Использование точечного мутагенеза с введением остатков

Московский Государственный университет имени М. В. Ломоносова
Биологический факультет
Кафедра Биохимии
Мымриков Евгений Викторович
«Использование точечного мутагенеза с введением
остатков цистеина для изучения белок-белковых
взаимодействий в олигомерах
малых белков теплового шока человека»
Дипломная работа
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Гусев Н. Б.
Москва 2009
Оглавление
Список сокращений.......................................................................................................................4
1. Обзор литературы..................................................................................................................5
1.1.
Семейство малых белков теплового шока ..................................................................5
1.2.
Структура малых белков теплового шока...................................................................6
1.3.
Гетероолигомеры малых белков теплового шока ....................................................10
1.4.
Некоторые функции малых белков теплового шока человека ...............................13
1.4.1.
Предотвращение агрегации денатурированных белков ..................................13
1.4.2.
Роль малых белков теплового шока в предотвращении апоптоза..................15
1.4.3.
Возможное участие малых белков теплового шока в регуляции мышечного
сокращения...........................................................................................................................16
1.5.
«Горячие точки» в структуре малых белков теплового шока, корреляции между
точечными мутациями малых белков теплового шока и некоторыми наследственными
заболеваниями..............................................................................................................................18
1.6.
Роль петли, соединяющей пятую и седьмую β-складки, во взаимодействии
мономеров sHsp ...........................................................................................................................20
2. Цели и задачи исследования...............................................................................................23
3. Материалы и методы...........................................................................................................24
Выделение и очистка малых белков теплового шока (sHsp) человека ..................24
3.1.
3.1.1.
Препаративная экспрессия .................................................................................24
3.1.2.
Выделение и очистка Hsp20 дикого типа (Hsp20WT) .....................................24
3.1.3.
Выделение и очистка мутанта Hsp20 с заменами C46S/E116C (Hsp20Cys) ..26
Выделение и очистка αВ-кристаллина с точечной мутацией E117C (αB3.1.4.
CryCys)…..............................................................................................................................27
3.1.5.
Выделение
и
очистка
Hsp22
с
мутированными
остатками
C10S/C99S/N138C/C195S (Hsp22Cys) ...............................................................................30
3.1.6.
Получение препаратов других sHsp дикого типа.............................................31
Сравнение структуры и свойств малых белков теплового шока дикого типа и их
3.2.
«цистеиновых» мутантов............................................................................................................31
3.2.1.
Сравнение вторичной структуры методом кругового дихроизма..................31
3.2.2.
Исследование третичной структуры методом собственной триптофановой
флуоресценции.....................................................................................................................33
3.2.3.
Исследование гидрофобных свойств с помощью зонда bis-ANS...................35
3.2.4.
Исследование олигомерного состояния методом гель-фильтрации ..............37
3.2.5.
Измерение шаперонной активности малых белков теплового шока .............37
3.3.
Исследование белок-белковых взаимодействий в гомоолигомерах
«цистеиновых» мутантов sHsp человека...................................................................................38
3.4.
Исследование белок-белковых взаимодействий в гетероолигомерах
«цистеиновых» мутантов sHsp человека...................................................................................39
3.5.
Некоторые аналитические методы ............................................................................39
3.5.1.
SDS-электрофорез по методу Лэммли ..............................................................39
3.5.2.
SDS-электрофорез в градиенте ПААГ ..............................................................40
3.5.3.
Спектрофотометрический метод определения концентрации белка .............41
3.5.4.
Окрашивание гелей серебром ............................................................................41
4. Результаты и их обсуждение ..............................................................................................42
4.1.
Выделение малых белков теплового шока человека ...............................................42
4.1.1.
Выделение и очистка Hsp20WT и Hsp20Cys ....................................................42
4.1.2.
Выделение и очистка αB-CryCys .......................................................................44
4.1.3.
Выделение и очистка Hsp22Cys .........................................................................46
4.2.
Сравнение структуры и свойств sHsp дикого типа и их «цистеиновых»
мутантов ………………………………………………………………………………………...47
2
4.2.1.
Сравнение вторичной структуры sHsp дикого типа и их «цистеиновых»
мутантов. ..............................................................................................................................47
4.2.2.
Исследование третичной структуры белков методом собственной
триптофановой флуоресценции .........................................................................................50
4.2.3.
Исследование гидрофобных свойств малых белков теплового шока с
помощью зонда bis-ANS .....................................................................................................52
4.2.4.
Исследование олигомерного состояния методом гель-фильтрации ..............56
4.2.5.
Измерение шаперонной активности малых белков теплового шока .............57
4.3.
Исследование белок-белковых взаимодействий в гомоолигомерах
«цистеиновых» мутантов sHsp человека...................................................................................61
Сравнение структуры «цистеиновых» мутантов малых белков теплового шока в
восстановленном и окисленном состояниях.....................................................................64
4.4.
Исследование белок-белковых взаимодействий в гетероолигомерах
«цистеиновых» мутантов sHsp человека...................................................................................69
Выводы .........................................................................................................................................73
Благодарности..............................................................................................................................74
Список литературы......................................................................................................................75
3
Список сокращений
АА – акриламид
АТР – аденозинтрифосфорная кислота
БСА – бычий сывороточный альбумин
ДТТ – дитиотреитол
КД – круговой дихроизм
МБА – метиленбисакриламид
МЭ – β-меркаптоэтанол
ПААГ – полиакриламидный гель
ПСА – персульфат аммония
ТЕМЕД - N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин
УЗ – ультразвук
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат
ЭПР – электронный парамагнитный резонанс
bis-ANS – 1,1’-бис-(4-анилино)-нафталено-5,5’-дисульфоновая кислота
αB-Cry – αВ-кристаллин
αB-CryCys– αВ-кристаллин с точечной мутацией E117C
cAMP – циклический аденозинмонофосфат
eIF2α – фактор инициации трансляции 2α
FGF-2 – фактор роста фибробластов 2
Hsp20WT – Hsp20 дикого типа
Hsp20Сys – Hsp20 с двойной мутацией C46S, E116C
Hsp22Cys – Hsp22 с заменами C10S, C99S, C195S, N138C
Hsp27WT – Hsp27 дикого типа
IPTG – изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид
LB – среда Луриа-Бертани
MAPKAP киназа – протеинкиназа, активируемая МАР-киназой
NGF-β – фактор роста нервов бета
SDS – додецилсульфат натрия
sHsp – малые белки теплового шока
VEGF – эндотелиальный фактор роста
4
1.
Обзор литературы
1.1. Семейство малых белков теплового шока
Сворачивание белка – достаточно сложный и, как правило, многостадийный процесс.
Небольшие по размеру и простые по структуре белки способны сворачиваться спонтанно,
в то время как для больших сложно устроенных белков необходимо наличие специальных
«помощников» – шаперонов. Основную роль в этом процессе играют белки, относящиеся
к семействам Hsp60 (GroEL у бактерий) и Hsp70 (DnaK у бактерий). Hsp60 и Hsp70
связываются с гидрофобными участками на поверхности развернутого белка и
направляют его сворачивание, используя энергию гидролиза ATP (Narberhaus, 2002; Vos et
al., 2008).
Помимо этого в клетке есть несколько других, менее изученных групп белковшаперонов, среди которых стоит отметить семейство малых белков теплового шока
(sHsp). Представители этого семейства обнаружены практически у всех живых
организмов, их объединяет несколько общих черт: а) наличие высоко консервативного αкристаллинового домена; б) небольшая молекулярная масса от 12 до 43 кДа; в) склонность
к формированию крупных олигомеров; г) динамичная четвертичная структура; д)
шапероноподобная активность, состоящая в их способности предотвращать агрегацию
частично
денатурированных
белков,
образующихся
в
результате
различных
неблагоприятных воздействий (Haslbeck et al., 2005; Narberhaus, 2002). sHsp не обладают
АТРазной
активностью
и
не
способны
обеспечивать
сворачивание
частично
денатурированных или неправильно свернутых белков, но они способны замедлять или
предотвращать агрегацию денатурированных белков и передавать их на ATP-зависимые
шапероны.
Количество различных sHsp у разных организмов сильно варьирует, хотя, по всей
видимости, чем сложнее устроен организм и чем большему количеству различных
стрессорных воздействий он подвергается, тем большее число генов, кодирующих sHsp,
присутствует в его геноме. Наибольшее число генов sHsp обнаружено у растений (17 у
Triticum aestivum и 19 у Arabidopsis thaliana), в геноме человека 10 генов кодируют малые
белки теплового шока (HspB1 – B10) (Haslbeck et al., 2005). Наиболее изученными sHsp
человека являются αА- (HspB4) и αВ-кристаллин (HspB5). Они составляют основную
массу белков, входящих в состав хрусталика глаза. Способность этих белков сохранять
прозрачность хрусталика и, тем самым, предотвращать развитие катаракты широко
5
исследуется в настоящее время (Ecroyd and Carver, 2009; Horwitz, 2000; Horwitz, 2009).
αА-кристаллин обнаружен только в хрусталике глаза, а αВ-кристаллин, как и некоторые
другие представители sHsp человека (Hsp27, Hsp20, Hsp22), экспрессируется в
большинстве тканей организма, в том числе в мозге, легких, сердце и скелетных мышцах.
1.2. Структура малых белков теплового шока
В структуре малых белков теплового шока выделяют три элемента: N-концевой
домен,
консервативный
α-кристаллиновый
домен
и
короткую
С-концевую
последовательность (рис. 1, А). Рассмотрим структуру и свойства каждого из этих
доменов.
A)
Б)
N
ACD
C
В)
Рис. 1. Структура малых белков теплового шока.
А) Общий план строения малых белков теплового шока: N – N-концевой домен, ACD – αкристаллиновый домен, С – С-концевая последовательность; Б) Структура димера Hsp16.9
из Triticum aestivum. Показан «обмен» цепями между субъединицами, β6-складка
(обозначена синим) одного мономера образует контакты с β2-складкой (обозначена
желтым или зеленым) другого мономера (по Stamler et al., 2005); В) Структура олигомеров
Hsp16.5 из Т. aestivum (слева) и Hsp16.9 из M. jannaschii (справа) (van Montfort et al., 2001).
Последовательность N-концевого домена мало консервативна. Тем не менее, у
многих малых белков теплового шока в N-концевой части располагается так называемый
WDPF домен, а в других белках в этой части располагаются значительные количества
6
гидрофобных остатков. В опытах, выполненных на αА-кристаллине и Hsp16.5 M.
jannaschii, проводили частичное или полное удаление N-концевого домена или заменяли
этот домен на N-концевой домен другого малого белка теплового шока (Eifert et al., 2005).
В ходе этих опытов было установлено, что длина и аминокислотный состав N-концевого
домена малых белков теплового шока играют важную роль в формировании крупных
олигомеров (Eifert et al., 2005). Судя по всему, N-концевые пептиды могут образовывать
своеобразные мостики между соседними димерами малых белков теплового шока.
Причем эти мостики могут располагаться как на поверхности олигомеров sHsp, так и
могут быть спрятанными внутри сферических структур, образуемых олигомерами малых
белков теплового шока (Kim et al., 1998; Stamler et al., 2005; Theriault et al., 2004). В Nконцевом домене многих малых белков теплового шока располагаются участки,
фосфорилируемые различными протеинкиназами (Панасенко и соавт., 2003). В
зависимости от расположения участка и степени его фосфорилирования может изменяться
ориентация N-концевого пептида. Например, N-концевой домен может быть либо
закреплен к β7-складке, расположенной в кристаллиновом домене того же мономера, либо
образовывать «мостик» между соседними димерами, либо, наконец, участвовать в
связывании белков-субстратов (Theriault et al., 2004). При этом в составе N-концевого
домена αB-кристаллина выявлено две последовательности, принимающих участие во
взаимодействии с белками-субстратами (остатки 9-20 и 43-58) (Ghosh et al., 2005).
α-Кристаллиновый
домен
является
ключевым
и
наиболее
консервативным
элементом структуры всех малых белков теплового шока. Наличие кристаллинового
домена является необходимым и достаточным условием отнесения белка к семейству
малых белков теплового шока. α-Кристаллиновый домен имеет форму β-сендвича,
образованного двумя β-листами. В состав первого листа входят β2-, β3-, β8- и β9- складки, а
в состав второго – β4-, β5- и β7-складки. В структуре Hsp16.9 и Hsp16.5 была выявлена
короткая шестая β-складка, образующая контакты со второй β-складкой соседнего
мономера в составе димера (рис. 1, Б) (Kim et al., 1998; Stamler et al., 2005; van Montfort et
al., 2001). Участок, гомологичный шестой β-складке, отсутствует в структуре малых
белков теплового шока человека, но, по всей видимости, петля, соединяющая пятую и
седьмую β-складки также играет важную роль в димеризации sHsp человека (см. ниже).
Помимо указанного участка в структуре α-кристаллинового домена выявлены и другие
участки, вовлеченные в межсубъединичные взаимодействия. Например, пептиды,
ограниченные остатками 75-82 (β3), 131-138 (β8) и 141-148 (β9) αB-кристаллина, могут
участвовать в образовании межсубъединичных контактов (Ghosh and Clark, 2005).
Любопытно отметить, что указанные участки не только принимают участие во
взаимодействии мономеров sHsp, но и, по всей видимости, обеспечивают взаимодействие
7
αB-кристаллина как минимум с некоторыми денатурированными белками-субстратами, а
также с факторами роста и β-катенином (Ghosh et al., 2007). Если это заключение верно, то
представленные данные означают, что для проявления шаперонной активности или для
взаимодействия с регуляторными белками в структуре олигомеров sHsp должны
происходить значительные перестройки, и при этом должно происходить существенное
изменение межсубъединичных контактов.
С-концевой домен малых белков теплового шока крайне вариабелен по длине и
первичной структуре. Он принимает участие в олигомеризации малых белков теплового
шока, его ориентация определяет структуру и олигомерный состав sHsp (Ecroyd and
Carver, 2009; McHaourab et al., 2009) и влияет на растворимость комплексов, образованных
малыми белками теплового шока и денатурированными белками. В то же время в
некоторых случаях частичное или полное удаление С-концевого пептида не приводит к
значительным изменениям в структуре и свойствах sHsp. Недавно было установлено, что
замена треонина в положении 162 (расположенного в С-концевом домене αBкристаллина) на цистеин не влияет на структуру белка, если остаток цистеина находится в
восстановленном состоянии. В то же время в процессе окисления происходит образование
дисульфидной связи между остатками цистеина соседних мономеров и при этом
увеличивается вероятность агрегации кристаллина (Murugesan et al., 2008). Эти данные
хорошо согласуются с данными Гоша и соавт. (Ghosh et al., 2007) о том, что С-концевой
домен играет важную роль во взаимодействии мономеров кристаллина. Кроме того,
данные, полученные на мутанте T162C, свидетельствуют о том, что в определенных
условиях С-концевые домены обладают высокой подвижностью и могут располагаться
поблизости друг от друга, вследствие чего становится возможным образование
дисульфидной связи. В то же время образование такой связи резко дестабилизирует
структуру олигомера кристаллина и приводит к его агрегации.
Способность образовывать крупные, динамичные и варьирующие по составу
олигомеры сильно затрудняет кристаллизацию малых белков теплового шока. Вследствие
этого сведения о третичной и четвертичной структуре большинства малых белков
теплового шока остаются ограниченными. Однако несколько представителей семейства
sHsp имеют строго упорядоченную структуру. К настоящему времени удалось
закристаллизовать и определить структуру трех представителей этого семейства: Hsp16.9
из T. aestivum (van Montfort et al., 2001), Hsp16.5 из Methanococcus jannaschii (Kim et al.,
1998) (рис. 1, В) и Tsp36 из Taenia saginata (Stamler et al., 2005). Структурной единицей
олигомеров Hsp16.9 и Hsp16.5 служат димеры, а структурной единицей Tsp36 –
мономеры, содержащие два α-кристаллиновых домена. Любопытно отметить, что во всех
исследованных структурах стабилизация димеров обеспечивается за счет образования
8
контакта между петлей, соединяющей пятую и седьмую β-складки, одного мономера и
второй β-складкой другого мономера.
Большинство малых белков теплового шока человека существует в виде крупных
олигомеров, например, α-кристаллины образуют комплексы с молекулярной массой от
660 до 940 кДа (Horwitz, 2009), а Hsp27 существует в виде олигомеров с массой от 200 до
800 кДа (Rogalla et al., 1999). По всей видимости, структурной единицей этих олигомеров
также являются димеры. В пользу этого предположения есть довольно много
экспериментальных
данных.
Это
подтверждается
ранними
экспериментами
по
микрокалориметрии Hsp27, проведенными в лаборатории Завьялова (Dudich et al., 1995).
Совершенствование техники масс-спектроскопии позволило показать, что крупные
олигомеры sHsp состоят преимущественно из четного количества мономеров и склонны
диссоциировать с отделением также четного количества субъединиц. Другими словами, в
обычном случае именно димеры являются строительными блоками крупных олигомеров
sHsp. В то же время некоторые денатурирующие воздействия приводят к разрушению
устойчивых
димеров и
сопровождаются
образованием олигомеров
с нечетным
количеством субъединиц, которые обладают измененной шаперонной активностью
(Benesch et al., 2008).
Следует отметить, что далеко не все малые белки теплового шока образуют крупные
олигомеры. Например, Hsp20 и Hsp22 человека не образуют крупных олигомеров, а
существуют в виде димеров (Hsp20) (Bukach et al., 2004), либо равновесной смеси димеров
и мономеров (Hsp22) (Kim et al., 2004), а Hsp12.6 из Caenorhabditis elegans, имеющий
очень короткие N- и С-концевые последовательности, представлен в виде мономеров
(Leroux et al., 1997). Эти данные свидетельствуют о том, кристаллиновый домен в
основном отвечает за формирование димеров, а вариабельные N- и С-концевые
последовательности обеспечивают правильное встраивание и взаимодействие димеров
малых белков теплового шока между собой.
На структуру малых белков теплового шока оказывают значительное влияние
различные посттрансляционные модификации. Фосфорилирование Hsp27 MAPKAP
киназой 2 приводит к диссоциации высокомолекулярных комплексов на олигомеры с
кажущейся молекулярной массой 70-250 кДа (тетрамеры или димеры), а точечный мутант
Hsp27, имитирующий фосфорилирование по трем остаткам серина, ведет себя сходным
образом (Kato et al., 1994b; McHaourab et al., 2009; Rogalla et al., 1999). Фосфорилирование
αB-кристаллина также сопровождается заметным уменьшением его молекулярной массы
(Ito et al., 2001). Кроме фосфорилирования Hsp27 может подвергаться S-тиолированию
(образование смешанного дисульфида между единственным цистеином C137 и
различными соединениями, содержащими свободную –SH-группу). Такая модификация
9
приводит к уменьшению размеров олигомеров независимо от степени фосфорилирования
белка (Eaton et al., 2002). При различных патологических состояниях, а также при
старении, происходит гликозилирование белков, входящих в состав хрусталика глаза.
Кумар и соавт. показали, что при гликозилировании α-кристаллина различными агентами
(глюкозой,
фруктозой,
глюкозо-6-фосфатом
и
метилглиоксалем)
происходят
значительные изменения как во вторичной, так и в третичной структуре белка (Kumar et
al., 2007).
1.3. Гетероолигомеры малых белков теплового шока
Способность малых белков теплового шока образовывать крупные олигомеры и
сходство в структуре различных sHsp позволяет белкам, относящимся к одному и тому же
классу, формировать не только гомо-, но и гетероолигомерные комплексы. По
особенностям первичной структуры малые белки теплового шока могут быть поделены на
несколько групп или классов. Оказалось, что только белки, относящиеся к одной группе
(или одному классу), способны образовывать гетероолигомеры. Так в опытах с малыми
белками теплового шока растений показано, что Hsp16.9 пшеницы и Hsp18.1 гороха,
относящиеся к классу I, способны в условиях in vitro образовывать гетероолигомеры. В то
же время, Hsp18.1 и Hsp17.7 (оба белка гороха), относящиеся к разным классам, образуют
исключительно гомоолигомерные комплексы (цит. по Narberhaus, 2002).
