008669 - 1 - Область техники, к которой относится изобретение

008669
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в общем плане касается способов увеличения выхода веществ, продуцируемых организмом. В частности, настоящее изобретение касается способов увеличения общего содержания или содержания растворимых углеводов, или сахаристости, или увеличения содержания эндогенных углеводов в ткани растения с помощью продукции фермента, метаболизирующего сахар, который
катализирует превращение эндогенного сахара (сахара, обычно производимого растением) в чужеродный
сахар (сахар, который обычно не производится растением на данной стадии развития). Изобретение также касается растений или частей растений, которые продуцируют фермент, метаболизирующий сахар с
образованием чужеродного сахара, что приводит к увеличению общего содержания сбраживаемых углеводов, и сбраживаемых углеводов и других образующихся из них продуктов.
Полная библиография цитированных в настоящем описании публикаций приведена в конце описания изобретения.
Уровень техники
Растения являются основным источником возобновляемой биоэнергии, биоматериалов и промышленного сырья для промышленной биотрансформации. Выход и концентрация желательных сахаров в
растениях являются ключевыми факторами, определяющими техническую и экономическую целесообразность последующих технологических процессов. Однако метаболические процессы в растениях,
обеспечивающие биосинтез сахаров, демонстрируют значительную внутреннюю забуференность и избыточность. Следствием этого является тот факт, что изменение ключевого гена, обеспечивающего метаболизм сахара в растении, обычно не приводит к значительному полезному изменению выхода нужного
сахара (Moore, 1995; Nguyen-Quoc and Foyer, 2001; Fernie et al., 2002). Например, Botha et al. (2001) показали, что уменьшение на 70% активности ключевого фермента, обеспечивающего распад сахарозы (кислая инвертаза), не приводит к заметному изменению выхода или чистоты сахарозы в трансгенном сахарном тростнике.
Сахарозоизомеразы являются ферментами, продуцируемыми многими организмами, включая различные микроорганизмы, способные превращать дисахарид сахарозу в такие ее изомеры, как изомальтулоза (палатиноза) или трегалулоза. Сахарозоизомеразы различаются по своим свойствам, включая набор
дисахаридных продуктов реакции, соотношение моносахаридов, таких как глюкоза и фруктоза, среди
продуктов реакции, кинетические свойства ферментов, оптимальные условия для протекания реакции и
чувствительность фермента к отклонению от оптимальных условий (Veronese and Perlot, 1999).
Сахароза является главным промежуточным продуктом в потоке углерода от продуцирующих (фотосинтезирующих) тканей к потребляющим (растущие и запасающие) тканям в растении, кроме того, она
является первичным запасным продуктом в определенных растениях, таких как сахарный тростник или
сахарная свекла. В ряде работ указывается, что экспрессия введенных в растения генов сахарозоизомераз
может приводить к превращению сахарозы в её изомеры, такие как изомальтулоза, и отмечается, что такое превращение может быть выгодно для промышленного производства такого изомера. Основной акцент в таких работах делается на максимально большое или полное превращение сахарозы в ее изомер желательный продукт для промышленного использования (Birch and Wu, 2002; Börnke et al., 2002b), или
предшественник для дальнейшего превращения in planta в подходящие для промышленного использования материалы (Kunz et al., 2002).
Также обсуждается вопрос, что такое превращение может быть летальным для клеток растения, если значительная часть углерода и запасов энергии будет переведена в недоступную растению форму, что
может использоваться для уничтожения определенных клеток, например, при экспериментальном получении мужской стерильности (Börnke and Sonnewald, 2001). Действительно, в ряде работ сообщается, что
трансгенная экспрессия сахарозоизомераз опасна для развития и продуктивности растений, вызывая тяжелые нарушения роста, снижение содержания крахмала и снижение содержания растворимых углеводов (Börnke et al., 2002a, b).
В растениях табака были обнаружены тяжелые и повреждающие эффекты на развитие растения при
конститутивной экспрессии под контролем промотора CaMV35S гена сахарозоизомеразы, слитого с сигнальным пептидом ингибитора II протеиназы картофеля для направления сахарозоизомеразы во внеклеточное пространство (апоплазму). Были обнаружены низкие уровни изомальтулозы (от 0,3 до 0,6 мМ на
1 м поверхности ткани листьев), что примерно эквивалентно 20-44% от нормальных уровней углеводов в
крахмале листьев или в 10-45 раз превосходящие нормальные промежуточные уровни сахарозы в этой
фотосинтезирующей ткани. О влиянии на уровень запасных углеводов в потребляющих тканях ничего не
сообщалось. При этом сильно нарушался рост листьев и других органов, и растения теряли способность
к размножению (Börnke et al., 2002а).
В растениях картофеля экспрессия подобной секретируемой в апоплазму сахарозоизомеразы под
специфичным для клубней промотором пататина В33 не приводит к появлению неблагоприятных последствий для роста и развития растений. Выход изомальтулозы также был низким (10-15 мкмоль на 1 г
сырого веса ткани клубня, что эквивалентно примерно 4-5% от нормального уровня запасных углеводов
в крахмале клубня), и немного ниже обычных уровней сахарозы в этой запасающей крахмал ткани. Более
того, поскольку это сопровождалось снижением содержания сахарозы, гексоз и крахмала, общий выход
-1-
008669
растворимых углеводов (за исключением крахмала) и общее содержание сбраживаемых углеводов
(включая крахмал) в модифицированных линиях растений были снижены (Börnke et al., 2002b).
