АнтитромбиновАя Активность этилового эфирА N ‑лАурoил‑L‑АргининА (LAE) и метилового эфирА 9‑флуоренилметилоксикАрбонил‑L‑АргининА

Експериментальні роботи
УДК 577. 152.344 + 547.962
Антитромбиновая активность этилового
эфира Nα‑лаурoил-L-аргинина (LAE) и метилового
эфира 9‑флуоренилметилоксикарбонил-L-аргинина
(Fmoc-L-Arg-OMe)
А. А. Поярков, С. А. Пояркова, В. П. Кухарь
Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев;
e-mail: Spoyar@bpci.kiev.ua
Изучено ингибиторное действие на тромбин известного катионного сурфактанта этилового
эфира N α-лаурoил-L-аргинина (LAE) и метилового эфира 9-флуоренилметилоксикарбонил-L-аргинина
(Fmoc-Arg-OMe). Показано, что LAE и Fmoc-Arg-OМe подавляют гидролиз тромбином хромогенного субстрата Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (хромозим ТН) с константами ингибирования (К і ) 1,92 мкМ и
77 мкМ соответственно. LAE обладает почти в 10 раз более сильным ингибиторным действием на
тромбин, чем на трипсин (К і = 18,9 мкМ) при гидролизе хромозима ТН. При этом LAE сохраняет
способность гидролизоваться тромбином при рН 8,5 (kкат = 3,6 с-1) и трипсином (kкат = 56 с-1).
Высказывается предположение, что способность LAE подавлять рост некоторых микроорганизмов в некоторой степени обусловлена его ингибиторной активностью по отношению к сериновым
протеазам трипсиноподобного действия, участвующих в процессе инфицирования.
К л ю ч е в ы е с л о в а: тромбин, ингибиторы сериновых протеаз, этиловый эфир N α-лау­рoил-Lаргинина (LAE).
Т
ромбин – сериновая протеиназа трип­
синоподобного действия (EC 3.4.21.5)
выполняет ключевую роль в процессе
тромбообразования. Специфический ограни­
ченный протеолиз фибриногена, природного
субстрата тромбина, ведет к образованию ос­
новы кровяного сгустка [1]. Тромбин проявляет
как ферментативные свойства к ряду природ­
ных субстратов (фибриноген, факторы V, VIII,
XIII, протеин С) [2], так и гормоноподобные,
взаимодействуя с поверхностью эндотелиаль­
ных клеток [3].
В настоящее время в медицинской прак­
тике в качестве антикоагулянтов прямого дейс­
твия, т.е. инактивирующих непосред­ственно
тромбин, применяются природный ингибитор
гепарин и его низкомолекулярные фрагменты,
которые действуют посредством образования
тройного комплекса гепарина с тромбином и
антитромбином III [4]. Однако ряд осложне­
ний при терапии гепарином, побудил исследо­
вателей к интенсивному поиску синтетических
низкомолекулярных ингибиторов тромбина
[5,6], который продолжается более двадцати
лет, но лишь некоторые из синтезированных
соединений, такие как аргатробан [7] и ксеми­
лагатран [8], допущены к клиническим испы­
таниям.
124
Терапевтической мишенью для модели­
рования низкомолекулярных антикоагулянтов
является тромбин, строение которого хорошо
изучено [9], что существенно облегчает зада­
чу конструирования его ингибиторов. Извест­
ные синтетические ингибиторы тромбина, как
правило, являются конкурентными ингибито­
рами, связывающимися с активным центром
фермента и обладающие как обратимым, так и
необратимым действием [10]. Согласно данным
о строении вторичного связывающего центра
тромбина [9], он организован в так называе­
мую «гидрофобную клетку», которая образу­
ется за счет остатков аминокислот изолейцина
(Ile 174), триптофана (Trp 215), лейцина (Leu
99), гистидина (His 57), тирозина (Tyr 60 А) и
триптофана (Trр 60 D). Особая укладка a-цепи
тромбина в виде вытянутой петли с располо­
женными в ней Tyr 60 А и Trр 60 D вместе с
петлей вокруг Trp 148, образует узкую и глубо­
кую щель активного центра. Индольные коль­
ца Trp 60 D и Trp 148 прикрывают щель, тем
самым, затрудняя доступ к активному центру
тромбина. Специфическая пространственная
архитектура вторичного связывающего цент­
ра тромбина является одной из причин узкой
специфичности фермента, которая также от­
ражается на механизме гидролиза низкомоле­
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
А. А. Поярков, С. А. Пояркова, В. П. Кухарь
кулярных субстратов [11–13]. Вторичный свя­
зывающий участок тромбина называют также
арильным связывающим участком [14], пос­
кольку именно в этой части активного центра
тромбина связываются ароматические замес­
тители синтетических ингибиторов и субстра­
тов. Можно предположить, что гидрофобность
и конформационная лабильность остатка жир­
ной кислоты окажется оптимальной для моде­
лирования ингибиторов данного фермента за
счет особенностей строе­ния активного центра
тромбина, описанных выше. Одним из необ­
ходимых качеств, которым должны обладать
ингибиторы ферментов как потенциальные
лекарственные средст­ва – не только высокое
сродство к ферменту и селективность, но и
способность проникать через мембраны кле­
ток [7], чему, безусловно, способствовало бы
наличие в молекуле ингибитора остатка жир­
ной кислоты или иного гидрофобного замес­
тителя.