С этими выводами согласуются и данные, полученные Сугияма и соавт. (Sugiyama et
al., 2000). Эти авторы выделяют среди малых белков теплового шока человека два класса.
Различные белки, относящиеся к одному и тому же классу, способны образовывать
гетероолигомерные комплексы. Так к первому классу относятся Hsp27, αА-кристаллин,
αB-кристаллин и Hsp20, и эти четыре белка могут формировать между собой
гетероолигомеры. Наиболее распространенным примером гетероолигомеров такого типа
является «нативный» α-кристаллин, выделяемый из хрусталика глаза и состоящий из
гетероолигомеров αА- и αB-кристаллина, представленных в соотношении 3:1. Помимо
этого в литературе накоплен достаточно большой объем сведений о прочном
взаимодействии αВ-кристаллина и Hsp20 или о взаимодействии Hsp20 и Hsp27 (Bukach et
al., 2009; Bukach et al., 2004; Kato et al., 1994a; Pipkin et al., 2003; Sugiyama et al., 2000).
Несмотря на то, что образование гетероолигомерных комплексов sHsp исследуется
довольно давно, свойства таких комплексов изучены слабо. В нашей лаборатории были
изучены некоторые свойства гетероолигомеров Hsp20 и Hsp27 (Bukach et al., 2009; Bukach
et al., 2004). Установлено, что Hsp20 и Hsp27 образуют два типа комплексов с
10
молекулярными массами около 100-150 и 250-300 кДа, при этом молярное соотношение
двух разных малых белков теплового шока в этих комплексах близко к 1:1. Скорость
образования гетероолигомеров Hsp20 и Hsp27 зависит от температуры, и резко ускоряется
с ростом температуры (Bukach et al., 2009).
По данным Сугияма и соавт. (Sugiyama et al., 2000) ко второму классу малых белков
теплового шока человека относят HspB2 (MKBP) и HspB3, которые способны
обмениваться между собой субъединицами, но не способны взаимодействовать с малыми
белками теплового шока, относящимися к первому классу. Эта точка зрения была
поколеблена экспериментальными данными из лаборатории Бенндорфа (Fontaine et al.,
2005; Sun et al., 2004). Эти исследователи использовали метод коиммунопреципитации с
малыми белкам теплового шока, несущими различные «метки» (FLAG или Myc), а также
метод двойной гибридизации в клетках дрожжей. Помимо этого Бенндорф с соавторами
анализировали взаимодействие различных малых белков теплового шока, экспрессируя в
клетках химерные белки, состоящие из малых белков теплового шока, «слитых» с
различными флуоресцирующими белками. Опираясь на эти методы, Бенндорф с
соавторами смогли обнаружить, что вне зависимости от групп и классов практически все
малые белки теплового шока человека способны образовывать гетероолигомерные
комплексы. Особенно универсальным оказался Hsp22, который мог взаимодействовать с
Hsp27, αB-кристаллином, Hsp20 и HspB2 (MKBP) (Fontaine et al., 2005; Sun et al., 2004)
(см. таблицу 1).
11
Таблица 1. Образование гетероолигомеров между малыми белками теплового
шока человека.
По данным (Bukach et al., 2009; Bukach et al., 2004; Fontaine et al., 2005; Kato et al.,
1994a; Pipkin et al., 2003; Rogalla et al., 1999; Sugiyama et al., 2000; Sun et al., 2004; Zantema
et al., 1992)
Hsp27
MKBP
(HspB2)
HspB3
αB-Cry
Hsp20
Hsp22
Hsp27
+
–
–
+
+
±
MKBP(HspB2)
–
+
+
–
±
+
HspB3
–
+
–
–
–
–
αB-Cry
+
–
–
+
+
+
Hsp20
+
±
–
+
+
+
Hsp22
±
+
–
+
+
+
+ – обнаружено взаимодействие
– – взаимодействие отсутствует
± – данные о взаимодействии противоречивы
К сожалению, нам кажется, что данные, полученные в лаборатории Бенндорфа,
трудно
интерпретировать
коиммунопреципитации
из
однозначно.
гомогената
Например,
ткани
при
трудно
использовании
исключить
метода
возможность
взаимодействия этих белков посредством какого-либо общего белка-партнера или белкасубстрата. Исследования с использованием белков, соединенных с различного типа
«метками» в виде небольших пептидов или белков (FLAG, Myc, флуоресцирующих
белков и др.), или химерных белков в случае двойной гибридизации также нельзя
рассматривать как однозначное доказательство взаимодействия. Прежде чем проводить
такого рода исследования, желательно показать, что прикрепление к малым белкам
теплового шока используемых в работе меток не будет влиять на структуру и свойства
изучаемых белков.
В настоящее время нет сомнений в том, что исследование образования
гетероолигомерных комплексов различных малых белков теплового шока является
интересной и актуальной задачей. Однако для ее реализации желательно разработать
какие-то
новые
экспериментальные
подходы,
которые
позволили
бы
избежать
неопределенностей и неясностей, возникающих при использовании ставших уже
классическими старых экспериментальных методов.
12
1.4. Некоторые функции малых белков теплового шока
человека
1.4.1. Предотвращение агрегации денатурированных белков
Несомненно,
главной
функцией
малых
белков
теплового
шока
является
предотвращение агрегации денатурированных белков. Большую часть белков хрусталика
глаза составляют α-кристаллины. С возрастом под действием неблагоприятных факторов
может
происходить
модификация
белков
хрусталика
(частичный
протеолиз,
фосфорилирование, окисление, дезамидирование и др.), что, в свою очередь, может
приводить к образованию нерастворимых белковых агрегатов и катаракте. α-Кристаллины
взаимодействуют с денатурированными белками, предотвращая выпадение белков в
осадок и сохраняя прозрачность хрусталика (Ecroyd and Carver, 2009). По всей видимости,
в других тканях sHsp также способствуют поддержанию денатурированных белков в
растворимом виде. При определенных патологических состояниях, сопровождающихся
образованием
амилоидных
фибрилл,
таких
как
болезнь
Альцгеймера,
болезнь
Кройцфельда-Якоба и болезнь Александера, наблюдается повышение синтеза sHsp. Hsp27
и αB-кристаллин обнаруживаются в тельцах Леви и агрегатах, образованных αсинуклеином, более того, эти белки понижают токсичность α-синуклеина при его
гиперэкспрессии в клетках линии H4 (Ecroyd and Carver, 2009; Outeiro et al., 2006).
Механизм шапероноподобного действия малых белков теплового шока хорошо
описан в обзорах разных лет (Ecroyd and Carver, 2009; Haslbeck et al., 2005; McHaourab et
al., 2009; Narberhaus, 2002; Панасенко и соавт., 2003). Схематично этот механизм
представлен на рисунке 2. При воздействии различных неблагоприятных факторов резко
возрастает вероятность денатурации белков. sHsp связываются с такими белками и
передают их на ATP-зависимые шапероны. В том случае, если ренатурация оказывается
невозможной,
денатурированные
белки
подвергаются
убиквитинилированию
и
протеолитической деградации в протеасомах, либо попадают в фагосомы и расщепляются
под действием лизосомальных протеаз. Комплексы sHsp с субстратами достаточно
стабильны и могут существовать на протяжении нескольких часов (Narberhaus, 2002). В
модели, предложенной Макаурабом и соавт. (McHaourab et al., 2009) и основанной на
взаимодействии малых белков теплового шока с T4 лизоцимом, предполагается два типа
взаимодействия sHsp с белками мишенями (с низким и высоким сродством). Как уже
отмечалось, участки, обеспечивающие взаимодействие с белками-субстратами, и участки,
13
Схема сворачивания-разворачивания белка
Стресс
Нативный белок
I1
Денатурированный белок
I2
sHsp димер
sHsp олигомер
Белковый
агрегат
sHsp-I2
комплекс
Нерастворимый
осадок
Нативный
белок
Рис. 2. Механизм шапероноподобного действия малых белков теплового шока. sHsp
избирательно взаимодействуют с частично-развернутыми белками (I2), предотвращая их
агрегацию. Белки-субстраты sHsp затем передаются на ATP-зависимые шапероны
(Hsp70), при помощи которых восстанавливается их нативная структура (по Ecroyd and
Carver, 2009).
обеспечивающие
межсубъединичные
контакты
в
составе
олигомеров,
зачастую
перекрываются. По этой причине изменение олигомерного состояния малых белков
теплового шока зачастую сопровождается довольно существенными изменениями их
шаперонной активности. Например, 3D мутант, имитирующий фосфорилирование Hsp27
по трем остаткам серина и не способный образовывать крупные олигомеры, обладает
иным сродством к белкам-мишеням, чем Hsp27 дикого типа, склонный к образованию
только очень крупных олигомеров (McHaourab et al., 2009).
В недавно опубликованных работах был описан несколько необычный способ, с
помощью которого Hsp22 может защищать клетки от накопления денатурированных
белков. При воздействии различных неблагоприятных факторов (тяжелые металлы,
тепловой шок, вирусная инфекция) Hsp22 образует комплекс с белком Bag3. Такой
комплекс способен активировать какие-то еще не установленные протеинкиназы, а эти
протеинкиназы фосфорилируют фактор инициации eIF2α. Фосфорилирование eIF2α
приводит к ингибированию синтеза белков, которые не являются необходимыми клетке в
условиях стресса. Помимо этого комплекс Hsp22-Bag активирует процесс перехода
14
денатурированных белков в автофагосомы, где они гидролизуются лизосомальными
протеазами (Carra et al., 2009).
Таким образом, малые белки теплового шока позволяют клетке сохранять ценные
белковые и энергетические ресурсы и тем самым повышают её жизнеспособность в
условиях стресса.
1.4.2. Роль малых белков теплового шока в предотвращении
апоптоза
Многие малые белки теплового шока являются не только шаперонами, но и важными
регуляторными белками, участвующими в самых разных клеточных процессах. Одним из
процессов, в котором задействованы различные sHsp человека, является регуляция
программируемой
клеточной
предотвращении
апоптоза,
митохондриальному
пути.
гибели
(апоптоза).
происходящего
При
действии
Например,
через
Hsp27
участвует
активацию
определенных
факторов
каспаз
в
по
возможно
высвобождение цитохрома с из митохондрий. В цитоплазме цитохром с взаимодействует
с белком Apaf-1 и прокаспазой-9, что приводит к развитию апоптоза. Hsp27 связывает
вышедший из митохондрий цитохром с и, возможно, таким образом проявляет
антиапоптотическую активность в клеточных линиях (Bruey et al., 2000).
Оверэкспрессия другого малого белка теплового шока – Hsp20 в кардиомиоцитах
приводит к замедлению, либо полному предотвращению процесса апоптоза, вызванного
длительным воздействием изопротеренола. Причем мутантный белок, имитирующий
фосфорилирование Hsp20 по серину 16 (Hsp20S16D), обладает более высокой
антиапоптотической активностью, чем белок дикого типа (цит. по Гусев и соавт., 2005).
Фан и соавт. предположили, что действие Hsp20 направлено на ингибирование процесса
активации прокаспазы-3, они обнаружили, что при оверэкспрессии Hsp20 дикого типа и
Hsp20S16D в линии кардиомиоцитов активность прокаспазы-3 снижается на 10 и 25 %,
соответственно (Fan et al., 2004). Роль Hsp22 в регуляции апоптоза остается не вполне
ясной. По всей видимости, в зависимости от типа клеток этот белок проявляет как про-,
так и антиапоптотическое действие. С одной стороны его оверэкспрессия в клетках линии
HEK 293 сопровождается делением этих клеток, независящим от прикрепления к
подложке. Также Hsp22 был обнаружен среди генов, экспрессия которых вызывает
повышение пролиферации и защиту от апоптоза клеток рака молочной железы (цит. по
Shemetov et al., 2008). Однако в клеточных линиях SK-MEL-2 (меланома), PC-3 (опухоль
предстательной железы) и TC32 (саркома) уровень экспрессии Hsp22 снижен по
15
сравнению с нормальными клетками. Деметилирование ДНК, вызывающее повышение
экспрессии Hsp22, либо трансфекция вектором, содержащим ген Hsp22, приводит к
развитию апоптоза в клетках этих линий (Gober et al., 2003).
По всей видимости, малые белки теплового шока помимо поддержания стабильности
белков, способны повышать жизнеспособность клеток в условиях стресса и другим путем.
Они участвуют в регуляции апоптоза через взаимодействие с белками, непосредственно
вовлеченными в сигнальные пути, связанные с переключением метаболизма клетки на
путь апоптоза.
1.4.3. Возможное участие малых белков теплового шока в
регуляции мышечного сокращения
В самых ранних работах, посвященных исследованию Hsp27, были получены
данные, свидетельствующие о том, что этот белок теплового шока каким-то образом
влияет на процесс полимеризации актина. При этом было постулировано, что Hsp27
выступает в роли кепирующего белка, препятствующего полимеризации актина. В
лаборатории Бенндорфа было установлено, что такой активностью обладают только
нефосфорилированные мономеры Hsp25, выделенные из мускульного желудка птиц
(Benndorf et al., 1994). В то же время рекомбинантный Hsp27 не влияет на полимеризацию
актина. Эти экспериментальные данные сейчас признаны классическими и используются
для объяснения многочисленных эффектов, вызываемых малыми белками теплового шока
в мышцах. В то же время, нам кажется, что эти данные крайне загадочны и
противоречивы. Во-первых, в клетке и в изолированном виде Hsp27 никогда не бывает
представлен в мономерном состоянии и может диссоциировать только до димеров или
тетрамеров. Во-вторых, как правило, диссоциация до малых олигомеров становится
возможной только после фосфорилирования Hsp27. Все это делает крайне маловероятным
наличие в клетке нефосфорилированных мономеров Hsp27, единственных по данным
Бенндорфа и соавт. форм Hsp27, оказывающих существенное влияние на актиновый
цитоскелет. В то же время в литературе есть много данных о корреляции
фосфорилирования Hsp27 с развитием сокращения гладких мышц или изменением
клеточной подвижности. Например, в ряде экспериментов было показано, что
фосфорилирование Hsp27 при активации p38 MAPK/MK2 каскада необходимо для
сокращения
гладких
мышц,
вызванного
определенными
агентами
(бомбезином,
эндотелином-1 и другими), а ингибирование сигнального пути p38 MAPK/MK2/Hsp27
снижает силу сокращения в гладких мышцах из различных органов (цит. по Salinthone et
16
al., 2008). К сожалению, работы такого типа могут продемонстрировать только
корреляции между фосфорилированием Hsp27 и изменением сократительной активности,
но эти данные никоим образом не объясняют причинно-следственную связь между двумя
описанными явлениями. Поэтому, высказанное в нескольких обзорах заключение о том,
что Hsp27 способен прямо взаимодействовать с актиновыми фибриллами, влияя на
образование актомиозинового комплекса (Salinthone et al., 2008), кажется нам
сомнительным и преждевременным.
Существует несколько точек зрения на механизм регуляции мышечного сокращения
с помощью другого малого белка теплового шока – Hsp20. Имеющиеся в литературе
данные свидетельствуют о том, что фосфорилирование Hsp20 каким-то образом
способствует расслаблению гладких мышц. Однако для объяснения этого факта
предлагаются
совершенно
разные
гипотезы.
Согласно
одной
из
них
нефосфорилированный Hsp20 связывается с актином и α-актинином, тем самым укрепляет
цитоскелет и способствует поддержанию тонуса. При фосфорилировании Hsp20
диссоциирует от этих белков, следствием чего является нарушение связи активированного
актомиозина с мембраной, дестабилизация сократительного аппарата и расслабление (цит.
по Гусев и соавт., 2005). Другая точка зрения состоит в следующем. При
фосфорилировании протеинкиназой А Hsp20 транслоцируется на актиновые филаменты,
проявляет активность, сходную с активностью тропонина I, и тем самым препятствует
образованию активного актомиозинового комплекса, «выключая» актиновые филаменты.
Рембольт с соавторами утверждают, что Hsp20 является актин-связывающим белком
(Rembold et al., 2000), способным ингибировать АТРазу актомиозина, в то же время в
нашей лаборатории ни при каких
условиях не удалось обнаружить прямого
взаимодействия Hsp20 с интактным (неповрежденным) актином или с комплексом актина
с регуляторными белками (Bukach et al., 2005).
В последнее время появились свидетельства совершенно иного механизма регуляции
сокращения гладких мышц с помощью Hsp20. Согласно этой гипотезе Hsp20 может
фосфорилироваться
под
действием
сАМР-зависимой
протеинкиназы.
После
фосфорилирования по Ser16 Hsp20 оказывается способным с высоким сродством
взаимодействовать с белком 14-3-3 (Chernik et al., 2007). При этом фосфорилированный
Hsp20 вытесняет из комплекса с 14-3-3 фосфорилированный кофилин. Освободившийся
кофилин дефосфорилируется под действием протеинфосфатазы Slingshot и после этого
способствует деполимеризации актиновых филаментов, вследствие чего становится
возможным расслабление гладких мышц (Dreiza et al., 2005; Komalavilas et al., 2008;
Salinthone et al., 2008).
17
1.5. «Горячие точки» в структуре малых белков
теплового шока, корреляции между точечными
мутациями малых белков теплового шока и
некоторыми наследственными заболеваниями
В связи с тем, что малые белки теплового шока участвуют в многочисленных
процессах, протекающих в клетке (лишь небольшая часть которых была описана выше),
мутации в sHsp могут приводить к тяжелым нарушениям и сопровождаться различными
заболеваниями. В настоящее время выявлены определенные корреляции между
мутациями различных малых белков теплового шока человека и возникновением тяжелых
наследственных заболеваний. Мутации, описанные в литературе, зачастую располагаются
в различных участках структуры малых белков теплового шока, однако в литературе
вводится понятие так называемых «горячих точек», мутации вблизи которых наиболее
часто приводят к тяжелым последствиям. Одной из таких «горячих точек» является петля,
соединяющая пятую и седьмую β-складки малых белков теплового шока (таблица 2).
Перечисленные в таблице 2 мутации часто коррелируют с развитием некоторых
болезней человека. К таким болезням относятся врожденная катаракта (congenital cataract),
миопатия,
связанная
с
десмином
(desmin-related
myopathy,
DRM),
дистальная
наследственная нейропатия (distal hereditary motor neuropathy, dHMT) и болезнь ШаркоМари-Тута (Charcot-Marie-Tooth disease) (Ikeda et al., 2009; Sun and MacRae, 2005).
Мутация R120G в αВ-кристаллине сопровождается развитием врожденной катаракты и
миопатии, связанной с десмином. Сегодня влияние этой мутации, по-видимому, изучено
наиболее полно. αВ-кристаллин с заменой R120G имеет отличия от белка дикого типа как
во вторичной, так и третичной и четвертичной структурах, он в большей степени
подвержен химотрипсинолизу и обладает более низкой шаперонной активностью (Kumar
et al., 1999; Perng et al., 1999; Shroff et al., 2000). В лаборатории Бенндорфа обнаружили,
что при экспрессии в кардиомиоцитах и клетках линии COS-7 химерного αВ-кристаллина
с заменой R120G, соединенного с флуоресцирующим белком (CFP), мутантный белок в
большей степени склонен образовывать цитоплазматические агрегаты, чем белок дикого
типа. Такой химерный мутантный белок обнаруживается в ядерной и цитоскелетной
фракциях (Simon et al., 2007). Помимо этого, у мутантного белка изменяется способность
взаимодействовать с другими sHsp (Simon et al., 2007). В чем же причина таких
значительных изменений, возникающих всего лишь из-за одной точечной мутации? В
кристаллической структуре Hsp16.9 из T. aestivum консервативный Arg108 (остаток,
гомологичный Arg120 αВ-кристаллина) образует электростатические связи с Glu100,
располагающимся в петле, соединяющей пятую и седьмую β-складки, стабилизируя
18
взаимодействия между мономерами, а гомологичный остаток аргинина Hsp16.5 из M.
jannaschii, наоборот, образует связи внутри мономера (van Montfort et al., 2001). Остаток,
гомологичный Glu100 Hsp16.9, отсутствует в α-кристаллинах, но по данным Мишель и
соавт. (Michiel et al., 2009) замена консервативного аргинина на какой-либо другой
аминокислотный остаток приводит к изменению взаимодействий данного остатка с его
локальным окружением, а именно – петлей, соединяющей пятую и седьмую β-складки
ближайшего мономера. Так или иначе, этот остаток аргинина играет важную роль в
стабилизации либо мономеров, либо димеров малых белков теплового шока.