Для преодоления этих проблем в настоящем изобретении предлагается новый подход, основанный
на комбинации (i) фермента сахарозоизомеразы, главным образом высокоэффективной сахарозоизомеразы, такой как UQ68J; (ii) использования видов растений, таких как сахарный тростник, которые накапливают сахарозу в качестве запасного углевода; и (iii) адресной доставки введенной сахарозоизомеразы в
запасающие сахарозу компартменты растения, например, в крупные вакуоли запасающей сахарозу паренхимы зрелых стеблей в случае сахарного тростника. Поскольку изомальтулоза не метаболизируется в
растениях, настоящее изобретение предполагает, что в отличие от сахарозы она в зрелых запасных тканях не будет вовлекаться в «футильные циклы» деградации и синтеза, которые могут снижать эффективность хранения углеводов и их полезный выход. Таким образом, предлагаемый подход настоящего изобретения направлен на достижение более высоких выходов растворимых углеводов и сбраживаемых углеводов в модифицированных растениях, в отличие от более низкого их выхода, как сообщалось в предыдущих работах. В соответствии с высказанной гипотезой было обнаружено, что в соке сахарного тростника концентрация изомальтулозы может достигать величин более 500 мМ при экспрессии сахарозоизомеразы (например, высокоэффективной сахарозоизомеразы UQ68J), адресно направленной в запасающие сахарозу вакуоли паренхимы зрелых стеблей. Это превышает общее содержание запасных углеводов
в немодифицированном сахарном тростнике и может достигаться без соизмеримого снижения содержания эндогенных сахаров, что приводит к значительно более высокому общему содержанию растворимых
сахаров в модифицированных линиях растений.
Растения имеют высоко адаптированные сенсоры и транспортеры для сахарозы, однако обычно
предполагается, что эти сенсоры и транспортеры сахарозы не способны отвечать аналогичным: образом
на такие её изомеры, как изомальтулоза (Loreti et al., 2000; Sinha et al., 2002). В полную противоположность сахарозе, растения не способны метаболизировать некоторые её изомеры, такие как изомальтулоза,
как источник углерода и энергии (Sinha et al., 2002). Тем не менее, изомеры могут вызывать изменения в
наборе экспрессируемых клеткой генов и модифицировать активности некоторых ферментов, участвующих в метаболизме сахарозы или в каскадах трансдукции сигналов в растениях (Fernie et al., 2001; Sinha
et al., 2002).
Поскольку экзогенная доставка изомальтулозы в срезы ткани клубней картофеля изменяла метаболизм других экзогенно доставляемых сахаров, Fernie et al., (2001) предположили, что доставка изомальтулозы в клубни картофеля представляет собой новый путь для повышения уровня синтеза крахмала.
Однако экзогенная доставка подобных изомальтулозе веществ в такие органы растения, как клубни картофеля, не годится для практического использования в промышленных целях. Пока не было сообщений,
что такой подход был испытан или применен для повышения выхода крахмала. В работах Börnke et al.,
(2002b) трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген апоплазматической сахарозоизомеразы
под специфичным для клубня промотором, накапливали изомальтулозу в количествах, достигающих
нормального содержания сахарозы в клубнях, но демонстрировали сниженный выход крахмала и общих
растворимых сахаров.
Основываясь на предположении о различной способности растений «чувствовать» сахарозу и родственные вещества, такие как изомальтулоза, в настоящем изобретении был предложен другой подход
для достижения повышенных выходов эндогенных сахаров в растениях с помощью подходящей экспрессии введенной сахарозоизомеразы. Этот подход отличается по своим целям от ранее сформулированных
стратегий (вывести растения для получения изомальтулозы или производных изомальтулозы) и способен
преодолеть их недостатки (растения с пониженными выходами эндогенных углеводов). Поскольку сигнальные и контролирующие механизмы, задействованные в метаболизме растений, пока полностью не
известны, в настоящем изобретении была проведена значительная экспериментальная работа для определения границ условий, позволяющих получить желательный промышленный эффект (растения с повышенным выходом эндогенных углеводов). В связи с этим было обнаружено, что общее содержание
растворимых сахаров в соке на уровне 700-900 мМ в сахарозном эквиваленте может быть достигнуто в
линиях сахарного тростника, сконструированных для осуществления экспрессии на низком уровне сахарозоизомеразы, направленной в цитозольный компартмент, или присутствующей в обоих (цитозоль и
апоплазма) компартментах. Этот подход позволяет примерно удвоить общее содержание запасных углеводов, обычно получаемое из немодифицированного сахарного тростника, и сопровождается незначительным изменением состава получаемых сахаров. Данный подход не ограничивается только геном сахарозоизомеразы, продуктом превращения изомальтулозой или растением сахарного тростника, которые
были взяты в качестве примера. В более широком смысле он охватывает экспрессию в организме определенного введенного гена, что приводит к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата,
который в норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом
эквивалентным образом, что изменяет метаболические потоки и, как следствие, приводит к более высоким выходам желаемых эндогенных соединений.
-2-
008669
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение основывается отчасти на открытии того факта, что при определенном способе экспрессии гена в растении, приводящей к превращению части эндогенного сахара в сахар, который
обычно не продуцируется в растении на данной стадии развития, изменяется передача сигнала между
продуцирующими и запасающими сахара частями растения, и это приводит к увеличению общего содержания растворимых углеводов, в том числе и сахаров, в растении. Это открытие было сведено на
практике в форме методов для модификации общего содержания углеводов или сахаристости запасающих тканей растений, генетически модифицированных растений, запасающие ткани которых имеют более высокое содержание общих или растворимых углеводов или более высокую сахаристость, чем ткани
немодифицированных растений, и продуктов, получаемых из таких генетически модифицированных растений.