Монохлоргидрат этилового эфира Na-лау­
роиларгинина (LAE) – известный катионный
консервант, обладающий широким спектром
биологического действия. Это соединение ин­
гибирует рост некоторых микроорганизмов
(бактерий, грибов, в т.ч. дрожжей) [15], облада­
ет инактивирующим действием на поверхност­
ный антиген вируса гепатита В [16]; изучена
токсичность LAE [26]. Однако на сегодняшний
день в литературе нет данных о влиянии этого
соединения на активность ферментов, несмот­
ря на то, что существует целый класс белковых
ингибиторов сериновых протеиназ, обладаю­
щих актигрибковым действием. В последние
годы [17] появляются работы, в которых есть
указания на чрезвычайно важную роль сери­
новых протеаз трипсиноподобного действия в
процессе инфицирования некоторыми видами
грибов и бактерий. Учитывая, что тромбин яв­
ляется представителем сериновых протеиназ
трипсиноподобного действия, исследование
ингибиторной активности производных ар­
гинина, модифицированных жирными или
гидрофобными остатками, может быть сущест­
венным в проявлении ими антимикробных
свойств.
Целью нашей работы был синтез эфиров:
LAE и Na-9-флуоренилоксикарбонил-L-арги­
нина (Fmoc-Arg-OMe) и изучение их ингиби­
торных свойств по отношению к тромбину.
Материалы и методы
В работе использовали реактивы: тромбин
человека (активность 3000 NIH-ед/мг), выде­
ленный в нашей лаборатории, трипсин (ак­
тивность 40 U/мг) фирмы «Merck» (Германия),
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
растворители марки х.ч. или о.с.ч. Температуру
плавления синтезированных соединений оп­
ределяли на малогабаритном столике Koffler
Boetius (Германия).
Контроль реакции и чистоту продуктов
определяли при помощи ТСХ на пластинах с
силикагелем (Silica gel 60 F254), производства
фирмы «Merck» в системе растворителей: н-бу­
танол – уксусная кислота – вода, (4 : 1 : 1) (А),
бензол – этилацетат (5 : 4) (Б). Хроматограм­
мы соединений, содержащие жирную кислоту,
проявляли йодом и 10%-ным раствором мо­
либденовольфрамовой кислоты в этаноле.
Синтез лауроиларгинина проводили, ис­
пользуя N-оксисукцинимидный эфир лаури­
ловой кислоты, который конденсировали со
свободным аргинином в водно-диоксановой
среде. Полученный лауроиларгинин превра­
щали в его этиловый эфир обработкой хло­
ристым тионилом в абсолютном этаноле при
охлаждении до -20 °С. 9-Флуоренилметилок­
сикарбонил-L-аргинин (Fmoc-Arg), получали
конденсацией 9-флуоренилметилсукциними­
доил карбоната с аргинином в водно-диокса­
новой среде, обрабатывали хлористым тиони­
лом в абсолютном метаноле при температуре
-20 °С и получали метиловый эфир.
N-оксисукцинимидный эфир лауриловой
кислоты (I). К раствору, содержащему 2,63 г
(22,86 ммоль)
N-гидроксисукцинимида
в
150 мл сухого этилацетата и охлажденному
льдом, прибавляли 5 г (22,86 ммоль) хлорангид­
рида лауриловой кислоты. N-Метилморфолин
в количестве 2,6 мл (23,6 ммоль) прикапывали
порциями по 1 мл каждые 15 мин. Реакцию
вели 4 часа при 4 °С и 12 часов при комнатной
температуре. Осадок хлоргидрата N-метилмор­
фолина отфильтровывали. Растворитель отго­
няли в вакууме при 40 °С. Твердый осадок пе­
рекристаллизовывали из изопропанола. Выход
продукта – 5,7 г (84%). R f = 0,68 (Б).