Таблица 2. Точечные мутации малых белков теплового шока, коррелирующие с
некоторыми наследственными заболеваниями. Мутированные остатки выделены
желтым цветом. Синим цветом выделен единственный остаток цистеина Hsp27 (Cys137).
Пунктирной линией обозначена петля, соединяющая пятую и седьмую β-складки,
сплошной линией обозначена седьмая β-складка.
Белок
Заболевания, коррелирующие
с мутациями
Последовательность
-------------------------------________
петля
складка β7
αА-кристаллин
100
HNERQ DDHGY ISREF HRRYR L
120
Наследственная катаракта
αВ-кристаллин
104
HEERQ DEHGF ISREF HRKYR I
124
Десминовая миопатия,
наследственная катаракта
Hsp27 (HspB1)
124
HEERQ DEHGY ISRCF TRKYT L
144
Периферическая моторная
нейропатия
Hsp22 (HspB8)
125
HEEKQ QEGGI VSKNF TKKIQ L
145
Периферическая моторная
нейропатия ІІ типа, болезнь
Шарко-Мари-Тута
Hsp20 (HspB6)
103
HEERP DEHGF VAREF HRRYR L
123
Не описано
Мутации гомологичных остатков (или остатков, расположенных поблизости) были
обнаружены и в других малых белках теплового шока. Так в нашей лаборатории подробно
описано влияние мутаций K137E и K141E на структуру малого белка теплового шока с
молекулярной массой 22 кДа (Hsp22). Установлено, что обе мутации вызывают
увеличение доли неупорядоченных структур, снижают шаперонную активность, а
мутация K137E понижает способность димеров Hsp22 к диссоциации (Kasakov et al., 2007;
Kim et al., 2006). Мутация K141E, а также K141N, обнаружена у пациентов, страдающих
19
наследственной дистальной нейропатией и болезнью Шарко-Мари-Тута (Charсot–Marie–
Tooth disease) (Irobi et al., 2004).
Представленные данные свидетельствуют о том, что петля, соединяющая пятую и
седьмую β-складки малых белков теплового шока, а также участки, примыкающие к этой
петле, судя по всему играют важную роль в поддержании правильной структуры
мономеров и в образовании межсубъединичных контактов в составе димера. Вероятно,
именно поэтому точечные мутации консервативных остатков, расположенных в составе
этих участков столь драматично влияют на структуру и свойства малых белков теплового
шока. Рассмотрим более подробно роль этого участка в формировании структуры малых
белков теплового шока.
1.6. Роль петли, соединяющей пятую и седьмую β-складки,
во взаимодействии мономеров sHsp
Как уже отмечалось в петле, соединяющей пятую и седьмую β-складки, малых
белков теплового шока из T. aestivum и M. jannaschii располагается короткая шестая βскладка, которая формирует контакт со второй β-складкой соседнего мономера. Наличие
данной складки усиливает взаимодействие между мономерами, входящими в состав
одного димера (Kim et al., 1998; van Montfort et al., 2001). В Tsp36 из паразитического
червя Taenia saginata шестая β-складка отсутствует, но, тем не менее, петля β5-β7 также
участвует в формировании димеров этого белка. Установлено, что в окислительных
условиях остаток цистеина, располагающийся в данной петле, образует дисульфидную
связь с аналогичным остатком в другом мономере Tsp36 (Stamler et al., 2005).
20
Hsp27
CryAA
CRYAB
HSP20
Hsp22
:
:
:
:
:
*
20
*
40
*
60
*
MTERRVPF--SLLRGPSWDPFRDWYPHSRLFDQAFGLPRLPEEWSQWLGGSSWPGYVRPLPPAAIESPAVAAP
---MDVTIQHPWFKRTLG-P---FY-PSRLFDQFFGEGLFEYDLLPFLSSTISPYYRQ----SLFR--TV-----MDIAIHHPWIRRPFF-P---FHSPSRLFDQFFGEHLLESDLFP-TSTSLSPFYLRP--PSFLRAPSW---MEIPVPVQPSWLRRASA-PLPGLSAPGRLFDQRFGEGLLEAELAALCPTTLAPYYLRA--PSVALP-----MADGQMPFSCHYPSRLRRDPFRDSPLSSRLLDDGFGMDPFPDDLTASWPDWALPR-LSSAWPGTLRSGMVPRG
6
r
P
sRLfDq FG
l
P y
p
:
:
:
:
:
71
56
60
63
72
Hsp27
CryAA
CRYAB
HSP20
Hsp22
:
:
:
:
:
80
*
100
*
120
*
140
AYSRALSRQLSSGVSEIRHTADRWRVSLDVNHFAPDELTVKTKDGVVEITGKHEERQDEHGYISRCFTRKYTL
---------LDSGISEVRSDRDKFVIFLDVKHFSPEDLTVKVQDDFVEIHGKHNERQDDHGYISREFHRRYRL
---------FDTGLSEMRLEKDRFSVNLDVKHFSPEELKVKVLGDVIEVHGKHEERQDEHGFISREFHRKYRI
-------------VAQVPTDPGHFSVLLDVKHFSPEEIAVKVVGEHVEVHARHEERPDEHGFVAREFHRRYRL
PTATARFGVPAEGRTPPPFPGEPWKVCVNVHSFKPEELMVKTKDGYVEVSGKHEEKQQEGGIVSKNFTKKIQL
g
5 6 61V hF Pee6 VK
6E6 g4HeE4qdehG 6s4 F 44y 6
:
:
:
:
:
144
120
124
123
145
Hsp27
CryAA
CRYAB
HSP20
Hsp22
:
:
:
:
:
*
160
*
180
*
200
*
PPGVDPTQVSSSLSPEGTLTVEAPM--PKLA--TQSNEITIPVTFES---RAQLGGPEAAKSDETAAK
PSNVDQSALSCSLSADGMLTFCGPK--IQTGLDATHAERAIPVSREE---K-----P--TSAPSS--PADVDPLTITSSLSSDGVLTVNGPR--KQV----SGPERTIPITREE---K-----PAVTAAPKK--PPGVDPAAVTSALSPEGVLSI-----------------QAAPASAQA---P-----PP--AAAK---PAEVDPVTVFASLSPEGLLIIEAPQVPPYSTFGESSFNNELPQDSQEVTCT----------------P VDp 6 sLS G L
p
P
2
p
:
:
:
:
:
205
173
175
160
196
Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Hsp27,
αA-, αB-кристаллинов, Hsp20 и Hsp22 человека. Выравнивание выполнено в программе
GeneDoc (используется алгоритм ClustalW). Белыми буквами на черном фоне обозначены
остатки, консервативные во всех белках, белыми буквами на темно-сером фоне – остатки,
консервативные в четырех белках, черными буквами на светло-сером фоне – остатки,
консервативные в трех белках. Красным выделен Cys137 Hsp27 и остатки других белков,
находящихся в положении, гомологичном Cys137 Hsp27 (см. текст). Желтые стрелки
обозначают положение пятой и седьмой β-складок, которое было предсказано в
программе SwissModel на основе структуры Tsp36 (код в базе данных PDB – 2bol).
В малых белках теплового шока человека участок, гомологичный шестой β-складке
полностью отсутствует, а петля, соединяющая пятую и шестую β-складки, заметно
укорочена. Тем не менее, эта петля, по всей видимости, принимает участие в димеризации
и, возможно, олигомеризации, а также существенна для проявления шаперонной
активности sHsp человека. По данным Шрилакшми и соавт. (Sreelakshmi et al., 2004)
остатки 88-123 участвуют в межсубъединичных контактах αB-кристаллина, а пептид,
содержащий в своем составе остатки 113-120, участвует во взаимодействии αВкристаллина с некоторыми белками-субстратами и регуляторными белками (Ghosh et al.,
2005; Ghosh et al., 2007). Таким образом, эта петля и прилегающие к ней участки
структуры играют важную роль как в межсубъединичных взаимодействиях, так и во
взаимодействии sHsp с белками-партнерами.
Петля, соединяющая пятую и седьмую β-складки различных малых белков теплового
шока человека, достаточно консервативна (рис. 3). Однако в составе этой петли есть в
высшей степени консервативные остатки (остатки аргинина, гомологичные R120 αBкристаллина, остатки фенилаланина, гомологичные F118 αB-кристаллина), а также менее
консервативные остатки, сохраняющиеся в структуре не всех, а только некоторых малых
белков теплового шока. Наше внимание привлек низко консервативный остаток Сys137
21
Hsp27. Этот остаток располагается на границе между петлей и седьмой β-складкой (см.
рис. 3). Ранее (Zavialov et al., 1998a) было установлено, что в отсутствие
восстанавливающих агентов в олигомерах Hsp25 (малый белок теплового шока мыши,
гомологичный Hsp27 человека) становится возможным образование межмолекулярной
дисульфидной связи и при этом образование такой связи не приводит к существенным
изменениям в структуре белка. Следует отметить, что этот единственный остаток
цистеина Hsp27 может подвергаться S-тиолированию, а это означает, что он располагается
на поверхности белковой глобулы и доступен для небольших молекул тиолов (Eaton et al.,
2002; Zavialov et al., 1998b). Таким образом, Cys137 Hsp27 располагается в
непосредственной близости от участка, играющего важную роль во взаимодействии
мономеров малых белков теплового шока и в проявлении их шапероноподобной
активности. В то же время этот остаток располагается на поверхности молекулы белка и
не консервативен, как многие другие остатки (например, положение гомологичное R120
αB-кристаллина, см рис. 3). Мы предположили, что введение остатков цистеина в
структуру малых белков теплового шока в положение, гомологичное Cуs137 Hsp27 не
приведет к драматическим изменениям структуры и одновременно с этим позволит
получить
белки,
обладающие
удобной
«якорной»
площадкой
для
химической
модификации и для проведения различных манипуляций, направленных на исследование
структуры, свойств и взаимодействия представителей этого класса белков. Осуществление
этого плана возможно только в том случае, если в составе sHsp будет только один остаток
цистеина в положении, гомологичном Cys137 Hsp27. Таким образом, для реализации
нашего плана необходимо было заменить все имеющиеся в структуре малых белков
теплового шока остатки цистеина на остатки серина и ввести в структуру исследуемых
белков единственный остаток цистеина в положение, представляющее для нас особый
интерес.
22
2.
Цели и задачи исследования
Целью нашего исследования являлось изучение белок-белковых взаимодействий
различных малых белков теплового шока дикого типа и так называемых «цистеиновых»
мутантов, содержащих единственный остаток цистеина в положении, гомологичном
Cys137 Hsp27. В качестве таких «цистеиновых» мутантов предполагалось использовать
мутант αВ-кристаллина с точечной мутацией E117C (αB-CryCys), двойной мутант Hsp20 с
заменами C46S, E116C (Hsp20Cys) и сложный мутант Hsp22, в котором три остатка Cys
(C10, C99 и C195) были заменены на остатки серина и введен единственный остаток
цистеина в положение 138 (Hsp22Cys или Hsp22 4x).
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1.
Получить высокоочищенные препараты малых белков теплового шока дикого
типа и их «цистеиновых» мутантов;
2.
Сравнить свойства αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22 дикого типа и их
«цистеиновых» мутантов;
3.
Исследовать образование дисульфидных связей между мономерами малых
белков теплового шока при образовании гомо- и гетероолигомеров.
23
3.
Материалы и методы
3.1. Выделение и очистка малых белков теплового шока
(sHsp) человека
3.1.1. Препаративная экспрессия
Клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидами pET23b, содержащими
полноразмерную копию гена Hsp20WT, полноразмерную копию гена Hsp20Cys или
полноразмерную копию гена αB-CryCys. Трансформированные клетки переносили в 20 мл
однократной среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили ночь на качалке
при перемешивании (100 об/мин) при 30°С. Полученные культуры переносили в
трехкратную среду LB объемом около 750 мл, инкубировали 8 ч при 37°С и ночь при
30°С. Клетки осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 6300g, суспендировали
в 40 мл лизис-буфера (50 мМ трис-HCl, pH 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 14 мМ βмеркаптоэтанол, 0,5 мМ ФМСФ) и хранили при -20° С.
3.1.2. Выделение и очистка Hsp20 дикого типа (Hsp20WT)
Схематично этапы выделения представлены на рис. 4.
Суспензию клеток лизировали лизоцимом (конечная концентрация лизоцима 0,06
мг/мл) 30 мин на льду, а затем инкубировали их с ДНКазой I (конечная концентрация 3
мкг/мл) 15 мин при комнатной температуре. Далее дважды по 30 с обрабатывали
суспензию на ультразвуковом дезинтеграторе Branson S250D (выходная мощность 20%) и
центрифугировали 15 мин при 23700g. Отбирали супернатант, а осадок суспендировали в
25 мл лизис-буфера и процедуру экстракции, начиная с обработки ультразвуком,
повторяли дважды. Супернатанты (S1-S3) после всех экстракций объединяли, добавляли
(NH4)2SO4 до степени насыщения 30% и оставляли на 1 ч при 4° С для формирования
осадка. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 23700g, осадок растворяли
в 14 мл буфера В (МЭ) (20 мМ трис-ацетат, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 15 мМ βмеркаптоэтанол, 0,1 мМ ФМСФ) и диализовали против 2 л такого же буфера в течение
ночи.
24
Суспензия клеток в лизис-буфере
Обработка лизоцимом и ДНКазой
Обработка УЗ
Центрифугирование 15 мин при 23700g
P1
Обработка УЗ
Центрифугирование 20 мин при 23700g
P2
Обработка УЗ
Центрифугирование 20 мин при 23700g
S1
S2
S3
Высаливание (NH4)2SO4 до ст. нас 30%
центрифугирование
P.CA
S.CA
Диализ, ионообменная хроматография
Гидрофобная хроматография
Рис. 4. Схема выделения и очистки Hsp20WT.
25
P3
Частично очищенный препарат Hsp20WT, полученный на предыдущем этапе,
разводили буфером В до 40 мл, центрифугировали 30 мин при 105000g, отбирали
супернатант, разводили его буфером В (МЭ) до 80 мл и порциями по 20 мл наносили на
колонку HiTrapQ 5 ml (Amersham Biosciences), предварительно уравновешенную буфером
В (МЭ) (скорость нанесения и элюции 3 мл/мин). После нанесения колонку промывали 20
мл (4 объема колонки) буфера B (МЭ), элюцию проводили линейным градиентом NaCl от
10 до 360 мМ в 60 мл (12 объемов колонки) буфера В (МЭ). Собранные фракции (объемом
2 мл) анализировали при помощи электрофореза по методу Лэммли (Практикум по
биохимии, 1989). Фракции, содержащие по результатам электрофореза наибольшее
количество Hsp20WT, объединяли.
Следующим этапом очистки была гидрофобная хроматография на колонке Phenyl HP
HiTrap объемом 5 мл. Эту колонку уравновешивали буфером В (МЭ, рН 8,0), содержащим
0,3 М (NH4)2SO4. К препарату белка, полученному после ионообменной хроматографии
(объем ~100 мл), добавляли (NH4)2SO4 до концентрации 0,3 М и порциями по 50 мл
наносили на колонку. Промывали колонку 20 мл буфера уравновешивания, элюцию
проводили градиентом (NH4)2SO4. При этом сначала концентрация сульфата аммония в
элюирующем буфере уменьшалась с 300 до 15 мМ (объем этой части градиента 35 мл, 7
объемов колонки), а затем с 15 до 0 мМ сульфата аммония (объем этой части градиента 50
мл, 10 объемов колонки). Скорость нанесения и элюции составляла 1,5 мл/мин. При
проведении хроматографии собирали фракции объемом 1 мл и анализировали их
белковый состав с помощью электрофореза по методу Лэммли (Практикум по биохимии,
1989). Фракции, содержащие наибольшие количества высокоочищенного белка, (около 80
мл) собирали, концентрировали с помощью ультрафильтрации и диализовали в течение
ночи против 2 л буфера B (20 мМ трис-ацетат, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ
ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ). Полученный диализат концентрировали еще раз (до конечного
объема 5 мл) и вновь диализовали против 1 л такого же буфера 5 ч.
3.1.3. Выделение и очистка мутанта Hsp20 с заменами C46S/E116C
(Hsp20Cys)
Процедуры выделения и очистки Hsp20Cys аналогичны таковым для Hsp20WT. В
отличие от Hsp20WT, при выделении Hsp20Cys экстракцию белков из разрушенных
клеток проводили дважды.
26
3.1.4. Выделение и очистка αВ-кристаллина с точечной мутацией
E117C (αB-CryCys)
Схематично этапы выделения представлены на рис. 5.
Клетки E. coli разрушали, как это описано в предыдущем разделе. Нерастворимые
фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 23700g в течение 20 мин. К
супернатанту (S1) добавляли (NH4)2SO4 до степени насыщения 40% и оставляли при +4°С
на 80 мин для формирования осадка. Осадок (P1) суспендировали в 30 мл лизис-буфера,
обрабатывали ультразвуком (2 раза по 1 мин при мощности 15%) и центрифугировали при
тех же условиях. К полученному супернатанту (S2) также добавляли (NH4)2SO4 до степени
насыщения 40% и оставляли при +4°С на 60 мин. Осадок отделяли центрифугированием
при 23700g в течение 20 мин. В связи с тем, что осадок, полученный после второго
высаливания, содержал незначительные количества белка, для дальнейшего выделения
αB-CryCys использовали осадок, полученный после первого высаливания S1 (P1.CA).
Осадок растворяли в 21 мл буфера В (МЭ) и диализовали против 2 л этого же буфера в
течение ночи.
Полученный диализат разбавляли буфером В (МЭ) до 40 мл, центрифугировали 30
мин при 105000g. Супернатант разбавляли до 80 мл буфером В (МЭ) и частями по 20 мл
наносили на предварительно уравновешенную буфером В (МЭ) колонку HiTrapQ 5 ml
(Amersham Biosciences). После нанесения белка колонку промывали 4 объемами буфера В
(МЭ). Сорбировавшиеся на колонке белки элюировали линейным градиентом NaCl от 0 до
0,5 М в 60 мл элюирующего буфера при этом скорость нанесения и элюции составляла 3
мл/мин. Белковый состав фракций (1 мл) анализировали при помощи электрофореза по
методу Лэммли (Практикум по биохимии, 1989). Фракции, содержащие наибольшее
количество αB-CryCys, объединили.
Следующим этапом очистки была гель-фильтрация на колонке HiLoad 26/60
Superdex-200 (Amersham Biosciences). Для этого полученный ранее препарат (объем 65 мл)
концентрировали до 8 мл и подвергали хроматографии на колонке, уравновешенной 20
мМ трис-ацетат, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 15 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ
ФМСФ. Процедуру хроматографии проводили дважды, каждый раз нанося на колонку по
4 мл образца. Скорость элюции составляла 2 мл/мин. Фракции (по 3 мл), содержавшие
высокоочищенный αB-CryCys, объединяли. Полученный высокоочищенный препарат
(объем 66 мл) концентрировали до 26 мл и диализовали 15 часов против 2 л буфера В.
27
Суспензия клеток в лизис-буфере
Обработка лизоцимом и ДНКазой
Обработка УЗ
Центрифугирование 20 мин при 23700g
P1
Обработка УЗ
Центрифугирование 20 мин при 23700g
S1
S2
P2
Высаливание (NH4)2SO4 до ст. нас 40%
центрифугирование
P1.CA
S1.CA
P2.CA
S2.CA
Диализ, ионообменная хроматография
Рехроматография
Гель-фильтрация
Рис. 5. Схема выделения и очистки αB-CryCys.
28
Суспензия клеток в лизис-буфере
Обработка лизоцимом и ДНКазой
Обработка УЗ
Центрифугирование 15 мин при 23700g
P1
Обработка УЗ
Центрифугирование 20 мин при 23700g
S1
S2
P2
Высаливание (NH4)2SO4 до ст. нас 30%
центрифугирование
P.CA
S.CA
Диализ, гидрофобная хроматография
Гель-фильтрация
Рис. 6. Схема выделения и очистки Hsp22Cys.
