и ус ар ел

ус
и
ар
ел
кБ
ем
ия
н
ау
СЕРЫЯ БIЯЛАГIЧНЫХ НАВУК 2011 № 4
СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК 2011 № 4
ак
ад
ЗАСНАВАЛЬНIК – НАЦЫЯнальнАЯ АКАДЭМIЯ НАВУК БЕЛАРУСI
Часопіс выдаецца са студзеня 1956 г.
Выходзіць чатыры разы ў год
ая
ЗМЕСТ
На
ци
он
ал
ьн
Рупасова Ж. А., Яковлев А. П., Лиштван И. И., Жданец С. Ф. Особенности развития вегетативной
сферы таксонов рода Vaccinium в опытной культуре на выбывшем из промышленной эксплуатации торфяном
месторождении севера Беларуси.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Павловский Н. Б. Сохраняемость плодов разных сортов и видов голубики, интродуцированных
в Беларуси . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Корнеева Г. И. Анатомия корня гибридных форм рода фаленопсис (Phalaenopsis Blume). . . . . . . . . . . . . . . .
Жудрик Е. В. Особенности онтогенеза Strelitzia reginae banks при культивировании в Беларуси. . . . . . . . . Корень Л. В., Орловская О. А., Хотылева Л. В. Генетический анализ формирования хозяйственно
ценных признаков у отдаленных гибридов пшеницы (Тriticum aestivum). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ермишина Н. М., Кременевская Е. М., Гукасян О. Н., Буштевич В. Н., Гриб С. И., Лемеш В. А.
Использование ДНК-маркеров для создания D/R-замещенных форм тритикале с оптимальным аллельным
составом локуса Glu-D1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Кудряшова О. А., Водчиц М. П., Глеб Е. П., Гук Е. С., Волотович А. А. Стимуляция роста и развития
листопадных форм Rhododendron in vivo с использованием установки освещения на основе светодиодов. . . . . Дремук И. А., Шалыго Н. В. Окислительные процессы и проницаемость клеточных мембран в проростках
ячменя (Hordeum vulgare) при совместном действии низкотемпературного и водного стресса.. . . . . . . . . . . . . . . Важинская И. С., Купцов В. Н., Коломиец Э. И., Новик Г. И., Кантерова А. В. Криоконсервация как
эффективный способ хранения фитопатогенных грибов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
15
20
26
35
41
46
52
57
1
ус
и
АГЛЯДЫ
ау
кБ
ел
ар
Верещако Г. Г., Горох Г. А., Федосенко О. Л., Гунькова Н. В. Влияние феноболина на некоторые показатели
крови, репродуктивной системы и уровень гормонов в сыворотке крови крыс-самцов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Виноградов В. В., Туманов А. В., Виноградов С. В., Мацюк Я. Р., Андреев В. П., Смыковская Т. Ю.,
Яроцкий Ю. В. Стресс и генетический триггер тироцитов у крыс. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Гринько В. Н., Якимович Н. Н., Бильдюкевич А. А., Якимович И. В. Влияние составов питательной
среды на биосинтез L-лейцина культурой Corynebacterium glutamicum AC-L. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Романовская Т. В., Северин И. Н., Космачева С. М., Потапнев М. П., Гринев В. В. Разработка нового
лентивирусного вектора доставки для эктопической экспрессии гена одноцепочечного инсулина в мезенхимальных стволовых клетках человека. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Владимирская Т. Э., Швед И. А., Криворот С. Г., Веялкина Н. Н., Адамович А. В. Определение фаз
эстрального цикла белых крыс по клеточному составу влагалищных мазков. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Дроздов А. С., Чумакова Д. В., Бокуть О. С., Докучаева Е. А., Квасюк Е. И., Бокуть С. Б. Получение
гликогемоглобинов человека А1а1 и А1а2 с использованием киназной системы Saccharomyces cerevisiae . . . . . . .
Самусенко И. Э. Факторы, влияющие на успех размножения белого аиста Ciconia ciconia в пойме реки
Припять. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Анисимова Е. И., Пенькевич В. А., Вяль Ю. С. Гельминтофауна европейского зубра (Bison bonasus) на
территории Беларуси. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Шималов В. В. Встречаемость Echinococcus multilocularis (Cestoda, Taeniidae) в юго-западной части
Беларуси . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ем
ия
н
Волк М. В., Лобанок Е. С., Волотовский П. А. Хондрогенный потенциал мезенхимных стволовых
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
68
77
82
88
92
99
103
108
113
Вучоныя беларусі
121
ая
ак
ад
Памяти Елены Брониславовны Яронской . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ал
ьн
ИЗВЕСТИЯ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ 2011 № 4
Серия биологических наук
на русском, белорусском и английском языках
Тэхнічны рэдактар М. В. С а в і ц к а я
Камп’ютарная вёрстка Ю. В. Д з я н і ш ч ы к
ци
он
Здадзена ў набор 19.09.2011. Падпісана ў друк 21.10.2011. Выхад у свет 27.10.2011. Фармат 60 × 841/8. Папера афсетная. Ум. друк. арк. 14,88.
Ул.-выд. арк. 16,4. Тыраж 130 экз. Заказ 251.
Кошт нумару: індывідуальная падпіска – 19 380 руб., ведамасная падпіска – 49 174 руб.
Рэспубліканскае ўнітарнае прадпрыемства «Выдавецкі дом «Беларуская навука». ЛИ № 02330/0494405 ад 27.03.2009.
Вул. Ф. Скарыны, 40. 220141, Мінск. Пасведчанне аб рэгістрацыі № 395 ад 18.05.2009.
На
Надрукавана ў РУП «Выдавецкі дом «Беларуская навука».
© Выдавецкі дом «Беларуская навука».
Весці НАН Беларусі. Серыя біялагічных навук, 2011
ар
ус
и
PROCEEDINGS
OF THE NATIONAL ACADEMY
ел
OF SCIENCES OF BELARUS
кБ
BIOLOGICAL SERIES 2011 N 4
ау
FOUNDER IS THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF BELARUS
The Journal has been published since January 1956
ем
ия
н
Issued four times a year
Contents
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Rupasova Zh. A., Yakovlev A. P., Lishtvan I. I., Zhdanets S. F. Peculiarities of development of vegetative
sphere taxons of genus Vaccinium in practiced culture on the opencast peat fields of the north of Belarus . . . . . . . . . . . Pavlovski N. B. Safety of different taxa berry blueberry introduced into Belarus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Karneyeva H. I. The root anatomy of hybrid forms of genus phalaenopsis (Phalaenopsis blume) . . . . . . . . . . . . . Zhudryk E. V. Features of ontogenesis Strelitzia reginae banks at cultivation in Republic of Belarus . . . . . . . . . . Koren L. V., Orlovskaya O. A., Khotyleva L. V. Genetic analysis of agronomic traits formation in remote wheat
hybrids (Triticum aestivum) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Yermishina N. M., Kremenevskaya E. M., Gukasian O. N., Bushtevich V. N., Grib S. I., Lemesh V. A. Use of
DNA-markers for development of D/R-substituted forms of triticale with optimal allele composition of Glu-D1 locus . Kudryashova O. A., Vodchic M. P., Gleb E. P., Guk E. S., Volotovich A. A. Stimulation of growth and development of Rhododendron deciduous plants in vivo using of emplacement of illumination on the basis of light-emitting
diodes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Dremuk I. A., Shalygo N. V. Oxidative processes and cell membrane permeability in barley (Hordeum vulgare)
seedlings under combined action of low temperature and flooding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vazhynskay I. S., Kuptsov V. N., Kolomiets E. I., Novik G. I., Kanterova A. V. Cryoconsevation as an
effective method of preserving phytopathogenic fungi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vereshchako G. G., Goroch G. А., Fedosenko O. L., Gunkova N. V. The effects of phenoboline on some indicators
of the blood, reproductive system and level of hormones in rats-males of serum blood . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vinogradov V. V., Tumanov A. V., Vinogradov S. V., Matsyuk Ya. R., Andreyev V. P., Smykovskaya T. Yu.,
Yarotsky Yu. V. Stress and thyrocyte genetic trigger at rats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Grin’ko V. N., Yakimovich N. N., Bildyukevich A. A., Yakimovich I. V. Influence of structures of a nutrient
medium on biosynthesis L-leycine by culture Corynebacterium glutamicum AC-L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . На
Ramanouskaya T. V., Severin I. N., Kosmachevа S. M., Potapnev M. P., Grinev V. V. Development of new
lentiviral transfer vector for ectopic expression of single-chain insulin-coding gene in human mesenchimal
stem cells. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Vladimirskaya T. E., Shved I. A., Kryvorot S. G., Veyalkina N. N., Adamovich A. V. Determination
of the estrous cycle phases of white rats according to cellular makeup of vaginal smears . . . . . . . . . . . . . . . . 5
15
20
26
35
41
46
52
57
63
68
77
82
88
3
ус
и
ар
Drazdou A. S., Chumakova D. V., Bokut O. S., Dokuchaeva E. A., Kvasyuk E. I., Bokut S. B. Reception of
human glycohemoglobins а1а1 and а1а2 with use saccharomyces cerevisiae kinase system. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Samusenko I. E. Factors influencing white stork Ciconia ciconia breeding success at the Pripyat river floodplain.
Anisimova E. I., Penkevich V. A., Vial Y. S. Helminth fauna of europian bison (bison bonasus) on the territory
of Belarus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Shimalov V. V. The prevalence of Echinococcus multilocularis (Cestoda, Taeniidae) in south-west of Belarus . . . Reviews
ел
Volk M. V., Lobanok E. S., Volotovski P. A. Chondrogenic potential of mesenchymal stem cells . . . . . . . . . . . . scientists of belarus
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
In memory of Elena Bronislavovna Yaronskaya . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
99
103
108
113
121
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 634.739.3:736(476)
ел
Ж. А. РУПАСОВА1, А. П. ЯКОВЛЕВ1, И. И. ЛИШТВАН2, С. Ф. ЖДАНЕЦ1
кБ
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ВЕГЕТАТИВНОЙ СФЕРЫ ТАКСОНОВ РОДА VACCINIUM
В ОПЫТНОЙ КУЛЬТУРЕ НА ВЫБЫВШЕМ ИЗ ПРОМЫШЛЕННОЙ ЭКСПЛУАТАЦИИ
ТОРФЯНОМ МЕСТОРОЖДЕНИИ СЕВЕРА БЕЛАРУСИ
Центральный ботанический НАН Беларуси, Минск, e-mail: A.Yakovlev@cbg.by,
2
Институт природопользования НАН Беларуси, Минск
ау
1
(Поступила в редакцию 27.05.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В связи с обоснованием перспективности использования Вересковых для фиторекультивации выбывших из промышленной эксплуатации торфяных месторождений севера
Беларуси особый научный и практический интерес представляет исследование особенностей
развития вегетативной сферы таксонов рода Vaccinium в специфических условиях произрастания на малоплодородном остаточном слое торфяной залежи.
С этой целью при выполнении задания Государственной программы «Торф» в Глубокском
р-не Витебской обл. в условиях опытной культуры было проведено сравнительное исследование
биометрических параметров текущего прироста вегетативных органов 6 аборигенных и интродуцированных таксонов рода Vaccinium в контрастные по гидротермическому режиму сезоны
2009 и 2010 гг. Первый из них по основным его характеристикам оказался близким к многолетней климатической норме, тогда как второй был чрезвычайно жарким и засушливым.
Объекты и методы исследований. В качестве объектов исследований были привлечены
вступившие в генеративный период развития следующие таксоны рода Vaccinium – голубика топяная V. uliginosum L., выбранная в качестве эталона сравнения, голубика узколистная V. angustifolium L.,
голубика щитковая (высокорослая) V. corymbosum L. (сорт Bluecrop), их межвидовые гибриды
(V. angustifolium × V. corymbosum) − сорта Northblue и Northcountry, а также брусника обыкновенная
V. vitis-idaea L.
В конце каждого вегетационного сезона на опытных делянках путем бесповторного случайного отбора формировали выборки из 10 растений, характеризующие на момент наблюдений генеральную совокупность объектов [1]. У выбранных растений определяли количество и суммарные значения длины побегов с дифференциацией их на побеги формирования и ветвления.
Наряду с этим проводили замеры опытных растений голубик по высоте и диаметру кроны, который определяли как среднее арифметическое промеров в двух перпендикулярных направлениях: север–юг, запад–восток. Объем кроны вычисляли по формуле, предложенной немецким исследователем Г. Либстером [2].
Для вычисления индекса листа определяли среднее количество и усредненные параметры
длины и ширины листовых пластинок, сформировавшихся на обеих категориях побегов, с определением степени облиственности последних, характеризуемой количеством листьев, приходящимся на 10 см длины побега.
Результаты и обсуждение. Результаты проведенных исследований выявили существенные
генотипические различия в формировании вегетативной сферы опытных растений, что проявилось в несоизмеримости ее отдельных характеристик уже в первый год наблюдений, характеризовавшийся умеренным температурным фоном в период вегетации растений, при относительно
благоприятном режиме выпадения атмосферных осадков. Так, в конце сезона средняя высота
5
ус
и
ар
растений варьировалась в таксономическом ряду от 5 см у V. vitis-idaea до 51 см у сорта Bluecrop
высокорослой голубики, при изменении диаметра их кроны от 5 до 33 см. (табл. 1, 2). При этом
оба межвидовых гибрида голубики по данному признаку практически не отличались от ее высокорослого вида, тогда как для узколистной и топяной голубик были показаны примерно вдвое
меньшие его значения.
Таксон
север–юг
запад–восток
t
x ± sx
t
x ± sx
12,7 ± 1,2
24,3 ± 2,1
43,3 ± 2,1
25,7 ± 3,2
51,3 ± 4,2
5,3 ± 0,6
–
8,5*
22,3*
6,6*
15,5*
– 9,8*
14,0 ± 6,1
18,7 ± 7,0
34,7 ± 5,5
32,0 ± 10,2
33,3 ± 4,2
4,9 ± 0,1
–
0,9
4,4*
2,0
4,5*
– 2,6*
8,7 ± 2,1
18,3 ± 6,7
26,7 ± 11,6
22,7 ± 5,1
37,3 ± 2,3
7,5 ± 0,6
t
x ± sx
t
–
2,4*
2,6*
4,4*
16,0*
– 0,9
0,8 ± 0,5
4,9 ± 3,8
22,2 ± 14,2
10,6 ± 8,4
34,0 ± 9,3
0,1 ± 0,0
–
1,8
2,6*
2,0*
6,1*
– 2,4*
кБ
x ± sx
Объем куста, дм3
ау
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
Диаметр куста, см
Высота куста, см
ел
Т а б л и ц а 1. Характеристика габитуса растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного
периода 2009 г.
ем
ия
н
П р и м е ч а н и е . Здесь и далее в табл. 2, 5, 6: звездочка (*) – статистически значимые по t-критерию Стьюдента
различия с эталонным объектом при P < 0,05.
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Обращают на себя внимание весьма заметные различия диаметра кроны (куста) растений,
в зависимости от ориентации по сторонам света. К примеру, у V. uliginosum, как и у обоих межвидовых гибридов голубики, значения данного параметра были заметно выше в направлении
север-юг, тогда как у V. vitis-idaea – в направлении запад-восток. Что касается узколистной и высокорослой голубик, то влияние данного фактора на диаметр их кроны оказалось несущественным. Наименьшим объемом куста (0,1–0,8 дм3) характеризовались растения V. vitis-idaea
и V. uliginosum, наибольшим (34 дм3) – сорт Bluecrop высокорослой голубики.
Анализ данных табл. 2 показал, что в течение вегетационного периода 2009 г. таксоны рода
Vaccinium образовывали от 3–4 (V. vitis-idaea, V. uliginosum и сорт Bluecrop высокорослой голубики) до 10–14 (межвидовые гибриды Northblue, Northcountry и V. angustifolium) побегов формирования со средней длиной от 3 у V. vitis-idaea до 37 см у сорта Bluecrop, при среднем количестве
листьев на одном побеге от 7–8 шт. у дикорастущих видов голубики и брусники до 35 шт.
у сорта Bluecrop высокорослой голубики. Степень же облиственности побегов формирования
оказалась наименьшей (7,8–8,5) у обоих межвидовых гибридов голубики, наибольшей (23,9) −
у V. vitis-idaea. При этом параметры листовых пластинок у таксонов рода Vaccinium варьировались в среднем от 17–18 до 56 мм в длину и от 6–7 до 27 мм в ширину, при изменении индекса
листа, характеризуемого соотношением данных параметров, в интервале значений от 2,0 до 2,7.
Количество побегов ветвления, сформировавшихся к концу вегетационного периода, изменялось в таксономическом ряду от 7 шт. V. vitis-idaea до 67 шт. у сорта Bluecrop высокорослой
голубики. Вместе с тем различия их средней длины, как и среднего количества образовавшихся
на них листьев, при диапазонах варьирования соответственно от 1,2 до 5,0 см и от 2 до 9 шт.,
оказались не столь выразительными, как у побегов формирования. Однако степень облиственности побегов ветвления у всех исследуемых объектов, за исключением обоих межвидовых
гибридов голубики, была примерно вдвое выше, чем у побегов формирования, и изменялась
от 6,3 до 43,3. При этом у большинства из них размерные параметры листовых пластинок на побегах ветвления существенно уступали таковым на побегах формирования и изменялись в среднем от 10 до 33 мм в длину и от 6 до 14 мм в ширину, при несколько меньших значениях листового индекса (1,7–2,4).
Обращают на себя внимание существенные различия опытных растений по всем приведенным параметрам, обусловленные индивидуальным потенциалом их развития, о величине которых можно судить по данным табл. 3 и 4. Нетрудно убедиться, что интродуцированные виды
На
6
На
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
Таксон
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
Таксон
–
5,3 *
3,6**
3,1**
0,3
– 2,0*
t
11,0 ± 5,3
26,3 ± 4,7
22,3 ± 5,5
11,3 ± 3,1
67,0 ± 30,0
6,7 ± 1,2
x ± sx
–
3,7 *
2,6 *
0,1
3,2 *
– 1,4
t
количество, шт.
4,0 ± 1,0
14,3 ± 3,2
11,7 ± 3,5
9,7 ± 3,1
4,3 ± 1,5
2,7 ± 0,6
x ± sx
ая
x ± sx
1,7 ± 0,3
2,3 ± 0,6
5,0 ± 1,0
4,0 ± 1,0
4,7 ± 1,5
1,2 ± 0,3
x ± sx
t
–
1,8
5,5 *
3,9 *
3,3 *
– 2,1 *
длина, см
4,0 ± 1,0
6,0 ± 2,0
4,0 ± 1,0
2,3 ± 0,6
9,3 ± 3,1
5,0 ± 1,0
x ± sx
t
–
1,5
0,0
– 2,5 *
2,9 **
1,2
–
– 1,2
– 1,9
– 2,2 *
– 1,5
3,6 *
t
24,4 ± 7,7
25,6 ± 5,1
7,9 ± 0,4
6,3 ± 3,2
20,2 ± 3,7
43,3 ± 5,8
x ± sx
–
3,1 *
24,5 *
19,0 *
8,0 *
0,8
t
t
–
– 0,4
– 8,3 *
– 4,7 *
– 6,8 *
– 0,4
t
t
–
3,0 *
– 0,9
1,0
2,9 *
–2,1 *
ус
и
2,1 ± 0,1
2,4 ± 0,1
2,0 ± 0,1
2,2 ± 0,2
2,4 ± 0,1
1,7 ± 0,3
x ± sx
индекс листа, d/l
2,7 ± 0,1
2,6 ± 0,4
2,0 ± 0,0
2,3 ± 0,1
2,2 ± 0,0
2,6 ± 0,4
x ± sx
индекс листа, d/l
ар
–
– 0,6
4,2 *
1,9
6,4 *
– 3,5 *
ел
x ± sx
–
8,0 ± 0,0
0,4
7,3 ± 2,1
3,8 * 11,7 ± 1,5
3,4 * 9,7 ± 1,5
10,7 * 13,7 ± 1,5
– 5,7 * 6,0 ± 1,0
t
–
1,7
31,0 *
13,9 *
8,4 *
1,0
t
ширина листа (l), мм
6,3 ± 0,6
9,0 ± 2,6
27,0 ± 1,0
21,0 ± 1,7
26,0 ± 4,0
7,0 ± 1,0
x ± sx
ширина листа (l), мм
кБ
ау
x ± sx
длина листа (d), мм
17,0 ± 1,0
22,7 ± 3,1
55,3 ± 2,5
48,0 ± 2,6
56,3 ± 8,5
18,0 ± 2,0
x ± sx
длина листа (d), мм
–
16,7 ± 1,2
0,2
17,7 ± 4,2
– 3,7 * 23,0 ± 2,6
– 3,8 * 21,3 ± 2,1
– 0,9
32,7 ± 2,3
3,4 * 10,3 ± 1,5
t
степень облиствения
Побеги ветвления
13,2 ± 3,9
10,1 ± 1,8
8,5 ± 1,9
7,8 ± 1,7
9,7 ± 1,1
23,9 ± 3,5
x ± sx
степень облиствения
Побеги формирования
ем
ия
н
–
1,7
4,4 *
2,6 *
9,8 *
1,1
t
количество листьев
6,7 ± 0,6
12,0 ± 5,3
17,3 ± 4,2
11,3 ± 3,1
35,0 ± 5,0
8,0 ± 2,0
x ± sx
количество листьев
ак
ад
t
–
2,9 *
4,0 *
3,2 *
6,3 *
– 2,1 *
длина, см
5,3 ± 1,5
11,7 ± 3,5
21,0 ± 6,6
15,0 ± 5,0
36,8 ± 8,5
3,3 ± 0,6
ьн
количество, шт.
ал
Т а б л и ц а 2. Биометрические показатели текущего прироста вегетативных органов растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного
периода 2009 г.
ци
он
7
ус
и
ел
ар
голубики, как и их гибриды, значительно превосходили дикорастущий вид, принятый за эталон
сравнения, по высоте куста на 91–304 %, по диаметру кроны на 110–329 %, при наиболее выразительных различиях в западно-восточном направлении, а также в десятки раз по объему куста.
Наиболее выразительные различия по этим параметрам характеризовали сорт ��������������
Bluecrop������
высокорослой голубики, наименьшие – V. angustifolium, для которой не было выявлено сколь-либо
значимых расхождений с V. uliginosum по объему куста и по диаметру кроны в направлении
север-юг. В отличие от таксонов голубики, для брусники обыкновенной, напротив, было показано заметное отставание от эталонных значений данных показателей на 58–88 %, причем различия с ними по диаметру кроны в западно-восточном направлении не нашли статистического
подтверждения.
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
+ 91,3
+ 241,0
+ 102,4
+ 303,9
– 58,3
Диаметр куста
север–юг
–
+ 147,9
+ 128,6
+ 137,9
– 65,0
запад–восток
Объем куста
ау
Высота куста
+ 110,4
+ 206,9
+ 160,9
+ 328,7
–
ем
ия
н
Таксон
кБ
Т а б л и ц а 3. Относительные различия с V. uliginosum биометрических
характеристик габитуса растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце
вегетационного периода 2009 г.
–
+ 2675,0
+ 1225,0
+ 4150,0
– 87,5
П р и м е ч а н и е. Здесь и далее в табл. 4, 7–10 прочерк означает отсутствие статистически значимых по
t-критерию Стьюдента различий с эталонным объектом при P < 0,05
Т а б л и ц а 4. Относительные различия с V. uliginosum биометрических показателей текущего прироста
вегетативной сферы растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного периода 2009 г., %
Побеги формирования
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
количество
длина
+ 257,5
+ 192,5
+ 142,5
–
– 32,5
+ 120,8
+ 296,2
+ 183,0
+ 594,3
– 37,7
количество
листьев
степень
облиствения
длина
листа
ширина
листа
индекс
листа
–
+ 158,2
+ 68,7
+ 422,4
–
–
–
– 40,9
–
+ 81,1
+ 33,5
+ 225,3
+ 182,4
+ 231,2
–
–
+ 328,6
+ 233,3
+ 312,7
–
–
– 25,9
– 14,8
– 18,5
–
ак
ад
Таксон
Побеги ветвления
длина
количество
листьев
степень
облиствения
длина
листа
ширина
листа
индекс
листа
+ 139,1
+ 102,7
–
+ 509,1
–
–
+ 194,1
+ 135,3
+ 176,5
– 29,4
–
–
– 42,5
+ 132,5
–
–
– 67,6
– 74,2
–
+ 77,5
–
+ 37,7
+ 27,6
+ 95,8
– 38,3
–
+ 46,2
–
+ 71,2
– 25,0
+ 14,3
–
–
+ 14,3
– 19,0
ая
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
количество
ьн
Таксон
ци
он
ал
Наряду с этим большинство тестируемых таксонов голубики превосходили V. uliginosum по
размерным параметрам и побегов, и ассимилирующих органов, причем эти различия более выразительно проявились у побегов формирования, нежели у побегов ветвления (см. табл. 4). При
этом в обоих случаях лидирующие позиции по большинству оценочных критериев принадлежали сорту Bluecrop высокорослой голубики. Относительные размеры его различий с эталонным
объектом по разным признакам варьировались в весьма широком диапазоне значений − от 14 до
594 %. В наибольшей степени они проявились для количества побегов ветвления и средней длины побегов формирования. Лишь по степени облиственности тех и других побегов, как и по количеству побегов формирования, достоверных различий с аборигенным видом голубики выявлено не было, а по индексу листа последних интродуцент даже уступал ему на 18 %.
На
8
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Если по количеству побегов ветвления лидирующее положение в таксономическом ряду принадлежало высокорослому виду голубики, то по количеству побегов формирования – ее узколистному виду, для которого наряду с этим было показано превышение эталонных значений
лишь для весьма ограниченного набора исследуемых показателей − средней длины побегов формирования и длины их листовых пластинок, а также для количества побегов ветвления и их листового индекса. В остальных же случаях достоверных различий с растениями голубики топяной выявлено не было.
Заметим, что относительные размеры различий межвидовых гибридов голубики с V����������
. ��������
uliginosum по большинству оценочных критериев их вегетативной сферы занимали промежуточное
положение между таковыми высокорослой и узколистной голубик. Лишь по размерным параметрам листьев побегов формирования данные различия у гибрида Northblue оказались сопоставимы с таковыми у сорта Bluecrop. Обращает на себя внимание, что ассимилирующие органы побегов ветвления у обоих голубичных гибридов характеризовались сходным с установленным у
V. uliginosum листовым индексом, тогда как таковые побегов формирования, как и у сорта
Bluecrop, уступали ей по данному признаку на 15–26 %. Наряду с этим наблюдалось заметное
(примерно на 70 %) отставание обоих межвидовых гибридов от эталонного вида в степени облиственности побегов ветвления, а гибрида Northcountry – в таковой и побегов формирования.
Наибольшим же отставанием от голубики топяной по биометрическим показателям вегетативных органов, как, впрочем, и по габитусу растений, характеризовалась брусника обыкновенная. Относительные размеры статистически достоверных различий по количеству и средней
длине побегов формирования, средней длине побегов ветвления и размерным параметрам сформированных на них листьев составляли 19–38 %, причем для размеров листьев на побегах формирования подобных различий с V. uliginosum выявлено не было (см. табл. 4). Обращает на себя
внимание, что в таксономическом ряду рода Vaccinium брусника обыкновенная являлась единственным объектом, обладавшим почти на 80 % большей, чем у голубики топяной, степенью
облиственности и побегов формирования, и побегов ветвления.
Наращивание потенциала плодоношения у опытных растений во второй год наблюдений
предполагало активизацию темпов развития не только их генеративной, но и вегетативной сферы, чему в значительной степени способствовали весьма благоприятные погодные условия ранней дружной весны и начала лета 2010 г. Следствием этого явилось достижение всеми таксонами
рода Vaccinium более высоких, чем годом ранее, значений биометрических параметров сформировавшихся за сезон вегетативных органов, при сохранении генотипических различий, установленных в первый год наблюдений (табл. 5, 6). Вместе с тем у исследуемых объектов были выявлены существенные различия ответной реакции на изменение гидротермического режима сезона в плане изменения темпов развития их вегетативной сферы.
ая
Т а б л и ц а 5. Характеристика габитуса растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного
периода 2010 г.
Таксон
x ± sx
t
15,0 ± 1,0
37,7 ± 7,0
51,3 ± 8,1
29,7 ± 5,5
73,0 ± 14,4
5,8 ± 0,3
–
5,5*
7,7*
4,5*
6,9*
– 15,5*
ци
он
ал
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
ьн
Высота куста, см
Диаметр куста, см
север–юг
Объем куста, дм3
запад–восток
x ± sx
t
15,0 ± 3,0
34,0 ± 7,0
43,0 ± 8,9
38,7 ± 12,2
64,0 ± 18,4
6,2 ± 0,4
–
4,3*
5,2*
3,3*
4,6*
– 5,0*
x ± sx
t
11,3 ± 1,2
23,0 ± 7,0
34,3 ± 6,7
53,0 ± 19,5
64,3 ± 4,0
8,2 ± 0,7
–
2,8*
5,9*
3,7*
21,8*
– 4,0*
x ± sx
t
1,3 ± 0,3
15,1 ± 4,6
41,7 ± 18,8
36,8 ± 31,8
157,0 ± 51,2
0,2 ± 0,0
–
5,2*
3,7*
1,9*
5,3*
– 5,9*
На
Анализ межсезонных различий ее основных параметров, приведенных в табл. 7 и 8, убедительно показал заметное увеличение во второй год наблюдений основных характеристик габитуса растений, особенно у узколистного и высокорослого видов голубики. Вместе с тем отчетливо
обозначилось ослабление процесса новообразования побегов формирования у V. angustifolium
9
На
ьн
t
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
12,3 ± 2,5
41,0 ± 3,6
49,0 ± 12,5
83,3 ± 55,8
181,0 ± 9,6
11,0 ± 1,0
11,3*
5,0*
2,2*
29,3*
– 0,9
–
t
количество, шт.
Таксон
x ± sx
–
4,3 ± 1,2
7,3 ± 1,2 3,2**
4,0 ± 1,7 – 0,3
5,7 ± 2,1 1,0
5,7 ± 3,2 0,7
3,0 ± 1,0 – 1,5
ая
x ± sx
количество, шт.
V. uliginosum L.
V. angustifolium L.
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea L.
Таксон
ал
x ± sx
2,0 ± 0,5
4,7 ± 1,2
10,3 ± 3,5
7,0 ± 2,6
8,0 ± 2,0
1,6 ± 0,2
x ± sx
t
–
3,7*
4,1*
3,2*
5,0*
– 1,3
длина, см
–
– 1,2
– 8,1*
– 2,0*
– 5,4*
3,5*
t
Побеги ветвления
12,6 ± 0,7
10,7 ± 2,7
7,6 ± 0,8
10,2 ± 2,0
8,8 ± 1,0
20,6 ± 3,9
x ± sx
13,3 ± 1,2
26,3 ± 1,5
43,0 ± 5,3
40,0 ± 7,2
26,0 ± 4,4
17,7 ± 1,2
3,7 ± 0,6
5,3 ± 1,5
10,7 ± 2,1
8,3 ± 0,6
8,7 ± 2,1
4,7 ± 1,2
x ± sx
–
1,8
5,6*
9,9*
4,0*
1,3
t
x ± sx
18,7 ± 2,3
12,2 ± 5,4
10,9 ± 3,0
12,8 ± 3,5
10,9 ± 0,8
28,9 ± 3,8
x ± sx
–
– 1,9
– 3,6*
– 2,4*
– 5,5*
3,9*
t
t
x ± sx
t
x ± sx
ел
ар
ус
и
–
33,4*
3,5*
5,0*
– 0,6
– 0,8
t
индекс листа, d/l
–
5,3 ± 0,6
1,8 ± 0,0
9,3 ± 0,6 8,5* 2,4 ± 0,0
19,3 ± 1,5 14,8* 2,1 ± 0,1
13,7 ± 1,5 8,8* 2,3 ± 0,2
17,3 ± 0,6 25,5* 1,8 ± 0,1
1,8
6,7 ± 1,2
1,7 ± 0,2
x ± sx
ширина листа (l), мм
–
11,0*
4,1*
6,5*
– 0,9
2,9*
t
индекс листа, d/l
–
7,3 ± 1,2
1,8 ± 0,1
2,7* 2,8 ± 0,1
9,3 ± 0,6
18,0 ± 1,0 12,1** 2,4 ± 0,2
16,3 ± 2,5 5,6* 2,4 ± 0,1
15,3 ± 3,5 3,7* 1,7 ± 0,2
0,8 2,2 ± 0,2
8,0 ± 1,0
x ± sx
ширина листа (l), мм
кБ
t
–
13,8*
18,2*
19,6*
32,0*
2,2*
ау
9,7 ± 1,2
22,7 ± 1,2
40,0 ± 2,6
31,3 ± 1,5
31,0 ± 0,0
11,3 ± 0,6
x ± sx
степень облиствения длина листа (d), мм
–
11,8*
9,5*
6,3*
4,9*
4,6*
t
степень облиствения длина листа (d), мм
ем
ия
н
–
13,5*
6,2**
4,7*
5,2*
– 0,6
t
количество листьев
ак
ад
t
количество листьев
8,0 ± 2,0 –
10,0 ± 2,0
29,0 ± 7,5 4,7* 29,7 ± 1,5
50,0 ± 8,7 8,1* 38,0 ± 7,5
22,0 ± 2,0 8,6* 22,3 ± 4,0
33,7 ± 6,7 6,4* 29,3 ± 6,1
4,4 ± 0,5 – 3,1* 9,0 ± 2,0
x ± sx
длина, см
Побеги формирования
Т а б л и ц а 6. Биометрические показатели текущего прироста вегетативной сферы растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце
вегетационного периода 2010 г.
ци
он
10
ус
и
ел
ар
и у обоих межвидовых гибридов голубики, количество которых снизилось, по сравнению с предыдущим сезоном, на 41–66 %, при незначительном (не более чем на 8–33 %) его увеличении
у остальных таксонов. Несмотря на то что у сорта Bluecrop высокорослой голубики данного явления не наблюдалось, тем не менее все биометрические параметры его побегов формирования
и главным образом их листового аппарата на 8–54 % уступали прошлогодним значениям
(см. табл. 8). Все же остальные представители рода Vaccinium, особенно V. angustifolium и гибрид
Northblue, характеризовались на 33–148 % более высокими, чем годом ранее, средними показателями длины этого вида побегов и количества образованных на них листьев.
Диаметр куста
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
+ 18,1
+ 55,2
+ 18,5
+ 15,6
+ 42,3
+ 9,4
север–юг
запад–восток
+ 7,1
+ 81,8
+ 23,9
+ 20,9
+ 92,2
+ 26,5
+ 29,9
+ 25,7
+ 28,5
+ 133,5
+ 72,4
+ 9,3
ау
Высота куста
ем
ия
н
Таксон
кБ
Т а б л и ц а 7. Межсезонные различия характеристик габитуса растений рода Vaccinium
в опытной культуре в конце вегетационного периода, % (2010/2009)
Объем куста
+ 62,5
+ 208,2
+ 87,8
+ 247,2
+ 361,8
+ 100,0
Т а б л и ц а 8. Межсезонные различия биометрических показателей текущего прироста вегетативных органов
растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного периода, % (2010/2009)
Побеги формирования
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
количество
длина
+ 7,5
– 49,0
– 65,8
– 41,2
+ 32,6
+ 11,1
+ 51,0
+ 147,9
+ 138,1
+ 46,7
– 8,4
+ 33,3
количество листьев степень облиствения
+ 49,3
+ 147,5
+ 119,7
+ 97,4
– 16,3
+ 12,5
ак
ад
Таксон
– 5,0
–
– 10,6
+ 30,8
– 9,3
– 13,8
длина листа
ширина листа
индекс листа
– 21,8
+ 15,9
– 22,2
– 16,7
– 53,8
–
+ 15,9
–
– 33,3
– 22,4
– 41,2
+ 14,3
– 33,3
+ 7,7
+ 20,0
–
– 22,7
– 15,4
длина листа
ширина листа
индекс листа
– 41,9
+ 28,2
+ 73,9
+ 47,0
– 5,2
+ 9,7
– 33,8
+ 27,4
+ 65,0
+ 41,2
+ 26,3
+ 11,7
– 14,3
–
+ 5,0
+ 4,6
– 25,0
–
Побеги ветвления
V. uliginosum
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
количество
длина
+ 11,8
+ 55,9
+ 119,7
+ 637,2
+ 170,2
+ 64,2
+ 17,6
+ 104,4
+ 106,0
+ 75,0
+ 70,2
+ 33,3
количество листьев степень облиствения
ая
Таксон
– 7,5
– 11,7
+ 167,5
+ 260,9
– 6,5
– 6,0
– 23,4
– 52,4
+ 38,0
+ 103,2
– 46,0
– 33,3
П р и м е ч а н и е. Прочерк означает отсутствие межсезонных различий, превышающих 5 %.
На
ци
он
ал
ьн
Вместе с тем и степень облиственности, и размерные параметры листовых пластинок побегов формирования у данных таксонов, как и у сорта Bluecrop, в большинстве случаев на 5–33 %
уступали прошлогодним значениям. Исключением в этом плане явилась лишь V. angustifolium,
характеризовавшаяся отсутствием межсезонных различий в степени облиственности данного
вида побегов и в ширине листовых пластинок, при более высоких, чем в предыдущем сезоне,
значениях их длины и листового индекса. При этом во втором сезоне побеги формирования
V. uliginosum и V. vitis-idaea были отмечены увеличением ширины листовых пластинок на 14–16 %
при одновременном, причем более значительном, уменьшении их длины у первой из них и отсутствии межсезонных различий по данному признаку у второй, что привело к уменьшению
у обоих дикорастущих видов показателя индекса листа, указывавшему на изменение его формы.
Столь выразительные межсезонные различия размерных параметров листьев на побегах формирования у таксонов рода Vaccinium, на наш взгляд, скорее всего, связаны с проявлением их ответной реакции на воздействие экстремально высоких температур воздуха, сочетавшихся с периодическим дефицитом влаги.
11
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Вместе с тем наращивание потенциала плодоношения у исследуемых объектов во второй год
наблюдений обеспечивалось в первую очередь активизацией новообразования побегов ветвления, на которых формируется урожай ягодной продукции. По нашим данным, их общее количество увеличилось, по сравнению с предыдущим сезоном, на 12–637 %, при наименее выраженных межсезонных различиях у V. uliginosum и наибольших у межвидового гибрида Northcountry
(см. табл. 8). Достаточно близкой и сравнительно высокой степенью данного увеличения (на 120
и 170 %) характеризовались гибрид Northblue и сорт Bluecrop высокорослой голубики, тогда как
также сходными, но более низкими ее значениями (на 56 и 64 %) – V. angustifolium и V. vitis-idaea.
При этом средняя длина побегов ветвления, как, впрочем, и побегов формирования, у всех таксонов рода Vaccinium, особенно у V. angustifolium и гибрида Northblue, оказалась на 18–106 %
большей, чем годом ранее, что мы также увязываем с благоприятным характером погодных
условий весеннего и раннелетнего периодов года. Вместе с тем степень облиственности побегов
ветвления, как, впрочем, и побегов формирования, в данном сезоне у большинства таксонов существенно (на 23–52 %) уступала прошлогодним значениям, что объясняется незначительным
(на 6–12 %) уменьшением на них количества листьев. Исключением в этом плане явились лишь
оба межвидовых гибрида голубики, для которых было показано не только весьма выразительное
увеличение данных характеристик, но и наибольшее в таксономическом ряду увеличение (на
41–74 %) размерных параметров листьев. Следует заметить, что и у остальных таксонов рода
Vaccinium, за исключением V. uliginosum, имело место их увеличение, выраженное, правда, в несколько меньшей степени – не более чем на 10–28 %. Лишь у сорта Bluecrop высокорослой голубики из-за существенного увеличения ширины листовых пластинок, на фоне незначительного
уменьшения их длины, наблюдалось снижение на 25 % значений листового индекса. Снижением
последнего на 14 %, относительно предыдущего сезона, характеризовалась также V. uliginosum,
для побегов ветвления которой было показано значительное, причем непропорциональное,
уменьшение и длины, и ширины листовых пластинок на 42 и 34 % соответственно. Что касается
V. angustifolium и V. vitis-idaea, то увеличение размерных параметров их листьев во втором сезоне не сопровождалось изменением их индекса, а следовательно, и их формы.
Нетрудно убедиться, что, несмотря на генотипические различия параметров развития вегетативной сферы у таксонов рода Vaccinium, отчетливо проявился ряд сходных тенденций в проявлении их ответной реакции на воздействие абиотических факторов. Так, во второй год наблюдений, характеризовавшийся благоприятным гидротермическим режимом весенних месяцев
и экстремально высоким температурным фоном летнего периода, сочетавшимся с неравномерным распределением атмосферных осадков, имело место выраженное ингибирование новообразования побегов формирования у голубики узколистной и обоих межвидовых гибридов голубики при заметной активизации у всех исследуемых таксонов новообразования побегов ветвления,
обусловленной наращиванием потенциала плодоношения по мере взросления растений. У большинства объектов это сопровождалось заметным уменьшением не только степени облиственности обеих категорий побегов, но также и размерных параметров ассимилирующих органов на
побегах формирования с изменением их листового индекса. При этом на фоне ограничения количества листьев на побегах ветвления наблюдалось увеличение их размеров, а следовательно,
и площади ассимилирующей поверхности без существенных изменений ее формы, что должно
было способствовать нормализации работы фотосинтетического аппарата растений в условиях
температурного стресса. В этой связи нельзя не отметить наиболее выраженную среди таксонов
рода Vaccinium устойчивость к последнему параметров развития побегов ветвления и сформированных на них листьев у межвидовых гибридов Northblue и Northcountry.
Вместе с тем генотипические различия ответной реакции исследуемых таксонов на изменение погодных условий во второй год наблюдений обусловили изменения в степени их различий
с V. uliginosum по ряду характеристик вегетативной сферы растений. Сравнительный анализ данных табл. 3, 4 и 9, 10, отражающих степень указанных различий в годы наблюдений, выявил заметное их усиление во втором сезоне, главным образом у таксонов голубики, причем далеко не
по всем биометрическим параметрам. Так, наиболее выразительно усиление различий с эталонным объектом проявилось по объему куста, диаметру кроны в направлении север–юг, индексу
На
12
ус
и
ел
ар
листа у побегов формирования, среднему количеству и длине побегов ветвления, а также по размерным параметрам и форме их листьев. При этом полностью снивелировались различия с ним
по количеству побегов формирования у брусники и у большинства таксонов голубики. Заметим,
что в первом случае исчезли различия с голубикой топяной и по длине побегов ветвления, а также по ширине и форме их листьев. Вместе с тем во втором сезоне, как и в предыдущем, сохранилось подобие растений V. vitis-idaea и V. uliginosum по высоте, диаметру и объему куста, средней
длине, степени облиственности и ширине листовых пластин побегов формирования, а также по
количеству побегов ветвления и степени их облиственности.
Диаметр куста
Высота куста
запад–восток
+ 126,7
+ 186,7
+ 158,0
+ 326,7
– 58,7
+ 103,5
+ 203,5
+ 369,0
+ 469,0
– 27,4
ем
ия
н
+ 151,3
+ 242,0
+ 98,0
+ 386,7
– 61,3
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
север–юг
ау
Таксон
кБ
Т а б л и ц а 9. Относительные различия с V. uliginosum биометрических характеристик габитуса
растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного периода 2010 г., %
Объем куста
+ 1061,5
+ 3107,7
+ 2730,8
+ 11976,9
– 84,6
Т а б л и ц а 10. Относительные различия с V. uliginosum биометрических показателей текущего прироста
вегетативных органов растений рода Vaccinium в опытной культуре в конце вегетационного периода 2010 г., %
Побеги формирования
Таксон
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
количество
длина
количество листьев
степень облиствения
длина листа
ширина листа
индекс листа
+ 69,8
–
–
–
–
+ 262,5
+ 525,0
+ 175,0
+ 321,2
– 45,0
+ 197,0
+ 280,0
+ 123,0
+ 193,0
–
–
– 39,7
– 19,0
– 30,2
+ 63,5
+ 97,8
+ 223,3
+ 200,8
+ 95,5
+ 33,1
+ 27,4
+ 146,6
+ 123,3
+ 109,6
–
+ 55,6
+ 33,3
+ 33,3
–
+ 22,2
количество
длина
количество листьев
степень облиствения
длина листа
ширина листа
индекс листа
+ 233,3
+ 298,4
+ 577,2
+ 1371,6
–
135,0
+ 415,0
+ 250,0
+ 300,0
–
–
+ 189,2
+ 124,3
+ 135,1
–
–
– 41,7
– 31,6
– 41,7
+ 54,6
+ 134,0
+ 312,4
+ 222,7
+ 219,6
+ 16,5
+ 75,5
+ 264,2
+ 158,5
+ 226,4
–
+ 33,3
+ 16,7
+ 27,8
–
–
V. angustifolium
Northblue
Northcountry
Bluecrop
V. vitis-idaea
ак
ад
Побеги ветвления
Таксон
На
ци
он
ал
ьн
ая
Заключение. Исследование биометрических характеристик вегетативных органов 6 таксонов рода Vaccinium − V. uliginosum, выбранной в качестве эталона сравнения, V. angustifolium, гибридов узколистной и высокорослой голубик Northblue и Northcountry, сорта Bluecrop высокорослой голубики, а также V. vitis-idaea при возделывании на остаточном слое торфяной залежи
в контрастные по гидротермическому режиму сезоны показало, что темпы формирования их
вегетативной сферы определялись генотипом и возрастом растений, а также гидротермическим
режимом вегетационного периода.
В зависимости от погодных условий вегетационного периода таксоны рода Vaccinium образовывали за сезон от 3–4 до 10–14 побегов формирования со средней длиной от 3–5 до 35–50 см,
при среднем количестве листьев на одном побеге от 7–12 шт. у дикорастущих видов голубики
и брусники до 35–45 шт. у интродуцентов. При этом в разные годы параметры листовых пластинок на побегах формирования варьировались в среднем от 13–18 мм в длину и 6–7 мм в ширину
у брусники обыкновенной и голубики топяной до 48–56 мм и 27–30 мм соответственно у межвидовых гибридов голубики и сорта Bluecrop ее высокорослого вида, при изменении индекса листа
от 1,7 до 2,8. Количество сформированных за вегетационный период побегов ветвления варьировалось в диапазоне значений от 7–11 шт. V. vitis-idaea до 70–180 шт. у сорта Bluecrop, при изменении их средней длины и количества листьев на них соответственно от 2 до 15 см и от 2 до
13
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
13 шт. Размерные параметры листовых пластинок при этом составляли в длину от 10 до 40 мм,
в ширину − от 6 до 20 мм, при значениях листового индекса от 1,7 до 2,4.
Большинство тестируемых таксонов рода Vaccinium превосходили голубику топяную по биометрическим параметрам вегетативных органов при лидирующем положении сорта ������������
Bluecrop����
высокорослой голубики и наибольшем отставании от нее брусники обыкновенной. Установлено,
что, несмотря на генотипические различия параметров развития вегетативной сферы, у таксонов
рода Vaccinium отчетливо проявился ряд сходных тенденций в проявлении их ответной реакции
на воздействие абиотических факторов. На фоне экстремально высоких температур летнего
периода, сочетавшихся с периодическим дефицитом влаги, у голубики узколистной и у обоих
межвидовых гибридов имело место выраженное ингибирование новообразования побегов формирования, при заметной активизации у всех исследуемых таксонов новообразования побегов
ветвления, в связи с наращиванием потенциала плодоношения при увеличении возраста растений.
У большинства объектов это сопровождалось заметным снижением не только степени облиственности побегов, но и размерных параметров ассимилирующих органов на побегах формирования, при изменении их листового индекса. При этом на фоне ограничения количества листьев
на побегах ветвления наблюдалось увеличение их размеров без изменения формы, что должно
было способствовать нормализации работы фотосинтетического аппарата растений в условиях
температурного стресса. Наибольшей устойчивостью параметров развития побегов ветвления
и их ассимилирующих частей к неблагоприятным погодным факторам характеризовались межвидовые гибриды Northblue и Northcountry.
Литература
1. Л а к и н Г. Ф. Биометрия. М., 1980.
2. L i e b s t e r G., S h i m m e l p f e n g H. // Acta Horticulturae. 1977. N 61. P. 127–128.
Zh. A. Rupasova, A. p. Yakovlev, I. I. Lishtvan, S. F. Zhdanets
ак
ад
PECULIARITIES OF DEVELOPMENT OF VEGETATIVE SPHERE TAXONS OF GENUS VACCINIUM
IN PRACTICED CULTURE ON THE OPENCAST PEAT FIELDS OF THE NORTH OF BELARUS
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
The results of comparative analysis of biometric parameters of a current increment of vegetative shoots and of reproductive shoots at 6 taxons of genus Vaccinium – a bog blueberry (V. uliginosum), a lowbush blueberry (V. angustifolium),
a half-highbush blueberry (cv. Northblue and cv. Northcountry), a highbush blueberry (cv. Bluecrop), a lingonberry
(V. vitis-idaea) at cultivation on a residual layer of a peat long fallow during contrast seasons on a hydrothermal regime
is given. It was shown that rates of formation of their vegetative sphere were defined by a genotype and age of plants, and also
character of weather conditions of a growing season.
It was established that the maximal steadiness of parameters of development of reproductive shoots and leaves to adverse
weather conditions plants half-highbush blueberry (cv. Northblue and cv. Northcountry) be characterized.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 634.737:634.1.076
ел
Н. Б. ПАВЛОВСКИЙ
кБ
СОХРАНЯЕМОСТЬ ПЛОДОВ РАЗНЫХ СОРТОВ И ВИДОВ ГОЛУБИКИ,
ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ В БЕЛАРУСИ
Центральный ботанический сад НАН Беларуси, Минск, e-mail: pavlovskiy@tut.by
ау
(Поступила в редакцию 28.10.2010)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Голубика высокая (Vaccinium corymbosum) интродуцирована в Беларусь относительно недавно. Важным показателем целесообразности интродукции новых видов ягодных растений является не только высокая урожайность и ее стабильность, устойчивость растений к климатическим условиям среды нового района выращивания, но и способность плодов перспективных сортов к продолжительному хранению с минимальными потерями их массы при сохранении
товарных и пищевых качеств.
Известно, что один из основных факторов, определяющих сохраняемость плодов, – биологические особенности таксона (генотип). Практически все сорта голубики высокой – отдаленные
гибриды, полученные при скрещивании разных видов голубик (V. corymbosum, V. angustifolium,
V. australe, V. ashei и др.) [1], поэтому естественно, что сорта данной культуры различаются значительным генотипическим разнообразием и соответственно степенью сохраняемости плодов.
При анализе литературных источников, касающихся сохраняемости плодов голубики, нами не
найдены конкретные данные о сортовых особенностях их лежкоспособности. Только некоторые
авторы [2] при описании сорта дают лишь относительную оценку сохраняемости плодов, указывая, что его плоды хранятся «хорошо» или «плохо». Также в литературе имеются общие сведения о том, что плоды голубики в условиях обычной атмосферы при температуре + 4 °C хранятся
7 сут [3].
Исследования в этой области необходимы для выявления сортов, плоды которых способны
к длительному хранению без понижения товарных качеств и полезных свойств, а также для
научно обоснованного прогнозирования сохраняемости этой ценной пищевой и лечебнопрофилактической продукции в производственных условиях.
Цель исследования – определение потенциальной сохраняемости плодов голубики разных
сортов и видов в условиях обычной газовой среды.
Объекты и методы исследования. Исследования проводились на Ганцевичской научноэкспериментальной базе ЦБС НАН Беларуси в 2006–2010 гг. Объектами исследований являлись
плоды 28 видов и сортов голубики. Ягоды снимали в стадии потребительской спелости и сразу
же закладывали на хранение. Плоды расфасовывали в одноразовые пищевые пластиковые контейнеры для ягод и фруктов Т 602 с крышками Т 601, объемом 400 мл. Повторность опыта двукратная. Образцы составляли только из внешне здоровых плодов. Перед закладкой голубики на
хранение подсчитывали число ягод в каждой упаковке и определяли их массу. Образцы хранили
в холодильной камере при двух температурных режимах (+ 2 и + 5° C) с относительной влажностью воздуха 95 %. Каждые 4–5 дней проводили учеты их состояния путем разбора на фракции
и взвешивания, с последующей выбраковкой нестандартных плодов – пораженных болезнями
и с физиологическими расстройствами. По результатам хранения учитывали следующие показатели ( %): естественную убыль массы плодов, выход здоровых и нестандартных плодов. На основании вышеперечисленных параметров определяли сохраняемость плодов (сут). За критерий со15
ус
и
ел
ар
храняемости принимали максимальный срок хранения плодов, в течение которого они сохраняли
потребительские качества, а общие потери (естественная убыль + нестандарт) не превышали 10 %.
Статистическую обработку данных проводили на ПК с помощью программы Excel.
Результаты и их обсуждение. Сохраняемость плодов голубики в условиях обычной газовой
среды при температуре + 5 °C в зависимости от таксона составила 7–19 сут при выходе товарной
ягоды 90 % (табл. 1). Из 28 изучаемых объектов наиболее лежкоспособными при данном температурном режиме оказались плоды позднеспелых сортов (Berkeley, Darrow и Nelson) – 19 сут.
В среднем 16–18 сут сохраняли товарные качества плоды среднеспелых (Bluecrop, Blueray, Duke)
и позднеспелых (Carolinablue, Coville и Elizabeth) сортов.
кБ
Т а б л и ц а 1. Сохраняемость плодов голубики разных сортов и видов в условиях обычной атмосферы при
температуре хранения + 2 и + 5 °C (2006–2010)
Сохраняемость, сут
при t + 5 °C
Сорт, вид
предел варьирования
средняя
предел варьирования
19 ± 4
18 ± 4
17 ± 2
15 ± 4
12 ± 4
17 ± 2
17 ± 5
14 ± 3
19 ± 4
17 ± 4
13 ± 2
16 ± 2
12 ± 2
11 ± 3
13 ± 1
19 ± 2
9±2
7±1
11 ± 1
14 ± 3
12 ± 3
15 ± 3
16 ± 1
11 ± 2
11 ± 1
18 ± 1
8±0
7±1
14–26
10–24
16–20
8–20
8–20
14–19
9–28
9–20
14–26
12–24
12–15
10–19
10–17
6–20
11–16
14–21
6–14
5–10
8–13
9–20
6–17
12–20
14–19
5–12
9–16
12–26
7–8
5–9
28 ± 1
24 ± 3
21 ± 2
33 ± 7
15 ± 4
33 ± 5
34 ± 3
19 ± 3
27 ± 3
25 ± 1
19 ± 1
32 ± 7
22 ± 4
17 ± 3
30 ± 3
28 ± 3
10 ± 3
8±1
19 ± 3
24 ± 2
22 ± 2
28 ± 3
30 ± 3
19 ± 1
15 ± 1
29 ± 5
12 ± 1
9±1
20–34
22–29
17–23
27–47
9–19
29–44
30–44
15–22
23–31
24–26
16–20
20–50
16–28
10–22
22–37
23–32
7–22
6–17
15–22
22–28
18–24
24–31
26–34
18–20
14–16
19–39
11–13
8–11
+ 5°
+ 2°
+ 5°
+ 2°
5±1
5±1
6±1
5±1
6±1
7±1
6±1
8±1
5±0
7±1
7±1
7±1
8±1
5±1
7±1
7±1
6±1
6±2
7±1
6±1
8±1
8±1
6±1
7±0
8±1
8±0
8±1
7±1
3±1
3±1
3±1
3±1
2±1
3±1
3±1
2±1
4±1
3±1
3±1
3±1
2±1
4±1
3±1
2±1
4±1
3±1
3±1
3±1
3±1
2±1
2±1
4±1
2±1
2±1
1±1
2±0
5±1
5±1
4±1
5±1
4±1
3±1
4±1
2±1
5±0
3±1
3±1
3±1
2±1
5±1
3±1
3±1
4±1
4±1
3±1
4±1
2±1
2±1
4±1
3±0
2±1
2±1
2±1
3±1
7±1
7±1
7±1
7±1
8±1
7±1
7±1
8±1
6±1
7±1
7±1
7±1
8±1
6±1
7±2
8±1
6±1
7±1
7±1
7±1
7±1
8±1
8±2
6±1
8±1
8±1
9±1
8±0
ем
ия
н
ак
ад
ая
Количество
нестандартных
плодов, %
ау
средняя
ьн
Berkeley
Bluecrop
Blueray
Bluerose
Bluetta
Carolinablue
Coville
Croatan
Darrow
Duke
Earliblue
Elizabeth
Hardiblue
Herbert
Jersey
Nelson
Northblue
Northcountry
Northland
Patriot
Rancocas
Reka
Rubel
Weymouth
V. angustifolium
V. corymbosum
V. myrtiloides
V. uliginosum
при t + 2 °C
Убыль массы, %
ци
он
ал
Самым коротким сроком хранения плодов при данном температурном режиме характеризовался сорт голубики полувысокой Northcountry – 7 сут. Непродолжительную лежкоспособность
имели плоды и других сортов из группы полувысоких голубик, в частности Northblue
и Northland – 9 и 11 сут соответственно. По-видимому, данное свойство эти сорта унаследовали
от голубики узколистной (V. angustifolium), для которой характерна относительно непродолжительная сохраняемость плодов (11 сут). Следует отметить, что и другие ранне- и среднеспелые
сорта голубики, полученные от гибридизации с V. angustifolium, в частности Bluetta, Rancocas,
Weymouth, продуцируют плоды с непродолжительным сроком хранения (11–12 сут).
Хранение плодов голубики при температуре + 2 °C способствовало увеличению периода их
сохраняемости в 1,1–2,3 раза. Широкий диапазон кратности указывает на то, что плоды разных
На
16
ус
и
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
таксонов по-разному отреагировали на снижение температуры хранения. Сохраняемость плодов
раннеспелых сортов (Bluetta, Croatan, Earliblue, Northblue, Northcountry) увеличилась незначительно и составила 8–19 сут, а позднеспелых (Bluerose, Carolinablue, Coville, Elizabeth, Jersey,
Rubel) возросла более чем в 2 раза и достигла 30 сут и более.