Лауроиларгинин (2). К раствору, содержа­
щему 1,5 г (5,09ммоль) N-оксисукцинимидно­
го эфира лауриловой кислоты в 50 мл диок­
сана прибавляли 15 мл водного раствора 0,9 г
(5,11 ммоль) L-аргинина. Через 18 ч выпавший
осадок отфильтровывали, промывали водой
и перекристаллизовывали из смеси этанол –
вода. Выход продукта – 1,908 г (95,4%). Т. пл.
174–176 °С. R f = 0,45 (А). Найдено, %: С – 61.06;
Н – 10.05; N – 16.03 С18Н36N4О3. Вычислено, %:
С – 60.64; Н – 10.18; N – 15.72.
Хлоргидрат этилового эфира лауроил-L-аргинина (3). В коническую колбу, снабженную
магнитной мешалкой и хлоркальциевой труб­
кой, помещали 25 мл абсолютного этанола и
125
Експериментальні роботи
охлаждали до -20 °С. По каплям добавляли
0,210 мл раствора тионилхлорида (2,90 ммоль)
и вносили 0,689 г (1,93 ммоль) лауроиларги­
нина. Реакционную смесь перемешивали 2 ч
при -20 °С и 16 ч при комнатной температуре.
Растворитель отгоняли в вакууме при 40 °С.
Полученное масло растворяли в метаноле и
упаривали (операцию повторяли дважды). Ос­
таток осаждали диэтиловым эфиром. Выход
продукта – 0,648 г (80%). R f = 0,48 (А). Т пл.
46–48 °С. Найдено, %: С – 58,32; Н – 10.21;
N – 13,63 С20Н43СlN4О2. Вычислено, %: С –
59,02; Н – 10,65 N – 13,76.
9-Флуоренилметилоксикарбонил-L-аргинин
(4). К раствору, содержащему 3 г (17,18 ммоль)
L-аргинина в 30 мл воды прибавляли раствор
9-флуоренилметилсукцинимидоил карбоната
5,8 г (17,18 ммоль) в 90 мл диоксана. Реакцию
вели 2 ч при комнатной температуре. Раство­
ритель отгоняли в вакууме при 40 °С. Остаток
перекристаллизовывали из водного этанола.
Выход продукта – 6 г. (88%). Т. пл. 178–179 °С.
R f 0.4 (A).
Хлоргидрат метиловый эфир 9-флуоренилметилокси-L-аргинина (5) получали аналогич­
но этиловому эфиру лауроил-L-аргинина (3),
обрабатывая 1 г (4) в метаноле при -20 °С. Вы­
ход продукта – 0,966 г (83%). Т. пл. 76–78 °С.
R f = 0.3 (A). Найдено, %: С – 58,77; Н – 5,95;
N – 12,47 С22Н27СlN4О4. Вычислено, %: С –
59,12; Н – 6,09; N – 12,54.
Определение кинетических констант гидролиза Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (хромозима ТН).
Кинетические измерения проводили на спек­
трофотометре СФ-46А. Состав стандартной
реакционной смеси: 1,95 мл буфера Tris/НС1
0,05 М, 0,1 М NaCl, содержащего 0,66% ПЭГ
6000, рН 8,0 и 0,05 мл (1,67 нM) тромбина.
Реакционную смесь выдерживали 5 мин при
25 °С и реакцию инициировали добавлением
0,1 мл субстрата (концентрации субстрата в
опыте: 20, 62,5, 125 или 250 мкМ). Содержи­
мое пробы быстро перемешивали и помещали
в кювету спектрофотометра. Кювета сравне­
ния содержала 2 мл буфера и 0,1 мл субстра­
та. Скорость гидролиза п-нитроанилидного
субстрата определяли по приросту абсорбции
при 405 нм, регистрируя прирост абсорбции
каждую минуту в течение 5 мин. Молярный
коэффициент поглощения для п-нитроани­
лина, определенный в этих условиях составил
10 600 М-1 см-1. Вычисляли изменение абсорб­
ции в минуту и результаты обрабатывали в
программе EXCEL в двойных обратных коор­
динатах Лайнуивера–Бэрка. Из уравнения
линейной зависимости у = ах + b определяли
K m = -1/(b/a), a Vm = 1/b.
126
Константы определяли из трех независи­
мых экспериментов. Ошибка эксперимента не
превышала 7%.
Определение ингибиторной активности (Кi)
вели в тех же условиях, что и определение ки­
нетических параметров гидролиза хромозима
ТН.