29
3.1.5. Выделение и очистка Hsp22 с мутированными остатками
C10S/C99S/N138C/C195S (Hsp22Cys)
Замороженная суспензия клеток E. coli, в которых проводилась экспрессия белка
Hsp22Cys (Hsp22 дикого типа с заменами С10S/C99S/N138C/C195S), была любезно
предоставлена аспирантом А. А. Шеметовым.
Схематично этапы выделения и очистки представлены на рис. 6. Клетки E. coli
разрушали так, как это описано в процедуре выделения Hsp20. Нерастворимые фрагменты
клеток осаждали центрифугированием при 23700g в течение 20 мин, осадок подвергали
повторной экстракции. Супернатанты после первой (S1) и второй (S2) экстракции
объединяли, добавляли (NH4)2SO4 до степени насыщения 30% и оставляли при +4° С на 20
мин для формирования осадка. Полученную суспензию центрифугировали 20 мин при
23700g, осадок растворяли в 11 мл буфера В (МЭ, рН 8,0) и диализовали против 2 л такого
же буфера в течение ночи.
Препарат, полученный на предыдущей стадии, далее очищали методом гидрофобной
хроматографии на колонке PhenylHP HiTrap 5 ml (Amersham Biosciences). После диализа
препарат разводили до 40 мл буфером В (МЭ, рН 8,0) и центрифугировали при 105000g 15
мин. Супернатант разводили до 80 мл буфером В (МЭ, pH 8,0), добавляли (NH4)2SO4 до
конечной концентрации 0,3 М и частями по 20 мл наносили на колонку PhenylHP HiTrap,
предварительно уравновешенную буфером В (МЭ, рН 8,0), содержащим 0,3 М (NH4)2SO4.
Условия хроматографии были аналогичны условиям при очистке Hsp20WT. После
нанесения образца колонку промывали 4 объемами буфера уравновешивания (буфер В
(МЭ), содержащий 0,3 М сульфата аммония). Далее белки элюировали буфером с
уменьшающейся концентрацией сульфата аммония. При этом на первом участке
градиента (7 объемов колонки) концентрация сульфата аммония уменьшалась с 300 до 15
мМ, а на втором участке градиента (10 объемов колонки) концентрация сульфата аммония
уменьшалась с 15 до 0 мМ. Полученный на этой стадии препарат (объем 135 мл)
концентрировали до 11 мл методом ультрафильтрации и подвергали гель-фильтрации на
колонке Superdex-200 HiLoad 26/60 в условиях, аналогичных очистке αB-CryCys. При
этом в качестве буфера уравновешивания использовали 20 мМ трис-ацетат, рН 8,0, 150
мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ ФМСФ, 15 мМ β-меркаптоэтанол. Для того чтобы
избежать перегрузки, хроматографию на Superdex-200 проводили дважды, каждый раз
нанося на колонку по 5-6 мл образца.
Высокоочищенный препарат Hsp22Cys (объем 60 мл) концентрировали до 30 мл и
диализовали против 2 л буфера В в течение ночи, затем концентрировали до 4 мл и еще
раз диализовали 4 ч против 1 л такого же буфера.
30
3.1.6. Получение препаратов других sHsp дикого типа
Препарат Hsp27 и αB-кристаллина дикого типа был получен и любезно предоставлен
кандидатом биологических наук О.В. Букач, препарат Hsp22 дикого типа был получен и
любезно предоставлен аспирантом А.А. Шеметовым.
3.2. Сравнение структуры и свойств малых белков
теплового шока дикого типа и их «цистеиновых»
мутантов
Прежде чем приступить к исследованию взаимодействия между «цистеиновыми»
мутантами малых белков теплового шока, необходимо было показать, что мутантные
белки имеют такую же структуру, как и белки дикого типа. Для решения этой задачи мы
сравнивали вторичную и третичную структуру, а также гидрофобные свойства,
олигомерное состояние и
шаперонную
активность
белков дикого
типа и
их
«цистеиновых» мутантов.
Используемые белки как дикого типа, так и их «цистеиновые» мутанты,
предварительно восстанавливали в буфере В, содержащем 15 мМ ДТТ, при 37° С в
течение 30 мин.
3.2.1. Сравнение
дихроизма
вторичной
структуры
методом
кругового
Основными элементами вторичной структуры белков являются α-спирали, βскладки, повороты и неупорядоченные структуры. Эти структуры различаются по
поглощению лево- и правоциркулярно-поляризованного света, т.е. обладают так
называемым круговым дихроизмом. Полностью α-спиральные белки обладают наиболее
выраженным спектром кругового дихроима с отрицательным максимумом при 222 нм. В
то же время, спектры КД модельных белков, обладающих полностью β-складчатой или
неупорядоченной структурой имеют значительно меньшую амплитуду, отрицательный
максимум у β-складчатых белков находится при 217 нм, а у неупорядоченных при 198 нм
(Болотина, 1973). Однако, в природе не существует белков, состоящих только из какоголибо
одного
элемента
вторичной
структуры,
поэтому
спектр
КД
в
дальней
ультрафиолетовой области нативных белков обычно представляет собой сумму спектров,
31
характерных для различных элементов вторичной структуры, входящих в состав этих
белков.
К настоящему времени разработано множество программ, позволяющих на
основании спектров КД белков определять (или предсказывать) соотношение элементов
вторичной структуры. Одним из широко используемых пакетов программ для обработки
спектров КД является CDPro (Sreerama and Woody, 2000), который доступен на сайте
http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro. В состав этого пакета входят три программы:
CONTIN/LL, SELCON3 и CDSSTR. Первая программа лучше рассчитывает содержание
элементов вторичной структуры на основе спектров, регистрируемых в сравнительно
узкой области спектра (190 – 240 нм) с большим набором модельных белков, а последняя
программа дает более достоверные данные при работе с небольшим набором модельных
белков, но в широком диапазоне длин волн (от 178 до 260 нм) (Sreerama and Woody, 2000).
Образцы αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22 дикого типа и их «цистеиновых» мутантов
предварительно восстанавливали в буфере В, содержащем 15 мМ ДТТ. Обычно
восстановление проводили в пробе объемом 0,3 – 0,5 мл, при концентрации белка около 1
мг/мл. Восстановленные таким образом белки диализовали против 50 мМ КН2РО4, рН 7,5,
150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ в течение ночи при 4° С. После диализа определяли
концентрацию каждого из белков в пробе, регистрируя спектр поглощения в интервале
240-340 нм и рассчитывая концентрацию белка с использованием коэффициентов
поглощения при 280 нм, взятых из базы данных SwissProt (см. ниже). В случае если
концентрации белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов различались, проводили
разведение таким образом, чтобы концентрация белков во всех пробах была одинаковой.
Регистрацию спектров КД производили на приборе Chirascan Circular Dichroism
Spectrometer (Applied Photophysics) в диапазоне от 195 до 260 нм с шагом 0,5 нм, длина
оптического пути составляла 0,2 мм, в качестве контроля использовали 50 мМ КН2РО4, рН
7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ. Каждый спектр снимали трижды, полученные данные
усредняли и сглаживали в программе Chirascan. При измерении спектров КД
концентрация белков составляла 1,17 мг/мл для αB-CryWT и αB-CryCys, 0,95 мг/мл для
Hsp22WT и Hsp22Cys, 1,16 мг/мл для Hsp20WT и Hsp20Cys.
При измерении спектров КД окисленных «цистеиновых» мутантов αB-кристаллина,
Hsp20 и Hsp22 белки предварительно восстанавливали, как это было описано выше. В
ходе реакции восстановления объем пробы составлял 300 мкл, а конечная концентрация
белка составляла 1 мг/мл. Полученные таким образом образцы диализовали против 1 л
модифицированного буфера А (10 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ
ФМСФ) в течение ночи при 37°С. Аналогичный буфер использовали в качестве контроля.
Степень «сшивания» «цистеиновых» мутантов sHsp определяли с помощью метода
32
электрофореза по Лэммли (Практикум по биохимии, 1989) без добавления βмеркаптоэтанола в буфер для образцов.
Расчет соотношения элементов вторичной структуры на основании полученных
спектров КД проводили с помощью пакета программ CDPro (Sreerama and Woody, 2000).
При этом использовали набор модельных белков №1 (SP29, состоящий из 29 реперных
белков-стандартов), и для расчета использовали данные полученные в интервале 195-260
нм с шагом 1 нм.
3.2.2. Исследование третичной структуры методом собственной
триптофановой флуоресценции
Согласно
модели
дискретных
состояний
остатков
триптофана
в
белках,
предложенной Бурштейном в 70-х годах ХХ-го века, существует как минимум пять
спектральных форм остатков триптофана (рис. 7).
Спектральная форма А соответствует излучению невозмущенного индольного
хромофора в нейтральном гидрофобном окружении. Главный максимум этой формы
находится при 306,5 нм.
Спектральные формы S и I соответствуют излучению индольных остатков,
расположенных внутри белковой глобулы поблизости от полярных белковых групп.
Максимумы флуоресценции этих форм приходятся на 316-317 нм и 330-332 нм,
соответственно.
К спектральной форме II относятся триптофанилы, располагающиеся на поверхности
белковой глобулы и контактирующие с молекулами связанной воды. Эта форма имеет
максимум флуоресценции при 340-342 нм.
Спектральная
форма
III
соответствует
излучению
индольного
хромофора,
локализованного на поверхности белка в контакте с молекулами свободной воды.
Помимо пяти перечисленных, возможны и промежуточные варианты локализации
триптофановых остатков в молекуле белка (цит. по Пермяков, 2003).
33
Флуоресценция
A
100
S
I
II
III
80
60
40
20
0
280
300
320
340
360
380
400
Длина волны, нм
Рис. 7. Нормированные спектры флуоресценции остатков триптофана, относящихся
к пяти различным спектральным классам (Пермяков, 2003).
Таким образом, форма спектра собственной триптофановой флуоресценции белков
зависит от соотношения спектральных классов в исследуемом белке, которое, в свою
очередь, зависит от окружения остатков триптофана. При изменении третичной
структуры, по крайней мере, в окружении индольных хромофоров будет происходить
изменение формы спектров триптофановой флуоресценции. Поэтому мы использовали
данный метод для сравнения третичной структуры малых белков теплового шока дикого
типа и их «цистеиновых» мутантов.
Перед измерением собственной триптофановой флуоресценции малые белки
теплового шока восстанавливали, как это было описано выше. Затем разводили буфером
В до конечной концентрации 0,07-0,08 мг/мл и регистрировали спектр флуоресценции от
300 до 400 нм при возбуждении светом с длиной волны 295 нм на спектрофлуориметре
VARIANTM CaryEclipse. Все измерения проводили при 25° С, напряжении на ФЭУ, равном
600 В, и ширине щелей обоих монохроматоров 5 нм. Интенсивность флуоресценции в
максимуме
принимали
за
100%
и
таким
нормированные спектры флуоресценции.
34
образом
получали
так
называемые
3.2.3. Исследование гидрофобных свойств с помощью зонда bisANS
Использование ANS как зонда для изучения поверхности мембран и белков началось
еще в середине ХХ-го века и до настоящего времени это соединение и его производные
широко используются для подобных целей. Характерным свойством ANS и его
производных является резкое увеличение квантового выхода флуоресценции при
попадании в гидрофобную среду, либо в жесткое окружение, в которых подвижность
молекулы ANS оказывается ограниченной (Haugland, 1996; Slavik, 1982). Большинство
белков имеют один или два участка специфического связывания ANS, в то же время
некоторые белки практически не связывают этот гидрофобный зонд. Широко
распространено мнение, что ANS связывается с гидрофобными участками на поверхности
белка. Но, по всей видимости, это соединение может также взаимодействовать с
полярными участками, и, если при этом молекула попадает в жесткое окружение, то также
происходит резкое увеличение квантового выхода флуоресценции. Кроме участков с
высоким сродством к ANS в белке может присутствовать множество участков,
обладающих низким сродством. Молекулы ANS, связанные с такими участками, будут
иметь низкий квантовый выход и короткое время жизни флуоресценции (Slavik, 1982).
Если связанные молекулы ANS будут располагаться поблизости с остатками триптофана
белка (на расстоянии от 1,6 до 2,7 нм), то при возбуждении остатков триптофана будет
наблюдаться перенос энергии (FRET) на ANS (Slavik, 1982).
Исходя из вышесказанного, однозначная интерпретация данных по связыванию ANS
и его производных разными белками кажется весьма затруднительной, тем не менее,
существует ряд моделей, позволяющих рассчитывать количество участков связывания
ANS, либо кажущуюся константу связывания. Согласно одной из моделей, в которой
предполагается наличие в белке нескольких не влияющих друг на друга центров
связывания с одинаковым сродством, зависимость флуоресценции ANS (или его
производных) от суммарной концентрации зонда выглядит следующим образом:
F = Fmax(((N+C+K)/2*N)-(((N+C+K)/2*N)2 – C/N)0,5),
где F и Fmax – флуоресценции при определенной концентрации ANS и максимальная
флуоресценция, соответственно, N – концентрация центров связывания в µM, K –
кажущаяся константа диссоциации в µM, а С – суммарная концентрация ANS в µM.
Измеряя зависимость флуоресценции ANS от его концентрации при определенном
количестве белка с помощью представленного уравнения, можно определить количество
35
центров связывания и кажущуюся константу связывания. В том случае, если в белке
кроме высокоаффинных центров имеется несколько участков связывания с невысоким
сродством к ANS, то предложенная модель усложняется добавлением линейного члена:
F = Fmax(((N+C+K)/2*N)-(((N+C+K)/2*N)2 – C/N)0,5) + a*C,
где а – кажущаяся константа диссоциации для участков, имеющих низкое сродство к ANS
(цит. по Казаков, 2006).
O
-
NH
O
NH
O
S
S
O
O
O
-
Рис. 8. Структура bis-ANS.
В нашей работе использовалось производное ANS – bis-ANS (рис. 8). К пробе
объемом 0,6 мл, содержащей белок в концентрации 0,7 – 1,0 µМ в расчете на мономер в
буфере Ф (50 мМ KH2PO4, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ), порциями по 2-3 мкл
добавляли 190 или 240 µМ раствор bis-ANS до максимальной концентрации bis-ANS,
равной 8-9 µМ. Через 1 мин после каждой добавки записывали спектр флуоресценции в
интервале от 300 до 600 нм при возбуждении светом с длиной волны 295 нм
(избирательное
возбуждение
остатков
триптофана).
В
ряде
опытов
измеряли
интенсивность флуоресценции при следующих значениях длин волн возбуждающего (λex)
и испускаемого (λem) света: 1) λex=295 нм, λem=340 нм, 2) λex=295 нм, λem=495 нм и 3)
λex=385 нм, λem=495 нм. Измерение флуоресценции производили на спектрофлуориметре
VARIANTM CaryEclipse при 25° С, напряжении на ФЭУ 700 В и ширине щелей обоих
монохроматоров 5 нм.
36
3.2.4. Исследование
фильтрации
олигомерного
состояния
методом
гель-
В основе гель-фильтрации, как и любого другого хроматографического метода,
лежит принцип распределения молекул между подвижной и неподвижной фазами. В гельфильтрации неподвижной фазой является раствор, находящийся внутри гранул сорбента, а
подвижной – элюирующая жидкость. Крупные молекулы не способны проникать внутрь
гранул, поэтому они движутся вместе с элюентом, для них коэффициент распределения
(отношение количества вещества в неподвижной фазе к количеству вещества в подвижной
фазе) равен 0. Более мелкие молекулы проникают через поры в гранулы, и для них
коэффициент распределения принимает значения от 0 до 1. Чем меньше молекулы, тем
они дольше задерживаются в неподвижной фазе, и, следовательно, имеют больший объем
элюции (Остерман, 1985). Причем объем элюции зависит как от молекулярной массы, так
и от формы разделяемых молекул.
Гель-фильтрацию проводили на колонках Superdex-200 HR10/30 или Superdex-75
HR10/30. В качестве элюирующего буфера использовали буфер, содержащий 20 мM трисацетат, pH 7,6, 150 мM NaCl, 0,1 мM ЭДТА, 15 мM β-меркаптоэтанол, 0,1 мM ФМСФ,
либо этот же буфер без добавления β-меркаптоэтанола (при определении олигомерного
состояния окисленных белков). На колонку наносили от 14 до 56 мкг белка при гельфильтрации Hsp20 и Hsp22 дикого типа и их «цистеиновых» мутантов или от 20 до 280
мкг – при гель-фильтрации αB-CryWT и αB-CryCys. При сравнении «цистеиновых»
мутантов в восстановленном и окисленном состоянии на колонку наносили по 150 мкг
белка. Скорость элюции составляла 0,5 мл/мин, в отдельных случаях собирали фракции
объемом 0,4 мл и анализировали методом SDS-электрофореза в полиакриламидном геле
(Практикум по биохимии, 1989) с последующим окрашиванием гелей серебром (см.
раздел 3.5.4.).
3.2.5. Измерение
теплового шока
шаперонной
активности
малых
белков
Считается, что мерилом шапероноподобной активности является способность малых
белков теплового шока препятствовать или замедлять процесс агрегации частично или
полностью денатурированных белков. Обычно за процессом агрегации следят по
увеличению светорассеяния или по кажущемуся увеличению поглощения при 340, либо
при 360 нм. Для определения шаперонной активности исследуемых sHsp и сравнения
37
активности белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов мы использовали в качестве
модельного субстрата инсулин быка (Sigma).
Белки в концентрации 0,84 мг/мл предварительно восстанавливали в буфере В,
содержащем 5 мМ ДТТ. Раствор инсулина (4-6 мг/мл) в 2,5%-ной уксусной кислоте
готовили заранее и хранили при 4° С. Перед использованием препарат инсулина
центрифугировали и определяли концентрацию спектрофотометрически, поглощение
раствора инсулина с концентрацией 1 мг/мл считали равным 1,09 (при длине оптического
пути 1 см). Среда агрегации содержала 120 мкл буфера агрегации (100 мМ KH2PO4, 100
мМ NaCl, pH 9,0), 100 мкл буфера В (20 мМ трис-ацетат, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ
ЭДТА, 1,0 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ), 10 мкл раствора инсулина (конечная концентрация
около 0,2 мг/мл) и 20 мкл 0,3 М ДТТ (конечная концентрация 24 мМ). Общий объем
пробы составлял 250 мкл, агрегацию инициировали добавлением 0,3 М ДТТ (агрегация В
цепи становится возможной после разрушения
дисульфидных связей инсулина).
Кинетику агрегации измеряли при 37° С в отсутствие или в присутствии sHsp при
соотношениях sHsp : инсулин, равных 1:1 и 1:2 (по массе). Изменение оптической
плотности при 340 нм непрерывно регистрировали в течение 45-50 минут после
добавления ДТТ. Все измерения проводили на спектрофотометре Ultrospec 3100 Pro
(Amersham Biosciences).
3.3.
Исследование белок-белковых взаимодействий в
гомоолигомерах «цистеиновых» мутантов sHsp
человека
Завьяловым и соавторами (Zavialov et al., 1998a) было показано, что при диализе
против раствора, не содержащего восстановителей и ЭДТА, Hsp25 мыши и Hsp27
человека способны образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики. Мы
предположили, что полученные «цистеиновые» мутанты αВ-кристаллина, Hsp20 и Hsp22,
содержащие единственный остаток цистеина в положении, гомологичном Cys137 Hsp27
человека, также окажутся способными образовывать межмолекулярные дисульфидные
мостики в составе гомоолигомеров.
Для проверки этой гипотезы предварительно восстановленные образцы αВкристаллина, Hsp20, Hsp22 дикого типа и их «цистеиновых» мутантов, а также Hsp27WT
объемом 200 или 250 мкл в буфере В, содержащем 15 мМ ДТТ, с концентрацией белка 1,0
мг/мл диализовали против 1 л буфера А (50 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2,
0,1 мМ ФМСФ) при комнатной температуре в течение ночи. Для подбора оптимальных
условий для образования дисульфидных связей диализ проводили при 37°С или при 42°С.
