-глюкан, который может быть ассоциирован с галактаном, имеющим сложную макромолекулярную организацию. 2.5.7. Масс-спектрометрический анализ продуктов ферментативного гидролиза полисахарида из A. flabelliformis В настоящее время при анализе гибридных структур каррагинанов красных водорослей широко используют специфические ферменты – каррагиназы. Ферментативный анализ является чувствительным методом, с помощью которого можно установить тонкие детали структуры, не определенные методами спектроскопии и химическими методами [135]. Поскольку исследуемый полисахарид представляет собой гибридный ι/κ/β-каррагинан с преобладанием звеньев ι-типа, ферментативный гидролиз проводили с помощью рекомбинантной йота-каррагиназы из Microbulbifer thermotolerans, любезно предоставленной французскими коллегами. В качестве стандарта использовали коммерческий ιкаррагинан из Eucheuma spinosum («Sigma»). Полученную смесь олигосахаридов 106 разделяли методом ВЭЖХ, как описано в экспериментальной части (рис. 27). Согласно данным ВЭЖХ, в результате ферментативного гидролиза полисахарида были получены как низкомолекулярные продукты (смесь олигосахаридов), так и высокомолекулярная фракция полисахарида, устойчивая к действию фермента, обозначенная как резистентная фракция (РФ) (рис. 27). Выход РФ составил 19% (табл. 23). Анализ продуктов ферментативного гидролиза как исследуемого полисахарида, так и стандартного образца ι-каррагинана на ВЭЖХ свидетельствует о присутствии в полимерной цепи полисахарида из A. flabelliformis звеньев ιкарратетраозы (27%), ι-каррабиозы (6%), а также гибридных тетра- (9%) и гексасахаридов (39%), содержащих κ- и ι-звенья (рис. 27, табл. 23). Рисунок 27 – Высокоэффективная жидкостная хроматография смеси олигосахаридов, полученных в результате ферментативного гидролиза полисахарида из A. flabelliformis 107 Таблица 23 – Состав и структура олигосахаридов, образующихся в результате ферментативного гидролиза полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis Состав и структура олигосахаридов m/z Выход, % РФ DA-G4S-DA2S-G4S-DA2S-G4S DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S DA2S-G4S-DA2S-G4S DA-G4S-DA2S-G4S DA2S-G4S-DA-G4S DA2S-G4S 266,20 236,49 289,01 241,01 19 39 27 9 6 Для анализа смеси олигосахаридов, полученной в ходе ферментативного гидролиза каррагинана, и уточнения характера расположения дисахаридных звеньев вдоль полимерной цепи был использован метод масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ИЭР МС). Состав и структура олигосахаридов представлена в таблице 23. Последовательность моносахаридных звеньев установлена методом тандемной (режим МС/МС) масс-спектрометрии ИЭР. Согласно полученным компонентами данным, исследуемого согласующимся с ВЭЖХ, полисахарида являются основными гибридные гексаолигосахариды с различной последовательностью чередования κ- и ι-звеньев и тетрасахарид ι-каррагинана, а ι-каррабиоза и гибридные тетрасахариды κ/ιкаррагинана присутствуют в незначительных количествах (рис. 27, табл. 23). Тандемные масс-спектры ι-каррабиозы и ι-карратетраозы представлены на рисунке 28. Основными фрагментными ионами являются ионы B-типа, иногда сопровождаемые потерей сульфатной группы, а также интенсивные ионы С-типа (в тетрасахариде, рис. 28 Б), возникающие, главным образом, при разрыве гликозидной связи, ближайшей к сульфатной группе в положении С-4 остатка G4S на восстанавливающем конце молекулы. В масс-спектре ι-каррабиозы (рис 28 А), полученной в результате ферментативного гидролиза исследуемого полисахарида, характерно наличие сигнала, соответствующего иону Y1 с m/z 259,01, который образуется в результате разрыва α-(1→3) связи и отщепления остатка G4S с восстанавливающего конца, как и в случае с тандемными масс-спектрами 108 фрагментов κ/β-каррагинана, полученных ферментативным гидролизом [112]. В то же время в тандемных масс-спектрах фрагментов κ-каррагинана, полученных кислотным гидролизом, преобладал сигнал, соответсвующий однозарядному иону B-типа с m/z 241,00, характерный для отщепления невосстанавливающего конца [259]. Именно невосстанавливающем конце олигосахаридов, остатки что остатка G4S связано находятся с с G4S на частичным разрушением DА и лабильностью α-(1→3) связи в кислых условиях [254]. Рисунок 28 – ИЭР МС/МС ι-каррабиозы (А, m/z 241,00) и ι-карратетраозы (Б, m/z 236,50), полученных из полисахарида A. flabelliformis ферментативным гидролизом ι-каррагиназой из M. thermotolerans Анализ работ, посвященных особенностям процесса деградации фрагментов, содержащих остатки цепей, построенных их дисахаридных звеньев ι-типа, позволил установить особенности структуры гибридных фрагментов исследуемого полисахарида. Тандемный ИЭР МС/МС (рис. 29) гибридного трижды сульфатированного тетрасахарида был интерпретирован благодаря наличию характерных фрагментных ионов, позволяющих определить положение «идеальных» дисахаридов κ- и ι-типа. В масс-спектре присутствуют сигналы высокой интенсивности, соответсвующие фрагментным ионам С3 с m/z 313,03 и B3 с m/z 304,02, которые, вероятно, образуются при разрыве гликозидных связей олигосахаридов с κ-звеном на восстанавливающем конце, как было показано на олигосахаридах κ/β-каррагинана из T. crinitus, полученных ферментативным гидролизом [112] и олигосахаридах κ-каррагинана из C. armatus, полученных 109 кислотным гидролизом [259]. Анализ масс-спектра показывает, что в полимерной цепи присутствует два возможных варианта (изомера) данного тетрасахарида: DA2S-G4S-DA-G4S и DA-G4S-DA2S-G4S (рис. 29). Фрагментные ионы B1 и B′2 с m/z 222,99 и 232,00 соответственно указывают на наличие структуры DA-G4SDA2S-G4S. Учитывая особенности действия фермента ι-каррагиназы [260], можно предположить, что данные фрагменты находятся на восстанавливающем и невосстанавливающем концах исходного полимера, т.е. являются терминальными. Рисунок 29 – ИЭР МС/МС гибридного тетрасахарида ι/κ-каррагинана с m/z 289,02, полученного из полисахарида A. flabelliformis ферментативным гидролизом ιкаррагиназой из M. thermotolerans В тандемном ИЭР МС/МС спектре гибридного гексасахарида (рис. 30) были идентифицированы практически все фрагментные ионы, в том числе ионы, идентифицированные с учетом потери сульфатной группы. Отрыв сульфатной группы наблюдается и в случае «идеального» тетрасахарида ι-типа (рис. 28 Б), что может быть обусловлено электростатическим отталкиванием в источнике иона, приводящим к отщеплению сульфатной группы при DA2S. Анализ масс-спектра показывает, что в полимерной цепи присутствует три возможных варианта (изомера) данного гексасахарида: DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2SG4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S, первые два из которых являются терминальными фрагментами молекул полисахарида, а третий – внутренним. 110 Рисунок 30 – ИЭР МС/МС гибридного гексасахарида, полученного из полисахарида A. flabelliformis ферментативным гидролизом ι-каррагиназой из M. thermotolerans Таким образом, согласно данным ферментативного гидролиза и ИЭР МС/МС, основными компонентами, входящими в состав полимерной цепи полисахарида из A. flabelliformis, являются тетрасахарид ι→ι и ι-каррабиоза, а также гибридные тетра- (ι→κ, κ→ι) и гексасахариды (ι→ι→κ, κ→ι→ι, ι→κ→ι), содержащие ι- и κ-звенья. 2.6. Биологическая активность полисахаридов из стерильной и репродуктивной форм A. flabelliformis 2.6.1. Антикоагулирующая активность полисахаридов A. flabelliformis Антикоагулирующая активность – одно из наиболее широко исследуемых свойств сульфатированных полисахаридов. Как известно, сульфатированные полисахариды способны взаимодействовать с некоторыми катионными белками, такими как кофакторы каскада коагуляции в процессе ингибирования свертывания крови [261]. Было изучено антикоагулирующее действие полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis – суммарного, желирующего и нежелирующего по их способности подавлять процесс коагуляции по протромбиновому времени (ПТВ) (внешний путь коагуляции) и активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ) (внутренний путь коагуляции). Согласно анализу ПТВ, ни один из исследуемых полисахаридов не влияет на внешний путь коагуляции (рис. 31). Согласно АЧТВ анализу, нежелирующий 111 полисахарид увеличивал время коагуляции на 67%, тогда как суммарный и желирующий полисахариды – на 25 и 50% соответственно (рис. 31). Более сильное действие нежелирующих полисахаридов на внутренний путь коагуляции может быть обусловлено их большей степенью сульфатирования. Так было показано, что λ-каррагинан с высоким содержанием сульфатных групп проявляет большую антикоагулирующую активность, чем другие типы каррагинанов [193]. Однако позже Pereira с соавторами показал, что антикоагулирующая активность полисахаридов определяется не только количеством сульфатных групп, но и их местоположением и распределением вдоль полимерной цепи [262]. Кроме того, известно, что антикоагулирующая активность зависит от моносахаридного состава исследуемого полисахарида и его молекулярной массы [263, 264]. 250 АЧТВ ПТВ * 200 * 150 * % * 100 50 0 PBS гепарин суммар. желир. нежелир. Рисунок 31 – Изменение времени коагуляции в присутствии полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis (C = 10 мкг × мл-1, конечное значение). АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время, ПТВ – протромбиновое время. Результаты выражены как % изменения тромбинового времени относительно отрицательного контроля PBS (100%). * - достоверные отличия при P < 0,05 (ANOVA) Таким образом, результаты АЧТВ и ПТВ анализа показывают, что исследуемые каррагинаны воздействуют главным образом на внутренний путь коагуляции, тогда как их влияние на внешний путь коагуляции отсутствует. Наши результаты согласуются с данными Silva с соавторами, которые также наблюдали влияние каррагинанов на внутренний путь коагуляции [192]. 112 2.6.2. Влияние полисахаридов A. flabelliformis на образование АФК Известно, что каррагинаны способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток, оказывая на иммунную систему разнонаправленное действие, как стимулирующее, так и супрессивное [265, 266]. Одним из показателей иммуностимулирующего действия веществ является их способность индуцировать образование активных форм кислорода (АФК). Способность сульфатированных галактанов стимулировать формирование АФК зависит от структурных особенностей (моносахаридный состав, количество, положение и распределение сульфатных групп вдоль полимерной цепи), молекулярной массы этих полисахаридов и является одним из показателей их взаимодействия с иммунокомпетентными клетками [267]. В связи с этим, была изучена способность желирующих полисахаридов из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм водоросли A. flabelliformis индуцировать образование АФК. В качестве положительного контроля индукции образования АФК использовали липополисахарид (ЛПС) из Escherichia coli. Согласно результатам анализа, ЛПС в 2 раза больше индуцировал образование АФК, чем PBS, используемый в качестве отрицательного контроля (рис. 32). Исследуемые κ/β- и ι/κ-каррагинаны проявляли значительно меньшую способность стимулировать образование АФК по сравнению с ЛПС (рис. 32). Эти полисахариды активизируют выработку АФК в среднем на 50% по сравнению с отрицательным контролем независимо от концентрации каррагинана (рис. 32). Интересно отметить, что ι/κ-каррагинан из карпоспорофита A. flabelliformis при своей максимальной концентрации 100 мкг/мл практически полностью теряет свою активность. Ранее было показано, что при концентрации 100 мкг/мл только λкаррагинан из C. armatus, характеризующийся высокой степенью сульфатирования и отсутсвием 3,6-ангидрогалактозы, проявлял выраженную индукцию образования АФК (активация процесса на 30% по сравнению с контролем), тогда как κ/ι- и κ/βкаррагинаны, выделенные из водорослей C. pinnulatus и T. crinitus соответственно, не оказывали влияние на процесс формирования АФК [264]. 113 Рисунок 32 – Влияние желирующих полисахаридов из стерильной и репродуктивной (карпоспорофит) форм A. flabelliformis на образование АФК. Результаты выражены как % изменения содержания АФК относительно отрицательного контроля Таким образом, исследованные κ/β- и ι/κ-каррагинаны в незначительной степени индуцируют выработку АФК (на 50% по сравнению с отрицательным контролем). Кроме того, ι/κ-каррагинан при своей максимальной концентрации 100 мкг/мл практически полностью теряет свою активность. 