Ингибирование тромбина (концентрация
в опыте 1,67 нМ) изучали при четырех концен­
трациях субстрата (хромозима TH) и 5–7 кон­
центрациях ингибитора (от 10 до 100 мкМ).
Регистрировали снижение
абсорбции при
405 нм в минуту при температуре 25 °С в ко­
нечном объеме реакционной смеси 2,1 мл
(Тris/НС1 0,05 М, 0,1 М NaCl, содержащего
0,66% полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000), рН 8,0.
Полученные данные обрабатывали в системе
координат Диксона (1/V ÷ [I]), используя про­
грамму EXCEL.
Ki(каж) определяли из уравнения линей­
ной зависимости у = ах+b, как х = -(b/a), где
y = 1/V, a x= [I] концентрация ингибитора.
Значения Кi определяли из уравнения:
Ki(каж) = Ki(1+[S]/K m), откуда
Ki = Ki(каж)/(1+[S]/K m),
где Ki(каж) – величина, определенная по графи­
ку зависимости (1/V ÷ [I]), как – [I], [S] – кон­
центрация хромогенного субстрата, при ко­
торой вели определения К m. K m – константа
Михаэлиса для хромогенного субстрата.
Кi для трипсина (концентрация фермента
в опыте 2,8 нМ) определяли при разных кон­
центрациях хромозима ТН как абсциссу точки
пересечения прямых в координатах Диксона.
Определение константы скорости гидролиза LAE. Каталитические константы скорости
гидролиза определяли потенциометрическим
титрованием в стационарных условиях при
рН 8,5, как описано в работе [12].
Определение свертывающей активности
тромбина осуществляли в соответствии с ме­
тодикой, описанной в работе [15]. Исходный
раствор тромбина готовили таким образом,
чтобы время свертывания 0,1%-го раство­
ра фибриногена (90% свертываемого белка,
«Serva» Германия) в стандартных условиях со­
ставляло 15–20 с. Изучение влияния исследуе­
мых соединений на свертывающую активность
тромбина проводили при следующих условиях.
К смеси 0,5 мл 0,2%-го раствора фибриноге­
на в Tris/НСl буфере, рН 7,3 (0,05 М Tris, со­
держащий 0,15 М NaCl и 0,66% ПЭГ фирмы
«Serva» с молекулярной массой 6000) прибав­
ляли 0,5 мл раствора ингибитора в различных
концентрациях в том же буфере. Смесь тер­
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
А. А. Поярков, С. А. Пояркова, В. П. Кухарь
мостатировали 5 мин при температуре 29 °С,
затем прибавляли 20 мкл исходного раствора
тромбина и отмечали время, необходимое для
образования сгустка. Время свертывания фиб­
риногена определяли три раза для 5–6 раз­
личных концентраций пептида. Значение IС50
вычисляли из графика зависимости (t–t0)/t0 от
[I], где t0 – время свертывания фибриногена
в отсутствие пептида; t – время свертывания
фибриногена в присутствии исследуемого со­
единения; [I] – концентрация пептида.
Результаты и обсуждение
Эффективность действия ингибиторов во
многом определяется не только их сродством к
ферменту, но и механизмом их действия, что за­
служивает особого внимания. Ранее нами было
показано, что некоторые метиловые эфиры ар­
гининсодержащих пептидов обладают как суб­
стратными, так и ингибиторными свойствами
по отношению к тромбину [18]. Причем, при
увеличении гидрофобности аминокислот в по­
ложении Р2 субстрата, ингибиторные свойства
этих соединений усиливаются. При введении
же в это положение гидрофобной аминокис­
лоты D-конфигурации, соединение утрачивает
способность расщепляться тромбином, однако
и ингибиторные свойства такого соединения
также ухудшаются на порядок [12].
Поскольку LAE также является сложным
эфиром аргинина, который в положении Р2 со­
держит остаток жирной кислоты, было инте­
ресно выяснить характер этих взаимодействий
с вторичным связывающим центром тромбина
и влияние их на субстратные и ингибиторные
свойства такого соединения.
Гидролиз субстратов сериновыми проте­
иназами протекает по известной трехстадий­
ной схеме [19] и описывается уравнением:
KS
k3
k2
E S m
o ES 
o EA P1 o
E P2 , (1)(1)
KS
k3
k2
E S m
o ESэтой

o
EA P1 описывается
o E P2 , (1)
а ингибирование
реакции
K
уравнением:
E I m
i o EI. (2)
Ki
E I m
o EI.