38
Состояние белков до и после диализа анализировали методом электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Практикум по биохимии,
1989) либо в отсутствие β-меркаптоэтанола, либо с добавлением β-меркаптоэтанола в
буфер для образцов до конечной концентрации 5%.
3.4.
Исследование белок-белковых взаимодействий в
гетероолигомерах «цистеиновых» мутантов sHsp
человека
Мы использовали полученные нами «цистеиновые» мутанты малых белков
теплового шока и Hsp27WT для изучения белок-белковых взаимодействий в составе
гетероолигомерных комплексов. При этом мы предполагали, что введенный генноинженерными методами остаток цистеина будет образовывать дисульфидные связи между
различными белками только в том случае, если эти белки способны образовывать
гетеродимеры или гетероолигомеры. Для получения устойчивых гетероолигомерных
комплексов малых белков теплового шока предварительно восстановленные белки
(Hsp20Cys, αB-CryCys, Hsp22Cys или Hsp27WT) попарно смешивали в молярном
соотношении 1:1, при конечной концентрации белков, равной 50 µМ в расчете на
мономер. Полученные смеси инкубировали в буфере В, содержащем 15 мМ ДТТ, в
течение 1 часа при 42° С. Такой режим инкубации был выбран потому, что ранее в нашей
лаборатории было установлено, что в этих условиях достигается эффективное
образование гетероолигомерных комплексов Hsp27 и Hsp20 дикого типа (Bukach et al.,
2009). Затем полученные образцы белков диализовали против буфера А в течение ночи
при 4° С. Наличие гетеродимеров sHsp, «сшитых» дисульфидной связью, детектировали
методом SDS-электрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ (Walker, 2002) без добавления
β-меркаптоэтанола в буфер для образцов.
3.5.
Некоторые аналитические методы
3.5.1. SDS-электрофорез по методу Лэммли
Для анализа состава различных фракций использовали SDS-электрофорез по
методу Лэммли (Практикум по биохимии, 1989). В работе использовали 15%
разделяющий и 4% концентрирующий ПААГ. В качестве маркеров использовали
39
следующую смесь белков: фосфорилаза B – 97,0 кДа, бычий сывороточный альбумин
(БСА) – 66,2 кДа, овальбумин – 45,0 кДа, карбоангидраза – 31,0 кДа, ингибитор
трипсина – 21,5 кДа, лизоцим – 14,4 кДа.
Образцы для нанесения готовили, добавляя 4х-кратный буфер для образцов (250
мМ трис-НСl, рН 6,8; 40% глицерин, 8% SDS, 0,004% бромфенолового синего с
добавлением или без добавления 5% β-меркаптоэтанола) в количестве 1/4 от конечного
объема пробы. На гель наносили от 1 до 5 мкг белка на дорожку.
В качестве катодного буфера использовали 0,192 М трис-глицин, рН 8,6,
содержащий 0,1% SDS, а в качестве анодного – 0,25 М трис-НСl, рН 8,6. Электрофорез
проводили при силе тока 10 мА на одно стекло до входа бромфенолового синего в
разделяющий гель и 20 мА после входа (размеры геля 70×95×0,75 мм).
Гели фиксировали в 10% уксусной кислоте в течение 10-20 мин, окрашивали 20-30
мин 0,3% раствором Кумасси синего R-250, приготовленного на смеси, содержащей
20% изопропанола и 10% уксусной кислоты. После окрашивания гели отмывали в
кипящей водяной бане.
3.5.2. SDS-электрофорез в градиенте ПААГ
Для получения более четких белковых полос на электрофореграмме использовали
метод SDS-электрофореза в градиенте 10-20% ПААГ (Walker, 2002). Разделяющий гель
готовили из двух растворов акриламида с концентрацией 10% и 20%, соответственно
(состав растворов для полимеризации приведен в табл. 3). Остальные операции и
реактивы аналогичны предыдущему методу.
Таблица 3. Состав растворов для полимеризации градиентного
полиакриламидного геля
(приведены объемы, используемые для получения одного геля)
Компоненты
30% АА + 0,8% МБА, мл
Буфер для разделяющего геля (1,5М
трис-HCl, pH 8,8, 0,4% SDS), мл
Буфер для концентрирующего геля
(0,5М трис-HCl, pH 6,8, 0,4% SDS), мл
вода, мл
ПСА, мг
ТЕМЕД, мкл
Разделяющий
гель
10%
20%
1,2
2,4
40
Концентрирующий
гель
4%
0,2
0,9
0,9
-
-
-
0,38
1,4
3
2,5
0,2
3
2,5
0,92
2
1,0
3.5.3. Спектрофотометрический метод определения
концентрации белка
При измерении концентрации исследуемых белков в образцах мы основывались на
том, что при длине оптического пути 1 см поглощение их растворов с концентрацией 1
мг/мл при 280 нм равно для Hsp20 0,582 (Swiss-Prot O14558), для αB-кристаллина –
0,693 (Swiss-Prot P02489), для Hsp22 – 1,231 (Swiss-Prot Q9UJY1). Спектр поглощения
образцов белка регистрировали в интервале 240-340 нм на приборе Ultrospec 3100 Pro
(Amersham Biosciences).
3.5.4. Окрашивание гелей серебром
Этот метод более чувствителен, чем окрашивание гелей красителем Кумасси R-250,
поэтому мы применяли его в том случае, когда было необходимо детектировать очень
небольшие количества белка на геле (меньше 1 мкг). Последовательность операций при
окрашивании гелей серебром была следующей:
1. Фиксирование гелей в растворе, содержащем 40% С2Н5OН и 10% СН3СООН в
течение 30-60 минут;
2. Двукратное (по 10 мин каждое) промывание в 10% С2Н5ОН;
3. Пятикратное (по 5 мин каждое) промывание водой MilliQ;
4. Двухминутная инкубация в ослабителе Фармера (0,15% K3Fe(CN)6, 0,03% Na2S2O4,
0,05% Na2CO3);
5. Четырехкратное (по 5 мин каждое) промывание водой MilliQ;
6. 30-минутная инкубация в 0,1% водном растворе AgNO3;
7. 5-минутная инкубация в 2,5% растворе Na2CO3;
8. Проявление в 2,5% Na2CO3, содержащем 0,0074% HСОН. Время проявления и
цвет окрашенных зон зависит от количества и природы белка, нанесенного на гель;
9. 5-минутное отмывание в 1% СН3СООН.
На всех стадиях для приготовления растворов использовали воду MilliQ и работали
только в перчатках.
41
Результаты и их обсуждение
4.
4.1.
Выделение малых белков теплового шока
человека
4.1.1. Выделение и очистка Hsp20WT и Hsp20Cys
При подробном анализе белкового состава фракций, полученных в ходе экстракции,
было установлено, что уже в ходе первых двух экстракций Hsp20WT практически
полностью переходит в растворимую фракцию (рис. 9), следовательно, третья экстракция
не является необходимой процедурой. Следует отметить, что высаливание в интервале 030% насыщения сульфата аммония позволяет полностью осадить Hsp20WT, при этом
удается частично очистить исследуемый белок, хотя в препарате все еще остается
значительное количество примесей.
м
S1
S2
P2
S3
PCA SCA
97,0 –
66,2 –
45,0 –
31,0 –
21,5 –
14,4 –
Рис. 9. Анализ белкового состава фракций, полученных в ходе экстракции Hsp20wt.
м - белки-стандарты, S1 – супернатант после первой экстракции, S2 – cупернатант после
второй экстракции, P2 – осадок после второй экстракции, S3 – cупернатант после третьей
экстракции, PCA – осадок при высаливании экстракта до степени насыщения 30%, SCA –
супернатант при высаливании экстракта до степени насыщения 30% (см. рис. 4). Слева
обозначено положение белков-стандартов.
Для
дальнейшей
очистки
Hsp20WT
использовали
метод
ионообменной
хроматографии. При хроматографии на HiTrapQ на профиле элюции удается выявить
несколько плохо разрешенных пиков. Практически все пики, обнаруженные на профиле
элюции,
содержат
Hsp20,
в
разной
степени
42
загрязненный
протеолитическими
фрагментами. Собирая наиболее очищенные фракции, мы смогли получить препарат
высокоочищенного
протеолитических
хроматографии
на
Hsp20WT,
содержащего
фрагментов
этого
колонке
PhenylHP
белка.
HiTrap
незначительное
Далее
мы
с
помощью
отделили
количество
гидрофобной
Hsp20WT
от
его
протеолитических фрагментов, гидрофобность которых отличается от таковой интактного
белка. Таким образом, мы получили препарат Hsp20WT с электрофоретической чистотой
более 90% (рис. 12, дорожка 4).
В итоге в ходе выделения было получено 42 мг белка (из 750 мл культуры E. coli).
Этот выход почти в 10 раз превосходит обычный выход Hsp20WT, получаемый при
индукции экспрессии этого белка под действием IPTG (Bukach et al., 2004).
Как уже было отмечено в разделе «Материалы и методы», операции при выделении
Hsp20Cys не отличались от таковых для Hsp20WT. Были отмечены отличия в профилях
элюции этих белков при ионообменной и гидрофобной хроматографиях. При
хроматографии на колонке HiTrapQ белка дикого типа максимум оптической плотности
приходился на концентрацию NaCl 205 мМ, в то время как при хроматографии Hsp20Cys
максимум оптической плотности приходился на 157 мМ NaCl. Ослабление связывания
мутанта с анионообменником, по-видимому, обусловлено заменой отрицательно
заряженного остатка E116 на нейтральный остаток цистеина. При гидрофобной
хроматографии максимум элюции Hsp20WT приходился на 97,5 мМ сульфата аммония, а
максимум элюции «цистеинового» мутанта – на 60,6 мМ сульфата аммония. Это
изменение хроматографических свойств трудно объяснить. Однако следует отметить, что
мутированный белок элюируется с колонки фенил-сефарозы в виде более узкого пика, чем
белок дикого типа. Возможно, изменение ширины пика приводит к кажущемуся
изменению условий элюции с гидрофобного носителя.
Электрофоретическая чистота полученного препарата Hsp20Cys превышает 90%
(рис. 12, дорожка 1), а выход составил 40,5 мг белка (из 750 мл культуры Е. coli), что
соизмеримо с выходом Hsp20WT.
43
м
P1
S1
P2
S2
S1CA
S2CA
P1CA
P2CA
97,0 –
66,2 –
45,0 –
31,0 –
21,5 –
14,4 –
Рис. 10. Анализ белкового состава фракций, полученных в ходе экстракции
αBCryCys. м - белки-стандарты, P1 – осадок после первой экстракции, S1 – супернатант
после первой экстракции, P2 – осадок после второй экстракции, S2 – cупернатант после
второй экстракции, P1CA – осадок при высаливании S1 до степени насыщения 40%,
S1CA – супернатант при высаливании S1 до степени насыщения 40%, P2CA – осадок при
высаливании S2 до степени насыщения 40%, S2CA – супернатант при высаливании S2 до
степени насыщения 40% (см. рис.5). Слева обозначено положение белков-стандартов.
4.1.2. Выделение и очистка αB-CryCys
При экспрессии αB-CryCys было отмечено, что синтез этого белка в клетках Е. coli
проходит более интенсивно, чем других малых белков теплового шока человека. Тем не
менее, уже после первой экстракции основная его масса оказалась в супернатанте (рис. 10,
S1), поэтому мы не использовали фракции, полученные в ходе последующих экстракций,
для очистки αB-кристаллина. Фракционирование сульфатом аммония оказалось довольно
эффективным. В ходе этой стадии мы смогли очистить препарат от части примесных
белков, и при фракционировании в интервале 0-40% степени насыщения (NH4)2SO4
практически весь αB-кристаллин был обнаружен в осадке, в то время как лишь следовые
количества αB-CryCys оставались в супернатанте.
Полученный препарат содержал значительное количество примесных белков, от
которых удалось избавиться при проведении ионообменной хроматографии на колонке
HiTrapQ. В ходе элюции повышающейся концентрацией NaCl было получено два пика с
максимумами при 150 и 242 мМ NaCl, однако второй пик содержал небольшое количество
αB-CryCys
и
значительное
количество
примесей.
Мы
объединяли
фракции,
соответствующие только первому пику, и проводили дальнейшую очистку методом гельфильтрации на колонке Superdex-200 HiLoad 26/60. Нужно отметить, что уже после
проведения ионообменной хроматографии был получен высокоочищенный препарат αBCryCys.
44
При гель-фильтрации αB-CryCys элюировался симметричным пиком с максимумом
при 132 мл. Объем элюции кристаллина близок к исключенному объему колонки (около
110-115 мл), это позволяет заключить, что кристаллин образует олигомеры с очень
большой молекулярной массой. В ходе выделения был получен высокоочищенный,
электрофоретически гомогенный препарат αB-CryCys (рис. 12, дорожка 3, полоса с
кажущейся молекулярной массой около 50 кДа, по-видимому, соответствует димерам αBCryCys), выход белка составил 59,0 мг (c 750 мл культуры E. coli).
м
S1+S2 PCA
S3
SCA
97,0 –
66,2 –
45,0 –
31,0 –
21,5 –
14,4 –
Рис. 11. Анализ белкового состава фракций, полученных в ходе экстракции Hsp22 4x.
м - белки-стандарты, S1 + S2 – объединенные cупернатанты после первой и второй
экстракции, S3 – cупернатант после третьей экстракции, PCA – осадок при высаливании
экстракта (S1+S2) до степени насыщения 30%, SCA – супернатант при высаливании
экстракта (S1+S2) до степени насыщения 30% (см. рис.6). Слева обозначено положение
белков-стандартов.
45
1
2
3
4
м
97,0 –
66,2 –
45,0 –
31,0 –
21,5 –
14,4 –
Рис. 12. Анализ чистоты полученных препаратов sHsp. На гель наносили Hsp20Cys (1),
Hsp22Cys (2), αB-CryCys (3), Hsp20WT (4), м – белки-стандарты. Слева обозначено
положение белков-стандартов.
4.1.3. Выделение и очистка Hsp22Cys
При выделении Hsp22Cys проводили три экстракции, но в третьем супернатанте (S3)
содержалось небольшое количество белка, поэтому его не использовали для дальнейшей
очистки, а первые два экстракта (S1 и S2) объединили сразу после экстракции. При
высаливании сульфатом аммония до степени насыщения 30% весь Hsp22Cys перешел в
осадок (рис. 11). Полученный препарат содержал значительное количество примесных
белков, и для его дальнейшей очистки использовали метод гидрофобной хроматографии
на колонке PhenylHP HiTrap. В ходе гидрофобной хроматографии Hsp22Cys элюировался
одним симметричным пиком с максимумом при 13,8 мМ (NH4)2SO4. По данным
электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия фракции, содержащие Hsp22Cys,
были загрязнены незначительным количеством белковых примесей с кажущейся
молекулярной массой от 45 до 100-120 кДа. Дальнейшую очистку проводили методом
гель-фильтрации на колонке Superdex-200 HiLoad 26/60. На профиле элюции были
выявлены два пика, во втором из них (с максимумом при 200 мл) элюировался Hsp22Cys.
Описанный метод позволил получить 20 мг Hsp22Cys (из 1,0 л культуры E. coli), при
этом определенная методом электрофореза чистота полученного препарата превышала
90% (рис. 12, дорожка 3).
46
4.2.
Сравнение структуры и свойств sHsp дикого
типа и их «цистеиновых» мутантов
4.2.1. Сравнение вторичной структуры sHsp дикого типа и их
«цистеиновых» мутантов
Как уже отмечалось в обзоре литературы, α-кристаллиновый домен содержит
большое количество β-складок, а N- и C-концевые участки преимущественно обогащены
неупорядоченными элементами структуры. В структуре малых белков теплового шока
практически отсутствуют α-спиральные участки, поэтому на спектрах КД sHsp не
наблюдается выраженного отрицательного максимума в области 222 нм, характерного для
α-спиралей.
Полученные нами спектры кругового дихроизма представлены на рис. 13. Спектры
КД αB-кристаллина и Hsp20 имеют два плохо разрешенных отрицательных максимума
при 209 и 215 нм, причем в спектре Hsp20 первый пик больше по амплитуде, чем второй.
Спектр КД Hsp22 отличается от спектров двух других белков, он имеет один максимум
при 203,5 нм с величиной молярной эллиптичности около -6000 град*см2*дмоль-1.
Спектры белков дикого типа и «цистеиновых» мутантов практически не различаются по
форме и амплитуде, что свидетельствует об отсутствии существенных различий во
вторичной структуре этих белков.
47
2000
A)
1000
Длина волны, нм
210
220
230
240
210
220
230
240
210
220
230
240
250
260
0
-1000
-3000
1000
Б)
2
Молярная элиптичность, град*см *дмоль
-1
-2000
0
Длина волны, нм
250
260
-1000
-2000
-3000
-4000
-5000
1000
0
В)
Длина волны, нм
250
260
-1000
-2000
-3000
-4000
-5000
-6000
-7000
Рис. 13. Спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области
αB-кристаллина (А), Hsp20 (Б) и Hsp22 (В) дикого типа (черные кривые) и их
«цистеиновых» мутантов (красные кривые).
Таблица 4. Содержание элементов вторичной структуры в αB-кристаллине, Hsp20 и
Hsp22 дикого типа и их «цистеиновых» мутантах, определенное на основании
спектров КД в программах CONTINLL и CDSSTR (пакет программ CDPro).
Использовался набор из 29 реперных белков (SP29).
Белок
CryWT
αB-CryCys
Hsp20WT
Hsp20Cys
Hsp22WT
Hsp22Cys
α-спирали,
%
3,0-4,0
3,5
4,5-5,0
4,5-6,0
4,0-6,0
4,0-6,0
β-складки,
%
39,5-40,5
37,5-43,5
38,0-38,5
37,5-39,0
34,5-39,0
36,5-38,5
48
Повороты,
%
24,0-27,5
22,5-26,5
23,0-25,5
21,5-24,5
22,0-26,0
22,0-25,0
Неупорядоченные
структуры, %
28,5-31,5
30,0-30,5
31,0-34,0
31,0-34,5
33,0
33,0-33,5
В литературе предложено несколько подходов, позволяющих предсказывать
содержание различных элементов вторичной структуры по данным спектров КД в дальней
ультрафиолетовой области. Для оценки содержания элементов вторичной структуры в αBкристаллине, Hsp20 и Hsp22 дикого типа и их «цистеиновых» мутантах мы
воспользовались пакетом программ CDPro (Sreerama and Woody, 2000). Результаты
представлены в таблице 4. В этой таблице представлены данные, полученные с
использованием только двух программ, входящих в состав CDPro – CONTINLL и
CDSSTR. В третьей программе (SELCON3) в отдельных случаях обсчет спектров по
неизвестным причинам был невозможен, а если обсчет производился, то результаты не
согласовались с данными, полученными в двух других программах. Как и ожидалось,
соотношение элементов вторичной структуры оказалось одинаковым для белков дикого
типа и «цистеиновых» мутантов. При этом во вторичной структуре исследуемых sHsp
преобладают β-складки (от 34,5 до 43,5%) и неупорядоченые структуры (от 28,5 до
34,5%). Такие же результаты ранее были получены в нашей лаборатории при
исследовании вторичной структуры Hsp22 дикого типа (Kasakov et al., 2007). Кроме того,
подобное соотношение элементов вторичной структуры наблюдалось и в αА-кристаллине
дикого типа (Shroff et al., 2000). Анализируя данные таблицы 4, может возникнуть вопрос,
почему при малых различиях в рассчитанном соотношении различных элементов
вторичной структуры для всех малых белков теплового шока форма спектра КД у этих
белков довольно сильно отличается. Общая форма спектра КД для Hsp20 и αBкристаллина мало отличаются друг от друга, в то время как спектр КД Hsp22 имеет
совершенно иную форму, и его отрицательный максимум больше по величине и смещен в
коротковолновую область. Это кажущееся противоречие можно объяснить следующим
образом. Как уже отмечалось, все исследуемые малые белки теплового шока имеют
одинаково малое содержание α-спиралей. В то же время, содержание β-структур выше в
случае Hsp20 и αB-кристаллина, чем в случае Hsp22. Отсюда следует, что содержание
неупорядоченных
структур,
включающих
в
себя
повороты
и
собственно
разупорядоченные участки полипептидной цепи больше у Hsp22, чем у двух других
малых белков теплового шока. Отрицательный максимум на спектре КД, характерный для
разупорядоченных структур, смещен к 205 нм. Именно поэтому спектр КД Hsp22 имеет
самый большой по амплитуде и самый коротковолновый отрицательный максимум по
сравнению с двумя другими малыми белками теплового шока.