114 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1. Водоросли Прикрепленная форма красной водоросли A. flabelliformis, представленная репродуктивной формой (карпоспорофитом), была собрана с февраля по декабрь 2009 г. из естественных мест обитания на глубине 2 м в Амурском заливе (мыс Красный, Японское море). Водоросль A. flabelliformis, представленная репродуктивной формой с цистокарпами и стерильными растениями, была собрана в июле 2012 г. на побережье Японского моря в б. Троицы на глубине 0,5 м. Морфологические характеристики водорослей были определены с помощью светового микроскопа согласно Перестенко [268]. Для анализа пигментов отбирали средние по величине (10 см) и не имеющие внешних повреждений талломы сеголетних растений, промывали проточной водой для удаления эпифитов и растворимых солей, взвешивали, фиксировали в жидком азоте и хранили при температуре -80ºС. Водоросли, используемые для выделения полисахаридов, промывали проточной водой для удаления растворимых солей, сушили на воздухе и хранили в герметичных пластиковых пакетах. 3.2. Определение сухого вещества водоросли Для определения ежемесячных изменений сухого вещества водоросли в процентах образцы водоросли A. flabelliformis очищали от эпифитов, промывали проточной водой, осушали фильтровальной бумагой и взвешивали (n=3). Затем образцы высушивали в термостатированном шкафу при температуре 60°С в течение 24 ч и снова определяли вес. Содержание сухого вещества рассчитывали как отношение сухого веса водорослей к сырому. 3.3. Выделение фотосинтетических пигментов 3.3.1. Экстракция ФБП 0,1 М фосфатным буфером (метод 1) Экстракцию фикобилипротеинов проводили по методике, предложенной Розенбергом [241]. Для этого замороженные водоросли массой 200-500 мг для карпоспорофитов и 5-6 г для цистокарпов и стерильных растений (n=3) мелко растирали с небольшим количеством стеклянного песка, постепенно добавляя 115 небольшое количество 0,1 М фосфатного буфера (pH 6,8) в количестве, необходимом для полной гомогенизации образца. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин для отделения супернатанта от остатков водорослей. 3.3.2. Экстракция ФБП 1,5% водным раствором нитрата натрия (метод 2) Выделение пигментов проводили по методике, предложенной Каиксиан и соавторами [269]. Для экстракции 5-6 г (n=3) замороженной водоросли промывали 1 мМ фосфатным буфером (рН 6,8), после чего водоросли растирали в ступке с песком в 1,5% NaNО3 (рН 6,5) и экстрагировали пигменты замораживанием (-20ºС) и оттаиванием. Полученный экстракт центрифугировали при 6000 об/мин 4ºС в течение 60 мин, отделяли супернатант от остатков водоросли, которые в дальнейшем были использованы для выделения полисахаридов. Супернатант, обработанный активированным углем (1,0 г), перемешивали в течение 30 мин при 4ºС. Смесь отфильтровывали и концентрировали осаждением твердым (NH4)2SO4 до 75% насыщения. Осадок, собранный центрифугированием, затем растворяли в 15 мл 1 мМ фосфатного буфера (рН 6,8) и диализовали против 1 мМ фосфатного буфера-0,05 М NaCl (рН 6,8) в течение ночи (4ºС). 3.3.3. Выделение хлорофилла а и каротиноидов Хлорофилл а и каротиноиды экстрагировали по методу Д. И. Сапожникова [270]. Для этого 200-500 мг (n=3) фиксированных в жидком азоте водорослей растирали с небольшим количеством стеклянного песка, а также карбоната и сульфата натрия (для нейтрализации клеточного сока), постепенно добавляя минимальное количество 90% раствора ацетона, необходимого для полной гомогенизации растираемых водорослей (5-7 мл). Полученный гомогенат центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4ºС для отделения супернатанта от остатков водоросли. 116 3.3.4. Идентификация фотосинтетических пигментов Идентификация ФБП. Спектры поглощения полученных экстрактов ФБП регистрировали на спектрофотометре UV-21101 PS (“Shimadzu”, Япония). Идентификацию ФБП проводили по максимумам поглощения в области 565 нм, характерному для ФЭ, 615 нм – для ФЦ и 650 нм – для АФЦ. Концентрацию фикобилинов рассчитывали по формулам Розенберга [241]: СФЭ = 123,5 · A565 – 73,5 · A615 – 16,3 · A650, СФЦ = 163,2 ·A615 – 117,1 · A650, (1) САФЦ = 165,6 · A650 – 16,4 · A615, где А – оптическая плотность экстракта при данной длине волны; C – концентрация фикобилинов, мкг/мл. Содержание фикобилинов выражали в мг/г сухой массы водорослей. Определение количества ФБП водорослей проводили в трехкратной повторности. На основании трех измерений рассчитывали среднеарифметические значения показателя. Идентификация хлорофилла а и каротиноидов. Спектры поглощения полученных экстрактов хлорофилла а и каротиноидов регистрировали на спектрофотометре UV-21101 PS (“Shimadzu”, Япония). Идентификацию хлорофилла а и каротиноидов в экстрактах проводили по максимумам поглощения в области 664 нм, характерному для хлорофилла а, и 480 нм, характерному для каротиноидов. Концентрацию хлорофилла а в ацетоновом растворе рассчитывали по формуле, предложенной Джефри и Хамфреем [271]: Схла = А664/73,6, (2) где Схла – концентрация хлорофилла а, г/л; А664 – оптическая плотность экстракта при длине волны 664 нм; коэффициент экстинкции равен 73,6 л/г. Содержание хлорофилла а выражали в мг/г сухой массы водорослей. Концентрацию каротиноидов в ацетоновом растворе рассчитывали по формуле, предложенной Сили с соавторами [272]: Скар = (A480 - 0,033 · А661)/193, (3) где Скар – концентрация каротиноидов, г/л; 117 А480,661 – оптическая плотность экстракта при длинах волн 480 и 661 нм; коэффициент экстинкции равен 0,033 л/г и 193 л/г. Содержание каротиноидов выражали в мг/г сухой массы водорослей. Определение содержания хлорофилла а и каротиноидов водорослей проводили в трехкратной повторности. На основании трех измерений рассчитывали среднеарифметические значения показателя. 3.4. Выделение и фракционирование полисахаридов Карпоспорофиты. Высушенные водоросли (n=3) массой 3-5 г измельчали и заливали водой в соотношении 1:30. Экстракцию полисахаридов проводили в течение 12 ч при температуре 20°С. Полученный экстракт фильтровали, центрифугировали при 4000 об/мин для удаления остатков клеточной стенки, концентрировали на роторном испарителе и осаждали полисахариды тройным объемом этанола. Выпавший осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин и лиофильно сушили. Остаток водорослей заливали водой в соотношении 1:30 и трижды проводили экстракцию в течение 3 ч на водяной бане при 80°С при постоянном перемешивании. Три горячих экстракта объединяли, фильтровали и осаждали полисахариды как описано выше. Стерильная форма водорослей и цистокарпы. Остатки водорослей, полученные после выделения пигментов, заливали дистиллированной водой в соотношении 1:30 и экстрагировали полисахариды в течение 3 ч на водяной бане при 80°С при постоянном перемешивании как описано для карпоспорофитов. Кроме того, экстрагировали полисахариды по описанной методике из замороженной водоросли с цистокарпами без предварительного выделения пигментов в качестве контрольного образца. Разделение полисахаридов из карпоспорофитов и стерильных растений на желирующие и нежелирующие фракции проводили с помощью 4% CaCl2 и KCl соответственно, как описано ранее [37]. 3.5. Основные аналитические методы Общее количество сахаров в образцах определяли фенол-сернокислотным методом [249]. 118 Содержание каррагинана во фракциях определяли на основании реакции сульфатной группы полисахарида с голубым Тейлора (1,9-диметил-метиленовым голубым) [248]. Для этого к аликвоте раствора полисахарида (40 мкл) добавляли 200 мкл реактива и измеряли оптическую плотность при длине волны 535 нм на спектрофотометре “Quant” (Bio-tech instruments, США). Содержание белка в полисахариде определяли по методу Лоури [273]. Содержание общего растворимого белка в тканях водоросли определяли на сыром материале согласно методике Брэдфорд [274]. Для этого свежесобранные образцы (n=3) весом 1 г перемалывали до состояния пудры в жидком азоте и экстрагировали в 2-3 мл 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 4% ПВП-10, 0,1 мМ ЭДТА и 0,25% Triton X-100. Полученные экстракты центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 15 мин при 4°С. Надосадочную жидкость использовали для определения содержание общего растворимого белка в тканях водорослей. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (“Sigma”, США). Количество белка рассчитывали в мг и выражали в процентах от сухого веса водоросли. Аминокислотный анализ. Анализ был проведен на аминокислотном анализаторе Biochrom 30 с размером колонки 200 x 4,6 мм. При анализе были использованы литий-цитратные буферы и нингидринный реактив. Перед проведением анализа белка 2 мг полисахарида гидролизовали в 1 мл 6 N HCl в запаянных ампулах в течение 24 ч при температуре 105°С. После охлаждения до комнатной температуры гидролизат досуха упаривали на роторном испарителе при температуре 50°С с 3 мл 96% этанола трижды для удаления из раствора кислоты. Далее раствор обрабатывали 1 мл хлороформа четыре раза. Водную часть экстракта упаривали на роторном испарителе при температуре 60°С досуха. Вещество взвешивали. При приготовлении образца для аминокислотного анализа объем пробы доводили до 1 мл. Содержание сульфатных групп определяли турбидиметрическим методом [275]. Полный восстановительный гидролиз. Моносахаридный состав определяли методом полного восстановительного гидролиза [276, 277]. Нейтральные моносахариды анализировали в виде ацетатов полиолов [276] и альдононитрилов 119 [277] с помощью ГЖХ на хроматографе 6850 (“Agilent”, Германия), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,25 мм) с 5% Phenyl Methyl Siloxane (“Agilent”, Германия), с пламенно-ионизационным детектором, при температуре 175-225°C (скорость изменения температуры 3°C в 1 мин). Частичный восстановительный гидролиз. Для получения ацетатов альдононитрилов 5 мг полисахарида и 40 мг 4-метил-морфолин борана (“Aldrich”, США) гидролизовали 2 М трифторуксусной кислотой (ТФУ), содержащей миоинозитол в качестве внутреннего стандарта (1мг/мл), в запаянной ампуле в течение 8 ч при температуре 65°С. Для удаления избытка ТФУ гидролизат трижды упаривали с 3 мл этанола. К сухому остатку гидролизата добавляли 1 мл 6% раствора хлоргидрат гидроксиламина и нагревали в течение 1 ч при температуре 100°С. После охлаждения добавляли 1 мл уксусного ангидрида, нагревали в течение 1 ч при температуре 100°С. После охлаждения смесь трижды переупаривали с 3 мл толуола. Альдононитрилы экстрагировали хлороформом и упаривали досуха. Полученные альдононитрилы анализировали на хроматографе 6850 (“Agilent”, Германия), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,25 мм) с 5% Phenyl Methyl Siloxane (“Agilent”, Германия), с пламенноионизационным детектором, при температуре 175-290°С (скорость изменения температуры 10°С в 1 мин). В качестве стандартных образцов для получения агаробиита и каррабиита были использованы агароза (“Sigma”, США) и каппакаррагинан, выделенный из Kappaphycus alvarezii (“Sigma”, США). Метилирование. К образцу (2 мг) добавляли диметилсульфоксид (ДМСО) (1 мл) и встряхивали на вибраторе при 40°С, после чего прибавляли свежеприготовленный порошок NaOH (100 мг), а затем – MeI (0,2 мл). Взвесь встряхивали на вибраторе в течение 20 мин, после чего добавляли те же количества NaOH и MeI и встряхивали аналогичным образом. Затем смесь нагревали в термостате при 40°С в течение 1 ч, охлаждали льдом и останавливали реакцию добавлением 1 мл воды. Избыток MeI удаляли упариванием в вакууме, образовавшийся раствор пропускали через патрон Sep-Pak C18 (Waters Ltd, Англия), который затем промывали водой и 50% метанолом. Фракцию, элюированную метанолом, собирали и упаривали в вакууме. Далее образец гидролизовали 2 M ТФУ при 100°С в течение 6 ч, после чего гидролизат 120 восстанавливали, добавляя 2 мл смеси, состоящей из 1 мл NH4OH, 9 мл H2O и 0,1 г NaBH4, и оставляли на ночь в темноте. Восстановленную смесь пропускали через колонку с Ку-2 в H+-форме, упаривали досуха, а затем переупаривали с 3 мл метанола 3 раза. Затем смесь частично метилированных моносахаридов ацетилировали как описано выше и экстрагировали полученные ацетаты полиолов хлороформом. Полученные ацетаты полиолов анализировали с помощью газожидкостной хроматографии на хроматографе 6850 (“Agilent”, Германия), оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,25 мм) с 5% Phenyl Methyl Siloxane (“Agilent”, Германия), с пламенно-ионизационным детектором, при температуре 110-230°С (скорость изменения температуры 3°С в 1 мин), а также с помощью хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС). 3.6. Мягкий кислотный гидролиз Кислотный гидролиз полисахаридов из стерильной формы водоросли и карпоспорофитов проводили по методу, предложенному Yu и соавторами [278]. Для этого полисахариды (100 мг) растворяли в 0,1 N HCl (10 мл), выдерживали при температуре 37°С в течение 2 и 24 ч для полисахарида из стерильной формы водоросли и в течение 50 ч для полисахарида из карпоспорофита, после чего гидролиз останавливали с помощью 0,1 N NH4OH (рН 8-9), полисахарид осаждали пятью объемами 96% этанола, центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин, осадки растворяли в воде, концентрировали, лиофилизовали и снимали масс-спектры. 