Сохраняемость плодов голубики при обоих температурных режимах хранения определялась
главным образом естественной убылью массы, доля которой от общих потерь у большинства
таксонов составила 50–80 %. В период хранения в плодах продолжаются процессы жизнедеятельности, такие как дыхание, транспирация и изменение химического состава, приводящие
к обезвоживанию и расходованию аккумулированных органических соединений и как результат –
к потере массы [4]. Снижение температуры хранения как одного из наиболее важных абиотических
факторов, регулирующих жизнедеятельность плодов в это время, способствовало замедлению
метаболизма и естественной убыли массы и как результат – увеличению периода сохраняемости.
Об этом свидетельствует и тот факт, что при хранении плодов при более низкой температуре
(+2 °C) структура потерь практически не изменилась, при этом сохраняемость плодов возросла
существенно, особенно у позднеспелых сортов.
Значительный ущерб при хранении плодов голубики нанесли физиологические расстройства.
В зависимости от таксона доля потерь из-за функциональных заболеваний составила 20–50 % от
общих потерь. Среди исследуемых сортов в большей степени физиологическим расстройствам
были подвержены плоды раннеспелых сортов Northblue и Weymouth и позднеспелых – Darrow
и Herbert. Биологическая роль плода заключается в обеспечении питательными веществами находящихся в нем семян. После созревания семян начинается старение тканей околоплодника
и беспорядочный распад содержащихся в нем веществ [5]. Это ведет к лизису отдельных клеток,
затем к прекращению обмена веществ во всем плоде, и в результате физиологических расстройств он теряет потребительские качества.
Что касается порчи плодов голубики от паразитарных заболеваний во время хранения, то
следует отметить, что гниль, вызванная фитопатогенами, появлялась, как правило, позднее, когда потери составили более 10 %.
Анализ зависимости лежкоспособности ягод разных сортов голубики от сроков созревания
урожая позволил выявить, что плоды позднеспелых таксонов хранятся дольше. Ягоды раннеспелых сортов обладают в 2–3 раза более коротким сроком сохраняемости, чем средне- и позднеспелых. Хотя четкой линейной зависимости между лежкостью ягод и скороспелостью не наблюдается, но тем не менее общая тенденция, свидетельствующая о том, что у более поздних сортов
плоды хранятся дольше, прослеживается (табл. 2). При этом следует отметить, что при более
низкой температуре хранения (+ 2 °C) данная закономерность наблюдается четче, на что указывает более высокий коэффициент корреляции (0,59) между сохраняемостью плодов и средней
продолжительностью периода от массового цветения до начала созревания урожая.
Т а б л и ц а 2. Зависимость сохраняемости плодов голубики разных сортов от их скороспелости (2006–2010)
средняя
при t + 5ºС
при t + 2ºС
62–75
56–62
59–65
58–80
42–52
59–71
58–71
50–59
61–65
48–54
50–68
57–74
66 ± 4
60 ± 2
63 ± 2
66 ± 7
48 ± 3
67 ± 4
65 ± 4
54 ± 3
62 ± 3
50 ± 2
60 ± 5
66 ± 5
19
18
17
15
12
17
17
14
19
17
13
16
28
24
21
33
15
33
34
19
27
25
19
32
ци
он
На
Сохраняемость, сут
предел варьирования
ал
Berkeley
Bluecrop
Blueray
Bluerose
Bluetta
Carolinablue
Coville
Croatan
Darrow
Duke
Earliblue
Elizabeth
ьн
Продолжительность периода от фазы массового цветения до начала созревания, сут
Сорт
17
ус
и
Продолжение табл. 2
Продолжительность периода от фазы массового цветения до начала созревания, сут
Сохраняемость, сут
средняя
при t + 5ºС
58–62
52–66
56–65
54–69
47–63
51–64
55–67
45–57
63–72
46–55
63–80
48–56
59 ± 1
59 ± 4
60 ± 3
64 ± 2
55 ± 4
58 ± 4
61 ± 4
53 ± 4
66 ± 2
49 ± 3
69 ± 3
51 ± 2
12
11
13
19
9
7
11
14
12
15
16
11
0,39
ел
ау
Hardiblue
Herbert
Jersey
Nelson
Northblue
Northcountry
Northland
Patriot
Rancocas
Reka
Rubel
Weymouth
Коэффициент корреляции
при t + 2ºС
22
17
30
28
10
8
19
24
22
22
30
19
0,59
ар
предел варьирования
кБ
Сорт
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Плоды раннеспелых сортов теряли свои потребительские качества при хранении быстрее изза более интенсивной естественной убыли массы и функциональных расстройств. Цветение почти у всех сортов голубики в условиях Беларуси происходит практически одновременно во второй половине мая, но созревание урожая у раннеспелых сортов начинается через 50 дней после
цветения, а у позднеспелых – через 70 дней и более. Это косвенно свидетельствует о том, что
в плодах раннеспелых сортов процессы созревания и соответственно старения и отмирания тканей протекают более интенсивно, чем в плодах позднеспелых сортов. После съема плодов в них
происходят те же генетически обусловленные превращения веществ, что и на материнском растении. Только в плодах, находящихся на растении до образования пробкового слоя между плодоножкой и плодом, поддержание процессов метаболизма осуществляется за счет растения, а после съема – за счет аккумулированных в плоде органических соединений [4, 5]. В итоге из-за
более быстрого старения тканей околоплодника и физиологических расстройств плоды раннеспелых сортов теряют товарные качества при хранении раньше.
Следует отметить, что большое влияние на сохраняемость плодов голубики оказывали погодноклиматические условия вегетационного сезона, особенно в период их непосредственного созревания, о чем свидетельствует широкий диапазон варьирования их лежкоспособности по годам. Так,
продолжительность сохраняемости ягод голубики, созревших в засушливый период (июль 2010 г.),
была в 2 раза больше по сравнению с ягодами, созревающими в сезон с обычным количеством
осадков. Но когда засуха сменялась погодой с обильными осадками, ягоды некоторых сортов
(Berkeley, Bluecrop, Coville, Croatan, Darrow, Earliblue, Herbert, Rancocas, Weymouth) трескались
и становились некондиционными, находясь на растении. Это указывает на то, что сохраняемость
плодов голубики является довольно лабильным свойством, зависящим не только от генотипа, но
и от абиотических факторов. Тем не менее полученные результаты показывают, что плоды одних
сортов голубики обладают более высокой потенциальной сохраняемостью, чем других.
Таким образом, результаты 5-летних исследований позволили расположить сорта голубики
в порядке снижения сохраняемости плодов в следующей последовательности:
при температуре хранения + 5 °C: Berkeley = Darrow = Nelson > Bluecrop > Blueray =
Carolinablue = Coville = Duke > Elizabeth = Rubel > Bluerose = Reka > Croatan = > Patriot > Earliblue =
Jersey > Bluetta = Hardiblue = Rancocas > Herbert = Northland = Weymouth > Northblue >
Northcountry;
при температуре хранения + 2 °C: Coville > Bluerose = Carolinablue > Elizabeth > Jersey = Rubel >
Berkeley = Nelson > Darrow > Duke > Bluecrop = Patriot > Hardiblue = Rancocas > Blueray > Croatan =
Earliblue = Northland = Weymouth > Herbert > Bluetta > Northblue > Northcountry.
Заключение. Сохраняемость плодов голубики в условиях обычной газовой среды в зависимости от сорта составляла 7–19 сут при температуре хранения + 5 °C и 8–33 сут при температуре
+ 2 °C. Широкий диапазон сортовых особенностей голубики по сохраняемости ягод указывает
На
18
ус
и
ел
ар
на генотипическое разнообразие данной культуры. Сохраняемость ягод голубики является сортоспецифичным признаком. Плоды позднеспелых сортов медленнее теряют массу при хранении
и соответственно обладают более продолжительной сохраняемостью. Независимо от температуры
хранения лежкость ягод определялась потерями, состоящими главным образом из естественной
убыли массы и в меньшей степени – из-за отходов от функциональных расстройств и гнили.
Для успешного хранения плодов голубики следует учитывать потенциальную лежкоспособность каждого сорта. Ягоды сортов с коротким периодом их хранения во избежание значительных потерь следует сразу же после сбора отправлять на переработку или для замораживания.
Литература
N. B. PAVLOVSKI
ау
кБ
1. B u t k u s V., P l i s z k a K. // Problems of rational utilization and reproduction of berry plants in boreal forests on
the eve of the XXI century. Glubokoye-Gomel, 2000. P. 117–120.
2. L y r e n e P. M. // Blueberries For Growers, Gardeners, Promoters. Florida, Gainesville, 2006. P. 26–37.
3. R e j m a n А., P l i s z k a K. Borowka wysoka. Warszawa, 1991.
4. Ф р и д р и х Г. Физиология плодовых растений. М., 1983.
5. Л о й к о Р. Э., Д я ч е к П. И., С у б о ч Ф. И. Хранение и переработка плодов и овощей в колхозах и совхозах.
Мн., 1987.
ем
ия
н
SAFETY OF DIFFERENT TAXA BERRY BLUEBERRY INTRODUCED INTO BELARUS
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
It was established that period of safety of blueberry fruit in usual gas environment made up of 7–19 days at the temperature
of +5 °C and 8–33 days at the emperature of +2 °C depending on the cultivar. A wide range of cultivar characteristics on the
conservation of blueberry fruit, indicate on genotypic diversity of this culture. The safety of blueberry berries is specific sign
and depends on the cultivar precocity. The fruits of late variety lose of the mass by storage slower and thus have a longer
period of safety. The safety of berries was determined by losses consisting mainly of natural decrease of the mass and to
a lesser extent because of the waste from functional disorders and rots.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 581.8+582.592
ел
Г. И. КОРНЕЕВА
кБ
АНАТОМИЯ КОРНЯ ГИБРИДНЫХ ФОРМ РОДА ФАЛЕНОПСИС
(PHALAENOPSIS BLUME)
Центральный ботанический сад НАН Беларуси, Минск, loreley68@mail.ru
ау
(Поступило в редакцию 30.05.2011)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Род Phalaenopsis�����������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������
Blume�����������������������������������������������������
����������������������������������������������������������
объединяет тропические моноподиальные орхидеи – эпифиты и литофиты (65 видов и 7 межвидовых природных гибридов) [7, 11]. Листья блестящие,
мясистые, крупные, сидячие, удлиненно-эллиптической формы. Соцветия кистевидные от малодо многоцветковых на наклонном цветоносе длиной до 80 см, располагающиеся в пазухах листьев. Цветки разной величины, обычно ярко окрашенные, оригинальные и многообразные по
форме, высоко декоративные с продолжительным периодом цветения. По типу роста все они являются розеточными растениями, родина – Австралия (штат Квинсленд), Новая Гвинея, Индонезия
и Филиппины [7, 15, 16].
Фаленопсис – самая популярная орхидея среди горшечных растений, самая первая тропическая орхидея викторианских коллекций. С появлением тетраплоидных гибридов практическое
значение этой культуры возросло. Как оказалось, они хорошо адаптируются и способны расти
в домашних условиях на протяжении всего времени, пока удается обеспечить режим, максимально приближенный к естественному. Эти орхидеи с успехом используются в Америке,
Японии и ряде стран Европы в качестве промышленной культуры, что потребовало серьезных
разработок по их ускоренной и эффективной репродукции [9, 12, 17].
Цель наших исследований – изучение особенностей формирования анатомической структуры вегетативных и генеративных органов фаленопсиса как основы для разработки оптимальных
технологических приемов при культивировании их в оранжереях умеренного климата. В данной
статье приводится анализ анатомического строения воздушных корней фаленопсиса в условиях
оранжереи Центрального ботанического сада НАН Беларуси.
Морфологические особенности органов растений и характерные для них структурные различия обусловлены их физиологической специализацией [8, 13]. Как и наземные растения, орхидеи данного рода – автотрофные, но в отличие от них они механически зависимы. Чтобы достигнуть света, эпифиты используют другие растения в качестве опоры. Используя готовые питательные вещества в виде растворенных в воде минеральных и органических соединений, корни
вместе с тем являются фотосинтезирующими органами и участвуют в автотрофном питании.
В целом корневая система состоит из многочисленных воздушных придаточных корней, которые образуются на укороченном стебле и направлены не только вниз, но горизонтально и вверх.
Как представитель однодольных фаленопсис имеет первичное строение корня.
Объекты и методы исследования. В качестве объектов исследования послужили образцы 19
гибридных форм рода Рhalaenopsis, полученные из Германии, культивируемые в оранжерее ЦБС
НАН Беларуси. Исследования проводили согласно методическим рекомендациям [1, 6].
Результаты и их обсуждение. Как показали результаты, наружный слой корня фаленописа
представлен веламеном (рис. 1). Это многослойный эпидермис, который состоит из 3–4 слоев
плотно сомкнутых мертвых клеток с утолщенными клеточными стенками. Снаружи покрыт кутикулой, благодаря наличию которой он сходен с обычным однослойным эпидермисом. Кутикула
На
20
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 1. Наружная часть поперечного временного среза корня фаленопсиса
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
расположена веерообразно, повторяя форму наружного края клеток веламена, и имеет пропускные каналы между клетками эпидермиса и внешней средой. Клетки внешнего слоя веламена бокаловидной или трапециевидной формы, направлены перпендикулярно продольной оси корня.
По размеру данные клетки больше, чем клетки внутренних слоев веламена, которые повторяют
форму наружных, либо являются ромбовидными или многоугольными. Содержимое клеток связано между собой посредством каналов, которые обнаруживаются в кутинизированных клеточных стенках. В клетках имеется большое количество микротрубочек, ориентированных перпендикулярно оси корня, особенно их много во внутренних слоях.
Клетки эпидермиса фаленопсиса в условиях дефицита влаги могут образовывать корневые
волоски, хотя в оптимальных условиях для них это не свойственно. Появление волосков позволяет увеличить всасывающую поверхность в местах контакта корней с питательной средой.
Корневой чехлик у фаленопсиса защищен от высыхания толстым слоем кутикулы. Эпидермис
корневого чехлика представлен живыми клетками, которые делятся и формируют внутренние
слои, в результате чего и образуется велламен.
Кора корня характеризуется наличием большого количества межклетников как схизогенного, так и лизогенного происхождения. На участках с большим количеством межклетников она
приобретает вид аэренхимы и выполняет соответственно функцию газообмена. Паренхиму коры
корня фаленопсиса можно условно разделить на три слоя клеток: экзодерму, мезодерму и эндодерму (рис. 1).
Непосредственно под веламеном находятся клетки экзодермы, которые ближе к корневому
чехлику образуют несколько слоев. Среди них выделяется один ряд клеток овальной формы
с толстыми клеточными стенками. При расположении ближе к основанию корня ряд клеток экзодермы с толстыми стенками образует сплошное кольцо. Участки клеточных стенок экзодермы,
расположенные со стороны веламена, утолщены больше по сравнению с внутренними и имеют
пропускные каналы. В старых корнях стенки клеток этого слоя опробковевают и выполняют
механическую и защитную функцию. В молодых участках корня между названными клетками
экзодермы и слоем клеток веламена расположены мелкие клетки с тонкими стенками. Вероятно,
из этих клеток образуются внутренние слои веламена. Внутреннюю сторону слоя клеток экзодермы с толстыми стенками окружают несколько слоев рыхло расположенных мелких тонкостенных клеток, содержащих хлоропласты. Слой этих клеток наиболее интенсивно окрашен
в зеленый цвет, что придает соответствующий оттенок воздушным корням фаленопсиса. На срезах молодых корней или фрагментов корня возле корневого чехлика видно, что клетки экзодермы с толстыми стенками не соединены между собой и не образуют сплошного кольца. Между
21
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ними находится несколько (3–5) слоев тонкостенных клеток с хлоропластами. Слой клеток экзодермы с утолщениями, напоминающими пятна Каспари, функционально и по структуре сходен
с эндодермой.
Наибольший слой среди клеток коры корня занимает мезодерма. Это совокупность клеток
паренхимы, расположенных между экзодермой и эндодермой. От периферии корня к центру
клетки мезодермы варьируют по форме и размерам. На периферии корня они имеют округлую
форму, меньшие по размеру и расположены плотнее, чем клетки, находящиеся ближе к центру.
В центральной части коры клетки наиболее крупные, расположены рыхло и имеют большие
межклетники. Ближе к центральному цилиндру размер клеток уменьшается, они располагаются
более плотно и принимают вытянутую форму в направлении к центральному цилиндру.
Клетки коры корня фаленопсиса имеют живое содержимое и единичные хлоропласты.
Оболочки указанных клеток образуют уголковую колленхиму. Это механическая ткань первичного происхождения, состоящая из живых клеток с утолщенными по углам стенками. Колленхимные
клетки упруги и пластичны, приспособлены для выполнения опорной функции для растущего
корня. Особенности роста колленхимной ткани не препятствует его удлинению, а ее пластичность меняется с возрастом корня [5, 8, 13]. Ближе к корневому чехлику у фаленопсиса преобладает колленхима, а ближе к стеблю – склеренхима. В процессе старения корня колленхимные
волокна склерифицируются, и корни становятся очень прочными на разрыв. После образования
склеренхимы на месте колленхимы корни больше не удлиняются. Неравномерное утолщение
клеточных стенок, связанное с развитием склеренхимы в старых корнях, придает прочность им
при изгибе и скручивании, что препятствует разрывам и изломам корней, закрепляющих растение на опоре.
В слоях клеток коры обнаружены включения, характерные для растений, произрастающих
в засушливых условиях. Они представлены идиобластами – клетками, в которых формируются
кристаллы. Среди них преобладают рафиды – кристаллы в форме игл, заостренных с обеих сторон. При повреждении стенок идиобластов рафиды рассыпаются в образовавшуюся лизогенную
полость. Идиобласты имеют более крупные размеры по сравнению с клетками паренхимы корня,
и в зрелом состоянии идиобласты лишены протопласта, представляя собой мертвые структуры.
Все свободное пространство вокруг рафидов внутри идиобластов заполнено слизью, способной
к набуханию [10]. Рафиды представляют собой отложения минеральных веществ, образованных
оксалатом кальция [5, 8]. Наличие структур, содержащих соли, повышает осмотическое давление в корне.
В клетках коры обнаружены гифы гриба, представляющие эндомикоризу орхидных (рис. 2).
Фаленопсис, как и другие представители семейства, в естественных условиях является
Рис. 2. Наружная часть поперечного временного среза корня (эндомикориза)
На
22
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
облигатно-микотрофным растением. Гифы гриба проникают из субстрата в клетки коры корня,
где образуют клубки, которые впоследствии перевариваются клетками растения-хозяина. Этот
процесс напоминает явление фагоцитоза [2, 3]. В отличие от эктотрофной микоризы микориза
орхидных не образует грибного чехла вокруг корней и при недостатке влаги и питательных веществ корни фаленопсиса способны формировать корневые волоски.
Внутренний слой клеток коры фаленопсиса представлен эндодермой, которая образована одним слоем клеток квадратной или прямоугольной формы, окружающих центральный цилиндр
(рис. 3). Клетки эндодермы имеют живое содержимое, но отличаются элементами структуры их
оболочек. В местах соединения кольца эндодермы клеточные стенки имеют утолщения – пояски
Каспари, представляющие собой полосу, опоясывающую радиальные и поперечные стенки,
и образованную из материала клеточной оболочки. В старых корнях фаленопсиса в клетках эндодермы обнаруживаются утолщения клеточной оболочки, расположенные неравномерно. Чаще
всего они обнаруживаются с внутренней стороны кольца эндодермы. Наиболее толстостенные
клетки эндодермы примыкают к флоэме. Среди плотного кольца клеток эндодермы обнаружены
пропускные клетки, размещенные на участках контакта с лучами ксилемы (рис. 3). В отличие от
остальных клеток эндодермы в зрелых корнях на оболочках пропускных клеток выделяются
только пятна Каспари, а утолщений оболочек не наблюдается. Через эти клетки осуществляется
связь между корой и центральным цилиндром. Они обеспечивают условия для транспорта воды
из коры в центральный цилиндр, так как одна из функций эндодермы заключается в регулировании поступления тока воды в горизонтальном направлении от клеток коры к центральному
цилиндру корня, где расположены проводящие ткани. Транспорт воды на уровне эндодермы осуществляется путем смены быстрого апопластного тока на медленный симпластный, так как диаметр стели, куда через эндодерму поступает вода, в 5–6 раз меньше диаметра поверхности коры
и всасывающей поверхности корня [4]. Кольцо из толстостенных клеток эндодермы особенно
четко выделяется на поперечных срезах старых корней.
Центральный цилиндр состоит из проводящих тканей, перемежающихся с паренхимой. От
коры корня он отграничен кольцом дифференцированных клеток эндодермы.
Плотное примыкание элементов проводящей ткани и радиальное расположение лучей ксилемы указывает на первичное строение корня фаленопсиса [14]. Нами было обнаружено, что протоксилема расположена на периферии центрального цилиндра, а метаксилема – ближе к его центру. Ксилема корня у фаленопсиса полиархного типа. Она занимает центральное положение
и образует 10 радиально расположенных лучей, и на поперечном срезе имеет форму звезды.
Элементы ксилемы на периферии центрального цилиндра имеют меньший диаметр по сравне-
На
Рис. 3. Центральная часть поперечного временного среза корня (центральный цилиндр, слой эндодермы с пропускными
клетками напротив лучей ксилемы).
23
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
нию с теми, которые расположены ближе к центру. Переход от узких элементов ксилемы к широким постепенный. На поперечных срезах корней в центральной части центрального цилиндра
между сосудами ксилемы различимы клетки сердцевинной паренхимы. В процессе старения
корня клетки паренхимы разрушаются, а стенки сосудов ксилемы склерифицируются.
В корнях фаленопсиса со стороны центрального цилиндра к клеткам эндодермы примыкает
слой более мелких и тонкостенных, по сравнению с клетками эндодермы, паренхимных клеток.
Они представляют собой меристематическую ткань – перицикл, в котором происходит образование боковых корней [8]. На меристематическую активность перицикла оказывают влияние некоторые факторы. Так, например, на здоровых, неповрежденных корнях фаленопсиса боковые
корни обычно не образуются, но при их повреждении на участках, расположенных выше повреждения и ближе к основанию корня, боковые корни иногда образуются. Их возникновение
связано с функциональной активностью перицикла. Клетки перицикла, расположенные против
участков флоэмы, меньшие по размеру и образуют более узкий слой по сравнению с клетками
перицикла, примыкающими к лучам ксилемы. В периферической части центрального цилиндра
в промежутках между лучами ксилемы и перициклом расположена флоэма (рис. 3). Более подробное описание этой структуры пока не проведено в связи с необходимостью усовершенствования методических подходов к ее исследованиям.
Заключение. Анатомическое строение корней фаленопсисов связано с эпифитным образом
жизни. Наиболее характерные особенности их структуры заключаются в следующем.
Воздушные корни покрыты толстым слоем кутикулы, что характерно для надземных структурных органов наземных растений. Большую часть объема тканей корня занимает веламен –
многослойный эпидермис, важнейшей функцией которого является водо- и газообмен между
растением и внешней средой обитания; его пористая структура увеличивает всасывательную
поверхность корня. Обмен между клетками эпидермиса и внешней средой обеспечивают пропускные каналы. Клетки коры фаленопсиса содержат хлоропласты, в результате чего они участвуют в процессе фотосинтеза. Структурный состав клеток коры способствует удержанию
воды в клетках корня даже при ее недостатке во внешней среде, что осуществляется в основном
за счет идиобластов, повышающих осмотическое давление в корне. Ксилема корня фаленопсиса
полиархного типа, в центральном цилиндре она расположена радиально в виде лучей. Высокая
прочность корня фаленопсиса обеспечивается колленхимой и склеренхимой, а количественное
соотношение этих тканей зависит от возраста корня.
Литература
ци
он
ал
ьн
ая
1. Е р е м и н В. М., Ш к у р а т о в а Н. В. Выпускные квалификационные работы по структурной и экологической анатомии растений: Методические рекомендации к выполнению ВКР. Южно-Сахалинск: РАН, Дальневосточное
отделение, 2008.
2. Жизнь растений: В 6 т./ Под ред. А. Л. Тахтаджян. М., 1982, т. 5. С. 15–20.
3. М и ш у с т и н Е. Н., Е м ц е в В. Т. Микробиология. М., 1970.
4. П о л е в о й В. В. Физиология растений. М., 1989.
5. Т у т а ю к В. Х. Анатомия и морфология растений. 2-е изд. М., 1980.
6. Ф у р с т Г. Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М., 1979.
7. Ч е р е в ч е н к о Т. М. Тропические и субтропические орхидеи. Киев, 1993.
8. Э c а у К. Анатомия семенных растений: Пер. с англ. М., 1980. С. 142.
9. C h a - u m S., U l z i i b a t B., K i r d m a n e e C. // Australian Journal of Crop Science. 2010. Vol. 4. I. 9. Р. 750–
756.
10. C h e a v i n W. H. S. // Brit. Jour. Micros. and Photomicrogr., 1938. Vol. 2. Р. 155–158.
11. C h r i s t e n s o n E. A. Phalaenopsis: A Monograph. Portland, Oregon: Timber Press, Inc., 2001.
12. C u i G. R. // Journal of Tropical and Subtropical Botany. Beijing: Science Press, 2010. Vol. 18. Р. 696–706.
13. E s a u K. // Hilgardia. 1936. Vol. 10. Р. 431–476.
14. G u t t e n b e r g H. Der primäre Bau der Angiospermenwurzel // K. Linsbauer: Handbuch der Pflanzenanatomie.
1940. Bd 8 Р. 39.
15. K a o Y. Y. Molecular cytogenetic study of Phalaenopsis orchids. Associate Professor Institute of Molecular and
Cellular Biologie, National Taiwan Universiti [Electronic resource]. 2008. Mode of access: http:// cell. lifescience. ntu. edu.
tw/english/.. %5Cfaculty_en %5Ckao_yy_en._htm. – Date of access: 17.07.2008.
На
24
ус
и
16. S w e e t H. R. Genus Phalaenopsis. USA: Orchid Digest Inc., 1980.
17. Z h a n g J. X., W u J. X., T i a n L. N. // Acta Physiologiae Plantarum. Berlin: Springer-Verlag GmbH, 2011. Vol. 33.
Р. 409–417.
ар
H. I. KARNEYEVA
The ROOT ANATOMY OF HYBRID FORMS OF GENUS PHALAENOPSIS BLUME
ел
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
The anatomical structure of aerial roots of the Phalaenopsis, reflects the life form of it as a epiphyte. Multi-layered
epidermis with crossing channels provides water and gas exchange. A thick layer of cuticle on the epidermis, water-bearing
cells and crystals in the cells of the cortex contribute to water retention. Thanks to the chloroplasts contained in the cortical
cells, roots of Phalaenopsis are involved in the process of photosynthesis. The mechanical structure of the fibers in the roots
increases their strength to consolidate on a pedestal.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 582.548.21
ел
Е. В. ЖУДРИК
кБ
ОСОБЕННОСТИ ОНТОГЕНЕЗА STRELITZIA REGINAE BANKS
ПРИ культивировании В БЕЛАРУСи
Белорусский государственный педагогический университет им. Максима Танка, Минск,
e-mail: j.katty@mail.ru
ау
(Поступила в редакцию 26.08.2010)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В современном цветоводстве большое внимание уделяется интродукции новых
видов с целью обогащения ассортимента декоративных растений для промышленного цветоводства
и озеленения. Среди них наибольшее значение приобретают виды тропической и субтропической
флоры, отличающиеся высокой декоративностью цветочной продукции, низкой себестоимостью,
хорошей адаптацией к местным условиям, высокой устойчивостью к болезням и вредителям.
Одним из таких перспективных видов, занимающих ведущее место в ассортименте цветочных
культур многих стран мира, является стрелитция королевская – Strelitzia reginae Banks – субтропическое многолетнее растение, интродуцент из флоры Южной Африки. Растения стрелитции
отличаются высокой декоративностью соцветий в срезке и горшечной культуре, в связи с чем
они пользуются большим спросом на мировом рынке. Соцветия хорошо переносят транспортировку и сохраняют декоративность в срезке до трех недель.
Важнейшими условиями для успешной интродукции субтропических растений являются
прохождение полного цикла развития, а также своевременное начало и продолжительность фаз
онтогенеза. При выращивании растений Strelitzia reginae в закрытом грунте наблюдается замедление ритма развития растений за счет увеличения продолжительности прегенеративного периода
онтогенеза. Это связано с отличием климатических условий естественного ареала произрастания вида и условий оранжереи (длительности светового дня, относительной влажности воздуха,
температурного режима). В связи с этим актуально изучение закономерностей развития и поиск
эффективных способов размножения и сокращения времени прохождения периодов онтогенеза
Strelitzia reginae в условиях закрытого грунта Беларуси с целью получения декоративной продукции стрелитции в максимально сжатые сроки.
Объекты и методы исследования. Объектом исследования служили растения стрелитции
королевской на разных этапах онтогенеза. При исследовании особенностей онтогенеза использована классификация возрастных периодов и состояний, разработанная Т. А. Работновым и детализированная А. А. Урановым [3, 4], а также методика И. П. Игнатьевой [1]. Морфологические
особенности растений изучали согласно руководству по изучению морфологии цветковых растений Всероссийского НИИ растениеводства им. Н. И. Вавилова [2]. С целью сокращения латентного и прегенеративного периодов онтогенеза испытывали регуляторы роста растений: гетероауксин растворимый порошок, 92 % (концентрация 0,1; 0,01; 0,001 % при экспозиции 6, 12, 24 ч);
препаративные формы фитовитала: фитовитал, фитовитал с янтарной кислотой, фитовитал с салициловой кислотой (концентрация 1,5; 2; 2,5 % при экспозиции 24 ч); 0,5 % эпин (раствор 0,25 г/л).
Обработки препаратами проводили на наиболее сензитивных стадиях онтогенеза: предпосевная
обработка семян путем замачивания; обработка виргинильных растений (1-летние и 3-летние)
путем сочетания пролива и опрыскивания.
Результаты и их обсуждение. В результате многолетних фенологических наблюдений за
растениями стрелитции королевской, согласно классификации возрастных периодов и состоя-
На
26
ус
и
ар
ний Т. А. Работнова, А. А. Уранова и методики И. П. Игнатьевой, нами выделены и описаны три
периода (латентный, прегенеративный и генеративный) и семь возрастных состояний (семена,
проростки, ювенильные, имматурные, виргинильные, молодые генеративные и средневозрастные генеративные растения) онтогенеза растений. Определены характерные признаки каждого
возрастного состояния и время их прохождения растениями стрелитции (табл. 1).
Т а б л и ц а 1. Возрастные состояния онтогенеза Strelitzia reginae при выращивании в оранжерейных условиях
Прегенеративный Проростки (pl)
Прегенеративный Ювенильные растения (j)
Имматурные растения (im)
Виргинильные растения (v)
ел
Растения находятся в состоянии покоя зародыша, защищенного плотной семенной кожурой. Зародыш семени
четко дифференцирован, линейный, бесхлорофильный.
–
Питательная ткань: эндосперм и нуцелярный перисперм.
Питание гетеротрофное
Начинается с подземного прорастания семени. Семядоля
гиперфильная, неассимиляционная. Заканчивается возрастное состояние формированием первого фотосинтези- 2,5
рующего листа. Лист имеет округло-овальную форму, мес
светло-зеленую окраску. Характеризуется наличием главного корня. Тип питания – автогетеротрофный
Два фотосинтезирующих листа, отличных от взрослых более мелкими размерами и светлой окраской. Главный ко3
рень останавливается в росте, происходит нарастание при- мес
даточных и боковых корней. Тип питания – автотрофный
Четко не выделяются
–
Взрослые вегетативные растения с более крупными, темны7–12
ми листьями, листорасположение спиральное. Вторичная
мес
гоморизная корневая система
Растения, имеющие 14 листьев, характеризующиеся вет5–6 лет
влением побега, имеющие первые цветоносы
Растения, характеризующиеся максимальным стабильным
7–8 лет
и активным цветением (процент цветущих растений – 80–100)
Молодые
генеративные растения (g1)
Средневозрастные
генеративные растения (g2)
ак
ад
Генеративный
Возраст
растений
кБ
Семена (se)
Общие признаки возрастных состояний
ау
Латентный
Возрастное состояние
ем
ия
н
Период онтогенеза
На
ци
он
ал
ьн
ая
Такие возрастные состояния, как позднегенеративные растения, субсенильные и сенильные
нами не рассматривались в связи с резким снижением у таких растений продуктивности цветения и невозможности их использования в промышленном цветоводстве.
Отмечено, что растения Strelitzia reginae при выращивании в условиях защищенного грунта
проходят полный цикл развития, обладают непрерывным ростом, период покоя не выражен.
Однако длительный латентный и виргинильный периоды в онтогенезе стрелитции в оранжерейных условиях определяют необходимость поиска способов ускорения темпов развития растений.
Одним из перспективных путей регулирования развития растений является применение регуляторов роста, позволяющих сократить продолжительность основных периодов онтогенеза.
Первую обработку регуляторами роста проводили на стадии семян. Отмечали скорость прорастания семян, дружность всходов и время прохождения стадии проростка, а также степень
развития растений. При естественном ходе онтогенеза максимальная скорость прорастания (через 2 мес) наблюдается при посеве семян в течение первых пяти дней после созревания плодов.
Процент проросших семян в этом случае также наибольший – 30,1 %. Семена прорастают достаточно дружно (в течение 10–11 дней). Отмечается резкое понижение (в 2 раза) процента проросших семян при посеве на 6–10-й день после созревания плодов. При посеве семян спустя 6–11
дней с момента созревания плодов замедляется срок появления первых всходов от 3 мес до
1 года и увеличивается продолжительность прорастания семян до 1,5–7 мес. При посеве семян
через 2 недели после созревания плода отмечена полная потеря всхожести (табл. 2).
При испытании биологической эффективности регуляторов роста на всхожесть семян учеты
проводили спустя 1,5 и 3 мес после их посева. Все испытанные препараты оказали влияние на
сокращение периода прорастания семян (на 15 дней).
27
ус
и
Т а б л и ц а 2. Всхожесть семян Strelitzia reginae в зависимости от продолжительности их послеуборочного
хранения
1–5
6–10
11–15
15–21
35
35
35
35
56-й
84-й
169-й
–
65-й
126-й
360-й
–
Количество проросших семян
в течение всего срока всходов
шт.
%
ар
Количество посеянных Сроки появления первых Сроки появления последних
семян, шт.
всходов, день
всходов, день
10,5
5,3
3,6
–
ел
Сроки посева
(количество дней после
созревания плодов), дни
30,1
15,2
10,4
–
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
При применении фитовитала (2 % при экспозиции 24 ч) через 1,5 мес после посева отмечена
максимальная всхожесть семян Strelitzia reginae (51,3 %). Увеличение концентрации препарата
снижало показатели всхожести. Спустя 3 мес отмечены максимальные показатели всхожести
(70,3 %), что в 2,3 раза выше в сравнении с контрольным вариантом.
При предпосевной обработке семян препаративной формой фитовитала с салициловой кислотой увеличение всхожести обратно пропорционально увеличению концентрации препарата.
Максимальное число проросших семян (45,4 %) наблюдали при обработке препаратом в концентрации 1,5 % при экспозиции 24 ч через 1,5 мес от посева. Та же тенденция сохранялась спустя
3 мес. В этом случае показатель всхожести семян составлял 80,1 %, что в 2,7 раза выше контроля.
При обработке семян препаративной формой фитовитала с янтарной кислотой отмечена тенденция снижения процента всхожести при увеличении концентрации препарата. Однако обработка 1,5 %-ным раствором этого препарата при экспозиции 24 ч оказала максимальное влияние
на всхожесть среди всех испытанных регуляторов уже через 1,5 мес от посева – всхожесть
90,2 %. Следует отметить, что увеличение концентрации препарата на данном этапе до 2 % практически в 2 раза снижало процент всхожести (до 50,1 %). Через 3 мес от посева 1,5 % фитовитал
с янтарной кислотой при экспозиции 24 ч по-прежнему оказывал максимальное влияние на всхожесть среди всех препаратов (всхожесть 100 %). Увеличение концентрации препарата снижало
процент всхожести в незначительной степени, без резких скачков: 2 %-ный раствор при экспозиции 24 ч – 85,4 % проросших семян; 2,5 %-ный раствор при экспозиции 24 ч – 70,8 %.
При предпосевной обработке семян гетероауксином (0,001 %) максимальная всхожесть (20,1 %)
через 1,5 мес от посева отмечена при экспозиции 12 ч. Дальнейшее увеличение экспозиции снижало всхожесть. В случае использования 0,01 % гетероауксина процент проросших семян рос
пропорционально увеличению времени экспозиции. Максимальное значение всхожести (50,2 %)
наблюдали при экспозиции 24 ч. При обработке 0,1 % гетероауксином максимальная всхожесть
(20,1 %) выявлена при экспозиции 12 ч. Сокращение и дальнейшее повышение продолжительности замачивания семян приводило к уменьшению процента проросших семян. Выявлено, что
наиболее эффективное влияние на всхожесть семян оказывал гетероауксин в концентрации 0,01 %,
дальнейшее повышение концентрации препарата снижало этот показатель.
Анализ всхожести семян через 3 мес после их посева показал, что низкая концентрация гетероауксина – 0,001 % – при минимальной экспозиции (6 ч) была самой неэффективной. Максимальные
показатели всхожести (50,2 и 65,1 %) отмечены при применении гетероауксина в малой концентрации (0,001 %) при продолжительности замачивания 12 и 24 ч, а также при применении препарата в более высокой концентрации и минимальной экспозиции (0,01, 0,1 % при экспозиции
6 ч: 65,2 и 55,4 % соответственно). Наиболее эффективным оказалось применение 0,01 % гетероауксина при экспозиции 6 ч, что способствовало увеличению всхожести семян (65,2 %) в 2 раза
по сравнению с контролем.
Анализ влияния испытанных регуляторов роста на всхожесть семян Strelitzia reginae показал, что эффективными (раннее появление всходов и максимальные значения показателя всхожести) через 1,5 мес являются гетероауксин (0,01 %, при экспозиции 24 ч; 0,001 % при экспозиции 12 ч); фитовитал (2 % при экспозиции 24 ч); фитовитал с салициловой кислотой (1,5 % при
экспозиции 24 ч); фитовитал с янтарной кислотой (2 % при экспозиции 24 ч). Данные формы регуляторов роста позволяют повысить всхожесть семян до 50,2–51,3 %. Наиболее эффективной
На
28
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
(всхожесть 90,2 %) оказалась предпосевная обработка семян препаративной формой фитовитала
с янтарной кислотой (1,5 % при экспозиции 24 ч).
Анализ данных всхожести семян Strelitzia reginae через 3 мес от посева показал, что максимальные значения всхожести (70,3–100,0 %) наблюдаются при обработке фитовиталом и его препаративными формами. Наиболее эффективным оказался фитовитал с янтарной кислотой (1,5 %
при экспозиции 24 ч). Процент проросших семян в данном варианте составил 100 %. В целом
наиболее эффективным условием использования чистого фитовитала для прорастания семян является 2 % концентрация, а при его сочетании с органическими кислотами – 1,5 % концентрация
при экспозиции 24 ч.
Эффективность действия испытанных препаратов оценивалась также по их влиянию на длительность прохождение этапов онтогенеза. При анализе продолжительности прохождения фазы
прорастания семян Strelitzia reginae учитывали время от посева до прорастания семян. Макси­
мальное сокращение (на 56,8 %) длительности данного периода в опытных вариантах по сравнению с контролем наблюдали при обработке гетероауксином (0,001 %, экспозиция 12 ч) и на 34,1 %
при обработке фитовиталом (2 %, экспозиция 24 ч) (рис. 1). Отмечен ингибирующий эффект
(увеличение времени прорастания на 15,9 %) действия гетероауксина (0,001 % при экспозиции 6 ч)
на скорость прорастания семян стрелитции.
Фаза прохождения стадии проростка (время от прорастания семени до полного раскрытия
первого листа) сокращалась на 34,1–58,2 % при обработке гетероауксином (0,1 и 0,01 % при всех
экспозициях). Однако наиболее эффективным (сокращение на 58,8 %) из всех вариантов оказалось применение 0,01 % гетероауксина при экспозиции 12 ч.
Применение фитовитала в меньшей степени оказывало влияние на сокращение данного периода. Эффективнее оказались фитовитал (2 %, экспозиция 24 ч) и фитовитал с салициловой
кислотой (1,5 %, экспозиция 24 ч). Предпосевная обработка данными препаратами позволила сократить период проростков практически в 2 раза (рис. 2).
На стадии ювенильных растений (3 мес) проводили учет морфометрических показателей побеговой и корневой систем растений, выращенных из семян, обработанных регуляторами роста.
Отмечены растения Strelitzia reginae, отличающиеся от контрольных темпами роста, с более развитой корневой системой. Достоверное увеличение (на 112 %) длины придаточных корней по
сравнению с контролем наблюдали в варианте предпосевной обработки семян гетероауксином
(0,01 % при экспозиции 12 ч). Более развитая (в 5,7 раза) корневая система отмечена в варианте
На
Рис. 1. Влияние регуляторов роста на продолжительность фазы прорастания семян Strelitzia reginae Banks: Г1 – гетероауксин, 0,1 %; Г2 – гетероауксин, 0,01 %; Г3 – гетероауксин, 0,001 %; экспозиция: а – 6, б – 12, в – 24 ч; Ф1 – фитовитал; Ф2 – фитовитал+салициловая кислота; Ф3 – фитовитал + янтарная кислота. Концентрация: а – 1,5, б – 2, в –
2,5 % (экспозиция 24 ч)
29
ус
и
ар
ел
кБ
ем
ия
н
ау
Рис. 2. Влияние регуляторов роста на продолжительность стадии проростка Strelitzia reginae Banks: Г1 – гетероауксин, 0,1 %; Г2 – гетероауксин, 0,01 %; Г3 – гетероауксин, 0,001 %; экспозиция: а – 6, б – 12, в – 24 ч; Ф1 – фитовитал;
Ф2 – фитовитал+салициловая кислота; Ф3 – фитовитал + янтарная кислота. Концентрация: а – 1,5, б – 2, в – 2,5 %
(экспозиция 24 ч)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
обработки семян гетероауксином (0,001 % при экспозиции 24 ч). Максимальную длину (увеличение на 118 %) придаточных корней наблюдали в варианте обработки фитовиталом с янтарной
кислотой (1,5 % при экспозиции 24 ч).
Предпосевная обработка семян препаратами фитовитала способствовала увеличению длины
корневой системы сеянцев в среднем на 75–80 %. Максимальный показатель количества корней
(увеличение в 5,2 раза по сравнению с контролем) отмечен при обработке фитовиталом с янтарной кислотой (2 % при экспозиции 24 ч). Другие концентрации этого препарата также оказывали
положительное влияние на данный признак.
По эффективности стимуляции развития корневой системы сеянцев стрелитции выделили
следующие регламенты применения препаратов: 0,01 % гетероауксин, экспозиция 12 ч; 0,001 %-ный
гетероауксин, экспозиция 24 ч; 1,5 и 2 % фитовитал с янтарной кислотой.
Анализируя развитие надземной части ювенильных растений (3 мес) определяли скорость раскрытия листьев, длину, ширину листовой пластинки, длину черешка, количество листьев на растении.
Скорость раскрытия листьев была достоверно выше в вариантах предпосевной обработки
семян гетероауксином (0,01 % при экспозиции 24 ч), а также фитовиталом с салициловой кислотой (1,5 и 2 % при экспозиции 24 ч). Максимальное увеличение длины листовой пластинки (на
34,1–36,4 %) наблюдали в вариантах обработки гетероауксином (0,1 % при всех экспозициях
и 0,001 % при экспозиции 6 и 24 ч), а также увеличение на 37,6 % при обработке фитовиталом
(2 %, экспозиция 24 ч) и фитовиталом с янтарной кислотой (2 %, экспозиция 24 ч). Стимулирующее
действие на такой признак, как ширина листовой пластинки оказывали следующие препараты: гетероауксин (0,1 % при экспозиции 6 ч) и фитовитал (2 % при экспозиции 24 ч) – увеличение на 25,7
и 20,0 % соответственно. Влияние регуляторов на рост черешка листа оказалось незначительным.
Только в варианте обработки фитовиталом (2 %, экспозиция 24 ч) увеличение данного показателя
составило 46,2 %. Максимальный эффект на процесс формирования листьев на растении Strelitzia
reginae оказал гетероауксин (0,01 % при экспозиции 12 ч и 0,001 % при экспозиции 6 ч).
Выявлена высокая биологическая эффективность действия на развитие сеянцев ювенильных
растений фитовитала с янтарной кислотой (1,5 и 2 % при экспозиции 24 ч) и гетероауксина (0,01 %
при экспозиции 12 и 24 ч).
Изучение морфометрических показателей корневой и побеговой системы виргинильных растений Strelitzia reginae проводили на однолетних растениях, выросших из семян, обработанных
регуляторами роста, при пересадке. Анализировали следующие признаки: длину и диаметр придаточных корней, длину и диаметр боковых корней, количество придаточных и боковых корней
На
30
ус
и
ар
на растении. Установлено, что предпосевная обработка семян регуляторами роста незначительно (увеличение площади корневой системы на 5–10 %) влияет на развитие корневой системы однолетних растений Strelitzia reginae.
При изучении развития надземного побега виргинильных растений анализировали такие показатели, как количество листьев и высота растений (табл. 3).
Т а б л и ц а 3. Морфометрические показатели надземного побега однолетних растений Strelitzia reginae
0,01
0,001
Фитовитал
Фитовитал + салициловая
кислота
Фитовитал + янтарная
кислота
Контроль
2,5
2,0
1,5
2,5
2,0
1,5
2,5
2,0
1,5
–
5,8 ± 0,4
6,1 ± 1,0
6,1 ± 0,7
5,6 ± 0,8
5,8 ± 0,7
6,2 ± 0,7
5,4 ± 0,5
5,0 ± 0,6
5,8 ± 0,4
5,2 ± 0,4
5,6 ± 0,5
5,8 ± 0,7
5,1 ± 0,8
5,6 ± 0,5
5,2 ± 0,7
5,0 ± 0,3
5,2 ± 0,4
5,8 ± 0,4
3,6 ± 0,8
ел
6
12
24
6
12
24
6
12
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
–
Высота растений, см
кБ
Гетероауксин
Количество листьев на растении,
шт.
ау
0,1
Экспозиция,
количество часов
ем
ия
н
Концентрация,
%
Препарат
17,2 ± 0,8
17,2 ± 1,6
18,0 ± 0,6
18,8 ± 2,6
17,7 ± 0,5
18,7 ± 1,2
17,1 ± 0,9
16,7 ± 0,5
18,3 ± 0,7
15,4 ± 1,1
17,2 ± 1,1
15,6 ± 0,8
15,9 ± 1,7
18,1 ± 1,6
17,3 ± 0,4
16,4 ± 1,8
17,1 ± 1,5
15,4 ± 1,7
13,7 ± 2,1
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Растения, выросшие из семян, обработанных гетероауксином (0,1 % при экспозиции 12 ч
и 0,01 % при экспозиции 24 ч) на 39 и 40,6 % соответственно превосходили по высоте контрольные.
Эти растения отличались на 10–25 % от контрольных количеством сформировавшихся листьев.
Основной целью сокращения длительности прегенеративного периода в онтогенезе растений
стрелитции королевской было ускорение наступления срока массового цветения, в связи с тем
что растения зацветают на стадии формирования 14–15 листьев. Среди экспериментальных растений с сокращенными стадиями онтогенеза (стадии прорастания семян и стадии проростка)
были отобраны образцы с максимальным количеством листьев и хорошо развитой корневой системой, а также контрольные образцы с обычным прохождением сроков онтогенеза. Опытные
растения обрабатывали (пролив растений) регуляторами: фитовиталом, фитовиталом с салициловой кислотой, фитовиталом с янтарной кислотой в концентрациях 1,5 и 2 % и эпином в концентрации 0,5 %. Обработки проводили по следующей схеме: в сезоны предполагаемого цветения
(февраль – апрель и сентябрь – декабрь) – пролив растений 2 раза в месяц с интервалом 15 дней;
в остальные месяцы – 1 раз в месяц. Всего проведено 18 обработок: сентябрь – ноябрь – 6; декабрь – январь – 2; февраль – апрель – 6; май – август – 4. Первое цветение растений отмечено
через 3,5 года от появления всходов в вариантах обработки сеянцев фитовиталом (2 %), фитовиталом с салициловой кислотой (1,5 и 2 %) и эпином (0,5 %). При обработке сеянцев этими препаратами отмечали цветение 25, 33 и 25, 40 % растений соответственно. Все цветущие растения
имели по одному цветоносу.
Повторный анализ продуктивности цветения проведен через 2 мес в период основного сезона цветения культуры (ноябрь – декабрь). Результаты влияния регуляторов на цветение растений
Strelitzia reginae представлены на рис. 3.
Наибольшее количество (75 %) цветущих растений выявлено в вариантах обработки сеянцев
фитовиталом (2 %) и фитовиталом с янтарной кислотой (2 %), причем с двумя цветоносами – 50
и 25 % соответственно.
31
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 3. Влияние регуляторов роста на цветение Strelitzia reginae Banks: Эп – эпин; Ф/в – фитовитал; Ф/в+с. к. –
фитовитал+салициловая кислота; Ф/в +я. к. – фитовитал + янтарная кислота; контроль – обработка водой
ак
ад
ем
ия
н
Эффективным оказалось применение фитовитала (1,5 %) – 67 % цветущих растений с 1 цветоносом и фитовитала с салициловой кислотой (2 %) – 50 % цветущих растений с 1 цветоносом.
Применение фитовитала с салициловой кислотой (1,5 %) и фитовитала с янтарной кислотой (1,5 %)
стимулировало цветение 25 % растений, причем в варианте сочетания с салициловой кислотой
растения имели по 2 цветоноса. Контрольные растения не зацвели.
Таким образом, применение препаративных форм фитовитала обеспечивает раннее вступление растений в фазу цветения и массовое цветение спустя 3,5 года от посева семян. Наиболее
эффективными являются фитовитал (2 %) и фитовитал с янтарной кислотой (2 %), которые способствуют быстрому вступлению растений в фазу цветения и образованию большего количества цветоносов на растении. Это позволяет значительно увеличить продуктивность цветения
культуры. Так, по сравнению с контрольными цветущими растениями (5–6 -летними), продуктивность растений, обработанных фитовиталом (2 %), увеличивается в 5 раз (табл. 4).
Т а б л и ц а 4. Влияние фитовитала и его препаративных форм на цветение Strelitzia reginae Banks
Количество цветущих растений
ал
ци
он
На
32
Средний выход соцветий
(с 90 растений), шт.
%
шт.
%
66,3
73,3
48
72,7
114,1
60,1
66,7
–
–
60,3
45,1
50,0
–
–
45,1
24,2
26,7
24
100,0
48,0
69,1
76,7
–
–
69,1
21,0
23,3
–
–
21,2
21,0
23,3
–
–
21,0
ьн
2 % фитовитал
(3,5-летние растения)
1,5 % фитовитал
(3,5-летние растения)
2 % фитовитал
с салициловой кислотой
(3,5-летние растения)
1,5 % фитовитал
с салициловой кислотой
(3,5-летние растения)
2 % фитовитал
с янтарной кислотой
(3,5-летние растения)
1,5 % фитовитал
с янтарной кислотой
(3,5-летние растения)
Контроль
(5–6- летние растения)
Количество растений с двумя
соцветиями
шт.
ая
Препарат
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Эффективным препаратом является также фитовитал с янтарной кислотой (2 %), который позволяет повысить количество цветоносов в 3 раза. Таким образом, применение этих регуляторов
роста с целью увеличения выхода цветочной продукции экономически оправдано.
Заключение. В условиях оранжереи растения Strelitzia reginae проходят полный цикл развития, обладают непрерывным ростом, период покоя не выражен. Латентный и прегенеративный
периоды в онтогенезе стрелитции в оранжерейных условиях крайне растянуты.
Перспективным путем регулирования продолжительности сроков развития растений стрелитции королевской является применение регуляторов роста, которые позволяют сократить продолжительность основных периодов онтогенеза за счет ускорения вегетативного развития. На
разных этапах развития растений каждый из испытанных препаратов показал определенную эффективность.
На стадии прорастания семян наибольшую эффективность показали препаративные формы
фитовитала (предпосевная обработка семян). Максимально ранние всходы отмечены при обработке фитовиталом с янтарной кислотой (1,5 % экспозиция 24 ч). Повышение всхожести семян до
90,2 % наблюдается в данном случае через 1,5 мес от посева. Через 3 мес от посева повышение
всхожести до 70,3–100 % наблюдается при обработке препаративными формами фитовитала: 2 %
фитовиталом (70,3 %), 1,5 % фитовиталом с салициловой кислотой (80,1 %), 1,5 % фитовиталом
с янтарной кислотой (100 %).
Сократить фазу прорастания семян на 56,8 % позволяет предпосевная обработка гетероауксином (0,001 %, экспозиция 12 ч).
Сокращение фазы прохождения стадии проростка в 2 раза обеспечивает предпосевная обработка семян фитовиталом (2 %, экспозиция 24 ч), фитовиталом с салициловой кислотой (1,5 %,
экспозиция 24 ч), гетероауксином (0,01 %, экспозиция 12 ч).
Наиболее эффективными препаратами для повышения степени развития ювенильных и виргинильных растений стрелитции, увеличения площади корневой системы являются гетероауксин (0,01 %, экспозиция 12 и 24 ч), а также фитовитал с янтарной кислотой (1,5 %, экспозиция
24 ч) и фитовитал (2 %, экспозиция 24 ч). Обработка проводится путем пролива растений.
Основным экономически значимым показателем для растений стрелитции королевской
является качество цветочной продукции и ее получение в сжатые сроки. Максимально раннее зацветание (через 3,5 года от посева семян) наблюдается в вариантах обработки растений путем пролива фитовиталом (2 %), фитовиталом с салициловой кислотой (1,5 %) и эпином (0,5 %). Причем наибольшее количество цветоносов отмечено при обработке эпином (40 %
цветущих растений). Высокой эффективностью действия на дальнейшее увеличение продуктивности цветения молодых генеративных растений отличаются фитовитал (2 %) и фитовитал с янтарной кислотой (2 %). Количество цветочной продукции при данных вариантах
обработки составляет соответственно 114 и 69 соцветий с 90 растений. Эти препараты способствуют быстрому вступлению растений в фазу цветения и образованию большего количества цветоносов (в 3–5 раз), что позволяет значительно увеличить продуктивность цветения культуры.
Предложенные препараты можно эффективно использовать в сочетании друг с другом – для
каждого этапа онтогенеза наиболее эффективный препарат. Для предпосевной обработки семян –
фитовитал и его препаративные формы, для ускорения темпов роста и развития растений – гетероауксин (0,001 и 0,01 %), эпин (0,5 %) и фитовитал (2 %), для увеличения цветочной продукции
стрелитции – фитовитал (2 %) и фитовитал с янтарной кислотой (1,5 %).
Наиболее эффективным регулятором роста на всех этапах онтогенеза стрелитции королевской является 1,5 % фитовитал с янтарной кислотой при экспозиции 24 ч. Этот режим обработки
позволяет повысить всхожесть семян до 100 %, сократить период их прорастания на 10–15 %,
в 1,5 раза сократить длительность фазы проростков, увеличить темпы роста и морфометрические показатели виргинильных растений в 3–5 раз, а также получить цветочную продукцию на
3-й год развития культуры (75 % цветущих растений).
Также экономически выгодно применение фитовитала (2 %). Данный режим обработки позволяет получить максимально ранние и дружные всходы (через 1,5 мес от посева – всхожесть
33
ус
и
51,3 %), сократить период прорастания семян на 34,1 %, фазу проростка в 2 раза, увеличить темпы роста и развития виргинильных растений в 5 раз, а также получить максимально высокие
показатели цветочной продукции (114 цветоносов с 90 растений) на 3-й год развития.
ар
Литература
E. V. ZHUDRYK
кБ
ел
1. И г н а т ь е в а И. П. Онтогенетический морфогенез вегетативных органов травянистых растений: учебное
пособие. М., 1989.
2. Иллюстрированное руководство по морфологии цветковых растений / Всероссийский НИИ растениеводства
им. Н. И. Вавилова; сост. О. Н. Коровина. СПб., 1997.
3. Р а б о т н о в Т. А. // Тр. БИН АН СССР: Сер. 3. Геоботаника. М.; Л., 1950. Вып. 6. С. 77–204.
4. У р а н о в А. А. Онтогенез и возрастной состав популяций цветковых растений. М., 1967. С. 3–8.
Summary
ау
FEATURES OF ONTOGENESIS STRELITZIA REGINAE BANKS AT cultivation
IN REPUBLIC of BELARUS
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
the ontogenesis periods Strelitzia reginae Banks in conditions of the closed ground in Belarus are considered. Problems
of search effective ways of reduction the most sensitive periods ontogenesis and increases of an output flowers production are
certain.
УДК 631.524.84.575.222.73:633.1
ел
Л. В. КОРЕНЬ, О. А. ОРЛОВСКАЯ, Л. В. ХОТЫЛЕВА
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
кБ
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФОРМИРОВАНИЯ ХОЗЯЙСТВЕННО ЦЕННЫХ
ПРИЗНАКОВ У ОТДАЛЕННЫХ ГИБРИДОВ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM)
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, e-mail: L.Koren@igc.bas-net.by
ау
(Поступила в редакцию 17.03.2011)
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Успехи в области отдаленной гибридизации пшеницы определяются необходимостью создания высокоадаптивных форм с высокой и стабильной урожайностью, устойчивостью
к фитопатогенам, обладающих улучшенным качеством зерна. В последнее время в селекции
мягкой пшеницы наблюдается тенденция сужения круга сортов, использующихся в качестве исходного материала. Сохранение такой тенденции неизбежно приводит к уменьшению генетического разнообразия. Для расширения генофонда культурной пшеницы могут быть использованы
дикорастущие виды трибы Triticeae, которые являются источниками генов устойчивости к болезням [1–5], а также улучшенного качества зерна [6–8]. Создание коллекций пшеницы с идентифицированным чужеродным генетическим материалом–важный шаг как в освоении генетических ресурсов, так и в ускорении селекционного процесса. Однако для практической селекции
пшеницы интерес представляют формы, сочетающие хозяйственно ценные признаки дикорастущих видов с наследственно закрепленным превышением лучшего родителя – мягкой пшеницы –
по признакам, связанным с продуктивностью.