Точное определение содержания β-складок и неупорядоченных структур по данным
КД представляет собой сложную и до конца нерешенную задачу, тем не менее, в связи с
тем, что форма и амплитуда спектров КД белков дикого типа и их «цистеиновых»
мутантов практически не отличаются друг от друга, мы можем заключить, что внесение
49
точечных мутаций не приводит к каким-либо значительным изменениям во вторичной
структуре малых белков теплового шока человека (αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22).
4.2.2. Исследование третичной структуры белков методом
собственной триптофановой флуоресценции
Несмотря на то, что вторичная структура sHsp при внесении мутаций не изменилась,
замена аминокислотных остатков могла привести к нарушениям в третичной структуре
белков. Поэтому на следующем этапе нашей работы мы сравнивали третичную структуру
белков дикого типа и «цистеиновых» мутантов, используя метод собственной
триптофановой
флуоресценции.
В
исследуемых
малых
белках
теплового
шока
присутствует различное количество остатков триптофана – в αB-кристаллине два, в Hsp20
только один, а в Hsp22 четыре остатка. О третичной структуре в окружении этих остатков
можно судить по спектрам собственной триптофановой флуоресценции. Мы записывали,
а затем сравнивали спектры флуоресценции белков дикого типа и их «цистеиновых»
мутантов в области от 300 до 400 нм при длине волны возбуждающего света 295 нм (рис.
14). Максимумы спектров триптофановой флуоресценции всех белков располагаются при
345 – 346 нм, форма спектров у белков дикого типа и «цистеиновых» мутантов полностью
совпадает. Это является свидетельством того, что внесение точечных мутаций не
приводит к изменению в окружении остатков триптофана, а, следовательно, сравниваемые
белки имеют одинаковую третичную структуру, по крайней мере, в окружении
триптофанильных остатков.
Мы попытались оценить относительный вклад трех спектральных форм (I, II и III) во
флуоресценцию малых белков теплового шока. Для этого в программе Origin 8.0
аппроксимировали полученные нами спектры суммой спектров, характерных для
спектральных форм I, II и III, умноженных на коэффициенты, характеризующие вклад
каждого класса в общую флуоресценцию. При определении этих коэффициентов мы
столкнулись с рядом трудностей. Во-первых, спектры, получаемые на приборе VARIANTM
CaryEclipse, сдвинуты на 5-6 нм в длинноволновую область по сравнению с теми
спектрами, которые приводятся в книге Е.А. Пермякова (Пермяков, 2003). Во-вторых,
измеряемые спектры имеют большую полуширину. И, в-третьих, при аппроксимации
получается
высокая
величина
погрешности
в
спектральных форм в общую флуоресценцию белка.
50
определении
вклада
различных
100
A)
80
60
40
20
0
300
320
340
360
Интенсивность флуоресценции, %
380
400
Длина волны, нм
100
Б)
80
60
40
20
0
300
320
340
360
380
400
Длина волны, нм
100
В)
80
60
40
20
0
300
320
340
360
380
400
Длина волны, нм
Рис. 14. Спектры собственной триптофановой флуоресценции αB-кристалина (А),
Hsp20 (Б) и Hsp22 (В) дикого типа (черные кривые) и их «цистеиновых» мутантов
(красные кривые). Интенсивность в максимуме принимали за 100%.
Тем не менее, по всей видимости, основной вклад во флуоресценцию всех
исследованных малых белков теплового шока вносит спектральная форма II, меньшая
доля триптофановой флуоресценции приходится на спектральную форму I. Таким
51
образом, большая часть остатков триптофана располагается на поверхности белковой
глобулы, но не контактируют с молекулами свободной воды.
4.2.3. Исследование гидрофобных свойств малых белков
теплового шока с помощью зонда bis-ANS
Как было отмечено в обзоре литературы, некоторые белки могут иметь от одного до
нескольких центров специфического связывания гидрофобного зонда bis-ANS, в то время
как на других белках такие центры отсутствуют, и эти белки практически не связывают
bis-ANS. Помимо этого некоторые белки могут содержать множество центров
низкоаффинного связывания этого зонда (Slavik, 1982). По всей видимости, параметры
связывания bis-ANS разными малыми белками теплового шока человека значительно
варьируют, поэтому не всегда оказывается возможным описать кривые титрования sHsp
одной и той же моделью.
На рис. 15 представлены кривые связывания bis-ANS αB-кристаллином дикого типа
и его «цистеиновым» мутантом. Для определения параметров связывания bis-ANS с αBкристаллином мы использовали модель, описанную в разделе «Материалы и методы», не
учитывающую наличия низкоаффинных центров связывания. При этом интенсивность
флуоресценции (F) является функцией трех переменных (Fmax, максимальная величина
флуоресценции, N, концентрация центров связывания и К, константа диссоциации):
F = Fmax(((N+C+K)/2*N)-(((N+C+K)/2*N)2 – C/N)0,5),
Аппроксимация со свободно варьирующими тремя переменными оказывается достаточно
затруднительной. Пытаясь достичь наилучшей подгонки, мы придавали величине N
разные фиксированные значения и делали возможным свободное изменение значений Fmax
и K. Оптимальная подгонка была достигнута при величине N, равной 0,23 µM. В этом
случае максимальная амплитуда флуоресценции для белка дикого типа и его
«цистеинового» мутанта оказались равными 557±3 и 539±2 отн. единицам, а константа
диссоциации 0,84±0,20 µM и 0,69±0,02 µM (см. врезку на рис.15). Несмотря на то, что
данная модель не полностью описывает взаимодействие белков с bis-ANS, полученное
нами значение кажущейся константы диссоциации сопоставимо с таковым для
«нативного» α-кристаллина (то есть полученного из хрусталика и состоящего из αА- и αBкристаллина) – 0,95 µM (Sharma et al., 1998). Параметры связывания bis-ANS и кривые
титрования αB-кристаллина дикого типа и его «цистеинового» мутанта этим зондов очень
52
Интенсивность флуоресценции, отн.ед.
500
400
Equation
y = Pmax*(((N + x + K)/(2*N)) - (((N + K + x)/(2
*N))^2 - x/N)^0.5);
300
Adj. R-Square
0.99958
Value
200
Pmax
CryCys
N
0.23
0
CryCys
K
0.6921
0.01722
Equation
y = Pmax*(((N + x + K)/(2*N)) - (((N + K + x)/(2
*N))^2 - x/N)^0.5);
Adj. R-Square
100
Standard Error
CryCys
538.89733
2.42499
0.99958
Value
Standard Error
CryWT
Pmax
CryWT
N
557.16776
0.23
0
CryWT
K
0.84569
2.73088
0.02043
7
8
0
0
1
2
3
4
5
6
C(bis-ANS), µM
Интeнсивность флуоресценции, отн. ед.
Рис. 15. Связывание bis-ANS αB-кристаллином дикого типа (черная кривая) или его
«цистеиновым» мутантом (красная кривая). λex = 385 нм, λem = 495 нм, концентрация
белка – 0,67 µM в пересчете на мономер
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
C (bis-ANS), µM
Рис. 16. Связывание bis-ANS Hsp22 дикого типа (черные квадраты) или его
«цистеиновым» мутантом (красные кружки). λex = 385 нм, λem = 495 нм, концентрация
белка составляла около 0,9 µM.
сходны, что позволяет заключить, что внесение точечной мутации практически не влияет
на гидрофобные свойства αB-кристаллина.
Другие исследуемые малые белки теплового шока – Hsp20 и Hsp22, по всей
видимости, не имеют высокоаффинных центров связывания bis-ANS. В том случае, если
концентрация этих белков в инкубационной среде составляла 1 µM, то добавление даже 89-кратного молярного избытка bis-ANS не приводило к насыщению, а сопровождалось
практически линейным (или параболическим) увеличением флуоресценции (рис. 16).
Такая форма кривой характерна для белков, имеющих множество центров связывания,
53
обладающих низким сродством к bis-ANS, которые к тому же (при параболической
кривой титрования) могут влиять на связывание зонда другими центрами. По этим
причинам количественное сравнение Hsp20 дикого типа с его «цистеиновым» мутантом
или Hsp22 с его «цистеиновым» мутантом оказывается довольно затруднительным. Тем не
менее, оказалось, что при титровании Hsp22 bis-ANS интенсивность флуоресценции в
случае «цистеинового» мутанта была выше интенсивности флуоресценции в случае белка
дикого типа (рис. 16), свидетельствуя о том, что «цистеиновый» мутант Hsp22 лучше
связывает bis-ANS и обладает большей гидрофобностью, чем белок дикого типа. Следует
отметить, что «цистеиновый» мутант Hsp22 немного лучше связывается с фенилсефарозой: максимум элюции белка дикого типа приходится на 15 мМ (NH4)2SO4
(Казаков, 2006), в то время как максимум элюции Hsp22Cys располагается при 13,5 мМ
(NH4)2SO4, это также свидетельствует в пользу того, что «цистеиновый» мутант Hsp22
действительно обладает немного большей гидрофобностью, чем белок дикого типа. В
случае Hsp20 мы наблюдали незначительные различия в характере связывания bis-ANS
белком
дикого
типа
и
его
«цистеиновым»
мутантом,
причем
интенсивность
флуоресценции при связывании bis-ANS с «цистеиновым» мутантом была несколько
меньше интенсивности флуоресценции зонда при связывании с белком дикого типа
(данные не представлены).
Подводя итог этому разделу, можно заключить, что по данным собственной
белковой флуоресценции «цистеиновые» мутанты αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22
практически не отличаются от соответствующих белков дикого типа. αB-кристаллин
обладает участками высокого сродства к bis-ANS, при этом связывание зонда не зависит
от внесения единичной точечной мутации (E117C). Двойная мутация (C46S/E116C) Hsp20
сопровождается незначительными изменениями в параметрах связывания bis-ANS. В то
же
время
введение
четырех
точечных
мутаций
в
структуру
Hsp22
(C10S/C99S/N138C/C195S) приводит к некоторому увеличению связывания bis-ANS с
мутированным белком. Количественная оценка изменений гидрофобности исследуемых
белков затруднительна, однако представленные результаты свидетельствуют о том, что
введение указных мутаций не приводит к драматическим изменениям структуры, но
может сопровождаться некоторыми изменениями гидрофобных свойств, измеряемых по
параметрам связывания bis-ANS.
54
11,0
А)
Объем элюции, мл
10,8
10,6
10,4
10,2
10,0
0
50
100
150
200
250
300
Количество белка, мкг
11,0
Б)
Объем элюции, мл
10,8
10,6
10,4
10,2
10,0
10
20
30
40
50
60
Количество белка, мкг
12,0
В)
Объем элюции, мл
11,8
11,6
11,4
11,2
11,0
10
20
30
40
50
60
Количество белка, мкг
Рис. 17. Зависимость объема элюции αВ-кристаллина (А), Hsp20 (Б) и Hsp22 (В)
дикого типа (черные линии) и их «цистеиновых» мутантов (красные линия) от
количества нанесенного белка. Гель-фильтрацию проводили либо на колонке Superdex200 (А), либо на колонке Superdex-75 (Б и В). Буфер элюции – 20 мМ трис-ацетат, pH 7,6,
150 мM NaCl, 0,1 мM ЭДТА, 15 мM β-меркаптоэтанола, 0,1 мM ФМСФ.
55
4.2.4. Исследование олигомерного состояния методом гельфильтрации
Как уже отмечалось ранее, все малые белки теплового шока образуют олигомеры,
причем размер таких олигомеров является характерным для каждого белка. Учитывая это
обстоятельство, на следующем этапе нашей работы мы провели сравнение олигомерного
состояние αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22 дикого типа и их «цистеиновых» мутантов. Для
этого мы определяли объемы элюции при нанесении на гель-фильтрационную колонку
различных количеств исследуемых белков. На рис. 17 представлена зависимость объема
элюции (положения максимума на профиле элюции) от количества наносимого sHsp. В
случае αB-кристаллина и Hsp20 разведение не приводит к изменению олигомерного
состояния или формы этих белков и по этой причине объем элюции практически не
зависит от количества наносимого на колонку белка. В то же время при уменьшении
количества наносимого Hsp22 наблюдается увеличение объема элюции этого белка, что,
вероятно, вызвано сдвигом равновесия между димерами и мономерами в сторону
образования мономеров. Подобное поведение малых белков теплового шока человека
(Hsp20 и Hsp22) при гель-фильтрации и ранее наблюдалось в нашей лаборатории (Bukach
et al., 2004; Kim et al., 2004).
«Цистеиновый» мутант αB-кристаллина, также как и белок дикого типа образует
крупные олигомеры с кажущейся молекулярной массой около 600 кДа. Объем элюции
пика αB-CryCys на 0,2 мл меньше объема элюции пика белка дикого типа (рис.17, А), что
соответствует разнице в кажущейся молекулярной массе около 50 кДа. Вероятно,
«цистеиновый» мутант αB-кристаллина имеет менее компактную форму, что приводит к
наблюдаемому увеличению кажущейся молекулярной массы белка. Такие же изменения
могли бы наблюдаться, если бы олигомеры αB-CryCys имели в своем составе на один
димер больше, чем белок дикого типа. Однако это предположение кажется менее
правдоподобным, так как по форме и полуширине пика при гель-фильтрации αB-CryCys и
αB-CryWT практически не отличаются друг от друга (данные не представлены).
Объем элюции Hsp20WT и его «цистеинового» мутанта соответствует кажущейся
молекулярной массе, равной 42 кДа, таким образом, этот белок преимущественно
представлен димерами. Согласно данным, полученным при гель-фильтрации (рис. 17, Б),
введение двух точечных мутаций не влияет на объем элюции Hsp20, следовательно, не
сопровождается изменениями олигомерного состояния или формы этого белка.
Как уже отмечалось ранее, Hsp22 существует в виде равновесной смеси димеров и
мономеров. При гель-фильтрации мы наблюдали незначительные различия в поведении
Hsp22 дикого типа и его «цистеинового» мутанта. При равном количестве нанесенного
56
белка объем элюции «цистеинового» мутанта все время был на 0,1 мл меньше, чем у белка
дикого типа (рис. 17, В). Введение четырех точечных мутации в Hsp22 могло привести
либо к изменению формы белка (причем она стала менее компактной), либо к изменению
равновесия в сторону образования димеров (отношение количества димеров к количеству
мономеров для Hsp22Cys при одной и той же концентрации белка оказывается выше). В
любом случае, указанные изменения в форме или олигомерном состоянии исследуемых
белков были минимальными.
4.2.5. Измерение шаперонной активности малых белков
теплового шока
Как и ожидалось, все исследуемые в нашей работе белки обладают шаперонной
активностью, подавляя агрегацию инсулина. На рис. 18-20 приведена кинетика агрегации
инсулина в отсутствие или в присутствии sHsp.
При обоих выбранных весовых соотношениях инсулин/sHsp αB-кристаллин дикого
типа и его «цистеиновый» мутант эффективно и полностью предотвращают агрегацию
инсулина (рис. 18). Таким образом, единственная точечная мутация (E117C) не влияет на
взаимодействие αB-кристаллина с инсулином и его шаперонную активность при
использовании этого субстрата.
В отличие от αB-кристаллина, «цистеиновый» мутант Hsp20 обладает очень низкой
шаперонной активностью, в то время как Hsp20WT полностью предотвращает агрегацию
инсулина (рис. 19). Мы предполагаем, что такой эффект может быть вызван заменой
цистеина в положении 46 на серин (мутация C46S). Эта гипотеза основана на том, что, вопервых, введение одного остатка цистеина не влияет на шаперонную активность αBкристаллина, первичная структура которого очень похожа на таковую Hsp20. Во-вторых,
по данным Гоша и соавт. (Ghosh et al., 2007) остатки 33-40 αB-кристаллина (гомологичные
остаткам 38-46 Hsp20) непосредственно взаимодействуют с инсулином, а участие петли
β5-β7 (в которой располагается вторая мутация) в связывании инсулина незначительно. В
то же время, конечно, нельзя исключать возможность того, что мутация в β5-β7-петле
также может приводить к изменению взаимодействия Hsp20 с субстратами, в частности с
инсулином.
57
100
1
A)
80
60
40
3
2
D340, %
20
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
100
1
Б)
80
60
40
20
2
3
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
Рис. 18. Кинетика агрегации инсулина без sHsp (1) и в присутствии αВ-кристаллина
дикого типа (2) или его «цистеинового» мутанта (3) при весовом соотношении
инсулин/Cry, равном 1:1 (A) или 2:1 (Б).
D340 при агрегации инсулина без sHsp после 48 мин инкубации принимали равной 100%.
58
1
3
100
A)
80
60
40
20
D340, %
2
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
1
3
100
Б)
80
60
40
20
2
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
Рис. 19. Кинетика агрегации инсулина без sHsp (1) и в присутствии Hsp20 дикого
типа (2) или Hsp20Cys (3) при весовом отношении инсулин/Hsp20, равном 1:1 (A) или
2:1 (Б). D340 при агрегации инсулина без sHsp после 48 мин инкубации принимали равной
100%.
Шаперонная активность Hsp22 ниже, чем у αB-кристаллина (рис. 20). Белок дикого
типа при соотношении инсулин/Hsp22WT, равном 2:1, подавляет агрегацию инсулина
только на начальном этапе. Hsp22Cys имеет сходную с белком дикого типа шаперонную
активность. Например, при соотношении инсулин/Hsp22, равном 1:1, как белок дикого
типа, так и «цистеиновый» мутант практически полностью подавляют агрегацию
инсулина, а при соотношении 2:1, подавление агрегации оказывается заметно меньше. По
всей видимости, Hsp22, существующий в виде равновесной смеси димеров и мономеров,
обладает более низкой шаперонной активностью, чем другие исследуемые белки (αBкристаллин и Hsp20), однако при этом замена четырех аминокислотных остатков в
структуре белка не приводит к существенным изменениям его шаперонной активности.
Таким образом, только в случае Hsp20 «цистеиновый» мутант обладал меньшей
шаперонной активностью, чем белок дикого типа. В то же время шаперонная активность
«цистеиновых» мутантов αB-кристаллина и Hsp22 практически не отличалась от
шаперонной активности белков дикого типа.
59
A)
120
1
100
80
60
40
3
2
D340, %
20
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
120
2
Б)
100
1
80
3
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Время, мин
Рис. 20. Кинетика агрегации инсулина без sHsp (1) и в присутствии Hsp22 дикого
типа (2) или Hsp22Cys (3) при весовом отношении инсулин/Hsp22, равном 1:1 (A) или
2:1 (Б). D340 при агрегации инсулина без sHsp после 48 мин инкубации принимали равной
100%.
Завершая этот раздел, можно заключить, что внесение точечных мутаций не
приводит к значительным изменениям во вторичной, третичной и четвертичной структуре
исследуемых белков. Кроме того, в случае αB-кристаллина и Hsp22 мутации не влияют и
на шаперонную активность этих белков. Все это, как нам кажется, позволяет использовать
«цистеиновые» мутанты полученных белков для анализа структуры и свойств гомо- и
гетероолигомеров малых белков теплового шока.
60
4.3.
Исследование белок-белковых взаимодействий в
гомоолигомерах «цистеиновых» мутантов sHsp
человека
Завьялов и соавторы (Zavialov et al., 1998a) обнаружили, что Hsp25 мыши,
являющийся
гомологом
Hsp27
человека,
способен
в
окислительных
условиях
образовывать межсубъединичные дисульфидные мостики. Нами были получены
мутантные формы αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22, содержащие остаток цистеина в
положении, гомологичном единственному остатку цистеина Hsp27 (Cys137). Как было
установлено в предыдущих разделах, такие мутантные белки имеют структуру,
практически не отличающуюся от структуры белков дикого типа. Опираясь на эти
данные, мы попытались установить, способны ли полученные нами мутантные формы
sHsp образовывать межсубъединичные дисульфидные мостики аналогично тому, как это
происходило в случае Hsp25 мыши.