3.7. Ферментативный гидролиз Полисахарид из репродуктивной формы A. flabelliformis (карпоспорофит) подвергали ферментативному гидролизу рекомбинантной ι-каррагиназой (Microbulbifer thermotolerans), экспрессированной в Escherichia coli штамм BL21(DE3). К раствору полисахарида объемом 1 мл (0,1% в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 8,5)) добавляли 10 мкл ι-каррагиназы (50 мкг/мл) и инкубировали при 30°С в течение ночи. После чего добавляли новую аликвоту фермента для обеспечения полноты протекания реакции. В качестве стандартного образца использовали ι-каррагинан из Euchemia spinosum (“Sigma”, США). 121 3.8. Определение молекулярной массы 3.8.1. Вискозиметрический метод Средневязкостные молекулярные массы образцов полисахаридов рассчитывали [279] согласно уравнению Марка-Хаувинка-Куна: | η | = KmMα, (4) где | η | – характеристическая вязкость, Km и α – эмпирические константы, значения которых взяты из работ [280, 281]. Вязкость растворов полисахаридов измеряли в модифицированном вискозиметре Убеллоде (СКБ “Пущино”) с диаметром капилляра 0,3 мм в диапазоне концентраций 1-2 мг/мл в 0,1 М растворе NaCl. Измерения проводили при температуре 25°С с точностью измерения времени ±0,1 с. Значения характеристической вязкости для образцов полисахаридов вычисляли методом наименьших квадратов экстраполяцией графика зависимости (ln ηотн)/С на бесконечное разбавление. 3.8.2. Молекулярные массы низкомолекулярных (НМ) производных полисахаридов Среднечисловые молекулярные массы НМ-производных полисахаридов определяли по методу, основанному на реакции восстанавливающих сахаров с ферроцианидом [256]. К 0,2 мл раствора олигосахарида трех различных концентраций: 200, 100 и 50 γ прибавляли 0,2 мл раствора, содержащего 0,53% Na2CO3, 0,065% KCN и добавляли 0,2 мл 0,05% раствора ферроцианида калия. Затем кипятили на водяной бане в течение 15 мин, охлаждали и добавляли 1 мл раствора, содержащего 1,5 г Fe(III) аммиачных квасцов, 1 г дюпанола в 1000 мл 0,05 N Н2SO4. Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 700 нм на спектрофотометре “Quant” (Bio-tek instruments, США). Все измерения проводили в трех параллелях. На основании калибровочной кривой по галактозе определяли концентрацию восстанавливающего углеводного рассчитывали молекулярные массы исследуемых образцов. 122 остатка и 3.9. Очистка полисахарида от белка 3.9.1. Обработка полисахарида протеазой из Streptomyces caespitosus Образец полисахарида массой 100 мг растворяли в 10 мл 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,5) (1% раствор) и добавляли 0,5 мл раствора фермента в том же самом буфере концентрацией 2 мг/0,5 мл. Смесь выдерживали при температуре 37°С в течение 3 ч. Затем фермент инактивировали выдерживанием смеси при температуре 80°С в течение 15 мин. Далее раствор пропускали через ультрафильтрационную мембрану с диаметром пор 10 кДа и осаждали полисахарид четырьмя объемами этанола. 3.9.2. Очистка полисахарида от белка по методу Севага К 1% водному раствору полисахарида добавляли хлороформ в количестве 0,2 от объема раствора полисахарида и н-бутанол в количестве 0,2 от объема хлороформа. Полученный раствор встряхивали в течение 2 мин в делительной воронке и после разделения трех фаз собирали водный слой, содержащий полисахарид, который затем концентрировали на роторном испарителе и лиофильно высушивали. 3.10. Хроматографические методы 3.10.1. Ионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе Образец полисахарида (100 мг) растворяли в 50 мл дистиллированной воды (2 мг/мл) и наносили на анионообменную колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (“Sigma”, США) (2,2 × 28,0 см). Полисахарид элюировали ступенчатым градиентом концентраций – 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 2,0 и 4,0 М NaCl в воде. Полученные фракции объемом по 5,0 мл анализировали на присутствие каррагинана по реакции сульфогрупп с голубым Тейлора (1,9-диметил-метиленовым голубым) [248] и на общее содержание углеводов фенол-сернокислотным методом [249]. Фракции, соответствующие пикам на выходных кривых, объединяли, диализовали против воды и лиофилизовали. 123 3.10.2. Гельпроникающая хроматография на биогеле Р-10 Образец НМ-каррагинана из карпоспорофита A. flabelliformis, полученного мягким кислотным гидролизом, массой 15 мг растворяли в 3 мл дистилированной воды и наносили на колонку (1,5 × 78,0 см) с биогелем Р-10, элюировали дистиллированной водой, собирали фракции объемом 4,0 мл. Собранные фракции анализировали на присутствие сахаров фенол-сернокислотным методом [249] и на основании реакции сульфатной группы каррагинанов с голубым Тейлора [248]. Фракции, соответствующие пикам на выходных кривых, объединяли и лиофилизовали. 3.10.3. Адсорбционная хроматография на фосфате кальция Аликвоту экстракта ФБП объемом 6,0 мл наносили на колонку со свежеприготовленным фосфатом кальция (2,0 × 73,0 см), уравновешенную 0,1 М KH2PO4 (pH 7,4). Пигменты элюировали 0,1 М KH2PO4, собирали фракции объемом 4,0 мл, которые затем анализировали спектрофотометрически на Cecil CE 1011 (Великобритания) при длинах волн 565 нм, характерной для ФЭ, 615 нм – для ФЦ и 650 нм – для АФЦ. Получение фосфата кальция. Для получения свежеприготовленного фосфата кальция смешивали равные объемы 1 М раствора Na2HPO4 и 1,5 М раствора CaCl2. Выпавший осадок Ca3(PO4)2 промывали 5 раз водой для удаления растворимой соли, добавляли к нему небольшое количество целлита и набивали полученным сорбентом колонку. 3.10.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Продукты ферментативного гидролиза полисахарида анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием Dionex Ultimate 3000 HPLC system. Олигосахариды разделяли на гельфильтрационной колонке Superdex peptide 10/300 (GE Healthcare, Франция), предел эксклюзии 1007000 Да. В качестве подвижной фазы использовали 100 мМ LiNO3, отфильтрованный через мембрану с диаметром пор 0,1 мкм. Скорость потока 1 мл/мин. Объем вводимого образца 100 мкл. 124 3.10.5. Хромато-масс-спектрометрия ГЖХ-МС ацетатов частично метилированных полиолов проводили на хромато-масс-спектрометре Fisons MD-800 (капиллярная колонка Rtx-5 (5%-ый дифенилметилполисилоксан, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина жидкой фазы 0,25 мк). Программирование температуры: изотерма 150°С (1 мин), далее линейный рост 3°С/мин до 230°С. Газ-носитель – гелий, ввод без делителя потока. 3.11. Физические методы анализа 3.11.1. ИК-спектроскопия ИК-спектры образцов полисахаридов в пленках регистрировали на спектрофотометре с Фурье-преобразованием Vector 22 (“Bruker”, Германия) с разрешением 4 см-1. Для этого 8 мг вещества растворяли в 1 мл воды и сушили при температуре 37°С на полиэтиленовой подложке до получения сухой пленки. Затем пленку зажимали между двумя окнами из NaCl и регистрировали ИК-спектр. Спектры нормировали по поглощению скелета моносахаридного кольца при ~1074 см-1 (А1074 ≈ 1,0). 3.11.2. Спектроскопия ЯМР Одномерные спектры 1H, 13С ЯМР и двумерные спектры 1H-1H COSY, 1Н-1Н ROESY и 1H-13C HSQC образцов полисахаридов и олигосахаридов были получены на приборе DPX-700 (176,05 МГц) (“Bruker”, Германия) в растворе D2O при температуре 50°С. Химические сдвиги были описаны относительно внутреннего стандарта – метанола (δС 50,15, δН 3,337). Для получения и обработки данных спектров ЯМР была использована стандартная программа фирмы “Bruker” (XWINNMR 1,2). 3.11.3. Масс-спектрометрия В качестве матрицы для масс-спектрометрии МАЛДИ использовали 2,5дигидроксибензойную кислоту (DHB) (“Sigma”, США). Масс-спектры МАЛДИ получали с помощью тандемного времяпролетного масс-спектрометра “Ultra Flex III” (“Bruker”, Германия), оснащенного азотным лазером (длина волны 337 нм), 125 режимами работы “рефлектор” и “LIFT”, в режимах регистрации катионов и анионов с использованием матрицы DHB при ускоряющем напряжении 25 кВ, мощности лазера 20%, числе выстрелов 250 при частоте 66 Гц. Для регистрации масс-спектра смешивали 1 мкл водного раствора образца при концентрации 5 мг/мл и 1 мкл 1 М раствора матрицы (этанол:вода, 1:1). 1 мкл смеси наносили на мишень из нержавеющей стали, после чего высушивали в потоке воздуха. ИЭР масс-спектры регистрировали на квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре Agilent 6510 Q-TOF с двойной ионизацией в режиме регистрации положительных ионов при напряжении иглы в 3,5 кВ, температуре осушающего газа 325°C и напряжении фрагментатора 243 В. Сухой образец разбавляли в смеси ацетонитрил/вода (1:1) до получения концентрации 0,01 мг/мл и вводили полученный образец с помощью шприцевого насоса со скоростью потока 5 мкл/мин. Калибровку проводили с помощью стандартной калибровочной смеси “HP-mix”. В тандемном режиме энергия столкновительной диссоциации выбиралась из промежутка 10-30 В по интенсивности фрагментных ионов. В качестве столкновительного газа применялся аргон. 3.12. Биологическая активность полисахаридов 3.12.1. Антикоагулирующая активность Протромбиновое время (ПВ) Образцы полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis и нефракционированный гепарин в конечных концентрациях 10 и 1 мкг/мл соответственно, инкубировали в течение 1 мин при 37°С с 0,1 мл плазмы крови человека с последующим добавлением 0,2 мл раствора тромбопластин кальциевой смеси (Технология-стандарт, Россия) предварительно нагретом при 37°С. После этого регистрировали время образования сгустка. Влияние образцов полисахаридов на ПВ рассчитывали согласно следующему уравнению: %=((tобразца – tPBS)/tPBS)×100. (5) Время образования и активности тромбопластина (АЧТВ) Образцы полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis и нефракционированный гепарин в конечных концентрациях 10 и 1 мкг/мл соответственно, инкубировали в течение 2 мин при 37°С с 90 мкл плазмы крови 126 человека с последующим добавлением 90 мкл АЧТВ реагента, содержащего фосфолипид эллаговой кислоты (Технология-стандарт, Россия). После инкубирования при 37°С в течение 3 мин добавляли 40 мкл 0,025 М CaCl2 и засекали время. Влияние образцов полисахаридов на АЧТВ рассчитывали согласно следующему уравнению: %=((tобразца – tPBS)/tPBS)×100. (6) 3.12.2. Влияние полисахаридов на образование активных форм кислорода (АФК) Этическое одобрение Протокол исследования был одобрен медицинским этическим комитетом местной больницы (Владивосток, Россия). Информированное согласие было получено от всех субъектов, которые приняли участие в исследовании. Ни один из доноров не употреблял никаких лекарств в течение 14 дней до забора крови. Кровь брали из локтевой вены нормальных здоровых добровольцев в пластиковые пробирки Vacuette (Greiner Bio-One International AG, Кремсмюнстер, Австрия), содержащие 3,8% раствор тринатрийцитрата в качестве антикоагулянта в соотношении цитрат:кровь 1:9. Лейкоциты Лейкоциты были выделены из венозной крови путем лизиса эритроцитов в растворе, содержащем 0,15 М NH4Cl, 10 мМ NaHCO3 и 0,1 мМ ЭДТА, в течение 10 мин [282]. Фракцию лейкоцитов промывали дважды, повторно суспендировали в фосфатном буфере (PBS) и доводили до концентрации ≈ 107 не-лимфоцитов (полиморфноядерные лейкоциты и моноциты) на мл. Определение образования АФК Образование активных форм кислорода анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием 2-[6(4-амино) фенокси-3H-ксантен-3-он9-ил] бензойной кислоты (APF), как описано Setsukinai и соавторами [283]. Клетки высевали в 96-луночный планшет для тканевых культур (Costar, Cambridge, MA) (100 000 клеток/лунку) и выдерживали в течение 1 ч с образцами (50 и 100 мкг/мл, 127 конечное значение), APF (10 мкМ) добавляли в среду в течение последних 30 мин. Клетки собирали, выдерживали во льду 10 мин и сразу анализировали с помощью проточной цитометрии. Цитометрические измерения проводили с использованием четырех цветовых FACSCalibur (Becton Dickinson). Переднее и боковое рассеивание света использовали для идентификации клеточных популяций, измерения размера и гранулярности клеток. 3.13. Измерение параметров условий обитания водоросли Температуру и соленость воды, а также интенсивность и количество фотосинтетически активной радиации (ФАР) в месте обитания A. flabelliformis (Амурский залив, мыс Красный, Японское море) регистрировали ежемесячно в течение 2009 г. Температуру воды измеряли ртутным термометром, соленость – солемер-рефрактометром “Атаго”. Интервал между измерениями температуры воды и солености составлял 3-5 дней. Интенсивность ФАР, проникающей в толщу воды на месте сбора биологического материала, измеряли квантовым фотометром LI-COR 189, оснащенным 2D подводным датчиком UWQ, LI-COR 7254 (Biospherical Instruments Inc. Сан-Диего, США). В течение исследуемого периода интенсивности ФАР регистрировали каждые 3-5 дней. Измерения проводили с 8:00 до 20:00, интервал между измерениями составлял 30 мин. Полученные за сутки данные интегрировали и рассчитывали дневную дозу падающей на воду фотосинтетической радиации. В течение каждого месяца вели учет пасмурных и солнечных дней. На основании полученных за каждый месяц данных рассчитывали среднесуточные параметры интенсивности и дозы ФАР, полученные в течение каждого месяца. 