В соответствии с этим одним из аспектов настоящего изобретения являются способы, обеспечивающие изменение общего содержания растворимых сахаров или сахаристости запасающих тканей растения. Эти способы, как правило, включают в себя продукцию в клетках растения метаболизирующих
сахара ферментов, которые катализируют превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, который обычно не продуцируется в растении на данной стадии развития. В результате определенного уровня продукции метаболизирующего сахар фермента или определенного уровня его функциональной активности общее содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается по
сравнению с соответствующей запасающей тканью растения, которое не продуцирует этот фермент. В
некоторых воплощениях изобретения, метаболизирующий сахар фермент продуцируется в клетках растения с помощью экспрессии полинуклеотида, кодирующего данный фермент. В этих воплощениях растение представляет собой трансгенное растение, выбираемое из множества трансгенных растений на том
основании, что оно содержит в своем нуклеоме кодирующий фермент полинуклеотид, функционально
связанный с регуляторным элементом транскрипции. Такое трансгенное растение выбирается на основании того, что оно продуцирует метаболизирующий сахар фермент на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание или содержание растворимых углеводов или сахаристость
запасающей ткани выбранного трансгенного растения является увеличенным по сравнению с этими параметрами соответствующей запасающей ткани контрольного растения. Соответственно, в клетках таких
растений полинуклеотид функционально связан с регулирующим транскрипцию элементом, функциональным в растительных клетках. В некоторых воплощениях полинуклеотид, кодирующий фермент,
экспрессируется конститутивно, и контролирующий его транскрипцию элемент является, таким образом,
конститутивным промотором. В других воплощениях полинуклеотид, кодирующий фермент, экспрессируется селективно, что включает координацию экспрессии во времени, тканеспецифичную экспрессию и
внутриклеточную локализацию фермента. В этих последних воплощениях элемент, контролирующий
транскрипцию, выбирается из тканеспецифичного промотора, из промотора, регулируемого в процессе
развития, или из индуцибельного промотора.
В некоторых воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается в результате продукции в клетках растения фермента, метаболизирующего сахар, на таком
уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к частичному превращению, что
составляет обычно менее чем примерно 20%, но, как правило, менее чем примерно 15%, и чаще менее
чем примерно 10% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Соответственно, частичное
превращение осуществляется в тканях, претерпевающих деление клеток и/или рост клеток, обеспечивающие рост растения. В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, имеет подходящий уровень активности в цитоплазме клеток растения, или его активность может быть распределена между цитоплазмой и субклеточными компартментами, участвующими в запасании и/или транспорте сахаров.
Соответственно, в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого снижения содержания эндогенных сахаров или углеводов.
В других воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается путем адресования фермента, метаболизирующего сахар, в определенный компартмент клетки
растения, который участвует в запасании сахаров. В этих воплощениях фермент, метаболизирующий
сахар, присутствует в соответствующем внутриклеточном компартменте в таком количестве или с такой
функциональной активностью, которая приводит к превращению значительного количества, которое
обычно составляет по меньшей мере примерно 20%, но, как правило, по меньшей мере около 40%, и более часто по меньшей мере примерно 60% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Соответственно, такое значительное превращение осуществляется в тканях, которые по существу прекратили
деление клеток или рост клеток и которые используются для запасания углеводов. Желательно, чтобы
значительное превращение сахара не происходило в тканях, претерпевающих деление клеток и/или рост
клеток, обеспечивающие рост растения. Подходящим внутриклеточным компартментом является компартмент, отвечающий за запасание сахаров, обычно вакуоль или вакуоль и апоплазматическое пространство. Соответственно, в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого
уменьшения содержания эндогенных сахаров или углеводов.
Как правило, к клеткам растений, которые функционируют в качестве запасников углерода, отно-3-
008669
сятся клетки нефотосинтезирующих тканей или органов и запасающих тканей или органов, например
корней, клубней, стеблей, плодов или семян, а также нефотосинтезирующие клетки продуцирующих органов, например листьев. В соответствии с этим, в качестве растений для генноинженерных манипуляций используются растения, экономическая ценность тканей которых определяется содержанием в них
сахаров. К таким растениям относятся виды, используемые для получения овощей и фруктов в коммерческих целях, а также виды, которые выращиваются для экстракции из них сахарозы и других сахаров, в
частности сахарный тростник и сахарная свекла.
Пригодный эндогенный сахар и чужеродные сахара выбираются из моносахаридов, олигосахаридов
и производных сахаров, включая сахароспирты, сахарные кислоты, аминосахара и другие варианты, такие как дезоксисахара, метилированные сахара и тому подобное. В одном из воплощений эндогенным
сахаром является сахароза, а чужеродный сахар выбирается из изомальтулозы и трегалулозы. В этом воплощении ферментом, метаболизирующим сахар, обычно является сахарозоизомераза.