(2)
(2)
Сравнение каталитических констант гид­
ролиза LAE тромбином (3,36 ± 0,23)с-1 и трип­
сином (56,14 ± 2,5) с-1 в условиях стационарной
кинетики, когда концентрация субстрата зна­
чительно превышает концентрацию фермента,
показало, что трипсином это соединение гид­
ролизуется в 17 раз быстрее, чем тромбином.
Ингибиторные свойства соединений ис­
следовали по их способности тормозить реак­
цию расщепления хромогенного субстрата
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
Tos-Gly-Pro-Arg-pNA (хромозим TH) тромби­
ном при рН 8,0 (буфер 0,05 М Tris/НС1, содер­
жащий 0,1 М NaCl и 0,66% ПЭГ). Изменение
активности фермента регистрировали спек­
трофотометрически по снижению изменения
скорости нарастания оптической плотности
при 405 нм в присутствии различных концен­
траций ингибиторов.
Поскольку исследуемые соединения яв­
ляются как субстратами, так и ингибиторами
тромбина и трипсина, для сравнения их инги­
биторного эффекта необходимо использовать
константы ингибирования (Ki), а не величины
IC50 [24]. Величина IC50 в случае конкурент­
ного ингибирования зависит от концентрации
субстрата и связана с величиной Ki соотноше­
нием:
IC50 = Ki(1+[S]/K m).
(3)
Как наиболее точный метод для оценки
ингибиторного эффекта, позволяющий одно­
временно определить характер ингибирова­
ния, для определения Кi мы использовали ме­
тод Диксона [21].
Ингибиторное
действие
LAE
на
тромбин оказалось достаточно высоким
(Ki = 1,92 ± 0,21 мкМ). А пересечение прямых,
построенных в координатах Диксона, в левом
верхнем углу указывает на конкурентный ха­
рактер ингибирования, что и ожидалось для
субстратоподобных ингибиторов. Абсцисса
точки пересечения прямых является величи­
ной равной Ki (рис. 1). Ингибиторный эффект
Fmoc-Аrg-OМe (Ki = 77 ± 20 мкМ) значитель­
но ниже, чем LAE. Пересечение прямых, опи­
сывающих зависимость значений обратных
величин скорости реакции от концентрации
ингибитора, в левом верхнем квадрате свиде­
тельствует о конкурентном характере ингиби­
рования этим соединением тромбина (рис. 2).
Для более точного определения величин
Кi мы определили кинетические параметры
гидролиза хромозима ТН тромбином. Величи­
ну константы Михаэлиса (К m = (2,63 ± 0,18)×
×10‑5 М)
и
каталитическую
константу
(kкат = 122.86 ± 8 с-1) определяли в координа­
тах “двойных обратных величин” Лайнуивера–
Бэрка, в тех же экспериментальных условиях,
что и определение константы ингибирования.
Зная концентрацию субстрата, при которой
велось определение ингибиторного эффекта и
величину К m, можно вычислить константу ин­
гибирования из уравнения [21]:
Ki = Ki(каж) /(1+[S]/K m).
(4)
127
Експериментальні роботи
500000
25mkL
мкл
25
400000
300000
мкл
50mkL
1/V
200000
75 mk
мклL
75
100 mkL
100000
0
-100
-50
-100000
0
50
100
150
200
250
-200000
[I], ɦɤɆ
Рис. 1. Определение константы ингибирования К і LAE для тромбина в координатах Диксона при различных концентрациях хромозима TH. Ki = 1,92 мкM.
Ɋɢɫ. 1. Ɉɩɪɟɞɟɥɟɧɢɟ ɤɨɧɫɬɚɧɬɵ ɢɧɝɢɛɢɪɨɜɚɧɢɹ Ʉɿ LAE ɞɥɹ ɬɪɨɦɛɢɧɚ ɜ
ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ Ⱦɢɤɫɨɧɚ ɩɪɢ ɪɚɡɥɢɱɧɵɯ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹɯ ɏɪɨɦɨɡɢɦɚ.
Гидролиз LAEKi
тромбином
протекает в 40
трипсин обратно пропорционален его скорости
=1,92 ɦɤM
раз медленнее, чем гидролиз хромозима ТН, и
даже при инкубировании с тромбином в тече­
ние 5 мин LAE гидролизуется не более чем на
7%, что не превышает ошибки эксперимента.