3.14. Статистический анализ Для оценки статистических различий в содержании фотосинтетических пигментов, сухого вещества водоросли, общего растворимого белка и полисахаридов между отдельными месяцами в течение 2009 г. и в содержании ФБП и полисахаридов в июле 2012 г. полученные данные подвергали однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA) с последующим использованием многорангового LSD-теста. Представленные значения соответствуют средним и их 128 стандартным отклонениям (SD); различия считали достоверными при P < 0,05. Для выявления взаимосвязи между сухим веществом водоросли, количеством общего растворимого белка, содержанием пигментов, полисахаридов, их моносахаридным составом и факторами среды (свет, температура воды) в 2009 г. использовали непараметрический тест по Спирмену (Spearman Rank test). Взаимосвязь считали достоверной при P < 0,05. Результаты экспериментов по биологической активности полисахаридов выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Достоверность различий между показателями оценивали по однопараметрическому тесту ANOVA. Различия считали достоверными при уровне значимости P < 0,05. 129 4. ВЫВОДЫ 1. Установлено влияние фотосинтетически активной радиации и температуры воды среды обитания водоросли A. flabelliformis на ее пигментный и полисахаридный состав. Показано, что низкий уровень ФАР способствует наибольшему накоплению ФБП и полисахаридов в водоросли. 2. Показано, что благоприятным временем сбора водоросли A. flabelliformis для получения сульфатированных полисахаридов с высоким выходом является период, характеризующийся низкими температурами воды и ФАР (ноябрь-февраль). В условиях высокой интенсивности ФАР среды обитания водоросли (апрель, августсентябрь) в клеточной стенке макрофита синтезируются галактаны с высокой степенью сульфатирования. 3. Подобраны оптимальные условия для комплексного выделения из A. flabelliformis ФБП и полисахаридов. Показано, что более эффективно пигменты экстрагируются из макрофита водным 1,5% раствором NaNO3. При последовательной экстракции ФБП, а затем полисахарида выход последнего увеличивается в 1,6 раза. 4. Проведен полисахаридов, сравнительный выделенных качественный из стерильной и и количественный репродуктивной анализ форм A. flabelliformis. Показано, что репродуктивная форма водоросли продуцирует в 1,5 раза больше полисахарида, чем стерильная. Установлено, что независимо от стадии развития в водоросли A. flabelliformis синтезируются в основном желирующие типы полисахаридов, отнесенные к каррагинанам. 5. Установлено, что желирующий полисахарид из стерильной формы A. flabelliformis имеет гибридную каппа/бета структуру с соотношение каппа- и бетазвеньев 3:1. Показано, что полимерная цепь этого полисахарида построена из каппа-каррабиозы, каппа-карратетраозы, каппа-каррагексаозы, бета-каррабиозы, бета-карратетраозы, тетра- и гекса-олигосахаридов с различной последовательностью чередования каппа- и бета-звеньев. 6. Установлено, что желирующий полисахарид из карпоспорофита A. flabelliformis представляет собой йота/каппа-каррагинан с преобладанием звеньев йота-типа, содержит звенья бета-каррагинана и минорные количества ню-каррагинана. 130 7. Показано, что основными звеньями йота/каппа-каррагинана являются йотакаррабиоза, йота-карратетраоза, а также гибридные тетра- (DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA2S-G4S) и гексасахариды (DA2S-G4S-DA2S-G4S-DA-G4S, DA-G4SDA2S-G4S-DA2S-G4S, DA2S-G4S-DA-G4S-DA2S-G4S) с различной последовательностью йота- и каппа-звеньев. 8. Показано, что в каррагинанах из A. flabelliformis заместителем одной из гидроксильных групп галактозы является ксилоза в фуранозной форме, которая, вероятно, занимает положение 6 1,3-связанной β-D-галактозы. 9. Показано, что полисахариды из обеих форм водоросли антикоагулирующую активность и индуцируют образование АФК. 131 проявляют 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Craigie J.S. Cell wall // In: Cole K.M. and Sheath R.G. (eds.), Biology of the red algae, Cambridge: Cambridge University Press. – 1990. – P. 221-257. 2. Усов А.И. Проблемы сульфатированных и достижения полисахаридов красных в структурном водорослей анализе // Химия растительного сырья. – 2001. – № 2. – С. 7-20. 3. Knutsen S.H., Myslabodski D.E., Larsen B., Usov A.I. A modified system of nomenclature for red algal galactans // Bot. Mar. – 1994. – Vol. 37, N 2. – P.163169. 4. Rees D.A. The carrageenans system of polysaccharides. 1. The relation between the κ- and λ-components // J. Chem. Soc. – 1963. – Vol. 1. – P. 1821–1832. 5. Knutsen S.H. Isolation and analysis of red algal galactans : Dr. Sci. Thesis. – University of Trondeim, Norway, 1992. – 96p. 6. Lewis G., Stanley N., Guist G. Commercial production and application of algal hydrocolloids // In: Lembi C. (eds.), Algae and Human affairs; Seattle: Univ. of Washington. – 1988. – P. 206–232. 7. Sandford P. Application of marine polysaccharides in the chemical industries // In: Sandford P. (eds.), Biotechnology of marine polysaccharides; W.: Colwell eds. – 1985. – P. 453-519. 8. Yermak I.M., Khotimchenko Yu.S. Chemical Properties, biological activities and application of carrageenan from red algae // In: Fingerman M., Nagabhushanam R. (eds.), Recent Advances in Marine Biotechnology; USA-UK: Sci. Publ. Inc. – 2003. – P. 207-255. 9. Cardozo K.H.M., Guaratini T., Barros M.P., Falcao V.R., Tonon A.P., Lopes N.P., Campos S., Torres M.A., Souza A.O., Colepicolo P., Pinto E. Metabolites from algae with economical impact // J. Comp. Biochem. Physiol. – 2007. – Vol. 146. – P. 60-78. 10. Campo V.L., Kawano D.F., Silva D.B., Carvalho I. Carrageenans: Biological properties, chemical modifications and structural analysis – A review // Carbohydr. Polym. – 2009. – Vol. 77. – P. 167-180. 132 11. Ермак И.М., Хотимченко Ю.С. Физико-химические свойства, применение и биологическая активность каррагинана – полисахарида красных водорослей // Биология моря. – 1997. – Т. 23, № 3. – С. 129-142. 12. Usov A.I. Structural analysis of red seaweed galactans of agar and carrageenan groups // Food Hydrocoll. – 1998. – Vol. 12. – P. 301-308. 13. Sekar S., Chandramohan M. Phycobiliproteins as a commodity: trends in applied research, patents and commercialization // J. Appl. Phycol. – 2008. – Vol. 20. – P. 113-136. 14. Glazer A.N. Directional energy transfer in a photosynthetic antenna // J. Biol. Chem. – 1989. – Vol. 264. – P. 1-4. 15. Bhat V., Madyastha K.M. C-Phycocyanin: a potent peroxyl radial scavenger in vivo and in vitro // Biochem. Res. Commun. – 2000. – N 1. – P. 20-25. 16. Romay C.H., Gonzalez R., Ledón N., Remirez D., Rimbau V. C-Phycocyanin: A biliprotein with antioxidante, anti-inflammatory and neuroprotective effects // Curr. Protein Pept. Sci. – 2003. – Vol. 4. – P. 207–216. 17. Ge B., Qin S., Han L., Lin F., Ren Y. Antioxidant properties of recombinant allophycocyanin expressed in Escherichia coli // J. Photochem. Photobiol. B. – 2006. – Vol. 84, N 3. – P. 175-180. 18. Hsiao G., Chou P.H., Shen M.Y., Chou D.S., Lin C.H., Sheu J.R. C-Phycocyanin, a very potent and novel platelet aggregation inhibitor from Spirulina platensis // J. Agric. Food Chem. – 2005. – Vol. 53. – P. 7734-7740. 19. Remirez D., Ledón N. Role of histamine in the inhibitory effects of phycocyanin in experimental models of allergic response // Mediators Inflamm. – 2002. – N 11. – P. 81-85. 20. Chapman V.J., Chapman D.J. Seaweeds and their uses // London, UK: Chapman and Hall. – 1980. – P. 98-148. 21. Hung D., Hori K., Nang H.Q., Kha T., Hoa L.T. Seasonal changes in growth rate, carrageenan yield and lectin content in the red alga Kappaphycus alvarezii cultivated in Camranh Bay, Vietnam // J. Appl. Phycol. – 2009. – Vol. 21. – P. 265-272. 133 22. Brown M.T. Interactions between environmental variables on growth rate and carrageenan content of Solieria chordalis (Solieriaceae, Rhodophyceae) in culture // J. Appl. Phycol. – 1995. – Vol. 7. – P. 427-432. 23. Zertuche-Gonzalez J.A., Pacheco-Ruiz I., Soria-Mercado I.E. Carrageenan yield and properties of Eucheuma uncinatum (Seth. & Gard.) Daw. cultured under natural conditions // Hydrobiologia. – 1993. – Vol. 260/261. – P. 601-605. 24. Aguilera J., Bischof K., Karsten U., Hanelt D., Wiencke C. Seasonal variations of ecophysiological patterns in macroalgae from an Arctic fjord. II. Pigment accumulation and biochemical defence systems against high light stress // Mar. Biol. – 2002. – Vol. 140. – P. 1087-1095. 25. Pereira D.C., Trigueiro T.G., Colepicolo P., Marinho-Soriano E. Seasonal changes in the pigment composition of natural population of Gracilaria domingensis (Gracilariales, Rhodophyta) // Braz. J. Pharmacog. – 2012. – Vol. 22, N 4. – P. 874-880. 26. Титлянов Э.А., Новожилов А.В., Чербаджи И.И. Анфельция тобучинская: биология, экология, продуктивность : монография. – М.: Наука, 1993. – 224 с. 27. Estevez J.M., Ciancia M., Cerezo A.S. DL-Galactan hybrids and agaransfrom gametophytes of the red seaweed Gymnogongrus torulosus // Carbohydr. Res. – 2001. – Vol. 331. – P. 27–41. 28. Титлянов Э.А., Титлянова Т.В. Морские растения стран АзиатскоТихоокеанского региона, их использование и культивирование / Ред. А.В. Адрианов. В.: Дальнаука. – 2012. – 377 с. 29. Reis R.P., Yoneshigue-Valentin Y., Cesar P.S. Spatial and temporal variation of Hypnea musciformis carrageenan (Rhodophyta, Gigartinales) from natural beds in Rio de Janeiro State, Brazil // J. Appl. Phycol. – 2008. – Vol. 20. – P. 1-8. 30. Pickering T.D., Skelton P., Sulu J.R. Intentional introductions of commercially harvested alien seaweeds // Bot. Mar. – 2007. – Vol. 50. – P. 338-350. 31. Freile-Pelegrin Y., Robledo D. Carrageenan of Eucheuma isiforme (Solieriaceae, Rhodophyta) from Yucatan, Mexico. II. Seasonal variations in carrageenan and biochemical characteristics // Bot. Mar. – 2006. – Vol. 49. – P. 72-78. 134 32. Bixler H.J. Recent developments in manufacturing and marketing carrageenan // Hydrobiologia. – 1996. – Vol. 326/327. – P. 35-37. 33. Mehta G.K., Meena R., Prasad K., Ganesan M., Siddhanta A.K. Preparation of galactans from Gracilaria debilis and Gracilaria salicornia (Gracilariales, Rhodophyta) of Indian waters // J. Appl. Phycol. – 2010. – Vol. 22. – P. 623-627. 34. Acleto C.O. The seaweeds resources of Peru // In: Critchley A.T., Ohno M. (eds.), Seaweed resources of the World, Yokosuka: JICA. – 1998. – P. 343-346. 35. Tseng C.K. Algal biotechnology industries and research activities in China // J. Appl. Phycol. – 2001. – Vol. 13, N 4. – P. 375-380. 36. Усов А.И. Полисахариды красных морских водорослей // Прогресс химии углеводов. – М.: 1985. – С. 77–96. 37. Yermak I.M., Kim Y.H., Titlynov E.A., Isakov V.V., Solov’eva T.F. Chemical structure and gel properties of carrageenans from algae belonging to the Gigartinaceae and Tichocarpaceae, collected from the Russian Pacific coast // J. Appl. Phycol. – 1999. – Vol. 11. – P. 41–48. 38. Белоус О.С., Титлянова Т.В., Титлянов Э.А. Морские растения бухты Троицы и смежных акваторий (залив Петра Великого, Японское море) / Ред. П.Г. Горовой. В.: Дальнаука. – 2013. – 264 с. 39. Usov A.I. Polysaccharides of the red algae // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. – 2011. – Vol. 65. – P. 115-217. 40. Gantt E., Lipschultz C.A., Grabowski J., Zimmerman B.K. Phycobilisomes from blue-green and red algae // Plant Physiol. – 1979. – Vol. 63. – P. 615-620. 41. Glick R.E., Zilinskas B.A. Role of the colorless polypeptides in phycobilisome reconstitution from separated phycobiliproteins // Plant Physiol. – 1982. – Vol. 69. – P. 991-997. 42. Поспелова Н.В., Нехорошев М.В. Содержание фикобилипротеинов в некоторых видах красных водорослей Черного моря // Экология моря. – 2002. – С. 78-80. 43. Scheer H., Staehelin L.A., Arntzen C.J. Excitation transfer in phycobiliproteins // In: Staehelin L.A. and Arntzen C.J. (eds.), Photosynthetic membranes and light harvesting systems, Germ.: Springer-Verlag Berlin Heidelberg. – 1986. – P. 327342. 135 44. Kawsar S.M.A., Fujii Y., Matsumoto R., Yasumitsu H., Ozeki Y. Protein Rphycoerythrin from marine red alga Amphiroa anceps: extraction, purification and characterization // Phytologia Balcanica. – 2011. – Vol. 17, N 3. – P. 347-354. 45. Zhongzheng P., Baicheng Z., Chengkui Z. Comparative studies on spectral properties of R-phycoerythrin from the red seaweeds from Qingdao // Chin. J. Oceanol. Limnol. – 1986. – Vol. 4, N 4. – P. 353-359. 46. Morisset W., Kremer B.P. Phycobiliproteins – characterization of coloured algal proteins by a simple electrophoretic procedure // Biochem. Educ. – 1984. – Vol. 12, N 4. – P. 178-180. 47. Middepogu A., Murthy S.D.S., Prasanna R.B. Structural organization and functions of phycobiliproteins in Cyanobacteria // Int. J. Plants, Animal and Environm. Sci. – 2012. – Vol. 2, N 2. – P. 9-17. 