Цель данного исследования – изучение характера наследования хозяйственно ценных
признаков у отдаленных F1–F4 -гибридов пшеницы для выделения из гибридных популяций
интрогрессивных форм, сочетающих высокую устойчивость к болезням с высокой продуктивностью.
Материалы и методы исследования. Материалом для исследования послужили отдаленные F1–F4-гибриды пшеницы, полученные нами в результате скрещивания сортов Фестивальная
и Саратовская 29 с дикорастущими видами T. dicoccum К45926, T. dicoccoides, T. kiharae [9].
Методами цитологического и морфологического анализов ранее была выявлена интрогрессия
чужеродного генетического материала в гибридный геном новых форм пшеницы [10].
Исследования проводили в 2006–2010 гг. на Биологической опытной станции Института генетики и цитологии НАН Беларуси. Анализировали количественные признаки – высоту и продуктивную кустистость растения, длину колоса, количество колосков и зерен в колосе у полученных отдаленных гибридов в сравнении с родительскими формами. Степень доминантности
учитываемых количественных признаков рассчитывали по формуле
hp = (F1 – МР) / (Р – МР),
На
ци
он
где hp – показатель доминантности; F1 – величина признака у гибридного растения F1; МР – средняя величина признака обеих родительских форм; Р – средняя величина признака у лучшего родителя.
В F2–F3-поколениях выявляли растения, превышавшие лучшего родителя по анализируемым
признакам. Частоту таких растений и степень превышения лучшего родителя определяли применяя формулы Г. С. Воскресенской и В. И. Шпота для оценки трансгрессий [11].
Для статистического анализа полученных данных использовали пакет программ Ехеl.
35
ус
и
ау
кБ
ел
ар
Результаты и их обсуждение. Анализировали степень доминантности признаков длина
и количество колосков главного колоса у F1–F2-гибридов. Значение степени доминантности до
0,5 характеризует промежуточное наследование или отсутствие доминантности, более 0,5 – частичное доминирование, 1,0 – полное доминирование, более 1,0 – сверхдоминирование. Естес­
твенно, что указанные расчеты доминантности отражают лишь общий характер проявления признаков, а не тип действия отдельных генов. Тем не менее полученные результаты вносят определенный вклад в изучение закономерностей наследования признаков, связанных с продуктивностью.
Как видно из табл. 1, наследование длины колоса у отдаленных F1-гибридов пшеницы проявляется по-разному в зависимости от комбинации. Встречается как полное доминирование образца мягкой пшеницы (комбинация T. dicoccoides × Фестивальная, hp = 1,07), так и явно выраженное
сверхдоминирование (T. kiharae × Саратовская 29, hp = 3,29). В то же время гибриды комбинаций
T. dicoccum К45926 × Фестивальная и T. kiharae × Фестивальная характеризовались промежуточным наследованием или отсутствием доминантности. Наибольшая длина колоса была у растений вида T. kiharae и гибридов с его участием, наименьшая – у T. dicoccum К45926 и гибрида
T. dicoccum К45926 × Фестивальная. Следовательно, в данных комбинациях признак длина колоса
наследуется преимущественно от дикорастущего вида пшеницы.
ем
ия
н
Т а б л и ц а 1. Показатели морфометрических признаков колоса и их наследование
у отдаленных F1-гибридов пшеницы (2007)
Длина, см
Гибридные комбинации,
родительские формы
X ± Sx
hp
Число колосков
X ± Sx
hp
17,0 ± 1,18
18,6 ± 0,56
14,4 ± 0,65
14,8 ± 0,45
– 2,67
1,04
– 0,62
– 0,51
20,3 ± 0,40
13,7 ± 0,33
13,6 ± 0,24
18,5 ± 0,43
17,8 ± 0,33
–
–
–
–
–
Гибридные комбинации
T. dicoccum К45926 × Фестивальная
T. dicoccoides × Фестивальная
T. kiharae × Саратовская 29
T. kiharae × Фестивальная
8,1 ± 0,35
9,7 ± 0,31
11,4 ± 0,51
9,9 ± 0,39
– 0,13
1,07
3,29
– 0,40
Родительские формы
7,0 ± 0,26
6,8 ± 0,13
10,6 ± 0,19
9,6 ± 0,28
9,9 ± 0,29
ак
ад
T. dicoccum К45926
T. dicoccoides
T. kiharae
Фестивальная
Саратовская 29
–
–
–
–
–
ал
ьн
ая
По числу колосков в колосе гибриды комбинации T. dicoccoides × Фестивальная имели показатели доминантности, близкие к 1, что указывает на полное доминирование родительского
образца мягкой пшеницы. Растения данной комбинации характеризовались наибольшим проявлением анализируемого признака (18,6 шт.). Уменьшение числа колосков в колосе и неполное доминирование или сверхдоминирование с отрицательным знаком (депрессия, hp = –2,67) отмечено
у гибридов других анализируемых комбинаций (табл. 1).
Анализ распределения растений в гибридных F2-популяциях по характеру наследования
морфометрических признаков колоса обнаружил промежуточное и частичное доминирование
с уклонением в ту или иную сторону, достигающее сверхдоминирование (табл. 2).
ци
он
Т а б л и ц а 2. Распределение растений в гибридных F2 -популяциях по характеру
наследования морфометрических признаков колоса (2008)
Признак
Длина колоса, см
Число колосков колоса
На
36
% растений от числа проанализированных с hp
< – 1,0 = – 1,0
от – 1,0
до – 0,50
от – 0,51
до – 0,01
0
от + 0,01
до + 0,50
от + 0,51
до + 1,0
= + 1
> + 1
9,8
– 11,8
25,5
– – 15,7
27,4
T. dicoccum К45926 × Фестивальная
39,2
41,2
– –
13,7
–
9,8
5,9
– – ус
и
Продолжение табл. 2
% растений от числа проанализированных с hp
41,3
5,0
Длина колоса, см
Число колосков колоса
37,5
8,3
Длина колоса, см
Число колосков колоса
50,0
– от – 0,51
до – 0,01
0
T. dicoccoides × Фестивальная
–
27,2
15,7
–
–
5,7
24,8
– T. kiharae × Саратовская 29
–
4,2
–
– –
8,3
12,5
–
T. kiharae × Фестивальная
– – 12,5
– – –
12,5
– от + 0,01
до + 0,50
от + 0,51
до + 1,0
2,1
11,3
7,2
18,4
= + 1
> + 1
ар
Длина колоса, см
Число колосков колоса
от – 1,0
до – 0,50
–
– 6,5
34,8
ел
< – 1,0 = – 1,0
–
12,5
–
6,3
8,3
12,5
– – 50,0
45,9
6,2
6,2
– –
31,3
75,0
кБ
Признак
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Наблюдаемое сверхдоминирование по признаку длина колоса у 50 % гибридных растений
комбинации T. kiharae × Саратовская 29 и у 27,4–75 % растений (в зависимости от комбинации) – по
числу колосков в колосе указывает на положительный гетерозис по данным признакам у этих
растений. В то же время у гибридного материала F2 выявлена депрессия в проявлении обсуждаемых признаков: у 37,5–50,0 % гибридных растений длина колоса меньше среднего значения родительских форм, число колосков в колосе было меньше у 5,0–41,2 % растений. На основании
установленного сверхдоминирования или полного доминирования при анализе наследования
количественных морфологических признаков колоса у гибридов F1–F2 можно предположить
присутствие в последующих поколениях трансгрессивных форм, превышающих по данным показателям лучшего родителя, что объясняется возрастающей долей гомозигот.
В табл. 3 приведены средние показатели и частота трансгрессий морфометрических признаков колоса растений F2–F3-популяций отдаленных гибридов пшеницы. В F2 были выявлены положительные трансгрессии по длине колоса с частотой от 4,96 до 45,83 %, по числу колосков –
с частотой от 6,25–14,89 %. Степень превышения лучшей родительской формы варьировала по
длине колоса от 6,80 до 18,52 %, по числу колосков – от 5,26 до 26,50 %.
Анализ трансгрессивной изменчивости признаков, связанных с продуктивностью колоса отдаленных F3-гибридов, свидетельствует о том, что большинство выявленных в F2 трансгрессий
оказались наследственно закрепленными. Как видно из табл. 3, показатели длины колоса и числа колосков в колосе, а также частота и степень трансгрессий по данным признакам в F3 оказались выше, чем в предыдущем поколении гибридов. Наибольшие значения длины колоса, числа
колосков в колосе, а также частота трансгрессий по данным признакам отмечены в F3-комбинации
T. kiharae × Саратовская 29 (табл. 3). Высокая степень трансгрессии выявлена по длине колоса
у растений комбинации T. dicoccum К45926 × Фестивальная (35,92 %), по числу колосков –
у T. dicoccoides × Фестивальная (11,50 %).
ьн
Т а б л и ц а 3. Показатели морфометрических признаков колоса, частота и степень трансгрессий у отдаленных
F2, F3 -гибридов пшеницы (2008, 2009)
ал
Гибридные комбинации
T. dicoccum К45926 × Фестивальная
ци
он
T. dicoccoides × Фестивальная
T. kiharae × Саратовская 29
T. kiharae × Фестивальная
Поколение
F2
F3
F2
F3
F2
F3
F2
F3
Длина колоса, см
Число колосков
Х ± Sx
Тч , %
Тс, %
Х ± Sx
Тч , %
Тс, %
7,5 ± 0,30
9,2 ± 0,28
7,2 ± 0,12
9,1 ± 0,24
10,3 ± 0,43
11,6 ± 0,57
9,9 ± 0,45
10,0 ± 0,25
11,76
22,53
4,96
22,92
45,83
66,67
31,25
31,58
9,71
35,92
6,80
26,21
18,52
29,63
13,89
6,48
19,3 ± 0,41
19,0 ± 0,26
17,8 ± 0,23
20,0 ± 0,23
16,9 ± 0,44
19,1 ± 0,41
19,0 ± 0,40
19,1 ± 0,45
9,80
7,04
14,89
33,33
8,33
40,00
6,25
21,05
9,09
5,91
26,50
11,50
5,26
14,21
10,00
11,50
На
П р и м е ч а н и е. Тч – частота трансгрессии; Тс – степень трансгрессии.
37
ус
и
кБ
ел
ар
Озерненность колоса в F1 оказалась низкой вследствие частичной стерильности ранних поколений, причиной которой являются выявленные нами нарушения в процессе мейоза, обусловленные неоднородностью хромосомного состава скрещиваемых форм [9]. Наиболее низкая озерненность колоса отмечена в комбинациях T. kiharae × Саратовская 29 и T. kiharae × Фестивальная
(2,4 и 0,9 зерен на колос соответственно). Фенологические наблюдения за цветением растений
данных комбинаций показали, что в подавляющем большинстве цветки в колосьях были стерильными, зерна в них не завязывались. Объяснить этот факт можно тем, что вид T. kiharae является видом-носителем ЦМС [12]. В более поздних поколениях гибридов наблюдается возрастание данного показателя, что связано со стабилизацией мейоза вследствие формирования гамет,
сбалансированных по хромосомному набору и элиминации несбалансированных. Как видно из
табл. 4, в F3 все гибридные комбинации характеризуются более широкими пределами изменчивости числа зерен в колосе по сравнению с первым поколением, а также более высокими показателями данного признака, что указывает на протекающий формообразовательный процесс
в F3-популяциях и дальнейшую стабилизацию генотипов.
F1
Гибридные комбинации
F3
lim
X ± Sx
ем
ия
н
X ± Sx
ау
Т а б л и ц а 4. Показатели числа зерен в колосе растений отдаленных
F1, F3 –гибридов пшеницы (2007, 2009)
T. dicoccum К45926 × Фестивальная 9,5 ± 1,91 3–16 33,0 ± 1,87
20,2 ± 3,49 2–37 32,0 ± 2,06
T. dicoccoides × Фестивальная
2,4 ± 0,88 1–8 25,6 ± 4,23
T. kiharae × Саратовская 29
0,9 ± 0,29 0–3 25,1 ± 2,58
T. kiharae × Фестивальная
lim
6–68
10–63
1–50
5–45
С целью выделения высокопродуктивных генотипов в 2010 г. анализировали потомство лучших растений F3. В большинстве случаев полученные семьи F4 по анализируемым признакам
продуктивности внутри гибридных комбинаций достоверно различались (табл. 5).
ак
ад
Т а б л и ц а 5. Дисперсионный анализ семей F4 комбинаций отдаленных гибридов пшеницы
Гибридные комбинации
*P < 0,05.
**P < 0,01.
ая
T. dicoccum К45926 × Фестивальная
T. dicoccoides × Фестивальная
T. kiharae × Саратовская 29
T. kiharae × Фестивальная
df
Высота
растения
6 1067,25**
4 407,92**
1
180,50
1 743,69**
MS
Продуктивная
кустистость
Длина
колоса
10,37**
11,14**
0,50
124,82**
51,62**
25,08**
58,68**
3,92
Число
Число
колосков колоса зерен колоса
28,96**
3,92
16,06**
13,87*
1291,48**
1471,01**
3068,06**
155,47
ци
он
ал
ьн
Как видно из табл. 6, высота гибридных растений F4 была небольшой и варьировала у разных
генотипов от 85,7 до 115,5 см, что способствовало устойчивости к полеганию анализируемых форм.
Выявленная в F3 частота положительных трансгрессий по длине колоса и числу колосков в нем
обусловила возможность выделения в F4 семей с высокими показателями данных признаков. К таким семьям можно отнести № 60/6/2, 93/7/1, 93/7/3, 93/7/8 из комбинации T. dicoccum
К45926 × Фестивальная, № 79/15/1, 79/15/7, 83/16/5 из комбинации T. dicoccoides × Фестивальная.
В двух других комбинациях (T. kiharae × Саратовская 29, T. kiharae × Фестивальная) анализируемые
семьи также характеризовались высокими показателями длины колоса и числа колосков в колосе.
Как правило, выделенные по морфометрическим признакам колоса (длине и числу колосков)
генотипы имели достаточно высокие показатели озерненности колоса (от 21,0 до 50,6 шт.).
Исключение составили № 46/19 комбинации T. kiharae × Саратовская 29 и № 83/16/5 комбинации
T. dicoccoides × Фестивальная, число зерен в колосе у которых было значительно ниже (9,6 и 16,8 шт.
соответственно, табл. 6).
На
38
На
ьн
57/4
60/6/1
60/6/2
93/7/1
93/7/3
93/7/8
119/8
70/11/1
76/13/2
79/15/1
79/15/7
83/16/5
46/19
48/20/1
17/28
113/34/1
H
R
R
R
R
R
R
H
R
R
R
R
R
H
R
R
бурой
ржавчине
ак
ад
S
H
H
H
H
H
H
H
S
S
H
H
S
S
H
H
мучнистой
росе
Устойчивость к
3,0 ± 0,23
3,8 ± 0,25
5,2 ± 0,55
4,6 ± 0,52
6,1 ± 0,37
4,9 ± 0,41
3,6 ± 0,40
3,2 ± 0,42
3,0 ± 0,30
4,8 ± 0,49
5,7 ± 0,50
4,3 ± 0,54
3,6 ± 0,41
3,2 ± 0,42
8,6 ± 0,48
3,3 ± 0,48
Продуктивная
кустистость
ем
ия
н
102,2 ± 1,80
85,7 ± 2,52
101,6 ± 1,59
109,6 ± 2,39
109,4 ± 2,19
110,8 ± 1,89
85,7 ± 1,95
115,3 ± 2,17
115,0 ± 2,27
114,2 ± 1,72
110,8 ± 2,21
99,3 ± 2,69
108,1 ± 3,33
114,4 ± 2,04
109,3 ± 1,51
96,5 ± 2,19
Высота
растения, см
П р и м е ч а н и е. R – устойчивый, S – восприимчивый; H – промежуточный.
T. kiharae × Фестивальная
T. kiharae × Саратовская 29
T. dicoccoides × Фестивальная
№
семьи
ая
T. dicoccum К45926 × Фестивальная
Гибридные комбинации
ал
ел
20,9 ± 0,59
17,2 ± 0,52
20,4 ± 0,45
18,0 ± 0,57
20,2 ± 0,44
19,6 ± 0,50
16,2 ± 0,40
20,0 ± 0,42
19,6 ± 0,57
20,1 ± 0,48
21,0 ± 0,42
19,2 ± 0,56
18,0 ± 0,22
19,9 ± 0,54
20,0 ± 0,57
18,2 ± 0,62
Число колосков
кБ
ау
7,8 ± 0,15
8,7 ± 0,30
9,4 ± 0,34
10,6 ± 0,37
9,8 ± 0,23
12,9 ± 0,41
5,2 ± 0,24
8,1 ± 0,18
7,2 ± 0,30
9,3 ± 0,15
8,7 ± 0,26
11,6 ± 0,41
9,1 ± 0,54
12,7 ± 0,44
10,4 ± 0,31
9,5 ± 0,37
Длина, см
Главный колос
ар
ус
и
42,6 ± 2,05
28,0 ± 3,01
32,7 ± 3,42
31,6 ± 3,42
50,6 ± 2,41
36,7 ± 3,02
12,4 ± 1,68
18,7 ± 2,06
36,5 ± 3,18
37,9 ± 2,23
45,9 ± 2,75
16,8 ± 2,09
9,6 ± 2,86
35,7 ± 2,94
26,9 ± 3,03
21,0 ± 1,73
Число зерен
Т а б л и ц а 6. Характеристика семей отдаленных F4 -гибридов по устойчивости к болезням и основным признакам продуктивности растения (2010)
ци
он
39
ус
и
Литература
ау
кБ
ел
ар
Большинство генотипов F4 проявляли высокую толерантность к бурой ржавчине, однако
были менее устойчивы к возбудителю мучнистой росы (табл. 6). Таким образом, у отдаленных
гибридов пшеницы выявлена экспрессия генов устойчивости к патогенам, интрогрессированных в их геном от дикорастущих видов.
Заключение. На основании анализа наследования признаков продуктивности в первом поколении отдаленных гибридов пшеницы, а также распределения растений в популяциях F2–F3
по степени доминантности и трансгрессивной изменчивости отобраны формы с высоким уровнем продуктивности. Большинство генотипов поколения F4 в год испытания проявили высокую
толерантность к бурой ржавчине, но были менее устойчивы к возбудителю мучнистой росы.
Полученные качественно новые интрогрессивные формы пшеницы могут быть рекомендованы
для включения в селекционные программы в качестве генетических источников изменчивости
хозяйственно ценных признаков, а также для практического использования в сельскохозяйственном производстве.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Белорусского республиканского фонда
фундаментальных исследований, договор № Б09СО-004.
ак
ад
ем
ия
н
1. К р и в ч е н к о В. И. Устойчивость зерновых колосовых к возбудителям головневых болезней. М., 1984.
2. Г о н ч а р о в Н. П. Сравнительная генетика пшениц и их сородичей. Новосибирск, 2002.
3. В а в и л о в Н. И. // Мировые ресурсы хлебных злаков. Пшеница. М.; Л., 1964.
4. Д а в о я н Р. О., Б е б я к и н а И. В., Д а в о я н Э. Р., К е к а л о Н. Ю. // Тез. междунар. конф. «Генетика
в 21 веке: современное состояние и перспективы развития». М., 2004. Т. 1. С. 98.
5. А в с е н и н В. И., М о ц н ы й И. И., Р ы б а л к а А. И., Ф а й т В. И. // Цитология и генетика. 2003. Т. 38,
№ 1. С. 11–17.
6. Ж у к о в с к и й П. М. Культурные растения и их сородичи. Л., 1971.
7. К о н а р е в В. Г. Белки пшеницы. М., 1980.
8. Д о р о ф е е в В. Ф., Ф и л а т е н к о А. А., М и г у ш о в а Э. Ф. и д р. Культурная флора СССР / Ред.
В. Ф. Дорофеев. Л., 1979. Т. 1.
9. О р л о в с к а я О. А., К о р е н ь Л. В., Х о т ы л е в а Л. В. // Весці НАН Беларусі. Сер. біял. навук. 2010.
№ 4. С. 50–54.
10. О р л о в с к а я О. А., К о р е н ь Л. В., Х о т ы л е в а Л. В. // Междунар. науч. конф. «Фундаментальные
и прикладные аспекты генетики». Минск, 3–6 декабря 2008. Мн., С. 142–144.
11. В о с к р е с е н с к а я Г. С., Ш п о т а В. И. // Селекция и семеноводство. 1967. № 6. С. 18–20.
12. Х а й л е н к о Н. А., А л т а е в а Н. А. // e-lib. gasu. ru/konf/biodiversity/2010/36. pdf.
L. V. KOREN, O. A. ORLOVSKAYA, L. V. KHOTYLEVA
ая
GENETIC ANALYSIS OF AGRONOMIC TRAITS FORMATION
IN REMOTE WHEAT HYBRIDS (Triticum aestivum)
Summary
На
ци
он
ал
ьн
Wheat forms combining disease resistance and a high productivity level were selected on the basis of the analysis of
dominance degree and transgressive variability of productivity traits in the remote wheat hybrids F1–F4. The produced
qualitatively new introgressive forms may be recommended for including in breeding programs as genetic sources of
agronomic traits variability.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 575.222.73:577.2.086 [633.11+633.14]
ел
Н. М. ЕРМИШИНА1, Е. М. КРЕМЕНЕВСКАЯ1, О. Н. ГУКАСЯН 1,
В. Н. БУШТЕВИЧ 2, С. И. ГРИБ 2, В. А. ЛЕМЕШ 1
кБ
Использование ДНК-маркеров для создания D/R-замещенных форм
тритикале с оптимальным аллельным составом локуса GLU-D1
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, e-mail: N.Yermishina@mail.ru,
2
Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию, Жодино
ау
1
(Поступила в редакцию 17.02.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Ценная зерновая культура тритикале имеет сравнительно короткую историю селекции. В связи с этим ее генетическая база требует расширения, чтобы вести эффективную селекцию в соответствии с современными требованиями. Расширить генетическое разнообразие тритикале можно путем интрогрессии в геном этой культуры ценных генов родительских видов – ржи
и в особенности пшеницы. Селекция пшеницы имеет, в отличие от тритикале, давнюю историю
и большие достижения. Ценные гены лучших сортов пшеницы, расположенные на хромосомах
геномов А и В, могут быть сравнительно просто интрогрессированы в геном тритикале путем
получения отдаленных гибридов между тритикале и пшеницей с последующим беккроссированием этих гибридов тритикале. Гены генома D пшеницы могут быть интрогрессированы в геном
тритикале путем получения D/R, а также D/А и D/B замещенных линий.
Из хромосом генома ������������������������������������������������������������������
D�����������������������������������������������������������������
пшеницы наибольший интерес представляет 1�����������������������
D����������������������
, на которой локализованы важные гены, связанные с хлебопекарными качествами муки. Именно пониженные по сравнению с пшеницей хлебопекарные качества муки тритикале сдерживают широкое использование
этой культуры для пищевых целей. Хлебопекарные качества пшеницы в значительной степени
определяются тремя генными локусами запасающих белков семени, обозначаемыми Glu-A1, GluB1 и Glu-D1, расположенными на хромосомах 1�����������������������������������������������
A����������������������������������������������
, 1�������������������������������������������
B������������������������������������������
и 1��������������������������������������
D�������������������������������������
соответственно. Они кодируют высокомолекулярные субъединицы глютенинов (HMW). Известно, что чем больше HMW субъединиц
глютенинов синтезируется в зерне, тем лучше хлебопекарные качества полученной из него муки
[1]. Каждый локус Glu-A1, Glu-B1 (у пшеницы и тритикале) и Glu-D1 (у пшеницы) включает два
тесно сцепленных гена, кодирующих субъединицы различной молекулярной массы, которые относятся к х- и у- типам [2–4]. Как было показано P. I. Payne et al. [5] и R. J. Hamer et al. [6], хорошие
хлебопекарные качества гексаплоидной пшеницы обеспечивает аллельный состав локуса Glu-D1
Dx5 + Dy10, в то время как сочетание аллелей Dx2 + Dy12 связано с низкими значениями признака. Геном гексаплоидных тритикале включает только локусы глютенинов геномов А и В Glu-A1
и Glu-B1. Из-за отсутствия локуса Glu-D1 у тритикале синтезируется лишь 1–3 субъединицы глютенинов [7], что снижает содержание клейковины на 10–15 % по сравнению с пшеницей [8].
Для создания форм тритикале с высокими хлебопекарными качествами наибольший интерес
представляют замещения гомеологичных хромосом 1R тритикале на хромосомы 1D пшеницы.
При этом важно, чтобы в качестве донора хромосомы 1D были использованы сорта пшеницы
с оптимальным аллельным составом локуса Glu-D1.Работы, связанные с расширением генофонда тритикале за счет интрогрессии ценных генов пшеницы, в Беларуси не получили широкого
распространения. Это связано с определенными сложностями получения гибридов между тритикале и пшеницей, создания и точной идентификации R/D-замещенных линий тритикале.
Использование ДНК-маркеров может способствовать решению большинства названных проб41
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
лем. Однако количество публикаций по применению ДНК-маркеров для получения R/D-замещенных
линий тритикале, в том числе с целью повышения хлебопекарных качеств муки этой культуры,
ограничено.
Цель настоящей работы – изучение возможности оптимизации процесса подбора исходного
материала, идентификации и отбора ���������������������������������������������������
D��������������������������������������������������
/�������������������������������������������������
R������������������������������������������������
-замещенных форм тритикале с оптимальным аллельным составом локуса Glu-D1, обеспечивающим высокие хлебопекарные качества муки, с помощью применения соответствующих ДНК-маркеров.
Материалы и методы исследования. Материалом для исследования служили сорта мягкой
пшеницы Triticum aestivum: Рассвет, Ростань, Рапсодия, Блискавица и Дарья (яровые), а также
Былина, Капылянка, Исток, Knirps����������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������
и Rezo���������������������������������������������������
�������������������������������������������������������
(озимые); линии гексаплоидного тритикале, отобранные в F4 гибридов между озимыми тритикале и озимой пшеницей (Дубрава × (Папарать × АД60) × Исток, ((Папарать × АД60) × Дубрава) × ����������������������������������������������������
Rezo������������������������������������������������
и GWT������������������������������������������
���������������������������������������������
-1983-91 × �������������������������������
Knirps�������������������������
; формы, отобранные в поколении F2 гибридов между сортами яровых тритикале и пшеницы Лотос × Дарья.
Сорта пшеницы и формы тритикале изучали на предмет наличия у них оптимального для
хлебопекарных качеств аллельного состава локуса Glu-D1 (Dx5 + Dy10), используя праймеры,
приведенные в статье Ahmad [8]:
F: GCCTAGCAACCTTCACAATC
R: GAAACCTGCTGCGGACAAG (к аллелям Dx2, Dx5) и
F: GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG
R: TGGAGAAGTTGGATAGTACC (к аллелям Dy10, Dy12)
Линии гексаплоидного тритикале, отобранные в F4 гибридов между формами озимых тритикале (в скобках приведено их происхождение) и сортами озимой мягкой пшеницы комбинаций
скрещивания (Дубрава × (Папарать × АД60)) × Исток, ((Папарать × АД60) × Дубрава) × Rezo и GWT1983-91 × Knirps, были оценены на наличие SSR-маркера Xgwm 33-1���������������������������
D��������������������������
[9] хромосомы 1����������
D���������
, используя праймеры:
F: CCT CTT CCT CCC TCA CTT AGC
R: TGC TAA CTG GCC TTT GCC
Растения тритикале и пшеницы выращивали на опытном поле Биологической опытной станции Института генетики и цитологии НАН Беларуси в 2009–2010 гг. Выделение ДНК осуществляли из собранных в поле листьев с помощью набора реактивов Genomic DNA Purification Kit
#K0512 («Fermentas») по методике, предложенной производителем.
ПЦР с праймерами к генам глютенина пшеницы Glu-D1 проводили в реакционной смеси
объемом 25 мкл, содержащей 2,5 мкл ПЦР-буфера (75 мМ Трис-HCl, pH 8.3, 20 мМ (NH4)2SO4,
0,1 %-ный твин-20), 2 мМ MgCl2 200 мкМ каждого дНТФ, 0,6 мкМ каждого праймера, 1 ед. Taqполимеразы и 100 нг геномной ДНК. Амплификация включала фазу денатурации при + 94 оС
(5 мин), далее 45 циклов при + 94 оС (1 мин), + 63 оС (1 мин), + 72 оС (1 мин) и заключительную
элонгацию при + 72оС (10 мин). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом
в 2 %-ном (Dx5) и 3 %-ном (Dy10) агарозном геле в 1 × ТАЕ-буфере (40 мМ Трис-HCl, рН 8,0,
10 мМ ЭДТА) при 80 В 45–50 мин. Для определения длины амплифицированных фрагментов использовали ДНК-маркер 100 п. о. («Fermentas»).
D�����������������������������������������������������
проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содерПЦР с SSR-маркером Xgwm 337–1������������������������������������������������������
жащей 50–100 нг ДНК-матрицы, по 0,2 мМ каждого дНТФ, 1,5 мМ MgCl2, 0,6 мкМ прямого
и обратного SSR-праймеров, 1 ед. Таq-полимеразы. Амплификация включала фазу денатурации
при + 94 оС (3 мин), далее 45 циклов при + 94 оС (1 мин), + 55 оС (1 мин), + 72 оС (2 мин) и заключительную элонгацию при + 72 оС (10 мин). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в 7%-ном акриламидном геле (130 В, 15 мА) 3–4 ч. Использовали маркер 100 п. о.
Окрашивание ДНК в геле проводили этидиум бромидом.
Результаты и их обсуждение. Результаты ПЦР-анализа показали, что в геноме всех изученных пшениц представлены аллели локуса Glu-D1 Dx5 и Dy10, определяющие хорошие хлебопекарные качества муки. Установлено присутствие фрагмента 450 п. н., наличие которого связывают с аллелем Dx5 (рис. 1), и фрагмента 576 п. н., который является маркером аллеля Dy10 (рис. 2).
На
42
ус
и
ар
ел
кБ
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК сортов пшеницы с праймерами Р1 и Р2 к гену Dx5 локуса
Glu-D1: М – маркер 100 п. о.; 1 – Былина; 2 – Капылянка; 3 – Исток; 4 – Knirps; 5 – Rezo; 6 – Рассвет; 7 – Ростань; 8 –
Рапсодия; 9 – Блискавица; 10 – Дарья; К – контроль амплификации (без ДНК)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Использованные в настоящей работе в качестве исходного материала для скрещивания сорта
яровой и озимой мягкой пшеницы были отобраны нами по комплексу хозяйственно ценных
признаков, в том числе по хорошим хлебопекарным качествам. Результаты молекулярногенетического анализа дали возможность прийти к однозначному заключению, что вклад хромосомы 1D в высокие хлебопекарные качества этих сортов пшеницы определяется оптимальным
аллельным составом локуса Glu-D1, и каждый из них можно использовать в скрещиваниях для
получения D/R-замещенных линий.
M. E. ����������������������������������������������������������������������������������
Kazman����������������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������
et�������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������
al����������������������������������������������������������������������
. ��������������������������������������������������������������������
[10] были созданы замещенные линии тритикале, донором ��������������
D�������������
-генома которых был сорт пшеницы Chinese Spring, несущий на 1D хромосоме локус Glu-D1 аллельного состава Dx2 + Dy12 [11]. Величина седиментационного осадка у созданных генотипов оказалась
значительно выше исходных форм тритикале с полным набором хромосом. Однако при сравнении линий тритикале с различными аллелями Glu-D1 оказалось, что при сочетании аллелей Dx5 +
Dy10 уровень седиментации был выше, чем у линий с Dx2 + Dy12 [11]. Эти работы продемонстрировали возможность улучшения хлебопекарных качеств тритикале путем получения 1�������������
D������������
/1����������
R���������
замещенных линий. При этом эффект замещения был выше в том случае, когда в качестве донора хромосомы 1D использовали сорта пшеницы с оптимальным аллельным составом локуса Glu-D1.
Однако процесс создания D������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������
/�����������������������������������������������������������
R����������������������������������������������������������
-замещенных линий тритикале остается весьма сложным и трудоемким. Существует ряд трудностей, связанных с наличием барьеров несовместимости между
тритикале и пшеницей. Процесс стабилизации геномов полученных отдаленных гибридов в ходе
их репродуцирования протекает достаточно длительное время и в значительной степени непредсказуемо. Использование для отбора генотипов с желаемым сочетанием хромосом родительских
видов с помощью традиционных цитологических методов связано со значительными трудозатратами. Использование методов маркер-сопутствующей селекции может существенно облегчить проведение этого этапа работ. Тем не менее остается неясным, как наиболее рационально
использовать молекулярные маркеры в сочетании с традиционными методами отбора по комплексу селекционно-ценных признаков в процессе создания замещенных линий тритикале.
На
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК сортов пшеницы с праймерами Р3 и Р4 к генам Dy10/
Dy12 локуса Glu-D1: М – маркер 100 п. о.; 1 – Былина; 2 – Капылянка; 3 – Исток; 4 – Knirps; 5 – Rezo; 6 – Рассвет; 7 –
Ростань; 8 – Рапсодия; 9 – Блискавица; 10 – Дарья; К – контроль амплификации (без ДНК)
43
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
С целью анализа характера D/R-замещений у линий BC1F4, BC2F3, F4 и F5 гибридов между
яровыми тритикале и пшеницей R. S. Gill et al. [12] использовали набор SSR-маркеров ко всем
хромосомам генома �����������������������������������������������������������������������
D����������������������������������������������������������������������
и генома ������������������������������������������������������������
R�����������������������������������������������������������
. В результате были отобраны формы с разным сочетанием хромосом этих геномов, в том числе с замещениями 1D/1R, а также формы, имеющие одновременно
как хромосому 1D, так и хромосому 1R.
В настоящем исследовании линии озимых тритикале, отобранные в F4 (Дубрава × (Папарать × АД60)) × Исток, ((Папарать × АД60) × Дубрава) × Rezo и GWT-1983-91 × Knirps (озимые), были
оценены на наличие 1D хромосомы с помощью SSR-маркера Xgwm337 к малому плечу 1��������
D�������
хромосомы пшеницы [9]. Из 49 проанализированных форм только у одной из них – (Дубрава × (Папара
ть × АД60)) × Исток – установлено наличие фрагмента, ассоциированного с хромосомой 1D, т. е.
генотипы с желаемым замещением хромосом 1D/1R встречаются относительно редко. Поэтому
следует либо расширять объем отбираемых линий, либо начинать отбор генотипов, несущих
хромосому 1D, в более ранних поколениях.
Следует также заметить, что использованный нами SSR-маркер Xgwm337 был разработан для
пшеницы. Как показал наш опыт, при использовании данного маркера для идентификации хромосомы 1������������������������������������������������������������������������������
D�����������������������������������������������������������������������������
у гибридов между тритикале и пшеницей имеет место неспецифическая амплификация, связанная с присутствием хромосом генома ��������������������������������������������
R�������������������������������������������
ржи. В связи с этим нами была изучена возможность использования аллель-специфичного маркера целевых генов – глютенина пшеницы
Glu-D1 –для отбора 1D/1R замещенных форм в расщепляющихся поколениях гибридов между
тритикале и пшеницей. Поскольку хромосома 1D пшеницы привносится в геном тритикале один
раз при получении гибридов, а гены Dx5 и Dy10 сцеплены, нет необходимости проводить анализ
линий на присутствие как аллеля Dx5, так и аллеля Dy10. Достаточно использовать праймеры
лишь к одному из них (мы использовали праймеры для обнаружения аллеля Dx5), что позволяет
существенно снизить трудозатраты при проведении анализов.
Для линии F4 (Дубрава × (Папарать × АД60)) × Исток с присутствием 1��������������������
D�������������������
хромосомы было показано наличие аллеля Dx5. Последующий анализ 22 растений поколения – F5 – идентифицированной линии, имеющей аллель Dx5, дал отрицательный результат. Очевидно, цитологическая
стабилизация этой линии в F4 еще не завершилась. Среди взятых в анализ растений могли быть
формы, имеющие одновременно хромосому 1D и хромосому 1R [12]. В F5 могло иметь место расщепление по этим хромосомам. В результате линии F5 с хромосомой 1D либо не были отобраны
для молекулярно-генетического анализа, либо были утрачены из-за недостаточно высокой зимостойкости. A. J. Lukaszewski и В. Apolinarska [13], А. Seal и M. D. Bennett [14] установили, что
R���������������������������������������������������������������������������������������
/��������������������������������������������������������������������������������������
D�������������������������������������������������������������������������������������
замещения у гексаплоидных озимых тритикале практически не происходят, структура ржаных хромосом, часто измененная у яровых тритикале в результате гибридизации с пшеницей,
остается неизмененной у озимых тритикале. Было сделано предположение, что селекционное
давление может действовать у озимых тритикале на сохранение или поддержание целого
R-генома и нормальной структуры хромосом ржи [13].
Как свидетельствуют наши результаты и данные литературы [13, 14], отбор замещенных
форм на озимых тритикале малоэффективен. Поэтому в дальнейшем мы проводили аналогичную работу с яровыми формами. Были исследованы гибриды F2 ярового тритикале. На рис. 3
представлены результаты амплификации праймеров Р1 и Р2 к аллелю Dx5 11 линий, отобранных
по комплексу селекционных показателей в поколении F2 гибридов между сортом яровых гексаплоидных тритикале Лотос и сортом яровой мягкой пшеницы Дарья.
Как видно, характерный фрагмент 450 п. н. обнаружен у шести из них, что свидетельствует
об интрогрессии хромосомы 1D пшеницы в геном тритикале.
Формы с хромосомой 1D встречались среди гибридов между яровыми тритикале и пшеницей
с относительно высокой частотой (54,5 %). Поскольку анализировали лишь второе поколение гибридов, однозначно нельзя сказать, в какой степени эта высокая частота обусловлена ранним поколением, а не тем, что анализировали именно гибриды между яровыми, а не озимыми формами.
В целом полученные результаты показали, что маркеры к аллелю Dx5 локуса Glu-D1 можно
с успехом использовать для отбора 1����������������������������������������������������
D���������������������������������������������������
/1�������������������������������������������������
R������������������������������������������������
замещенных форм в расщепляющихся поколениях гибридов между тритикале и пшеницей. По-видимому, отбор таких линий следует начинать в ран-
На
44
ус
и
ар
ел
кБ
Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК яровых отдаленных гибридов тритикале F2 с пшеницей
и сорта пшеницы с праймерами Р1 и Р2 к гену Dx5 локуса Glu-D1: М – маркер 100 п. о.; 1 – сорт Дарья; 2 – 12 – гибриды F2 тритикале Лотос × пшеница Дарья; К – контроль амплификации (без ДНК)
ем
ия
н
ау
них поколениях (начиная с F2), поскольку в более поздних поколениях (F4 и далее) их может не
оказаться или их может быть немного.
Заключение. Результаты молекулярно-генетического анализа использованных в качестве
исходного материала для скрещивания сортов яровой и озимой мягкой пшеницы, характеризующихся хорошими хлебопекарными качествами, дали возможность прийти к однозначному заключению, что вклад хромосомы 1��������������������������������������������������������
D�������������������������������������������������������
в высокие значения этого признака данных сортов пшеницы определяется оптимальным аллельным составом локуса Glu-D1 -Dx5 и Dy10.
Показано, что для отбора 1D/1R замещенных форм в расщепляющихся поколениях гибридов
между тритикале и пшеницей с успехом можно использовать маркер Dx5 локуса Glu-D1. Повидимому, отбор таких линий следует осуществлять в ранних поколениях, начиная с F2. Среди
форм F2 яровых тритикале было отобрано шесть, а среди F4 озимых – одна линия с наличием
гена глютенина пшеницы Dx5. Ведется дальнейшая маркер-сопутствующая селекция по созданию D/R-замещенных линий тритикале.
Литература
ал
ьн
ая
ак
ад
1. S a l m a n o w i c z B., D y l e w i c z M. // J. Appl. Genet. 2007. Vol. 48, N 4. Р. 347–357.
2. L a f i a n d r a D., T u c c i G. F., P a v o n I A., T u r c h e - t t a T., M a r g i o t t a B. // Theor. Appl. Genet. 1997.
Vol. 94. P. 235–240.
3. I k e d a T. M., A r a k i E., F u j i t a Y., Y a n o H. // Theor. Appl. Genet. 2006. Vol. 112. P. 327–334.
4. T h o m p s o n R. D., B a r t e l s D., H a r b e r d N. P. // Nucleic Acids Research. 1983. Vol. 13. P. 6833–6846.
5. P a y n e P. I., N i g h t e n g a l e M. A., K r a t t i g e r A. F., H o l t L. M. // J Sci Food Agric. 1987. Vol. 40. P. 51–65
6. H a m e r R. J., W e e g e l s W. P., M a r s e i l l e J. P. // J Cereal Sci. 1992. Vol. 15. P. 91–102.
7. A m i o u r N., B o u g u e n n e c A., M a r c o z C., S o u r - d i l l e P., B o u r g o i n M., K h e l i f i D., B r a n l a r d G. //
Euphytica. 2002. Vol. 123. P. 295–305.
8. A h m a d M. // Theor. Appl. Genet. 2000. Vol. 101. P. 892–896.
9. R ö d e r M. S., K o r z u n V., W e n d e h a k e K., P l a s - c h k e J., T i x i e r M. H., L e r o y P., G a n a l M. W. //
Genetics. 1998. Vol. 149. P. 2007–2023.
10. K a z m a n M. E., L e l l r y T., R ö b b e l e n G. Die Backqualität von 6 × -Triticale: Möglichkeiten chromosomaler
Manipulationen. Bericht über die 44. Arbeitstagung der Vereinigung österreichischer Planzenzüchter, Gumpenstein.
11. L a f f e r t y J., L e l l e y T. // Plant Breeding. 2001. Vol. 120. P. 33–37.
12. http://www.shigen.nig.ac.jp/ewis/article/html/53/article.html
13. L u k a s z e w s k i A. J., A p o l i n a r s k a B. // Can. J. Genet. Cytol. 1981. Vol. 23. P. 281–285.
14. S e a l A., B e n n e t t M. D. // Can. J. Genet. Cytol. 1982. Vol. 23. P. 647–653.
N. M. YERMISHINA, E. M. KREMENEVSKAYA, O. N. GUKASIAN, V. N. BUSHTEVICH, S. I. GRIB, V. A. LEMESH
ци
он
USE OF DNA-MARKERS FOR DEVELOPMENT OF D/R-SUBSTITUTED FORMS OF TRITICALE WITH
OPTIMAL ALLELE COMPOSITION OF GLU-D1 LOCUS
Summary
На
High efficiency of using DNA-markers for optimization of the process of producing D/R-substituted lines of triticale with
enhanced bread-making quality has been demonstrated. The varieties of spring and winter common wheat with optimal allele
composition of Glu-D1 locus (Dx5 + Dy10), as well as 1D/1R-substituted forms in segregating populations of hybrids between
triticale and wheat have been selected with the help of corresponding markers.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 581.14:582.912.42
ел
О. А. КУДРЯШОВА, М. П. ВОДЧИЦ, Е. П. ГЛЕБ, Е. С. ГУК, А. А. ВОЛОТОВИЧ
кБ
СТИМУЛЯЦИЯ РОСТА И РАЗВИТИЯ ЛИСТОПАДНЫХ ФОРМ
RHODODENDRON IN VIVO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УСТАНОВКИ ОСВЕЩЕНИЯ
НА ОСНОВЕ СВЕТОДИОДОВ
Полесский государственный университет, Пинск, e-mail: volant777@tut.by
ау
(Поступила в редакцию 25.06.2010)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Рододендрон (лат. Rhododendron) – самый многочисленный род растений семейства Ericaceae (Вересковые), насчитывающий около 1300 дикорастущих видов, из которых в садоводстве используют более 600 видов, и 8000 сортов [1–3]. Рододендрон желтый (Rhododendron
luteum L., Azalea pontica L.) – растение семейства Ericaceae, занесенное в Красную книгу
Республики Беларусь (3-я категория охраны) [4]. В верхушечных соцветиях данного вида содержится до 0,3 % эфирного масла, которое используется в композициях высших сортов парфюмерии. По данным разных авторов, содержание эфирного масла в верхушечных соцветиях у рододендрона желтого в 1,5–3,0 раза превышает таковое у рододендронов других видов (в том числе
большинства сортовых рододендронов) [5]. Закладка производственных плантаций рододендрона желтого на территории Белорусского Полесья на долгие годы обеспечит стабильным источником высококачественного сырья для получения абсолюта или абсолютного масла, а также будет
способствовать выводу указанного вида из Красной книги Республики Беларусь. Растения рода
рододендрон представляют собой медленно растущие кустарники, формирование цветочных
почек наблюдается на 2–3-й год развития растений. На сегодняшний день представляют практический интерес данные по стимуляции роста и развития растений рододендрона желтого на этапах производства посадочного материала in vivo, поскольку ускорение роста и развития растений
в ювенильном возрасте способствует более раннему их зацветанию.
Излучение источников искусственного освещения – один из наиболее эффективных факторов, влияющих на рост и развитие растений in vivo. Большинство из существующих в наше время ламп недостаточно экономичны. Физиологическая радиация обычно колеблется в пределах
5–20 % подводимой мощности, а поглощение этой радиации хлорофиллом составляет 50–90 %.
Следовательно, в лучшем случае растения могут использовать на создание органического вещества не более 2,5–18 % энергии, потребляемой лампами. Поэтому важнейшей проблемой светотехники является разработка рациональных осветителей, дающих строго направленный пучок
лучей и создающих равномерное освещение на определенной площади. Известно, что перегрев
растений, особенно при использовании ламп, богатых инфракрасными лучами, – наиболее часто
наблюдаемое явление в условиях светокультуры. При этом имеет значение не столько температура среды, сколько температура тканей растений, особенно листьев. Лампы солнечного света
и лампы накаливания повышают температуру листьев по сравнению температурой воздуха на
5–6 и 9–11 °С соответственно [6]. Поэтому очень важен вопрос устранения избытка инфракрасных лучей, вызывающих перегрев растений.
Светодиод (по-английски light emitting diode или LED) – это полупроводниковый прибор
с электронно-дырочным p–n-переходом или контактом «металл – полупроводник», преобразующий электрический ток непосредственно в световое излучение [7]. Главное преимущество светодиода в отличие от лампы накаливания или люминесцентной лампы заключается в том, что
На
46
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
электрический ток преобразуется в световое излучение практически без потерь, при этом светодиод практически не нагревается, что определяет длительный срок его службы. Светодиод
излучает в узкой части спектра, излучение идет полностью в переднюю сферу, механически прочен, исключительно надежен. В отличие от ламп накаливания и всех других типов ламп светодиоды излучают свет в относительно узкой полосе спектра, ширина которой составляет 20–30 нм,
что делает их особенно удобными для формирования светильников со специальным спектром
излучения. Срок службы светодиода может достигать 100 тыс. ч, что почти в 100 раз больше, чем
у лампочки накаливания, и в 5–10 раз больше, чем у люминесцентной лампы. Падение яркости
свечения светодиодов, например, через 50 000 ч, как правило, не превышает 25 %. Светодиод
является низковольтным электроприбором, это качество определяет безопасность работы со светодиодами в целом. Сверхминиатюрность и встроенное светораспределение (оптические линзы)
дополняют положительные качества светодиода [7–10].
За период февраль–ноябрь 2009 г. при научном сопровождении сотрудников сектора микроклонального размножения растений УО «Полесский государственный университет» (Пинск,
Республика Беларусь) и при содействии компании ООО «Ellis Amalgamated LLC» (Минск,
Республика Беларусь) был сконструирован опытный образец установки освещения на основе
светодиодов. Опытный образец созданной установки испытывался на предмет стимуляции
роста и развития растений семейства Ericaceae в биотехнологической лаборатории сектора микроклонального размножения растений УО «Полесский государственный университет» с ноября
2009 г. по апрель 2010 г. В настоящей статье приведены результаты испытаний созданного опытного образца светодиодной лампы и сравнительного анализа эффективности использования световых установок с разным типом ламп для стимуляции роста и развития растений Rhododendron
luteum (L.) Sweet in vivo.
Объекты и методы исследования. В качестве объекта исследования использовали семена
двух популяций рододендрона желтого Rhododendron luteum (L.) Sweet, собранные в декабре
2009 г. во время экспедиции в районы населенных пунктов Ветчин и Марковское Гомельской области. Семена высевали на верховой торф (ПРУП «Зеленоборское», Республика Беларусь) в емкости размером 15×20 см2 из расчета 0,5 г на емкость, и размещали под четырьмя разными типами ламп (оригинальные светодиодные; OSRAM L 36W/954 Lumilux de Lux Daylight; OSRAM L
36W/76 Natura; OSRAM L 36W/77 Fluora), различающимися по освещенности и спектральному
составу света (табл. 1).
Т а б л и ц а 1. Тип и характеристика задействованных в эксперименте ламп
Количество ламп
на полке, шт.
Освещенность,
лк
OSRAM L 36W/954 Lumilux de Lux Daylight
OSRAM L 36W/76 Natura
OSRAM L 36W/77 Fluora
Лампа светодиодная (оригинальная)
4
4
4
1
9000
6000
7000
4000
ьн
ая
Маркировка лампы
На
ци
он
ал
После посева семян емкости (лотки) укрывали пленкой во избежание пересыхания семян
и впоследствии всходов. Всходы культивировали при соблюдении следующих условий: фотопериод (свет/темнота, ч) – 16/8 ч, температура – + 25 ± 1 °С. Сеянцы однократно обрабатывали раствором фунгицида «Байтан». На протяжении испытаний за семенами и проростками осуществляли ежедневный уход – полив-опрыскивание, проветривание посевов на протяжении 1–2 ч.
Проводили фенологические наблюдения и фотодокументацию.
На 30, 40 и 50-е дни после посева семян анализировали изменчивость роста и развития растений по признакам «площадь листовой пластинки первого настоящего листа», «высота проростков», «количество настоящих листьев». Измерения первых двух признаков у проростков
проводили с помощью миллиметровой бумаги. Количество анализируемых проростков – не менее 30 в каждом варианте опыта. На 60-й день после посева провели учет взошедших растений
под каждым из исследуемых типов ламп и пикировку.
47
ус
и
кБ
ел
ар
Общий математический анализ данных проводили по стандартным методам вариационной
статистики [11] с использованием программы статистического анализа данных STATISTICA 6.0
[12]. Дисперсионный анализ данных проводили в программе AB-Stat, разработанной в Институте
генетики и цитологии НАН Беларуси.
Результаты и их обсуждение. Семена проклюнулись практически одновременно на 7–8-й
день после посева. Дружные всходы во всех исследуемых вариантах опыта появились на 12-й
день после посева. Согласно данным, полученным на 30, 40 и 50-е дни после посева семян, высота проростков популяции «Ветчин» под светодиодной лампой достоверно (при Р < 0,01) превышала высоту проростков под остальными типами ламп на 1,2–3,0 мм (16,4–56,6 %), 2,6–4,4 мм
(22,7–46,7 %) и 4,9–7,7 мм (30,2–56,9 %) соответственно (табл. 2). Высота проростков популяции «Марковское» под светодиодной лампой в большинстве случаев достоверно (при Р < 0,05
и Р < 0,01) превышала высоту проростков под остальными типами ламп на 1,3–1,5 мм (39,1–47,8 %),
3,0–3,4 мм (42,6–48,8 %) и 3,3–5,8 мм (24,4–51,8 %) соответственно по состоянию на 30, 40 и 50-е
дни после посева семян (табл. 2).
50
ем
ия
н
40
1
2
3
4
НСР05
НСР01
1
2
3
4
НСР05
НСР01
1
2
3
4
НСР05
НСР01
Площадь листовой пластинки
первого настоящего листа, мм 2
Высота проростков, мм
Популяция
«Ветчин»
Популяция
«Марковское»
5,87 ± 0,31
7,13 ± 0,22
5,30 ± 0,29
8,30 ± 0,38**
0,84
1,12
9,63 ± 0,42
11,27 ± 0,54
9,43 ± 0,36
13,83 ± 0,34**
1,14
1,51
16,30 ± 0,75
15,87 ± 0,42
13,53 ± 0,69
21,23 ± 0,99**
2,04
2,69
3,40 ± 0,12
3,20 ± 0,17
5,27 ± 0,24*
4,73 ± 0,18*
0,52
0,69
7,20 ± 0,41
6,90 ± 0,38
9,77 ± 0,34**
10,27 ± 0,58**
1,22
1,61
17,33 ± 0,94**
11,20 ± 0,61
13,67 ± 0,73
17,00 ± 0,80**
2,01
2,67
Количество настоящих листьев, шт.
Популяция
«Ветчин»
Популяция
«Марковское»
Популяция
«Ветчин»
Популяция
«Марковское»
5,93 ± 0,58**
5,85 ± 0,50**
3,90 ± 0,33
3,77 ± 0,41
1,31
1,74
8,77 ± 0,79
10,70 ± 0,65*
5,83 ± 0,43
8,60 ± 0,66
1,72
2,28
11,80 ± 0,85*
10,90 ± 0,76
10,07 ± 0,99
8,70 ± 0,79
2,41
3,19
4,03 ± 0,46
2,53 ± 0,30
4,48 ± 0,37*
3,43 ± 0,29
0,97
1,29
7,70 ± 0,54
7,30 ± 0,49
8,13 ± 0,63
8,93 ± 0,62*
1,60
2,12
12,93 ± 1,15**
8,97 ± 0,94
11,83 ± 0,74
9,57 ± 0,63
2,39
3,17
2,10 ± 0,10
1,97 ± 0,03
2,03 ± 0,06
1,93 ± 0,05
0,18
0,23
3,60 ± 0,14
3,57 ± 0,11
3,43 ± 0,15
3,57 ± 0,11
0,39
0,52
5,70 ± 0,17**
5,27 ± 0,18
5,73 ± 0,17**
5,00 ± 0,22
0,51
0,68
1,97 ± 0,08
2,00 ± 0,10
2,01 ± 0,07
1,97 ± 0,09
0,24
0,31
4,17 ± 0,16
4,03 ± 0,13
4,37 ± 0,11**
3,67 ± 0,12
0,39
0,52
5,67 ± 0,18
5,87 ± 0,20
6,10 ± 0,21
6,33 ± 0,24
0,55
0,73
ак
ад
30
Тип
лампы
ая
Возраст,
дни
ау
Т а б л и ц а 2. Изменчивость количественных признаков у растений Rhododendron luteum (L.) Sweet
ьн
П р и м е ч а н и е. Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка. Тип лампы: 1 –
OSRAM L 36W/954 Lumilux de Lux Daylight; 2 – OSRAM L 36W/76 Natura; 3 – OSRAM L 36W/77 Fluora; 4 – лампа
светодиодная. Полужирным шрифтом у отдельных вариантов опыта выделены максимальные, достоверные значения по анализируемым признакам.
ал
* Значимо при Р < 0,05.
** Значимо при Р < 0,01.
ци
он
Анализ изменчивости признака «количество настоящих листьев» в большинстве случаев достоверных различий между вариантами опыта не выявил. В зависимости от возраста проростков
наблюдали варьирование данного признака в пределах 1–2 настоящих листьев, 3–5 и 5–7 настоящих листьев на 30, 40 и 50-е дни после посева семян соответственно. Незначительное, достоверное при Р < 0,01, превышение показателей по данному признаку на 0,70–0,73 было отмечено для
проростков популяции «Ветчин» под лампами OSRAM L 36W/954 Lumilux de Lux Daylight
и OSRAM L 36W/77 Fluora на 50-й день после посева семян (табл. 2).
На
48
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Площадь листовой пластинки первого настоящего листа у проростков под светодиодной
лампой достоверно при Р < 0,05 превышала на 1,7 мм2 (22,3 %) таковую у проростков под лампами OSRAM L 36W/76 Natura только в случае с проростками популяции «Марковское» на 40-й
день после посева (табл. 2). В остальных случаях по данному признаку проростки, выросшие под
светодиодными лампами, чаще занимали средние позиции в зависимости от варианта опыта, достоверно (при Р < 0,05) превышая на 0,90–2,80 мм2 (35,6–47,5 %) худший показатель (чаще всего
у проростков под лампами OSRAM L 36W/77 Fluora) и достоверно (при Р < 0,05) на 1,00–3,36 мм2
(30,6–35,1 %) уступая лучшему показателю (как правило, у проростков под лампами OSRAM L
36W/76 Natura и OSRAM L 36W/954 Lumilux de Lux Daylight).
Возможное объяснение данного явления кроется в различиях по всхожести семян при разных условиях освещения (табл. 3). При оценке данного признака в двух исследуемых случаях
(для популяций «Ветчин» и «Марковское») установлено, что по всхожести проростки под светодиодными лампами в 1,3–1,9 и 1,7–2,5 раза соответственно превышали всхожесть проростков
под остальными типами ламп (табл. 3). Исчезновение (с возрастом проростков) достоверности
превышения показателей площади листовой пластинки первого настоящего листа в исследуемых популяциях Rhododendron luteum (L.) Sweet под светодиодной лампой возможно объяснить
различиями по площади питания на отдельное растение. Поскольку под остальными типами
ламп всхожесть семян была ниже, чем под светодиодными лампами, растения под светодиодными лампами получали питание с меньшей площади. Можно предположить, что при равной плотности посадки достоверность превышения показателей площади листовой пластинки первого
настоящего листа и количества настоящих листьев у растений при освещении светодиодами будет преобладать.