Для сравнения реакционных свойств LAE на
тромбин и трипсин, мы проверили его воз­
можность ингибировать гидролиз хромозима
ТН трипсином. Определение ингибиторного
эффекта LAE в отношении трипсина вели при
двух концентрациях субстрата и величину Ki
определяли как абсциссу точки пересечения
прямых (рис. 3). Ингибиторный эффект LAE
при сравнении его действия на тромбин и
гидролиза этими ферментами, т.е. он является
более эффективным ингибитором тромбина,
чем трипсина, что свидетельствует о его селек­
тивности. Кинетические параметры гидролиза
и ингибирования изученных соединений при­
ведены в таблице.
Строго говоря, поскольку LАЕ обладает
способностью как ингибировать сериновые
протеиназы тромбин и трипсин, так и служить
субстратом для этих ферментов, то его нельзя
отнести ни к обратимым, ни к необратимым
ингибиторам тромбина [20]. Вследствие это­
го ингибирование может происходить за счет
900000
50 mkL
мкл
50
800000
700000
600000
500000
100 мкл
100
mkL S
1/V
400000
300000
200000
100000
0
-300
-200
-100
0
-100000
100
200
300
400
500
-200000
[I], ɦɤM
Рис. 2. Определение Ki LAE в отношении трипсина в координатах Диксона при различных концентраɊɢɫ. 2. Ɉɩɪɟɞɟɥɟɧɢɟ Ki LAE ɜ ɨɬɧɨɲɟɧɢɢ ɬɪɢɩɫɢɧɚ ɜ ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
циях хромозима TH. Ki = 18,94 мкM.
Ⱦɢɤɫɨɧɚ ɩɪɢ ɪɚɡɥɢɱɧɵɯ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹɯ ɏɪɨɦɨɡɢɦɚ. Ki=-18,94 ɦɤM
128
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
А. А. Поярков, С. А. Пояркова, В. П. Кухарь
500000
50 мкМ
400000
75 мкМ
300000
200000
1/V
100 мкМ
100000
0
-0,0012
-0,001
-0,0008 -0,0006 -0,0004 -0,0002
0
0,0002
0,0004
0,0006
0,0008
-100000
-200000
[I], M
Рис 3. Определение величины Кi Fmoc-Arg-OMe в координатах Диксона при различных концентрациях
ɜɟɥɢɱɢɧɵ Ʉi Fmoc-Arg-OMe ɜ ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ Ⱦɢɤɫɨɧɚ
хромозимаɊɢɫ
TH. 3.
Ki Ɉɩɪɟɞɟɥɟɧɢɟ
= 77 мкM.
ɩɪɢ ɪɚɡɥɢɱɧɵɯ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹɯ ɏɪɨɦɨɡɢɦɚ.
Ki = 77 ɦɤM
Сравнение ингибиторных и каталитических характеристик LAE и Fmoc-Arg-OMe в отношении тромбина и трипсина
Соединения
LAE
Fmoc-Arg-OME
Тромбин
Трипсин
Ki мкМ
kcat c
Ki мкМ
kcat c-1
1,92
3,6
18,9
56
77
–
–
–
торможения одной из стадий ферментативного
катализа, описываемого уравнением (1). Одной
из причин такого явления может быть непро­
порциональное замедление одной из стадий
ферментативного катализа, вызванное «непро­
дуктивным связыванием» [22], происходящее
как на стадии ацилирования, так и на стадии
деацилирования. Это предположение нуждает­
ся в последующем изучении посредством раз­
деления кинетических стадий и определения
индивидуальных констант гидролиза.
Сравнение констант ингибирования LAE
и Fmoc-Аrg-OMe указывает на то, что LAE об­
ладает более сильным действием на тромбин.
Несмотря на то, что остаток лауриловой кис­
лоты связывается в подцентре тромбина, тра­
диционно называемым «арильным», он лучше
ингибирует тромбин, чем более объемный и
гидрофобный остаток 9-флуоренилметилок­
сикарбонила. Можно предположить, что ин­
гибиторный эффект остатка жирной кислоты
в бόльшей степени обусловлен изменением
конформации вторичного связывающего тром­
бина, что приводит к торможению фермента.
Однако поскольку тромбин все-таки сохраняет
свои каталитические свойства, мы не можем
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
-1
отнести этот эффект за счет его денатурации и
предполагаем некое изменение структуры вто­
ричного связывающего центра этого фермен­
та. Тот факт, что LAE обладает более сильным
инактивирующим действием на тромбин, чем
на трипсин, говорит о важности архитектуры
вторичного связывающего центра тромбина,
которая вносит существенный вклад в прояв­
ление этим ферментом узкой специфичности.
Поэтому соединения лауроиларгинина, моди­
фицированные по карбоксильной группе арги­
нина могут быть перспективными ингибито­
рами.