В одном из своих родственных аспектов настоящее изобретение обеспечивает способы получения
растения с такой запасающей тканью, которая имеет увеличенное содержание эндогенных углеводов по
сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения. Эти способы обычно включают в себя отбор трансгенного растения с желательным содержанием эндогенных углеводов из большого количества трансгенных растений, в нуклеом которых введен полинуклеотид, функционально связанный с регулирующим транскрипцию элементом, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар. Трансгенное растение
выбирается на основании того, что оно продуцирует фермент, метаболизирующий сахар, на таком уровне или с такой функциональной активностью, что содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани или органе трансгенного растения увеличено по сравнению с соответствующей запасающей тканью
контрольного растения.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку трансгенного растения, имеющую
повышенное общее содержание углеводов или повышенное содержание эндогенных углеводов по сравнению с клетками контрольного растения, как здесь определено. Нуклеом клетки трансгенного растения
включает в себя контролирующий транскрипцию элемент, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим фермент, метаболизирующий сахар. Фермент, метаболизирующий сахар, катализирует превращение эндогенного сахара растительной клетки в чужеродный сахар. Преимущественно, фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или содержание эндогенных углеводов в клетках трансгенного
растения увеличивается по сравнению с клетками контрольного растения.
В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает трансгенное растение, имеющее запасающую ткань с увеличенным общим содержанием углеводов или с увеличенной сахаристостью, или с увеличенным содержанием эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения, как здесь определено. Трансгенное растение включает в себя
клетки, которые имеют в своем нуклеоме полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар. Для осуществления экспрессии полинуклеотид функционально связан с регулирующим транскрипцию элементом,
который функционален в клетках растения. В одном из воплощений фермент, метаболизирующий сахар,
продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения увеличено по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения.
В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает запасающую ткань трансгенного растения, в которой увеличено общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов по сравнению с запасающей тканью контрольного растения, как здесь определено.
Запасающая ткань трансгенного растения включает в себя клетки, в нуклеом которых включен полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар. Для осуществления экспрессии полинуклеотид функционально
соединен с регулирующим транскрипцию элементом, который является функциональным, по меньшей
мере, в некоторых клетках растения. В одном из воплощений фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется в производящей и/или запасающей тканях растения на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения увеличено по сравнению с запасающей тканью контрольного растения. Соответственно, запасающая ткань выбирается из плодов, семян, стеблей, клубней
или корней.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает общие углеводы или эндогенные углеводы,
выделяемые из растения или запасающей ткани, как в широком смысле описано выше. В одном из воплощений углеводы выбираются из простых сахаров, включая сахарозу, глюкозу и фруктозу.
В следующем своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения продукта с помощью ферментации, который обычно включает в себя ферментирование углеводов, являющихся субстратами для ферментации и которые получают из растения или запасающей ткани растения, как в об-4-
008669
щих чертах описано выше. Продукт ферментации, получаемый таким способом, как правило, включает в
себя один или более компонентов, таких как этанол, уксусная кислота, молочная кислота, углекислый газ
или другие продукты, получающиеся в результате ферментации субстратов, включающих в себя углеводы, выделенные из растения или запасающей ткани, как в общих чертах описано выше.
В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы для продуцирования в растении чужеродного сахара, который эндогенно не продуцируется растением на данной стадии развития как
эндогенный сахар. Эти способы обычно включают в себя адресную доставку в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахаров в клетках растения, метаболизирующего сахар фермента,
который катализирует превращение эндогенного сахара в чужеродный сахар. В некоторых воплощениях
субклеточный компартмент выбирается из вакуоли или апоплазматического пространства. Фермент, метаболизирующий сахар, преимущественно доставляется в субклеточный компартмент на таком уровне
или с такой функциональной активностью, которые приводят к значительному увеличению общего содержания сахара, обычно по меньшей мере примерно на 10%, но предпочтительно по меньшей мере
примерно на 50%, и более предпочтительно по меньшей мере примерно на 100% выше содержания эндогенного сахара в соответствующем немодифицированном растении. Соответственно, чужеродный сахар
накапливается без соизмеримого уменьшения содержания эндогенных сахаров или углеводов.
В еще одном из своих аспектов настоящее изобретение обеспечивает клетку трансгенного растения,
которая включает в себя чужеродный сахар, как здесь описано. Нуклеом клеток трансгенного растения
включает в себя регуляторный элемент транскрипции, функционально связанный с полинуклеотидом,
который кодирует метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара
клеток растения в чужеродный сахар. Фермент, метаболизирующий сахар, включает в себя сигнальную
последовательность, которая обеспечивает адресную доставку фермента в субклеточный компартмент,
используемый в клетке растения для запасания сахаров.
В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает трансгенное растение, имеющее запасающую ткань, которая накапливает чужеродный сахар, как здесь определено. Трансгенное растение
включает в себя клетки, в нуклеоме которых содержится полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар;
этот полинуклеотид функционально связан с транскрипционным регуляторным элементом, который
функционален в клетках растения, причем фермент, метаболизирующий сахар, включает сигнальную
последовательность, адресно доставляющую фермент в субклеточный компартмент, используемый для
запасания сахаров в клетках растения.
В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает запасающую ткань трансгенного растения, которая накапливает чужеродный сахар, как здесь определено. Запасающая ткань трансгенного
растения включает в себя клетки, в нуклеоме которых содержится полинуклеотид, кодирующий метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный
сахар; этот полинуклеотид функционально связан с транскрипционным результатом элементом, который
функционален, по меньшей мере, в некоторых клетках растения, причем фермент, метаболизирующий
сахар, имеет в своем составе сигнальную последовательность, которая адресно доставляет фермент в
субклеточный компартмент, используемый для запасания сахаров в клетках запасающей ткани. Соответственно, запасающая ткань выбирается из плодов, семян, стеблей, клубней или корней.