48. Pangestuti R., Kim S.K. Biological activities and health benefit effects of natural pigments derived from marine algae // J. Func. Foods. – 2011. – Vol. 3, N 4. – P. 255-266. 49. Ayehunie S., Belay A., Baba T.W., Ruprecht R.M. Inhibition of HIV-1 replication by an aqueous extract of Spirulina platensis (Arthrospira platensis) // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retroviral. – 1998. – Vol. 18. – P. 7–12. 50. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В. Мейчик Н.Р., Носов А.М., Полесская О.Г., Харитонашвили Е.В., Чуб В.В. Физиология растений / Ред. И.П. Ермакова. М.: Изд-во «Академия». – 2007. – 640 с. 51. Кочубей С.М. Организация фотосинтетического аппарата высших растений / С.М. Кочубей. – Киев: Изд-во «Альтерпрес», 2001. – 205 с. 52. Кузнецов В.В. Физиология растений / В.В. Кузнецов, Г.Д. Дмитриева. – М.: Высш. шк., 2005. – 736 с. 53. Сиренко Л.А., Паршикова Т.В. Каротиноиды гидробионтов // Экология моря. – 2005. – С. 63-67. 54. Sies H., Stahl W. Nutritional protection against skin damage from sunlight // Annu. Rev. Nutr. – 2004. – Vol. 24. – P. 173–200. 55. Stahl W., Sies H. Antioxidant activity of carotenoids // Mol. Aspects Med. – 2003. – Vol. 24. – P. 345–351. 136 56. Wertz K., Seifert N., Hunziker-Buchwald P., Riss G., Wyss A., Lankin C., Goralczyk R. beta-Carotene inhibits UVA-induced matrix metalloprotease 1 and 10 expression in keratinocytes by a singlet oxygen-dependent mechanism // Free Radic. Biol. Med. – 2004. – Vol. 37. – P. 654–670. 57. Wertz K., Hunziker-Buchwald P., Seifert N., Riss G., Neeb M., Steiner G., Goralczyk R. beta-Carotene interferes with ultraviolet light A-induced gene expression by multiple pathways // J. Invest. Dermatol. – 2005. – Vol. 124. – P. 428–434. 58. Flores-Moya A., Fernandez-Garcia J.A., Niell F.X. Influences of light intensity and temperature on the summer disappearance of Laurencia pinnatifida (Ceramiales, Rhodophyta) // Crypt. Botanica. – 1992. – Vol. 2. – P. 345-350. 59. Calabrese G., Felicini G.P. Research on red algal pigments. The effect of the intensity of white and green light on the rate of photosyntesis and it’s relationship to pigment components in Gracilaria compressa (C. Ag.) Grev. (Rhodophyceae, Gigartinales) // Phycologia. – 1973. – Vol. 12. – P. 195-199. 60. Franklin L.A., Forster R.M. The changing irradiance environment: consequences for marine macrophyte physiology, productivity and ecology // Eur. J. Phycol. – 1997. – Vol. 32. – P. 207-232. 61. Sagert S., Schubert H. Acclimation of the photosynthetic apparatus of Palmaria palmata (Rhodophyta) to light qualities that preferentially excite photosystem I or photosystem II // J. Phycol. – 1995. – Vol. 31. – P. 547-554. 62. Xu J., Gao K. Growth, pigments, UV-absorbing compounds and agar yield of the economic red seaweed Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta) grown at different depths in the coastal waters of the South China Sea // J. Appl. Phycol. – 2008. – Vol. 20. – P. 681-686. 63. Ramlov F., Souza J.M.C., Faria A.V.F., Maraschin M., Horta P.A., Yokoya N.S. Growth and accumulation of carotenoids and nitrogen compounds in Gracilaria domingensis (Kütz.) Sonder ex Dickie (Gracilariales, Rhodophyta) cultured under different irradiance and nutrient levels // Braz. J. Pharmacog. – 2011. – Vol. 21, N 2. – P. 255-261. 137 64. Franklin L.A., Levavasseur G., Osmond C.B., Henley W.J., Ramus J. Two components of onset and recovery during photoinhibition of Ulva rotundata // Planta. – 1992. – Vol. 186. – P. 399-408. 65. Pereira D.T., Schmidt É.C., Bouzon Z.L., Ouriques L.C. The effects of ultraviolet radiation-B response on the morphology, ultrastructure, and photosynthetic pigments of Laurencia catarinensis and Palisada flagellifera (Ceramiales, Rhodophyta): a comparative study // J. Appl. Phycol. – 2014. – Vol. 26. – P. 2443–2452. 66. Algarra P., Vina G., Niell J. Effect of light quality and irradians level interactions on short-term pigment response of the red alga Corallina elongata // Mar. Ecol. Prog. Ser. – 1991. – Vol. 74. – P. 27-32. 67. Алехина Н.Д. Физиология растений: учебник для студ. Вузов / Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В. Ф. Гавриленко. – М.: Академия, 2005. – 640 с. 68. Madsen T.V., Brix H. Growth, photosynthesis and accimation by two submedial macrophytes in relation to temperature // Oecologia. – 1997. – Vol. 110. – P. 320-327. 69. Duarte P., Ferreira I.G. Seasonal adaptation and short-term metabolic responses of Gelidium sesguipedule to variation in light and temperature // MEPS. – 1995. – Vol. 342. – P. 289-300. 70. Bulboa C.R., Macchiavello J.E. The effects of light and temperature on different phases of life cycle in the carageenan productivity of alga Chondracanthus chamissoi (Rhodophyta Gigartinales) // Bot. Mar. – 2001. – Vol. 44. – P. 371-374. 71. Gomez F.L., Figueroa I., Sousa-Pinto B., Vinegla E., Perez-Rodriguez C., Maestre S., Coelho A., Pereira R. Effects of UV radiation and temperature on photosynthesis as measured by PAM fluorescence in red alga Gelidium pulchellum (Turner) Kutzing // Bot. Mar. – 2001. – Vol. 44. – P. 9-16. 72. Latham H. Temperature stress-induced bleaching of the coralline alga Corallina officinalis: a role for the enzyme bromoperoxidase // Biosci. Horiz. – 2008. – Vol. 1/2. – P. 104-113. 73. Hanisak M.D. Cultivation of Gracilaria and other macroalgae in Florida for energy production // In: Bird K.T., Benson P. (eds.), Seaweed cultivation for renewable resources, Amsterdam: Elsevier. – 1987. – P. 191–218. 138 74. Dawes C.Y., Koch E.W. Physiological responses of red algae Gracilaria verrucosa and G. tikvahiae before and after nutrient enrichment // Bull. Mar. Sci. – 1990. – Vol. 46. – P. 335-344. 75. Karsten U., Dummermuth A., Hoyer K., Wiencke C. Interactive effects of ultraviolet radiation and salinity on the ecophysiology of two Arctic red algae from shallow waters // Polar Biol. – 2003. – Vol. 26. – P. 249–258. 76. Ding L., Ma Y., Huang B., Chen S. Effects of seawater salinity and temperature on growth and pigment contents in Hypnea cervicornis J. Agardh (Gigartinales, Rhodophyta) // BioMed Res. Int. – 2013. – Vol. 2013. – P. 1-10. 77. Baghel R.S., Kumari P., Reddy C.R.K., Jha B. Growth, pigments, and biochemical composition of marine red alga Gracilaria crassa // J. Appl. Phycol. – 2014. – Vol. 26. – P. 2143–2150. 78. Lahaye M. Developments on gelling algal galactans, their structure and physico-chemistry // J. Appl. Phycol. – 2001. – Vol. 13. – P. 173-184. 79. Chiovitti A., Bacic A., Craik D.J., Munro S.L., Kraft G.T., Liao M.L., Falshaw R., Furneaux R.H. A pyruvated carrageenan from Australian specimens of the red alga Sacronema filiforme // Carbohydr. Res. – 1998. – Vol. 314. – P. 229–243. 80. Falshaw R., Furneaux R.H. Carragenan from the tetrasporic stage of Gigartina clavifera and Gigartina alveata (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. – 1995. – Vol. 276, N 1. – P. 155–165. 81. Lahaye M., Rochas С. Chemical structure and physico-chemical properties of agar // Hydrobiologia. – 1991. – Vol. 221. – P. 137-148. 82. Usov A.I., Bilan M.I., Shashkov A.S. Structure of sulfated xylogalactans from the calcareous red alga Corallina pilulifera P. et R. (Rhodophyta, Corallinaceae) // Carbohydr. Res. – 1997. – Vol. 303. – P. 93-102. 83. Усов А.И., Билан М.И. Полисахариды водорослей. 52. Строение сульфатированного ксилогалактана из известковой красной водоросли Bossiella cretacea (P. et R.) Johansen (Rhodophyta, Corallinaceae) // Биоорг. Химия. – 1998. – Т. 24, № 2. – С. 139-146. 84. Navarro D.A., Stortz C.A. The system of xylogalactans from the red seaweed Jania rubens (Corallinales, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. – 2008. – Vol. 343, N 15. – P. 2613-2622. 139 85. Chiovitti A., Bacic A., Craik D.J., Munro S.L.A., Kraft G.T., Liao M.L. Cell-wall polysaccharides from Australian red algae of the family Solieriaceae (Gigartinales, Rhodophyta) – novel, highly pyruvated carrageenans from genus Callophycus // Carbohydr. Res. – 1997. – Vol. 299. – P. 229-243. 86. Dolan T., Rees D.A. The carrageenans. II. The position of the glycosidic linkages and sulfate esters in λ-carrageenans // J. Chem. Soc. – 1965. – Vol. 1. – P. 35343539. 87. Penman A., Rees D.A. Carrageenans. X. Synthesis of 3,6-di-O-methyl-Dgalactose – a new sugar from the methylation analysis of polysaccharides related to θ-carrageenan // J. Chem. Soc. – 1973. – N 19. – P. 2188-2191. 88. Anderson N.S., Dolan T.C.S., Lawson C.J., Penman A., Rees D.A. Carrageenans. V. The masked repeating structures of λ- and μ-carrageenans // Carbohydr. Res. – 1968. – Vol. 7. – P. 468-473. 89. Усов А.И. Полисахариды морских водорослей: проблемы изучения и использования // Биологически активные вещества морских организмов. М.: ИО АН СССР. – 1990. – С. 97-111. 90. Craigie J.S., Wong K.F. Carrageenan biosynthesis // In: Jensen A. and Stein J.R. (eds.), Proc. Int. Seaweed Symp. – 1979. – Vol. 9. – P. 360-370. 91. Hilliou L., Larotonda F.D.S., Abreu P., Abreu M.H., Sereno A.M., Goncalves M.P. The impact of seaweed life phase and postharvest storage duration on the chemical and reological properties of hybrid carrageenans isolated from Portuguese Mastocarpus stellatus // Carbohydr. Polym. – 2012. – Vol. 87. – P. 2655-2663. 92. Cáceres P.J., Carlucci M.J., Damonte E.B., Matsuhiro B., Zuñiga E.A. Carrageenans from chilean samples of Stenogramme interrupta (Phyllophoraceae): structural analysis and biological activity // Phytochemistry. – 2000. – Vol. 53, N 1. – P. 81-86. 93. Барабанова А.О., Ермак И.М., Глазунов В.П., Исаков В.В., Титлянов Э.А., Соловьева Т.Ф. Сравнительная характеристика каррагинанов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus crinitus (Gmel.) Rupr. (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Биохимия. – 2005. – Т. 70, № 3. – С. 430-437. 140 94. Sen Sr.A.K., Das A.K., Sarkar K.K., Siddhanta A.K., Takano R., Kamei K., Hara S. An agaroid-carrageenan hybrid type backbone structure for the antithrombotic sulfated polysaccharide from Grateloupia indica Boergensen (Halymeniales, Rhodophyta) // Bot. Mar. – 2002. – Vol. 45. – P. 331-338. 95. Takano R., Shiomoto K., Kamei K., Hara S., Hirase S. Occurrence of carrageenan structure in an agar from the red seaweed Digenea simplex (Wulfen) C. Agardh (Rhodomelaceae, Ceramiales) with a short review of carrageenan-agarocolloid hydrid in the Florideophycidae // Bot. Mar. – 2003. – Vol. 46. – P. 142-150. 96. Takano R., Nose Y., Hayashi K., Hara S., Hirase S. Agarose-carrageenan hybrid polysaccharide from Lomentaria catenata // Phytochemistry. – 1994. – Vol. 37. – P. 1615–1619. 97. Rodriguez M.C., Merino E.R., Pujol C.A., Damonte E.B., Cerezo A.S., Matulewicz M.C. Galactans from cystocarpic plants of the red seaweed Callophyllis variegate (Kallymeniaceae, Gigartinales) // Carbohydr. Res. – 2005. – Vol. 340. – P. 2742-2751. 98. Estevez J.M., Ciancia M., Cerezo A.S. The system of sulfated galactans from the red seaweed Gymnogongrus torulosus (Phyllophoraceae, Rhodophyta): location and structural analysis // Carbohydr. Polym. – 2008. – Vol. 73. – P. 594-605. 99. Pujol C.A., Estevez J.M., Carlucci M.J., Ciancia M., Cerezo A.S., Damonte E.B. Novel DL-galactan hydrids from red seaweed Gymnogongrus torulosus are potent inhibitors of herpes simplex virus and dengue virus // Antivir. Chem. Chemother. – 2002. – Vol. 13. – P. 83-89. 100. Meeuse B.J.D., Andries M., Wood J.A. Floriden starch // J. Exp. Bot. – 1960. – Vol. 11. – P. 129–140. 101. Painter T.J. Algal polysaccharides // In: Aspinall G.O. (eds.), The Polysaccharides, New York: Academic Press. – 1983. – P. 195–285. 102. Yu S., Blennow A., Bojko M., Madsen F., Olsen C.E., Engelsen S.B. Physico-chemical characterization of floridean starch of red algae // Starch/Sta¨rke. – 2002. – Vol. 54. – P. 66–74. 103. Viola R., Nivall P., Pedersen M. The unique features of starch metabolism in red algae // Proc. R. Soc. Lond. B. – 2001. – Vol. 268. – P. 1417–1422. 141 104. Turvey J.R., Williams E.L. The structures of some xylans from red algae // Phytochemistry. – 1970. – Vol. 9. – P. 2383–2388. 105. Stevenson T.T., Furneaux R. Chemical methods for analysis of sulphated galactans from red algae // Carbohydr. Res. – 1991. – Vol. 210, N 8. – P. 277-298. 106. 13 Velde F.V., Knutsen S.H., Usov A.I., Rollema H.S., Cerezo A.S. 1H and C high resolution NMR spectroscopy of carrageenans: application in research and industry // Food Sci. Technol. – 2002. – Vol. 13. – P. 73-92. 107. Matsuhiro B. Vibrational spectroscopy of seaweed galactans // Hydrobiologia. – 1996. – Vol. 326/327. – P. 481-489. 108. Mangin C.M., Goodall D.M., Roberts M.A. Separation of ι-, æ- and λcarrageenans by capillary electrophoresis // Electrophoresis. – 2001. – Vol. 22, N 8. – P. 1460-1467. 