Т а б л и ц а 3. Количество взошедших растений Rhododendron luteum (L.) Sweet при освещении
разными типами ламп
Тип ламп
Популяция «Марковское»
398
315
280
534
385
280
413
690
ак
ад
OSRAM L 36W/954 Lumilux de Lux Daylight
OSRAM L 36W/76 Natura
OSRAM L 36W/77 Fluora
Лампа светодиодная (оригинальная)
Популяция «Ветчин»
На
ци
он
ал
ьн
ая
Трехфакторный дисперсионный анализ установил высокодостоверное (при Р < 0,01) влияние
возраста проростков и типа используемых для освещения ламп на изменчивость всех исследуемых признаков (табл. 4). При этом доля влияния возраста проростков составила 32,6–77,1 %
в зависимости от анализируемого признака, а доля влияния типа ламп – 0,2–5,6 %. Установлено
высокодостоверное (при Р < 0,01) влияние генотипа проростков на изменчивость признаков «высота проростков» и «количество настоящих листьев». Доля влияния фактора на изменчивость
указанных признаков составила 5,6 и 0,2 % соответственно (табл. 4). Комбинации исследуемых
факторов, за единственным исключением (возраст×генотип), оказывали достоверное (в большинстве случаев при Р < 0,01) влияние на изменчивость признака «высота растений». Доля влияния
при этом не превышала 2,8 % (для комбинации возраст×тип ламп). Комбинации факторов
возраст×генотип и возраст×генотип×тип ламп оказывали высокодостоверное (при Р < 0,01) влияние на изменчивость признака «количество настоящих листьев». В то время как достоверного
влияния совокупности всех исследуемых факторов на изменчивость признака «площадь листовой пластинки первого настоящего листа» выявить не удалось (табл. 4).
Заключение. Установлено, что освещение семян двух исследуемых популяций Rhododendron
luteum (�����������������������������������������������������������������������������������
L����������������������������������������������������������������������������������
.) �������������������������������������������������������������������������������
Sweet��������������������������������������������������������������������������
(популяции «Ветчин» и «Марковское») созданной установкой на основе светодиодов приводит к повышению всхожести семян в 1,3–1,9 и 1,7–2,5 раза соответственно по сравнению со всхожестью семян под остальными исследуемыми типами люминесцентных ламп.
Установлено, что высота проростков популяции «Ветчин» под светодиодной лампой достоверно (при Р < 0,01) превышала высоту проростков под остальными типами ламп на 1,2–3,0 мм
(16,4–56,6 %), 2,6–4,4 мм (22,7–46,7 %) и 4,9–7,7 мм (30,2–56,9 %) соответственно на 30, 40 и 50-е
49
На
ая
2
3
6
3
6
29
667
Фактор В (тип ламп)
АЧВ
БЧВ
АЧБЧВ
Повторности
Случайные отклонения
8,135
12,044
19,640*
199,546**
105,646**
417,490**
24,274
1,563
0,527
61,938**
12,901
15,714
7,479
163,147**
* Значимо при Р < 0,05.
** Значимо при Р < 0,01.
ар
18,818
1,121
0,798
0,158
0,122
0,222
0,570
1,082
77,108
–
ус
и
Доля влияния, %
ел
0,603
0,826
2,841**
1,127
0,436
1,583*
6,088**
23,112**
823,504**
2,971
Средний квадрат
Количество настоящих листьев
кБ
ау
56,448
2,989
0,294
3,211
2,438
1,272
0,573
64,647**
0,222
33,800
32,553
–
Доля влияния, %
43,662*
2481,179**
21,202
Средний квадрат
Площадь листовой пластинки первого
настоящего листа
ем
ия
н
2,678
2,836
5,603
0,058
4,132
58,149
–
Доля влияния, %
ак
ад
6,518
963,735**
6498,735**
31,088
Средний квадрат
Высота проростков
П р и м е ч а н и е. Полужирным шрифтом выделены значимые средние квадраты.
1
АЧБ
2
719
Фактор Б (генотип)
Фактор А (возраст)
Общее
Степени свободы
ьн
Источник варьирования
ал
Т а б л и ц а 4. Трехфакторный дисперсионный анализ изменчивости количественных признаков у растений Rhododendron luteum (L.) Sweet
ци
он
50
ус
и
Литература
кБ
ел
ар
дни после посева семян. Высота проростков популяции «Марковское» под светодиодной лампой
в большинстве случаев достоверно (при Р < 0,05 и Р < 0,01) превышала высоту проростков под
остальными типами ламп на 1,3–1,5 мм (39,1–47,8 %), 3,0–3,4 мм (42,6–48,8 %) и 3,3–5,8 мм (24,4–
51,8 %) соответственно.
Трехфакторный дисперсионный анализ выявил достоверное (за единственным исключением)
влияние всех исследуемых факторов на изменчивость анализируемых признаков. При этом доля
влияния возраста проростков в зависимости от анализируемого признака составила 32,6–77,1 %,
доля влияния генотипа – 1,1–4,1 %, а доля влияния типа ламп – 0,2–5,6 %.
Результаты исследований свидетельствуют о достоверном ускорении роста и развития растений Rhododendron luteum (L.) Sweet, что проявлялось в повышении всхожести семян и высоты
проростков при освещении всходов опытным образцом оригинальной установки освещения на
основе светодиодов.
ем
ия
н
ау
1. А л е к с а н д р о в а М. С. Рододендроны. М., 2001.
2. К о н д р а т о в и ч Р. Я. Рододендроны в Латвийской ССР. Рига, 1981.
3. З а р у б е н к о А. У. Культура рододендронов на Украине. Киев, 2006.
4. П а ш к о в Г. П. Красная книга Республики Беларусь: Растения. Мн., 2005.
5. Х е й ф и ц Л. А., Д а ш у н и н В. М. Душистые вещества и другие продукты для парфюмерии. М., 1994.
6. К л е ш н и н А. Ф. Растение и свет. Теория и практика светокультуры растений. М., 1954.
7. Ю н о в и ч А. Э. // Экология и жизнь. 2003а. Т. 33, № 4. С. 62–65.
8. А л ф е р о в В. Ю., М и т р о х и н Ю. В. // Светотехника. 2009. № 5. С. 9–12.
9. Б и л у н д Л. // Светотехника. 2009. № 6. С. 64–66.
10. Ю н о в и ч А. Э. // Светотехника. 2003б. № 3. С. 2–6.
11. Д о с п е х о в Б. А. Методика полевого опыта. М., 1985.
12. Б о р о в и к о в В. П. STATISTICA: Искусство анализа данных на компьютере. СПб., 2001.
O. A. KUDRYASHOVA, M. P. VODCHIC, E. P. GLEB, E. S. GUK, A. A. VOLOTOVICH
ак
ад
STIMULATION OF GROWTH AND DEVELOPMENT OF RHODODENDRON DECIDUOUS PLANTS
IN VIVO USING OF EMPLACEMENT OF ILLUMINATION ON THE BASIS OF LIGHT-EMITTING DIODES
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
The results of trials of the created pre-production model of a light-emitting diode lamp as well as comparative analysis of
efficiency of use of light installations with different type of lamps for in vivo germination, growth and development stimulation of two investigated populations of Rhododendron luteum (L.) sweet are presented. Authentic influence of used lightemitting diode lamp type on germination increase is established. Authentic (in most cases, at Р < 0.01) increase in height
of sprouts is revealed at use of the created light-emitting diode lamp. The three-factorial dispersive analysis has established authentic (in most cases, at Р < 0.01) influence of lamps type, of age and genotype of sprouts on variability of three analyzed traits.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
И. А. ДРЕМУК, Н. В. ШАЛЫГО
ел
УДК 58.02+577.352
кБ
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН
В ПРОРОСТКАХ ЯЧМЕНЯ (HORDEUM VULGARE) ПРИ СОВМЕСТНОМ ДЕЙСТВИИ
НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО И ВОДНОГО СТРЕССА
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск, e-mail: irinadremuk@yandex.ru
ау
(Поступила в редакцию 25.11.2010)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Растения в природе часто подвергаются комплексному воздействию различных
стрессоров. Такими стрессорами являются низкие температуры и избыточное увлажнение почвы, что наблюдается ранней весной. Совместное действие этих факторов окружающей среды,
как правило, приводит к значительной потере урожайности сельскохозяйственных культур.
При избыточном увлажнении, когда корни оказываются под водой, а листья остаются на воздухе, наблюдается гипоксия [1]. В таких условиях в листьях растений увеличивается содержание
активных форм кислорода (АФК), генерация которых происходит преимущественно в митохондриях [2], вследствие чего могут повреждаться клеточные структуры и активироваться реакции
перекисного окисления липидов (ПОЛ) [3]. При низкотемпературном стрессе АФК также выступают факторами повреждения мембранных структур, что приводит к изменению проницаемости клеточных мембран и активации процессов ПОЛ [4, 5].
Следует отметить, что на сегодняшний день работы, в которых исследовалось совместное
действие двух рассмотренных выше стрессовых факторов, отсутствуют. Цель настоящего исследования – изучение генерации АФК, изменения содержания продуктов ПОЛ и барьерных свойств
мембран в условиях совместного действия низкотемпературного и водного стресса.
Объекты и методы исследования. В качестве объекта исследования использовали зеленые
проростки ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта Гонар, выращенные при температуре + 23 °C
( ± 2 °С) в режиме 14 ч света (интенсивность 150 мкмоль квантов/м2·с) и 10 ч темноты. Для моделирования совместного действия низкотемпературного стресса и избыточного увлажнения
5-дневные растения ячменя на 3 сут (стрессовый период) помещали в холодильную камеру
с температурой + 4 °С и указанным выше фотопериодом и заливали водой до середины колеоптиля, после чего растения возвращали на 3 сут в нормальные условия выращивания (постстрессовый период). Навески листьев, срезанных выше колеоптиля, брали для исследования перед
началом действия стрессора, через 24 и 72 ч после начала действия стрессового фактора, а также
через 72 ч в постстрессовый период. Основным контролем служили растения ячменя, выращенные в нормальных условиях. В качестве дополнительных контролей использовали растения, находившиеся в условиях низкотемпературного стресса (+ 4 °С) с нормальным водоснабжением,
а также растения, находившиеся в условиях избыточного увлажнения при температуре + 23 °C.
Определение общего уровня АФК и содержания H2O2. Навески листьев по 0,5 г растирали
в фарфоровой ступке в жидком азоте до порошка, затем приливали 2 мл 0,2 н НClO4 и растирали
до гомогената. Гомогенат количественно переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 мин при 7000 g��������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
. Для нейтрализации кислотного значения рН к 500 мкл супернатанта добавляли 37–38 мкл 4 М КОН и центрифугировали 5 мин при 13 000 g. Полученный
супернатант использовали для определения общего уровня АФК и H2O2.
На
52
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Для определения АФК к 950 мкл 0,15 М Трис-НСl буфера (рН 7,5) последовательно добавляли
25 мкл нейтрализованного супернатанта и 25 мкл 0,5 мМ дихлорфлуоресцеин-диацетата.
Контролем служила проба, состоящая из 975 мкл 0,15 М Трис-НСl буфера и 25 мкл 0,5 мМ
дихлорфлуоресцеин-диацетата. Пробы инкубировали 20 мин в термостате при 37 °С, после чего
регистрировали спектры флуоресценции (λвозб = 496 нм, λрегист = 524 нм), используя спектрофлуориметр (�������������������������������������������������������������������������������
Solar��������������������������������������������������������������������������
, Беларусь). Содержание уровня АФК определяли по количеству образовавшегося дихлорфлуоресцеина, концентрацию которого рассчитывали по калибровочной кривой [6 ].
Определение содержания пероксида водорода в экстрактах листьев проводили с помощью
флуоресцентного метода [7], в основе которого лежит реакция окисления скополетина в присутствии H2O2, катализируемая пероксидазой хрена. К 930 мкл 0,1 М Трис-������������������������
HCl���������������������
буфера рН 7,0 последовательно добавляли 10 мкл раствора пероксидазы хрена (200 ед. на 1 мл) и 10 мкл 0,1 мМ раствора скополетина. Реакцию запускали добавлением 50 мкл нейтрализованного супернатанта.
Контролем служила проба, состоящая из 950 мкл 0,1 М Трис-HCl буфера и 50 мкл супернатанта.
Вторым контролем служила проба, состоящая из 980 мкл 0,1 М Трис-HCl буфера, 10 мкл раствора
пероксидазы хрена (5 ед. на 10 мкл) и 10 мкл 0,1 мМ раствора скополетина. Определение содержания H2O2 проводили регистрируя флуоресценцию скополетина (λвозб = 370 нм, λрегистр = 464 нм)
на спектрофлуориметре Solar (Беларусь). Концентрацию пероксида водорода рассчитывали по
калибровочной кривой, построенной с использованием H2O2 фирмы Sigma (Германия).
Количественное определение продуктов ПОЛ. К свежему растительному материалу (навеска
0,5 г) добавляли 4 мл 0,25 %-ного раствора тиобарбитуровой кислоты в 10 %-ной трихлоруксусной кислоте и растирали до гомогената. Гомогенат переносили в центрифужные пробирки и уровень маркировали. Пробы инкубировали в течение 30 мин в кипящей водяной бане, затем охлаждали в проточной воде и доводили до метки дистиллированной водой, после чего центрифугировали 15 мин при 8000 g. Супернатант спектрофотометрировали при 530 нм, используя
спектрофотометр Uvikon������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������
-931 (Германия). Количество ТБК-продуктов определяли используя коэффициент молярной экстинкции ε = 1,55⋅105 М–1 ·см–1[8 ].
Определение проницаемости клеточных мембран для электролитов и нуклеотидов проводили, как описано в работе [9]. Для определения выхода электролитов брали навески листьев
ячменя по 0,5 г. Листья тщательно промывали дистиллированной водой, затем помещали в стеклянные пробирки. Пробы заливали дистиллированной водой в соотношении 15 мл воды на 0,5 г
сырого веса листьев и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, затем листья
удаляли из воды. Удельную электропроводность полученных растворов определяли с помощью
кондуктометра HI9932 (HANNA instruments, Германия).
При определении проницаемости мембран для свободных нуклеотидов использовали навески листьев весом 0,5 г. Листья предварительно многократно промывали дистиллированной водой, помещали в стеклянные пробирки, затем заливали 10 мл дистиллированной воды, после
чего инкубировали в течение 2 ч при температуре 20 °С [10]. Выход свободных нуклеотидов
оценивали по поглощению инкубационной среды при 260 нм на спектрофотометре Uvikon-931.
В статье представлены данные опытов, проведенных в 3-кратной биологической повторности. Статистическую обработку данных проводили в программе SigmaPlot���������������������
������������������������������
10.0 при доверительной вероятности 0,95.
Результаты и их обсуждение. Анализ совместного действия низкотемпературного и водного стресса на рост проростков ячменя показал, что за 3 дня действия двух стрессовых факторов
опытные растения отставали в росте от контрольных растений на 45 ± 5 %. Растения, находившиеся в условиях только избыточного увлажнения или низкой температуры, были ниже контрольных растений на 4 ± 1 и 43 ± 5 % соответственно. После переноса их в нормальные условия
выращивания (постстрессовый период) рост опытных растений ускорялся. При этом через 3 сут
постстрессового периода растения, подвергнутые избыточному увлажнению, достигали значения контрольных растений. Растения, ранее находившиеся в условиях совместного действия
низкой температуры и избыточного увлажнения, отставали в росте от контрольных растений на
15,1 ± 2,7 %, а растения, выращенные только при низкой температуре, – на 14,5 ± 3,5 %. Полу­
ченные данные свидетельствуют о том, что совместное действие низкотемпературного и водно53
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
го стресса приводит к торможению роста проростков ячменя, что обусловлено не столько последствием избыточного увлажнения, сколько влиянием низкой температуры.
Содержание общего уровня АФК и пероксида водорода в листьях ячменя увеличивалось как
в условиях совместного действия низкотемпературного и водного стресса, так и при их раздельном
действии. Однако при сочетанном действии низкотемпературного и водного стрессов процесс накопления АФК и H2O2 проходил более интенсивно (рис. 1). Так, уже через 1 сут совместного действия стрессовых факторов общий уровень АФК в проростках ячменя на 52 % превышал их
уровень в растениях, выращенных в нормальных условиях, в то время как в растениях, находившихся в условиях избыточного увлажнения или выращенных при низкой температуре, уровень
АФК был выше контроля только на 28 и 36 % соответственно. С ростом продолжительности
стрессового воздействия (низкая температура + избыточное увлажнение) содержание АФК возрастало и через 3 сут уровень АФК в таких растениях увеличивался в 2,7 раза по отношению
к растениям, выращенным в нормальных условиях. В условиях избыточного увлажнения уровень АФК в проростках ячменя был выше контроля в 1,6 раза, а в растениях, выращенных при
низкотемпературном стрессе, – в 2,3 раза. После снятия стрессовых воздействий содержание
АФК во всех вариантах без исключения снижалось практически до уровня контроля. Кривые накопления H2O2 в указанных выше вариантах практически повторяли ход кривых содержания
общего уровня АФК (рис. 1, А, Б).
Известно, что накопление АФК в растительной клетке вызывает усиление ПОЛ. До начала
действия стрессовых факторов в опытных и контрольных вариантах уровень продуктов ПОЛ
(ТБК-продуктов) был одинаковым (рис. 2). В стрессовых условиях количество продуктов ПОЛ
увеличивалось в одинаковой степени как при совместном действии стрессоров, так и при их раздельном влиянии. Однако через 3 сут картина изменилась: при совместном действии низкотемпературного и водного стресса уровень ТБК-продуктов увеличился в 1,8 раз по сравнению с растениями,
выращенными в нормальных условиях. В варианте с использованием только низкотемпературного
стресса количество продуктов ПОЛ в растениях было выше контроля в 1,6 раза, в то время как
при избыточном увлажнении содержание ТБК-продуктов превышало контроль только в 1,4 раза.
После окончания действия стрессовых факторов уровень продуктов ПОЛ в растениях всех вариантов приближался к уровню контроля.
У проростков ячменя, подвергавшихся совместному действию низкотемпературного и водного стрессов, выход электролитов из листьев через 1 сут превысил контроль в 1,6 раза, тогда
как увеличение выхода электролитов при низкотемпературном стрессе и избыточном увлажнении по отдельности составило 1,5 и 1,2 раза соответственно (табл.1). При более длительном действии стрессовых факторов (3 сут) выход электролитов практически не изменялся по сравнению
Рис. 1. Содержание АФК (А) и H2O2 (Б) в проростках ячменя, находившихся 3 сут в условиях избыточного увлажнения (2), низкотемпературного стресса (3), совместного действия этих факторов (4), а также в контрольных растениях
(1). Вертикальная штриховая линия указывает на окончание действия стрессового фактора и начало постстрессового
периода. P < 0,05
На
54
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 2. Содержание продуктов ПОЛ в проростках ячменя, находившихся 3 сут в условиях избыточного увлажнения
(2), низкотемпературного стресса (3), совместного действия этих факторов (4), а также в контрольных растениях (1).
Вертикальная штриховая линия указывает на окончание действия стрессового фактора и начало постстрессового
периода. P < 0,05
со значениями, зарегистрированными через 1 сут. После снятия стрессовых воздействий выход
электролитов из листьев снижался до исходного уровня.
Т а б л и ц а 1. Выход электролитов из листьев ячменя в условиях действия
низкотемпературного и водного стресса
Удельная электропроводность, µS/см
Вариант
Через 1 сут
Через 3 сут
+ 3 сут
5,20 ± 0,53
5,18 ± 0,19
ак
ад
Исходный уровень
К
5,27 ± 0,27
5,37 ± 0,29
ИУ
5,36 ± 0,32
6,43 ± 0,30
6,18 ± 0,52
5,23 ± 0,12
5,35 ± 0,19
7,90 ± 0,45
6,96 ± 0,28
5,35 ± 0,32
5,33 ± 0,29
8,16 ± 0,17
7,41 ± 0,15
5,40 ± 0,47
НТ
НТ+ИУ
ьн
ая
П р и м е ч а н и е . К – контроль, ИУ – избыточное увлажнение, НТ – низкая
температура, НТ+ ИУ – низкая температура + избыточное увлажнение; 5-дневные проростки ячменя на 3 сут (стрессовый период) помещали в холодильную
камеру с температурой + 4 °С и заливали водой, после чего растения возвращали на 3 сут в нормальные условия выращивания (обозначено как + 3 сут).
P < 0,05. То же для табл. 2
Проницаемость клеточных мембран для свободных нуклеотидов в листьях ячменя в течение
3 сут действия стрессового фактора практически не менялась во всех вариантах (табл. 2).
ал
Т а б л и ц а 2 . Выход свободных нуклеотидов из листьев ячменя
в условиях действия низкотемпературного и водного стрессов
На
ци
он
Вариант
Оптическая плотность, отн. ед.
Исходный уровень
Через 1 сут
Через 3 сут
+ 3 сут
К
0,027 ± 0,005
0,036 ± 0,005
0,031 ± 0,006
0,032 ± 0,009
ИУ
0,035 ± 0,004
0,030 ± 0,004
0,031 ± 0,003
0,028 ± 0,003
НТ
0,030 ± 0,005
0,038 ± 0,006
0,034 ± 0,005
0,031 ± 0,003
НТ+ИУ
0,028 ± 0,003
0,036 ± 0,010
0,035 ± 0,006
0,030 ± 0,003
55
ус
и
кБ
ел
ар
Заключение. Показано, что совместное действие низкотемпературного и водного стресса
приводит к торможению роста проростков ячменя, накоплению в них активных форм кислорода
и интенсификации процессов перекисного окисления липидов, что обусловлено преимущественно влиянием низкой температуры. При совместном действии низкотемпературного и водного
стресса, а также при их раздельном воздействии (особенно низкотемпературного стресса) отмечено увеличение выхода электролитов из ткани растений, что указывает на нарушение барьерных свойств клеточных мембран. После снятия действия стрессоров выход электролитов из
листьев ячменя снижался и достигал контрольных значений. При этом проницаемость мембран
для свободных нуклеотидов практически не изменялась. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения в клеточных мембранах, вызванные низкой температурой, избыточным
увлажнением и их совместным действием, имеют обратимый характер.
Литература
ем
ия
н
ау
1. В а р т а п е т я н Б. Б. // Вестн. РФФИ. 2007. № 5. С. 28–59.
2. S a i r a m R. K., K u m u t h a D., E z h i l m a t h i K. et al. // Biologia Plantarum. 2008. Vol. 52. P. 401–412.
3. F o y e r C. H., D e s c o u r v i e r e s P., K u n e r t K. J. // Plant Cell Environ. 1994. Vol. 17. P. 507–523.
4. В о й н и к о в В. К. Температурный стресс и митохондрии растений. Новосибирск, 1987.
5. К о л у п а е в Ю. Е., К а р п е ц Ю. В. // Физиология и биохимия культурных растений. 2009. Т. 41, № 2.
C. 95–108.
6. К о з е л Н. В., Ш а л ы г о Н. В. // Физиол. растен. 2009. Т. 56, № 3. С. 351.
7. M o h a n t y J. G., J a f f e J. S., S c h u l m a n E. S. et al. // J. Immunol. Methods. 1997. Vol. 202, N 2. P. 133–141.
8. Р о г о ж и н В. В., К у р и л ю к Т. Т. // Биохимия. 1996. № 8. С. 1432–439.
9. К о ж у ш к о Н. Н. // Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды / Под ред.
Г. В. Удовенко. Л., 1976. С. 33.
10. К о н е в С. В., М а ж у л ь В. М. // Межклеточные контакты. Мн., 1977. С. 63.
I. A. DREMUK, N. V. SHALYGO
ак
ад
OXIDATIVE PROCESSES AND CELL MEMBRANE PERMEABILITY IN BARLEY (Hordeum vulgare)
SEEDLINGS UNDER COMBINED ACTION OF LOW TEMPERATURE AND FLOODING
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
Combined action of low temperature and flooding was shown to inhibit plant growth as well as to increase ROS production and membrane lipid peroxidation in green barley seedlings, all effects being mainly determined by low temperature influence. The intensification of electrolyte output under stress conditions in data was observed suggesting the disturbance
of membrane barrier properties. The results obtained also indicate the reversibility of changes in cell membranes caused
by low temperature, flooding and combined action of both low temperature and flooding.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 579.2+579.6
ел
И. С. ВАЖИНСКАЯ, В. Н. КУПЦОВ, Э. И. КОЛОМИЕЦ, Г. И. НОВИК, А. В. КАНТЕРОВА
кБ
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КАК ЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ХРАНЕНИЯ
ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, e-mail: vazhynskayaira@mail.ru
ау
(Поступила в редакцию 04.04.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Расширение экономических, торговых связей между государствами, глобальное
потепление климата существенно повышают возможность распространения болезней растений,
которые наносят огромный экономический ущерб, поражая различные сорта злаковых, бобовых,
плодовых, эфирно-масличных, технических и овощных культур. Концепция интегрированного
управления фитосанитарным состоянием агроэкосистем основывается на сохранении и рациональном использовании генетических ресурсов как полезных микроорганизмов, так и вредных
в целях создания искусственных инфекционных фонов, необходимых для селекции устойчивых
сортов, разработке биологических и химических средств защиты растений. Для поддержания
генетических ресурсов и генетического разнообразия полезных и вредных организмов созданы
коллекции генофондов, в которых маточные культуры поддерживаются в виде живого материала, а при длительном хранении – в условиях криоконсервации.
Среди экономически значимых для сельского хозяйства Беларуси фитопатогенов следует
особо отметить грибы родов Fusarium, Rhizoctonia и Colletotrichum.
Грибы рода Fusarium широко распространены в природе и являются возбудителями заболеваний более 200 видов культурных растений, вызывая их увядание и гибель [1]. Фузариоз колоса
и зерна озимой пшеницы и ржи представляет серьезную проблему во многих регионах ее возделывания [2–4]. Фузариозная корневая гниль на территории всей Европы представляет опасность
для неустойчивых сортов растений и наносит значительный ущерб посевам, а иногда приводит
к их гибели. Вспышки фузариоза колоса и корневых гнилей отмечались постоянно в течение
многих десятилетий в разных странах мира, однако в последние годы эпифитотии фузариоза
значительно участились [5].
Грибы рода Rhizoctonia являются источником инфекции 250 видов растений, включая промышленно ценные [6, 7]. Представители этих фитопатогенов вызывают корневую гниль рассады, рак растущих растений и почернение клубней картофеля [8]. Грибы рода Rhizoctonia вызвают заболевания таких культур, как зерновые злаки, капуста, салат, сахарная свекла, фасоль, соя,
перец, картофель, нанося большой урон сельскому хозяйству.
Очень большую опасность для производителей люпина во многих странах мира, включая
Чили, ЮАР, Австралию, Польшу, Германию, Россию, Беларусь, представляет гриб Colletotrichum
lupini – возбудитель антракноза [9–16]. Вследствие быстрого развития антракноз в считанные
дни способен повредить посевы люпина на огромных площадях. Так, во время эпифитотии антракноза в Беларуси в 1997 г. значительная часть посевов желтого люпина в республике была
полностью уничтожена [17].
Для хранения грибов рода Fusarium и Rhizoctonia рекомендуется использование твердых субстратов, главным образом почвы. Субстрат-наполнитель фасуют в специальные емкости (пробирки, ампулы или флаконы), инокуляцию субстрата проводят густой суспензией культуры грибов, емкости герметично закрывают и подготовленные образцы закладывают на консервацию
57
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
в заданных условиях. Метод хранения в почве особенно рекомендуется для грибов рода Fusarium
[18]. На агаровых средах грибы этого рода быстро образуют мутанты, что обычно не происходит
при хранении в почве. Для хранения грибов рода Colletotrichum, как правило, применяют метод
субкультивирования на сусло-агаре или на мальт-агаре.
Для мицелиальных грибов, как и для микроорганизмов различных таксономических групп,
успешно применяется длительная консервация при температуре –70 °С. Техника метода проста
и не требует частого вмешательства в процесс хранения. Выживаемость клеток при замораживании и последующем оттаивании существенно зависит от состава суспензионной среды [19–21].
Такой метод хранения уже активно используется в Белорусской коллекции микроорганизмов
(БКМ).
Использование чистых культур грибов в качестве тест-объектов в селекционной работе по
созданию устойчивых к болезням сортов растений и разработке биопестицидов невозможно без
сохранения их фитопатогенных свойств на протяжении длительного периода времени. В БКМ
проводится работа по подбору условий долгосрочной консервации фитопатогенных грибов для
определения оптимального способа хранения.
Цель настоящей работы – проверка результатов выживаемости грибов, а также сохранения
их фитопатогенных свойств после криоконсервации при –70 °С.
Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили штаммы фитопатогенных грибов Fusarium solani БИМ F-347 (сумчатая стадия – Nectria haematococca), Rhizoctonia
solani БИМ F-362 (совершенная стадия – Thanatephorus cucumeris), Colletotrichum lupini БИМ
F-382, хранящиеся в БКМ Института микробиологии НАН Беларуси. Изучение фитопатогенных
свойств грибов проводили на культурах озимой ржи (сорт Калинка) и узколистного люпина (сорт
Вясковы), любезно предоставленных сотрудниками Института генетики и цитологии НАН
Беларуси и НПЦ НАН Беларуси по земледелию.
Хранение культур грибов методом криоконсервации осуществляли при – 70 °С в течение
2 лет. В качестве протекторной среды использовалось обезжиренное молоко (10 %). Культуры
после хранения размораживали при + 37 °С на водяной бане, не допуская их перегрева.
Выращивали при + 25 °С на картофельно-декстрозном агаре в чашках Петри в течение 14 сут.
Скорость радиального роста грибов (Kr, мм/сут) определяли по формуле Kr = (a–b)/n, где
a – радиус колонии в конце периода линейного роста, мм; b – радиус колонии в начале периода
линейного роста, мм; n – продолжительность линейного роста в сутках [22].
Величину ростового коэффициента (РК) рассчитывали по формуле:
РК = d × h × g/t, где d – диаметр колонии, мм; h – высота колонии, мм; g – плотность колонии
в баллах (1 – редкая, 2 – средняя, 3 – плотная); t – продолжительность роста колонии в сутках [23].
Для характеристики фенотипических свойств использовали общепринятые методы [24]. Для
микроскопирования мицелия использовали микроскопы марки Люмам Р 8 и NIKON.
Выживаемость штаммов после криоконсервации определяли по Луста [25].
Определение патогенности штаммов F. solani БИМ F-347 и R. solani БИМ F-362 проводили по
Khandaker [26]. Для получения посевного материала грибы выращивали на влажном зерне ржи,
помещенном во флаконы и стерилизованном в автоклаве в течение 1 ч при 121 °С последовательно 3 раза через день [27]. Каждый флакон был засеян инокулятом в виде 15 дисков с мицелием
размером 5 мм в диаметре, вырезанных из 3-дневной культуры, выращенной на картофельнодекстрозном агаре. Далее флаконы помещали в термостат при + 25 °С и культивировали мицелий в течение трех недель. После инкубации покрытые мицелием зерна ржи были высушены на
воздухе на стерильной бумаге и хранились при + 4 °С до момента их использования. Патогенность
грибов по отношению к росткам ржи тестировалась при выращивании растений в почве с внесенным тест-инокулюмом. Почва, используемая в опыте, просеивалась через сито с отверстиями
величиной 2 мм и стерилизовалась паром. Для инокуляции почвы грибами 10 г инокулюма смешивали с 1 кг почвы и выдерживали во влажном состоянии в течение трех дней. Перед посадкой
семян почву, зараженную грибами, помещали в полиэтиленовые пакеты (10 × 16 см). Контролем
служила почва в пакетах, смешанная со стерилизованным и высушенным на воздухе зерном
ржи, не зараженным грибами. Для каждого опыта использовали по три пакета, в каждый пакет
На
58
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
помещали от пяти до десяти зерен в зависимости от их величины. Для посева были отобраны
семена с 90–100 %-ной всхожестью. Через тринадцать дней после помещения семян в пакеты
растения были извлечены с корнем, промыты водопроводной водой и тщательно проверены на
наличие заболевания по шкале от 0 (отсутствие симптомов) до 4 (более чем 75 % тканей поражены, либо растение погибло) баллов [28].
Определение степени патогенности штамма C. lupini БИМ F�����������������������������
������������������������������
-382 проводили по разработанной нами методике. Гриб выращивали в чашках Петри на картофельно-декстрозном агаре
(pH 6,0) в течение 2 недель при 23 ± 2ºС. В выросшую культуру добавляли 20 мл стерильной
воды и стерильной петлей смывали споры. Полученную споровую суспензию доводили стерильной водой до концентрации 1 × 106 спор на 1 мл. Титр спор гриба определяли с помощью камеры
Горяева по формуле:
Т = А ⋅ 250 000, где Т – количество спор гриба в 1 см3; А – среднее количество спор в одном
большом квадрате камеры.
Семена люпина, подвергнутые поверхностной стерилизации 70%-ным спиртом, погружали
на 2 мин в приготовленный инокулюм гриба C. lupini.
Для проращивания инфицированных семян использовали чашки SPB (Square Plastic Bioassay
Dish) с фильтровальной бумагой. Инкубацию проводили при 23 ± 2 °C��������������������������
в течение 5 сут, регулярно добавляя водопроводную воду для увлажнения фильтровальной бумаги. Степень поражения
проростков антракнозом оценивали по 9-балльной шкале, где 1 балл – поражение отсутствует;
3 – на проростке коричневые в виде штрихов некрозы; 5 – на проростке: а) язва без разрыва,
охватывающая до ½ окружности проростка, б) на семядоле маслянистое пятно, впоследствии
оно приобретает коричневую окраску, в) увядание развивающихся настоящих листьев; 7 – на
проростке язва с разрывом, охватывающая 2/3 окружности проростка; 9 – а) язва охватывает всю
окружность проростка, б) мацерация проростка, в) гибель проростка.
Результаты и их обсуждение. C целью определения сохранности штаммов грибов F. solani
БИМ F-347, R. solani БИМ F-362, C. lupini БИМ F-382 после длительного хранения в течение двух
лет при –70 °С были изучены их физиолого-морфологические признаки (таблица).
ак
ад
Физиолого-морфологические признаки грибов F. solani, R. solani и C. lupini, выращенных
на картофельно-декстрозном агаре после криоконсервации
Характеристика свойств через 14 сут роста
ьн
ая
Выживаемость, %
Ростовой коэффициент
Скорость радиального роста, мм/сут
Цвет колоний
Цвет реверзума
Ширина скелетных гиф, мкм
Ширина воздушных гиф, мкм
Начало спорообразования
Штаммы грибов
F. solani БИМ F-347
R. solani БИМ F-362
C. lupini БИМ F-382
98–99
150–200
97–99
130–180
96–99
80–100
Темно-розовый
Темно-бордовый
2,3–2,5
0,3–0, 5
Через 5–7 сут
Бледно-желтый
Не окрашен
2,2–3,5
0,3–0, 4
Через 5–8 сут
Серый
Темно-серый
2,0–2,5
0,3–0,5
Через 5–7 сут
6–8
6–9
7–9
На
ци
он
ал
Гифы субстратного мицелия F. solani БИМ ����������������������������������������������
F���������������������������������������������
-347 имели розоватую окраску, воздушный и поверхностный мицелий был бесцветным. Независимо от вида гиф мицелий R. solani БИМ F-362
и C. lupini БИМ ��������������������������������������������������������������������������
F�������������������������������������������������������������������������
-382 был практически бесцветным, однако в большой массе мицелий имел желтоватый или сероватый оттенок.
Септы мицелия всех штаммов были ярко выражены. Расстояние между септами существенно различалось в зависимости от вида гифы и штамма, но не от способа хранения, и в среднем
составляло 10–35 мкм. Культура R. solani в большом количестве продуцировала оидии, что подтверждает ее способность к очень активному размножению с помощью вегететивных клеток.
Радиальная скорость роста мицелия исследованных штаммов после хранения в замороженном состоянии составляла в среднем 6–9 мм/сут. Мицелий культур, поддерживаемых методом
периодических пересевов, имел радиальную скорость роста в среднем 9–11 мм/сут. Однако после
59
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 1. Проростки озимой ржи, пораженные грибом F. solani БИМ F-347,восстановленным после криоконсервации
(1), и здоровые без внесения инфекции (2)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
второго пассажа радиальная скорость роста мицелия грибов, хранившихся разными способами,
была практически одинакова.
Для подтверждения способности инфицировать растения злаковых грибами F. solani БИМ
F-347 и R. solani БИМ F-362 был проведен лабораторный опыт по определению фитопатогенных
свойств этих культур по отношению ко ржи (Secale cereale). После появления всходов ржи все
образцы были тщательно проверены на наличие поражения ростков грибами. В результате было
установлено, что штаммы F. solani БИМ F-347 и R. solani БИМ F-362 сохранили присущие им
фитопатогенные свойства, поражение растений было полным. По стандартной оценке степень
поражения растений соответствует 4 баллам, т. е. самой высокой. На рис. 1 наглядно видна разF��������������������������
-347, и контрольным образница между проростком ржи, пораженным грибом F. solani БИМ ���������������������������
цом, который выращивали в стерильной почве без присутствия фитопатогена. Стебель опытного
растения полностью почернел, что привело к гибели растения. Аналогичный результат получен
при проверке патогенности штамма R. solani БИМ F-362 (рис. 2). Следует отметить, что гибель
Рис. 2. Проростки озимой ржи, пораженные грибом R. solani БИМ F-362, восстановленным после криоконсервации
(1), и здоровые без внесения инфекции (2)
На
60
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 3. Проростки узколистного люпина, полученные при обработке семян: 1 – водой; 2 – питательной средой; 3 –
споровой суспензией гриба C. lupini БИМ F-382, поддерживаемого периодическими пересевами; 4 – споровой суспензией гриба C. lupini БИМ F-382, восстановленного после лиофилизации; 5 – споровой суспензией гриба C. lupini
БИМ F-382, восстановленного после криоконсервации
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
растений при инфицировании этим штаммом наступала быстрее, чем при заражении грибом
F. solani БИМ F-347.
Таким образом, длительное хранение F. solani БИМ F-347 и R. solani БИМ F-362 при –70 °С не
оказало отрицательного влияния на их фитопатогенные свойства, что позволяет рекомендовать
указанные грибы в качестве тест-культур для проверки озимой ржи на устойчивость к ризоктониозу и фузариозу колоса.
F��������������������������������������
-382, хранившегося различными способаДля сравнения способности штамма C. lupini БИМ ���������������������������������������
ми, инфицировать растения люпина был проведен лабораторный опыт определения фитопатогенных свойств этой культуры (рис. 3). После появления проростков люпина, выросших из инфицированных семян, все варианты были тщательно проверены на наличие симптомов поражения.
В результате установлено, что наибольшим поражающим эффектом обладал штамм C. lupini
БИМ F����������������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������������������
-382, хранившийся методом криоконсервации. Степень поражения растений соответствовала 9 баллам. В то же время фитопатогенные свойства гриба при хранении методами субкультивирования и лиофилизации проявлялись слабее, степень поражения проростков люпина
варьировала от 5 до 7 баллов.
Таким образом, длительное хранение C. lupini БИМ F-382 при –70 °С не оказало отрицательного влияния на патогенные свойства, что позволяет использовать гриб в качестве тест-культуры
для проверки люпина на устойчивость к антракнозу.
Результаты наших исследований согласуются с данными ряда авторов, показавших эффективность применения метода криоконсервации, в частности при –70 °С, фитопатогенных грибов
с целью сохранения их жизнеспособности и свойств [29–31]. При оптимизации способа криоконсервации мы учитывали особенности конкретного микроорганизма, условия его культивирования, состав криопротектора, режимы охлаждения и отогрева.
Заключение. Проведенные исследования подтвердили перспективность использования криоконсервации для эффективного сохранения физиолого-морфологических и фитопатогенных свойств
грибов. Штаммы F. solani БИМ F-347, R. solani БИМ F-362, C. lupini БИМ F-382 после длительного
хранения могут служить в качестве тест-объектов при проведении научно-исследовательских работ
по созданию биологических средств защиты растений, а также в селекции зерновых и зернобобовых
культур на устойчивость к болезням. Изученные культуры могут быть также предложены для
пополнения фондов генетических банков фитопатогенных микроорганизмов.
61
ус
и
Литература
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
1. Г о л и к о в Н. Н. // Защита и карантин растений. 2003. № 3. С. 44.
2. Ш е ш е г о в а Т. К. // Защита и карантин растений. 2003. № 4. С. 50–51.
3. Ч у л к и н а В. А. Защита зерновых культур от обыкновенной гнили. М., 1979.
4. Ч у л к и н а В. А. Корневые гнили хлебных злаков в Сибири. Новосибирск, 1985.
5. И в а щ е н к о В. Г. // Микология и фитопатология. 1998. Т. 32. Вып. 5. С. 1–10.
6. Л е в и т и н М. М. // Защита и карантин растений. 2002. № 1. С. 16–17.
7. M o r d u e J. T. M. Commonwealth Mycological Institute. 1974.
8. B o l k a n H. A. // Bean production problems: Disease, insect, soil and climatic constrains of Phaseolus vulgaris /
Eds. H. F. Schwats and G. E. Galvez. Columbia, 1980. P. 67–100.
9. W e I n h o l d A. F. Abst. 69th Annu. Meet. Amer. Phytopath. Soc. 1977.
10. М у р о м ц е в Г. С. // Тр. Всесоюз. НИИ удобрений и агропочвовед. 1962. Вып. 40. С. 255–260.
11. T h o m a s G. J. // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium: Proceedings of the 9th International Lupin
Conference. Klink/Muritz, 20–24 June 1999. Klink/Muritz, 1999. P. 43–45.
12. F r e n c e l I. M., L e w a r t o w s k a E., W i a t r K. et al. // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium:
Proceedings of the 9th International Lupin Conference. Klink/Muritz, 20–24 June 1999. Klink/Muritz, 1999. P. 37–39.
13. L i n d n e r K., F l a t h K., G a r b e G. et al. // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium: Proceedings
of the 9th International Lupin Conference. Klink/Muritz, 20–24 June 1999. Klink/Muritz, 1999. P. 57–59.
14. H a s h a g e n U., I b a n e z R., B a e r E. // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium: Proceedings of the 9th
International Lupin Conference. Klink/Muritz, 20–24 June 1999. Klink/Muritz, 1999. P. 46–47.
15. M e y J. A. M., W y k P. S., R o m e r P. // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium: Proceedings of the 9th
International Lupin Conference. Klink/Muritz, 20–24 June 1999. Klink/Muritz, 1999. P. 23–25.
16. Y a k u s h e v a A. S. // Lupin in modern agriculture: Proceedings Conference. Olsztyn – Kortowo, 25–27 June
1997. Olsztyn, 1997. Vol 1. P. 126–134.
17. K u p t s o v V. // Lupin, An Ancient Crop for the New Millenium: Proceedings of the 9th International Lupin
Conference. Klink/Muritz, 20–24 June 1999. Klink/Muritz, 1999. P. 150–151.
18. Б и л а й В. И. Фузарии. Киев, 1977.
19. L u d l a m H. A. // J. Appl. Bacteriol. 1989. Oct. Vol. 67, N 4. P. 417–423.
20. P a s a r e l l L., M c G i n n i s M. R. // J. Clin. Microbiol. 1992. Apr. Vol. 30, N 4. P. 1000–1004.
21. C a l c o t t C. A. Freezing and thawing microbes. 1978.
22. Методы экспериментальной микологии / Справочник. Киев, 1982.
23. Б у х а л о А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев, 1988.
24. С а т т о н Д., Ф о т е р г и л л А., Р и н а л ь д и М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов.
М., 2001.
25. Л у с т а К. А., Ф и х т е Б. А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов. Пущино, 1990.
26. M d M a n i r u z z a m a n K h a n d a k e r, A b u l K h a i v, M d K h u r s h e d e d A l a m B h u i y a n et al. //
Bangladesh J. Bot. 2008. Vol. 37, N 1. P. 75–80.
27. B a l a l i G. R., N e a t e S. M., S c o t t E. S. et al. // Plant Path. 1995. Vol. 44, N 6. P. 1050–1057.
28. C a r l i n g D. E., H e l m D. J., L e i n e r R. H. // Plant Disease. 1990. Vol. 74. P. 860–863.
29. R a p e r K. B. // Culture Collection. Toronto, 1993. N 81.
30. P a s a r e l l L., M c G i n n i s M. R. // J. Clin. Microbiol. 1992. Vol. 30. P. 1000–1004.
31. B a k e r M., J e f f r i e s P. // J Clin Microbiol. 2006. Vol. 44, N 2. P. 617–618.
I. S. VAZHYNSKAY, V. N. KUPTSOV, E. I. KOLOMIETS, G. I. NOVIK, A. V. KANTEROVA
ьн
CRYOCONSEVATION AS AN EFFECTIVE METHOD OF PRESERVING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
Summary
На
ци
он
ал
Physiological-morphological and phytopathogenic properties of fungi F. solani BIM F-347, R. solani BIM F-362,
C. lupini BIM F-382 were characterized after storage by cryoconservation technique. It was found that long-term maintenance
of fungal cultures in frozen state at -70 °C did not induce changes in mycelium structure, growth rate and sporulation. Fungal
strains retained capacity to infect and cause pathologies of winter rye and lupine cultivars. Cryoconservation was shown to
be the optimal method of preserving phytopathogenic properties of fungi as compared to subculturing and freeze-drying
technologies. Summing up, cryoconservation process may be recommended for prolonged maintenance of fungal cultures
in specialized collections of phytopathogenic microorganisms.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 615.357+591.463
ел
Г. Г. Верещако, Г. А. Горох, О. Л. Федосенко, Н. В. Гунькова
кБ
ВЛИЯНИЕ ФЕНОБОЛИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ,
РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И УРОВЕНЬ ГОРМОНОВ
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС-САМЦОВ
Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель, е-mail: irb@mail.gomel.by
ау
(Поступила в редакцию 18.11.2010)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Стероидные препараты андрогенного и анаболического действия в последние десятилетия получили широкое распространение в клинической практике и особенно в спорте.
Они используются для восстановления организма, наращивания мышечной массы, что позволяет существенно увеличивать физическую работоспособность организма. Механизм их действия
на клеточном уровне связан со стимуляцией синтеза нуклеиновых кислот и запуском процесса
образования новых молекул белка, повышением проницаемости клеточных мембран, а также
активизацией синтеза макроэргов [1–3]. Анаболические стероиды способны ингибировать
остеолиз и фиксировать кальций в костях, нормализовать обмен кальция и фосфора [4, 5]. Для
достижения необходимого эффекта анаболические стероидные препараты обычно используются многократно и в повышенных дозах. Однако следует иметь в виду, что избыточное применение стероидных препаратов вызывает ряд нежелательных эффектов, в том числе токсическое действие на печень, снижение половой функции, гипертрофию тканей и т. д. [1, 4]. Поэтому
была поставлена задача получения таких препаратов, у которых андрогенное действие было бы
снижено при сохранении или повышении анаболических свойств [4].
Одним из таких синтезированных препаратов является феноболин (17β-Окси-19-нор-4андростен-3-он-17β-фенилпропионат), обладающий пролонгированным действием и высокой
анаболической активностью. Считается, что его андрогенные эффекты по сравнению с тестостероном менее выражены. В последнее время в литературе появились данные, в которых показано,
что некоторые синтезированные анаболики со сниженной андрогенной активностью (например,
такие как ретаболил), тем не менее вызывают у крыс значительное снижение массы семенников
и простаты, количества половых клеток и их подвижности [6–8]. Однако сведения о влиянии
феноболина на состояние репродуктивной системы самцов отсутствуют, а в отношении других
систем носят ограниченный характер. В связи с этим представляет интерес оценить влияние
этого препарата на некоторые важнейшие системы организма.
Цель настоящего исследования – изучение действия многократного (четыре раза) введения
феноболина в дозе 2,5 мг/кг (2,5 мг/кг·4) на состояние крови, репродуктивной системы и уровень
гормонов в сыворотке крови крыс-самцов.
Материал и методы исследования. Опыты выполнены на белых крысах-самцах стадного
разведения, возраст которых на начало эксперимента составлял 2 мес (неполовозрелые животные), содержавшихся в стандартных пищевых условиях вивария.
Все животные были разбиты на две группы: интактные (контроль) и животные, которым четырехкратно с интервалом в три недели внутримышечно вводили феноболин в дозе 2,5 мг/кг.
Отбор материала для исследований осуществляли на 10, 17, 37 и 97-е сутки после введения последней дозы феноболина. Контролем служили животные аналогичного возраста и пола.
Перед отбором материала для исследований животных взвешивали, после декапитации собирали кровь, извлекали семенники с придатками, массу которых оценивали. В крови определя63
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ли количество лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов, моноцитов, эритроцитов, содержание
гемоглобина на гемоанализаторе Celltac�����������������������������������������������������
������������������������������������������������������������
MEK�������������������������������������������������
����������������������������������������������������
-63-18 ������������������������������������������
J�����������������������������������������
/����������������������������������������
K���������������������������������������
(Япония). В сыворотке крови анализировали содержание тироксина, трийодтиронина (наборы иммуноферментного анализа (ИФА)),
тестостерона и кортикостерона (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(ВЭЖХ)). Рассчитывали относительную массу семенников и эпидидимисов (отношение массы
органа к массе тела, выраженное в процентах). Один из семенников от каждой крысы, освобожденный от туники и кровеносных сосудов, использовали для получения суспензии сперматогенных клеток в 5%-ной уксусной кислоте с генцианвиолетом, в которой подсчитывали количество
сперматогенных клеток, в том числе сперматогоний, сперматоцитов, сперматид, сперматозоидов
и их общее количество в камере Горяева [9]. Зрелые половые клетки выделяли из эпидидимисов,
число которых определяли по [10]. Полученные данные обрабатывали статистически общепринятыми методами с вычислением степени достоверности с использованием t-критерия Стьюдента
при уровне значимости Р < 0,05.
Результаты и их обсуждение. Анализ гематологических данных показывает, что количество лейкоцитов на 10-е сутки после введения феноболина несколько повышается (111,5 %),
а в остальные сроки понижается, однако эти изменения не носят достоверного характера (табл. 1).
Такая же тенденция просматривается и в отношении числа лимфоцитов крови. Что касается количества других клеток лейкоцитарного ряда (моноцитов и гранулоцитов), а также показателей
красной крови (эритроцитов и гемоглобина), то их отклонение от контроля несущественно, за исключением достоверного снижения содержания гемоглобина на 10-е сутки и числа гранулоцитов на 17-е сутки.
Т а б л и ц а 1. Изменение гематологических показателей крыс-самцов
после введения феноболина (2,5 мг/кг · 4)
Изучаемый показатель
10-е сутки
8,9 ± 0,9
5,8 ± 0,8
0,4 ± 0,03
2,6 ± 0,2
10,2 ± 0,5
166 ± 7,7
17-е сутки
12,3 ± 1,1
8,1 ± 0,9
1,1 ± 0,2
3,1 ± 0,4
8,6 ± 0,2
137 ± 2,7
37-е сутки
13,6 ± 1,0
8,4 ± 0,6
1,0 ± 0,1
4,2 ± 0,5
9,2 ± 0,1
147 ± 1,9
97-е сутки
16,9 ± 1,9
10,6 ± 1,9
1,6 ± 0,1
4,5 ± 0,9
8,6 ± 0,1
127 ± 2,1
ак
ад
Лейкоциты, · 109/л
Лимфоциты, · 109/л
Моноциты, · 109/л
Гранулоциты, · 109/л
Эритроциты, · 1012/л
Гемоглобин, г/л
Контроль
ая
Лейкоциты, · 109/л
Лимфоциты, · 109/л
Моноциты, · 109/л
Гранулоциты, · 109/л
Эритроциты, · 1012/л
Гемоглобин, г/л
ал
ьн
Лейкоциты, · 109/л
Лимфоциты, · 109/л
Моноциты, · 109/л
Гранулоциты, · 109/л
Эритроциты, · 1012/л
Гемоглобин, г/л
ци
он
Лейкоциты, · 109/л
Лимфоциты, · 109/л
Моноциты, · 109/л
Гранулоциты, · 109/л
Эритроциты, · 1012/л
Гемоглобин, г/л
На
64
Феноболин
% к контролю
9,7 ± 1,0
6,1 ± 0,7
0,6 ± 0,1
2,9 ± 0,7
9,0 ± 0,1
137 ± 2,7*
109,0
105,2
150,0
111,5
88,2
82,5
8,5 ± 1,3
5,5 ± 1,0
1,1 ± 0,2
1,8 ± 0,4*
9,2 ± 0,1
141 ± 1,2
69,1
67,9
100,0
58,1
107,0
102,9
12,3 ± 1,5
7,7 ± 1,3
1,1 ± 0,1
3,5 ± 0,3
8,9 ± 0,1
134 ± 1,8
90,4
91,7
110,0
83,3
96,7
91,1
13,6 ± 0,8
7,0 ± 1,0
2,4 ± 0,5
5,1 ± 0,6
9,3 ± 0,2
131 ± 3,2
80,5
66,0
150,0
113,3
108,1
103,1
* Достоверно при Р < 0,05. То же для табл. 2.
ус
и
ар
В результате исследования относительной массы семенников и эпидидимисов крыс выявлено
их выраженное снижение во все сроки после введения феноболина, достигающее максимума на
17-е сутки (табл. 2). В этот период падение относительных масс семенников достигает почти 34,8 %,
а эпидидимисов – 45,2 %.
Т а б л и ц а 2. Изменение некоторых показателей репродуктивной системы
крыс-самцов после введения феноболина (2,5 мг/кг·4)
0,79 ± 0,05
0,23 ± 0,01*
0,15 ± 0,01
0,85 ± 0,02
1,21 ± 0,03
1,23 ± 0,03*
3,44 ± 0,09
0,037 ± 0,001*
ау
10-е сутки
ОМ семенников, %
0,85 ± 0,02
ОМ эпидидимисов, %
0,37 ± 0,06
Сперматогонии, · 108/г
0,17 ± 0,01
Сперматоциты, · 108/г
0,79 ± 0,02
Сперматиды, · 108/г
1,07 ± 0,04
Сперматозоиды, · 108/г
1,59 ± 0,03
Общее количество клеток, · 108/г
3,62 ± 0,05
Сперматозоиды эпидидимисов, · 108/г
0,062 ± 0,002
17-е сутки
ОМ семенников, %
0,95 ± 0,05
ОМ эпидидимисов, %
0,31 ± 0,02
Сперматогонии, · 108/г
0,17 ± 0,01
Сперматоциты, · 108/г
0,96 ± 0,06
Сперматиды, · 108/г
1,00 ± 0,05
Сперматозоиды, · 108/г
1,64 ± 0,02
Общее количество клеток, · 108/г
3,77 ± 0,10
Сперматозоиды эпидидимисов, · 108/г
0,068 ± 0,01
37-е сутки
ОМ семенников, %
0,95 ± 0,02
ОМ эпидидимисов, %
0,34 ± 0,01
Сперматогонии, · 108/г
0,20 ± 0,01
Сперматоциты, · 108/г
0,79 ± 0,04
Сперматиды, · 108/г
0,93 ± 0,04
Сперматозоиды, · 108/г
1,52 ± 0,05
Общее количество клеток, · 108/г
3,44 ± 0,06
Сперматозоиды эпидидимисов, · 108/г
0,066 ± 0,002
97-е сутки
ОМ семенников, %
0,80 ± 0,04
ОМ, %
0,32 ± 0,02
Сперматогонии, · 108/г
0,12 ± 0,02
Сперматоциты, · 108/г
0,82 ± 0,03
Сперматиды, · 108/г
0,93 ± 0,02
Сперматозоиды, · 108/г
1,21 ± 0,04
Общее количество клеток, · 108/г
3,08 ± 0,02
Сперматозоиды эпидидимисов, · 108/г
0,074 ± 0,003
Феноболин
ел
Контроль
кБ
Изучаемый показатель
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
0,62 ± 0,11*
0,17 ± 0,04*
0,27 ± 0,02*
1,31 ± 0,05*
1,11 ± 0,06
1,46 ± 0,07
4,15 ± 0,4*
0,004 ± 0,001*
0,74 ± 0,06*
0,21 ± 0,02*
0,20 ± 0,01
0,90 ± 0,04
1,03 ± 0,06
1,40 ± 0,04
3,53 ± 0,03
0,028 ± 0,004*
0,77 ± 0,01
0,28 ± 0,01
0,16 ± 0,01
1,12 ± 0,04
1,47 ± 0,07
1,76 ± 0,03
4,51 ± 0,11
0,065 ± 0,002
ал
П р и м е ч а н и е. ОМ – относительная масса.
На
ци
он
Введение феноболина животным вызывает определенную стимуляцию процесса сперматогенеза на стадиях от сперматогоний до сперматид включительно (за исключением первого срока
наблюдений, когда количество сперматогоний несколько уменьшалось). В то же время количество сперматозоидов в тестикулярной ткани на 10, 17 и 37-е сутки было снижено. К 97-м суткам
(отдаленный период) после введения препарата анаболического действия число сперматогенных
клеток всех стадий сперматогенеза повышалось: от 133,3 % для сперматогоний до 145,5 % для
сперматозоидов, вследствие чего общее количество сперматогенных клеток в семеннике достигало 146,4 % по сравнению с контролем (табл. 2). Несмотря на это, количество зрелых половых
65
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
клеток, выделенных из эпидидимисов животных,
которым вводили феноболин в дозе 2,5 мг/кг,
было резко снижено. На 10-е сутки оно составляло 59,7 %, на 17-е сутки – всего 5,9 % и на 37-е
и 97-е сутки соответственно 42,4 и 87,8 % от контрольных значений.
Следовательно, феноболин оказывал выраженное действие на изучаемые показатели репродуктивной системы крыс, особенно значительное
на этапе перехода сперматозоидов из семенных
извитых канальцев в эпидидимис и при их превращении в спермии, что сопровождалось резким
Изменение содержания некоторых гормонов в сыво- падением числа этих клеток и отражалось на эпиротке крови крыс–самцов после введения феноболина дидимисе, относительная масса которого суще(2,5 мг/кг · 4) (в % к контролю). Звездочка (*) – разлиственно уменьшалась.