Демонстрация того, что экспрессия в организме введенного гена, приводящая к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата, которое в норме чувствуется организмом, в веществопродукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, может изменять метаболические потоки и приводить к накоплению более высоких количеств желательных эндогенных веществ,
явилась в высшей степени новым и неожиданным фактом и имеет широкую промышленную применимость за рамками гена сахарозоизомеразы, продукта превращения изомальтулозы, эндогенных углеводных соединений или растений сахарного тростника, обеспечиваемых данным изобретением в виде подробно описанных примеров. В соответствии с этим, настоящее изобретение включает в себя в широком
смысле экспрессию в организме введенного гена, приводящую к частичному превращению эндогенного
вещества-субстрата, которое в норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, в результате чего изменяются метаболические потоки и накапливаются более высокие количества желаемых эндогенных веществ.
В настоящем изобретении также описан новый промотор, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:10, который обеспечивает специфическую экспрессию генов в стеблях растений (например, однодольных, особенно травянистых однодольных, таких как сахарный тростник). Этот промотор обеспечивает удобную систему экспрессии, которая не была получена при использовании тестированных ранее промоторов, и который структурно отличается от этих промоторов по ряду параметров,
включая отсутствие участка, описываемого последовательностью SEQ ID NO:20. Соответственно, настоящее изобретение в другом своем аспекте обеспечивает изолированную молекулу ДНК, включающую
нуклеотидную последовательность, которая соответствует или комплементарна последовательности,
представленной в SEQ ID NO:10, или ее биологически активной части, или ее варианту, имеющему последовательность, идентичную по меньшей мере на 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% последовательности, пред-5-
008669
ставленной в SEQ ID NO:10. Желательно, чтобы варианты не имели в своем составе последовательности,
представленной в SEQ ID NO:20, и гибридизовались с последовательностью, представленной в SEQ ID
NO:10, по меньшей мере, в условиях средней строгости.
Как правило, в настоящем изобретении используемый промотор сливают с кодирующей последовательностью для получения химерной конструкции с целью экспрессии кодируемой последовательности в
интересующем растении. Конструкцию затем можно ввести в клетку растения-хозяина, или в растение,
или в часть растения с помощью любого подходящего метода. Таким образом, другим аспектом настоящего изобретения является химерная ДНК-конструкция, включающая в себя молекулу ДНК как в общем
плане описано выше, функционально связанную с чужеродной или эндогенной последовательностью
нуклеиновой кислоты, которая должна быть транскрибирована. В некоторых воплощениях изобретения,
химерная ДНК- конструкция также включает в себя 3'-нетранслируемую последовательность, которая
функционально связана с чужеродной или эндогенной последовательностью ДНК и которая выполняет в
клетках растения функцию терминации транскрипции и/или обеспечивает присоединение полиаденилированной нуклеотидной последовательности к 3'-концу транскрибируемой последовательности РНК.
Чужеродная или эндогенная последовательность ДНК является чужеродной или эндогенной по отношению к растительной клетке, в которую она введена или будет введена. В некоторых воплощениях
изобретения чужеродная или эндогенная последовательность ДНК кодирует структурный или регуляторный белок, или вместо этого транскрипт, способный модулировать экспрессию соответствующего
гена-мишени. В некоторых воплощениях изобретения транскрипт включает в себя антисмысловую РНК,
или рибозим, или другой транскрибируемый участок, предназначенный для понижающей регуляции экспрессии соответствующего гена-мишени. Например, другой транскрибируемый участок может включать
в себя смысловой транскрипт, предназначенный для смысловой супрессии (ко-супресии) соответствующего гена-мишени.
В другом своем воплощении настоящее изобретение предусматривает способ получения трансформированных растительных клеток, включающий введение в способные к регенерации клетки растения
химерной ДНК-конструкции, как в общем плане описано выше, с целью получения трансформированных растительных клеток и идентификацию или отбор трансформированных растительных клеток. В
близком к этому аспекте настоящее изобретение обеспечивает трансформированную растительную клетку, содержащую химерную ДНК-конструкцию, как в общем плане описано выше.
В еще одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ отбора стабильных генетических трансформантов из трансформированных растительных клеток, включающий введение в способные к регенерации растительные клетки химерной ДНК -конструкции, в общем плане описано выше,
с целью получения трансформированных растительных клеток и идентификацию или отбор линии
трансформированных растительных клеток из этих трансформированных растительных клеток. Способные к регенерации клетки могут быть способными к регенерации клетками двудольного растения, но
обычно это клетки однодольного растения, например такие, как способные к регенерации клетки травянистого однодольного растения. В некоторых воплощениях изобретения экспрессия химерной ДНКконструкции в трансформированных клетках изменяет фенотипические характеристики трансформированных клеток.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения дифференцированного
трансгенного растения, включающий в себя введение химерной ДНК-конструкции, как в общем плане
описано выше, в способные к регенерации растительные клетки с целью получения способных к регенерации трансформированных клеток, идентификацию или отбор популяции трансформированных клеток,
и регенерацию дифференцированного трансгенного растения из этой популяции клеток. В некоторых
воплощениях изобретения экспрессия химерной ДНК-конструкции обеспечивает дифференцировку
трансгенного растения, легко отличимого от соответствующего нетрансгенного растения. В близком к
этому аспекте настоящее изобретение обеспечивает получение дифференцированного трансгенного растения, содержащего клетки, содержащие химерную ДНК-конструкцию, как в общем плане описано выше. Химерная ДНК-конструкция передается в процессе полного цикла дифференцировки трансгенного
растения его потомству так, что она экспрессируется в растениях-потомках. Таким образом, настоящее
изобретение также обеспечивает семена, другие части растения, ткани и растения-потомки, происходящие из дифференцированного трансгенного растения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 графически представлены результаты капиллярного электрофореза растворимых сахаров
из тканей листа (№ 3), стебля (междоузлие № 12) и молодого корня контрольного растения Q117 и растений из трансгенных линий pUbi68J1.2, pUbil4S2.36 и pUbiErw2.1. Взятые в качестве образцов растения
были 6-месячного возраста и имели 12-13 узлов. Трансгенные линии представляли собой первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. Пики: 1 - сахароза, 2 - изомальтулоза, 3 - фруктоза и 4 - глюкоза.