109. Bongaerts K., Paoletti S., Denef B., Vanneste K., Cuppo F., Reynaers H. Light scattering investigation of iota-carrageenan aqueous solutions. Concentration dependence of association // Macromol. – 2000. – Vol. 33, N 23. – P. 8709-8719. 110. Goncalves A.G., Ducatti D.R.B., Grindley T.B., Duarte M.E.R., Noseda M.D. ESI-MS differential fragmentation of positional isomers of sulfated oligosaccharides derived from carrageenans and agarans // J. Am. Soc. Mass Spectrom. – 2010. – Vol. 20. – P. 1-13. 111. Fatema M.K., Nonami H., Ducatti D.R.B., Goncalves A.G., Duarte M.E.R., Noseda M.D., Cerezo A.S., Erra-Balsells R., Matulewicz M.C. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry analysis of oligosaccharides and oligosaccharide alditols obtained by hydrolysis of agaroses and carrageenans, two important types of red seaweed polysaccharides // Carbohydr. Res. – 2010. – Vol. 345. – P. 275-283. 112. Anastyuk S.D., Barabanova A.O., Correc G., Nazarenko E.L., Davydova V.N., Helbert W., Dmitrenoc P.S., Yermak I.M. Analysis of structural heterogeneity of kappa/beta-carrageenan oligosaccharides from Tichocarpus crinitus by negativeion ESI and tandem MALDI mass spectrometry // Carbohydr. Polym. – 2011. – Vol. 86, N 2. – P. 546–554. 142 113. Brummer Y., Cui S.W. Understanding carbohydrate analysis // In: Brummer Y. and Cui S.W. (eds.), Food carbohydrates: chemistry, physical properties and application, Taylor and Francis group. – 2005. – P. 67-104. 114. Hama Y., Tsuneoka A., Morita R., Nomoto O., Yoshinaga K., Hatate H., Sumi T., Nakagawa H. Selective hydrolysis of the 3,6-anhydrogalacotosidic linkage in red algal galactans: a combination of reductive acid hydrolysis and anhydrous mercaptolysis // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 2010. – Vol. 74, N 9. – P. 18951900. 115. Hama Y., Nakagawa H., Kurosawa M., Sumi T., Xia X., Yamaguchi K. A gas chromatographic method for the sugar analysis of 3,6-anhydrogalacose-contaning algal galactans // Anal. Biochem. – 1998. – Vol. 265. – P. 42-48. 116. Errea M., Ciancia M., Matulewicz M., Cerezo A. Separation and quantitation of enantiomeric 3,6-anhydrogalactoses by conversion to the corresponding diastereomeric acetylated sec-butyl 3,6-anhydrogalactonates // Carbohydr. Res. – 1998. – Vol. 311. – P. 235-238. 117. Navarro D.A., Stortz C.A. Determination of the configuration of 3,6anhydrogalactose and cyclizable α-galactose 6-sulfate units in the red seaweed galactans // Carbohydr. Res. – 2003. – Vol. 338. – P. 2111-2118. 118. Falshaw R., Furneaux R.H. The structural analysis of disaccharides from red algal galactans by methylation and reductive partial-hydrolysis // Carbohydr. Res. – 1995. – Vol. 269. – P. 183-189. 119. Stortz C.A., Cerezo A.S. Specific fragmentation of carrageenans // Carbohydr. Res. – 1987. – Vol. 166. – P. 317–323. 120. Ciancia M., Matulewicz M.C., Stortz C.A., Cerezo A.S. Room temperature, low-field 13C-n.m.r. spectra of degraded carrageenans. Part II. On the specificity of the autohydrolysis reaction in kappa/iota and mu/nu structures // Int. J. Biol. Macromol. – 1991. – Vol. 13. – P. 337–340. 121. Noseda M.D., Cerezo A.S. Room temperature, low-field 13 C-n.m.r. spectra of degraded carrageenans: Part III. Autohydrolysis of a lambda carrageenan and of its alkali-treated derivative // Int. J. Biol. Macromol. – 1993. – Vol. 15. – P. 177–181. 143 122. Chen H., Yan X., Zhu P., Lin J. Antioxidant activity and hepatoprotective potential of agarooligosaccharides in vitro and in vivo // Nutri. J. – 2006. – Vol. 5. – P. 31-42. 123. Pereira L., Amado A.M., Critchley A.T., Velde F.V., Ribeiro-Claro P.J.A. Identification of selected seaweed polysaccharides (phycocolloids) by vibrational spectroscopy (FTIR-ATR and RT-Raman) // Food Hydrocoll. – 2009. – Vol. 30. – P. 1-7. 124. Andriamanantoanina H., Chambat G., Rinaudo M. Fractionation of extracted Madagascan Gracilaria corticata polysaccharides: structure and properties // Carbohydr. Polym. – 2007. – Vol. 68. – P. 77-88. 125. Lloyd A.G., Dodgson K.S., Price R.G., Rose F.A. Infrared spectra of sulphate esters. I. Polysaccharide sulphates // Biochim. Biophys. Acta. – 1961. – Vol. 46. – P. 108–115. 126. Prado-Fernandez J., Rodriguez-Vazquez J.A., Tojo E., Andrade J.M. Quantitation of κ-, ι- and λ-carrageenans by mid-infrared spectroscopy and PLS regression // Anal. Chim. Acta. – 2003. – Vol. 480. – P. 23-37. 127. Rochas C., Lahaye M., Yaphe W. Sulfate content of carrageenan and agar determined by infrared spectroscopy // Bot. Mar. – 1986. – Vol. 29. – P. 335-340. 128. Caceres P.J., Faundez C.A., Matsuhiro B., Vasquez J.A. Carrageenophyte identification by second-derivative Fourier transform infrared spectroscopy // J. Appl. Phycol. – 1997. – Vol. 8. – P. 523-527. 129. Bhattacharjec S.S., Yaphe W., Hamer G.K. 13 C-NMR spectroscopic analysis of agar, kappa-carrageenan and iota-carrageenan // Carbohydr. Res. – 1978. – Vol. 60. – P. 977-990. 130. Miller I.J., Blunt J.W. Evaluation of the structure of the polysaccharides from Chondria macrocarpa and Ceramium rubrum as determined by 13 C NMR spectroscopy // Bot. Mar. – 2002. – Vol. 45. – P. 1-8. 131. Miller I.J., Blunt J.W. New 13 C NMR methods for determining the structure of algal polysaccharides, Part 1. The effect of substitution on the chemical shifts of simple diad galactans // Bot. Mar. – 2000. – Vol. 43. – P. 239–250. 132. Velde F.V., Pereira L., Rollema H.S. The revised NMR chemical shift data of carrageenans // Carbohydr. Res. – 2004. – Vol. 339. – 2309-2313. 144 133. Gordon-Mills E., Tate M., Hounslow A. Use of solid and gel state 13 C NMR spectroscopy for differentiation between agarophytes and carrageenophytes // Hydrobiologia. – 1990. – Vol. 204/205. – P. 629-636. 134. Miller I.J., Blunt J.W. Desulfation of algal galactans // Carbohydr. Res. – 1998. – Vol. 309. – P. 39-43. 135. Araki T., Higashimoto Y., Morshita T. Purification and characterization of kappa-carrageenase from marine bacterium Vibrio sp. CA-1004 // Fisheries Sci. – 1999. – Vol. 65, N 6. – P. 937-942. 136. Fu X.T., Kim S.M. Agarase: Review of major sources, categories, purification method, enzyme characteristics and applications // Mar. Drugs. – 2010. – Vol. 8. – P. 200-218. 137. Michel G., Nyval-Collen P., Barbeyron T., Czjzek M., Helbert W. Bioconversion of red seaweed galactans: a focus on bacterial agarases and carrageenases // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – Vol. 71. – P. 23-33. 138. Ekborg N.A., Taylor L.E., Longmire A.G., Henrissat B., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Genomic and proteomic analyses of the agarolytic system expressed by Saccharophagus degradans 2-40 // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – Vol. 72. – P. 3396-3405. 139. McLean M.W., Williamson F.B. Kappa-carrageenase from Pseudomonas carrageenovora // Eur. J. Biochem. – 1979b. – Vol. 93. – P. 553-558. 140. Potin P., Richard. C., Barbeyron T., Henrissat B., Gey C., Petillot Y., Forest E., Dideberg O., Rochas C., Kloareg, B. Processing and hydrolytic mechanism of the cgkA-encoded kappa-carrageenase of Alteromonas carrageenovora // Eur. J. Biochem. – 1995. – Vol. 228, N 3. – P. 971-975. 141. McLean M.W., Williamson F.B. Neocarratetraose 4-O-monosulphate betahydrolase from Pseudomonas carrageenovora // Eur. J. Biochem. – 1981. – Vol. 113. – P. 447-456. 142. Guibet M., Colin S., Barbeyron T., Genicot S., Kloareg B., Michel G., Helbert W. Degradation of λ-carrageenan by Pseudoalteromonas carrageenovora λ-carrageenase: a new family of glycoside hydrolases unrelated to κ- and ι-carrageenases // Biochem. J. – 2007. – Vol. 404. – P. 105-114. 145 143. Denis C., Le Jeune H., Gaudin P., Fleurence J. An evalution of method for quantifying the enzymatic degradation of the red seaweed Grateloupia turuturu // J. Appl. Phycol. – 2009. – Vol. 21. – P. 153-159. 144. Sugano Y., Terada I., Arita M., Noma M. Purification and characterization of a new agarose from a marine bacterium Vibrio sp. strain JT0107 // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – Vol. 59. – P. 1549-1554. 145. Leon O., Quintana L., Peruzzo G., Slebe J.C. Purification and properties of an extracellular agarose from Alteromonas sp. strain C-1 // Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – Vol. 58. – P. 4060-4063. 146. Guibet M., Boulenguer P., Mazoyer J., Kervarec N., Antonopoulos A., Lafosse M., Helbert W. Composition and distribution of carrabiose moieties in hybrid κ/ιcarrageenans using carrageenases // Biomacromolecules. – 2008. – Vol. 9, N 1. – P. 408-415. 147. Jouanneau D., Boulenguer P., Mazoyer J., Helbert W. Enzymatic degradation of hybrid ι/ν-carrageenan by Alteromonas fortis ι-carrageenase // Carbohydr. Res. – 2010. – Vol. 345. – P. 934-940. 148. Piculell L. Gelling carrageenans // In: Stephen A.M. (eds.), Food Polysaccharides and their Applications; New York: Marcel Dekker Inc. – 1995. – P. 205–244. 149. Brunt D., Buliga G. Chemical structure and macromolecular conformation of polysaccharides in the aqueous environment // In: Brunt D. and Buliga G. (eds.), Biotechnology of Marine Polesaccharides, W.: Colwell eds. – 1985. – P. 29-73. 150. Janaswamy S., Chandrasekaran R. Effect of calcium ions on the organization of iota-carrageenan helices: An X-ray investigation // Carbohydr. Res. – 2002. – Vol. 337. – P. 523-535. 151. Stanley N.F. Carrageenan // In: Harris P. (eds.), Food Gels; Liverpool: Elsever Appl. Science. – 1990. – P. 79-119. 152. Hung L.D., Nang H.Q., Buu N.Q. Chemical composition of sulphated galactans in agar from some Gracilaria species growing along the coast of Southern Vietnam // J. Chem. – 2000. – Vol. 38, N 4. – P. 80-83. 153. Lahaye M. Chemistry and physico-chemistry of phycocolloids // Cah. Biol. Mar. – 2001. – Vol. 42. – P. 137-157. 146 154. Mohamed Z.H., Hember M.W.N., Richardson R.K., Morris E.R. Kinetic and equilibrium process in the formation and melting of agarose gels // Carbohydr. Polym. – 1998. – Vol. 36. – P. 15-26. 155. McCandless E.L., West J.A., Guiry M.D. Carrageenan patterns in the Phyllophoraceae // Biochem. System. Ecol. – 1982. – Vol. 10. – P. 275-284. 156. Pereira L., Velde F., Mesquita J.F. Cytochemical studies on underutilized carrageenophytes (Gigartinales, Rhodophyta) // J. Biol. Biomed. Eng. – 2007. – Vol. 1. – P. 1-5. 157. Pereira L., Mesquita J.F. Carrageenophytes of occidental Portuguese coast: 1spectroscopic analysis in eight carrageenophytes from Buarcos bay // Biomol. Eng. – 2003. – Vol. 20. – P. 217-222. 158. Amimi A., Mouradi A., Givernaud T., Chiadmi N., Lahaye M. Structural analysis of Gigartina pistillata carrageenans (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. – 2001. – Vol. 333, N 4. – P. 271-279. 159. Piriz M.L., Cerezo A.S. Seasonal variations of carrageenans in tetrasporic, cystocarpic and ‘sterile’ stages of Gigartina skottsbergii S. et G. (Rhodophyta, Gigartinales) // Hydrobiologia. – 1991. – Vol. 226. – P. 65-69. 160. Byankina (Barabanova) A.O., Sokolova E.V., Anastyuk S.D., Isakov V.V., Glazunov V.P., Volod′ko A.V., Yakovleva I.M., Solov′eva T.F., Yermak I.M. Polysaccharide structure of tetrasporic red seaweed Tichocarpus crinitus // Carhydr. Polym. – 2013. – Vol. 98. – P. 26-35. 161. Yermak I.M., Barabanova A.O., Glazunov V.P., Isacov V.V., Solov’eva T.F., Kim Y.H., Kwang S.S., Titlyanova T.V. Carrageenans from cystocarpic and sterile plants of Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae, Rhodophyta) collected from the Russian Pacific coast // J. Appl. Phycol. – 2006. – Vol. 18. – P. 361-368. 162. Roleda M.Y., Ganzon-Fortes E.T., Montano N.E. Agar from vegetative and tetrasporic Gelidiella acerosa (Gelidiales, Rhodophyta) // Bot. Mar. – 1997. – Vol. 40. – P. 501-506. 163. Givernaud T., Gourji A.E., Mouradi-Givernaud A., Lemoine Y., Chiadmi N. Seasonal variations of growth and agar composition of Gracilaria multipartita harvested along the Atlantic coast of Morocco // Hydrobiologia. – 1999. – Vol. 398/399. – P. 167-172. 147 164. Yakovleva I.M., Yermak I.M., Titlynov E.A., Barabanova A.O., Glazunov V.P., Skriptsova A.V. Changes in growth rates, anatomy and polysaccharide content of a sterile form of Tichocarpus crtinitus (Gmel.) Rupr. (Rhodophyta, Tichocarpaceae) under differing photon irradiances in the Sea of Japan (Russia) // Bot. Mar. – 2001. – Vol. 44. – P. 493-500. 165. Buriyo A.S., Kivaisi A.K. Standing stock, agar yield and properties of Gracilaria salicornia harvested along the Tanzanian coast // West Indian Ocean J. Mar. Sci. – 2003. – Vol. 2. – P. 171-178. 166. Torres M., Niell F.X., Algara P. Photosynthesis of Gelidium sesquipedale: effect of temperature and light on pigment concentration, C/N ratio and cell wall polysaccharides // Hydrobiologia. – 1991. – Vol. 221. – P. 77-82. 167. Torres M., Niell F.X., Figueroa F.L. Photosynthetic metabolism and cell-wall polysaccharide accumulation in Gelidium sesquipedale (Clem.) Born. Et Thur. under different light qualities // J. Appl. Phycol. – 1995. – Vol. 7. – P. 167-174. 