чия достоверны при Р < 0,05
В оценке последствий влияния феноболина
на организм крыс-самцов немаловажное значение имеет реакция эндокринной системы. Установлено, что содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови животных на введение феноболина в последующий период изменяется незначительно (рисунок). Только на 17-е сутки
после введения феноболина выявляется снижение уровня трийодтиронина (на 44,0 % от уровня
контроля). Введение феноболина приводило к некоторому снижению уровня кортикостерона,
а содержание тестостерона, достоверно повышаясь на 10-е сутки, существенно уменьшается
к 97-м суткам. Значительное изменение содержания тестостерона в сыворотке крови крыссамцов в большинстве случаев при введении феноболина обусловлено его влиянием не только
на процесс сперматогенеза, но и непосредственно на активность гормонпроизводящих клеток
Лейдига. Об атрофии клеток Лейдига и снижении их количества при введении ряда анаболиков
указывается в сообщениях [6, 8].
Заключение. Обобщая полученные результаты, следует отметить, что эффекты четырехкратного введения феноболина с интервалом в три недели на кроветворную, репродуктивную
и эндокринную системы существенно различаются. Если в первый срок наблюдения отмечается некоторая стимуляция лейкопоэза, а в последующем выявляется тенденция к несущественному снижению количества лейкоцитарных элементов крови, то в репродуктивной системе
крыс-самцов наблюдается длительное падение относительной массы семенников с придатками,
количества зрелых половых клеток, выделенных из эпидидимисов, и снижение содержания тестостерона в сыворотке крови животных. Уровень гормонов в сыворотке крови крыс-самцов, особенно кортикостерона и тестостерона, также указывает на дезинтеграцию гормональной регуляции
в организме после введения анаболического препарата. Особое внимание следует обратить на тот
факт, что гибель половых клеток под влиянием феноболина происходит на стадии окончательной
дифференцировки сперматозоидов в придатках семенника. Выраженное угнетение репродуктивной системы крыс-самцов при введении феноболина свидетельствует о его высокой андрогенной
активности, в то время как принято считать, что в этом анаболическом препарате преобладают
анаболические свойства.
Таким образом, исходя из полученных данных, можно сделать однозначный вывод о негативных последствиях влиянии феноболина на состояние репродуктивной системы самцов и поэтому
его использование в спорте или в культуризме (бодибилдинге) должно быть полностью исключено.
Литература
1. G r u n d і g P., B a c h m a n n M. Anabole Steroide. Sport Verlag. Ingenohl. Heilbronn, 1994.
2. K i c m a n A. T., G o w e r D. B. // Annals of clinical biochemistry. 2003. Vоl. 40, Pt. 4. Р. 321–356.
3. K u h n C. M. // Recent Prog. Horm. Res. 2002. Vоl. 57. Р. 411–434.
4. Б у л а н о в Ю. Б. Анаболические стероиды и андрогены: Сб. ст. Тверь, 2002.
На
66
ус
и
ел
ар
5. Д з а м у к о в Р. А., В а л и у л л и н В. В. // Физиология мышечной деятельности: Тез. докл. междунар. конф.
М., 2000. С. 52–53.
6. T a k a h a s h i M., T a t s u g I Y., K o h n o T. // Endocr J. 2004. Vоl. 51, N 4. Р. 425–434.
7. K a r b a l a y – D o u s t S., N o o r a f s h a n A., A r d e k a n i F. M, M i r k h a n i H. // Asian J. Androl. 2007.
Vоl. 9, N 2. Р. 235–239.
8. N a r a g h i M. A., A b o l h a s a n i F., K a s h a n i I. et al. // Folia Morphol. (Warsz.). 2010. Vоl. 69, N 3. P. 138–146.
9. М а м и н а В. П., С е м е н о в Д. И. // Цитология. 1976. Т. 18, N 7. С. 913–914.
10. Е в д о к и м о в В. В., К о д е н ц о в а В. М., В р ж е с и н с к а я О. А. и др. // Бюл. эксп. биол. и мед. 1997.
Т. 123, № 5. С. 524–527.
G. G. Vereshchako, G. А. GOROCH, O. L. Fedosenko, N. V. Gunkova
Summary
кБ
THE effects of phenoboline on some indicators of the blood,
reproductive system and level of hormones in rats-males of serum blood
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
The effects of phenoboline in 2.5 mg/kg (2,5 mg/kg����������������������������������������������������������������������
х���������������������������������������������������������������������
4) to quantitative indicators of white and red blood cells, reproductive system, thyroid hormones, corticosterone and testosterone in the blood serum of rats was studied. A moderate influence on
the number of leucocytes and leucocytes formula blood elements and the 10 days following its introduction to indicators
of red blood was found. Injection of anabolic drugs caused by falling relative mass of testes, especially, epididymis and dramatically
reduce the number of spermatozoa from epididymis. Phenoboline in some cases had pronounced effect on testosterone
and serum corticosterone in experimental animals. Found on the dangers of repeated use phenoboline, which has negative
effects on the reproductive system in rats-male.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 577.171.5: 547.962+591.147.1:599.323.4
ел
В. В. ВИНОГРАДОВ 1, А. В. ТУМАНОВ 1, С. В. ВИНОГРАДОВ 2, Я. Р. МАЦЮК 2,
В. П. АНДРЕЕВ 2, Т. Ю. СМЫКОВСКАЯ 1, Ю. В. ЯРОЦКИЙ 1
кБ
СТРЕСС И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ТРИГГЕР ТИРОЦИТОВ у крыс
Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси, Гродно,e-mail: val@biochem.unibel.by,
2
Гродненский государственный медицинский университет, e-mail: pharma@grsmu.by
1
ау
(Поступила в редакцию 28.10.2010))
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Ранее нами было показано, что периодический дозированный стресс (ежедневное
30-минутное воздействие электрическим током, звуком и светом в течение 1–3 мес) увеличивает
процентное содержание двуядерных клеток (2 ЯК) в щитовидной железе (ЩЖ) крыс, которые
служат маркером пролиферационного эндомитоза тироцитов и соответственно их гиперплазии
[1]. Известно, что в условиях начального этапа сильного стрессорного воздействия (10, 30, 60 мин)
в плазме крови крыс достоверно повышается уровень тиреотропина (ТТГ), тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3) [2, 3], что свидетельствует об активации гормонообразовательной функции секреторных элементов ЩЖ. Учитывая несовместимость генетических программ деления и работы клеток [4], было интересно выяснить может ли эмоционально-болевой стресс (ЭБС) в фазе
тревоги (60 мин опыта) быть активатором пролиферации тироцитов и какова здесь роль ТТГ.
Цель работы – расшифровка механизмов тиреотропного действия стресса.
Материалы и методы исследования. Все эксперименты проводились на половозрелых
крысах-самках линии Вистар массой 150–200 г. В первой серии опытов (40 крыс) 10 интактных
животных служили контролем, следующие 10 подвергались ЭБС по методике Десатурато (асинхронные раздражения электрическим током, звуком и светом) с экспозицией 60 мин. Еще 20 крысам в течение 14 дней с помощью металлического зонда вводили 30 мг/кг мерказолила (МЗ),
10 из них за 1 ч до забоя подвергали ЭБС. Животных умерщвляли декапитацией.
Во второй серии опытов (70 крыс) 60 животным внутрибрюшинно вводили адреналин (0,18 %
эпинефрин-гидротартрат: фармацевтическая компания «Здоровье», Украина) в дозе 0,2 мл (0,36 мг)
на 100 г массы тела. Затем по 10 крыс декапитировали через 5, 10, 15, 30, 45 и 60 мин после однократного введения препарата. Последними декапитировали 10 интактных животных (контроль).
В первой серии опытов в плазме крови измеряли концентрацию Т4 и Т3 с помощью иммуноферментных наборов (К211 и К212 фирмы «Хема-Медика», Москва). Активность тиреопероксидазы (ТПО) в гомогенате ткани ЩЖ определяли спектрофотометрическим методом по окислению йодида. Материал ЩЖ для гистологических исследований сразу после забора фиксировали
в жидкости Карнуа и заключали в парафин. Изготовленные парафиновые срезы толщиной 5 мкм
окрашивали гематоксилином и эозином для изучения общей микроструктуры ЩЖ крыс после
введения МЗ и при дополнительных воздействиях ЭБС. Срезы толщиной 10 мкм подвергали гистохимической обработке по А. Шабадашу с целью определения функциональной активности
тироцитов и содержания в коллоиде гликопротеинов. Рибонуклеопротеины (РНП) тироцитов
выявляли общепринятым методом Эйнарсона.
Кариометрические исследования (определение площади, периметра и диаметра ядра) окрашенных гематоксилин-эозином срезов оптимальной толщины (5 мкм), которая не должна была
превышать более чем в 1,5–2 раза средний диаметр измеряемых ядер, проводили при помощи
компьютерного анализа изображений Bioscan NT 2.0 (It Lab., Беларусь), микроскопа Axioscop 2
plus (Zeiss, Германия) при увеличении 40 и цифровой видеокамеры Sony (DFW–Х 710, Япония).
На
68
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Измерялись только те ядра, которые попадали в срез целиком. Идентификацию целых ядер проводили традиционным способом (фокусировали с помощью вращения микровинта микроскопа).
Для исследования митозов и эндомитозов ткань ЩЖ контрольных и опытных животных
фиксировали глютаровым альдегидом и четырехокисью осмия, заливали в смесь метилового
и бутилового метакрилатов. Серийные полутонкие срезы толщиной 0,5–1,0 мкм окрашивали
смесью красителей – азур II и основным фуксином. Окрашенные препараты изучали методом
световой микроскопии и фотографировали цифровой фотокамерой Canon Power Shot А710.
Процентное содержание двуядерных форм в общей популяции специализированных клеток проводили с помощью микрометрической сетки, вставленной в окуляр микроскопа «Биолам Л-211»
( × 400). Количество митозов вычислялось по отношению к общему количеству клеток фолликулярного эпителия. Среднее вычислялось в процентах (исходя из подсчета около 1000 клеток).
Во второй серии опытов в плазме крови оценивали концентрацию Т4 и Т3 иммуноферментным методом. Кроме того, в плазме крови и адреналовых железах измеряли содержание кортикостерона методом высокоэффективной хроматографии на хроматографе «Милихром», где в качестве подвижной фазы использовали гексан, метанол и хлороформ в соотношении 7:1:1.
Активность тиреопероксидазы в гомогенате ткани ЩЖ определяли спектрофотометрически.
Весь полученный цифровой материал обрабатывали методами параметрической статистики, используя лицензионную компьютерную программу Statistica 6.0 для Windows.
Результаты и их обсуждение. На рис 1 представлен общий вид фолликулов ЩЖ (а, в, д) и содержание в них гликопротеинов (б, г, е) при воздействии ЭБС и МЗ. Следует отметить нормальный вид
фолликулов и богатое содежание гликопротеинов в коллоиде у контрольных животных (рис.1, а, б).
Активация секреторной функции ЩЖ при воздействии одночасового ЭБС приводит к уменьшению
размеров фолликулов, появлению многочисленных резорбционных вакуолей в коллоиде, расширению перифолликулярных капилляров с явлениями стаза. В коллоиде периферически расположенных фолликулов из-за увеличенного содержания резорбционных вакуолей содержание гликопротеинов снижено (рис. 1, в, г). По сравнению с контролем (рис. 1, а, б) 14-дневное введение МЗ приводит к
отечности стромы ЩЖ, уменьшению размеров фолликулов за счет набухания тироцитов и сокращения внутрифолликулярных полостей, малому содержанию в них коллоида и гликопротеинов (рис. 1,
д, е). В отличие от ЭБС, где уменьшение размеров фолликулов ЩЖ и содержания в них коллоида
и гликопротеинов связано с повышенной секрецией йодтиронинов в кровь, что документируется
обилием резорбционных вакуолей (рис. 1, в, г), при введении МЗ имеет место глубокий гипотиреоз:
активность ключевого фермента тироксиногенеза – ТПО в ЩЖ уменьшается на 42 % (с 384,8 ± 51,89
до 202,8 ± 36,32 мкМ/мин/г белка, Р = 0,01), содержание Т3 в крови снижается на 68 % (с 1,043 ± 0,186
до 0,333 ± 0,042 нмоль/л, Р = 0,005), а Т4 – на 67 % (с 24,99 ± 4,72 до 9,38 ± 3,08 нмоль/л, Р = 0,02).
Представленная на рис. 1, д, е морфологическая характеристика струмогенного действия МЗ фактически демонстрирует типичную картину паренхиматозного зоба, обусловленного гиперплазией тироцитов. Об МЗ-зависимой усиленной пролиферации секреторных элементов ЩЖ свидетельствует
наличие в них митотических фигур, двуядерных клеток, а также новообразованных эпителиальных
почек, врастающих в полость фолликулов (рис. 2, а, б, в)
Визуальная оценка морфологических сдвигов, характеризующих соотношение функции и пролиферации тироцитов при воздействии ЭБС и МЗ, подкрепляется данными цитометрии и кариометрии эпителиальных клеток ЩЖ (маркерами функциональной гипертрофии), подсчетом в них
митозов и эндомитозов (маркеров пролиферации).
Из таблицы видно, что ЭБС (60 мин) увеличивает гипертрофию клеток (высоту тироцитов)
и ядер (площадь, периметр и диаметр) по сравнению с контролем и на фоне МЗ (что доказывает
активацию функции), а также уменьшает процентное содержание двуядерных клеток и митозов
как по сравнению с контролем, так и на фоне МЗ (что доказывает угнетение пролиферации). Тот
факт, что стимуляция специфической функции ЩЖ (гормоносинтеза) имеет место на фоне активированной МЗ пролиферации тироцитов свидетельствует о том, что в аварийной фазе ЭБС (экспозиция 60 мин), когда наблюдается всплеск концентрации адреналина в крови и блокируется
секреция инсулина β-клетками поджелудочной железы (транзиторный диабет напряжения) [5],
реципрокно включается мощный антипролиферативный механизм контроля секреторного цикла тиреоидных клеток.
69
ус
и
ар
ел
б
ау
кБ
а
г
ем
ия
н
в
д
е
ая
ьн
а
→
→
→
→
ак
ад
Рис. 1. Влияние ЭБС и МЗ на общий вид фолликулов ЩЖ (а, в, д) и содержание в них гликопротеинов (б, г, е): а, б –
контроль; в, г – ЭБС; д, е – мерказолил. × 200
б
→
ци
он
ал
→
в
г
Рис. 2. Пролиферация тироцитов после введения МЗ: а – тироцит в метафазе митоза; б – многочисленные ядрышки
в постмитотических ядрах тироцитов (обозначены жирной стрелкой), тонкими стрелками обозначены ядра, образовавшиеся путем эндомитоза; в – фрагмент фолликула с тироцитом, находящимся в метафазе митоза (жирная стрелка),
в основании растущей эпителиальной почки находится тироцит с двумя ядрами, образовавшимися в процессе
эндомитотического деления (тонкая стрелка); г – эпителиальный пролиферат, растущий внутрь фолликула. × 1000
На
70
ус
и
Цитометрические и кариометрические параметры тироцитов при воздействии ЭБС и М3
Группа
М3
М3 +ЭБС
7,24 ± 0,15
17,55 ± 0,37
4,12 ± 0,06
16,41 ± 0,18
0,17 ± 0,002
7,56 ± 0,12
0,004
13,71 ± 0,31*
27,24 ± 0,70*
5,25 ± 0,07*
20,09 ± 0,26*
0,20 ± 0,006*
6,82 ± 0,14*
0,002
8,44 ± 0,19*
21,89 ± 0,54*
4,41 ± 0,08*
18,63 ± 0,24*
0,17 ± 0,002
11,57 ± 0,23*
0,36
12,91 ± 0,40*
27,04 ± 0,72*
5,05 ± 0,09*
20,53 ± 0,28*
0,19 ± 0,003*
9,82 ± 0,20*
0,20
* Р < 0,05 по сравнению с контролем.
ар
ЭБС
ел
Высота тироцитов, мкм
Площадь ядра, мкм2
Диаметр ядра, мкм
Периметр ядра, мкм
РНП, ед. оптич. плотности
% двуядерных клеток
% митозов
Контроль
кБ
Показатель
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Приведенные в таблице данные цитометрии и кариометрии, измерения уровня РНП и подсчета количества митозов и эндомитозов подтверждают антагонистический характер взаимосвязи деления и функции специализированных клеток, отчетливо проявляющийся и при стимуляции пролиферации тироцитов МЗ. Повышение содержания РНП в ЩЖ в адреналиновой фазе
ЭБС является биохимической основой гипертрофии секреторных клеток, т. е. «структурного
следа адаптации», возникающего во внутренних органах в ответ на повышение интенсивности
их функционирования в результате активации синтеза нуклеиновых кислот и белков, за счет
чего возрастает масса необходимых для адаптации структур, в том числе ферментов тироксиногенеза.
Для оценки прямого действия катехоламинов на ЩЖ необходимо было смоделировать с помощью экзогенного гормона такую же ситуацию, что и при начальной адреналиновой стадии
развития стресса, т. е. ввести in vivo крысам большую дозу адреналина и исследовать активность
тироксиногенеза в динамике первых 60 мин опыта.
Полученные результаты представлены на рис. 3, из которого следует, что активность ключевого фермента биосинтеза йодтиронинов в ЩЖ – ТПО в течение 5–60 мин после однократного
введения адреналина (АД) поддерживается на стабильно высоком уровне (кривая 3), что обеспечивает устойчивое повышение во все сроки опыта секреции в кровь Т4 (кривая 1) и более сильное – Т3 (кривая 2). Сдвиг интратиреоидного гормоногенеза в сторону повышенного образования
Т3 является характерным признаком адренергического влияния [6].
Это указывает на то, что действие ЭБС в течение первых 60 мин опыта опосредовано АД:
мишенью являются ферменты, контролируемые опероном дифференцировки. Поскольку ТПО –
признанный маркер дифференцировки тироцитов, ее активация, а также морфологические признаки разнонаправленного действия ЭБС на функцию и пролиферацию фолликулярного эпителия ЩЖ свидетельствуют о переключении генетического триггера.
Вопрос о регуляции пролиферации эндокринной паренхимы ЩЖ крайне запутан. Несов­
местимость на клеточном уровне программ пролиферации и дифференцировки является общепринятой в биологии, однако в отношении ЩЖ аксиоматический принцип – «работающая клетка не
делится», почему-то игнорируется: многие авторы считают, что ТТГ, действующий через цАМФ,
может одновременно стимулировать в тироцитах их размножение и секреторную функцию.
Согласно [7], ТТГ и цАМФ индуцируют деление тироцитов собак, сохраняющих функциональную активность, причем обе программы (пролиферации и дифференцировки) включаются
ими in vitro «в одних и тех же клетках, в одно и то же время». Однако такой вывод не может быть
принят безоговорочно, поскольку известно, что в ЩЖ сосуществуют две генетически различные популяции тироцитов с неодинаковой чувствительностью к комитогенам, часть которых
in vitro пролиферирует под влиянием ТТГ и комитогенов, а другая, на которую комитогены не
действуют, способна лишь дифференцироваться под влиянием ТТГ [8]. Поэтому в одной и той
же культуре тироцитов, где присутствуют разнодифференцированные клетки в ответ на добавку
ТТГ и комитогенов, могут одновременно регистрироваться и включение 3Н тимидина в ДНК,
и захват йода.
71
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 3. Концентрация Т4 (1, нМ/л), Т3 (2, нМ/л) в плазме крови, активность ТПО (3, мМ/мин/г белка) в ЩЖ и содержание
кортикостерона в крови (4, нМ/л) и надпочечниках (5, нМ/г) после введения адреналина. К – контроль
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
В ситуации in vivo оба развивающихся одновременно процесса в ЩЖ, т. е. гипертрофия
(активация функции) и физиологическая регенерация (компенсация убыли секреторных элементов за счет их новообразования) тоже могут быть связаны с разными пулами тироцитов: 1) когда
делятся нефункционирующие клетки интерфолликулярных островков, а секретируют клетки
фолликулов; 2) когда в пределах одного фолликула делятся одни клетки, а секретируют другие.
Ранее нами было показано, что ежедневные 30-минутные барокамерные и эмоциональноболевые раздражения в течение 1–3 мес на самом деле действуют как промоторы адаптации,
приводя к активации стресс-лимитирующих систем, контролирующих пролиферацию тироцитов и соответственно наращивая их функциональный потенциал (структурный след адаптации).
Здесь может одновременно наблюдаться и гипертрофия одних секреторных элементов и пролиферация других, поскольку часть клеток (в силу действия генетического триггера) выводится из
секреторного акта, т. е. из под контроля ТТГ, и под воздействием инсулиноподобных модуляторов начинает активно пролиферировать [1].
В настоящей работе установлено, что на фоне дефицита инсулина в фазе тревоги ЭБС (в течение первых 15–60 мин опыта развивается «транзиторный диабет напряжения» [5]) проявляются
только стресс-обусловленные признаки усиления секреторной функции тироцитов, а их пролиферативная активность снижается (таблица)
Исходя из классических представлений о генетической регуляции синтеза ферментов [9], по
аналогии с кортикоцитами [4] и лимфоцитами [10] нами разработана модель генетического триггера тироцитов при стрессе (рис. 4), где роль модуляторов пролиферации и дифференцировки
секреторных клеток выполняют соответственно инсулин/ИРФ-1 и ТТГ/адреналин, которые активируя мембранные рецепторы (S1a,b и S2a,b) дифференцированных клеток синергично с ферментами Е1 (гуанилатциклаза) и Е2 (аденилатциклаза) инициируют производство внутриклеточных посредников (цГМФ и цАМФ).
Далее в соответствии с концепцией оперона [9], цАМФ – корепрессор синтеза гуанилатциклазы, соединяясь с репрессором R1, блокирует оператор (О1) и структурные аутосинтетические
гены тироцитов (СГ1), препятствуя образованию мРНК1, мРНКп и митотических белков, отвечающих за пролиферацию тироцитов (Бп). А цГМФ – корепрессор синтеза аденилатциклазы вместе с R 2 блокирует оператор (О2) и функциональные гены (СГ2), обеспечивающие продукцию
мРНК, мРНКд и специфических функциональных белков (Бд), отвечающих за отправление специфической функции секреторных клеток, т. е. за гормонообразование и секрецию Т3 и Т4.
Схема общего типа взаимодействия между указанными группами генов предельно упрощена, ее не следует понимать буквально, однако она решает поставленную задачу – позволяет рассмотреть динамическое поведение системы. Согласно схеме, гены связаны с различными кле-
На
72
ус
и
ар
ел
кБ
ау
Рис. 4. Модель генетического триггера тироцитов: S – рецептор; Е1,2 – гуанилат- и аденилатциклазы; ГР – генрегулятор; R – репрессор; О – оператор; СГ – структурный ген; Б – белки (ферменты)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
точными функциями и со средой через специфические рецепторы, которые могут реагировать
на гормональные сигналы и изменять внутриклеточное состояние. Связывание гормонального
эффектора дифференцировки (ТТГ/адреналин) с рецепторным аппаратом тироцитов вызовет
увеличение в них уровня цАМФ и соответственно блокирование белков митоза, что может привести к новому стационарному состоянию с пониженной скоростью пролиферации и постепенному дрейфу системы в направлении дифференцировки. При этом в результате репрессии митотического оперона клеточного цикла и снижения уровня цГМФ, подавляющего вместе с R 2 оперон
дифференцировки, будет производиться все больше и больше цАМФ (и соответственно
R1цАМФ), что в конце концов приведет к полному прекращению пролиферации и остановке клеточного цикла.
С другой стороны, связывание митогенных факторов роста (инсулин/ИРФ-1) с рецепторами
клеточной мембраны через повышение в тироцитах уровня цГМФ будет с зеркальной точностью
инициировать пролиферацию в ущерб дифференцировке.
Представленная модель фактически описывает генетический триггер, который в зависимости от природы и степени сродства управляющих сигналов может работать как рубильникпереключатель реципрокных оперонов, «перебрасывающий» жизнедеятельность тиреоидных
клеток из одного стационарного состояния в другое – из фазы секреции в фазу регенерации
и наоборот [10]. Согласно [9], триггеры, т. е. системы, способные неопределенно долго находиться в любом из двух устойчивых пограничных состояний, играют большую роль в механизмах
биологической регуляции. Настоящая модель учитывает представления о перекрестной регуляции дифференцировки и пролиферации по механизму обратной связи, который осуществляется
при соединении эффектора с соответствующим репрессором функционального и митотического
оперонов [9], кейлонную гипотезу [11], где важную роль в реализации механизма обратной связи
играют циклические нуклеотиды, а также данные о том, что ТТГ/адреналин и инсулин/ИРФ-1
могут разнонаправлено влиять на содержание цАМФ и цГМФ в эффекторных клетках [12].
Регуляция пролиферации у эукариот осуществляется с помощью механизма строгого контроля, при котором определяющим фактором является равновесие двух антагонистов [13]. Они
могут быть как внутриклеточными (цАМФ и цГМФ, катионы, анионы, различные реципрокные
инициаторные белки для каждой фазы митотического цикла), так и внеклеточными (ТТГ/адреналин и инсулин/ИРФ-1). На протяжении клеточного цикла концентрации цАМФ и цГМФ изменяются противонаправленно, что служит основанием для утверждения о взаимном антагонизме этих циклических нуклеотидов. В большинстве случаев между концентрацией цАМФ
и пролиферацией клеток была обнаружена обратная зависимость, а с содержанием цГМФ – пря73
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
мая [14]. Монобутирильные производные цАМФ и цГМФ, которые хорошо проникают через клеточную мембрану, легко индуцируют отрицательную и положительную плейотропную реакцию
в культуре фибробластов [15].
Экзогенный цГМФ даже в такой низкой концентрации, как 10 –6 М, стимулирует не только
пролиферацию, но и гидролиз цАМФ [16]. Из этого следует, что стрессорные гормоны и все
физиологические факторы, способные повышать внутриклеточную концентрацию цАМФ (отрицательный сигнал) и/или уменьшать концентрацию цГМФ (положительный сигнал), можно
рассматривать как неспецифические ингибиторы пролиферации [14]. Естественно, что как активаторы могут квалифицироваться все факторы, способные вызывать противоположные сдвиги,
например инсулин, который устраняет контактное торможение и активирует клеточный цикл
фибробластов через увеличение в них соотношения цГМФ/цАМФ с 0,18/22,0 до 2,00/17,0 [17].
Давно известно, что катехоламины являются прямыми активаторами тироксиногенеза – раздражение симпатических нервов ЩЖ оказалось единственным способом, позволившим воспроизвести в эксперименте если не всю клиническую картину тиреотоксикоза, то хотя бы основные
его симптомы. Лечебная эффективность β-блокаторов, нивелирующая клиническую картину гипертиреоза, – важный диагностический признак феохромоцитомы и других опухолей мозгового
слоя надпочечников, постоянно секретирующих избыточные количества катехоламинов [12],
и одновременно – доказательство наличия у последних тиреотропных потенций, не опосредованных ТТГ, т. е. прямого действия адреналина и норадреналина на тироксиногенез, реализующегося с уровня β-адренорецепторов на тироцитах.
Прямое действие катехоламинов на ЩЖ ведет к повышению концентрации цАМФ, увеличению поглощения йода, усилению эндоцитоза тиреоглобулина тироцитами, миграции лизосом
к апикальной мембране, усилению секреции Т3 и Т4. Агонисты β-адренорецепторов повышают
уровень цАМФ, стимулируют образование коллоидных капель, секрецию тиреоидных гормонов
[6]. Выделенная из организма и инкубируемая в аппарате Варбурга ЩЖ, дает вполне отчетливую и немедленную реакцию на прямое действие катехоламинов. Так, добавление адреналина
к инкубационной среде возбуждает функциональную активность тиреоидной паренхимы, о чем
свидетельствует возрастание поглощения ею кислорода, а также йода и способности образовывать йодтиронины [18].
Доказано, что симпатины оказывают секреторное и трофическое действие на ЩЖ, конкурируя в этом плане с ТТГ [18]. В принципе в этом ничего удивительного нет, поскольку биогенные
амины и ТТГ задействуют один и тот же биохимический механизм, который связан с активацией аденилатциклазы и приводит к запуску цАМФ-зависимого сигнального каскада, контролирующего секрецию и гипертрофию тироцитов.
Активация ЩЖ катехоламинами может ингибироваться введением адреноблокаторов, которые не подавляют стимуляцию тироцитов ТТГ. С другой стороны, действие ТТГ блокируется
полифлоретинфосфатом, который не влияет на эффекты катехоламинов. Отсюда следует, что
стимуляция тироксиногенеза ТТГ и катехоламинами первоначально реализуется через различные рецепторы мембраны тироцита, но затем осуществляется через один механизм – активацию
образования цАМФ [6]. По всей вероятности, точно также катехоламины и АКТГ могут активировать кору надпочечников – вначале через различные рецепторы на кортикоцитах, а затем через
единый цАМФ-зависимый механизм. Во всяком случае такое предположение можно сделать исходя из четкой временной синхронизации показателей тироксиногенеза в ЩЖ (см. рис. 3, кривые
1–3) и кортикостероидогенеза в надпочечниках (кривые 4, 5) после введения адреналина.
Таким образом, стрессорные гормоны, которые увеличивают в клетках-мишенях уровень
цАМФ и инсулин, который увеличивает в них концентрацию цГМФ, попеременно толкают маятник генетического триггера тироцитов из одного устойчивого состояния в другое: из состояния
работы в состояние репарации и наоборот. Переключению генетического триггера тироцитов на
обеспечение гормоносинтеза (активацию функции специализированных клеток) в адреналиновую фазу ЭБС (фаза тревоги – 60 мин опыта [4]) способствует развитие на начальном этапе стрессорной реакции «транзиторного диабета напряжения», обусловленного торможением адреналином продукции инсулина в поджелудочной железе [5].
На
74
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
О том, что тироциты являются мишенью для стресс-реализующих и стресс-лимитирующих
гормонов свидетельствует тот факт, что на базальной мембране тироцитов имеются рецепторы
как для стрессорных гормонов, так и инсулина. Кроме того, рецептор ТТГ также может узнавать
инсулин [6], что не исключает вероятности прямой блокировки им сигнала, активирующего гормонообразование в тироцитах.
Поскольку тиреотропин на клеточном уровне действует через тот же мессенджер, что и стрессорные гормоны, предложенная триггерная модель фактически дезавуирует цитированное выше
представление, что ТТГ и цАМФ могут включать генетические программы дифференцировки
и пролиферации тироцитов «в одних и тех же клетках, в одно и то же время»
Кстати, под большим вопросом остается и часто декларируемое в литературе представление
о митогенном цАМФ-зависимом действии ТТГ на тироциты, поскольку in vivo изменений в содержании ДНК в ЩЖ после введения тиреотропного гормона не найдено [19]. Это свидетельствует о том, что ТТГ не является митогеном и, следовательно, действует только на интерфазные
клетки, обеспечивая их гипертрофию (дифференцировку), в том числе – синтез специфических
белков на предсуществующих матрицах РНК.
Поскольку в фазе тревоги болевого стресса содержание ТТГ в крови увеличивается [2], а количество митозов и эндомитозов в фолликулярном эпителии ЩЖ снижается (таблица), тиреотропин не может считаться истинным активатором пролиферации тироцитов.
Учитывая, что и в опытах in vitro ТТГ сам по себе не проявляет митогенной активности и не
приводит к размножению тиреоидных клеток в безсывороточной культуре ткани [20], а внутриклеточный мессенджер действия ТТГ – цАМФ для многих тканей является антимитогеном [21],
можно предположить, что в развитии гиперпластической реакции эндокринной паренхимы ЩЖ
крыс на МЗ лимитирующее значение имеет не ТТГ, содержание которого в крови здесь также
увеличено, но истинные митогены: инсулин, цГМФ, трансформирующие факторы роста и т. д.,
обеспечивающие переключение генетического триггера на пролиферацию, о чем свидетельствует общеизвестное МЗ-зависимое снижение в ткани железы активности ТПО – ферментного маркера дифференцировки тироцитов.
Заключение. Установлено, что в фазе тревоги эмоционально-болевого стресса (60 мин опыта) проявляются только стресс-обусловленные признаки усиления секреторной функции тироцитов, а их пролиферативная активность снижается. Разнонаправленное действие стресса на функцию и пролиферацию тироцитов может свидетельствовать о соответствующем переключении
стрессорными гормонами генетического триггера, лимитирующего работу и деление специализированных клеток, на обеспечение гормоносинтеза секреторными элементами ЩЖ.
Литература
На
ци
он
ал
ьн
ая
1. В и н о г р а д о в В. В., Г о л ы ш к о П. В., М а ц ю к Я. Р., Я р о ц к и й Ю. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер.
мед. навук. 2010. № 1. С. 105–111.
2. Р о б у А. И. Взаимоотношения эндокринных комплексов при стрессе. Кишинев, 1982.
3. В и н о г р а д о в В. В., Г о л ы ш к о П. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. навук. 2008. № 4. С. 110–122.
4. В и н о г р а д о в В. В. Стресс: Морфобиология коры надпочечников. Мн, 1998.
5. П а н и н Л. Е. Биохимические механизмы стресса. Новосибирск, 1983.
6. К у б а р к о А. И., Р о м а н о в с к и й Д. И. Щитовидная железа. Фундаментальные аспекты. Мн.; Нагасаки,
1998. С. 61–103.
7. D u m o n t J. F., L a m y F., R o g e r P., M a e n h a u t C. // Physiol. Reviews. 1992. Vol. 72. P. 667–697.
8. R o g e r P., D u m o n t J. // Moll. Cell. Endocrinol. 1984. Vol. 36. P. 79–93.
9. М о н о Ж., Ж а к о б Ф. // Регуляторные механизмы клетки. М., 1964.
10. В и н о г р а д о в С. В., В и н о г р а д о в В. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер. мед. бiял. навук. 2002. № 2. С. 29–32.
11. B u l l o u g h t W. // Life Sci. 1975. Vol. 16. P. 323–330.
12. Т е п е р м е н Д., Т е п е р м е н Х. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М., 1989.
13. D i c k s o n R., A b e l s o n J., B a r n e s W. // Science. 1975. Vol. 177. P. 37–35.
14. A b e l l C., M o n a h a n T. // J. Cell. Biol. 1973. Vol. 59. P. 549–548.
15. R u d l a n d P., S e e l e y V., S e I f e r t W. // Nature. 1974. Vol. 7. P. 1286–1290.
16. M o e n s W., W o k a e r A., K r a m R. // Proc. Nat. Academ. Sci (Wash). 1975. Vol. 72. P. 1063–1067.
17. J i m e n e s d e A s u a L., C l I n g a n D., R u d l a n d P. // Proc. Nat. Academ. Sci (Wash). 1975. Vol. 72.
P. 2724–2728.
75
ел
STRESS AND THYROCYTE GENETIC TRIGGER AT RATS
ар
V. V. VINOGRADOV, A. V. TUMANOV, S. V. VINOGRADOV, Ya. R. MATSYUK,
V. P. ANDREYEV, T. Yu. SMYKOVSKAYA, Yu. V. YAROTSKY
ус
и
18. А л е ш и н Б. В. // Пробл. эндокринол. 1970. Т. 16, № 2. С. 108–117.
19. Р а ч е в Р. Р., Е щ е н к о Н. Д. Тиреоидные гормоны и субклеточные структуры. М., 1975.
20. F a y e t G., H o v s e p I a n S. // Biochimie 1979. Vol. 61. P. 923–930.
21. Б а л а ж А., Б л а ж е к И. Эндогенные ингибиторы клеточной пролиферации. М., 1982.
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
It was found that the anxiety phase in painful and emotional stress (60 min of the experiment) showed only stress-stipulated signs of enhancement of thyrocyte secretory function, with the thyrocyte proliferative activity being decreased. The fact
that the stress effect on the thyrocyte function and proliferation was not unidirectional can indicate a corresponding stress
hormone switching over of the genetic trigger, limiting the function and division of specialized cells, to supply of secretory
elements to the thyroid gland.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 577.150.6:575.24
ел
В. Н. ГРИНЬКО, Н. Н. ЯКИМОВИЧ, А. А. БИЛЬДЮКЕВИЧ, И. В. ЯКИМОВИЧ
кБ
ВЛИЯНИЕ СОСТАВОВ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ НА БИОСИНТЕЗ L-ЛЕЙЦИНА
КУЛЬТУРОЙ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM AC-L
Институт физико-органической химии НАН Беларуси, Минск, e-mail: gms_124@mail.ru
(Поступила в редакцию 17.05.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Введение. L-лейцин − незаменимая аминокислота, которая находит широкое применение
в медицине. В организме человека и животного данная аминокислота является мощным стимулятором β-клеток панкреатических островков поджелудочной железы, синтезирующих инсулин.
Показано, что внутривенное введение раствора лейцина в 1,5−4,0 раза увеличивает скорость выделения инсулина островками Лангерганса. Лейцин считают регулятором метаболизма белка,
в частности, он снижает распад протеинов, усиливает синтез ДНК. Именно по лейцину определяют скорость синтеза протеинов в организме [1]. Лейцин хорошо всасывается при назначении
перорально, свободно проникает через гематоэнцефалический барьер, быстро включается в систему синтеза белка [2 − 4]. Избыток этой аминокислоты не оказывает отрицательного влияния
на оплодотворение, течение беременности и лактацию [5].
Существует несколько промышленных способов получения аминокислот и, в частности,
лейцина: экстракция из белковых гидролизатов, микробиологический, ферментативный и химический синтез. В настоящее время экономически целесообразным является метод микробного
синтеза, основанный на способности к сверхсинтезу аминокислоты специальными штаммамипродуцентами. Существенное преимущество данного способа − это то, что синтезируемая аминокислота существует только в L����������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������
-форме, поэтому отпадает необходимость в трудоемких стадиях разделения стереоизомеров аминокислот и рацемизации ненужного D-изомера, который не
усваивают живые организмы. Достоинство данного метода заключается в том, что в качестве исходного сырья можно применять дешевые источники азота и углерода.
Цель работы − изучение влияния концентрации основных компонентов питательной среды
на рост и лейцинпродуцирующую способность бактерий штамма-продуцента Corynebacterium
glutamicum AC-L.
Материалы и методы исследования. В качестве продуцента ���������������������������
L��������������������������
-лейцина использовали бак�����������������������������������������
-��������������������������������������
L�������������������������������������
(депонирован в коллекцию культур митериальный штамм Corynebacterium glutamicum AC���������������������������������������
кроорганизмов Белорусского государственного университета под порядковым номером B 1011).
Посевной материал выращивали на среде, содержащей следующие компоненты: меласса – 10 %,
MgSO4·7Н2О – 0,1 %, КН2РО4– 0,2 %, (NH4)2SO4–1,5 %, мел – 2,5 %. Выращивание проводили при
температуре 31 ± 1 oС в колбах Эрленмейера вместимостью 750 см3 на лабораторной круговой
качалке с числом оборотов 240 − 260 мин–1. Объем посевной среды составлял 50 см3, время выращивания – 18−20 ч, концентрация биомассы продуцента – 8,0–10,0 г/л в пересчете на сухие вещества. Посевной материал в количестве 10 % вносили в ферментационные среды.
Культивирование продуцента проводили в лабораторных ферментаторах EDF 5.2 производства
фирмы Biotechnikais centrs (Латвия) вместимостью 7,5 дм3. Ферментаторы снабжены трехъярусными турбинными мешалками для перемешивания ферментационных сред, автоматическими
системами рН и термостатирования, системой аэрации среды стерильным воздухом, датчиком
для измерения растворенного в ферментационной среде кислорода воздуха, записывающими
и регистрирующими приборами.
77
ус
и
P
,
x ⋅t
кБ
k=
ел
ар
Концентрацию компонентов питательных сред, предназначенных для выращивания продуцента, в процессе исследований изменяли в зависимости от целей и задач экспериментов.
Содержание лейцина определяли методом тонкослойной хроматографии, используя систему растворителей − изопропанол: этилацетат: аммиак в соотношении 2:2:1 соответственно. О количестве биомассы судили по величине оптической плотности клеточной суспензии (ФЭК – 2 УХЛ4.2, λ 440 нм) с последующим пересчетом на сухую массу по стандартной кривой.
Удельную биосинтетическую активность продуцента (К), выражающую среднюю скорость
биосинтеза целевой аминокислоты граммом биомассы культуры в единицу времени (г/г⋅ч), рассчитывали по формуле [6]:
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
где Р – концентрация лейцина в ферментационной среде (г/л) за время t (ч); х – максимальное содержание биомассы продуцента в г/л за время t (ч).
Определение содержания сахаров в питательных средах и культуральной жидкости (КЖ)
проводили по Бертрану в модификации Шорля [7]. В качестве источников углеродного питания
для продуцента L-лейцина Corynebacterium glutamicum AC������������������������������������
-�����������������������������������
L����������������������������������
использовали сахар-песок и мелассу – сырье, которое доступно для организации производства L-лейцина в нашей республике.
Источниками азота для культивирования продуцента �������������������������������������
L������������������������������������
-лейцина служили соли хлористого аммония, диамония фосфата и сульфата аммония.
В наших экспериментах в качестве источников калия и фосфора в составе питательной среды, предназначенной для культивирования продуцента L-лейцина Corynebacterium glutamicum
AC-L, использовали калий фосфорнокислый однозамещенный, в качестве источника магния –
сульфат магния, концентрацию калия, фосфора и магния в исследуемых минеральных солях
определяли методом атомно-адсорбционного анализа [8], концентрацию аммонийного азота −
методом отгонки с паром (ГОСТ 26716-85).
����������������
-лейцина продуРезультаты и их обсуждение. Влияние источников углерода на биосинтез L���������������
центом Corynebacterium glutamicum AC-L. Наиболее существенным и дорогостоящим компонентом в составе питательной среды, предназначенной для выращивания продуцента L-лейцина,
является источник органического углерода.
На рис. 1 представлены зависимости накопления ���������������������������������������
L��������������������������������������
-лейцина в ферментационной среде и изменения удельной биосинтетической активности продуцента Corynebacterium glutamicum AC-L
от содержания сахара в питательных средах.
Из представленных на рис. 1 данных видно, что
максимальное накопление L������������������������
�������������������������
-лейцина в КЖ наблюдается, когда концентрация источника углерода в питательной среде находится в пределах 13,5−15,0 %. Характер
графика изменения биосинтетической активности от
концентрации сахара в начальной питательной среде
свидетельствует о том, что при увеличении содержания
сахара более 14 %, резко снижается производительность процесса биосинтеза. Так, например, если при
концентрации сахара, равной 14 %, удельная биосинтетическая активность составляет 0,03 (г/г⋅ч), то при увеличении концентрации источника углеродного питания до
Рис. 1. Зависимость накопления L-лейцина (1) 15,0 % производительность процесса снижается прак���������������������
-лейцина в КЖ увелии удельной биосинтетической активности штам­ тически в 2 раза, а содержание L��������������������
ма-продуцента (2) от содержания сахара в пи- чивается незначительно. В условиях промышленного
тательной среде: P – концентрация L-лейцина, производства это приводит к перерасходу энергопотрег/дм3; К – удельная биосинтетическая активность, г/г⋅ч; Ссах –концентрация сахара в пита- бления и увеличению себестоимости продукции. На
основании анализа экспериментальных данных рис. 1
тельной среде
На
78
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
можно заключить, что концентрация сахара в питательной среде должна находиться на уровне 13,0–
13,5 %.
В качестве примера на рис. 2 представлены результаты биосинтеза L-лейцина продуцентом
Corynebacterium glutamicum AC-L, когда в качестве
источника углеродного питания в составе питательной среды использовали мелассу. Меласса является
отходом производства сахара-песка, содержит до 60 %
сахарозы, имеет относительно низкую стоимость.
Из рис. 2 видно, что при использовании в составе питательной среды мелассы, максимальная концентрация �������������������������������������
L������������������������������������
-лейцина, полученная в процессе биосинтеза в КЖ, составляла не более 10 г/л целевой Рис. 2. Результаты биосинтеза L�����������������
������������������
-лейцина на питааминокислоты. Низкая концентрация целевого про- тельных средах, содержащих мелассу: РВ – содердукта в КЖ, скорее всего, является следствием со- жание редуцирующих веществ мелассы в питательной среде, %
держания в мелассе ингибирующих веществ (например, меланоидинов), что препятствует накоплению L-лейцина в ферментационной среде.
На основании вышеизложенного в качестве источника углеродного питания для роста
Corynebacterium glutamicum AC������������������������������������������������������������
-�����������������������������������������������������������
L����������������������������������������������������������
и биосинтеза продуцентом ��������������������������������
L�������������������������������
-лейцина в составе исходной питательной среды было предложено использовать сахар-песок в концентрации 13,0−13,5 %.
Влияние концентрации азота на биосинтез L��������������������������������������������
���������������������������������������������
-лейцина продуцентом �����������������������
Corynebacterium��������
glutam�������
icum AC-L. В качестве критерия оценки влияния различных источников минерального азота на
культивирование продуцента ������������������������������������������������������������
L�����������������������������������������������������������
-лейцина использовали концентрацию аммонийного азота, которую варьировали в составе питательной среды в пределах концентраций 0,1–1,0 %.
Полученные данные представлены в табл. 1.
ак
ад
Т а б л и ц а 1. Влияние концентраций аммонийного азота различных источников на рост продуцента
Corynebacterium glutamicum AC-L и биосинтеза L-лейцина
Источники и концентрация аммонийного азота в питательной среде, %
Показатель биосинтеза L-лейцина
3
0,25
0,50
11,0
15,0 16,5
21,0−22,4
11,5 12,7
8,5
0,75
(NH4)2HPO4
NH4Cl
1,0
0,25
0,50
0,75
16,0
11,0
12,3
8,5
12,0 13,5
21,0−22,4
9,2 10,4
1,0
0,25
0,50
0,75
13,5
10,0
10,4
7,7
13,5 14,5
21,0−22,4
10,4 11,1
1,0
14,0
10,7
ая
Концентрация L-лейцина в КЖ, г/дм
Биомасса продуцента в КЖ, г/дм3
Конверсия сахара в лейцин, %
(NH4)2SO4
На
ци
он
ал
ьн
Анализ экспериментальных данных показывает, что наиболее эффективным источником
азота в составе питательных сред, предназначенных для культивирования продуцента L-лейцина,
является сернокислый аммоний, концентрация которого должна находиться в пределах 0,75−1,0 %
в пересчете на содержание в среде аммонийного азота.
Влияние концентраций источников магния, калия, фосфора и серы на биосинтез L-лейцина
продуцентом Corynebacterium glutamicum AC-L. Магний и калий являются неорганическими кофакторами для многих ферментативных реакций, в том числе для реакций с участием АТФ, так
как участвуют в связывании ферментов с субстратами. Калий и магний требуются для обеспечения нормальной жизнедеятельности микроорганизмов в относительно больших количествах,
поэтому их соли всегда включают в состав питательных сред [9].
Сера входит в состав белков (в аминокислотах цистеин и метионин), некоторых коферментов,
например СоА, и карбоксилазы. Фосфор необходим для построения нуклеиновых кислот, фосфолипидов и коферментов.
В табл. 2 представлены результаты исследования процессов биосинтеза L���������������
����������������
-лейцина продуцентом Corynebacterium glutamicum AC-L, в которых были использованы питательные среды,
содержащие аммонийный азот в концентрации 0,75 %. Концентрацию фосфора варьировали
79
ус
и
в интервале 0,02–0,06 %, магния – 0,0014–0,011 %, калия – 0,025–0,075 %. Концентрация серы в составе питательной среды оставалась практически без изменений за счет использования сульфата
аммония и сульфата магния и находилась на уровне 0,43 %.
ар
Т а б л и ц а 2. Влияние концентраций калия, магния и фосфора на рост продуцента Corynebacterium glutamicum
AC-L и биосинтез L-лейцина
магний
калий
максимальная биомасса продуцента
в ферментационной среде
0,20
0,40
0,60
0,40
0,40
0,40
0,40
0,40
0,055
0,055
0,055
0,014
0,027
0,055
0,082
0,11
0,25
0,50
0,75
0,50
0,50
0,50
0,50
0,50
21,5
22,4
22,2
19,6
20,8
22,4
22,8
22,4
L-лейцин
в ферментационной среде
ау
кБ
фосфор
ел
Концентрация, г/дм3
15,0
17,5
17,0
14,0
16,5
17,5
17,0
17,5
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Анализ экспериментальных данных (табл. 2) свидетельствует о том, что оптимальные концентрации анализируемых соединений, которые обеспечивают максимальное накопление биомассы продуцента в КЖ и максимальную концентрацию L-лейцина в ферментационной среде,
составляют для фосфора – 0,04 %, для калия – 0,0055 %. Содержание серы при указанных концентрациях микроэлементов находится на уровне 0,43 %.
Влияние ростовых факторов на культивирование продуцента L-лейцина Corynebacterium
glutamicum AC-L. Штамм-продуцент L-лейцина Corynebacterium glutamicum AC����������������
������������������
-���������������
L��������������
является ауксотрофным мутантом по биотину и тиамину. Известно, что концентрация биотина и тиамина
в питательной среде может оказывать существенное влияние на рост и продукцию целевой аминокислоты ауксотрофными мутантами по указанным витаминам [10, 11].
В табл. 3 приведены данные по выращиванию продуцента L-лейцина C. glutamicum АС-L
и биосинтезу данным штаммом целевой и сопутствующих аминокислот в зависимости от концентрации биотина и тиамина в составе питательной среды.
Анализ экспериментальных данных, представленных в табл. 3, показывает, что концентрация биотина и тиамина в питательной среде оказывает влияние на рост продуцента и биосинтез
L-лейцина. Оптимальное содержание витаминов в составе питательных сред находится в интервале 0,5−0,75 мг/дм3 для дестиобиотина и 1,0−1,5 мг/дм3 для тиамин хлорида. Снижение или
увеличение их концентрации в большую или меньшую сторону от указанных пределов приводили к недостаточно высокому уровню накопления биомассы штамма-продуцента и уменьшению концентрации L-лейцина в КЖ. Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том,
что концентрация в питательной среде биотина и тиамина не влияет на биосинтез продуцентом
L-лейцина сопутствующих аминокислот.
ал
Т а б л и ц а 3. Зависимость накопления биомассы продуцента L-лейцина C. glutamicum АС-L, биосинтеза
целевой и сопутствующих аминокислот от содержания в питательной среде дестиобиотина и тиаминхлорида
Концентрация витаминов, мг/дм3
Тиамин хлорид
0,125
0,25
0,50
0,75
1,5
0,25
0,50
0,75
1,5
3,0
ци
он
Дестиобиотин
На
80
Концентрация аминокислот, г/дм3
Содержание биомассы
продуцента, г/дм3
Leu
Ile
Ala
Val
Glu
Lys
17,5
20,0
25,8
25,0
23,5
15,5
18,0
21,0
19,5
17,0
0,77
0,72
0,84
0,72
0,75
6,30
3,17
1,95
1,31
0,93
0,88
0,96
0,73
0,96
0,81
1,91
3,03
5,45
7,20
8,19
4,19
3,61
3,52
3,66
4,41
ус
и
ел
ар
Заключение. Проведена оценка влияния основных компонентов питательной среды на накопление биомассы и биосинтез L-лейцина продуцентом Corynebacterium glutamicum AC-L.
Показано, что в составе питательной среды для культивирования продуцента наиболее целесообразно использовать в качестве источника углеродного питания сахар-песок. Определены источники, а также оптимальные концентрации аммонийного азота, микроэлементов, биотина
и тиамина в составе питательной среды.
Полученные данные могут быть использованы для усовершенствования технологического
процесса биосинтеза L-лейцина с использованием продуцента Corynebacterium glutamicum AC-L.
Литература
ем
ия
н
ау
кБ
1. S h i g e r i N., H a j i m u M., F u m i s h i r o I. // Arg. Boil. Chem. 1972. Vol.46, N 2. P. 487–491.
2. F u m i s h i r o I., I o s u h i k o I., S h i n i j i O. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1967. Vol. 3, N 4. P. 234–242.
3. C h i b a t a I., T o s a T., S a t o T. Eur. patent appl. № 0076516А26, 1983.
4. N a k a n i s h i Y., K i s h i m o t o A., N i s h i y a m a K. et. al. Eur. patent appl. № 0098122, 1984.
5. A k a s h i K., S h i b a i H., H i r o s i Y. // Agr. And Biolog. Chem. 1979. Vol.43, N 10. P. 2087–2092.
6. З у р а б я н А. С., Б о с е н к о А. М., К а р а б е к о в В. Т. // Аминокислоты и их производные: междунар.
науч.-техн. конф. Гродно, 23–25 октября 1996 г. Гродно, 1996. C. 52.
7. Ф е р м а н Г. И., Ш о й х е т М. К. Химико-технологический контроль спиртового и ликеро-водочного производства. М., 1975.
8. М а з о Г. Н. // Соросов. образоват. журн. 2000. Т.6, № 7. С. 31–34.
9. М о с и ч е в Н. С., С к л а д н е в А. А., К о т о в В. Б. Общая технология микробиологических производств.
М., 1982.
10. Я к и м о в и ч М. Н., Я к и м о в и ч Н. Н., М а к с и м о в а Н. П. / / Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук.
2006. № 2. С. 105–110.
11. Методы селекции и свойства штаммов микроорганизмов-продуцентов аминокислот. М., ОНТИТЭ Имикробиопром,
1985.
V. N. GRIN’KO, N. N. YAKIMOVICH, A. A. BILDYUKEVICH, I. V. YAKIMOVICH
ак
ад
INFLUENCE OF STRUCTURES OF A NUTRIENT MEDIUM ON BIOSYNTHESIS L-LEYCINE BY CULTURE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM AC-L
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
The effect of concentrations of major components of nutrient medium on growth and leucine production ability of the
bacterial producer strain Corynebacterium glutamicum AC-L to optimize the biosynthesis of L-leucine has been studed.
The data obtained can be used to improve the process of biosynthesis of L-leucine using a producer Corynebacterium
glutamicum AC-L.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 578.22:577.29
ел
Т. В. РОМАНОВСКАЯ 1, И. Н. СЕВЕРИН 2, С. М. КОСМАЧЕВА2,
М. П. ПОТАПНЕВ 2, В. В. ГРИНЕВ 1
кБ
РАЗРАБОТКА НОВОГО ЛЕНТИВИРУСНОГО ВЕКТОРА ДОСТАВКИ
ДЛЯ ЭКТОПИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО ИНСУЛИНА
В МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
Белорусский государственный университет, Минск, е-mail: romanovskaya.t@mail.ru,
Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии, Минск
1
ау
2
(Поступила в редакцию 4.11.2010)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Около 2 % населения Республики Беларусь страдают сахарным диабетом, причем около 10 % из них составляют пациенты с инсулин-зависимой формой заболевания. В настоящее время ключевым способом коррекции уровня глюкозы у таких пациентов является
заместительная инсулинотерапия. Альтернативная перспектива может быть связана с использованием стволовых клеток человека в сочетании с генно-инженерными методами [1, 2].
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) красного костного мозга человека представляют
собой достаточно легко получаемый и культивируемый в условиях лаборатории тип клеток.
Они могут быть подвергнуты генетической модификации и последующей аутологичной трансплантации в организм пациента [3].
Молекула препроинсулина – продукт гена ins человека представляет собой белок, состоящий из 110 аминокислот, в котором выделяют лидерный, или сигнальный, пептид длиной
24 аминокислоты, ��������������������������������������������������������������������������
B�������������������������������������������������������������������������
цепь (30 аминокислот), С пептид (31 аминокислота) и А цепь (21 аминокислота). В островковых клетках поджелудочной железы образование зрелого инсулина происходит в несколько этапов. Лидерный пептид отщепляется в процессе переноса белка в канальцы
эндоплазматической сети, в результате чего препроинсулин превращается в проинсулин. Затем
в аппарате Гольджи происходит образование зрелого инсулина. При этом молекула приобретает характерную третичную структуру с образованием трех дисульфидных связей между А и В
цепями, а С пептид вырезается при участии тканеспецифических прогормонконвертаз PC1
и ���������������������������������������������������������������������������������������
PC�������������������������������������������������������������������������������������
2 [4]. В неспециализированных клетках, каковыми являются и МСК, вероятнее всего, экспрессия прогормонконвертаз ������������������������������������������������������������
PC����������������������������������������������������������
1 и PC����������������������������������������������������
������������������������������������������������������
2 отсутствует либо недостаточна для того, чтобы обеспечить созревание инсулина. Для решения этой проблемы предлагается использование модифицированных вариантов гена инсулина человека [5].
Цель работы – разработка лентивирусного вектора для доставки в МСК искусственного гена,
кодирующего одноцепочечный аналог инсулина человека. Белок, образующийся при трансляции
мРНК такого гена после отщепления лидерного пептида, обладает свойствами зрелого гормона
без дополнительных ферментативных превращений.
Материалы и методы исследования. В работе были использованы клетки линии HEK
293Т эмбриональной почки человека как продуценты рекомбинантных лентивирусных частиц. Клетки инкубировали при температуре + 37 °С во влажной атмосфере с 5 % СО2 в полной среде ��������������������������������������������������������������������������
D�������������������������������������������������������������������������
-�����������������������������������������������������������������������
EM���������������������������������������������������������������������
(�������������������������������������������������������������������
Sigma��������������������������������������������������������������
-�������������������������������������������������������������
Aldrich������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������
Co���������������������������������������������������
., США), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich Co., США), 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4 ммоль/л L-глютамина
(Invitrogen, США), 4,5 г/л глюкозы, 1 ммоль/л пирувата натрия, 100 мкг/мл стрептомицина
и 100 ед/мл пенициллина.
На
82
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Получение и культивирование МСК осуществляли в соответствии с методикой, описанной
ранее [6]. Для трансдукции использовали МСК второго пассажа.
Гомогенизацию ткани поджелудочной железы осуществляли путем обработки ее раствором
коллагеназы Ia в концентрации 5 мг/мл при температуре + 37 °С на протяжении 40 мин при периодическом встряхивании. Далее проводили фракционирование полученного материала путем
центрифугирования в 11%-ном растворе фиколла при ускорении 800 g в течение 10 мин.