На фиг. 2 в виде диаграмм представлена эффективность превращения сахаров различными генами
сахарозоизомеразы в E.coli (А) и в стеблях трансгенных растений сахарного тростника (Б). Эффективность превращения сахаров определяется как соотношение изомальтулоза/(сахароза + изомальтулоза) х
-6-
008669
100. Результаты на панели (А) представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех
повторов культур. Результаты на панели (Б) представляют собой максимальные эффективности превращения в стеблях из 11 линий pUbiErw, 11 линий pUbil4S и 9 линий pUbi68J. Взятые в качестве образцов
растения сахарного тростника были 6-месячного возраста и имели от 12 до 15 узлов, первое вегетативное
поколение, выращенное из каллюса.
На фиг. 3 представлены фотографии 6-месячных типичных растений трех фенотипических классов
линий сахарного тростника, трансформированных pUbi68J. Слева: нормальное (pUbi68J2.36). В центре:
растение со слабой главной жилкой (pUbi68J1.2). Справа: низкорослое (pUbi68J2.22). Растения представляют собой первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса.
На фиг. 4 представлены фотографии Нозерн-блот анализа суммарной РНК из листьев и стеблей сахарного тростника. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели от 12 до 15
узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса. На верхней панели представлены результаты гибридизации с зондами кДНК сахарозоизомеразы UQ68J, размер молекул около 1700 п.о. На
нижней панели показан результат разделения суммарной РНК и окрашивание бромистым этидием больших и малых субъединиц рРНК. Дорожка 1 - pUbi68J2.22, междоузлия 3-4. Дорожка 2 - pUbi68J2.22, номера листьев 1-2. Дорожка 3 - pUbi68J2.36, междоузлия 3-4. Дорожка 4 - pUbi68J2.36, номера листьев 12. Дорожка 5 - pUbi68J1.2, междоузлия 3-4. Дорожка 6 - pUbi68J1.2, номера листьев 1-2. Дорожка 7 - контрольное растение Q117, междоузлия 3-4. Дорожка 8 - контрольное растение Q117, номера листьев 1-2.
На фиг. 5 представлены диаграммы, демонстрирующие высокую эффективность превращения сахарозы в изомальтулозу в стебле, листьях и корнях растений трансгенной линии pUbi68J2.22. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели 12 узлов, первое вегетативное поколение,
выращенное из каллюса.
На фиг. 6 представлены диаграммы, демонстрирующие накопление сахарозы в трансгенных
pUbi68J2.36 и контрольных Q117 растениях сахарного тростника. Взятые в качестве образцов растения
были 6-месячного возраста и имели 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса.
На фиг. 7 представлены диаграммы, демонстрирующие накопление изомальтулозы в тканях стебля
и листьев растений трансгенной линии pUbi68J2.36. Взятые в качестве образцов растения были 6месячного возраста и имели 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса.
На фиг. 8 представлены диаграммы, демонстрирующие общую концентрацию растворимых сахаров
(в глюкозных эквивалентах) в трансгенных pUbi68J2.36 и контрольных Q117 растениях сахарного тростника. Взятые в качестве образцов растения были 6-месячного возраста и имели 15 узлов, первое вегетативное поколение, выращенное из каллюса.
На фиг. 9 представлены диаграммы, демонстрирующие скорости фотосинтетической фиксации CO2
в листьях растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных Q117 растений сахарного тростника.
Растения были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линии
pUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений.
На фиг. 10 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрацию хлорофилла в листьях растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных растений Q117 сахарного тростника. Растения были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линии pUbi68J2.36
представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений.
На фиг. 11 представлены диаграммы, демонстрирующие соотношение хлорофиллов а/b в листьях
растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных растений Q 117 сахарного тростника. Растения
были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линии
pUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений.
На фиг. 12 представлены графики, демонстрирующие скорости фотосинтетического транспорта
электронов, измеренные по флуоресценции хлорофилла при различных интенсивностях света, в листьях
растений трансгенной линии pUbi68J2.36 и контрольных растений Q117 сахарного тростника. Растения
были 4-месячного возраста и были морфологически неразличимы. Растения трансгенной линии
pUbi68J2.36 представляли собой третье вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации. Результаты представляют собой средние значения и стандартные ошибки для трех повторов растений.
На фиг. 13 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы в корнях
растений разных трансгенных линий, в которых экспрессируемая сахарозоизомераза направлялась в вакуоли, и контрольных растений Q117. Корни получали из двухглазковых секций сахарного тростника,
которые заворачивали в мокрую ткань и выдерживали при 28°С в течение 7 дней.