Fmoc-Аrg-OМe обладает также значитель­
ным ингибиторным действием на тромбин,
которое сравнимо по величине с таковым для
метилового эфира дансиларгинина [23], пред­
шественника известного агротробана [5], ко­
торый в настоящее время уже используется в
клинической практике [25].
К сожалению нам не удалось оценить ин­
гибиторный эффект LAE в реакции расщеп­
ления фибриногена тромбином, так как ока­
залось, что он осаждает фибриноген из его
раствора уже при концентрации 0,1 мг/мл.
Для Fmoc-Аrg-OМe величина IC50 составила
129
Експериментальні роботи
7,4×10‑4 М, хотя при более высоких концент­
рациях он также способен осаждать фибри­
ноген из его раствора. Возможно лишь пред­
положить, что на поверхности фибриногена
находится некий участок, который, связываясь
с остатком жирной кислоты и таким гидро­
фобным остатком как Fmoc, может вызывать
изменения в структуре фибриногена, приводя­
щие к образованию его нерастворимой формы.
Безусловно, это предположение нуждается в
дальнейшем исследовании.
Мы показали, что известный консервант
LAE обладает способностью ингибировать
тромбин и трипсин, являющиеся представите­
лями семейства сериновых протеиназ. Уже су­
ществует класс белковых ингибиторов серино­
вых протеиназ, обладающих антимикробным
действием. Возможно, что LAE является пред­
ставителем этого класса низкомолекулярных
ингибиторов. Так как в последнее время осо­
бый интерес у исследователей вызывают сери­
новые протеазы трипсиноподобного действия,
участвующие в процессе инфицирования не­
которыми грибами и бактериями, то факт на­
личия ингибиторной активности у известно­
го поверхностного катионита может служить
частичным объяснением антибактериальной и
фунгистатической активности LAE.
Антитромбінова активність
етилового ефіру Na‑лаурoїлL-аргініну (LAE) і метилового
ефіру 9-флуоренілметил­
оксикарбоніл-L-аргініну
(Fmoc‑L-Arg-OMe)
А. А. Поярков, С. А. Пояркова, В. П. Кухар
Інститут біоорганічної хімії і
нафтохімії НАН України, Київ;
e-mail: Spoyar@bpci.kiev.ua
Вивчено інгібіторну дію на тромбін ві­
домого катіонного сурфактанту етилового
ефіру Na-лаурoїл-L-аргініну (LAE) та мети­
лового ефіру 9-флуоренілметилоксікарбонілL-аргініну (Fmoc-Arg-OMe). Показано, що
LAE і Fmoc-Arg-OМe пригнічують гідроліз
тромбіном хромогенного субстрату Tos-GlyPro-Arg-pNA (хромозим ТН) з константами
інгібування (К і) 1,92 мкМ та 77 мкМ відповід­
но. LAE має майже в 10 разів більшу інгібу­
вальну дію щодо тромбіну, ніж на трипсин
(К і = 18,9 мкМ) за гідролізом хромозима ТН.
При цьому LAE зберігає здатність гідролізу­
ватися тромбіном при рН 8,5 (kкат = 3,6 с-1) та
трипсином (kкат = 56 с-1).
130
Висловлюється припущення, що здатність
LAE гальмувати ріст деяких мікроорганізмів
частково може бути обумовлена його інгібі­
торною активністю щодо серинових протеїназ
трипсиноподібної дії, які беруть участь у про­
цесі інфікування.
К л ю ч о в і с л о в а: тромбін, інгібіто­
ри серинових протеїназ, (LAE)етиловий ефір
Na‑лауроїл-L-аргініну.
antithrombic activity
of na-lauroyl-l-arginine
ethyl ester (lae) and
9‑fluorenylmethoxycarbonyll-aRginine methyl ester
(Fmoc‑L‑Arg-OMe)
A. A. Poyarkov, S. A. Poyarkova,
V. P. Kukhar
Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry,
National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv;
e-mail: Spoyar@bpci.kiev.ua
Summary
Simple synthetic compounds of lauroyl­
arginine ethyl ester (LAE) and 9-fluorenylmeth­
oxycarbonyl-L-agrinine methyl ester (Fmoc-ArgOMe) were studied for their inhibitory effect on
the hydro­lysis of chromogenic substrate Tos-GlyPro-Arg-pNA (Chromozym TH) by thrombin with
Ki for LAE 1.92 mM and 77 mM for Fmoc ArgOMe. It was shown that LAE inhibits thrombin
activi­ty almost 20 times more strongly than trypsin
(К і = 18.9 mМ).