Верхнюю фракцию, обогащенную островковыми клетками, отбирали и использовали для выделения РНК. Тотальную клеточную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol® (Invitrogen,
США) в соответствии с рекомендациями производителя. Синтез кДНК на выделенной тотальной клеточной РНК проводили в реакции обратной транскрипции с использованием реагентов
фирмы Fermentas (UAB Fermentas, Литва) и рандомных гексамеров (ПРАЙМТЕХ, Беларусь).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной методике с использованием реагентов фирмы Fermentas (UAB Fermentas, Литва) и праймеров фирмы ПРАЙМТЕХ
(ПРАЙМТЕХ, Беларусь). Количественную ПЦР (ПЦР в реальном времени) выполняли с использованием набора реагентов Maxima™ SYBR® Green qPCR Master Mix фирмы Fermentas
(UAB Fermentas, Литва) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, а также
праймеров фирмы ПРАЙМТЕХ (ПРАЙМТЕХ, Беларусь). Последовательности праймеров
приведены в табл. 1. Учет полученных данных проводили на оборудовании Chromo4 фирмы
BioRad (США). Данные выражали в процентах относительно уровня экспрессии референсгена.
Т а б л и ц а 1. Праймеры для количественной оценки экспрессии генов
методом ПЦР в реальном времени
Анализируемый ген
gapdh
pcsk2
ins
Последовательность, 5′→3′
GAPDH_F
GAPDH_R
PCSK1_F
PCSK1_R
PCSK2_F
PCSK2_R
INS(A)_F
INS(A)_R
GCTGAGTACGTCGTGGAGTC
TCTCATGGTTCACACCCA
AATCACAAATGCGGGGT
TCAATAGCATCCGTCACAAT
GGAAAGGTGTTACCATTGGA
TGAAGTCGTAACTTGCTTCG
GGGGAACGAGGCTTCTTCTA
GTTCCACAATGCCACGCT
ак
ад
pcsk1
Название праймера
На
ци
он
ал
ьн
ая
Рестрикцию плазмидной ДНК и лигирование фрагментов выполняли с использованием реагентов фирмы Fermentas (����������������������������������������������������������������
UAB�������������������������������������������������������������
Fermentas, Литва). Электрофоретический анализ ДНК – по стандартной схеме, приведенной в руководстве Т. Маниатис и др. [7]. Агарозные гели готовили на
основе ТАЕ-буфера с бромистым этидием.
Для секвенирования использовали набор реагентов CycleReaderTM Auto DNA Sequencing Kit
фирмы Fermentas�������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������������
(�����������������������������������������������������������������������
UAB��������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������
Fermentas����������������������������������������������������������
, Литва) в точном соответствии с рекомендациями производителя.
����������������������������������������������������
-1 �����������������������������������������������
blue�������������������������������������������
плазмидной ДНК осуществляли согласно станТрансформацию бактерий E. сoli XL��������������������������������������������������
дартной схеме [7]. Плазмидную ДНК выделяли с использованием щелочного лизиса [7].
Рекомбинантные лентивирусные частицы получали путем котрансфекции клеток линии
HEK 293Т лентивирусным вектором доставки и парой вспомогательных векторов pCMV_
dR8.91 и pMD2. G в соответствии с протоколом [8]. Определение титра полученных рекомбинантных лентивирусных частиц и трансдукция МСК проводили согласно описанным методикам [8, 9].
Результаты и их обсуждение. На первом этапе научно-исследовательской работы был проанализирован уровень экспрессии в МСК генов прогормонконвертаз PC�������������������������
���������������������������
1 и ���������������������
PC�������������������
2. Результаты количественной ПЦР, представленные в табл. 2, подтверждают исходное предположение о низкой
экспрессии данных генов в МСК. Следовательно, эктопическая экспрессия в МСК гена, кодирующего препроинсулин дикого типа, не может приводить к продукции модифицированными
83
ус
и
клетками зрелой формы гормона. Решением указанной проблемы может быть использование искусственного гена, кодирующего одноцепочечный преинсулин, созревание которого не требует
участия указанных ферментов.
МСК
Островки ПЖ
100
0–0,003
0
0,2–0,3
100
3910
127
8225
кБ
gapdh
pcsk1
pcsk2
ins
ел
Уровень экспрессии (в % относительно гена gapdh)
Ген
ар
Т а б л и ц а 2. Уровень экспрессии генов прогормонконвертаз и гена инсулина
в МСК костного мозга и в островковых клетках поджелудочной железы человека
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Принципиальная возможность создания одноцепочечных функционально активных форм
инсулина была показана ранее авторами ряда зарубежных публикаций [10, 11]. В данной работе
за основу был взят вариант, показанный на рис. 1, А, предлагаемый [11], в котором С-пептид проинсулина заменен на гексапептид (на рис. 1, А он выделен рамкой), а также имеются еще несколько аминокислотных замен, предназначенных для повышения термодинамической стабильности
третичной структуры белка (замены на рисунке выделены подчеркиванием).
Нами были разработаны перекрывающиеся олигонуклеотиды, которые позволили синтезировать с помощью ПЦР нуклеотидную последовательность единицы транскрипции модифицированного гена инсулина, включающую, кроме части, кодирующей зрелый одноцепочечный инсулин, также участки, соответствующие 5′- и 3′-нетранслируемым регионам РНК гена инсулина
дикого типа (за исключением сайта полиаденилирования) и участок, кодирующий лидерный
пептид преинсулина человека, необходимый для транспортировки зрелого белка в канальцы эндоплазматической сети. Последовательности олигонуклеотидов приведены в табл. 3. Схема
и этапы синтеза требуемого фрагмента показаны на рис. 1.
Рис. 1. Синтез последовательности модифицированного гена инсулина человека, кодирующей одноцепочечный
вариант гормона: А – аминокислотная последовательность одноцепочечного варианта инсулина, Б – схема синтеза,
В – электрофорез промежуточных и конечного продуктов ПЦР-синтеза. Дорожки 1–4 – продукты, соответствующие
второй–пятой стадиям синтеза. М – маркеры молекулярного веса фрагментов ДНК
На
84
ус
и
Т а б л и ц а 3. Олигонуклеотиды для ПЦР-синтеза модифицированного гена инсулина человека
Название
олигонуклеотида
SCI-57_F4
SCI-57_F5
SCI-57_R
ар
SCI-57_F3
ел
SCI-57_F2
AGGCGCGCCCTCCAGGACAGGCTGCATCAGAAGAGGCCATCAAGCAGATCACTGTCCTTCTGCC
TGGCCCTGTG
TGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGAC
CCAGCCGCAGC
TGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCAGATCTGGTGGAAGCTCTCTAC
CTAGTGTGCGGGGA
CTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACAGATCCTACCGGTGGTGGTCCGCGTCGT
GGCATTGTGGA
CGTCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTCATAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTG
CAACTAGACGCA
TGGATCCATCTCTCTCGGTGCAGGAGGCGGCGGGTGTGGGGCTGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTT
GCAGTAGTTCTC
кБ
SCI-57_F1
Нуклеотидная последовательность, 5′→3′
ау
П р и м е ч а н и е. Серым цветом выделены области перекрывания олигонуклеотидов.
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Конечный продукт амплификации был клонирован в составе промежуточного плазмидного
Т-вектора pTZ57R/T и секвенирован. В дальнейшем синтезированная последовательность
была переклонирована из промежуточного плазмидного вектора в лентивирусный вектор
pHR-SINcPPT-SIEW по сайтам распознавания для рестриктаз AscI и BamHI. В лентивирусном
векторе pHR����������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������
-���������������������������������������������������������������������������
SINcPPT��������������������������������������������������������������������
-�������������������������������������������������������������������
SIEW���������������������������������������������������������������
сайты для этих рестриктаз уникальны и располагаются в полилинкере вектора между внутренним промотором PSFFV от вируса Френды и участком внутренней
посадки рибосомы IRES от вируса энцефаломиокардита (рис. 2). Клонирование по этим сайтам
новой единицы транскрипции позволило создать новый бицистронный лентивирусный вектор,
названный pHR-hSCI, одновременно кодирующий целевой продукт – одноцепочечный инсулин
и репортерный белок eGFP. Схема той части нового вектора, которая должна запаковываться
в рекомбинантные лентивирусы и переноситься в целевые клетки, показана на рис. 3.
В дальнейшем рекомбинантные лентивирусы, полученные на основе вектора pHR-hSCI,
использовались для трансдукции ��������������
МСК при множественности инфекции (МИ) 5, 10 и/или 20. Пересев
клеток и оценка их жизнеспособности, а также
определение процентного содержания клеток, положительных по репортерному белку ��������������
eGFP����������
, проводились на 3, 10, 17 и 24-е сутки после завершения
процедуры трансдукции. Эффективность трансдукции, оцениваемая методом проточной цитофлуориметрии, для разных вариантов опыта представлена
в табл. 4. Поскольку даже при МИ 5 эффективность
трансдукции на 3-е сутки превышала 90 %, то для
всех дальнейших исследований был выбран именно
этот вариант МИ. Было обнаружено, что трансдуцированные МСК красного костного мозга человека успешно растут и пролиферируют на протяжении всего периода культивирования (данные не
Рис. 2. Карта вектора pHR-SINcPPT-SIEW
представлены). Кроме того, было установлено, что
На
Рис. 3. Структура запаковываемой в лентивирусные частицы области лентивирусного вектора доставки pHR-hSCI
85
ус
и
процентное содержание клеток, продуцирующих репортерный белок ������������������������
eGFP��������������������
, существенно не меняется на протяжении 24 сут, что говорит о стабильности наследования переносимой генетической конструкции (см. табл. 4).
10
17
24
Доля клеток, продуцирующих eGFP, %
5
10
20
5
5
5
90,57
91,08
93,02
91,37
92,67
91,04
ел
3
МИ
кБ
Время после трансдукции, сут
ар
Т а б л и ц а 4. Анализ эффективности трансдукции МСК
красного костного мозга человека рекомбинантными лентивирусами
и стабильности наследования трансгенов
ем
ия
н
ау
Наконец, на последнем этапе научно-исследовательской работы проводилась количественная
оценка эктопической экспрессии гена одноцепочечного инсулина на уровне РНК. Для этого из
модифицированных МСК была выделена РНК, на ее матрице синтезирована кДНК, которая далее была использована для количественной ПЦР. Результаты анализа приведены в табл. 5. Видно,
что в трансдуцированных клетках содержание РНК транскриптов гена одноцепочечного инсулина
в 200–300 раз выше, чем в контрольных (нетрансдуцированных), но в 10 раз ниже, чем в островковых клетках поджелудочной железы, где уровень экспрессии гена ins примерно в 80 раз превышает уровень экспрессии гена gapdh (см. табл. 2).
Т а б л и ц а 5. Уровень эктопической экспрессии гена инсулина
в МСК красного костного мозга человека
Время после
трансдукции,
сут
24
Уровень эктопической экспрессии гена
инсулина (в % относительно гена gapdh)
Трансдуцированные
Нетрансдуцированные
Трансдуцированные
Нетрансдуцированные
74,8
0,3
66,6
0,2
ак
ад
10
Анализируемые
клетки
ци
он
ал
ьн
ая
Заключение. Нами был создан модифицированный ген инсулина, кодирующий одноцепочечную форму инсулина человека, и разработан новый лентивирусный вектор pHR-hSCI для
доставки этого гена в МСК костного мозга человека. Трансдуцирующие вирусные частицы, полученные на основе данного вектора, позволяет с высокой эффективностью переносить генетическую конструкцию в целевые клетки, в которых после трансдукции наблюдается высокая
и стабильная эктопическая экспрессия сконструированного гена одноцепочечного преинсулина.
Эта работа получила финансовую поддержку со стороны Министерства здравоохранения
Республики Беларусь (грант № 299/54). Авторы благодарны D. Trono (лаборатория вирусологии
и генетики Федеральной политехнической школы г. Лозанна, Швейцария), ������������������������
M�����������������������
. Scherr���������������
���������������������
(отдел гематологии, гемостаза и онкологии Медицинской школы г. Ганновер, Германия) и O. Heidenreich
(Северный научно-исследовательский институт рака при Университете г. Ньюкасл, Великобритания)
за предоставленные базовые векторы.
Литература
1. G i a n n o u k a k i s N., T r u c c o M. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. Vol. 7, N 5. P. 467–475.
2. L e e D. D., G r o s s m a n E., C h o n g A. S. // Horm. Metab. Res. 2008. Vol. 40, N 2. P. 147–154.
3. P o r a d a C. D., Z a n j a n i E. D., A l m e i d a - P o r a d G. // Stem. Cell Res. Ther. 2006. Vol. 1, N 3. P. 365–369.
4. K a u f m a n n J. E., I r m i n g e r J. - C., H a l b a n P. A. // Biochem. J. 1995. Vol. 310. P. 869–874.
5. Y o o n J. - W., J u n H. - S. // Trend. Mol. Med. 2002. Vol. 8. P. 62–68.
На
86
ус
и
ар
6. K o s m a c h e v a S. M., S e v i a r y n I. N., G o n c h a r o v a N. V. et al. // Bulletin of Experimental Biology and
Medicine. 2011. DOI: 10.1007/s10517-011-1276-1.
7. М а н и а т и с Т., Ф р и ч Э., С э м б р у к Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.
8. C o c k r e l l A. S., K a f r i T. // Mol. Biotechnol. 2007. Vol. 36, N 3.P. 184–204.
9. D a m m e A. V., T h o r r e z L., M a L., V a n d e n b u r g h H. et al. // Stem Cell. 2006. Vol. 24. P. 896–907.
10. L e e H. C., K i m S.- J., K i m K. - S. et al. // Nature. 2000. Vol. 408, P. 483–488.
11. H u a Q. - X., N a k a g a w a S. H., J i a W. et al. // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, P. 14703–14716.
ел
T. V. RAMANOUSKAYA, I. N. SEVERIN, S. M. KOSMACHEVА, M. P. POTAPNEV, V. V. GRINEV
Summary
кБ
DEVELOPMENT OF NEW LENTIVIRAL TRANSFER VECTOR FOR ECTOPIC EXPRESSION
OF SINGLE-CHAIN INSULIN-CODING GENE IN HUMAN MESENCHIMAL STEM CELLS
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
An actual problem nowadays is increasing frequency of diabetes mellitus. The technology of stem cells as well as genetic
engineering methods being combined open new perspectives for therapy of this disease. We have developed new lentiviral
transfer vector pHR-hPPI carrying human single-chain insulin gene under control of constitutive promoter. The vector was
used for transduction of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. More than 90 % of transduced cells were
stably expressing eGFP reporter protein during 24 days. The quantitative PCR analysis showed that insulin gene transcripts
number was 200–300 times more in transduced cells comparing to nontransduced cells, but still 10 times less comparing
to pancreatic islet cells.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 612.014.4:591.465]-074
ел
Т. Э. ВЛАДИМИРСКАЯ, И. А. ШВЕД, С. Г. КРИВОРОТ,
Н. Н. ВЕЯЛКИНА, А. В. АДАМОВИЧ
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
кБ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАЗ ЭСТРАЛЬНОГО ЦИКЛА БЕЛЫХ КРЫС
ПО КЛЕТОЧНОМУ СОСТАВУ ВЛАГАЛИЩНЫХ МАЗКОВ
Белорусская медицинская академия последипломного образования,
Минск, e-mail: naumenko. sveta@mail. ru
ау
(Поступила в редакцию 26.08.2010)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. В настоящее время значительное количество научных исследований посвящено
изучению морфофункционального состояния женской репродуктивной системы. Поэтому во
время доклинических испытаний безопасности лекарственных препаратов и химических веществ многие исследователи сталкиваются с необходимостью изучения репродуктивной функции самок экспериментальных животных. Наибольшую научную и практическую ценность
представляют работы, в которых учтены особенности физиологии репродукции и использован
комплексный подход, включающий физиологические и морфологические методики [1,2].
Оптимальными экспериментальными животными являются мышевидные грызуны как полиэстричные животные со спонтанным типом овуляции. В среднем продолжительность эстрального цикла у самок крыс, отсаженных от самцов, составляет шесть-семь дней. Такая особенность
цикла делает крыс удобным объектом для исследования изменений, происходящих в течение
репродуктивного цикла [3].
С наступлением половой зрелости в половых органах самок животных происходят циклические изменения. Репродуктивный период завершается развитием половых органов, дифференцировкой вторичных половых признаков, у самок устанавливаются половые циклы. У животных
половой цикл подразделяется на сексуальный период и период покоя. Сексуальный период
наступает с появлением течки и возникновением у животных охоты. В связи с этим успешный
результат случки (копуляции) и само оплодотворение имеют место лишь тогда, когда встреча
половозрелых животных происходит в период собственно течки, или, пользуясь принятой терминологией, эструса, в момент овуляции – выбрасывания яйцеклеток из зрелых фолликулов [4].
Эстральный цикл (ЭЦ) представляет собой периодически повторяющиеся изменения во влагалище половозрелых самок млекопитающих (исключая приматов), соответствующие циклическим процессам в яичниках, яйцеводах и матке. ЭЦ зависит от эндокринной функции яичников
и у различных видов животных длительность его варьирует. В течение этого периода выделяют
4 стадии (диэструс, проэструс, эструс, метэструс), каждая их которых характеризуется определенной функцией и морфологическим состоянием слизистой влагалища и его гладкомышечной
оболочки. Диэструс (межтечка) – это стадия покоя вагинального эпителия, обусловленная низким уровнем эстрогенов в организме; на нее падает около половины продолжительности ЭЦ.
Переход яичника в фолликулярную фазу овариального цикла служит сигналом к началу нового
ЭЦ и переходу от диэструса в проэструс. Проэструс (предтечка), продолжающийся около 12 ч,
совпадает с наиболее высоким уровнем секреции эстрогенов созревающими фолликулами яичника и характеризуется гипертрофией и гиперплазией эпителиальных клеток влагалища и последующим отторжением клеток, секретирующих слизь. Эструс, или собственно течка (длительность около 27 ч), сопровождается максимально выраженным созреванием эпителиальных
клеток (ЭПК), их расслоением и образованием чешуйчатого слоя; период течки и конец предтеч-
На
88
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ки сочетается с активацией полового поведения и по времени примерно совпадает с овуляцией.
Наличие большого количества ороговевших клеток в мазках является отражением эстрогенной
активности. На стадии метэструса (послетечки), длящейся около 6 ч, происходит резкое снижение функциональной активности вагинального эпителия, отторжение базального слоя клеток,
а также формирование клеток желтого тела и начало секреции прогестинов [5].
Так как каждой фазе полового цикла характерен свой клеточный состав, то о стадии полового цикла и функции яичников можно судить по влагалищным мазкам. Исследование мазков
и определения фазы ЭЦ основано на изучении соотношения между тремя типами клеток, выявляемых в мазке: эпителиоцитами, ороговевшими клетками и лейкоцитами. При этом периоды
диэструса и эструса отличаются четкими поведенческими особенностями у крыс, в связи с тем,
что течка у млекопитающих является наиболее ярким признаком наличия цикла, было общепринято считать ее первой стадией ЭЦ [6].
Целью данной работы являлось исследование анализа клеточного состава влагалищных мазков для оценки характера течения полового цикла белых крыс.
Материалы и методы исследования. Были использованы беспородные половозрелые белые
крысы линии Вистар (n = 50), достигшие 4–5-месячного возраста, весом 200–300 г. Животные находились в стационарных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Во время
эксперимента проводилось наблюдение за состоянием и поведением экспериментальных животных. Все процедуры были выполнены в соответствии с требованиями технического кодекса
установившейся практики [7].
В течение месяца у всех животных в утренние часы с 9.30 до 10.30 получали влагалищные
мазки. Для более детального анализа использовали окраску по Романовскому, однако при рутинной работе достаточно использовать метод Леффлера [8, 9]. О фазе цикла судили по соотношению различных типов клеток в мазке. Таким образом, было исследовано 5 последовательных
половых циклов. Животных с нарушенным циклом из опыта исключали.
Для получения влагалищных мазков использовали ватные тампоны, которые осторожно вводили во влагалище крыс на глубину 5–6 мм (рис. 1, А). Затем влагалищные выделения наносились
тонким мазком на промаркированное предметное стекло (рис. 1, Б) и высушивались на воздухе.
Цитологическое исследование окрашенных мазков проводилось в световом микроскопе на
увеличении х100 – для оценки общей картины мазка, х200 или х400 – для идентификации типов
клеток влагалищного эпителия и анализа пропорции между обнаруженными клетками, на х1000
оценивали состояние микрофлоры.
В зависимости от выбранной методики результат окраски мазков был следующим:
Окраска препарата по Романовскому: цитоплазма эпителиальных клеток – в голубоватый
или красноватый цвет, ядра – в синий цвет, «чешуйки» – в синий цвет разной интенсивности,
ядра лейкоцитов – от темно-бордового до почти фиолетового цвета.
Окраска метиленовым синим по Леффлеру: цитоплазма – в голубой цвет разной интенсивности, ядра клеток окрашены в синий цвет, «чешуйки» окрашены в голубой цвет либо не
окрашены.
На
Рис. 1. Приготовление мазка: использование ватного тампона при взятии мазка (А), приготовленный мазок (Б)
89
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Результаты и их обсуждение. В течение всего периода наблюдения внешний вид, состояние
шерстяного покрова, кожи и видимых слизистых оболочек, а также двигательная активность исследуемых животных не были измены. Во время приручения отмечено снижение настороженности, пугливости и агрессивной реакции со стороны животных в ответ на проводимые манипуляции.
Цитологическая картина в течение диэструса представлена в большом количестве густой
слизью и умеренным количеством низкодифференцированных эпителиальных клеток (базальным
и парабазальным эпителием) (рис. 2, А). В мазках на протяжении всей стадии фазы инфильтрации лейкоцитами чередуются с отсутствием таковой в ткани влагалищного эпителия. К концу
диэструса может наблюдаться раннее ороговение ЭПК, при этом ороговевшие клетки смешаны
с лейкоцитами и большими, раздувшимися ядерными ЭПК.
При переходе диэструса к раннему проэструсу слизь становится более водянистой, но скудной, отмечено появление во влагалищных мазках большого количества базальных (12–25 мкм
в диаметре) и парабазальных (18–36 мкм) ЭПК, ладьевидной формы, с изогнутыми краями
(рис. 2, Б). В начале проэструса в мазке наблюдаются округлые или овальные парабазальные
ЭПК с четкими границами. Ядра с нежным тонкоплетистым или мелкозернистым хроматином,
цитоплазма резко базофильна. Присутствует водянистая слизь (рис. 2, В, Г).
В фазу проэструса происходит дальнейшее
созревание ЭПК и постепенно в мазке появляются промежуточные клетки (20–46 мкм),
сравнительно крупные, обычно полигональные. Ядра пузырьковидные, окру­глые с четкой
структурой хроматина. Цитоплазма может
быть эозинофильной, цианофильной, нередко
вакуолизирована. Более зрелые промежуточные клетки являются препикнотичными, характерна складчатость цитоплазмы. Такая
картина часто наблюдается во время переходного периода между проэструсом и эструсом.
Слизи практически нет (рис. 2, Д).
По мере созревания клетки поверхностного (функционального) слоя становятся крупными (в диаметре 30–50 мкм) и сглаженными,
полигональной формы, с пикнотичными ядрами или безъядерные, цитоплазма широкая,
светлая, наступает стадия эструса. В норме
в период эструса в мазке обнаруживаются типичные для этой стадии крупные отдельные
ороговевающие клетки (чешуйки). Оптима­
льным сроком для спаривания следует считать
тот день, когда в препарате влагалищного
мазка подавляющее большинство клеточных
элементов представлено чешуйками. Ближе
к концу эструса часто наблюдается скопление
чешуек в виде конгломератов. Встречаются
Рис. 2. Влагалищный мазок самки крысы: А – диэструс, единичные старые ЭПК с пикнотичным ядром
густая слизь и незрелые клетки; Б – начало проэструса,
1 – базальные, 2 – парабазальные клетки; В – выражен- (рис. 2, Е).
Хорошим показателем начала стадии меный проэструс; Г – парабазальные клетки; Д – переход
проэструса в эструс; Е – выраженный эструс, 3 – проме- тэструса служит нарастающее число лейкоцижуточная клетка с пикнотичным ядром; Ж, З, – выражен- тов. Во время нормального метэструса наблюный метэструс. Окрашивание по Романовскому, х100
дается большое количество парабазальных
(А, Б, В, Е, Ж), х200 (Д), х400 (Г, З)
ЭПК и лейкоцитов (рис. 2, Ж, З), изредка
На
90
ус
и
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
встречается небольшое количество светлых
ороговевающих элементов, оставшихся от
предыдущей стадии эструса.
Кроме того, прослеживается присутствие
бактерий (сравнительно толстых, крупных,
прямых или слегка изогнутых палочек разной
длины) в мазках, особенно в период эструса и
метэструса, которые покрывают клетки либо
свободно лежат между ними – это физиологиРис. 3. Нормальная микрофлора влагалищных мазков самческая флора (рис. 3, А, Б).
ки крысы в эструсе (А – окрашивание по Леффлеру, х1000),
Во влагалищных мазках некоторых самок
метэструсе (Б – окрашивание по Романовскому, х1000)
на стадиях диэструса либо раннего проэструса в большом количестве присутствовали эритроциты. Было отмечено, что дальнейшего развития эстрального цикла не наступало.
Заключение. Картина влагалищного мазка достаточно четко характеризует и отражает физиологическое состояние самки и ее готовность к спариванию, а также позволяет оценить характер и особенности нарушений фаз эстрального цикла.
Результаты проведенных цитологических исследований, наблюдение за животными и анализ
данных литературы позволили выделить особенности цитологической картины влагалищных
мазков у крыс в различные фазы эстрального цикла и сформулировать следующие рекомендации в проведении исследований:
При взятии мазка важно приучить животных к рукам экспериментатора, эта процедура безболезненна для крысы, как правило, животные очень быстро привыкают к этой манипуляции.
Самок лучше подсаживать в фазу позднего проэструса, спаривание животных происходит
нормально только в начале стадии эструса, что связано с активацией полового поведения самок
на фоне высокого уровня эстрогенов [10].
У крыс не должно наблюдаться кровянистых выделений во время полового цикла, поэтому
присутствие большого количества эритроцитов в мазке должно насторожить исследователя.
Литература
ал
ьн
ая
1. Б е с с а л о в а Е. Ю. // Клін. анат. та опер. хірургія. 2006. Т. 5, № 3. С. 85–90.
2. H a s c h e k W. M., R o u s s e a u x C. G., W a l l i g M. A. Handbook of Toxicologic Pathology. San Diego: Academic
Press, 2002.
3. K r i n k e G. J., B u l l o c k G., B u n t o n T. The Handbook of Experimental Animals: The Laboratory Rat. London:
Academic Press, 2000.
4. M a r c o n d e s F. K., B i a n c h i F. J., T a n n o A. P. // Braz. J. Biol. 2002. Vol. 62, N 4A. P. 609–614.
5. W e s t w o o d F. R. // Toxicologic Pathology. 2008. Vol. 36. P. 375–384.
6. H u b s c h e r C. H., B r o o k s D. L., J o h n s o n J. R. // Biotech. Histochem. 2005. Vol. 80. P. 79–87.
7. ТКП 125–2008 «Надлежащая лабораторная практика», утвержденный постановлением МЗ РБ № 56 от 28 марта 2008 г.
8. С а в и ч е в а А. М., С о к о л о в с к и й Е. В., Д о м е й к а М. Порядок проведения микроскопического исследования мазков из урогенитального тракта. СПб., 2007.
9. Ш а б а л о в а И. П., П о л о н с к а я Н. Ю. Основы клинической цитологической диагностики: учебное пособие. М., 2009.
10. К о н д р а т е н к о Е. И., Л о м т е в а Н. А. // Журн. высш. нерв. деят. 2003. Т. 53, № 3. С. 376–378.
T. E. VLADIMIRSKAYA, I. A. SHVED, S. G. KRYVOROT, N. N. VEYALKINA, A. V. ADAMOVICH
ци
он
DETERMINATION OF THE ESTROUS CYCLE PHASES OF WHITE RATS ACCORDING TO CELLULAR
MAKEUP OF VAGINAL SMEARS
Summary
На
Article is devoted research of the analysis of cellular structure vaginal smears for an estimation of character of a current
of a sexual cycle of white rats. Cytologic changes are resulted, distinctive for each stage of estrous cycle and features
of transition of one cycle phase in another are allocated.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 577.1+599:539.1.047
ел
А. С. дроздов, Д. В. ЧУМАКОВА, О. С. БОКУТЬ, Е. А. докучаева,
Е. И. КВАСЮК, С. Б. Бокуть
кБ
получение гликогемоглобинов человека а1а1 и а1а2
с использованием киназной системы saccharomyces cerevisiae
Международный государственный экологический университет им. А. Д. Сахарова,
Минск, e-mail: bokut_sergey@mail.by
ау
(Поступила в редакцию 24.02.2011)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Неферментативное гликозилирование белков является наиболее общим процессом пост-трансляционной модификации данных макромолекул, включая сывороточный альбумин [1], коллаген [2], тубулин [3], α-кристаллин [4], гемоглобин [5] и другие белки [6]. Суть этого
процесса заключается в способности различных соединений, имеющих карбонильные группы,
таких как глицериновый альдегид [7], ацетальдегид [8] и восстанавливающие сахара [9], реагировать с α- и/или ε-аминогруппами белков, в частности гемоглобина, как in vivo, так и in vitro
[7, 10–13]. Именно альдегидные свойства глюкозы и некоторых интермедиатов ее гликолитического распада в красных кровяных клетках являются причиной образования ряда минорных
гликоформ гемоглобина in vivo [9]. Эти минорные варианты основной формы гемоглобина человека HbA1, обозначенные HbA1a1, HbA1a2, HbA1b и HbA1C, отличаются своим суммарным зарядом,
что и отражает порядок их элюции при разделении на катионообменной смоле BioRex-70 [14].
Гемоглобин А1С представляет собой стабильный минорный вариант гемоглобина человека,
образующийся in vivo в результате неферментативной пост-трансляционной модификации HbA1
глюкозой не только по β-цепям, но и по α-цепям в тетрамерах гемопротеида, включая Nεбоковые цепи аминокислот [11, 15, 16]. Подобная модификация изменяет способность гемоглобина связывать аллостерические эффекторы, и, как следствие, Т-состояние гемоглобина А1С оказывается дестабилизированным [17]. Установлено, что HbA1C может принимать участие в эффективном генерировании активных форм кислорода, способных инициировать окислительный
стресс у больных диабетом. Кроме того, присутствие углеводного фрагмента в молекуле HbA1C
служит причиной появления ряда структурных особенностей, к которым относятся снижение
степени α-спирализованности, увеличение доступности триптофанилов для молекул воды, увеличение термолабильности и ослабление связи гем-глобин [18].
Присутствие ковалентно связанного с ε-аминогруппой Lys99 α1-субъединицы продукта
Амадори создает стерическое препятствие перемещению G-спирали в положение, характерное
для Т-состояния тетрамера [18], что затормаживает конформацию данного гемопротеида в Rи R2-состояниях [19].
Химическая природа модифицирующего фрагмента в гемоглобине A1b долгое время оставалась неизвестной. Только в 1991 г. появилось первое указание на то, что модифицирующим соединением в HbA1b является пировиноградная кислота [20]. Позже с помощью время-пролетной
масс-спектрометрии с ионизацией методом электрораспыления было доказано, что HbA1b действительно представляет собой тетрамеры гемоглобина, β-цепи которого модифицированы пировиноградной кислотой [21] и данную минорную форму гемоглобина следует рассматривать
в качестве белка-маркера болезни накопления гликогена I типа [21].
Минорные формы гликогемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2, являющиеся продуктами неферментативной модификации HbА1 по α-NH2-группам N-концевых валинов β-цепей тетрамерного бел-
На
92
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
ка фруктозо-1,6-дифосфатом и глюкозо-6-фосфатом соответственно [9, 14], из-за их низкого содержания в эритроцитах, менее доступны и малоизученны. Известно лишь, что HbA1a1 и HbA1a2
проявляют низкую аффинность к кислороду и обладают пониженной кооперативностью [22].
На основании данных ЭПР-спектроскопии гликовариантов HbA1a1 и HbA1a2 в нитрозоформе было
предположено, что фруктозо-1,6-дифосфат и глюкозо-6-фосфат выступают в роли ковалентно
присоединенных аллостерических эффекторов, что приводит к стабилизации четвертичной
структуры этих минорных форм гемоглобинов в Т-состоянии [23].
Для получения гемоглобинов A1C и A1b успешно используются методы инкубации HbА1
in vitro в растворах глюкозы [9, 24] или пировиноградной кислоты [25] соответственно. Минорные
формы гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2 теоретически также можно получить путем инкубации
in vitro очищенного HbА1 в растворах фруктозо-1,6-дифосфата и глюкозо-6-фосфата. Однако
указанные фосфаты сахаров являются весьма дорогостоящими реагентами и, кроме того, в водных растворах нестабильны.
Вместе с тем известно, что экстракты клеток пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae
обладают активной киназной системой, способной с высокой эффективностью трансформировать аденозин (Ado) в аденозин-5’-трифосфат (АТР) в присутствии глюкозы и неорганического
фосфата [26]. Поэтому одной из потенциальных возможностей получения HbA1a1 и HbA1a2 in vitro
может оказаться использование ферментов гликолиза S. cerevisiae в качестве инструмента для
синтеза фосфатов сахаров. Катаболизируя глюкозу в присутствии неорганического фосфата
и Ado, ферменты гликолиза в экстрактах клеток S. cerevisiae могут обеспечить образование соответствующих интермедиатов – глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата – и при оптимизации условий процесса возможно поддержание их концентрации в течение длительного периода
времени на уровне, достаточном для протекания реакции неферментативного гликозилирования
гемоглобина.
Цель данной работы – изучение возможности получения in vitro гликоформ HbA1a1 и HbA1a2
в системе генерирования синтеза АТР с использованием экстрактов, получаемых из высушенных клеток S. сеrevisiae.
Материалы и методы исследования. При выделении гемоглобинов использовали анионообменную DEAE-целлюлозу DE-52 Whatman (Великобритания) и катионообменную смолу
BioRex-70 Bio Rad (США).
Буферные растворы готовили на основе Tris Serva (Германия), KH2PO4 и KOH Fluka
(Швейцария) и HCl Merck (Германия). Компонентами дрожжевой киназной системы являлись
KH2PO4 и MgCl2 Fluka (Швейцария), глюкоза и Ado производства Fluka (Швейцария). Выход
АТР оценивали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol UV254 Merck
(Германия) или на пластинах TLC-Card Silica gel254 Fluka�������������������������������������
������������������������������������������
(Швейцария). Растворителями для проведения ТСХ служили диоксан Fluka (Швейцария) и водный раствор аммиака «Пять океанов»
(РБ). В качестве стандартов при проведении ТСХ использовали аденозин-5’-монофосфат (АМР),
аденозин-5’-дифосфат (ADP) Serva (Германия) и ATP Fluka (Швейцария).
Кровь здоровых взрослых доноров была любезно предоставлена ГУ РНПЦ «Мать и дитя».
Выделение гемоглобина HbA1 из лизатов эритроцитов осуществляли методом ионообменной
хроматографии с использованием DEAE-целлюлозы DE-52 [13].
Пекарские дрожжи, производства Минского дрожжевого комбината, измельчали и высушивали в суховоздушном термостате ТС-80М в течение суток при температуре 28–30 ºC. Вы­
сушенные клетки измельчали в ступке или в кофемолке до образования однородной пылеобразной
массы. Экстракт, обладающий АТР синтезирующей активностью, получали путем суспендирования высушенных клеток в 200 мМ калий-фосфатном буфере (КФБ), pH 7,0, содержащем 15 мM
MgCl2 и глюкозу при 23 °С. Реакцию синтеза АТР инициировали добавлением к экстракту аденозина в конечной концентрации 2 мг/мл. Эффективность реакции оценивали по накоплению
в реакционной смеси АТР методом ТСХ в системе растворителей диоксан–вода–аммиак как 6:6:1.
Идентификацию разделяемых компонентов реакционной смеси, включающей Ado, AMP, ADP
и ATP, осуществляли в УФ-свете с использованием лампы UV-240 Lamp фирмы Merck
(Германия).
93
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Гликоформы гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2 получали инкубированием лизата эритроцитов
человека или очищенного препарата гемоглобина HbA1 в 5%-ном экстракте дрожжевых клеток
в 200 мМ КФБ, pH 7,0, содержащем 15 мМ MgCl2 и 1%-ную глюкозу в течение примерно 40 ч при
28 °С (все последующие операции, связанные с выделением гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2, проводили при 4 °С).
Для разрушения нуклеиновых кислот реакционную смесь обрабатывали бычьей панкреатической дезоксирибонуклеазой I в 200 мМ КФБ, pH 7,0, содержащем 15 мM MgCl2 и 1%-ную глюкозу при комнатной температуре в течение 1 ч, смесь центрифугировали 10 мин при 10 000 g
и перед нанесением на колонку подвергали диализу против 50 мМ КФБ, рН 6,6 с использованием
диализных мешков MWCO 12–14000 Sigma-Aldrich (США).Выделение гемоглобинов HbA1a1
и HbA1a2 проводили с помощью жидкостного хроматографа низкого давления ÄKTAprime plus
«General Electric» (США) на колонке (1,6 × 40 см) с BioRex-70 предварительно уравновешенной
50 мМ КФБ, рН 6,6. Колонку элюировали в изократическом режиме этим же буфером. Фракции,
соответствующие пикам HbA1a1 и HbA1a2, собирали и концентрировали в ячейках для ультрафильтрации на мембранах Amicon типа YM-05 (44,5 мм) под давлением азота или в картриджах
для ультрафильтрации 10 000 MWN����������������������������������������������������
�������������������������������������������������������
���������������������������������������������������
Amersham�������������������������������������������
. Площади полученных пиков и их относительный процентный вклад рассчитывали с помощью функции ����������������������������������
Peak������������������������������
�����������������������������
Integration������������������
программного обеспечения хроматографа ÄKTAprime plus.
Концентрацию различных форм гемоглобинов в периферической крови и на всех стадиях
выделения и очистки определяли спектрофотометрически на приборах Cary 500 UV-VIS Varian
(США) или UV-VIS-2501 PС Shimadzu (Япония), используя для расчетов молярный коэффициент
поглощения, равный 13,8 мM–1 ·см–1 при 540 нм [27].
Все цифровые данные, представленные в статье, являются усредненными величинами из 4–5
измерений.
Результаты и их обсуждение. Известно, что суммарное содержание гемоглобинов HbA1a1
и HbA1a2 в красных кровяных клетках человека по различным данным составляет от 0,38–042 %
[14] до 1–2 % [9]. Для увеличения выхода данных гликоформ гемоглобина нами была использована реакция неферментативного гликозилирования как предварительно очищенного HbA1, так
и HbA1 в составе лизата эритроцитов в системе генерирования АТР с участием ферментов гликолиза экстрактов дрожжевых клеток in vitro.
При подборе оптимальных условий реакции синтез АТР проводили в течение 4 ч в присутствии различных концентраций глюкозы, высушенных клеток дрожжей и Ado������������
���������������
при комнатной температуре. Анализ временных зависимостей накопления АТР при различных
концентрациях глюкозы и дрожжевых клеток
в присутствии в инкубационной среде 2 мг/мл
Ado свидетельствует о том, что концентрация
АТР в реакционной смеси достигает максимума примерно через 1,5–2 ч после начала реакции, а затем несколько снижается (рис. 1).
Как следует из этого рисунка, увеличение
в инкубационной среде содержания глюкозы
до 2 % или дрожжевых клеток до 20 % приводит к ускорению реакции синтеза АТР на ее
начальном этапе (в течение первого часа). При
этом повышение концентрации глюкозы до
Рис. 1. Зависимость накопления АТР от времени в 200 мМ 2 % приводит не к пикообразному, а пролонКФБ, pH 7,0, содержащем 15 мМ MgCl2 и 2 мг/мл Ado при
гированному накоплению в системе АТР,
различных концентрациях глюкозы и дрожжевых клеток:
▬○▬ − 1%-ная глюкоза, 5%-ные клетки; ▬□▬ − 2%-ная о чем свидетельствует его сравнительно высоглюкоза, 5%-ные клетки; ▬∆▬ − 1%-ная глюкоза, кая концентрация в течение всего периода ин20%-ные клетки; t = 28 °C
кубации (рис. 1). Необходимо отметить, что
На
94
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
в синтезах с повышенным содержанием глюкозы
или клеток дрожжей в системе оставалось 20–25 %
непрореагировавшего Ado (данные не приведены).
Увеличение содержания Ado в инкубационной
среде до 3 мг/мл при фиксированных концентрациях глюкозы и дрожжевых клеток, составляющих 2 и 5 %, соответственно, приводит почти
к двукратному увеличению концентрации АТР,
которая достигает максимума через 3 ч после начала реакции (рис. 2). Уровень исходного аденозина в инкубационной среде падает до ∼4 %, что
свидетельствует о максимальном выходе АТР.
На основании полученных данных можно
предположить, что время активного функционирования АТР синтезирующей системы может быть
увеличено путем повышения в ней содержания
глюкозы и/или аденозина. Поскольку реакция неферментативного гликозилирования HbA1 проте- Рис. 2. Зависимость накопления АТР (▬○▬) и рас��������������������������������������
(▬□▬) от времени в процессе гликокает довольно медленно, то для увеличения выхо- ходования Ado�����������������������������������
литического распада глюкозы в 200 мМ КФБ, pH 7,0,
да минорных форм гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2 содержащем 15 мМ MgCl и 3 мг/мл �������������
Ado����������
в присут2
требуется подбор таких условий, которые позво- ствии 2%-ной глюкозы и 5%-ных
дрожжевых клеток;
лят длительное время поддерживать определенt = 28 °C
ный уровень гликозилирующих агентов – глюкозо6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата в среде инкубации. Таким образом, чем дольше относительно стабильно функционирует АТР генерирующая система, тем большее время в ней
поддерживается необходимая концентрация глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата, что
в присутствии в реакционной среде гемоглобина HbA1 должно обеспечить протекание реакции
его гликозилирования и увеличение конечного выхода минорных форм HbA1a1 и HbA1a2.
Следует отметить, что при сохраняющейся общей закономерности протекания процесса образования АТР его концентрация в инкубационной смеси существенно зависит от качества клеток S. cerevisiae и может изменяться в широких пределах.
Для поддержания постоянного уровня АТР в генерирующей системе в течение 40–50 ч,
необходимых для образования гемоглобинов
HbA1a1 и HbA1a2, в инкубационную среду, не
содержащую гемоглобина (рис. 3, кривая 1),
периодически добавляли Ado до концентрации 2 мг/мл (содержание Ado в реакционной
смеси контролировали методом ТСХ). Для
поддержания постоянного уровня глюкозы
в реакционную смесь вносили 2–2,5 мг моносахарида в среду инкубации объемом 10 мл
в промежутки времени, указанные стрелками
на рис. 3 (кривая 1). Более длительное проведение процесса оказалось мало эффективным,
очевидно, вследствие постепенной инактивации ферментов гликолиза в дрожжевых экстрактах.
Рис. 3. Временная зависимость изменения концентрации
Как видно из рис. 3, кривые накопления АТР в инкубационной среде, содержащей 200 мМ КФБ,
��������������������������
, 2 % глюкозы и дрожжеАТР в реакционной смеси от времени реакции pH 7,0, 15 мМ MgCl2, 2 мг/мл Ado�����������������������
вой экстракт в отсутствие (кривая 1) и в присутствии
как в отсутствие гемоглобина, так и в присут- HbA лизата эритроцитов (кривая 2). Стрелками показа1
ствии гемоглобина лизата эритроцитов имеют ны интервалы времени добавления в инкубационную
один и тот же характер, и ход кривых подсреду аденозина и глюкозы
95
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
тверждает пролонгированное функционирование АТР синтезирующей системы. Однако уровень
АТР в реакционной смеси, содержащей лизат эритроцитов, заметно ниже, чем в его отсутствие
(кривые 2 и 1 соответственно), что можно, вероятно, объяснить несколькими причинами. Одной
из них, как предполагалось ранее [28], является возможность расходования образующегося АТР
на фосфорилирование постоянно вносимых в реакционную среду новых порций глюкозы.
Увеличение концентрации глюкозы и соответственно глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6дифосфата, являющихся продуктами ее гликолитического распада, способствует интенсификации
реакции неферментативного гликозилирования HbA1, добавленного в инкубационную среду
в очищенном виде или в составе лизата эритроцитов. В свою очередь неферментативное гликозилирование HbA1 связывает часть фосфатов сахаров, снижая интенсивность гликоли­тического генерирования АТР, что и приводит к уменьшению концентрации аденозинтрифосфата
в реакционной среде. Наблюдаемое уменьшение молярной концентрации АТР в среде инкубации в присутствии лизата эритроцитов также может оказаться кажущимся вследствие разведения исходной реакционной смеси добавлением лизата эритроцитов.
Таким образом, можно утверждать, что высушенные клетки S. сеrevisiae способны поддерживать образование АТР на постоянном уровне в течение практически 2 сут, что одновременно
является свидетельством достаточно высокого и относительно постоянного образования в реакционной смеси глюкозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-дифосфата, необходимых для модификации
гемоглобина HbА1 с образованием соответствующих минорных форм HbA1a2 и HbA1a1.
Обработка реакционной смеси панкреатической дезоксирибонуклеазой и последующий диализ
позволяют в значительной степени избавиться от фрагментов деградации �����������������������
DNA��������������������
и других низкомолекулярных примесей, что подтверждается сильным падением оптической плотности при 260 нм
в растворе после диализа (не показано). Такая предварительная обработка реакционной смеси
перед выделением минорных форм гемоглобина на смоле BioRex-70 способствует уменьшению
нагрузки на колонку, что положительно влияет на процесс разделения гликовариантов гемоглобина.
На рис. 4 приведены результаты хроматографического выделения HbA1a1 и HbA1a2 из исходных лизатов эритроцитов (хроматограмма 1), из реакционной смеси, состоящей из АТР генери-
Рис. 4. Профиль элюции гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2 при их хроматографическом выделении на колонке с катионообменной смолой BioRex-70. Хроматограмма 1 – гемоглобины HbA1a1 и HbA1a2 лизата эритроцитов; 2 – гемоглобины
HbA1a1 и HbA1a2, образованные в реакционной смеси после совместной инкубации АТР генерирующей системы
и предварительно очищенного препарата HbA1; 3 – гемоглобины HbA1a1 и HbA1a2 из реакционной смеси после инкубации лизата эритроцитов в АТР генерирующей системе. Элюцию проводили в изократическом режиме 50 мМ КФБ
рН 6,6 со скоростью тока 0,2 мл/мин. Пики, соответствующие минорным гликовариантам гемоглобина HbA1a1
и HbA1a2, обозначены вертикальными стрелками
На
96
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
рующей системы и предварительно очищенного препарата HbA1 (хроматограмма 2), и из реакционной смеси, включающей киназную систему дрожжей и лизат эритроцитов (хроматограмма 3).
На первой стадии процедуры выделения колонку элюировали в изократическом режиме 50 мМ
КФБ, рН 6,6. В течение первых 250 мин хроматографирования элюировались субформы гликозилированного гемоглобина семейства HbA1а – HbA1a1 и HbA1a2 [14]. На второй стадии хроматографирования в результате элюции колонки прямым линейным градиентом NaCl (0–0,1 M) в 50 мM
КФБ, ������������������������������������������������������������������������������������
pH����������������������������������������������������������������������������������
6,6 с последующей промывкой колонки этим же буфером, содержащим 0,1 М �����������
NaCl�������
, получены фракции, содержащие формы HbA1b и HbA1С (не показано). При промывке колонки 50 мM
КФБ, pH 6,6, содержащим 1 М NaCl, элюируется основная форма гемоглобина человека HbA1.
Хотя использование описанных ранее классических условий выделения гликозилированных
вариантов гемоглобина человека [14] не позволило полностью разделить именно формы HbA1a1
и HbA1a2, полученные хроматограммы оказались пригодными для оценки процентного соотношения гемоглобинов HbA1a1, HbA1a2, HbA1b, HbA1С и HbA1 в реакционных смесях. Процентное
содержание указанных вариантов гемоглобина, рассчитанное с помощью функции Peak
Integration программного обеспечения хроматографа ÄKTAprime plus, представлено в таблице.
Как следует из таблицы, инкубирование предварительно очищенного HbA1 в дрожжевой системе генерирования АТР приводит к увеличению выхода гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2 в 7,34
и 4,76 раза. При инкубировании в дрожжевом экстракте лизата эритроцитов наблюдается увеличение выхода гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2 в 13 и 6,97 раз соответственно, по сравнению с выходом этих форм при их выделении из исходных лизатов эритроцитов.
Выход гемоглобинов HbA1a1, HbA1a2, HbA1b, HbA1С и HbA1, выделенных с помощью
ионообменной хроматографии на BioRex-70
Лизат эритроцитов
Формы
гемоглобина
Очищенный HbA1 + S. cerevisiae Лизат эритроцитов + S. cerevisiae
Содержание
форм Hb, %
Площадь
пиков,
mAu/мл
Содержание
форм Hb, %
Площадь
пиков,
mAu/мл
Содержание
форм Hb, %
5229,81
237,07
95,08 %
4,31 %
4235,71
284,82
90,42 %
6,08 %
4339,88
264,47
88,94 %
5,42 %
HbА1а1
12,66
0,23 %
79,17
1,69 %
145,78
2,99 %
HbА1а2
21,15
0,38 %
84,79
1,81 %
129,16
2,65 %
HbА1
HbA1b, HbA1С
ак
ад
Площадь
пиков,
mAu/мл
ьн
ая
Заключение. Cуммарный выход гемоглобинов HbA1a1 и HbA1a2, полученных в описанных
выше условиях, возрастает в 9,2 и 5,7 раза соответственно, что доказывает перспективность использования АТР генерирующей системы на основе экстрактов высушенных клеток S. cerevisiae
для получения минорных вариантов HbA1a1 и HbA1a2. Таким образом, разработанный метод биотехнологического получения HbA1a1 и HbA1a2 делает их более доступными для выделения, что,
несомненно, будет способствовать развитию исследований влияния ковалентно связанных фосфатов сахаров на функциональную активность данных модифицированных гемоглобинов.
Литература
На
ци
он
ал
1. S c h l e i c h e r E. D., Olge mol le r B., Wie de n m a n n E., G e r bit z K. D. // Clin. Chem. 1993. Vol. 39. P. 625–628.
2. T u r k Z., M is u r I., Tu rk N., Be n ko B. // Clin. Chem. Lab. Med. 1999. Vol. 37. P. 813–820.
3. W i l l i a m s S. K., H o w a r t h N. I., D e v e n n y J. J., B i t e n s k y M. W. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79.
P. 6546–6550.
4. B i e m e l K. M., F r i e d l D. A., L e d e r e r M. O. // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 24907–24915.
5. R a h b a r S. // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 2005. Vol. 1043. P. 9–19.
6. M i k š í k I., D e y l Z. // J. Chromatogr. B. 1997. Vol. 699. P. 311–345.
7. A c h a r y a A. S., R o y R. P., D o r a i B. // J. Protein Chem. 1991. Vol. 10. P. 345–355.
8. B r a u n K. P., P a v l o v i c h J. G., J o n e s D. R., P e t e r s o n C. M. // Alcohol Clin. Exp. Res. 1997. Vol. 21. P. 40–43.
9. C o h e n M. P., W u V.-Y. // Methods Enzymol. 1994. Vol. 231. P. 65–75.
10. S h a p i r o R., M c M a n u s M. J., Z a l u t C., B u n n H. F. // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255. P. 3120–3127.
11. P e t e r s o n K. P., P a v l o v i c h J. G., G o l d s t e i n D. et al. // Clin. Chem. 1998. Vol. 44. P. 1951–1958.
97
ус
и
ау
кБ
ел
ар
12. Z h a n g X., M e d z i h r a d s z k y K. F., C u n n i n g h a m J. et al. // J. Chromatogr. B. 2001. Vol. 759. P. 1–15.
13. С я х о в и ч В. Э., П а р у л ь Д. А., Б о к у т ь С. Б. // Изв. НАН Беларуси. Сер. биол. наук. 2005. № 4. С. 74–81.
14. M c D o n a l d M. J., S h a p i r o R., B l e i c h m a n M. et al. // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253. P. 2327–2332.
15. L a p o l l a A., T u b a r o M., F e d e l e D. et al. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005. Vol. 19. Р. 162–168.
16. S y a k h o v i c h V. E., S a r a s w a t h i N. T., R u f f M. et al. // Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun.
2006. Vol. 62. Р. 106–109.
17. D e R o s a M. C., S a n n a M. T., M e s s a n a I. et al. // Biophys. Chem. 1998. Vol. 72. P. 323–335.
18. S e n S., K a r M., R o y A., C h a k r a b o r t i A. S. // Biophys. Chem. 2005. Vol. 113. P. 289–298.
19. S a r a s w a t h i N. T., S y a k h o v i c h V. E., B o k u t S. B. et al. // Сrystal structure of glycated human hemoglobin.
Pdb3b75/pdb. Last modified 2009–02–24.
20. P r o m e D., B l o u q u i s t Y., P o n t h u s C. et al. // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. P. 13050–13064.
21. Z u r b r i g g e n K., S c h m u g g e M., S c h m i d M. et al. // Clin. Chem. 2005. Vol. 51, N 6. P. 989–996.
22. M c D o n a l d M. J., B l e i c h m a n M., B u n n H. F., N o b l e R. W. // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 702–707.
23. N a g a i K., E n o k i Y., K a n e k o A., H o r i H.// Biochem. Biophys. Acta. 1980. Vol. 623. P. 376–380.
24. W a t k i n s N. G., N e g l i a - F i s h e r C. I., D y e r D. G. et al. // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 7207–7212.
25. Б и р ю к о в И. А. Изучение структурно-функциональных особенностей минорного гемоглобина человека
А1b: Дис. … магистра биол. наук. 2005.
26. A s a d a M., N a k a n i s h i K., M a t s u n o R. et al. // Agric Biol. Chem. 1978. Vol. 42. P. 1533–1538.
27. A n t o n i n i E., B r u n o r i M. / Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands. Amsterdam. NorthHolland Pub. Comp. 1971.
28. З и н ч е н к о А. И., З а л а ш к о Л. М., Б а р а й В. М. // Изв. АН БССР. Сер. биол. наук. 1989. № 1. С. 30–34.
ем
ия
н
a. s. drazdou, d. v. chumakova, o. s. bokut, e. a. dokuchaeva, e. i. kvasyuk, s. b. bokut
RECEPTION OF HUMAN GLYCOHEMOGLOBINS А1а1 AND А1а2 WITH USE
SACCHAROMYCES CEREVISIAE KINASE SYSTEM
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
This paper describe the conditions of biotechnological obtaining minor human hemoglobin’s A1a1 and A1a2 with using
dried Saccharomyces cerevisiae cells in the presence of erythrocyte lysate. It was showed that glucose-6-phosphate
and fructose-1,6-diphosphate generated by kinase system of S. cerevisiae can participate in the reaction of non-enzymatic
glycosylation hemoglobin A1 and increase the level HbA1a1 and HbA1a2 in the reaction mixture.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
УДК 598.342:591.525/.526
ел
И. Э. САМУСЕНКО
кБ
Факторы, влияющие на успех размножения белого аиста
Ciconia ciconia в пойме реки Припять
Научно-практический центр НАН Беларуси по биоресурсам, Минск, e-mail: zoo@biobel.bas-net.by
(Поступила в редакцию 05.04.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
Введение. Белый аист Ciconia ciconia – один из наиболее изученных видов птиц, динамика
численности которого отслеживается на протяжении многих десятилетий на больших участках
ареала, благодаря чему он является удобной моделью для изучения популяционных процессов
и влияния на них внешних факторов. Белый аист гнездится на значительной части территории
Европы, при этом распространение вида неравномерно и в пределах современного ареала условия
его обитания имеют существенные различия. Об этом свидетельствует происходящее с начала
ХХ века до конца 1980-х годов катастрофическое сокращение численности в западной части ареала, где в некоторых странах белый аист оказался на грани исчезновения, в то время как наиболее
многочисленная восточная часть популяции, к которой относится и белорусская группировка вида,
характеризовалась наивысшей плотностью гнездования и более стабильными трендами численности по сравнению с западной частью. С конца 1980-х годов начался практически повсеместный
рост численности и расширение ареала, причины которых до конца не исследованы [1].
Белый аист включен в Приложение II Конвенции по сохранению мигрирующих диких животных (Боннская конвенция) – список видов, требующих постоянного контроля за состоянием
их численности. По результатам Шестого международного учета вида в 2004–2005 гг. общий
размер мировой популяции был оценен в 230 тыс. пар, из которых 21,5 тыс. пар (более 9 %) гнездилось в Беларуси [2]. Абсолютные учеты численности вида, проведенные в 2004 г. в различных
регионах Беларуси, показали, что плотность гнездования и размер выводка у гнездящихся в поймах рек белых аистов значительно превышают данные показатели на остальных участках [3].
Наибольшие показатели плотности гнездования и размера выводка отмечены в долине
р. Припять, что позволяет считать пойму реки ключевым на территории Беларуси местообитанием вида, где существуют наиболее благоприятные условия для поддержания высоких популяционных воспроизводственных параметров.
В последние годы изучению факторов, влияющих на успех размножения белого аиста, уделяется особое внимание. Установлено, что репродуктивные показатели могут иметь межгодовые
различия из-за разницы условий отдельных гнездовых сезонов и зависеть от многих факторов,
которые в разных частях ареала также могут различаться [4]. На популяционном уровне на успех
размножения данного вида влияют погодные условия и состояние кормовой базы, в результате
чего размер выводка или доля неуспешных пар может коррелировать с датой прилета птиц [5–9],
гидрологическими условиями в местах гнездования [10, 11], а также обилием пищи [12, 13].
В Беларуси до настоящего времени не проводилось детального анализа аспектов гнездовой
экологии белого аиста. В задачи данного исследования входило выявление факторов, воздействующих на успех размножения белого аиста в оптимальных для вида местообитаниях в пойме
р. Припять, с целью совершенствования охраны вида.