168. Reani А., Cosson J., Parker A., Zaoui D. Influence of culture conditions on growth and rheological properties of carrageenans in Cystoclonium purpureum // Bot. Mar. – 1998. – Vol. 41. – P. 299-304. 169. Neish A.C., Shacklock P.F. Greenhouse experiments on the propagation of strain T4 of Irish Moss // Natn. Res. Coun. Can., Atl. Reg. Lab. Tech. Rep. – 1971. – N 14. – 25 p. 170. Hurtado M.A., Manzano-Sarabia M., Hernandez-Garibay E., Pacheco-Ruiz I., Zertuche-Gonzalez J.A. Latitudinal variations of the yield and quality of agar from Gelidium robustum (Gelidiales, Rhodophyta) from the main commercial harvest beds along thee western coast of the Baja California Peninsula, Mexico // J. Appl. Phycol. – 2011. – Vol. 23. – P. 727-734. 171. Fogg G.E. Environmental conditions and the pattern of metabolism in algae // In: Jackson D. (eds.), Algae and Man; New York: Plenum Press. – 1964. – P. 77-85. 172. Dawes C.J., Lawrence J.M., Cheney D.P., Mathiesow A.C. Ecological studies of Floridian Eucheuma (Rhodophyta, Gigartinales). III. Seasonal variations of carrageenan, total carbohydrate, protein, and lipid // Bull. Mar. Sci. – 1974. – Vol. 24, N 2. – P. 286-299. 148 173. Thomas P.C., Subbaramaiah K. Seasonal variations in growth and phycocolloid content in Hypnea pannosa J. Agardh (Gigartinales, Rhodophyta) from Mandapam region // Proc. Indian Natn. Acad. – 1994. – Vol. B60, N 1. – P. 93-98. 174. Goes H.G., Reis R.P. Temporal variation of the growth, carrageenan yield and quality of Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Gigartinales) cultivated at Sepetiba bay, southeastern Brazilian coast // J. Appl. Phycol. – 2012. – Vol. 24. – P. 173-180. 175. Tasende M.G., Cid M., Fraga M.I. Qualitative and quantitative analysis of carrageenan content in gametophytes of Mastocarpus stellatus (Stackhouse) Guiry along Galician coast (NW Spain) // J. Appl. Phycol. – 2013. – Vol. 25. – P. 587596. 176. Breden P.C., Bird K.T. Effects of environmental factors on carrageenan from Gymnogongrus griffithsiae (Gigartinales, Rhodophyta) // J. Appl. Phycol. – 1994. – Vol. 6. – P. 371-380. 177. Tasende M.G., Cid M., Fraga M.I. Spatial and temporal variations of Chondrus crispus (Gigartinaceae, Rhodophyta) carrageenan content in natural populations from Galicia (NW Spain) // J. Appl. Phycol. – 2012. – Vol. 24, N 4. – P. 941–951. 178. Boulus A., Spaneir E., Friedlander M. Effect of outdoor conditions on growth rate and chemical composition of Gelidium crinale in culture // J. Appl. Phycol. – 2007. – Vol. 19. – P. 471-478. 179. Zinoun M., Cosson J. Seasonal variation in growth and carrageenan content of Calliblepharis jubata (Rhodophyceae, Gigartinales) from the Normandy coast, France // J. Appl. Phycol. – 1996. – Vol. 8. – P. 29-34. 180. Barabanova A.O., Yermak I.M., Glazunov V.P., Yakovleva I.M., Kim Y.H., Solov’eva T.F. Influence of life-history stage and photon irradiance on yield and quality of carrageenan in Tichocarpus crinitus (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Jpn. J. Phycol. – 2004. – Vol. 52. – P. 61-65. 181. Rivero-Carro H., Craigie J.S., Shacklock P.F. Influence of tissue sourse and growth rates on dry weight and carrageenan composition of Chondrus crispus (Gigartinales, Rhodophyta) // Hydrobiologia. – 1990. – Vol. 204/205. – P. 533538. 149 182. Patil R.T., Speaker T.J. Water-based microsphere delivery system for proteins // J. Pharm. Sci. – 2000. – Vol. 89. – P. 9–15. 183. Garcia A.M., Chaly E.S. Preliminary spherical agglomerates of water-soluble drug using natural polymer and cross–linking technique // J. Control. Release. – 1996. – Vol. 40. – P. 179–186. 184. Винникова Л.Г. Физико-химические аспекты взаимодействия белков с нерастворимыми полисахаридами // Хранение и переработка сельхозсырья. – 1997. – С. 13 185. Lahaye M., Kaeffer B. Seaweed dietary fibres: structure, physico–chemical and biological properties relevent to intestinal physiology // Sci. Aliment. – 1997. – Vol. 17. – P. 563–584. 186. Costa L.S., Fidelis G.P., Cordeiro S.L., Oliveira R.M., Sabry D.A., Ciara R.B.G., Nobre L.T.D.B., Costa M.S.S.P., Almeida-Lima J., Farias E.H.C., Leite E.L., Rocha H.A.O. Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds // Biomed. Pharmacother. – 2010. – Vol. 64. – P. 21–28. 187. Carlucci M.J., Pujol C.A., Ciancia M., Noseda M.D., Matulewicz M.C., Damonte E.B., Cerezo A.S. Antiherpetic and anticoagulant properties of carrageenans from the red seaweed Gigartina skottsbergii and their cyclized derivatives: Correlation between structure and biological activity // Int. J. Biol. Macromol. – 1997. – Vol. 20. – P. 97–105. 188. Wijesekara I., Pangestuti R., Kim S.-K. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae // Carbohydr. Polym. – 2011. – Vol. 84. – P. 14-21. 189. Franz G., Alban S. Structure-activity relationship of antithrombotic polysaccharide derivatives International // Int. J. Biol. Macromol. – 1995. – Vol. 17. – P. 311–314. 190. Suwan J., Zhang Z., Li B., Vongchan P., Meepowpan P., Zhang F., Mousa S.A., Mousa S., Premanode B., Kongtawelert P., Linhardt R.J. Sulfonation of papaintreated chitosan and its mechanism for anticoagulant activity // Carbohydr. Res. – 2009. – Vol. 344. – P. 1190-1196. 191. Sebaaly C., Kassem S., Grishina E., Kanaan H., Sweidan A., Chmit M.S., Kanaan H.M. Anticoagulant and antibacterial activities of polysaccharides of red 150 algae Corallina collected from Lebanese coast // J. Appl. Pharm. Sci. – 2014. – Vol. 4, N 4. – P. 30-37. 192. Silva F.R.F., Dore C.M.P.G., Marques C.T., Nascimento M.S., Benevides N.M.B., Rocha H.A.O., Chavante S.F., Leite E.L. Anticoagulant activity, paw edema and pleurisy induced carrageenan: Action of major types of commercial carrageenans // Carbohydr. Polym. – 2010. – Vol. 79. – P. 26-33. 193. Farias W.R.L., Valente A.-P., Pereira M.S., Mourao P.A.S. Structure and anticoagulant activity of sulfated galactans // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, N 38. – P. 29299-29307. 194. Pereira M.G., Benevides N.M.B., Melo M.R.S., Valente A.-P., Melo F.R., Mourao P.A.S. Structure and anticoagulant activity of a sulfated galactan from the red alga, Gelidium crinale. Is there a specific structural requirement for the anticoagulant action? // Carbohydr. Res. – 2005. – Vol. 340. – P. 20145-2023. 195. Rocha de Souza M.C., Marques C.T., Dore C.M.G., Ferreira da Silva F.R., Rocha H.A.O., Leite E.L. Antioxidant activities of sulphated polysaccharides from brown and red seaweeds // J. Appl. Phycol. – 2007. – Vol. 19. – P. 153–160. 196. Wang J., Zhang Q., Zhang Z., Li Z. Antioxidant activity of sulphated polysaccharide fractions extracted from Laminaria japonica // Int. J. Biol. Macromol. – 2008. – Vol. 42. – P. 127–132. 197. Zhang Q., Li N., Zhou G., Lu X., Xu Z., Li Z. In vivo antioxidant activity of polysaccharide fraction from Porphyra haitanensis (Rhodophyta) in aging mice // Pharmacol. Res. – 2003. – Vol. 48. – P. 151–155. 198. Sokolova E.V., Barabanova A.O., Homenko V.A., Solov’eva T.F., Bogdanovich R.N., Yermak I.M. In vitro and ex vivo studies of antioxidant activity of carrageenans, sulfated polysaccharides from red algae // Bull. Exp. Biol. Med. – 2011. – Vol. 150, N 4. – P. 426-428. 199. Sun L., Wang C., Shi Q., Ma C. Preparation of different molecular weight polysaccharides from Porphyridium cruentum and their antioxidant activities // Int. J. Biol. Macromol. – 2009. – Vol. 45. – P. 42–47. 200. Yuan H., Zhang W., Li X., Lü X., Li N., Gao X., Song J. Preparation and in vitro antioxidant activity of κ-carrageenan oligosaccharides and their oversulfated, 151 acetylated, and phosphorylated derivatives // Carbohydr. Res. – 2005. – Vol. 340. – P. 685–692. 201. Haijin M., Xiadu J., Huashi G. A κ-carrageenan derived oligosaccharide prepared by enzymatic degradation containing anti-tumor activity // J. Appl. Phycol. – 2003. – Vol. 124. – P. 297–303. 202. Yuan H., Song J., Li X., Li N., Liu S. Enhanced immunostimulatory and antitumor activity of different derivatives of κ-carrageenan oligosaccharides from Kappaphycus striatum // J. Appl. Phycol. – 2011. – Vol. 23. – P. 59–65. 203. Zhou G., Xin H., Sheng W., Sun Y., Li Z., Xu Z. In vivo growth-inhibition of S180 tumor by mixture of 5-Fu and low molecular lambda-carrageenan from Chondrus ocellatus // Pharmacol. – 2005. – Vol. 462. – P. 145–168. 204. Wang W., Wang S.-X., Guan H.-S. The antiviral activities and mechanism of marine polysaccharides: an overview // Mar. Drugs. – 2012. – Vol. 10, N 12. – P. 2795-2816. 205. Carlucci M.J., Ciancia M., Matulewicz M.C., Cerezo A.S., Damonte E.B. Antiherpetic activity and mode of action of natural carrageenans of diverse structural types // Antiviral Res. – 1999. – Vol. 43. – P. 93–102. 206. Chattopadhyay K., Mateu C.G., Mandal P., Pujol C.A., Damonte E.B., Ray B. Galactan sulfate of Grateloupia indica: Isolation, structural features and antiviral activity // Phytochem. – 2007. – Vol. 68. – P. 1428–1435. 207. Chattopadhyay K., Ghosh T., Pujol C.A., Carlucii M.J., Damonte E.B., Ray B. Polysaccharides from Gracilaria corticata: sulfation, chemical characterization and anti-HSV activities // Int. J. Biol. Macromol. – 2008. – Vol. 43. – P. 346-351. 208. Talarico L.B., Zibetti R.G.M., Faria P.C.S., Scolaro L.A., Duarte M.E.R., Noseda M.D., Pujol C.A., Damonte E.B. Anti-herpes simplex virus activity of sulfated galactans from thered seaweeds Gymnogongrus griffithsiae and Cryptonemia crenulata // Int. J. Biol. Macromol. – 2004. – Vol. 34. – P. 63–71. 209. Haslin C., Lahaye M., Pellegrini M., Chermann J.-C. In vitro Anti-HIV activity of sulfated cell-wall polysaccharides from gametic, carposporic and tetrasporic stages of the Mediterranean red alga Asparagopsis armata // Planta Med. – 2001. – Vol. 67. – P. 301–305. 152 210. Witvrouw M., De Clercq E. Sulfated polysaccharides extracted from sea algae as potential antiviral drugs // Gen. Pharmacol. – 1997. – Vol. 4. – P. 497–511. 211. Buck C.B., Thompson C.D., Roberts J.N., Müller M., Lowy D.R., Schiller J.T. Carrageenan is a potent inhibitor of papilloma virus infection // Plos Pathog. – 2006. – Vol. 2. – P. 0671–0680. 212. Ji J., Wang L.C., Wu H., Luan H.M. Bio-function summary of marine oligosaccharides // Int. J. Biol. Sci. – 2011. – Vol. 3. – P. 74-86. 213. Ли Б.Д., Титлянов Э.А. Адаптация бентических растений к свету. III. Содержание фотосинтетических пигментов в морских макрофитах из различных по освещенности мест обитания // Биология моря. – 1978. – №2. – С. 47-55. 214. Муравьева И.П. Сравнение химического состава красных водорослей Callithamnion corymbosum (J.E. Smith) Lyngb. и Ceramium rubrum (Huds.) Ag. из севастопольских бухт (Черное море) // Экология моря. – 2006. – T. 71. – С. 93-99. 215. Цымбал И.М., Заиченко Н.Ю. Изменение содержания фотосинтетических пигментов у церамиума как ответная реакция на загрязнение среды // Екологiчна безпека. – 2010. – Т. 1. – С. 111-117. 216. Титлянов Э.А. Адаптация водорослей и кораллов к свету : автореф. дис… д-ра биол. наук. – Владивосток, 1983. – 54 с. 217. Collen J., Davison I.R. Seasonality and thermal acclimation of reactive oxygen metabolism in Fucus vesiculosus (Phaeophyceae) // J. Phycol. – 2001. – Vol. 37. – P. 474-481. 218. Logan B.A., Grace S.C., Adams III W.W., Demmig-Adams B. Seasonal differences in xanthophylls cycle characteristics and antioxidants in Mahonia repens growing in different light environments // Oecologia. – 1998. – Vol. 116. – P. 9-17. 219. Ли Б.Д. Сезонная динамика пигментов фотосинтеза у морских зеленых водорослей // Ред. Титлянов Э.А., Звалинский В.И., Экологические аспекты фотосинтеза морских макроводорослей, Владивосток: ДВНЦ АН СССР. – 1978. – С. 158-166. 153 220. Bischof K.D., Peralta G., Krabs G., Poll W.H., Perez-Llorens J.L., Breeman A.M. Effect of solar UV-B radiation on canopy structure of Ulva communities from southern Spain // J. Exp. Bot. – 2002. – Vol. 53. – P. 2411-2421. 221. Talarico L., Kosovel V. Phycobilisomes and phycobiliproteins variations during the annual cycle of in Halopithys incurvus (Huds.) Batt. (Rhodornelaceae, Rhodophyta) // Boll. Soc. Adr. Sci. – 1983. – Vol. 67. – P. 69-79. 222. Sampath-Wiley P., Neefus C.D., Jahnke L.S. Seasjnal effect of sun exposure and emersion on intertidal seaweed physiology: fluctuations in antioxidant contents, photosynthetic pigments and photosynthetic efficiency in the red alga Porphyra umbilicalis Kutzing (Rhodophyta, Bangiales) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. – 2008. – Vol. 361. – P. 83-91. 223. Falkowski P.G. Aquatic photosynthesis / P.G. Falkowski, J.A. Raven. – Oxford: Black-well Science, 1997. – 375 p. 224. Яковлева И.