At the same time LAE preserves the ability to
be hydrolyzed by thrombin at pH 8.5 (kcat = 3.6 с-1)
and trypsin (kcat = 56 с-1).
It is suggested, that LAE ability to suppress
growth of some microorganisms is conditioned to
some extent by its ability to inhibit the activity of
trypsin-like serine proteases, participating in the
infection process.
K e y w o r d s: thrombin, inhibitors of serine
proteases, Na-lauroyl-L-arginine ethyl ester.
1. Fenton J. W., Offosu F. A., Moon D. G.,
Maraganore J. M. // Blood Coagul. Fibrinol. –
1991. – 2. – P. 69–75.
2. Максименко А. В. // Биохимия. – 1993. – 58,
№ 9. – С. 1373–1383.
3. Coughlin S. R. // PNAS. – 1999. – 96, N 20. –
P. 11023–11027.
4. Linhardt R. J. // J. Med. Chem. – 2003. – 46,
N 13. – P. 2552–2564.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
А. А. Поярков, С. А. Пояркова, В. П. Кухарь
5. Das J., Kimball S. D. // Bioorg. Med. Chem. –
1995. – 3, N 8. – P. 999–1007.
6. Leung D., Abbenante G., Fairlie D. P. // J. Med.
Chem. – 2000. – 43, N 3. – P. 305–332.
7. Fizgerald D., Murphy N. // Coronary Artery
Disease. – 1996. – 7. – P. 455–458.
8. Eriksson U. G., Bredberg U., Hoffmann K-J. et
al. // DMD. – 2003. – 31. – P. 294–305.
9. Bode W., Mayer I., Baumann U. et al. // EMBO
J. – 1989. – 8, N 11. – P. 3467–3475.
10. Sanderson P. E. J., Naylor-Olsen A. M. //Current
Med. Chem. – 1998. – 5. – P. 289–304.
11. Пояркова С. A., Храпунов А. Н., Драган А. И.,
Колычева М. П. // Биополимеры и клетка. –
1992. – 8. – С. 20–30.
12. Пояркова С. А., Кибирев В. К., Серебряный С. Б.
// Укр. биохим. журн. – 1987. – 59, № 5. –
С. 5–11.
13. Ayala Y., Di Cera E. // J. Mol. Biol. – 1994. –
5. – Р. 733–746.
14. Lau W. F., Tabernero L., Sack J. S., Iwano­
wicz E. J. // Bioorg. Med. Chem. – 1995. – 3,
N 8. – P. 1039–1048.
15. Rodriguez E., Seguer J., Rocabayera X., Manre­
sa A. // J. Appl. Microbiol. – 2004. – 9. –
P. 903–912.
16. Sugimoto Y., Toyoshima S. // Antimicrob. Agents
Chemother. – 1981. – 20. – P. 120–127.
17. Дэвис Д. А., Калинина Н. А., Самохвалова Л. В.
и др. // Биоорг. химия. – 2005. – 31, № 3. –
С. 259–268.
18. Пояркова С. А., Кибирев В. К., Серебряный С. Б.
// Укр. биохим. журн. – 1986. – 58, № 6. –
С. 3–8.
19. Березин И. В., Мартинек К. Основы
фи­зической
химии
ферментативного
катализа. – Москва: Высшая школа,
1977. – 243 с.
20. Яковлев В. А. Кинетика ферментативных
реак­ций. - Москва: Наука, 1965. – 268с.
21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. – Москва:
Мир, 1966. – 816 с.
22. Клесов А. А., Цейлин В. И. // Биоорг.
химия. – 1977. – 3, № 11. – С. 1523–1538
23. Okamoto S., Hifikafa A., Ikezawa K. et al. //
Thrombosis Research. – 1976. – 8. – P. 77–82.
24. Костерін С. О., Прилуцький Ю. І., Борис­
ко П. О., Мірошниченко М. С. // Укр. біохім.
журн. – 2005. – 77, № 1. – С. 113–125.
25. Шандер А. / В кн.: «Альтернатива пере­
ливанию крови в хирургии» Материалы
Междунар. сателлитного симпозиума /
Москва, 6 октября 1998 г., в рамках VI
Всесоюзного съезда анестезиологов и
реаниматоров. – М., 1999. – С. 68–80.
26. Ruckmana S. A., Rocabayerab X., Borzelle­
cac J. F., Sanduskyd C. B. // Food and Chemical
Toxicology. – 2004. – 42. – P. 245–259.
Получено 23.11.2006
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2007, т. 79, № 1
131