На фиг. 14 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы в листьях
растений трансгенной линии pU3ZERsN68J3.2 (в которых экспрессируемая сахарозоизомераза направля-7-
008669
лась в вакуоли). Растения были 8-месячного возраста, имели 21 междоузлие и были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117. Трансгенное растение представляло собой второе вегетативное поколение (из стеблевых черенков) после регенерации.
На фиг. 15 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы в стеблях
растений трансгенной линии pU3ZERsN68J3.2His (в которых экспрессируемую сахарозоизомеразу адресовали в вакуоли). Растения были 8-месячного возраста, имели 35 междоузлий и были морфологически
неотличимы от контрольных растений линии Q117. Трансгенное растение представляло собой второе
вегетативное поколение (корневые отпрыски тростника из исходного горшка) после регенерации каллюса.
На фиг. 16 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы во фракциях
«внеклеточной» и «внутриклеточной» жидкости из тканей стебля растений трансгенных линий
pU3ZERsN68J3.2His (а), pU3ZERsN68J1.17 (b), pU3ZERc68JC3.1His (с) и pU3ZERsN68JC3.7His (d). Растения a, b, d были 8-месячного возраста, а растение с было 12-месячного возраста. Число междоузлий в
растениях а, b, с и d составляло 35, 20, 43 и 30, соответственно. Трансгенное растение b представляло
собой второе вегетативное поколение, выращенное из стеблевых черенков; трансгенные растения а, с и d
представляли собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходных
горшков. Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений
линии Q117.
На фиг. 17 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации изомальтулозы, других сахаров (сумма глюкозы, фруктозы и сахарозы в сахарозных эквивалентах, т.е. G/2 + F/2 + S) и общее содержание сахаров (в сахарозных эквивалентах) в тканях стеблей растений контрольной линии Q117 (а) и
растений трансгенных линий pU3ZERsN68J3.2 #1 (b), pU3ZERsN68J3.2 #2 (с) и pU3ZERsN68J3.2His (d).
Все растения были 8-месячного возраста и имели 21, 27, 22 и 35 междоузлий, соответственно. Контрольные растения Q117 выращивали из стеблевых черенков. Трансгенные растения b и с представляли собой
второе вегетативное поколение, выращенное из стеблевых черенков. Трансгенное растение d представляло собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходного горшка.
Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии
Q117.
На фиг. 18 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации сахарозы, других сахаров
(сумма глюкозы, фруктозы и изомальтулозы в сахарозных эквивалентах) и общее содержание сахаров (в
сахарозном эквиваленте) в тканях стеблей растений контрольной линии Q117 (а) и трансгенных линий
pU3ZER.sN68J1.17 #1 (b), pU3ZERsN6SJ1.17 #2 (с) и pU3ZERsN68J1.2 (d). Все растения были 8месячного возраста и имели 21, 20, 30 и 31 междоузлие, соответственно. Контрольное растение Q117
выращивали из стеблевых черенков. Трансгенное растение b представляло собой второе вегетативное
поколение, выращенное из стеблевых черенков. Трансгенные растения с и d представляли собой второе
вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходных горшков. Растения всех
трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117.
На фиг. 19 представлены диаграммы, демонстрирующие концентрации сахарозы, других сахаров
(сумма глюкозы, фруктозы и изомальтулозы в сахарозных эквивалентах) и общее содержание сахаров (в
сахарозном эквиваленте) в тканях стеблей растений контрольной линии Q117 (а) и трансгенных линий
pU3ZERc68JC1.3His (b), pU3ZERc68JC3.7His (с) и pU3ZERc68JC3.8His (d). Все растения были 8месячного возраста и имели 28, 32, 38 и 30 междоузлий, соответственно. Контрольные растения Q117 и
трансгенные растения b, с и d представляли собой второе вегетативное поколение в виде корневых отпрысков тростника из исходных горшков. Растения всех трансгенных линий были морфологически неотличимы от контрольных растений линии Q117.
На фиг. 20 представлены диаграммы, демонстрирующие уровни активности GUS в тканях стеблей
растений трансгенной линии с промотором 67А (p67A-GUS6.7) и трансгенной линии с промотором 67В
(p67B-GUS3.1). Растения обеих линий были 6-месячного возраста, имели по 14 междоузлий и были выращены из стеблевых черенков.
На фиг. 21 графически представлены структуры иллюстративных «векторов для прямого переноса
гена», использованных для создания растений сахарного тростника с фенотипом высокого общего содержания сахаров.
-8-
008669
Таблица А. Краткое описание последовательностей
-9-
008669
Осуществление изобретения
1. Определение терминов
Если не определено иначе, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же
значение, которое вкладывает в них любой средний специалист в области, к которой относится изобретение. Хотя любые методы или материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, могут быть
использованы при осуществлении или при проверке настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные методы и материалы. Ниже определены основные термины, используемые в настоящем изобретении.
Неопределенные артикли «а» или «an» используются здесь для обозначения одного или более чем
одного (то есть по меньшей мере одного) грамматического объекта, к которому относится артикль. Например, термин «элемент» с неопределенным артиклем «an» обозначает один или более чем один элемент.
Термин «около» используется в изобретении в отношении величины, уровня, значения, объема,
длины, положения, размера или количества, которые варьируют в пределах максимум 30%, предпочтительно 20% и более предпочтительно 10% от указанных величины, уровня, значения, объема, длины,
положения, размера или количества.
Термин «чужеродный» используется в изобретении для обозначения вещества, продуцируемого
модифицированным растением, которое обычно не продуцируется соответствующим немодифицирован- 10 -
008669
ным растением на той же стадии развития.