Материалы и методы исследования. В основу работы положены материалы многолетних
исследований (1991–2010 гг.) на мониторинговом участке в пойме р. Припять общей площадью
330 км2, где в разные годы гнездилось от 115 до 190 пар белого аиста. Полевые работы включали
99
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
учеты и картирование гнезд, определение характера их занятости, а также подсчет птенцов
в гнездах перед вылетом. При сборе и анализе популяционных показателей использовалась общепринятая международная методика [14]. Так, гнездящейся считалась пара, занимающая гнездо не менее половины гнездового периода, т. е. 1,5 мес. За неуспешную принималась гнездящаяся пара, не имеющая вылетевших из гнезда птенцов. Для характеристики успеха размножения
в отдельные годы рассчитывалось среднее количество слетков на гнездящуюся пару (JZa) и на
успешную пару (JZm), а также доля неуспешных пар в процентах (%НРО).
Для сравнения с современными показателями использованы результаты исследований белого аиста на той же территории в 1970-е годы [15].
Выполнен корреляционный анализ зависимости успешности размножения от гидрологических
и температурных факторов, численное отображение которых основано на статистических данных
гидрометеорологического мониторинга: продолжительность половодья (в днях); водность весны
и лета (% от нормы); расход воды весной и летом (% от нормы); расход воды в реке по гидрологическому посту «Черничи», расположенному на территории мониторингового участка, в разные месяцы с марта по август (м3); количество осадков весной и летом (% от нормы); средняя температура
весной, летом и в разные месяцы с марта по июль (°С); отклонение температуры весной и летом от
нормы (% от нормы); переход среднесуточной температуры через 0, 5, 10 °С.
Статистическую обработку материалов производили в программе Statistica 6.0. Оценку связи
между популяционными показателями белого аиста и различными факторами среды проводили
с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Для оценки значимости различий популяционных показателей использован критерий t-Стьюдента для независимых выборок.
Достоверными считали различия и выявленные зависимости при уровне значимости P < 0,05.
Результаты и их обсуждение. На мониторинговом участке в пойме Припяти с 1974 по 2004 г.
происходило увеличение размера выводка у успешных пар (r = 0,770, P < 0,01), а с 2004 г. по 2010 г.
наблюдалось устойчивое его сокращение (r = –0,895, P < 0,05). Средний размер выводка у гнездящихся пар в последние годы также имеет тенденцию к сокращению (1997–2010: r = 0,746,
P < 0,05), что является следствием возрастания доли неуспешных пар на протяжении последнего
десятилетия. Так, в 2007, 2009 и 2010 гг. около четверти всех приступивших к размножению аистов не имели потомства, тогда как в периоды более ранних наблюдений этот показатель варьировал в пределах 3,7–7,9 %.
Выявлена тесная связь между числом слетков и местом расположения гнезд в различных
участках поймы, которая подтверждает значимость более обводненных стаций вблизи русла
реки для обеспечения высоких репродуктивных показателей белого аиста. Так, за период 1991–
2010 гг. среднее количество птенцов в выводке (�����������������������������������������������
JZa��������������������������������������������
и JZm��������������������������������������
�����������������������������������������
) было значительно выше у пар, гнездящихся на расстоянии не далее 2 км от русла реки, чем у пар, гнездящихся на удалении более 2 км
от русла (t-тест: P < 0,05). Очевидно, что прирусловые участки характеризуются наиболее благоприятными кормовыми условиями для выращивания максимального числа птенцов.
С помощью корреляционного анализа установлено, что размер выводка у белого аиста в пойме
р. Припять значительно коррелирует с продолжительностью весеннего половодья и водностью бассейна реки, а также показателями расхода воды в весенние месяцы (таблица). Из 25 проанализированных показателей (гидрологических и температурных) в таблице приведены только достоверные
(Р < 0,05) информативные связи. Особенно значимыми для успешного выведения потомства оказались высокие показатели обводненности бассейна реки в апреле – период откладки яиц – и в мае,
когда вылупляется основная масса птенцов (таблица). В данном случае имеет место зависимость от
факторов, напрямую определяющих кормовую базу, а через нее и успешность размножения.
Максимальный средний размер выводка у успешных пар (от 3,14 до 3,49), как правило, отмечался
в годы с длительным периодом затопления, а в условиях отсутствия весеннего затопления поймы или
при непродолжительном, меньше 3 мес, половодье размер выводка обычно не превышал 2,5 птенца.
Между размером выводка и водностью бассейна реки в летние месяцы существует определенная отрицательная зависимость, однако данная связь не является статистически достоверной
(JZm: r = –0,303, P = 0,509, JZa: r = –0,244, P = 0,598). Согласно данным [11], высокие и катастрофические долгие паводки, которые по времени захватывают и летний период, могут отрицательно влиять на продуктивность вида.
На
100
ус
и
Корреляционные связи успеха размножения с гидрологическими и температурными факторами
Расход воды в реке в мае, м3/с
Переход среднесуточной температуры через
0 °С (дата)
Осадки весной (% от нормы)
Средняя температура в марте, °С
Отклонение средней температуры весны от нормы
(% от нормы)
0,668
0,013
0,882
0,009
0,647
0,031
0,788
0,004
0,176
0,627
0,247
0,637
–0,029
0,951
0,372
0,468
0,505
0,078
0,791
0,034
0,560
0,073
0,763
0,006
0,670
0,034
0,666
0,149
–0,524
0,227
–0,101
0,849
0,055
0,858
0,027
0,955
0,109
0,750
0,038
0,911
–0,883
0,001
–0,813
0,049
0,915
0,004
0,834
0,039
ар
Расход воды в реке в апреле, м3/с
Доля неуспешных пар
(%HP0)
ел
Водность весны (% от нормы)
Количество слетков
у гнездящихся пар (JZa)
кБ
Продолжительность половодья (дней)
Количество слетков
у успешных пар (JZm)
ау
Факторы
ем
ия
н
П р и м е ч а н и е. Числитель – коэффициент корреляции, знаменатель – достоверность связи Р. Полужирным
шрифтом обозначены значимые корреляционные связи.
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
Не выявлено связи между размером выводка белого аиста и плотностью гнездования вида.
Это говорит об отсутствии острой внутривидовой конкуренции в популяции белого аиста в пойме р. Припять, вероятно, в связи с высокой кормовой емкостью территории.
Корреляционный анализ показал, что количество неуспешных пар белого аиста увеличивается
в годы с более ранним переходом среднесуточной температуры через 0 °C����������������������
, со значительными колебаниями температурного режима и нормы осадков в весенние месяцы, а также при более высоких среднемесячных температурах марта (таблица). Таким образом, раннее наступление климатической весны и нестабильные климатические условия периода начала гнездования отрицательно
влияют на успех размножения вследствие возрастания доли безрезультатно гнездящихся пар.
Наряду с естественными факторами, влияющими на успех размножения вида, в последнее
время возрастает негативное воздействие факторов антропогенной природы. Участились случаи
сбрасывания гнезд с опор линий электропередачи и водонапорных башен. Так, только за период
с 2004 по 2007 г. в 10 из 27 населенных пунктов мониторингового участка электриками было
разрушено около 10 % гнезд белого аиста, в последующие годы количество гнездящихся аистов
в большинстве из этих населенных пунктов уменьшилось. Из-за беспокойства птиц и уничтожения гнезд на водонапорных башнях количество расположенных на них гнезд за период 2004–
2010 гг. уменьшилось более чем на 1/3.
Следствием все более частого гнездования белого аиста на хозяйственных сооружениях является увеличение смертности как птенцов, так и взрослых птиц. Известно, что для аистов столкновение с проводами или поражение электрическим током является одной из основных причин
гибели [16, 17]. В Украине из-за столкновений и электроповреждений на ЛЭП гибнет 64,0 %
взрослых аистов [18], в Польше – 74,5 % [19], в Венгрии – 94,1% [20]. По данным белорусского
центра кольцевания, белые аисты составляют почти треть погибших на ЛЭП окольцованных
птиц на протяжении последних десяти лет [3]. К тому же по вине птиц может происходить около
50 % всех отключений ЛЭП, среди которых половина приходится на долю аистов [21].
Сходного характера проблема возникает при гнездовании аистов на водонапорных башнях,
на широких крышах которых гнезда могут достигать значительных размеров. Это способствует
удержанию дополнительной влаги на поверхности башни, что приводит к коррозии металла, сокращает срок службы и увеличивает затраты на обслуживание данного сооружения.
Поэтому с ростом частоты гнездования аистов на ЛЭП и водонапорных башнях и с возрастанием экономических потерь, связанных с воздействием птиц, усиливаются меры по предотвращению гнездования на этих технических сооружениях.
101
ус
и
ем
ия
н
Литература
ау
кБ
ел
ар
Заключение. Успех размножения белого аиста в пойме р. Припять определяется сочетанием
погодных и гидрологических условий местообитания в период размножения. Наиболее высокий
показатель среднего размера выводка отмечается при продолжительном весеннем половодье
и высоких показателях водности бассейна реки в первую половину периода размножения. Раннее
наступление климатической весны и нестабильные климатические условия периода начала гнездования отрицательно влияют на успех размножения вследствие возрастания доли безрезультатно гнездящихся птиц.
Рост частоты использования для устройства гнезд хозяйственных сооружений, особенно
столбов ЛЭП, создает дополнительную угрозу для популяции вида вследствие возрастания риска
гибели птиц и усиления негативного антропогенного влияния.
Результаты проведенных исследований доказывают, что для организации охраны вида, поддержания высокой численности белого аиста в оптимальных местообитаниях в долине р. Припять,
а также отвлечения птиц от устройства гнезд на потенциально опасных и нежелательных с точки зрения хозяйствования человека опорах, необходимо осуществление мероприятий по охране,
восстановлению и улучшению ключевых для вида пойменных местообитаний, особенно поймы
р. Припять, а также поиск и внедрение технологий и методов охраны, направленных на снижение опасности линий электропередачи для птиц.
ьн
ая
ак
ад
1. S c h u l z H. // Weisßtorch im Aufwind? – White Storks on the up? Bonn, 1999. P. 351–365.
2. C а м у с е н к о И. Э. // Природные ресурсы. 2007. № 4. С. 55–62.
3. С а м у с е н к о И. Э. // Природные ресурсы Национального парка «Припятский» и других особо охраняемых
природных территорий Беларуси: изучение, сохранение, устойчивое использование: Сб. науч. тр. Мн., 2009. С. 339–347.
4. T r y j a n o w s k i P., S p a r k s T. H., J a k u b i e c Z. et al. // Population Ecology. 2005. Vol. 47. P. 119–125.
5. S æ t h e r B.-E., G r ø t a n V., T r y j a n o w s k i P. et al. // J. Animal Ecol. 2006. Vol. 75. P. 80–90.
6. V e r g a r a P., A g u i r r e J. I., F e r n a n d e z – C r u z M. // J. Avian Biol. 2007. Vol. 38. P. 573–579.
7. T r y j a n o w s k i P., S p a r k s T. H. // Acta Oecologica. 2008. Vol. 33. P. 203–206.
8. F u l i n M., J e r z a k L., S p a r k s T. H., T r y j a n o w s k i P. // Biologia. 2009. Vol. 64. P. 361–364.
9. Г р и щ е н к о В. Н. // Беркут. 2006. № 1, вып. 1–2. С. 85–93.
10. T r y j a n o w s k i P., J e r z a k L., R a d k i e w i c z J. // Waterbirds. 2005. Vol. 28, Iss. 3. P. 378–382.
11. T r y j a n o w s k i P., S p a r k s T. H., P r o f u s P. // Basic and Applied Ecology. 2009. Vol. 10. P. 387–392.
12. T r y j a n o w s k i P., K u ź n i a k S. // Ardea. 2002. Vol. 90. P. 213–217.
13. T h o m s e n K.-M., S t r u w e B. // Corax. 1994. Bd. 15, H. 4. S. 293–308.
14. S c h ü z E. // Beitr. Vogelkde. 1952. Vol. 2. S. 287–298.
15. К л а к о ц к и й В. П. // Припятский заповедник. Исследования. 1976. Вып. 1. С. 154–156.
16. F i e d l e r G. // Weisßtorch im Aufwind? – White Storks on the up? Bonn, 1999. P. 505–511.
17. G a r r i d o J. R., F e r n á n d e z – C r u z M. // Ardeola. 2003. Vol. 50, N 2. P. 191–200.
18. Г р и щ е н к о В. Н., Г а б е р Н. А. // Аисты: распространение, экология, охрана. Мн., 1990. С. 90–93.
19. J a k u b i e c Z. // Studia Naturae. 1991. N 37. S. 107–124.
20. L o v á z i P. // Weisßtorch im Aufwind? – White Storks on the up? Bonn, 1999. P. 203–211.
21. Г а л и н с к а я И. А., Г а б е р Н. А. // Аисты: распространение, экология, охрана. Мн., 1992. С. 36–45.
I. E. Samusenko
ал
Factors influencing White Stork Ciconia ciconia breeding success
at the Pripyat River floodplain
Summary
На
ци
он
White Stork breeding success was studied in response to temperature and hydrological data at the Pripyat River floodplain between 1991 and 2010. Brood size was positively significantly correlated with duration of spring flooding and spring
water discharge rate in Pripyat River. Especially strong correlation of breeding success was established with water discharge
rate in May, when majority of chicks hatch. Proportion of unsuccessful pairs was negatively correlated with the average
temperature transition through 0 °C in spring. It positively correlated with average temperature in March and temperature
deviation in relation to the spring norm. Thus, early spring and unstable weather conditions during the beginning of breeding
season are negatively influenced on the breeding success.
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ел
УДК 576.895.1:599.735.3(476)
Е. И. АНИСИМОВА, В. А. ПЕНЬКЕВИЧ, Ю. С. ВЯЛЬ
кБ
ГЕЛЬМИНТОФАУНА ЕВРОПЕЙСКОГО ЗУБРА
(bISON BONASUS) НА ТЕРРИТОРИИ БЕЛАРУСИ
Научно-практический центр НАН Беларуси по биоресурсам, Минск, e-mail: anis-zoo@yandex.ru
ау
(Поступила в редакцию 19.05.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Выявление структурной организации, закономерностей формирования и функционирования сообщества позвоночных копытных, в состав которого входит европейский зубр
(Bison bonasus L�����������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������
.), а также оценка видового состава и динамики видового разнообразия их гельминтов являются научной основой для рекомендаций по профилактике распространения инвазий и использования их в охотничьих хозяйствах.
В 90-х годах прошлого века в обеих частях Беловежской пущи (белорусской и польской) содержалось более 60 % мирового поголовья зубров, имеющих многогранное значение для
Беларуси [7], что определило необходимость разработки программы по его сохранению, расселению и использованию. При разработке национальной программы единственной подходящей
моделью для решения проблемы была признана метапопуляционная, которая предусматривала
создание от 7 до 9 новых центров содержания зубров [8]. В настоящее время в Беларуси создано
8 центров содержания и разведения этих редких видов мировой териофауны.
Один из важнейших аспектов экологических исследований – изучение гельминтозов как
фактора, влияющего на состояние популяции зубра. Особенно это касается паразитов, местом локализации которых является печень, легкие или желудочно-кишечный тракт. Наряду
с возбудителями вирусно-бактериального происхождения гельминты нарушают гомеостаз
и вызывают нарушения в состоянии органов и систем организма животных. В этой связи
представляет интерес степень инвазированности зубров различными гельминтами, которые
наравне с непосредственным воздействием на поражаемые органы служат еще и воротами
проникновения микрофлоры в ткани организма. Звери не только становятся более восприимчивыми к инфекционным заболеваниям, но и тяжелее переносят неблагоприятные климатические условия [15, 14]. Изучением гельминтов зубров в Беларуси в разные годы занимались многие исследователи [1–6, 9, 10, 12, 17]. Наиболее изученной является гельминтофауна
европейского зубра в Беловежской пуще, на обеих территориях которой (белорусской и польской) выявлена возможность паразитирования более 40 видов гельминтов [11, 22]. В результате многолетних исследований установлено, что к 2000 г. по сравнению с 1965 г. видовой
состав гельминтов у зубров в Беловежской пуще на территории Беларуси увеличился от 17
до 23 и представлен 18 видами нематод, 4 – трематод и 1 – цестод [1, 13, 15]. При высокой
экстенсивности заражения, которая достигает 75 % и выше, на одного зубра приходилось от
1 до 8 видов гельминтов. Среди паразитов преобладают нематоды, которые встречались
у 100 % зараженных зубров.
На территории заповедников зубры относятся к основному генофонду, поэтому важно изучать встречаемость гельминтов у данного вида в Национальном парке «Беловежская пуща»,
в «Березинском биосферном заповеднике», в Национальном парке «Припятский», где с 2000 г.
такие работы проводились фрагментарно. До настоящего времени не осуществлялся сравнительный анализ встречаемости и видового состава гельминтов в различных популяциях.
103
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Принимая во внимание эпизоотическую значимость и возможность активизации влияния
гельминтозных заболеваний на состояние популяций зубров, необходимость изучения видового
разнообразия гельминтов и тенденции их динамики является актуальной.
Материал и методы исследования. Исследования популяций зубра проводились в 2006–
2010 гг. на 1-м стационаре Минской области (Воложинский опытный лесхоз), 1-м Могилевской
области (Осиповичский опытный лесхоз), 3 стационарах Гомельской области (Экспериментальное
лесоохотничье хозяйство «Лясковичи», Национальный парк «Припятский», Полесский государственный радиационно-экологический заповедник) и Сельскохозяйственно-производственном
кооперативе «Озеры» Гродненской области, обитающих в разных ландшафтно-растительных
условиях Беларуси. В связи с тем что зубр входит в Красные книги Беларуси, Литвы, Польши,
Украины, России, то в основном проводились копрологические исследования (ово- и ларвоскопия), а также вскрытие выбракованных или павших животных [19]. По Беларуси обследовано
170 биопроб от зубров. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи тестов: G-тест, t-тест, индекс Чекановского-Серенсена (Ics, %), ранговый коэффициент корреляции по Спирмену (rs).
Результаты и их обсуждение. Из 170 биопроб от зубров в 77 (45,3 %) выявлены гельминты.
При этом один вид гельминтов обнаружен в 45 (58,4 %), два вида – в 23 (29,9 %), три – в 5 (6,5 %),
четыре вида гельминтов встречены в 4 пробах (5,2 %). В среднем приходится 1,58 ± 0,83 вида
гельминтов на одну пробу. Трематоды регистрировались в 18,2 % исследованных проб, цестоды –
у 7,8, нематоды – у 88,3 %.
Из озерской субпопуляции обследовано 26 проб, из них у 18 (69,2 %) зарегистрированы гельминты с преобладанием 1 вида (50,0 %). В среднем на одну исследованную пробу приходится 1,61 ± 0,7
вида гельминтов. Встречаемость по классам гельминтов составила: трематод – 5,6, цестод – 11,1,
нематод – 100,0 %. Выявлены представители 6 родов. По встречаемости и интенсивности заражения доминировали неоаскарисы (ИВ = 48,1 %) и диктиокаулиды (ИВ = 33,3 %), субдоминант – буностомы (ИВ = 18,5 %), которые встречались реже, но с большей интенсивностью инвазии.
Гельминтологические исследования зубров березинско-борисовской субпопуляции выявили
15 видов гельминтов: Fasciola hepatica, Dicrocelium lanceatum, Paramphystomum sp., Moniezia
benedeni, Oesophagostomum radiatum, Bunostomum plebotomum, Ostertagia ostertagi, Cooperia
oncophora, H. contortus, Nematodirus helvetianus, Neoscarus vitulorum, Dictyocaulus filaria,
Trichocephalus globulosa, Capillaria biolata, Paramphistomum ichkawai [20, 1], из которых 4 вида из
класса трематод, 1 – цестод и 10 – нематод. Наиболее часто регистрировались представители
трихостронгилид (до 80 %). Частота встречаемости других видов гельминтов находилась в пределах 1,0–5,0 %. Общая зараженность зубров гельминтами составила 80,0 %.
Из воложинской субпопуляции зубров обследовано 27 проб, из них в 3 (11,1 %) зарегистрированы гельминты. В двух из них представители из класса трематоды и 1 – цестоды.
Из осиповической субпопуляции зубров обследовано 30 биопроб, из них в 16 (53,3 %) зарегистрированы гельминты. При этом один вид гельминтов зарегистрирован в 10 (62,5 %), два вида
– в 5 (31,2 %), три – в 1 пробе (6,2 %), четыре и более вида гельминтов не встречались. В среднем
приходится 1,44 ± 0,63 вида гельминтов на одну обследованную пробу. Встречаемость по классам у зараженных животных составила: цестод – 6,3, нематод – 93,8 %. По встречаемости и интенсивности заражения доминировали диктиокаулиды (ИД = 30,1) и неоаскарисы (ИД = 21,7),
часто встречались буностомы (ИВ = 13,3 %) и трихостронгилиды (ИВ = 13,3 %). Остальные виды
регистрировались единично.
Из озеранской субпопуляции зубров обследованы 44 пробы, из них в 18 (69,2 %) зарегистрированы гельминты. При этом были зарегистрированы 1 (66,7 %) или 2 (33,9 %) вида гельминтов.
В среднем на одну обследованную пробу приходилось 1,3 ± 0,48 вида гельминтов. Встречаемость
по классам c�������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������
оставила: трематод – 5,6, цестод – 11,1, нематод – 100,0 %. Доминировали трихостронгилиды (ИД = 55,79), буностомы (ИД = 30,27) и диктиокаулиды (ИД = 16,22).
В результате наших и проводимых ранее исследований [21, 9] в Национальном парке
«Припятский» установлено 15 видов паразитических червей: Fasciola hepatica, Dicrocoelium
lanceatum, Moniezia benedeni, Bunostomum trigonocephalum, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora,
На
104
ус
и
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Haemonchus contortus, Nematodirus helvetianus, Neoascaris vitulorum, Trichocephalus globulosa,
Capillaria bovis, Oesophagostomum venulosum, Oesophagostomum radiatum, Dictyocaulus viviparus,
Protostrongylus sp. У зубров Приокско-Террасного заповедника, откуда были привезены основатели припятской субпопуляции, паразитирует 17 видов гельминтов [16].
Копроскопические исследования на территории ПГРЭЗ показали, что у зубра полесской популяции паразитируют гельминты семейства трихостронгилиды (100 %), фасциолы (16,5 %), парамфистумы (17,6 %), мониезии (8,2 %), диктиокаулюсы (5,8 %), неоаскарисы (10,6 %), нематодирусы (11,8 %), капиллярии (22,4 %), трихоцефалы (4,3 %). Преобладает нематодозная инвазии.
Нематодирусы чаще встречались у молодых зубров [18]. При гельминтологическом вскрытии
павших зубров выявили 14 видов гельминтов с экстенсивностью инвазии: Fasciola hepatica –
10,4 %, Paramphistomum cervi – 19,8 %, Moniezia expansa – 7,1 %, Bunostomum trigonocephalum –
12,5 %, Nematodirus helvetianus – 11,8 %, Haemonchus contortus – 13,4 %, Setaria labiato-papillosa – 3,8 %,
Dictyocaulus viviparus – 4,9 %, Ostertagia ostertagi – 15,2 %, Oesophagostomum radiatum – 22,0 %,
Oesophagostomum venulosum – 22,0 %, Trichocephalus ovis – 4,3 %, Capillaria bovis – 22,4 %,
Соореriа oncophora – 11,5 %. Нематоды составили 78,6, трематоды – 12,3 и цестоды – 7,1 %.
Доминировали – Capillaria bovis, Oesophagostomum venulosum, Oesophagostomum radiatum и трематода Paramphistomum cervi. Субдоминантный вид – Setaria labiato-papillosa. Пораженность зубров гельминтами в разные периоды варьировала от 78,1 до 100 %. Паразитирование только
одного вида зарегистрировано у 24,7 % зубров. У большинства животных одновременно встречались два (51,8 %) и три (11,7 %), реже – 4 (7,1 %), 5 (3,5 %) и 6 (1,2 %) видов гельминтов.
При копрологическом обследовании 39 проб экскрементов беловежской популяции зубра
в 20 выявлены яйца гельминтов. Встречаемость составила 51,3 %. В среднем приходится 1,9 ± 0,12
вида гельминтов на одну пробу. Встречаемость по классам у зараженных животных составила:
цестод – 5,0, трематод – 30,0, нематод – 90,0 %. Зарегистрированы представители 6 родов. В целом у зубров из Национального парка «Беловежская пуща» отмечена высокая встречаемость яиц
гельминтов и доминирование представителей двух родов: Dictiocaulus и Neoascaris. При сравнении результатов исследований в Порозовском и Сухопольском лесничествах выявлено, что
встречаемость выше в первом (41,4 и 30,0 % соответственно). Видовое богатство достоверно не
отличалось и составило 5 и 3 вида соответственно.
В обоих лесничествах доминировали диктиокаулиды (34,48 и 30,00 % соответственно).
Полученный результат подтверждает необходимость мониторинговых паразитологических исследований на территориях, где обитают популяции зубров, имеющие статус основного фонда вида.
При сравнительном анализе между составом гельминтов в субпопуляциях выявили, что его
сходство между озеранской и осиповичской субпопуляциями, а также озеранской и беловежской
(Ics) равен 0,48 и 0,36 соответственно, что говорит о более чем 50 % оригинального состава гельминтов (табл. 1). Низкое сходство состава отмечено для озерской и озеранской популяций (0,19),
у которых общими являются по одному виду нематод и цестод, а также для озеранской и воложинской (0, 12), у которых общий 1 вид цестод.
ьн
Т а б л и ц а 1. Коэффициент сходства состава гельминтов по субпопуляциям (Ics, %)
Субпопуляция
ал
Озерская
Озеранская
Воложинская
Беловежская
Озеранская
Воложинская
Беловежская
Осиповичская
0,19
–
–
–
0,25
0,12
–
–
0,13
0,36
0,05
–
0,62
0,48
0,17
0,08
На
ци
он
Наибольшее число видов гельминтов зарегистрировано в беловежской субпопуляции (37),
гельминтофауна которой уже сформировалась. Для озеранской и березинско-борисовской субпопуляций отмечено равное число видов – 15, в ПГРЭЗ – 14, наименьшее число видов к настоящему
времени выявлено в осиповичской – 9, а также воложинской и озерской субпопуляциях – по 6.
В динамике гельминтозной инвазии зубров многие исследователи отмечали значительные
колебания встречаемости основных видов гельминтов, когда одни выпадали, а другие приобре105
ус
и
ел
ар
тали широкое распространение [5, 4, 15]. При достаточно высокой численности видов диких
и домашних жвачных животных они имеют сходный состав пищи, условия обитания и освоения
угодий. В результате гельминты копытных являются менее специализированными паразитами,
что и определяет их достаточную стабильность территориальных фаунистических комплексов
и меньшую зависимость от круга хозяев, т. е. в большинстве своем они полигостальные паразиты. Расчет ранговой корреляции видового состава гельминтов европейского зубра с гельминтами диких копытных (оленя благородного, лося, косули) и домашних жвачных: крупного (КРС)
и мелкого (МРС) рогатого скота по Спирмену показал (табл. 2), что наибольшее сходство имеет
состав гельминтов между зубром и домашним скотом (0,40 и 0,46) и между зубром и лосем (0,37).
кБ
Т а б л и ц а 2. Корреляционный анализ состава гельминтов различных видов копытных животных
Олень
Лось
Зубр
Косуля
МРС
КРС
1,00
–
–
–
–
–
0,16
1,00
–
–
–
–
0,15
0,37
1,00
–
–
–
0,33
0,19
0,08
1,00
–
–
0,15
0,18
0,40
0,17
1,00
–
0,14
0,23
0,46
0,27
0,51
1,00
ау
Вид
Олень
Лось
Зубр
Косуля
МРС
КРС
ем
ия
н
П р и м е ч а н и е. МРС – мелкий рогатый скот; КРС – крупный рогатый скот.
ьн
ая
ак
ад
Заключение. В результате гельминтологических исследований, проведенных в различных
регионах обитания зубра, выявлен богатый видовой состав его гельминтов (37 видов гельминтов) и высокая степень инвазированности этого хозяина паразитами. Более половины животных
во всех субпопуляциях зубра являются носителями гельминтозной инвазии: озеранская – 69,2 %,
осиповичская – 53,3, припятская – 69,2, беловежская – 51,3, полесская – от 78,1 до 100 %. При
этом большинство из них заражены одним (от 50,0 до 66,7 %) или двумя (от 25,0 до 38,0 %) видами гельминтов. По три и более видов гельминтов встречаются редко. Во всех доминируют по
встречаемости нематоды, которые в 6 раз превосходят другие классы паразитических червей (G = 39,8;
P < 0,01). Комплекс гельминтов зубра отличается в различных популяциях, так как находится на
стадии формирования в некоторых из них. При акклиматизации зубров в новых фаунистических
комплексах они наравне с другими членами биоценоза начинают участвовать в циркуляции
местных видов гельминтов. Гельминтологические исследования различных субпопуляций зубра
выявили не только высокую инвазированность, но и высокую общность видового состава гельминтов с другими видами копытных.
В субпопуляциях зубров, переселенных в новые места обитания, процесс формирования гельминтофауны зависит прежде всего от выбора территории расселения, физиологического состояния животных, организации подкормки и регулярных лечебно-профилактических мероприятий.
Литература
ци
он
ал
1. А н и с и м о в а Е. И., Ш и к у л о В. Н. // Материалы междунар. совещ. «Териофауна России и сопредельных
территорий». М., 2007. С. 15
2. А н и с и м о в а Е. И., П е н ь к е в и ч В. А., С у б б о т и н А. М., К е к ш и н а А. М. // Материалы IV
междунар. конф. «Научное пространство Европы – 2008». София «Бял ГРАД-БГ» ООД, 2008. Т.21. С. 41–47
3. А н и с и м о в а Е. И., К е к ш и н а А. М., К о т л е р ч у к С. В., П о л о з С. В. // Материалы IV Всерос.
Съезда Паразитол. Общ-ва при РАН. СПб., 2008. Т.1. С. 27–31.
4. Б е л я е в а М. Я. Работы по гельминтологии к 80-летию акад. К. И. Скрябина. М., 1959.
5. В р у б л е в с к и й К. Зубр Беловежской пущи. Познань, 1927
6. Г а г а р и н В. Г., Н а з а р о в а Н. С. // Гельминты животных Киргизии и сопредельных территорий. Фрунзе,
1966. С. 62–63.
7. К о з л о П. Г., Б у н е в и ч А. Н., С т а в р о в с к и й Д. Д., У г л я н е ц А. В. // Сохранение биологического разнообразия лесов Беловежской пущи. Каменюки-Минск, 1996. С. 202–216.
8. К о з л о П. Г., П и к у л и к М. М. // Тез. докл ���������������������������������������������������������
VIII�����������������������������������������������������
зоол. науч. конф. «Структурно-функциональное состояние биологического разнообразия животного мира Беларуси». Мн., 1999. С. 69–71.
На
106
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
9. К о т л е р ч у к С. В, У г л я н е ц А. В., Ш и к у л о В. Н., А н и с и м о в а Е. И. // Молодежь в науке – 2007.
Приложение к журналу Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2008. Ч. 1. С. 121–123.
10. К о ч к о Ю. П., К а р а с е в Н. Ф. // Тез. докл. VII зоол. конф. Мн., 1994. С. 210.
11. К о ч к о Ю. П. // Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Фауна и флора Прибужья и сопредельных территорий на рубеже XXI столетия». Брест, 2000. С. 116–117.
12. К о ч к о Ю. П., Ш и м а л о в В. Т., Ш и м а л о в В. В. // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2000.
С. 122–124.
13. К о ч к о Ю. П., Я к у б о в с к и й М. В. // Изв. Академии аграрных наук Республики Беларусь. 2000. ­№ 4.
С. 70–73
14. К о ч к о Ю. П. // Беловежская пуща. Исследования. Вып. 11. Брест, 2003. С. 205–223.
15. К р а с о ч к о П. А., К о з л о П. Г., К р а с о ч к о И. А. и др. / / Экологические и ветеринарные аспекты
зубров Беларуси. Мн., 2004. С. 210–235.
16. Н а з а р о в а Н. С. // Материалы науч. конф. ВОГ. М., 1966. Ч.5. С. 115–118.
17. П е н ь к е в и ч В. А. // Экологические проблемы. Мн., 2007. C. 137–138.
18. П е н ь к е в и ч В. А. // Материалы 7-й междунар. науч. конф. «Сахаровские чтения – 2007». Мн., 2007.
С. 137–138.
19. Я т у с е в и ч А. И., К а р а с е в Н. Ф., Р о м а ш о в В. А. и др. Практикум по паразитологии и инвазионным болезням животных / Под ред. А. И. Ятусевича. Мн., 1999.
20. С у б б о т и н А. М., К а р а с е в Н. Ф., П е н ь к е в и ч В. А. и др. // Материалы III Междунар. науч.практ. конф. «Современные экологические проблемы устойчивого развития Полесского региона и сопредельных
территорий». Мозырь, 2007. Ч.3. С. 57–61.
21. С у б б о т и н А. М., К а р а с е в Н. Ф., К о т л е р ч у к С. В., К а ш т а л ь я н А. П. // Тр. V Респ. научпракт. конф. «Достижения и перспективы современной паразитологии». Витебск, 2006. С. 443–446.
22. D r o z d z J., D e m і a s z k і e w і c z A l e k s a n d e r W., L a c h o w I c z J a c e k // Acta parasitol. Pol. 1989.
Vol. 34, N 2. С. 117–12.
E. I. ANISIMOVA, V. A. PENKEVICH, Y. S. VIAL
HELMINTH FAUNA OF EUROPIAN BISON (bISON BONASUS) ON THE TERRITORY OF BELARUS
Summary
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
European bison (Bison bonasus L.) is the famous species of animals in Belarus. Thirty seven species of helminthes were
found in European bison on the territory Belarus. The highest intensity and prevalence of infection were shown by gastric nematodes. The dominants species and dynamics of prevalence were studied. Comparative analyses helminthes fauna in different
populations were obtained.
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
УДК 576.895.121:616.995.1(476)
ел
В. В. ШИМАЛОВ
кБ
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS (CESTODA, TAENIIDAE)
В ЮГО-ЗАПАДНОЙ части БЕЛАРУСИ
Брестский государственный университет им. А. С. Пушкина, e-mail: shimalov@brsu.brest.by
ау
(Поступила в редакцию 24.01.2011)
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Цестода Echinococcus multilocularis Leuckart, 1863 ((син.: Alveococcus multilocularis
(Leuckart, 1863)) входит в состав семейства Taeniidae Ludwig, 1886, имеет эпидемиологическое
���������������������������������������������������������������������������������������
эпизоотологическое���������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������������������
значение������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������
является�������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
возбудителем������������������������������������
������������������������������������������������
эхинококкоза�����������������������
�����������������������������������
. Облигатные
���������������������
дефинитивные хозяева этого ленточного червя – хищные млекопитающие семейств Canidae Fischer, 1817
и Felidae Fischer, 1817 [10, 24]. В жизненном цикле принимают участие промежуточные хозяева,
основные из которых – грызуны [1, 19]. Ими также могут быть насекомоядные млекопитающие,
зайцеобразные и человек.
Ареал этой цестоды ограничен Северным полушарием, эндемичная территория включает
многие государства Европы, Средней Азии и Закавказья, Китай, Японию, США и Канаду
[15, 25]. Паразитирует у человека в личиночной стадии и вызывает многокамерный (альвеолярный) эхинококкоз (альвеококкоз). Заражение людей происходит при проглатывании яиц. Факторы
передачи инвазии – вода, овощи, фрукты, лесные и болотные ягоды, огородная зелень, шерсть
животных, контаминированные яйцами гельминта. Не исключается также аэрогенный путь передачи яиц с пылью [6].
Поражают личинки (ларвоцисты) различные органы и ткани человека, преимущественно печень. Заболевание слабо поддается химиотерапии, основной метод лечения – хирургический,
в запущенных случаях неизбежен летальный исход, поэтому многокамерный эхинококкоз отнесен к гельминтозам повышенной опасности для человека [1, 14, 18].
В Беларуси цестода E. multilocularis встречается как у животных (взрослая и личиночная стадии), так и у людей (личиночная стадия).
И. В. Меркушева [16] находит личинки E. multilocularis у полевой мыши (Лунинецкий район)
и у 2 рыжих полевок (Лунинецкий и Витебский районы). Также эти паразиты выявлены
в Березинском биосферном заповеднике у речного бобра и рыжей полевки [4, 5, 11]. И. В. Мер­
кушева и А. Ф. Бобкова [17] считают, что для березинской популяции бобров этот гельминт указан Л. В. Колбиным и Н. Ф. Карасевым [11] под названием Echinococcus granulosus (Batsch, 1786)
larvae. В Беловежской пуще личинки E. multilocularis найдены В. Т. Шималовым в 70-х годах
ХХ века у рыжей и темной полевок в период полевых практик студентов биологического факультета Брестского государственного педагогического института (ныне Брестский государственный
университет) (цит. по [23]). Е. И. Анисимова [2] сообщает о находке ларвоцист E. multilocularis
у 2,6 % исследованных рыжих полевок и 0,9 % полевых мышей, пойманных в лесных биоценозах
Полесского государственного радиационно-экологического заповедника, а И. Н. Дубина, Н. Ф. Ка­
расев и В. А. Пенькевич [7] – у 1 из 17 исследованных нутрий в Витебской области. В Белорусском
Полесье (1980–1999) ларвоцисты этой цестоды были обнаружены у 2 обыкновенных бурозубок,
обыкновенной куторы, речного бобра, полевки-экономки, обыкновенной полевки и лесной
мыши, 2 обыкновенных хомяков, ондатр и водяных крыс, 5 рыжих полевок, 3 полевых мышей
[20–22].
На
108
ус
и
кБ
ел
ар
Дефинитивным хозяином цестоды E. multilocularis установлена в Беларуси лисица в центральной [3] и южной части [22, 26], а также домашняя собака – в северной части [8].
Мы располагаем краткой информацией о 2 случаях многокамерного эхинококкоза (альвеококкоза) человека, зарегистрированных в Беларуси. Один с локализацией личинок в печени у женщины в Брестской области (район Беловежской пущи) [12], другой – с поражением внутренних
органов, в том числе легких и печени женщины из Могилевской области (Кировский район) [9].
Все это указывает на то, что в Беларуси функционируют очаги эхинококкоза, возбудителем
которого является цестода E. multilocularis.
Важность проблемы многокамерного эхинококкоза для здоровья человека в Беларуси вынудила нас продолжить в ХХI веке гельминтологические исследования животных. Цель работы –
изучить распространение цестоды E. multilocularis у диких животных в юго-западной Беларуси.
Материал и методы исследования. В 2001–2010 гг. нами было исследовано 11 лисиц и 2 748
мелких насекомоядных млекопитающих и грызунов 15 видов – потенциальных хозяев цестоды
E. multilocularis (таблица).
ау
Видовой состав и количество исследованных в юго-западной части Беларуси мелких млекопитающих –
потенциальных хозяев цестоды E. multilocularis
Заказник
«Бугский»
Берег
мелиоративного
канала
Обочина
шоссейной
дороги
Crocidura leucodon Hermann, 1780 – белезубка белобрюхая
1
7
1
Neomys fodiens Pennant, 1771 – кутора обыкновенная
5
9
1
Sorex araneus Linnaeus, 1758 – бурозубка обыкновенная
115
135
107
S. minutus Linnaeus, 1766 – бурозубка
малая
15
21
12
693
187*
58
–
5
2
M. arvalis Pallas, 1778 – полевка
обыкновенная
52
187
122
M. oeconomus Pallas, 1776 – полевка-экономка
12
16
1
Apodemus agrarius Pallas,
1771 –мышь полевая
243
263
41
A. flavicollis Melchior, 1834 – мышь
желтогорлая
203
140
23
A. sylvaticus Linnaeus, 1758 – мышь
лесная
6
25
6
Micromys minutus Pallas,
1771 –мышь-малютка
10
–
–
Mus musculus Linnaeus, 1758 – мышь домовая
–
2
6
Rattus norvegicus Berkenhout,
1769 –крыса серая
11
1
1
–
3
–
Отряд Insectivora Bowdich, 1821
Семейство Soricidae Fischer von
Waldheim, 1814
ак
ад
Отряд Rodentia Bowdich, 1821
ем
ия
н
Вид животного и его систематическое положение
Семейство Cricetidae Fischer von
Waldheim, 1817
Clethrionomys glareolus Schreber, 1780 – полевка рыжая
ая
Microtus agrestis Linnaeus,
1761 – полевка темная
ци
он
ал
ьн
Семейство Muridae Illiger, 1811
Семейство Sminthidae Brandt, 1855
Sicista betulina Pallas, 1779 – мышовка лесная
На
* Найдены личинки цестоды E. multilocularis.
109
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Лисиц отстреливали охотники в Брестском (7 особей), Каменецком (2), Жабинковском
и Пружанском районах (по 1). Мелких зверьков отлавливали с помощью давилок «Геро», выставленных в естественных и трансформированных экосистемах. Отработано 11 200 ловушко-суток
в различных биоценозах ландшафтного заказника «Бугский» (Брестский район; 2001–2004,
2008), по берегам мелиоративных каналов (Брестский и Малоритский районы; 2005–2010) и по
окраине смешанных лесов и берегам осушительных каналов, расположенных вдоль шоссейных
дорог (3–5 м от края дороги) в Брестском районе (2008–2010).
Животных исследовали методом полного гельминтологического вскрытия, компрессирования тканей и органов.
Результаты и их обсуждение. В кишечнике 2 молодых самок лисиц, отстрелянных таксидермистом Брестского государственного университета В. Жуком в окрестностях деревень
Остромечево (Брестский район; 12.01.2003 г.) и Щерчово (Пружанский район; 24.01.2009 г.), было
обнаружено соответственно 36 и 2200 экз. половозрелых цестод E. multilocularis. Ранее (11.12.1999 г.)
этим охотником убит в 2 км от д. Пелище (Каменецкий район), а нами исследован половозрелый
самец лисицы, в кишечнике которого локализовалось 5000 экз. этого вида ленточных червей [26].
Личинки E. multilocularis были найдены у неполовозрелой самки рыжей полевки, пойманной
нами 28.08.2005 г. на берегу осушительного канала, проходящего в смешанном лесу мелиоративной системы, расположенной в Малоритском районе (20-й км Ковельского шоссе; ближайший
населенный пункт – д. Закрутин) недалеко от границы с Брестским районом. Один конгломерат
размером 1,5 × 1,0 см, по форме напоминающий семя фасоли, локализовался в печени зверька. На
этой же мелиоративной системе конгломерат личинок E. multilocularis размером с вишню обнаружен нами в печени половозрелого самца обыкновенной полевки, пойманного 16.08.1999 г. на
берегу канала у грунтовой дороги [21].
Остальные сведения о выявлении зараженных животных относятся к 70-м (данные В. Т. Шималова по грызунам Беловежской пущи), 80-м и началу 90-х годов ХХ века (наши данные).
Места находок в юго-западной Беларуси цестоды E. multilocularis у лисиц и ее личинок у насекомоядных млекопитающих и грызунов показаны на картосхеме. Их можно объединить в 3 крупных очага эхинококкоза.
Первый очаг охватывает территорию, ограниченную населенными пунктами Остромечево
(северная часть Брестского района) – Огородники (юго-западная часть Каменецкого района) –
Дмитровичи (центральная часть Каменецкого района) – Каменюки (северная часть Каменецкого
района) – Щерчово (юго-западная часть Пружанского района) – Пелище (южная часть Каменецкого района) – Видомля (южная часть Каменецкого района) – Остромечево. Очаг захватывает
юго-западную часть национального парка «Беловежская пуща». Возможно, границы этого очага
шире и простираются на прилегающие территории. Очаг включает значительную часть Каменецкого района, северную часть Брестского района и юго-западную часть Пружанского района.
Назван он нами Каменецким.
Второй очаг расположен в северо-западной части Малоритского района – территория, прилегающая к деревням Закрутин и Гусак и расположенная между ними (Закрутинско-Гусакский
очаг).
Третий очаг находится в окрестностях д. Томашовка Брестского района (Томашовский очаг).
Эти очаги частично (первый) или полностью (второй и третий) входят в состав национального парка «Беловежская пуща» (Каменецкий очаг), биологического заказника местного значения
«Гусак» (Закрутинско-Гусакский очаг) и биосферного резервата «Прибужское Полесье» (Томашовский очаг). Посещение людьми этих территорий может стать причиной их заболевания многокамерным эхинококкозом.
Нами установлен дефинитивный хозяин цестоды E. multilocularis в юго-западной Беларуси.
Это лисица, однако, не исключено, что бродячие домашние собаки и кошки, численность которых, как и лисиц, в регионе исследования достаточно высокая, тоже могут быть дефинитивными
хозяевами этого гельминта. Мы также не исключаем из этого списка енотовидных собак. Поддержанию очагов способствуют насекомоядные млекопитающие (2 вида) и грызуны (6 видов),
у которых количество многокамерных пузырей в печени колебалось от 1 до 5.
На
110
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
ак
ад
Места находок цестоды E. multilocularis у животных в юго-западной части Беларуси: ■ – лисица (Брестский,
Каменецкий и Пружанский районы); ● – грызуны (обыкновенный хомяк, ондатра – Каменецкий район; рыжая полевка – Брестский, Каменецкий, Малоритский районы; обыкновенная полевка, полевка-экономка – Малоритский район; темная полевка – Каменецкий район; полевая мышь – Брестский район); ▲ – насекомоядные млекопитающие
(обыкновенная бурозубка – Брестский район; обыкновенная кутора – Каменецкий район)
На
ци
он
ал
ьн
ая
Заключение. В юго-западной части Беларуси функционируют очаги эхинококкоза (возбудитель цестода E. multilocularis): Каменецкий, Закрутинско-Гусакский и Томашовский. Расположены
они на территориях Брестского, Малоритского, Каменецкого и Пружанского районов.
Установлено, что в поддержании этих очагов принимают участие лисицы (дефинитивные хозяева), насекомоядные млекопитающие и грызуны (промежуточные хозяева). Существует риск заражения жителей этих районов, туристов и других посетителей этого региона Беларуси. Один
такой случай зарегистрирован в районе Беловежской пущи в Брестской области. Это должно
учитываться медицинскими работниками при планировании и проведении просветительных
и профилактических мероприятий, а также туроператорами туристических фирм.
При проведении работ, направленных на регулирование численности хищных млекопитающих, дератизацию и охрану хомяков (3-я категория Красной книги Республики Беларусь [13];
численность популяции в Каменецком районе требует изучения), необходимо учитывать участие этих животных в формировании и поддержании очагов многокамерного (альвеолярного)
эхинококкоза. Национальный парк «Беловежская пуща», заказник «Гусак» и биосферный резерват «Прибужское Полесье» с их особым режимом охраны, в том числе биоразнообразия, могут
способствовать сохранению природных очагов эхинококкоза, функционирующих на их террито111
ус
и
ел
ар
риях, а также быть основными резервуарами, откуда инвазия может распространяться на прилегающие территории.
При анализе заболеваний печени человека в Беларуси следует предусматривать возможность
многокамерного эхинококкоза, поскольку именно в этом органе чаще всего локализуются личиночные стадии цестоды E. multilocularis.
Нами также установлены очаги эхинококкоза, вызываемого цестодой E. multilocularis, в Пинском
районе Брестской области (окрестности д. Малые Дворцы; время обнаружения – первое десятилетие
ХХI века) и Речицком районе Гомельской области (окрестности д. Гоголи; 80-е годы ХХ века).
Литература
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
1. А б у л а д з е К. И. Тениаты – ленточные гельминты животных и человека и вызываемые ими заболевания:
Основы цестодологии. М., 1964. Т. 4.
2. А н и с и м о в а Е. И. // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2002. № 4. С. 90–92.
3. А н и с и м о в а Е. И. // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2003. № 4. С. 100–107.
4. А р з а м а с а ў І. Ц., М е р к у ш а в а І. В., Ч ы к і л е ў с к а я І. В. // Весці АН БССР. Сер. біял. навук. 1982.
№ 5. С. 89–94.
5. А р з а м а с о в И. Т., М е р к у ш е в а И. В., Ч и к и л е в с к а я И. В. Структура паразитоценозов грызунов
геоботанических подзон Белоруссии. Мн., 1983.
6. Г е л л е р И. Ю. Эхинококкоз (медико-экологические аспекты и пути ликвидации инвазии). М., 1989.
7. Д у б и н а И. Н., К а р а с е в Н. Ф., П е н ь к е в и ч В. А. // Эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика паразитарных заболеваний человека: Тр. ІІІ Междунар. науч.-практ. конф. Витебск, 2002. С. 195–199.
8. Д у б и н а И. Н. // Ветеринария. 2003. № 5. С. 10–16.
9. Зов о помощи // Народный доктор. 2008. № 23 (декабрь). С. 26.
10. К о з л о в Д. П. Определитель гельминтов хищных млекопитающих СССР. М., 1977.
11. К о л б и н Л. В., К а р а с е в Н. Ф. // Материалы к науч. конф. ВОГ. М., 1965. Ч. 1. С. 120–123.
12. К о р з а н А. И., Г а л б а д р а х Д., Ч и с т е н к о Г. Н. и др. // Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы: Материалы междунар. науч.-практ. конф. Мн., 1997. С. 145–147.
13. Красная книга Республики Беларусь: Редкие и находящиеся под угрозой исчезновения виды диких животных. Мн., 2006. С. 40–41.
14. Л е й к и н а Е. С., З о р и х и н а В. И. // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. 1977. № 5. С. 592–599.
15. Л у к а ш е н к о Н. П., Б р е г а д з е И. Л. // Многотомное руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. М., 1968. Т. 9. С. 509–526.
16. М е р к у ш е в а И. В. // Фауна и экология паразитов грызунов. Мн., 1963. С. 53–137.
17. М е р к у ш е в а И. В., Б о б к о в а А. Ф. Гельминты домашних и диких животных Белоруссии: Каталог.
Мн., 1981. С. 23.
18. О з е р е ц к о в с к а я Н. Н., З а л ь н о в а Н. С., Т у м о л ь с к а я Н. И. Клиника и лечение гельминтозов. Л., 1984.
19. Р ы ж и к о в К. М., Г в о з д е в Е. В., Т о к о б а е в М. М. и др. Определитель гельминтов грызунов фауны
СССР. Цестоды и трематоды М., 1978.
20. Ш и м а л о в В. В. Гельминты, общие человеку и диким животным на осушенных землях Белорусского
Полесья: Дис. … канд. биол. наук. Мн., 1991.
21. Ш и м а л о в В. В. // Паразитология. 2002. № 3. С. 247–252.
22. Ш и м а л о в В. В., Ш и м а л о в В. Т. // Паразитология. 2001. № 2. С. 145–148.
23. Ш и м а л о в В. В. // Беловежская пуща: история, природа, туризм: Материалы Междунар. науч.-практ.
конф., посвященной 600-летию заповедности Беловежской пущи. Брест, 2010. С. 368–378.
24. K a s s a i T. Veterinary helminthology. Oxford, 1999.
25. M a l c z e w s k i A., R o c k i B., R a m i s z A. et аl. // J. Parasitol. 1995. № 2. P. 318–321.
26. S h i m a l o v V. V., S h i m a l o v V. T. // Parasitol. Res. 2003. № 1. P. 77–78.
V. V. SHIMALOV
ци
он
THE PREVALENCE OF ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS (CESTODA, TAENIIDAE)
IN SOUTH-WEST PART OF BELARUS
Summary
На
The helminthological investigation of 11 red foxes and 2 748 small insectivorous mammals and rodents of 15 species –
potential hosts of cestode E. multilocularis carried out in south-west Belarus during 2001–2010. Adult specimens of this helminth found in the intestine of 2 foxes (Brest and Pruzhany districts), and larvae – in the liver of red-backed vole who caught
on drainage channel bank in Malorita district. The known facts about findings of cestode E. multilocularis in animals
and humans, and the centers in south-west Belarus are presented.
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ар
АГЛЯДЫ
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ел
УДК 576.536:615
М. В. ВОЛК, Е. С. ЛОБАНОК, П. А. ВОЛОТОВСКИЙ
кБ
ХОНДРОГЕННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск, alana-riko@yandex.ru
ау
(Поступила в редакцию 06.01.2011)
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
Введение. Ежегодно миллионы людей заболевают остеопорозом, артритом, системными заболеваниями соединительной ткани, сопровождающимися поражением хряща, к тому же травматические переломы костей значительно увеличивают количество больных, нуждающихся
в репарации его повреждений. Учитывая, что хрящевая ткань обладает незначительными регенеративными свойствами и в большинстве случаев после повреждения суставной поверхности
развивается остеоартроз, современная медицина находится в поиске новых и усовершенствовании существующих подходов для лечения деструктивных заболеваний, восстановления структуры и функции гиалинового хряща. Известные методы медикаментозной терапии и хирургического лечения имеют большое значение в борьбе с данной патологией, но их использование не
всегда эффективно. Длительное время считалось, что репарация повреждений суставного хряща
невозможна даже при применении клеточных технологий. Однако в 2003 г. были выполнены
первые успешные реконструктивные операции на суставах с использованием мезенхимных стволовых клеток (МСК) костного мозга, результаты которых показали исключительную перспективность применения этого биоматериала. К настоящему времени накопилось достаточное количество обнадеживающих данных [1–4], подтверждающих целесообразность пересадки МСК
в ортопедической практике, и если ранее некоторые заболевания суставов обрекали людей на
инвалидность, то сейчас у таких больных появилась надежда не только на существенное улучшение качества жизни, но и на полное излечение.
Свойства МСК. МСК имеют фибробластоидную морфологию, высокую способность к адгезии и образованию колоний веретенообразновытянутых клеток, обладают определенным набором фенотипических и функциональных характеристик и являются плюрипотентными, т. е.
могут дифференцироваться в специализированные соматические клетки различных тканей
(рис. 1). Во взрослом организме они формируют
строму костного мозга, поддерживающую гемопоэз, являются источником клеток соединительной (костной, хрящевой, жировой, мышечной)
ткани. Через общий клеточный пул костного мозга рециркуляция прогениторных МСК в кровотоке обеспечивает стволовой баланс и репарацию
тканей мезодермального происхождения.
Существование в костном мозге наряду со
стволовыми кроветворными клетками МСК вперРис. 1. Монослойная культура МСК костного мозга
113
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
вые было показано в начале 70-х годов прошлого века А. Я. Фриденштейном [5]. На сегодняшний день главными источниками получения МСК служат костный мозг и жировая ткань [6, 7].
МСК могут быть выделены также из плаценты, амниотической жидкости, пуповинной крови [8, 9],
кожи, тимуса, мышечной ткани и синовиальной оболочки суставов [10]. Концентрация МСК
в периферической крови очень низкая [11].
Наиболее распространенный способ выделения МСК из костного мозга основан на их способности адгезировать к поверхности культурального пластика при культивировании в питательных средах и образовывать дискретные колонии фибробластоидных клеток. МСК обладают
высокими адгезивными свойствами, 90 % колониеобразующих клеток прикрепляются ко дну
культурального флакона за первые 30–60 мин после посева [5, 12]. В костном мозге взрослого
человека количество колониеобразующих клеток составляет 1–3 ⋅ 10 –4, и с возрастом их количество уменьшается. В селезенке и тимусе их концентрация колеблется в пределах 5–10 ⋅ 10 –5,
в лимфатических узлах – 1⋅10 –7 [5].
Большим преимуществом костного мозга является возможность многократного забора донорских клеток. В культуре МСК характеризуются высоким пролиферативным потенциалом,
обладают способностью к самоподдержанию с сохранением недифференцированного состояния
и при соответствующих условиях (наличие в среде роста определенных компонентов) дифференцируются [13, 14]. Показано, что МСК костного мозга взрослого человека могут давать in vitro
более чем 80 удвоений популяции, а взрослой крысы – более 120 [15].
На своей поверхности МСК имеют ряд маркеров, таких как CD90 (Thy-1), CD13, CD105 (SH2),
CD29, CD44, CD49a-f, CD51, CD54, CD71, CD73 (SH3), CD106 (табл.1), STRO-1 [5, 14–19]. Показана
также экспрессия отдельными МСК человека маркеров эмбриональных стволовых клеток – антигенов ����������������������������������������������������������������������������������
SSEA������������������������������������������������������������������������������
-1, ��������������������������������������������������������������������������
SSEA����������������������������������������������������������������������
-4 [20]. Отличительной чертой МСК является отсутствие на клеточной поверхности гемопоэтических маркеров CD34, CD45, CD14, маркера моноцитов и макрофагов –
CD11b, клеток эритроидной линии – гликофорина А, молекул гистосовместимости HLA-DR
и средний уровень экспрессии молекул HLA�����������������������������������������������������
��������������������������������������������������������
-����������������������������������������������������
ABC�������������������������������������������������
[5, 7, 8, 14, 17]. Уникальные, характерные только для МСК маркеры пока не идентифицированы [21].
ак
ад
Т а б л и ц а 1. Характеристика маркеров МСК
Маркер
Роль для клетки
ал
ьн
ая
CD29 (β1 интегриновая цепь) Рецептор к фибронектину [22]
CD44 (HCAM)
Рецептор гиалуроновой кислоты, может взаимодействовать с другими лигандами,
такими как остеопонтин, коллаген, металлопротеиназы матрикса [11]
CD73
Мембраносвязанная экто-5′-нуклеоти-даза, катализирует превращение пуриновых
мононуклеотидов в нуклеозиды [23]
CD90 (Thy-1)
Играет роль во взаимодействии клеток с матриксом, межклеточных контактах
и апоптозе [24]
CD105 (Endoglin)
Компонент TGFβ-рецептора [25]
CD106 (VCAM-1)
Рецептор β1-интегрина [15]
CD 54 (ICAM-1)
Лиганд для LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen-1), молекулы адгезии [26]
CD71
Рецептор к трансферрину [27]
CD13
Металлопротеиназа аминопептидаза N[28]
CD49a-f
Субъединицы интегринов [29]
CD51
Интегрин [30]
ци
он
Следует отметить, что антигенный состав и некоторые свойства МСК костного мозга и МСК
других тканей не идентичны. В частности, МСК жировой ткани экспрессируют CD49d, а костномозговые – нет. С другой стороны, антиген CD106 не определяется в адипоцитарных МСК [31].
Активность теломеразы у МСК жировой ткани выше, чем у МСК костного мозга [32].