В отдельных экспериментах было установлено, что при хранении полученные
«цистеиновые» мутанты переходят в частично окисленное состояние, поэтому перед
экспериментом их предварительно восстанавливали в буфере В, содержащем 15 мМ ДТТ.
Мы сравнивали состояние малых белков теплового шока дикого типа и их «цистеиновых»
мутантов перед диализом (в восстановленном состоянии) и после диализа (в окисленном
состоянии), который проводили при комнатной температуре в течение ночи. На рис. 21
представлены электрофореграммы, полученные при проведение SDS-электрофореза в
отсутствие β-меркаптоэтанола. В хорошем соответствии с данными литературы (Zavialov
et al., 1998a) оказалось, что окисление Hsp27 дикого типа приводит к практически
полному переходу исследуемого белка в димерное состояние, стабилизированное
дисульфидной связью (рис. 21, Г). Все исследованные «цистеиновые» мутанты (αBCryCys, Hsp20Cys и Hsp22Cys) также оказались способными эффективно образовывать
димеры, «сшитые» дисульфидной связью (рис. 21, А-В, дорожки 4). Представленные
данные означают, что участок, в котором располагается введенный остаток цистеина
(петля, соединяющая пятую и седьмую β-складки) вовлекается в межсубъединичные
взаимодействия в гомоолигомерах αB-кристаллина, Hsp20, Hsp22 также, как это
происходит в случае Hsp27. Стоит отметить, что для образования дисульфидной связи
остатки цистеина должны располагаться на небольшом расстоянии друг от друга (не более
8 Å), поэтому можно предположить, что в составе димеров β5-β7-петли двух мономеров
находятся в непосредственной близости друг от друга. На рис. 22 изображено
предполагаемое расположение β5-β7-петель и β7-складок мономеров sHsp, входящих в
61
1
2
3
4
1
2
1
2
3
4
66,2
45,0
31,0
21,5
A)
14,4
Б)
1
2
3
4
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
В)
Г)
Рис 21. Сравнение восстановленных и окисленных sHsp дикого типа (дорожки 1 и 2)
и их «цистеиновых» мутантов (дорожки 3 и 4). А – Hsp20, Б – Hsp22, В – αВкристаллин, Г – Hsp27WT.
Дорожки 1 и 3 – белки перед окислением, дорожки 2 и 4 – белки после диализа против
буфера А (50 мМ трис-HCl, 50 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ) при комнатной
температуре в течение ночи. Электрофореграмма получена при проведении SDSэлектрофореза в отсутствие β-меркаптоэтанола. Слева обозначено положение белковмаркеров.
β5-β7-петля
β7-складка
S
S
β7-складка
β5-β7-петля
Рис. 22. Предполагаемое взаимное расположение β5-β7-петлей и β7-складок двух
мономеров малых белков теплового шока, входящих в состав одного димера.
S – положение остатка цистеина в Hsp27 дикого типа и «цистеиновых» мутантах sHsp,
синей стрелкой указано образование дисульфидной связи при окислении. Границы петли
и β7-складки были предсказаны в программе SwissModel на основе кристаллической
структуры Tsp36 (код в базе данных PDB – 2bol).
62
состав одного димера. Мы предполагаем, что данные участки ориентированы
антипараллельно, и при этом остатки цистеина оказываются расположенными друг
напротив друга. О таком взаиморасположении мономеров косвенно свидетельствует тот
факт, что при введении остатка цистеина в положение 114 Hsp20 (на два остатка ближе к
N-концевой части молекулы) вероятность образования дисульфидной связи намного
меньше, чем у Hsp20 с мутацией E116C (данные не представлены). Беренжан и соавт.
(Berengian et al., 1999) провели систематическое мутирование остатков, расположенных в
участке 134-139 Hsp27 с последовательной заменой каждого их остатков этого участка на
остаток цистеина. Затем единственный остаток цистеина каждого мутантного белка был
модифицирован нитроксидной ЭПР-меткой и было исследовано взаимное расположение
таких меток в составе олигомера. На основе проведенных опытов был сделан вывод о том,
что остатки, расположенные в участках 134-139 двух соседних мономеров Hsp27
располагаются поблизости друг от друга. При этом высказано предположение, что
межсубъединичные контакты обеспечиваются за счет образования водородных связей
между антипараллельными β7-складками.
Так или иначе петля, соединяющая пятую и седьмую β-складки, либо β7-складка
играет важную роль в димеризации sHsp человека. Мутации, коррелирующие с развитием
наследственных заболеваний и располагающиеся в данном участке, скорее всего,
дестабилизируют структуру димеров и нарушают межсубъединичные взаимодействия,
что сказывается на функционировании малых белков теплового шока в клетке.
Образование дисульфидных связей между «цистеиновыми» мутантами Hsp22
оказывается менее вероятным (см. рис. 21, Б), чем между «цистеиновыми» мутантами αBкристаллина и Hsp20. Это хорошо согласуется с тем, что Hsp22 не образует устойчивых
димеров, и частично существует в мономерном состоянии. Стоит отметить, что Hsp20
дикого типа, содержащий единственный остаток цистеина в N-концевой части молекулы
(Сys46), и Hsp22 дикого типа, содержащий три остатка цистеина, расположенные в Nконцевой части (Cys10), в α-кристаллиновом домене (Cys99) и на С-конце молекулы белка
(Cys195) также способны окисляться с образованием димеров, «сшитых» дисульфидными
мостиками (рис.21, Б и В, дорожки 2). Однако вероятность «сшивания» белков дикого
типа оказывается меньше, чем у их «цистеиновых» мутантов. Кроме того, из-за наличия
трех остатков цистеина, расположенных в разных частях белка, Hsp22 дикого типа
способен образовывать высокомолекулярные ковалентно «сшитые» олигомеры-агрегаты
(рис. 21, Б, дорожка 2). Эти данные хорошо согласуются с результатами, ранее
полученными в нашей лаборатории (Kim et al., 2004).
Мы попытались оптимизировать условия «сшивания» «цистеиновых» мутантов и для
этой цели провели серию опытов, в ходе которых проводили диализ восстановленных
63
форм белка при 37° С (а не при комнатной температуре, как это делали в первой серии
экспериментов). Оказалось, что в этих условиях вероятность «сшивания» всех
исследуемых sHsp (кроме αB-кристаллина дикого типа, в котором отсутствуют остатки
цистеина) резко возрастает и достигает величины более 90% (данные не представлены).
Это означает, что в указанных условиях удается достичь практически количественного
образования «сшитых» димеров всех анализируемых малых белков теплового шока.
Сравнение структуры «цистеиновых» мутантов малых белков
теплового шока в восстановленном и окисленном состояниях
Для сравнения свойств восстановленных и окисленных «цистеиновых» мутантов αBкристаллина, Hsp20 и Hsp22 мы провели анализ спектров КД и собственной
триптофановой
флуоресценции,
а
также
исследовали
олигомерное
состояние
восстановленных и окисленных белков, полученных после диализа при 37° С, т. е. в
условиях когда более 90% белка было «сшито» дисульфидной связью.
На рис. 22 представлены спектры кругового дихроизма αB-CryCys, Hsp20Cys и
Hsp22Cys в восстановленном или окисленном состоянии. Спектры КД белков после
окисления незначительно отличаются по форме от спектров восстановленных белков, при
этом они обладают большей амплитудой в области отрицательных максимумов. Стоит
отметить, что при записи спектров КД мы использовали различные буферы: при записи
спектров восстановленных белков 50 мМ КН2РО4, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ ДТТ, а
окисленных белков – модифицированный буфер А (10 мМ трис-HCl, pH 7,4, 50 мМ KCl,
1,0 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ). Это могло в определенной степени повлиять на форму
спектров кругового дихроизма. В то же время, сравнение соотношения элементов
вторичной структуры до и после окисления, рассчитанное с помощью пакета программ
CDPro на основе спектров КД (таблица 5), показывает, что образование дисульфидной
связи не приводит к существенным изменениям во вторичной структуре αB-CryCys и
Hsp22Cys. В случае Hsp20Cys после окисления незначительно уменьшается доля βскладок (на 4-6%) и возрастает доля неупорядоченных структур и поворотов. Возможно,
образование дисульфидной связи в Hsp20Cys дестабилизирует структуру этого белка в
месте расположения окисленного остатка цистеина.
64
1000
Длина волны, нм
200
210
220
230
240
250
260
0
-1000
-2000
A)
2
Молярная элллиптичность, град*см *дмоль
-1
-3000
Длина волны, нм
0
200
210
220
230
240
250
260
-1000
-2000
-3000
-4000
Б)
-5000
-6000
Длина волны, нм
1000
200
210
220
230
240
250
260
0
-1000
-2000
-3000
-4000
-5000
В)
-6000
-7000
Рис. 22. Спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области
«цистеиновых» мутантов αB-кристаллина (А), Hsp20 (Б) и Hsp22 (В) в
восстановленном (черные кривые) и окисленном (красные кривые) состояниях.
Таблица 5.Содержание элементов вторичной структуры в «цистеиновых» мутантах
αB-кристаллина, Hsp20 и Hsp22 в восстановленном (Red) и окисленном (Ox)
состояниях, определенное на основании спектров КД в пакете программ CDPro.
Использовался набор из 29 реперных белков (SP29).
Белок
Состояние
αB-CryCys
Red
Ox
Red
Ox
Red
Ox
Hsp20Cys
Hsp22Cys
α-спирали,
%
3,5
3,0-4,0
4,5-6,0
4,5-5,0
4,0-6,0
3,0-5,5
β-складки,
%
37,5-43,5
40,0-41,5
37,5-39,0
31,0-35,0
36,5-38,5
37,5-38,5
65
Повороты,
%
22,5-26,5
23,5-25,5
21,5-24,5
24,0-26,5
22,0-25,0
22,5-23,5
Неупорядоченные
структуры, %
30,0-30,5
28,5-33,5
31,0-34,5
33,0-40,5
33,0-33,5
33,5-34,5
100
A)
80
60
40
20
0
300
320
340
360
Интенсивность флуоресценции, %
100
380
400
Длина волны, нм
Б)
80
60
40
20
0
300
320
340
360
380
400
Длина волны, нм
100
В)
80
60
40
20
0
300
320
340
360
380
400
Длина волны, нм
Рис. 23. Спектры собственной триптофановой флуоресценции «цистеиновых»
мутантов αB-кристаллина (А), Hsp20 (Б) и Hsp22 (В) в восстановленном (черные
кривые) и окисленном (красные кривые) состояниях. Интенсивность в максимуме
принимали за 100%.
66
40
A)
30
20
10
0
7
8
9
10
11
12
13
Объем элюции, мл
60
50
Б)
D280, mAu
40
30
20
10
0
13
14
15
16
17
18
Объем элюции, мл
110
100
90
В)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
13
14
15
16
17
18
Объем элюции, мл
Рис. 24. Профили элюции при гель-фильтрации на колонке Superdex-200
«цистеиновых» мутантов αB-кристаллина (А), Hsp20 (Б) и Hsp22 (B) в
восстановленном (черные кривые) и окисленном (красные кривые) состояниях.
Количество наносимого белка составляло около 150 мкг. Буфер элюции – 20 мM трисацетат, pH 7,6, 150 мM NaCl, 0,1 мM ЭДТА, 0,1 мM ФМСФ с добавлением или без 15 мM
β-меркаптоэтанола.
Мы не выявили существенных изменений в третичной структуре окисленных
«цистеиновых» мутантов исследуемых sHsp при использовании метода собственной
триптофановой
флуоресценции.
Оказалось,
что
формы спектров флуоресценции
окисленных и восстановленных форм «цистеиновых» мутантов практически не
отличаются друг от друга (рис. 23).
67
При анализе олигомерного состояния исследуемых белков методом гель-фильтрации
оказалось, что окисление «цистеинового» мутанта αB-кристаллина не сопровождается
значительным изменением объема элюции. Как восстановленный, так и окисленный
«цистеиновый» мутант αB-кристаллина, образует крупные олигомеры с кажущейся
молекулярной массой
около 600 кДа, и окисление приводит лишь к очень
незначительному (менее 0,1 мл) изменению объема элюции (рис. 24, А). Объемы элюции
восстановленного и окисленного «цистеиновых» мутантов Hsp20 также не отличаются
друг от друга, и в обоих случаях кажущаяся молекулярная масса белка составляет около
42 кДа, что соответствует димеру Hsp20 (рис. 24, Б). Это свидетельствует в пользу того,
что β5-β7-петля (в которой располагается дополнительный остаток цистеина) принимает
участие именно в стабилизации структуры димеров, а не во взаимодействии разных
димеров в составе крупных олигомеров. При окислении «цистеинового» мутанта Hsp22,
как и ожидалось, мы наблюдали сдвиг равновесия между мономерами и димерами белка в
сторону образования димеров, которые из-за образования дисульфидной связи были
неспособны к диссоциации (рис. 24, В). Действительно, больший по амплитуде пик на
профиле элюции при гель-фильтрации окисленного Hsp22Cys соответствует кажущейся
молекулярной массе 44 кДа, то есть «сшитому» димеру.
По всей видимости, окисление «цистеиновых» мутантов αB-кристаллина, Hsp20 и
Hsp22,
сопровождающееся
образованием
дисульфидной
связи
между
разными
мономерами sHsp, не приводит к значительным изменениям в структуре исследуемых
белков. С помощью примененных методов мы обнаружили лишь небольшие различия во
вторичной структуре, не выявили различий в третичной структуре αB-CryCys, Hsp20Cys и
Hsp22Cys в окисленном и восстановленном состоянии, а также в олигомерном состоянии
в случае αB-CryCys и Hsp20Cys. Это хорошо согласуется с данными Завьялова и соавт.
(Zavialov et al., 1998a), которые показали, что образование дисульфидной связи при
окислении малого белка теплового шока мыши Hsp25 (этот белок гомологичен Hsp27
человека и также содержит единственный остаток цистеина) не сопровождается
изменениями во вторичной структуре, олигомерном состоянии и шаперонной активности
этого белка. Более того, отсутствие наблюдаемых изменений при образовании
дисульфидного мостика еще раз свидетельствует о близком расположении остатков
цистеина в димерах малых белков теплового шока.
68
4.4.
Исследование белок-белковых взаимодействий в
гетероолигомерах «цистеиновых» мутантов sHsp
человека
Представленные результаты свидетельствуют о том, что все исследуемые
«цистеиновые» мутанты sHsp эффективно образуют дисульфидные связи внутри
гомодимеров. Опираясь на эти данные, мы попытались использовать «цистеиновые»
мутанты для изучения взаимодействий между различными малыми белками теплового
шока в составе гетероолигомерных комплексов. В случае успеха мы предполагали
обнаружить гетеродимеры взаимодействующих белков, которые были бы «сшиты»
дисульфидной связью.
Мы инкубировали попарно различные предварительно восстановленные sHsp в
эквимолярном соотношении при 42° С для образования гетероолигомерных комплексов
(Bukach et al., 2009), а затем проводили окисление путем диализа против буфера, не
содержащего восстановителей. Белковый состав полученных образцов анализировали
методом градиентного электрофореза (Walker, 2002), проводимого в отсутствие
восстановителей (рис. 25). На всех дорожках, соответствующих смеси двух sHsp
(центральные
дорожки),
обнаруживается
полоса,
отличающаяся
по
кажущейся
молекулярной массе от полос гомодимеров sHsp, входящих в состав смеси. Эта полоса
соответствует гетеродимерам «цистеиновых» мутантов sHsp, либо Hsp27 дикого типа,
«сшитым» дисульфидной связью.
Проанализируем полученные результаты для каждой пары малых белков теплового
шока.
В
парах
Hsp22-Hsp20
и
Hsp22-αВ-кристаллин
интенсивность
полос,
соответствующих гетеродимерам этих белков, незначительно ниже, чем интенсивность
полос гомодимеров (рис. 25, А и В). Это может означать, что более вероятным
оказывается
образование
гомодимеров
αВ-кристаллина,
Hsp20
и
Hsp22,
чем
гетеродимеров этих белков. К сожалению, нам не удалось исследовать возможность
образования комплексов между Hsp27 и Hsp22. Это обусловлено тем, что кажущиеся
молекулярные массы гомо- и гетеродимеров этих белков очень близки, поэтому на
электрофореграмме не удается разделить соответствующие полосы. (Следует отметить,
что при гель-фильтрации смеси, содержащей данную пару белков, электрофоретический
анализ собранных фракций показал, что пики, в которых элюируются Hsp27 и Hsp22,
практически не перекрываются (данные не представлены)).
69
Б)
A)
B)
97,0
66,2
45,0
31,0
n
21,5
14,4
Г)
Д)
97,0
66,2
45,0
31,0
21,5
14,4
Рис. 25. Образование гетероолигомеров малыми белками теплового шока человека.
А) Hsp22Cys + Hsp20Cys, Б) αB-CryCys + Hsp20, B) Hsp22Cys + αB-CryCys, Г) Hsp27WT +
Hsp20Cys, Д) Hsp27WT + αB-CryCys. На всех рисунках крайние дорожки соответствуют
изолированным белкам, а центральная - их эквимолярной смеси. Красной стрелкой
указаны полосы, соответствующие гетеродимерам. Положение белков-стандартов
обозначено слева.
В
паре
Hsp20-αВ-кристаллин
окисление
приводит
к
появлению
полосы
гетеродимера, интенсивность которой больше интенсивности полос гомодимеров (рис. 25,
Б). По всей видимости, вероятность образования как гомо-, так и гетеродимеров этих
белков примерно одинакова, и, следовательно, эти белки свободно взаимодействуют
между собой. В паре Hsp20-Hsp27 вероятность образования гетероолигомерного
комплекса оказывается еще выше, чем в предыдущем случае и при этом формирование
такого
комплекса
сопровождается
уменьшением
вероятности
формирования
гомоолигомеров (рис. 25, Г). Аналогичные результаты были получены и в случае смеси
Hsp27-αВ-кристаллин (рис. 25, Д).
70
Таблица 6. Образование гомо- и гетеродимеров между Hsp27 дикого типа и
«цистеиновыми» мутантами sHsp человека
Hsp27
αB-Cry
Hsp20
Hsp22
Hsp27
+
+
+
±?
αB-Cry
+
+
+
±
Hsp20
+
+
+
±
Hsp22
±?
±
±
+
Примечания: + - образуются гетеродимеры, «сшитые» дисульфидной связью;
± - вероятность образования гетеродимеров невысокая.
В таблице 6 представлены качественные данные, касающиеся образования гомо- и
гетеродимеров четырьмя малыми белками теплового шока человека. Как следует из
таблицы, все белки эффективно образуют гомодимеры. Три белка, αB-кристаллин, Hsp27
и Hsp20, эффективно образуют гетеродимеры, сшитые дисульфидной связью. Ранее
возможность образования гетероолигомеров этих белков постулировалась в литературе
(Bukach et al., 2009; Kato et al., 1994a; Pipkin et al., 2003; Sugiyama et al., 2000; Zantema et
al., 1992), однако ни в одном случае не были получены ковалентно сшитые комплексы
указанных белков.
Наши результаты, касающиеся Hsp22, в определенной степени отличаются от
данных литературы. Как уже было показано, Hsp22 эффективно образует гомодимеры, в
то же время, вероятность его «сшивания» со всеми остальными исследованными малыми
белками теплового шока меньше, чем вероятность образования гетеродимеров других
проанализированных парах белков. В этом отношении наши результаты отличаются от
данных из лаборатории Бенндорфа (Fontaine et al., 2005; Sun et al., 2004), в которых
постулируется, что Hsp22 эффективно взаимодействует практически со всеми sHsp
человека. В то же время наши результаты хорошо коррелируют с данными Чавеса Зобеля
и соавт., которые показали, что при коиммунопреципитации Hsp22 слабо взаимодействует
как с αB-кристаллином, так и Hsp27 (Chavez Zobel et al., 2003).