М. Устойчивость и адаптация морских красных макроводорослей к высоким интенсивностям видимой и ультрафиолетовой радиации : автореф. дис… канд. биол. наук. – Владивосток, 1999. – 23 с. 225. Hednry G.A.F., Price A.H. Stress indicators: Chlorophylls and carotenoids // In: Hednry G.A.F., Price A.H. (eds.), Methods in comparative plant ecology; L.: Chapman and Hall. – 1993. – P. 148-152. 226. Talarico L. Phycobiliproteins and phycobilisomes in red algae: adaptive responses to light // Sci. Mar. – 1996. – Vol. 60. – P. 205-222. 227. Luder U.H., Wiencke C., Knoetzel J. Acclimation of photosynthesis and pigments during and after six months of darkness in Palmaria decipiens (Rhodophyta): a study to simulate Antarctic winter sea ice cover // J. Phycol. – 2002. Vol. 38. – P. 904-913. 228. Wyman M., Gregory R.P.F., Carr N.G. Novel role for phycoerythrin in a marine cyanobacterium Synechoccus DC2 // Science. – 1985. – Vol. 230. – P. 818-820. 229. Gomez I., Wiencke C., Thomas D.N. Variations in photosynthetic characteristics of the Antarctic marine brown alga Ascoseira mirabilis in relation to thallus age and size // Eur. J. Phycol. – 1996. Vol. 31. – P. 167-172. 154 230. Евстигнеева И.К., Нехорошев М.В. Морфо-функциональные особенности видов рода Phyllophora Grev. В условиях поля Зернова (Черное море) // Тр. ЮгНИРО. – 2008. – Т. 46. – С. 55-63. 231. Bird K.T. Agar production and quality from Gracilaria sp. Strain G-16: effects of environmental factors // Bot. Mar. – 1988. – Vol. 31. – P. 33-39. 232. Mtolera M.S.P., Buriyo A.S. Studies on Tanzanian Hypneaceae: Seasonal variation in content and quality of kappa-carrageenan from Hypnea musciformis (Gigartinales, Rhodophyta) // West Indian Ocean J. Mar. Sci. – 2004. – Vol. 3, N 1. – P. 43-49. 233. Durako M.J., Dawes C.J. A comparative seasonal study of two populations of Hypnea musciformis from the East and West Coasts of Florida, USA I. Growth and chemistry // Mar. Biol. – 1980. – Vol. 59, N 3. – P. 151-156. 234. Кравченко А.О., Белоциценко Е.С., Яковлева И.М., Барабанова А.О., Ермак И.М. Сезонные изменения содержания фотосинтетических пигментов у красной водороли Ahnfeltiopsis flabelliformis Японского моря // Изв. ТИНРО. – 2011. – Т. 166. – С. 123-133. 235. Aziza M., Givernaud T., Chikhaouikhay M., Bennasser L. Seasonal variation of the growth, chemical composition and carrageenan extracted from Hypnea musciformis (Wulfen) Lamouroux harvested along the Atlantic coast of Morocco // Sci. Res. Essay. – 2008. – Vol. 2, N 10. – P. 509-514. 236. Fournet I., Zinoun M., Deslandes E., Diouris M., Floc’k J.Y. Floridean starch and carrageenan contents as responses of the red alga Solieria chordalis to culture conditions // Eur. J. Phycol. – 1999. – Vol. 34. – P. 125-130. 237. Xue C.H., Hang Y., Lin H., Chen L., Li Z.J., Deng D., Lu C.X. Chemical characters and antioxidant properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica // J. Appl. Phycol. – 2000. – Vol. 13. – P. 1–5. 238. Tannin-Spitz T., Bergman M., van-Moppes D., Grossman S. Antioxidant activity of the polysaccharide of the red microalga Porphyridium sp. // J. Appl. Phycol. – 2005. – Vol. 17. – P. 215–222. 239. Mohamed Z.A. Polysaccharides as a protective response against microcystininduced oxidative stress in Chlorella vulgaris and Scenedesmus 155 quadricauda and their possible significance in the aquatic ecosystem // Ecotoxicology. – 2008. – Vol. 17. – P. 504-516. 240. Pomin V.H. Structural and functional insights into sulfated galactans: A systematic review // Glycoconjug. J. – 2010. – Vol. 27, N 1. – P. 1–12. 241. Rosenberg G. Ecological growth strategies in the seaweeds Gracilaria foliifera (Rhodopyceae) and Ulva sp. (Chlorophyceae) : PHd Thesis. – New Haven, Connectieut, 1981. – 151 pp. 242. McCandless E.L., Craigie J.S., Walter J.A. Carrageenans in the gametophytic and sporophytiuc stages of Chondrus crispus // Planta. – 1973. – Vol. 112. – P. 201-212. 243. Rees D.W., Santos G.A., Dumont L.E., Parent C.A., Stanley N.F., Stancioff D.J., Guiseley K.B. β-Carrageenan: Isolation and characterization // Carbohydr. Polym. – 1993. – Vol. 22. – P. 247-252/ 244. Stancioff D.J., Stanley N.F. Infrared and chemical studies on algal polysaccharides // Proc. Int. Seaweed Symposium. – 1969. – Vol. 6. – P. 595-609. 245. Liao M.L., Kraft G.T., Munro S.L., Craik D.J., Bacic A. Beta/kappacarrageenans as evidence for continued separation of the families Dicranemataceae and Sarcodiaceae (Gigartinales, Rhodophyta) // J. Phycol. – 1993. – Vol. 29. – P. 833–844. 246. Kolender A.A., Matulewicz M.C. Desulfation of sulfated galactans with chlorotrimethylsilane. Characterization of β-carrageenan by 1 H NMR spectroscopy // Carbohydr. Res. – 2004. – Vol. 339. – P. 1619–1629. 247. Yu G., Zhao X., Yang B., Ren S., Guan H., Zhang Y., Lawson A.M., Chai W. Sequence determination of sulfated carrageenan-derived oligosaccharides by highsensitivity negative-ion electrospray tandem mass spectrometry // Anal. Chem. – 2006. – Vol. 78, N 24. – P. 8499-8505. 248. Keler T., Novonty A. Metachromatic assay for the quantitative determination of bacterial endotoxins // Anal. Biochem. – 1986. – Vol. 156. – P. 189-193. 249. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugar and related substances // Anal. Chem. – 1956. – Vol. 28, N 3. – P. 350-356. 156 250. Heaney-Kieras J., Roden L., Chapman D.J. The covalent linkage of protein to carbohydrate in the extra-cellular protein-polysaccharide from the red alga Porphyridium cruentum // Biochem. J. – 1977. – Vol.165. – P. 1-9. 251. Красильникова С.В., Медведева Е.И. О некоторых особенностях щелочерастворимого белка красной водоросли Furceliaria fastigiata // Химия природных соединений. – 1975. – № 3. – C. 400-404. 252. Medvedeva E.I., Lukina G.D., Selich E.F., Bozhko I.G. Structure and some characteristics of glycoproteins of the alga Phyllophora // Biokhimiya. – 1973. – Vol. 38. – P. 1181-1185. 253. Usov A.I., Shashkov A.S. Polysaccharides of algae XXXIV: Detection of iotacarrageenan in Phyllophora brodittei (Tum.) J Ag. (Rhodophyta) using 13C-NMR spectroscopy // Bot. Mar. – 1985. – Vol. 28. – P. 367–373. 254. Yang B., Yu G., Zhao X., Jiao G., Ren S., Chai W. Mechanism of mild acid hydrolysis of galactan polysaccharides with highly ordered disaccharide repeats leading to a complete sries of exclusively odd-numbered oligosaccharides // FEBS J. – 2009. – Vol. 276. – P. 2125-2137. 255. Kalitnik A.A., Byankina Barabanova A.O., Nagorskaya V.P., Reunov A.V., Glazunov V.P., Solov′eva T.F., Yermak I.M. Low molecular weight derivatives of different carrageenan types and their antiviral activity // J. Appl. Phycol. – 2013. – Vol. 25. – P. 65-72. 256. Park J.T., Johnson M.J. A submicrodetermination of glucose // J. Biol. Chem. – 1949. – Vol. 181. – P. 149–151. 257. Kolender A.A., Matulewicz M.C. Sulfated polysaccharides from the red seaweed Georgiella confluens // Carbohydr. Res. – 2002. – Vol. 337. – P. 57-68. 258. Chattopadhyay K., Adhikari U., Lerouge P., Ray B. Polysaccharide from Caulerpa racemosa: Purification and structural features // Carbohydr. Polym. – 2007. – Vol. 68. – P. 407-415. 259. Kalitnik A.A., Marcov P.A., Anastyuk S.D., Barabanova A.O., Glazunov V.P., Popov S.V., Ovodov Y.S., Yermak I.M. Gelling polysaccharide from Chondrus armatus and its oligosaccharides: the structural peculiarities and antiinflammatory activity // Carbohydr. Polym. – 2015. – Vol. 115. – P. 768-775. 157 260. Hatada Y., Mizuno M., Li Z., Ohta Y. Hyper-production and characterization of the ι-carrageenase useful for ι-carrageenan oligosaccharide production from a deep-sea bacterium, Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94T, and insight into the unusual catalytic mechanism // Mar. Biotechnol. – 2011. – Vol. 13, N 3. – P. 411-422. 261. Pomin V.H. Review: An overview about the structure–function relationship of marine sulfated homopolysaccharides with regular chemical structures // Biopolym. – 2009. – Vol. 91, N 8. – P. 601–609. 262. Pereira M.S., Melo F.L., Mourao P.A.S. Is there a correlation between structure and anticoagulant action of sulfated galactans and sulfated fucans? // Glycobiology. – 2002. – Vol. 12. – P. 573-580. 263. Pomin V.H., de Souza Mourão P.A. Structure versus anticoagulant and antithrombotic actions of marine sulfated polysaccharides // Brazilian J. Pharmacog. – 2012. – Vol. 22, N 4. – P. 921–928. 264. Yermak I.M., Barabanova A.O., Aminin D.L., Davydova V.N., Sokolova E.V., Solov’eva T.F., Kim Y.H., Shin K.S. Effects of structural peculiarities of carrageenans on their immunomodulatory and anticoagulant activities // Carbohydr. Polym. – 2012. – Vol. 87, N 1. – P. 713–720. 265. Bhattacharyya S., Liu H., Zhang Z., Jam M., Dudeja P.K., Michel G., Linhardt R.J., Tobacman J.K. Carrageenan-induced innate immune response is modified by enzymes that hydrolaze distinct galactosidic bonds // J. Nutr. Biochem. – 2010. – Vol. 10. – P. 906-910. 266. Zhou G., Sun Y., Xin H., Zhang Y., Li Z., Xu Z. In vivo antitumor and immunomodulation activities of different molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus // Pharmacol. Res. – 2004. – Vol. 50. – P. 47-50. 267. Stephanie B., Eric D., Sophie F., Christian B., Yu G. Carrageenan from Solieria chordalis (Gigartinales): Structural analysis and immunological activities of the low molecular weight fractions // Carbohydr. Polym. – 2010. – Vol. 8. – P. 448450. 268. Перестенко Л.П. Красные водоросли дальневосточных морей России / Л.П. Перестенко. – СПб.: Ольга, 1994. – 322 с. 158 269. Kaixian Q., Franklin M., Borowitzka M.A. The study for isolation and purification of R-phycoerythrin from a red alga // Appl. Biochem. Biotechnol. – 1993. – Vol. 43, N 2. – P. 133-139. 270. Сапожников Д.И. Пигменты пластид зеленых водорослей, растений и методика их использования / Д.И. Сапожников. – М.: Наука, 1964. - 120 с. 271. Jeffrey S.W., Humphrey G.F. New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton // Biochem. Physiol. – 1975. – Vol. 167. – P. 191-194. 272. Seely G.R., Duncan M.J., Vidaver W.E. Preparation and analytical extraction of pigments from brown algae with dimenthyl sulfoxide // Mar. Biol. – 1972. – Vol. 12. – P. 184-188. 273. Lowry O.H., Rosebrough N.L., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. – 1951. – Vol. 193, N 7. – P. 265275. 274. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding //Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72. – P. 248-254. 275. Dodgson K.S., Price R.G. A note on the determination of the ester sulfate content of sulfated polysaccharides // Biochem. J. – 1962. – Vol. 84. – P. 106-110. 276. Englist H.N., Cummings J.H. Simplified method for the measurement of total non-starch polysaccharides by liquid chromatograph of constituent sugars as alditol acetates // Analyst. – 1984. – Vol. 109, N 6. – P. 937-942. 277. Усов А.И., Элашвили М.Я. Количественное определение производных 3,6ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красных водорослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорг. Химия. – 1991. – Т. 17, № 6. – С. 839-848. 278. Yu G., Guan H., Ioanoviciu A.S., Sikkander S.A., Thanawiroon C., Tobacman J.K., Toida T., Linhardt R.J. Structural studies on k-carrageenan derived oligosaccharides // Carbohydr. Res. – 2002. – Vol. 337. – P. 433–440. 279. Жэнь–Юань Ц. Определение молекулярных весов биополимеров / Ред. С.Р. Рафиков. М.: Изд-во ИЛ. – 1962. – 234 с. 159 280. Maghami G.G., Roberts G.A.F. Evaluation of the viscometric constants for chitosan // Macromol. Chem. – 1988. – Vol. 189. – P. 195–200. 281. Rochas C., Rinaudo M., Landry S. Role of the molecular weight on the mechanical properties of kappa–carrageenan gels // Carbohydr. Polym. – 1990. – Vol. 12. – P. 255–266. 282. Lehmann A.K., Sørnes S., Halstensen A. Phagocytosis: measurement by flow cytometry // J. Immunol. Methods. – 2000. – Vol. 243, N 1. – P. 229-242. 283. Setsukinai K.I., Urano Y., Kakinuma K., Majima H.J., Nagano T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, N 5. – P. 31703175. 160 Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. И.М. Ермак за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, к.х.н. А.О. Барабановой за помощь в постановке первых экспериментов, к.б.н. Е.В. Соколовой за проведение экспериментов по биологической активности полисахаридов, к.х.н. В.И. Горбач за полезные советы, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой и всем сотрудникам ЛМОАБИ за внимание к работе, к.х.н. С.Д. Анастюку, к.ф.-м.н. В.П. Глазунову и к.х.н. В.В. Исакову за получение и помощь в интерпретации масс-спектров, ИК- и ЯМР спектров, к.б.н. Белоус О.С. за сбор и идентификацию водоросли, а также сотруднице ЛФАО Института Биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН к.б.н. И.М. Яковлевой за помощь в проведении эксперимента и интерпретации результатов по сезонной динамике пигментов. Автор также благодарит Dr. W. Helbert (Франция, CERMAV-CNRS) за любезное предоставление фермента йотакаррагиназы. 161