Использование МСК в качестве фидерного слоя (подложки) для гемопоэтических стволовых
клеток при совместном культивировании показало, что они синтезируют ряд биологически активных соединений, поддерживающих высокую пролиферативную активность последних. С помощью метода полимеразной цепной реакции было показано (рис. 2), что МСК костного мозга
экспрессируют интерлейкин-6 (Il6), фактор ингибирования лейкемии (LIF), макрофагальный
На
114
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор стволовых клеток
(�����������������������������������������������������������������������
SCF��������������������������������������������������������������������
), Flt��������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������
-3 лиганд, стромальный фактор-1 (�����������������������������
SDF��������������������������
-1), васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF). МСК, выделенные из пуповины, синтезируют
подобный спектр цитокинов [33], дополнительно включая гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий (GM-CSF) фактор.
В последние годы получено большое количество доказательств того,
что МСК обладают уникальными иммуносупрессивными свойствами
и играют роль модуляторов межлимфоцитарных взаимодействий.
S. Aggarwal и M. Pittenger показали, что в смешанных культурах МСК
изменяют цитокиновый профиль дендритных клеток, натуральных киллеров, наивных и эффекторных Т-лимфоцитов, снижают экспрессию лимβ
фоцитами активационных маркеров ���������������������������������
CD�������������������������������
25, ���������������������������
CD�������������������������
38, CD�������������������
���������������������
69, ингибируют пролиферацию активированных лимфоцитов, дифференцировку и хемотаксис
В-клеток [16]. Взаимодействие МСК и антиген-презентирующих клеток
(АПК) блокирует созревание последних, смещая их развитие в направле- Рис. 2. Экспрессия м-РНК
нии регуляторных АПК. МСК не экспрессируют молекулы, стимулирую- цитокинов МСК, выделенными из пуповины
щие В-клеточную пролиферацию (В-7, �������������������������������
CD�����������������������������
40, CD�����������������������
�������������������������
40���������������������
L��������������������
, ������������������
CD����������������
80, CD����������
������������
86) и, на- (UC – umbilical cord)
против, презентируют антигены, вовлеченные в Т-клеточные взаимодей- и костного мозга (BM –
bone marrow) [33]
ствия (VCAM-1, ICAM-1, LFA-3). Независимо от происхождения клетки
мезенхимального ряда не лизируются аллогенными натуральными киллерами и цитотоксическими лимфоцитами [34]. Кроме того, МСК уменьшают секрецию лимфоцитами гамма-интерферона. Рассмотренные эффекты МСК могут привести к подавлению развития воспаления и реакции «трансплантат против хозяина», что играет важную роль при их
использовании в клеточной терапии заболеваний [16, 35]. МСК также не оказывают цитотоксического воздействия на мононуклеары, не изменяют противоопухолевый иммунитет организма.
Однако в работе [36] отмечено, что при хондрогенной дифференцировке МСК теряют иммуносупрессивные свойства и индуцируют иммунный ответ у реципиента.
Предтрансплантационное культивирование МСК с целью накопления клеточной биомассы
является одним из необходимых и ключевых этапов восстановительной клеточной терапии.
Однако в условиях in vitro пока не удается нарастить большие количества МСК с полностью сохраненным потенциалом дифференцировки. Поэтому для широкого использования МСК в лечебных
целях требуется отработка условий их культивирования, основанная на глубоком понимании
потенциала развития культуры, механизмов хондрогенной дифференцировки, позволяющих накопить достаточное количество биологического материала с заданными
свойствами.
МСК, полученные из разных источников, отличаются по дифференцировочному потенциалу, оцениваемому по скорости и процентному выходу детерминированных и дифференцированных клеток. Механизмы,
запускающие процесс клеточной специализации, только начинают изучать,
и пока они недостаточно ясны. До конца не понятно, с какими событиями
на молекулярном уровне связана предопределенность клеточной судьбы.
Кроме характерного для МСК развития в трех, так называемых ортодоксальных направлениях с образованием остеобластов, хондробластов
и адипоцитов, показана их пластичность, т. е. способность преодолевать Рис. 3. Диаграмма, покабарьеры линейной специфичности и дифференцироваться в нейральные зывающая количество
генов, которые регулии продуцирующие инсулин клетки [13, 14], гепатоциты [37], кардиомио- руются в процессе развициты [12] и другие типы соматических клеток.
тия МСК в остеогенном,
Факторы хондрогенеза МСК. При сравнении количества транскриби- адипогенном и хондрогенруемых генов в дифференцирующихся МСК было выявлено, что экспрес- ном направлении, а так­же
сия 8 генов усиливается при всех трех направлениях ортодоксальной количество общих генов,
характерных для двух
дифференцировки [8]. Ос­теобласты и адипоциты имеют 235 общих ге- и трех линий дифференнов, что дает основание предположить их происхождение из общей
цировки [8]
115
ус
и
ар
ел
кБ
ау
ем
ия
н
Рис. 4. Окраска матрикса (толуидин голубой – натрия борат) в контрольном образце МСК (А) и после их хондрогенной дифференцировки (Б). В – экспрессия хондрогенных белков: 1 – маркер молекулярного веса, 2 – синдеркан, 3 –
коллаген II типа, 4 – перлекан, 5 – бета-актин [38]
ак
ад
клетки-прогенитора, тогда как хондробласты развиваются из отдельного предшественника, имея
3 и 10 общих генов с остео- и адипоцитами соответственно (рис. 3).
Критериями хондрогенной дифференцировки (рис. 4) служат образование хондрогенного
матрикса (протеогликаны) и экспрессия специфичных для хондробластов белков (синдеркан,
перлекан, коллаген II типа) [38].
Среди основных индукторов хондрогенной дифференцировки (табл. 2) следует отметить белки семейства TGFβ (Transforming growth factor β), BMP (Bone morphogenetic protein), активин,
остеогенный протеин-1, GDF-5 (Growth differentiation factor 5) [39–41].
Т а б л и ц а 2. Индукторы хондрогенной дифференцировки МСК [40]
Цитокины/факторы роста
Небелковые химические факторы
Простагландин Е2
Тиреоидный гормон
1,25-дигидрокси-витамин D
Аскорбиновая кислота
Дексаметазон
Этанол
ци
он
ал
ьн
ая
Изоформы TGFβ
Изоформы BMP
Активин
Остеогенный протеин – 1
GDF-5
FGF-2
IGF-1
Пролактин
Интерлейкин-1β
Cyr61
HB-GAM
Соматотропин
Конканавалин А
Установлено, что недифференцированные МСК костного мозга экспрессируют мРНК для
BMP-2, -4, -6, -7 (Bone morphogenetic protein), TGFβ-1, -3, FGF-1, -2 (Fibroblast growth factor), IGF
(Insulin-like growth factor) [42].
TGFβ-1 инициирует и поддерживает хондрогенный потенциал клеток посредством стимуляции митоген-активируемых протеинкиназ p38, ERK-1 и в меньшей степени JNК. Регуляция хон-
На
116
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
дрогенеза осуществляется через изменение уровня экспрессии N-кадгерина и межклеточные
взаимодействия при конденсации МСК [43]. Конденсация МСК происходит при их культивировании в виде плотной сферической массы, полученной путем центрифугирования суспензии
клеток в конической пробирке. Хондрогенная дифференцировка МСК возможна только при
культивировании клеток в виде трехмерной структуры и в монослое не протекает [44].
В МСК жировой ткани экспрессия хондрогенных генов и синтез молекул межклеточного матрикса – хрящевого связующего протеина, хрящевого олигомерного матриксного протеина, аггрекана и коллагена I, II, IX типов усиливается в присутствии BMP-2 [41]. В отличие от МСК
жировой ткани, для успешной хондрогенной дифференцировки МСК костного мозга данный белок или его изоформы не требуются [45].
FGF и его различные изоформы играют важную роль в повышении экспрессии одного из
главных регуляторов хондрогенеза – транскрипционного фактора Sox9 [40].
Изучая хондрогенное действие FGF-2, TGFβ1 и дексаметазона на МСК костного мозга крысы
при культивировании в гидрогеле (альгинат и агароза) R. Coleman [45] установила, что обработка
клеточного монослоя FGF-2 в присутствии TGFβ1 в 2%-ной агарозе снижает синтез гликозаминогликанов, а в 2%-ном альгинате значительно усиливает индуцируемый TGFβ-1 хондрогенез.
По данным P. O’Connell и D. Frenz [28, 46], при совместном введении в среду роста TGFβ1
с IGF-1 или FGF-2 проявляется их синергичное действие на хондрогенную дифференцировку
МСК, обусловленное пересечением сигнальных путей. В то же время Т. Ito с соавт. получили
противоположный результат, показав, что FGF�����������������������������������������������
��������������������������������������������������
-2 способен инактивировать сигнальные пути, индуцируемые IGF-I и TGFβ, что стимулирует хондрогенный потенциал МСК [47].
L. Longobardi с соавт. выявили модулирующий хондрогенез эффект у IGFBP-3 (IGFсвязывающий протеин-3), проявляющийся в антипролиферативном, апоптотическом влиянии,
значительном снижении экспрессии коллагена II типа и синтеза протеогликана мезенхимными
хондропрогениторами [48].
Такие ростовые факторы и митогены, как пролактин, интерлейкин-1β, �������������������
Cyr����������������
61, HB����������
������������
-���������
GAM������
, гормон роста, конканавалин А, также потенциируют хондрогенез в МСК [40]. Среди небелковых
соединений хондрогенный потенциал МСК увеличивают простагландин Е2, тиреоидный гормон, 1,25-дигидрокси-витамин D, аскорбиновая кислота, дексаметазон, этанол [32, 40, 49].
Для индукции хондрогенной дифференцировки МСК при отсутствии ростовых факторов
в бессывороточной среде W. Kafienah с соавт. использовали ингибитор рецептора ретиноивой
кислоты (Sox9-независимый путь) [50].
Многие хондрогенные факторы не являются специфичными, они также могут принимать
участие в остеогенной дифференцировке МСК [45, 50]. Однако при применении оптимальных
технологий культивирования и в присутствии в среде роста определенных компонентов МСК
способны проявлять только хондрогенный фенотип и синтезировать молекулы хондрогенного
матрикса [32, 39, 40].
Считается, что хондрогенный потенциал МСК снижается при увеличении возраста донора
клеток. Так, H. Zheng с соавт. [51], изучая ответ МСК крысы костного мозга на хондрогенную
индукцию, показали значительное образование молекул экстрацеллюлярного матрикса (коллаген II типа, аггрекан) только у МСК, полученных от крыс 1-недельного возраста, тогда как МСК
животных в возрасте 12 недель и 1 года не обладали этой способностью.
Только тщательный подбор ростовых факторов и их концентраций, при которых будет создаваться баланс между самоподдержанием и дифференцировкой клеток в культуре, позволит получать необходимые количества МСК и производных хондропрогениторов для коррекции деструктивных заболеваний хрящевой ткани.
Перспективы применения МСК в клеточной терапии хрящевой ткани. Возможности
восстановления хрящевой ткани весьма ограничены. Если нарушение целостности хрящевой
ткани распространяется до кости, то заживление зависит от возраста пациента, размера и локализации дефекта [52, 53]. Образование гиалиновой ткани способствует заживлению небольших
дефектов, а большие повреждения заполняются фиброзной тканью или волокнистым хрящем,
который биохимически и биомеханически отличается от нормального гиалинового хряща.
117
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
На сегодняшний день основными хирургическими методами лечения хрящевой ткани являются: пластика дефектов хряща цилиндрическими костно-хрящевыми аутотрансплантатами,
взятыми из малонагружаемых отделов или из другого сустава и пересаженных в виде мозаики
(mosaicplasty), имплантация аутологичных хондроцитов. Каждая из этих методик имеет ряд недостатков, а именно, образование в суставах фиброзной ткани, травмирование здоровых суставных поверхностей, неэффективность при отсутствии в суставе пациента полноценной хрящевой
ткани [54]. Наиболее перспективной методикой лечения является аутотрансплантация культур
МСК.
Расширение знаний о биологии стволовых клеток способствовало разработке методов клеточной терапии, направленно стимулирующих структурно-функциональное восстановление
хрящевой ткани. При введении МСК в место дефекта хряща используются два различных подхода: 1 – пересадка хондропрогениторов или полностью дифференцированных хондроцитов,
2 – пересадка менее дифференцированных плюрипотентных стволовых клеток.
Способность МСК восстанавливать хрящевую ткань в пораженном участке сперва была изучена на животных. ����������������������������������������������������������������������������
Y���������������������������������������������������������������������������
. Anraku с соавт. показали, что на 4-е сутки после введения экспериментальным животным недифференцированных МСК полость хрящевого дефекта закрывалась, к 7-м
суткам в центре региона повреждения инициировалась хондрогенная дифференцировка, через
2 недели наблюдалось образование хрящевой ткани, а в течение последующих 4 недель гиалиновый хрящ полностью реконструировался [1].
При изучении способности хондрогенных предшественников, полученных из МСК костного
мозга крысы, восстанавливать структуру и функцию метафиза, �������������������������������
R������������������������������
. ����������������������������
Coleman���������������������
выявила, что введенные в область дефекта хряща хондропрогенеторы репарировали только повреждения метафиза,
но не его функцию [45].
По данным M���������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������
. Nishimori с соавт. при внутрисуставной имплантации крысе МСК [2] заживление остеохондрального дефекта происходит значительно быстрее, чем в контроле, когда животным проводили внутрисуставное введение фосфатно-солевого буфера. На иммунодефицитных
крысах �������������������������������������������������������������������������������
A������������������������������������������������������������������������������
. Troken����������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������
с соавт. продемонстрировали ключевую роль плотности МСК, инкапсулированных в полиэтиленгликоль-диакрилатный гидрогель, используемый в дизайне хондрогенного
дефекта [55].
После получения доказательств, что МСК способны дифференцироваться в хондроциты и восстанавливать пораженный участок хряща, они были применены в клинике для лечения людей.
Для терапии деструктивных поражений хряща, возникших в результате развития остеоартрита, U. Noth использовал пересадку аутологичных МСК, результаты которой продемонстрировали
значительное снижение симптоматики заболевания [56]. Имплантированные клетки дифференцировались в хондроциты гиалиновой хрящевой ткани. Наблюдение за состоянием пациентов
в течение последующих 5 лет доказали эффективность клеточной терапии. Другая группа ученых применяла аутологичные МСК костного мозга для лечения значительных дефектов суставного хряща, что позволило редуцировать симптомы заболевания у 3 человек, хотя не получено
доказательств, что пересаженные МСК дифференцировались в клетки гиалинового хряща [57].
E����������������������������������������������������������������������������������������
. Wakitani с соавт. успешно применил аутологичные МСК костного мозга для лечения суставных дефектов у больных остеартритом людей, перенесших остеотомию большеберцовой кости
[58]. Перспективные для практической медицины данные также были получены группой
C. Centeno при лечении остеоартрита с помощью МСК [59].
В ряде работ показано, что аутологические МСК из костного мозга больных, страдающих
артритом, обладают пониженной способностью дифференцироваться в хондробласты [56]. В таких случаях, очевидно, к трансплантату аутологических клеток необходимо добавлять донорский клеточный материал.
H��������������������������������������������������������������������������������������
. Koga с соавт. использовали малоинвазивный адгезионный метод для доставки МСК в пораженный хрящ. Они показали, что при внесении суспензии МСК в место дефекта хряща более 60 %
клеток адгезируют к его поверхности в течение 10 мин и способствуют его восстановлению [60].
Трансплантированные МСК обладают высокой миграционной способностью, аккумулируются в зоне повреждения, приживаются и начинают дифференцироваться. Триггером к мобили-
На
118
ус
и
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
зации служат молекулярные сигналы из очага повреждения, например синтезируемый при тканевой гипоксии белок SDF-1 (stromal cell-derived factor).
Участие стволовых клеток в восстановлении поврежденных тканей – сложный, многофакторный процесс, в котором важную роль наряду с образованием новых клеток из МСК могут
играть их трофические и иммуномодулирующие свойства.
Клеточная терапия МСК в перспективе может стать альтернативой хирургическому методу
лечения. МСК несложно выделить из мезенхимальной ткани, клетки обладают высокой пролиферативной активностью и способностью к хондрогенной дифференцировке, методики лечения
малоинвазивны.
Конечно, использование трансплантации МСК как метода терапии ортопедических заболеваний – это прорыв в медицине, однако данный путь не прост и его эффективность будет доказана
только после всестороннего анализа (в разных лабораториях) репаративных процессов в хрящевой ткани и терапевтического потенциала МСК. Кроме того, во многом остается под вопросом
оценка отдаленных результатов заместительной клеточной терапии, био- и онкогенетическая
безопасность МСК.
Заключение. МСК являются плюрипотентными клетками, способными дифференцироваться в соматические клетки ряда тканей и органов. Иммуномодулирующие свойства МСК наряду
со способностью к хондроцитарной дифференцировке позволяют использовать их в терапии заболеваний, сопровождающихся поражением хрящевой ткани, и тем самым повысить эффективность лечения и качество жизни больных людей.
Литература
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
1. A n r a k u Y., M i z u t a H., S e i A. et al. // Osteoarthritis Cartilage. 2008. N 16. P. 961– 964.
2. N i s h i m o r i M., D e i e M., K a n a y a A. et al. // Journal of Bone and Joint Surgery – British Volume. 2006.
Vol. 88-B, N 9. P. 1236–1244.
3. K a f i e n a h W., M i s t r y S., P e r r y M. et. al. // Stem Cells. 2007. Vol. 25. P. 2460–2468.
4. Z h e n g H., M a r t i n J., D u w a y r i Y. et al. // The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and
Medical Sciences. 2007. N 62. P. 136–148.
5. Ч а й л а х я н Р. К., Л а ц и н и к Н. В., Г е р а с и м о в Ю. В. и др. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. Т. 1, № 4. С. 6–12.
6. M u s i n a R. A., B e k c h a n o v a E. S., S u k h i k h G. T. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.
2005. Vol. 139. P. 504–509.
7. R o m a n o v Y u. A., D a r e v s k a y a A. N., M e r z l i k i n a N. V., B u r a v k o v a L. B. // Cell. Technol. Biol.
Med. 2005. N 3. Р. 138–143.
8. M u s i n a R. A., B e k c h a n o v a E. S., B e l y a v s k i i A. V. et al. // Bulletin of Experimental Biology and
Medicine. 2007. Vol. 143. P. 127–131.
9. M i n g - S o n g T s a i M. - S., L e e J. - L., C h a n g Y. - J. et al. // Human Reproduction. 2004. Vol. 19. P. 1450–1456.
10. Y o s h i m u r a H., M u n e t a T., N i m u r a A. et al. // Cell and Tissue Research. 2007. Vol. 327. P. 449–462.
11. W e x l e r S., D o n a l d s o n C., D e n n i n g - K e n d a l l P. et al. // Br. J. Haematol. 2003. Vol. 121. P. 368–374.
12. К р у г л я к о в П. В., С о к о л о в а И. Б., А м и н е в а Х. К. и др. // Цитология. 2004. Т. 49, № 12. С. 1043–1054.
13. C h e n L. - B., J i a n g X. - B., Y a n g L. // Wolrd J Gastroenterol. 2004. Vol. 10. P. 3016–3020.
14. W o o d b u r y D., S c h w a r z E. J., P r o c k o p D. J., B l a c k I. B. // Journal of Neuroscience Research. 2000.
N 61. P. 364–370.
15. А н о х и н а Е. Б. Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс: Автореф. дис. … канд. биол. наук. М., 2007.
16. A g g a r w a l S., P i t t e n g e r M. // Blood. 2005. Vol. 105. P. 1815–1822.
17. K o l f C. M., C h o E., T u a n R. S. // Arthritis Research & Therapy. 2007. N 9. P. 204–213.
18. M a j u m d a r M. K., K e a n e - M o o r e M., B u y a n e r D. // Journal of Biomedical Science. 2003. N 10.
P. 228–241.
19. T o k a l o v S., G r ü n e r S., S c h i n d l e r S. et al. // Mol. Cells. 2007. Vol. 24. P. 255–260.
20. Л а г а р ь к о в а М. А., Л я к и ш е в а А. В., Ф и л о н е н к о Е. С. и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2006. № 1. С. 2–6.
21. Б е р с е н е в А. В. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2005. № 1. C. 14–16.
22. B r a k e b u s c h C., F ä s s l e r R. // Cancer Metastasis. 2006. Rev. 24. P. 403–411.
23. K l e m e n s M. R., S h e r m a n W. R., H o l m b e r g N. J. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990.
Vol. 172. P. 1371–1377.
24. G a r g e t t C. E. // Aust N Z J Obstet Gynaecol. 2006. Vol. 46. P. 250–253.
25. A t t i s a n o L., W r a n a J. L. // Cytokine Growth Factor. 1997. Rev. 7. P. 327–339.
119
ус
и
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
26. L e b e d e v a T., D u s t i n M. L., S y k u l e v Y. // Curr. Opin. Immunol. 2005. Vol. 17. P. 251–258.
27. A i s e n P. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005. Vol. 36. P. 2137–2143.
28. O’ C o n n e l l P. J., G e r k i s V., d’A p i c e A. J. F. // The Journal Of Biological Chemistry. 1991. Vol. 266.
P. 4593–4597.
29. C l o v e r J., D o d d s R. A., G o w e n M. // J Cell Sci. 1992. N 103. P. 267–271.
30. S a j i d M., S t o u f f e r G. A. // Thromb. Haemost. 2002. Vol. 87. P. 187–193.
31. Ш а х о в В. П., П о п о в С. В. Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии. Томск, 2004. С. 39–97.
32. P a r s h D., F e l l e n b e r g J., B r u m m e n d o r f T. H. et al. // J. Mol. Med. 2004. Vol. 82. P. 49–55.
33. L u L. - L., L i u Y. -J., Y a n g S. - G. et al. // Haematologica. 2006. N 91. P. 1017–1026.
34. С у з д а л ь ц е в а Ю. Г., Б у р у н о в а В. В., В а х р у ш е в И. В. и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2008.
Т. 145, № 2. С. 188–191.
35. К р у г л я к о в П. В., Л о х м а т о в а Е. А., К л и м о в и ч В. Б., З а р и ц к и й А. Ю. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006. Т. 3, № 5. C. 36–41.
36. C h e n X., M c C l u r g A., Z h o u G. - Q. et al. // Stem cells. 2007. N 2. P. 364–370.
37. T a l e n s - V i s c o n t i R., B o n o r a A., J o v e r R. et al. // World J Gastroenterol. 2006. Vol. 12. P. 5834–5845.
38. K a d i v a r M., K h a t a m i S., M o r t a z a v i Y. et al. // Iranian Biomedical Journal. 2006. Vol. 10. P. 175–184.
39. A l h a d l a q A., E l i s s e e f f J. H., H o n g L. et al. // Annals of Biomedical Engeneering. 2004. Vol. 32. P. 911–923.
40. H e n g B. C., C a o T., L e e E. H. // Stem Cells. 2004. N 22. P. 1152–1167.
41. S c h m i t t B., R i n g e J., H ä u p l T. et al. // Differentiation. 2003. Vol. 71. P. 567–577.
42. H e n n i g T., L o r e n z H., G o e t z k e K. et al. // European Cells and Materials. 2006. Vol. 12. Suppl. 1. P. 33.
43. T u l i R., T u l i S., N a n d i S. et al. // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 41227–41236.
44. Z u k P. A., Z h u M., A s h j i a n P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Los Angeles,
2002.
45. C o l e m a n R. Development of a small animal model to study tissue engineering strategies for growth plate defects.
Dis. philosophy in bioengineering. Georgia Institute of Technology, 2007.
46. F r e n z D. A., L i u W., W i l l i a m s J. D. et al. // Development. 1994. N 120. P. 415–424.
47. I t o T., S a w a d a R., F u j i w a r a Y., T s u c h i y a T. // Cytotechnology. 2008. Vol. 56. P. 1–7.
48. L o n g o b a r d i L., T o r e l l o M., B u c k w a y C. et al. // Endocrinology. 2003. Vol. 144. P. 1695–1702.
49. Y o o J. U., B a r t h e l T. S., N i s h i m u r a K. et al. // The Journal of Bone and Joint Surgery. 1998. N 80.
P. 1745–57.
50. K a f i e n a h W., M i s t r y S., P e r r y M. J. et. al. // Stem Cells. 2007. Vol. 25. P. 2460–2468.
51. Z h e n g H., M a r t i n J. A., D u w a y r i Y. et al. // The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences
and Medical Sciences. 2007. N 62. P. 136–148.
52. F u l l e r J. A., G h a d i a l l y F. N. // Clin Orthop Relat Res. 1972. N 86. Р. 193–205.
53. C o n v e r y F. R., A k e s o n W. H., K e o w n G. H. // Clin Orthop Relat Res. 1972. N 82. Р. 253–262.
54. K o g a H., E n g e b r e t s e n I., B r i n c h m a n n J. E. et al. // Knee Surg. Sports Traumatol Arthtosc. 2009.
N 7. Р. 1289–1297.
55. T r o k e n A., M a r i o n N., H o l l i s t e r S., M a o J. // Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers,
Part H: Journal of Engineering in Medicine. 2007. Vol. 221. P. 429–440.
56. N ö t h U., S t e i n e r t A. F., T u a n R. S. // Nature Clinical Practice Rheumatology. 2008. N 4. P. 371–380.
57. W a k i t a n i S., N a w a t a M., T e n s h o K. et al. // J Tissue Eng Regen Med. 2007. Vol. 1. P. 74–79.
58. W a k i t a n i S., I m o t o K., Y a m a m o t o T. et al. // Osteoarthritis Cartilage. 2002. N 10. P. 199–206.
59. C e n t e n o C. J., B u s s e D., K i s i d a y J. et al. // Pain Physician. 2008. Vol. 11. P. 343–353.
60. K o g a H., S h i m a y a M., M u n e t a T. et al. // Arthritis Research & Therapy. 2008. Vol. 10. P. 84.
M. V. VOLK, E. S. LOBANOK, P. A. VOLOTOVSKI
ьн
CHONDROGENIC POTENTIAL OF MESENCHYMAL STEM CELLS
Summary
На
ци
он
ал
Mesenchymal stem cells (MSC) are pluripotent cells of an adult organism which are able to differentiate to mature
somatic cells of a number of tissues and organs. MSC′s sources are red bone marrow, adipose tissue, skin, umbilical cord
blood and other tissues. MSC can acquire chondrogenic phenotype by influence of chondrogenic factors. Running
an experiments on animals to heal cartilage defect by MSC revealed significant potential for using them in clinical practice.
MSC′s immunomodulatory properties and chondrogenic potential make it possible to use these cells for cartilage defect
therapy to improve medical treatment efficiency and life quality of patients.
ВУЧОНЫЯ БЕЛАРУСІ
ел
ПАМЯТИ ЕЛЕНЫ БРОНИСЛАВОВНЫ ЯРОНСКОЙ
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
24 сентября 2011 г. на 57-м году жизни скоропостижно
скончалась известный ученый в области биофизики и биохимии растений, ведущий научный сотрудник Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, доктор биологических наук Елена Брониславовна Яронская.
Елена Брониславовна родилась 10 мая 1955 г. в г. Магнито­
горске в семье служащих. После окончания с золотой медалью
средней школы в Минске, а затем с отличием Белорусского государственного университета им. В. И. Ленина (биологический
факультет), она поступила в Москве в целевую аспирантуру по
специальности «биохимия» при Институте биоорганической
химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова
АН СССР (1977–1981). В 1982 г. блестяще защитила диссертацию на соискание ученой степени кандидата химических
наук по теме «Исследование липидной зависимости пирофосфатазы микросом». В 1981 г. Е. Б. Яронская вернулась в Минск
и была зачислена младшим научным сотрудником в Институт фотобиологии АН БССР (с 2004 г. –
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси). С этого времени ее научный путь
был прочно связан с лабораторией биофизики и биохимии фотосинтетического аппарата этого
института, научные интересы – с формированием и функционированием пигментного аппарата
фотосинтеза в растительной клетке.
В первые годы своей деятельности в Институте фотобиологии Е. Б. Яронская активно включилась в исследование чрезвычайно интересного и нового в биологии направления, связанного
с использованием системы биосинтеза хлорофилла в качестве мишени для действия фотодинамических гербицидов. С ее участием были изучены фотофизические и фотохимические процессы,
лежащие в основе фотодинамических повреждений растительных клеток с нарушенным метаболизмом порфиринов, разработаны теоретические основы создания фотодинамических гербицидов и новые композиции этих соединений, изучена природа их селективности, созданы технологии применения данных препаратов в практике сельского хозяйства. Результаты этих работ
внесли существенный вклад в развитие фундаментальной и прикладной наук, занимающихся
разработкой средств защиты растений. Полевые опыты, проведенные совместно с БелНИИЗиК
(в настоящее время – РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию», г. Жодино) на посевах ячменя и
овса, а также в розариях совхоза «Декоративные культуры», показали высокую эффективность
новых оригинальных препаратов при борьбе с двудольными сорняками.
Е. Б. Яронская понимала, что в процессе эволюции природа создала ряд механизмов, контролирующих степень развития фотодинамических процессов, связанных с нарушением метаболизма
порфиринов, функционирование которых является чрезвычайно важным в жизнедеятельности
сельскохозяйственных культур. Ею был раскрыт один из механизмов, контролирующий сверхнакопление порфиринов на генетическом уровне через механизмы пластидноядерной сигнализации. Ей удалось показать, что накопление ряда Mg-содержащих порфиринов (предшественников
хлорофилла в биосинтезе) подавляет экспрессию ядерных генов, кодирующих ферменты их биосинтеза, и выключает тем самым собственное образование этих тетрапирролов.
121
ус
и
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
Елена Брониславовна возглавила в институте новое приоритетное научное направление –
установление полифункциональности молекулы 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК). Наряду
с тем, что эта аминокислота является предшественником хлорофилла и гема, она обладает еще
и свойствами регулятора роста растений. Е. Б. Яронской в соавторстве с коллегами предложено
несколько возможных механизмов функционирования АЛК как регулятора роста растений,
в частности, через ее связь с метаболизмом фитогормонов цитокининов. В работе, проведенной
под руководством Е. Б. Яронской, впервые был зарегистрирован повышенный уровень содержания
цитокининов в растениях, содержащих избыток АЛК. Была высказана гипотеза, согласно которой
избыток АЛК, не участвующей в синтезе белков, хлорофилла и гема, расщепляется на два фрагмента, один из которых используется в синтезе пуринового кольца, составляющего основу цитокининов. Эти исследования открыли возможность управлять ростом и развитием растений с помощью экзогенной АЛК путем направленного изменения уровня эндогенных цитокининов.
В полевых испытаниях на растениях ячменя белорусской селекции (сорт Гонар), семена которых были инкрустированы составами, содержащими АЛК, было отмечено повышение всхожести и энергии прорастания семян, ускорение фазы кущения проростков, увеличение их высоты,
массы надземной части и общей кустистости, а также содержания хлорофилла, каротиноидов,
белков и свободных сахаров, что в итоге обеспечило прибавку урожайности на 23–26 %. Высокая
эффективность действия АЛК была продемонстрирована Е. Б. Яронской с коллегами при выращивании традиционной в Беларуси культуры – льна-долгунца. Отмечено увеличение общей
и технической длины растений, количества коробочек на них и количества семян в коробочках.
Прибавка к урожаю при этом составила 57 ц/га при средней урожайности 11 ц/га. На примере
водоросли хлорелла было показано, что введение АЛК в культуральную среду для выращивания
является эффективным способом повышения продуктивности водоросли и ее питательной ценности как кормовой добавки к рациону сельскохозяйственных животных. Когда в лаборатории
химии липидов Института биоорганической химии НАН Беларуси (заведующий лабораторией
д. х. н. М. А. Кисель) был осуществлен синтез липофильного производного АЛК – ее гексиловый
эфир, то по инициативе и под руководством Е. Б. Яронской были проведены научные исследования и производственные испытания, которые показали более высокую эффективность действия
этого препарата по сравнению с АЛК. Это объяснялось его повышенной способностью проникать в клетки растений и медленным гидролизом до свободной кислоты, что позволяет сохранять ее определенный уровень в растительной ткани в течение длительного времени.
Е. Б. Яронская поддерживала тесные связи с немецкими коллегами из Института биологии при
университете им. А. Гумбольдта (г. Берлин) – профессорами Паулем Хофманном и Берн­хардом
Гриммом, с докторами наук Габби Вальтер и Хайко Локштейном. В совместной работе с проф.
Б. Гриммом было показано, что АЛК контролирует экспрессию ряда закодированных в ядре хлоропластных белков на посттрансляционном уровне путем увеличения их стабильности. Стабилизация
белкового метаболизма под действием экзогенной АЛК может способствовать формированию устойчивости растений к ряду стрессовых факторов. Проведенные с участием Е. Б. Яронской опыты на
ячмене с целью выяснения механизмов формирования солеустойчивости растений позволили высказать гипотезу, согласно которой ингибирование синтеза эндогенной АЛК в стрессовых условиях
приводит к переключению метаболизма глутаминовой кислоты – предшественника АЛК и универсального стресс-протектора пролина – с пути синтеза хлорофилла и гема на путь синтеза пролина,
стимуляции накопления последнего и возрастанию солеустойчивости растений.
В 2009 г. Елена Брониславовна успешно защитила диссертацию на соискание ученой степени
доктора биологических наук на тему «Молекулярно-мембранные механизмы регуляции биосинтеза тетрапирролов в растениях». Она была удостоена большой чести – диплом доктора наук ей
был вручен Президентом Республики Беларусь Александром Григорьевичем Лукашенко. В диссертации раскрыт ряд генетических, биохимических и биофизических механизмов регуляции
биосинтеза растительных тетрапирролов, механизмов пластидно-ядерного взаимодействия, природы пластидных сигналов и их роли в регуляции экспрессии ядерных генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов. В работе блестяще показано взаимодействие трех сигналов –
светового, цитокининового и пластидного – в контроле функционирования ключевых стадий
На
122
ус
и
На
ци
он
ал
ьн
ая
ак
ад
ем
ия
н
ау
кБ
ел
ар
биосинтеза хлорофилла. На современном методическом уровне, в частности, in vivo с использованием дрожжевой двугибридной системы показано существование надмолекулярного комплекса магний-хелатазы и метилтрансферазы, который координирует активность этих двух ферментов. Полученные результаты наряду с имеющимися в литературе сведениями о существовании
полифункционального комплекса, участвующего в синтезе АЛК, экспериментально подтверждают идею, которая много лет назад была высказана А. А. Шлыком и сотрудниками о существовании полиферментного комплекса, осуществляющего биосинтез хлорофилла.
Е. Б. Яронская в совершенстве владела широким спектром биохимических, биофизических
и молекулярно-биологических методов исследования биосистем, что делало ее незаменимым
консультантом для молодых исследователей лаборатории, аспирантов. Она привлекала к научной работе молодежь, заботилась о ней и увлекала ее новыми научными идеями. Ею воспитаны
два молодых кандидата наук – И. В. Вершиловская и Е. Р. Грицкевич.
В период с 2006 по 2009 гг. Е. Б. Яронская являлась руководителем проекта «Разработка биорациональных средств защиты растений на основе производных 5-аминолевулиновой кислоты»
в ГПОФИ «Биорациональные пестициды», а с 2010 г. – руководителем задания «Разработка
и освоение технологии производства компонентов новых инкрустирующих составов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур в ГП «Инновационные биотехнологии», а также
проекта «Изучение механизмов действия сульфонилмочевинных гербицидов и механизмов снижения их фитотоксичности по отношению к сельскохозяйственным культурам с помощью 5-аминолевулиновой кислоты» ГПНИ «Фундаментальные основы биотехнологий». Она – автор более 150
научных работ, из них – двух глав в отечественной и зарубежной монографиях, 4 патентов на изобретения. В 2011 г. ею совместно с Н. Г. Авериной подготовлена к печати монография «Биосинтез
тетрапирролов в растениях», в которой на основании собственных экспериментальных данных
представлена концепция о независимом функционировании систем синтеза хлорофилла и гема
в хлоропласте, уделено внимание использованию систем биосинтеза тетрапирролов в качестве мишеней для фотодинамических гербицидов, АЛК как стимулятора роста и развития растений
и агента, формирующего устойчивость растений к абиотическим факторам внешней среды, а также созданию мутантов и трансгенных растений с модифицированной системой биосинтеза хлорофилла, представляющих собой большой потенциал для сельского хозяйства.
На протяжении последних 15 лет Елена Брониславовна являлась секретарем Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков и проводила огромную работу по организации
и проведению съездов общества и регулярных международных научных конференций «Молекулярные,
мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», участие в которых принимали более 200 ученых из стран ближнего и дальнего зарубежья. Она была активным членом Совета по защите диссертаций при Институте биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси.
Следует отметить, что Е. Б. Яронская как кандидат химических наук сформировалась в Москве
и прошла обучение в школе профессора Л. Д. Бергельсона. Затем она пришла в Институт фотобиологии к члену-корреспонденту АН СССР, профессору А. А. Шлыку – тоже в замечательную
научную школу Годнева-Шлыка, дальнейшее развитие которой в институте проходило под руководством проф. Н. Г. Авериной. По-видимому, это было очень важным в ее становлении как настоящего, влюбленного в науку исследователя. Но вместе с тем и собственные блестящие способности
Е. Б. Яронской позволили ей сформироваться в известного, серьезного современного ученогобиолога, доктора наук. Глубокая порядочность, принципиальность и требовательность, сочетающиеся с отзывчивостью и скромностью, позволили Елене Брониславовне заслужить уважение
и высокий авторитет у сотрудников института. Коллеги и ученики помнят Елену Брониславовну
как простого, замечательного человека с щедрым сердцем, которая охотно делилась своими знаниями и экспериментальным мастерством.
Уход из жизни Елены Брониславовны Яронской является тяжелой потерей не только для коллектива Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, но и для белорусской
биологической науки.
И. Д. Волотовский, Л. В. Дубовская,
Н. Г. Аверина, Н. В. Шалыго, Е. И. Слобожанина
ар
СЕРЫЯ БІЯЛАГІЧНЫХ НАВУК
ус
и
ВЕСЦІ НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМІІ НАВУК БЕЛАРУСІ № 4 2011
ел
Рефераты
УДК 634.739.3:736(476)
кБ
Р у п а с о в а Ж. А., Я к о в л е в А. П., Л и ш т в а н И. И., Ж д а н е ц С. Ф. Особенности развития вегетативной сферы таксонов рода Vaccinium в опытной культуре на выбывшем из промышленной эксплуатации торфяном месторождении севера Беларуси // Весці НАН Беларусі. Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 5–14.
ем
ия
н
ау
Дана сравнительная оценка биометрических показателей текущего прироста двух категорий побегов –
формирования и ветвления у 6 таксонов рода Vaccinium: V. uliginosum, выбранной в качестве эталона сравнения,
V. angustifolium, гибридов узколистной и высокорослой голубик Northblue и Northcountry, сорта Bluecrop высокорослой голубики, а также V. vitis-idaea при возделывании на остаточном слое торфяной залежи в контрастные по гидротермическому режиму сезоны. Показано, что темпы формирования их вегетативной сферы определялись генотипом и возрастом растений, а также характером погодных условий вегетационного периода.
Несмотря на генотипические различия параметров развития вегетативной сферы, у таксонов рода
Vaccinium выявлен ряд сходных тенденций в проявлении их ответной реакции на воздействие абиотических
факторов. На фоне экстремально высоких температур летнего периода, сочетавшихся с периодическим дефицитом влаги, на побегах ветвления у них наблюдалось заметное снижение количества листьев, сопровождавшееся увеличением их размеров, без изменения формы, что должно было способствовать нормализации
работы фотосинтетического аппарата растений в условиях температурного стресса. Наибольшей устойчивостью параметров развития побегов ветвления и их ассимилирующих частей к неблагоприятным погодным
факторам характеризовались межвидовые гибриды Northblue и Northcountry.
Табл. 10. Библиогр. – 2 назв.
ак
ад
УДК 634.737:634.1.076
П а в л о в с к и й Н. Б. Сохраняемость плодов разных сортов и видов голубики, интродуцированных
в Беларуси // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 15–19.
ьн
ая
На основании результатов пятилетних исследований установлено, что сохраняемость плодов голубики
в условиях обычной газовой среды у разных сортов составляла 7–19 сут при температуре хранения +5 °C
и 8–33 сут при температуре +2 °C. Широкий диапазон сортовых особенностей голубики по сохраняемости ягод
указывает на генотипическое разнообразие данной культуры. Сохраняемость ягод голубики является сортоспецифичным признаком и зависит от скороспелости сорта. Плоды позднеспелых сортов медленнее теряют
массу при хранении и соответственно обладают более продолжительной сохраняемостью. Лежкость ягод
определялась потерями, состоящими главным образом из естественной убыли массы и в меньшей степени –
из-за отходов от функциональных расстройств и гнили.
Табл. 2. Библиогр. – 5 назв.
ал
УДК 581.8+582.592
К о р н е е в а Г. И. Анатомия корня гибридных форм рода фаленопсис (Phalaenopsis Blume) // Весцi НАН
Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 20–25.
ци
он
Анатомическое строение воздушных корней фаленопсиса отражает его жизненную форму как эпифита.
Многослойный эпидермис с пропускными каналами обеспечивает водо- и газообмен. Толстый слой кутикулы
на эпидермисе, водоносные клетки и кристаллы в клетках коры способствуют удержанию воды в условиях
дефицита влаги. Благодаря хлоропластам, содержащимся в клетках коры, корни фаленопсиса участвуют в процессе фотосинтеза. Механические волокна в структуре корней усиливают их прочность для закрепления на
опоре.
Ил. 3. Библиогр. – 17 назв.
На
124
ус
и
УДК 582.548.21
Ж у д р и к Е. В. Особенности онтогенеза Strelitzia reginae Banks при культивировании в Беларуси //
Весцi НАН Беларуси. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 26–34.
кБ
ел
ар
Длительный латентный и виргинильный периоды в онтогенезе стрелитции королевской в оранжерейных
условиях определяют необходимость поиска способов ускорения темпов развития растений. Перспективным
путем регулирования развития растений является применение регуляторов роста, позволяющих сократить
продолжительность основных периодов онтогенеза: гетероауксина, фитовитала и его препаративных форм.
Повышение всхожести семян обеспечивает обработка фитовиталом с янтарной кислотой (1,5 % экспозиция 24 ч),
гетероауксином (0,01 %, экспозиция 6 ч). Сокращение фазы прохождения стадии проростка обеспечивает обработка фитовиталом (2 %), фитовиталом с салициловой кислотой (1,5 %), гетероауксином (0,01 %). Наиболее
эффективным регулятором роста на всех этапах онтогенеза стрелитции королевской является 1,5 % фитовитал
с янтарной кислотой при экспозиции 24 ч.
Табл. 4. Ил. 3. Библиогр. – 4 назв.
УДК 631. 524.84.575.222.73:633.1
ау
К о р е н ь Л. В., О р л о в с к а я О. А., Х о т ы л е в а Л. В. Генетический анализ формирования хозяйственно ценных признаков у отдаленных гибридов пшеницы (Triticum aestivum) // Весці НАН Беларусі.
Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 35–40.
УДК 575.222.73:577.2.086 [633.11+633.14]
ем
ия
н
На основании анализа степени доминантности и трансгрессивной изменчивости признаков продуктивности в F1–F4 -поколениях отдаленных гибридов пшеницы отобраны формы, сочетающие устойчивость
к болезням с высоким уровнем продуктивности. Полученные качественно новые интрогрессивные формы
могут быть рекомендованы для включения в селекционные программы в качестве генетических источников изменчивости хозяйственно ценных признаков пшеницы, а также для практического использования
в сельскохозяйственном производстве.
Табл. 6. Библиогр. – 12 назв.
ак
ад
Е р м и ш и н а Н. М., К р е м е н е в с к а я Е. М., Г у к а с я н О. Н., Б у ш т е в и ч В. Н., Г р и б С. И.,
Л е м е ш В. А. Использование ДНК-маркеров для создания D/R-замещенных форм тритикале с оптимальным аллельным составом локуса Glu-D1 // Весці НАН Беларусі. Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 41–45.
ьн
ая
С целью оптимизации процесса создания D/R-замещенных линий тритикале с улучшенными хлебопекарными качествами изучали возможность использования ДНК-маркеров для подбора исходного материала,
идентификации и отбора замещенных форм в расщепляющихся поколениях гибридов между тритикале и пшеницей. Выделены сорта яровой и озимой мягкой пшеницы с оптимальным аллельным составом локуса Glu-D1
(Dx5 + Dy10), которые целесо-образно включать в гибридизацию с тритикале. Показано, что маркеры к аллелю Dx5 можно с успехом использовать для отбора 1D/1R-замещенных форм в популяциях гибридов. Маркерсопутствующую селекцию 1D/1R-замещенных форм целесообразно проводить начиная с поколения F2.
Ил. 3. Библиогр. – 14 назв.
УДК 581.14:582.912.42
ал
К у д р я ш о в а О. А., В о д ч и ц М. П., Г л е б Е. П., Г у к Е. С., В о л о т о в и ч А. А. Стимуляция
роста и развития листопадных форм Rhododendron in vivo с использованием установки освещения на основе
светодиодов // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 46–51.
На
ци
он
Приведены результаты испытаний созданного опытного образца светодиодной лампы и сравнительного
анализа эффективности использования световых установок с разным типом ламп для повышения всхожести,
стимуляции in vivo роста и развития растений двух исследуемых популяций Rhododendron luteum (L.) Sweet.
Установлено повышение в 1,3–2,5 раза всхожести семян при использовании оригинальной установки освещения на основе светодиодов. Выявлено достоверное (в большинстве случаев при Р < 0,01) увеличение высоты
проростков при использовании созданной светодиодной лампы. Трехфакторный дисперсионный анализ установил достоверное (в большинстве случаев при Р < 0,01) влияние типа используемых для освещения ламп,
возраста и генотипа проростков на изменчивость трех анализируемых признаков.
Табл. 4. Библиогр. – 12 назв.
125
ус
и
УДК 58.02+577.352
Д р е м у к И. А., Ш а л ы г о Н. В. Окислительные процессы и проницаемость клеточных мембран
в проростках ячменя (Hordeum vulgare) при совместном действии низкотемпературного и водного стресса // Весці НАН Беларусі. Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 52–56.
кБ
ел
ар
Исследовали влияние совместного действия низкотемпературного и водного стресса на накопление общего
уровня активных форм кислорода (АФК и H2O2), содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ)
и проницаемость клеточных мембран для электролитов и свободных нуклеотидов в проростках ячменя. Показано, что совместное действие низкотемпературного и водного стресса приводит к торможению роста проростков ячменя, накоплению в них АФК и интенсификации процессов ПОЛ, что обусловлено преимущественно
воздействием низкой температуры. При совместном действии низкой температуры и избыточного увлажнения, так же, как и при их раздельном воздействии отмечено увеличение выхода электролитов из ткани растений, что указывает на нарушение барьерных свойств клеточных мембран. При этом проницаемость мембран
для свободных нуклеотидов не изменялась. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения
в клеточных мембранах, вызванные низкой температурой, избыточным увлажнением и совместным действием данных стрессовых факторов, имеют обратимый характер.
Табл. 2. Ил. 2. Библиогр. – 10 назв.
ау
УДК 579.2+579.6
ем
ия
н
В а ж и н с к а я И. С., К у п ц о в В. Н., К о л о м и е ц Э. И., Н о в и к Г. И., К а н т е р о в а А. В.
Криоконсервация как эффективный способ хранения фитопатогенных грибов // Весцi НАН Беларусi. Сер.
бiял. навук. 2011. № 4. С. 57–62.
Изучены физиолого-морфологические и фитопатогенные свойства грибов F. solani БИМ F-347, R. solani БИМ
F-362, C. lupini БИМ F-382 после хранения методом криоконсервации. Установлено, что длительное хранение грибных культур в замороженном при –70 °С состоянии не привело к изменениям в строении мицелия, скорости роста
и спорообразования. Штаммы грибов сохранили способность инфицировать и вызывать заболевания растений озимой ржи и люпина. Показано, что криоконсервация оказалась оптимальным способом сохранения
фитопатогенных свойств грибов по сравнению с методами субкультивирования и лиофилизации. Таким образом, метод криоконсервации может быть рекомендован для длительного хранения грибных культур при
создании специализированных коллекций фитопатогенных микроорганизмов.
Табл. 1. Ил. 3. Библиогр. – 31 назв.
ак
ад
УДК 615.357+591.463
В е р е щ а к о Г. Г., Г о р о х Г. А., Ф е д о с е н к о О. Л., Г у н ь к о в а Н. В. Влияние феноболина на показатели крови, репродуктивной системы и уровень гормонов в сыворотке крови крыс-самцов // Весцi
НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 63–67.
ьн
ая
Изучали влияние феноболинa в дозе 2,5 мг/кг (2,5 мг/кг.4) на количественные показатели клеток белой
и красной крови, репродуктивной системы, уровень тиреоидных гормонов, кортикостерона и тестостерона в сыворотке крови крыс-самцов. Установлено умеренное влияние феноболина на количество лейкоцитов
и лейкоцитарных элементов крови, а на 10-е сутки после его введения также и на показатели красной крови.
Введение анаболического препарата приводило к значительному падению относительной массы семенников,
особенно эпидидимисов, и к резкому снижению числа зрелых половых клеток, выделенных из придатков семенников. Феноболин в ряде случаев оказывал выраженный эффект на уровень тестостерона и кортикостерона
в сыворотке крови экспериментальных животных. Сделан вывод об опасности многократного использования
феноболина, который оказывает негативное влияние на состояние репродуктивной системы крыс-самцов.
Табл. 2. Ил. 1. Библиогр. – 10 назв.
ал
УДК 577.171.5: 547.962+591.147.1:599.323.4
ци
он
В и н о г р а д о в В. В., Т у м а н о в А. В., В и н о г р а д о в С. В., М а ц ю к Я. Р., А н д р е е в В. П.,
С м ы к о в с к а я Т. Ю., Я р о ц к и й Ю. В. Стресс и генетический триггер тироцитов у крыс // Весцi
НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4 . С. 68–76.
Установлено, что в фазе тревоги эмоционально-болевого стресса (60 мин опыта) проявляются только
стрессобусловленные признаки усиления секреторной функции тироцитов, а их пролиферативная активность
снижается. Разнонаправленное действие стресса на функцию и пролиферацию тироцитов может свидетельствовать о соответствующем переключении стрессорными гормонами генетического триггера, лимитирующего работу и деление специализированных клеток, на обеспечение гормоносинтеза секреторными элементами щитовидной железы.
Табл. 1. Ил. 4. Библиогр. – 21 назв.
На
126
ус
и
УДК 577.150.6:575.24
ар
Г р и н ь к о В. Н., Я к и м о в и ч Н. Н., Б и л ь д ю к е в и ч А. А., Я к и м о в и ч И. В. Влияние составов
питательной среды на биосинтез L-лейцина культурой Corynebacterium glutamicum AC-L // Весцi НАН
Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 77–81.
кБ
ел
Изучено влияние концентраций основных компонентов питательной среды на процесс культивирования
продуцента L-лейцина Corynebacterium glutamicum AC-L. Определены оптимальные концентрации источников углеродного и азотного питания, витаминов (тиамина и дестиобиотина), позволяющие достигать высокого уровня накопления биомассы продуцента и целевой аминокислоты при минимальной продолжительности
процесса биосинтеза. Установлено, что в качестве источника углеродного питания целесообразно использовать сахар-песок, источника минерального азота − сернокислый аммоний, концентрация которого должна находиться в пределах 0,75−1,0 % в пересчете на содержание в среде аммонийного азота.
Полученные данные могут быть использованы для усовершенствования технологического процесса биосинтеза L-лейцина с использованием продуцента Corynebacteriun glutamicum AC-L.
Табл. 3. Ил. 2. Библиогр. – 11 назв.
ау
УДК 578.22:577.29
ем
ия
н
Р о м а н о в с к а я Т. В., С е в е р и н И. Н., К о с м а ч е в а С. М., П о т а п н е в М. П., Г р и н е в В. В.
Разработка нового лентивирусного вектора доставки для эктопической экспрессии гена одноцепочечного инсулина в мезенхимальных стволовых клетках человека // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011.
№ 4. С. 82–87.
УДК 612.014.4:591.465]-074
ак
ад
Возрастающая частота заболеваемости сахарным диабетом является актуальной проблемой нашего времени. Технология использования стволовых клеток в сочетании с генно-инженерными методами открывает
новые перспективы для лечения этого заболевания. Нами был сконструирован новый лентивирусный вектор
доставки pHR-hSCI, несущий модифицированный ген одноцепочечного инсулина человека под контролем
конститутивного промотора. Вектор был использован для трансдукции мезенхимальных стволовых клеток
красного костного мозга человека. Более 90 % трансдуцированных клеток стабильно на протяжении 24 сут
экспрессировали репортерный белок eGFP. Количество РНК транскриптов гена одноцепочечного инсулина в
модифицированных клетках было в 200–300 раз выше, чем в контрольных, но в 10 раз ниже, чем в островковых
клетках поджелудочной железы.
Табл. 5. Ил. 3. Библиогр. – 11 назв.
В л а д и м и р с к а я Т. Э., Ш в е д И. А., К р и в о р о т С. Г., В е я л к и н а Н. Н., А д а м о в и ч А. В.
Определение фаз эстрального цикла белых крыс по клеточному составу влагалищных мазков // Весці
HAH Беларусь Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 88–91.
ьн
ая
Представлены результаты анализа клеточного состава влагалищных мазков и описан характер течения
полового цикла белых крыс. На основании личных наблюдений и обзора литературы определен клеточный
состав мазка, характерный для каждой стадии и выделены особенности перехода одной фазы цикла в другую.
Ил. 3. Библиогр. – 10 назв.
ал
УДК 577.1+599:539.1.047
ци
он
Д р о з д о в А. С., Ч у м а к о в а Д. В., Б о к у т ь О. С., Д о к у ч а е в а Е. А., К в а с ю к Е. И., Б о к у т ь С. Б.
Получение гликогемоглобинов человека А1а1 и А1а2 с использованием киназной системы Saccharomyces
cerevisiae // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 92–98.
На
Описаны условия биотехнологического способа получения минорных форм гемоглобина человека A1a1 и A1a2
с использованием высушенных клеток Saccharomyces cerevisiae и лизата эритроцитов. Показано, что глюкозо6-фосфат и фруктозо-1,6-дифосфат, генерируемые при гликолитическом распаде глюкозы ферментами
S. cerevisiae, способны участвовать в реакции неэнзиматического гликозилирования гемоглобина А1 и повышать уровень HbA1a1 и HbA1a2 в реакционной смеси.
Табл. 1. Ил. 4. Библиогр. – 28 назв.
127
ус
и
УДК 598.342:591.525/.526
C а м у с е н к о И. Э. Факторы, влияющие на успех размножения белого аиста Ciconia ciconia в пойме реки
Припять // Весці НАН Беларусі. Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 99–102.
кБ
ел
ар
На основании анализа результатов мониторинговых исследований белого аиста в пойме р. Припять
(1991–2010) установлено, что успех размножения вида определяется сочетанием погодных и гидрологических
условий место-обитания в период размножения. Наиболее высокий показатель среднего размера выводка отмечается при продолжительном весеннем половодье и высоких показателях водности бассейна реки в первую
половину периода размножения. Раннее наступление климатической весны и нестабильные климатические
условия периода начала гнездования отрицательно влияют на успех размножения вследствие возрастания доли
безрезультатно гнездящихся птиц. Полученные результаты позволили разработать рекомендации по оптимизации охраны вида.
Табл. 1. Библиогр. – 21 назв.
УДК 576.895.1: 599.735.3(476)
ау
А н и с и м о в а Е. И., П е н ь к е в и ч В. А., В я л ь Ю. С. Гельминтофауна европейского зубра (Bison
bonasus) на территории Беларуси // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2011. № 4. С. 103–107.
ем
ия
н
Зубр европейский (Bison bonasus L.) имеет особое значение в Беларуси. У европейского зубра на территории Беларуси зарегистрировано 37 видов гельминтов. Наибольшая интенсивность и встречаемость инвазии установлена для видов, локализующихся в желудочно-кишечном тракте. Проведен сравнительный анализ
встречаемости и видового состава гельминтов в различных популяциях.
Табл. 2. Библиогр. – 22 назв.
УДК 576.895.121:616.995.1 (476)
Ш и м а л о в В. В. Встречаемость Echinococcus multilocularis (Cestoda, Taeniidae) в юго-западной части
Беларуси // Весці НАН Беларусі. Сер. біял. навук. 2011. № 4. С. 108–112.
ак
ад
Представлены результаты гельминтологического исследования в 2001—2010 гг. в юго-западной Беларуси 11 лисиц и 2 748 насекомоядных млекопитающих и грызунов 15 видов — потенциальных хозяев цестоды
E. multilocularis. У 2 лисиц (Брестский и Пружанский районы) в кишечнике обнаружено 36 и 2 200 половозрелых особей этого гельминта. Личинки найдены в печени рыжей полевки, пойманной на берегу мелиоративного канала в Малоритском районе. Приводятся места находок цестоды E. multilocularis у диких животных
и очаги в юго-западной Беларуси.
Табл. 1. Ил. 1. Библиогр. – 26 назв.
УДК 576.536:615
В о л к М. В., Л о б а н о к Е. С., В о л о т о в с к и й П. А. Хондрогенный потенциал мезенхимных стволовых клеток // Весцi НАН Беларусi. Сер. биол. наук. 2011. № 4. С. 113–120.
На
ци
он
ал
ьн
ая
Мезенхимные стволовые клетки (МСК) являются плюрипотентными клетками взрослого организма, способными дифференцироваться в зрелые соматические клетки ряда тканей и органов. Источниками МСК могут
служить красный костный мозг, жировая ткань, кожа, пуповинная кровь и другие ткани. Под влиянием запускающих хондрогенез факторов МСК способны приобретать хондроцитарный фенотип. Эксперименты по
заживлению дефектов хрящевой ткани с помощью МСК, проведенные на животных, выявляют значительный
потенциал для их использования в клинике. Хондрогенный потенциал МСК наряду с иммуномодулирующими свойствами позволяет использовать эти клетки для лечения людей с заболеваниями, сопровождающимися
поражением ткани хряща, и тем самым повысить эффективность терапии.
Табл. 2. Ил. 4. Библиогр. – 60 назв.