Формирование гетероолигомеров, по всей видимости, является довольно сложным
процессом. До последнего времени считалось, что крупные олигомеры формируются
путем обмена и встраивания димеров (это в наибольшей степени относится к крупным
олигомерам α-кристаллина и Hsp27) (Sugiyama et al., 2000). В то же время, результаты
последних лет свидетельствуют о том, что в ходе формирования олигомеров
строительными блоками могут служить не только димеры, но и мономеры малых белков
71
теплового шока (Benesch et al., 2008). В нашем случае формирование гетеродимеров
возможно только в том случае, если димеры, диссоциировавшие из крупных олигомеров,
способны обмениваться субъединицами с димерами других малых белков теплового шока
или если изолированные мономеры одного белка теплового шока оказываются
способными проникать внутрь олигомеров другого малого белка теплового шока с
образованием смешанных димеров внутри олигомеров. Вопрос о том, каким образом
встраивание чужеродных мономеров влияет на олигомерное состояние гомоолигомеров
малых белков теплового шока явится предметом дальнейших исследований. При этом мы
надеемся, что использование «цистеиновых» мутантов позволит приблизиться к
пониманию того, как устроены гомо- и гетероолигомеры малых белков теплового шока
человека.
72
Выводы
1.
Получены высокоочищенные препараты Hsp20 дикого типа (Hsp20WT), а также
«цистеиновых»
мутантов
Hsp20,
Hsp22
и
αB-кристаллина,
содержащих
единственный остаток цистеина в положении, гомологичном Cys137 Hsp27;
2. «Цистеиновые» мутанты малых белков теплового шока мало отличаются от белков
дикого типа по структуре и шаперонной активности. В то же время введение
точечных мутаций в Hsp20 не сопровождается значительными изменениями
структуры, но приводит к уменьшению шаперонной активности;
3.
Участок, расположенный поблизости от вводимого остатка цистеина (петля,
соединяющая β5- и β7-складки) играет важную роль в образовании гомо- и
гетеродимеров различных sHsp человека;
4. Три малых белка теплового шока человека (αB-кристаллин, Hsp20 и Hsp27)
способны эффективно образовывать гетеродимеры между собой. Hsp22 также
способен образовывать гетеродимеры с другими малыми белками теплового шока,
однако вероятность встраивания этого белка в гетеродимерные комплексы меньше
вероятности встраивания других малых белков теплового шока.
73
Благодарности
Автор выражает признательность в первую очередь своему научному руководителю
Гусеву Николаю Борисовичу за всестороннюю помощь и поддержку в работе. Его советы
были неоценимы при выполнении работы, и, я думаю, помогут мне в дальнейшем при
работе в области биохимии.
Также автор благодарен сотрудникам лаборатории О.В. Букач, А.А. Шеметову, Н.Н.
Случанко, А.Е. Глуховой за плодотворное сотрудничество на протяжении курсовой и
дипломной работы, а также к.б.н. А.С. Сейт-Неби за методические советы и
предоставление молекулярно-биологических конструктов, использованных в работе.
Автор благодарен д.б.н. Д.И. Левицкому и к.б.н. А.В. Пивоваровой за помощь в
проведении экспериментов по круговому дихроизму.
Отдельно хочется поблагодарить сотрудников кафедры биохимии Биологического
факультета МГУ имени Ломоносова за приобретенные знания и умения, полученные за
время обучения на кафедре.
74
Список литературы
Болотина, И. А. (1973). Изучение структуры белков методом кругового дихроизма,
Итоги науки и техники, Молекулярная биология, M.: ВИНИТИ, сс. 61-104.
Гусев, Н. Б., Букач, О. В., Марстон, С. Б. (2005) Структура, свойства и возможная
физиологическая роль малого белка теплового шока с молекулярной массой 20
кДа (Hsp20, HspB6). Биохимия, 70, 762 - 772.
Казаков, А. С. (2006) Некоторые физико-химические свойства малого белка
теплового шока Hsp22 и двух его точечных мутантов. Дипломная работа, МГУ,
Биологический факультет.
Остерман, Л. А. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот, М.: Наука, 536.
Панасенко, О. О., Ким, М. В., Гусев, Н. Б. (2003) Структура и свойства малых белков
теплового шока. Успехи биологической химии, 43, 59-98.
Пермяков, Е. А. (2003) Метод собственной люминесценции белка, М.: Наука, 189.
Практикум по биохимии: Учебное пособие/ Под ред. С.Е Северина, Г.А. Соловьевой,
М.: Изд-во МГУ, 1989, 509 с..
Benesch, J. L., Ayoub, M., Robinson, C. V. and Aquilina, J. A. (2008) Small heat shock
protein activity is regulated by variable oligomeric substructure. J. Biol. Chem., 283,
28513-28517.
Benndorf, R., Hayess, K., Ryazantsev, S., Wieske, M., Behlke, J. and Lutsch, G. (1994)
Phosphorylation and supramolecular organization of murine small heat shock protein
HSP25 abolish its actin polymerization-inhibiting activity. J. Biol. Chem., 269,
20780-20784.
Berengian, A. R., Parfenova, M. and McHaourab, H. S. (1999) Site-directed spin labeling
study of subunit interactions in the alpha-crystallin domain of small heat-shock
proteins. Comparison of the oligomer symmetry in alphaA-crystallin, HSP 27, and
HSP 16.3. J. Biol. Chem., 274, 6305-6314.
Bruey, J. M., Ducasse, C., Bonniaud, P., Ravagnan, L., Susin, S. A., Diaz-Latoud, C.,
Gurbuxani, S., Arrigo, A. P., Kroemer, G., Solary, E. and Garrido, C. (2000) Hsp27
negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat. Cell Biol., 2,
645-652.
Bukach, O. V., Glukhova, A. E., Seit-Nebi, A. S. and Gusev, N. B. (2009)
Heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins HspB1
(Hsp27) and HspB6 (Hsp20). Biochim Biophys Acta, 1794, 486-495.
75
Bukach, O. V., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2005) Small heat shock protein with
apparent molecular mass 20 kDa (Hsp20, HspB6) is not a genuine actin-binding
protein. J. Muscle Res. Cell Motil., 26, 175-181.
Bukach, O. V., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2004) Some properties
of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur. J. Biochem., 271, 291-302.
Carra, S., Brunsting, J. F., Lambert, H., Landry, J. and Kampinga, H. H. (2009) HspB8
participates in protein quality control by a non-chaperone-like mechanism that
requires eIF2{alpha} phosphorylation. J. Biol. Chem., 284, 5523-5532.
Chavez Zobel, A. T., Loranger, A., Marceau, N., Theriault, J. R., Lambert, H. and Landry,
J. (2003) Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by
the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum. Mol. Genet., 12, 16091620.
Chernik, I. S., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2007) Small heat shock
protein Hsp20 (HspB6) as a partner of 14-3-3gamma. Mol. Cell Biochem., 295, 9-17.
Dreiza, C. M., Brophy, C. M., Komalavilas, P., Furnish, E. J., Joshi, L., Pallero, M. A.,
Murphy-Ullrich, J. E., von Rechenberg, M., Ho, Y. S., Richardson, B., Xu, N., Zhen,
Y., Peltier, J. M. and Panitch, A. (2005) Transducible heat shock protein 20 (HSP20)
phosphopeptide alters cytoskeletal dynamics. Faseb J., 19, 261-263.
Dudich, I. V., Zav'yalov, V. P., Pfeil, W., Gaestel, M., Zav'yalova, G. A., Denesyuk, A. I.
and Korpela, T. (1995) Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small
heat-shock proteins. Biochim Biophys Acta, 1253, 163-168.
Eaton, P., Fuller, W. and Shattock, M. J. (2002) S-thiolation of HSP27 regulates its
multimeric aggregate size independently of phosphorylation. J. Biol. Chem., 277,
21189-21196.
Ecroyd, H. and Carver, J. A. (2009) Crystallin proteins and amyloid fibrils. Cell Mol. Life
Sci., 66, 62-81.
Eifert, C., Burgio, M. R., Bennett, P. M., Salerno, J. C. and Koretz, J. F. (2005) N-terminal
control of small heat shock protein oligomerization: changes in aggregate size and
chaperone-like function. Biochim Biophys Acta, 1748, 146-156.
Fan, G. C., Chu, G., Mitton, B., Song, Q., Yuan, Q. and Kranias, E. G. (2004) Small heatshock protein Hsp20 phosphorylation inhibits beta-agonist-induced cardiac apoptosis.
Circ. Res., 94, 1474-1482.
Fontaine, J. M., Sun, X., Benndorf, R. and Welsh, M. J. (2005) Interactions of HSP22
(HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 337, 1006-1011.
76
Ghosh, J. G. and Clark, J. I. (2005) Insights into the domains required for dimerization and
assembly of human alphaB crystallin. Protein Sci., 14, 684-695.
Ghosh, J. G., Estrada, M. R. and Clark, J. I. (2005) Interactive domains for chaperone
activity in the small heat shock protein, human alphaB crystallin. Biochemistry, 44,
14854-14869.
Ghosh, J. G., Shenoy, A. K., Jr. and Clark, J. I. (2007) Interactions between important
regulatory proteins and human alphaB crystallin. Biochemistry, 46, 6308-6317.
Gober, M. D., Smith, C. C., Ueda, K., Toretsky, J. A. and Aurelian, L. (2003) Forced
expression of the H11 heat shock protein can be regulated by DNA methylation and
trigger apoptosis in human cells. J. Biol. Chem., 278, 37600-37609.
Haslbeck, M., Franzmann, T., Weinfurtner, D. and Buchner, J. (2005) Some like it hot: the
structure and function of small heat-shock proteins. Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 842846.
Haugland (1996) Molecular Probes, 319-320.
Horwitz, J. (2000) The function of alpha-crystallin in vision. Semin. Cell Dev. Biol., 11, 5360.
Horwitz, J. (2009) Alpha crystallin: the quest for a homogeneous quaternary structure. Exp.
Eye Res., 88, 190-194.
Ikeda, Y., Abe, A., Ishida, C., Takahashi, K., Hayasaka, K. and Yamada, M. (2009) A
clinical phenotype of distal hereditary motor neuronopathy type II with a novel
HSPB1 mutation. J. Neurol. Sci., 277, 9-12.
Irobi, J., Van Impe, K., Seeman, P., Jordanova, A., Dierick, I., Verpoorten, N., Michalik,
A., De Vriendt, E., Jacobs, A., Van Gerwen, V., Vennekens, K., Mazanec, R.,
Tournev, I., Hilton-Jones, D., Talbot, K., Kremensky, I., Van Den Bosch, L.,
Robberecht, W., Van Vandekerckhove, J., Van Broeckhoven, C., Gettemans, J., De
Jonghe, P. and Timmerman, V. (2004) Hot-spot residue in small heat-shock protein
22 causes distal motor neuropathy. Nat. Genet., 36, 597-601.
Ito, H., Kamei, K., Iwamoto, I., Inaguma, Y., Nohara, D. and Kato, K. (2001)
Phosphorylation-induced change of the oligomerization state of alpha B-crystallin. J.
Biol. Chem., 276, 5346-5352.
Kasakov, A. S., Bukach, O. V., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2007)
Effect of mutations in the beta5-beta7 loop on the structure and properties of human
small heat shock protein HSP22 (HspB8, H11). Febs J., 274, 5628-5642.
Kato, K., Goto, S., Inaguma, Y., Hasegawa, K., Morishita, R. and Asano, T. (1994a)
Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to
alpha B crystallin. J. Biol. Chem., 269, 15302-15309.
77
Kato, K., Hasegawa, K., Goto, S. and Inaguma, Y. (1994b) Dissociation as a result of
phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, hsp27. J. Biol.
Chem., 269, 11274-11278.
Kim, K. K., Kim, R. and Kim, S. H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein.
Nature, 394, 595-599.
Kim, M. V., Kasakov, A. S., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2006)
Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22
(HspB8, H11) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch. Biochem.
Biophys., 454, 32-41.
Kim, M. V., Seit-Nebi, A. S., Marston, S. B. and Gusev, N. B. (2004) Some properties of
human small heat shock protein Hsp22 (H11 or HspB8). Biochem. Biophys. Res.
Commun., 315, 796-801.
Komalavilas, P., Penn, R. B., Flynn, C. R., Thresher, J., Lopes, L. B., Furnish, E. J., Guo,
M., Pallero, M. A., Murphy-Ullrich, J. E. and Brophy, C. M. (2008) The small heat
shock-related protein, HSP20, is a cAMP-dependent protein kinase substrate that is
involved in airway smooth muscle relaxation. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol.
Physiol., 294, L69-78.
Kumar, L. V., Ramakrishna, T. and Rao, C. M. (1999) Structural and functional
consequences of the mutation of a conserved arginine residue in alphaA and alphaB
crystallins. J. Biol. Chem., 274, 24137-24141.
Kumar, P. A., Kumar, M. S. and Reddy, G. B. (2007) Effect of glycation on alphacrystallin structure and chaperone-like function. Biochem. J., 408, 251-258.
Leroux, M. R., Ma, B. J., Batelier, G., Melki, R. and Candido, E. P. (1997) Unique
structural features of a novel class of small heat shock proteins. J. Biol. Chem., 272,
12847-12853.
McHaourab, H. S., Godar, J. A. and Stewart, P. L. (2009) Structure and Mechanism of
Protein Stability Sensors: Chaperone Activity of Small Heat Shock Proteins.
Biochemistry.
Michiel, M., Skouri-Panet, F., Duprat, E., Simon, S., Ferard, C., Tardieu, A. and Finet, S.
(2009) Abnormal assemblies and subunit exchange of alphaB-crystallin R120
mutants could be associated with destabilization of the dimeric substructure.
Biochemistry, 48, 442-453.
Murugesan, R., Santhoshkumar, P. and Sharma, K. K. (2008) Role of alphaBI5 and
alphaBT162 residues in subunit interaction during oligomerization of alphaBcrystallin. Mol. Vis., 14, 1835-1844.
78
Narberhaus,
F.
(2002)
Alpha-crystallin-type
heat
shock
proteins:
socializing
minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol. Mol. Biol.
Rev., 66, 64-93; table of contents.
Outeiro, T. F., Klucken, J., Strathearn, K. E., Liu, F., Nguyen, P., Rochet, J. C., Hyman, B.
T. and McLean, P. J. (2006) Small heat shock proteins protect against alphasynuclein-induced toxicity and aggregation. Biochem. Biophys. Res. Commun., 351,
631-638.
Perng, M. D., Muchowski, P. J., van Den, I. P., Wu, G. J., Hutcheson, A. M., Clark, J. I.
and Quinlan, R. A. (1999) The cardiomyopathy and lens cataract mutation in alphaBcrystallin alters its protein structure, chaperone activity, and interaction with
intermediate filaments in vitro. J. Biol. Chem., 274, 33235-33243.
Pipkin, W., Johnson, J. A., Creazzo, T. L., Burch, J., Komalavilas, P. and Brophy, C.
(2003) Localization, macromolecular associations, and function of the small heat
shock-related protein HSP20 in rat heart. Circulation, 107, 469-476.
Rembold, C. M., Foster, D. B., Strauss, J. D., Wingard, C. J. and Eyk, J. E. (2000) cGMPmediated phosphorylation of heat shock protein 20 may cause smooth muscle
relaxation without myosin light chain dephosphorylation in swine carotid artery. J.
Physiol., 524 Pt 3, 865-878.
Rogalla, T., Ehrnsperger, M., Preville, X., Kotlyarov, A., Lutsch, G., Ducasse, C., Paul, C.,
Wieske, M., Arrigo, A. P., Buchner, J. and Gaestel, M. (1999) Regulation of Hsp27
oligomerization, chaperone function, and protective activity against oxidative
stress/tumor necrosis factor alpha by phosphorylation. J. Biol. Chem., 274, 1894718956.
Salinthone, S., Tyagi, M. and Gerthoffer, W. T. (2008) Small heat shock proteins in smooth
muscle. Pharmacol. Ther., 119, 44-54.
Sharma, K. K., Kaur, H., Kumar, G. S. and Kester, K. (1998) Interaction of 1,1'-bi(4anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid with alpha-crystallin. J. Biol. Chem., 273,
8965-8970.
Shemetov, A. A., Seit-Nebi, A. S. and Gusev, N. B. (2008) Structure, properties, and
functions of the human small heat-shock protein HSP22 (HspB8, H11, E2IG1): a
critical review. J. Neurosci. Res., 86, 264-269.
Shroff, N. P., Cherian-Shaw, M., Bera, S. and Abraham, E. C. (2000) Mutation of R116C
results in highly oligomerized alpha A-crystallin with modified structure and
defective chaperone-like function. Biochemistry, 39, 1420-1426.
Simon, S., Fontaine, J. M., Martin, J. L., Sun, X., Hoppe, A. D., Welsh, M. J., Benndorf, R.
and Vicart, P. (2007) Myopathy-associated alphaB-crystallin mutants: abnormal
79
phosphorylation, intracellular location, and interactions with other small heat shock
proteins. J. Biol. Chem., 282, 34276-34287.
Slavik, J. (1982) Anilinonaphthalene sulfonate as a probe of membrane composition and
function. Biochim Biophys Acta, 694, 1-25.
Sreelakshmi, Y., Santhoshkumar, P., Bhattacharyya, J. and Sharma, K. K. (2004) AlphaAcrystallin interacting regions in the small heat shock protein, alphaB-crystallin.
Biochemistry, 43, 15785-15795.
Sreerama, N. and Woody, R. W. (2000) Estimation of protein secondary structure from
circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR
methods with an expanded reference set. Anal. Biochem., 287, 252-260.
Stamler, R., Kappe, G., Boelens, W. and Slingsby, C. (2005) Wrapping the alpha-crystallin
domain fold in a chaperone assembly. J. Mol. Biol., 353, 68-79.
Sugiyama, Y., Suzuki, A., Kishikawa, M., Akutsu, R., Hirose, T., Waye, M. M., Tsui, S.
K., Yoshida, S. and Ohno, S. (2000) Muscle develops a specific form of small heat
shock protein complex composed of MKBP/HSPB2 and HSPB3 during myogenic
differentiation. J. Biol. Chem., 275, 1095-1104.
Sun, X., Fontaine, J. M., Rest, J. S., Shelden, E. A., Welsh, M. J. and Benndorf, R. (2004)
Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. J. Biol.
Chem., 279, 2394-2402.
Sun, Y. and MacRae, T. H. (2005) The small heat shock proteins and their role in human
disease. Febs J., 272, 2613-2627.
Theriault, J. R., Lambert, H., Chavez-Zobel, A. T., Charest, G., Lavigne, P. and Landry, J.
(2004) Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylationactivated protective function of mammalian Hsp27. J. Biol. Chem., 279, 2346323471.
van Montfort, R. L., Basha, E., Friedrich, K. L., Slingsby, C. and Vierling, E. (2001)
Crystal structure and assembly of a eukaryotic small heat shock protein. Nat. Struct.
Biol., 8, 1025-1030.
Vos, M. J., Hageman, J., Carra, S. and Kampinga, H. H. (2008) Structural and functional
diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ
chaperone families. Biochemistry, 47, 7001-7011.
Walker, J. M. (2002). Gradient SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins in
Walker, J. M. (Ed), The Protein Protocols Handbook: Second Edition: Humana Press
Inc., pp. 69-72.
80
Zantema, A., Verlaan-De Vries, M., Maasdam, D., Bol, S. and van der Eb, A. (1992) Heat
shock protein 27 and alpha B-crystallin can form a complex, which dissociates by
heat shock. J. Biol. Chem., 267, 12936-12941.
Zavialov, A., Benndorf, R., Ehrnsperger, M., Zav'yalov, V., Dudich, I., Buchner, J. and
Gaestel, M. (1998a) The effect of the intersubunit disulfide bond on the structural and
functional properties of the small heat shock protein Hsp25. Int. J. Biol. Macromol.,
22, 163-173.
Zavialov, A. V., Gaestel, M., Korpela, T. and Zav'yalov, V. P. (1998b) Thiol/disulfide
exchange between small heat shock protein 25 and glutathione. Biochim Biophys
Acta, 1388, 123-132.
81