Термин «биологически активный участок» в применении к последовательности промотора обозначает тот участок, который обеспечивает по меньшей мере около 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24, 26, 28 или 30% активности промотора с данной последовательностью. Также необходимо понимать,
что фраза «биологически активный участок» обозначает часть указанной последовательности ДНК, которая инициирует транскрипцию РНК или которая, будучи соединенной с определенным геном и введенной в клетку растения, вызывает экспрессию гена на уровне, который выше уровня экспрессии в отсутствие такой части последовательности ДНК. Включенные в объем настоящего изобретения биологически активные участки имеют длину по меньшей мере около 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800 или даже 900 нуклеотидов.
Используемые здесь термины «цис-действующая последовательность», «цис-действующий элемент» или «цис-регуляторный участок», или «регуляторный участок», или близкие по смыслу термины
обозначают в данном изобретении любую последовательность нуклеотидов, которая при встраивании в
подходящее положение по отношению к экспрессируемой генетической последовательности способна
регулировать, по меньшей мере, частично, экспрессию этой генетической последовательности. Специалисты в данной области знания должны понимать, что цис-регуляторный участок может быть способен к
активации, сайленсингу, энхансингу, подавлению или изменению любым другим образом уровня экспрессии, и/или специфичности по отношению к определенному типу клеток, и/или специфичности к определенной стадии развития последовательности гена на транскрипционном или пост-транскрипционном
уровне. В определенных воплощениях данного изобретения цис-действующая последовательность представляет собой активаторную последовательность, которая усиливает или стимулирует экспрессию экспрессируемой генетической последовательности.
Во всем описании изобретения, если в контексте специально не оговорено иначе, термины «включают», «включает» и «включающая» должны пониматься как включение указанной стадии или элемента,
или группы стадий или элементов, но не как исключение любой другой стадии или элемента, или любой
другой группы стадий или элементов.
Термин «соответствует чему-либо» или «соответствующий чему-либо» означает в изобретении полинуклеотид, который (а) имеет нуклеотидную последовательность, по существу, в значительной степени идентичную или комплементарную всей указанной полинуклеотидной последовательности или её
части, или (б) кодирует аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности пептида или белка. Эта фраза также включает в свой объем пептид или полипептид, имеющий
аминокислотную последовательность, которая, по существу, идентична аминокислотной последовательности указанного пептида или белка.
Термин «эндогенный» используется в изобретении для обозначения вещества, которое в норме
продуцируется немодифицированным растением, находящимся на той же стадии развития, что и исследуемое растение.
Термины «чужеродный полинуклеотид», или «экзогенный полинуклеотид», или «гетерологический
полинуклеотид» и тому подобные обозначают любую нуклеиновую кислоту (то есть генетическую последовательность), которая введена в геном растения с помощью экспериментальных манипуляций и
может включать в себя последовательности генов, обнаруженные в таком растении, при том условии, что
введенный ген содержит определенные модификации (например, точечную мутацию, присутствие селектируемого маркерного гена, присутствие сайта lохР и т.д.) по сравнению с имеющимся природным геном.
Термин «ген» в данном изобретении обозначает любой из или все дискретные кодирующие участки
клеточного генома, а также связанные с ними некодирующие и регуляторные области. Термин «ген»
также используется для обозначения открытой рамки считывания, кодирующей специфические полипептиды, интроны и связанные с ними 5'- и 3'-некодирующие нуклеотидные последовательности, участвующие в регуляции экспрессии. В этой связи термин «ген» может также включать в себя регуляторные сигналы, такие как промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или полиаденилирования, которые в норме связаны с данным геном, или гетерологические регуляторные сигналы. Последовательности ДНК могут представлять собой кДНК или геномные ДНК или их фрагменты. Ген может быть введен в подходящий вектор для внехромосомного поддержания или для интеграции в геном клетки-хозяина.
Используемые в изобретении термины «гибридизация в условиях малой строгости, средней строгости, высокой строгости или очень высокой строгости» описывают условия проведения гибридизации и
отмывки. Методика проведения реакций гибридизации может быть найдена в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6. В этом источнике описаны методы с использованием водных или неводных растворов, любой из которых может быть использован. Указываемые в изобретении специфические условия гибридизации означают следующее: 1) гибридизация в условиях малой
строгости проводится в 6xрастворе хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при температуре около 45°С, с
последующими двумя промывками в 0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре по меньшей мере 50°С (температура промывки может быть увеличена до 55°С для условий малой строгости); 2) гибридизация в усло- 11 -
008669
виях средней строгости проводится в 6xSSC при температуре около 45°С, с последующей одной или более промывками в 0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре 60°С; 3) гибридизация в условиях высокой строгости проводится в 6xSSC при температуре около 45°С, с последующей одной или более промывками в
0,2xSSC, 0,1% SDS при температуре 65°С; и 4) гибридизация в условиях очень высокой строгости проводится в 0,5 М фосфате натрия и 7% SDS при температуре 65°С, с последующей одной или более промывками в 0,2xSSC, 1% SDS при температуре 65°С.
Термин «интрон» обозначает участок ДНК или РНК, который обычно удаляется из первичного
РНК-транскрипта в результате сплайсинга и отсутствует в зрелой молекуле мРНК.
Используемое в изобретении понятие «иммуно-интерактивный» включает ссылку на любое взаимодействие, реакцию или другую форму ассоциации между молекулами, в частности, когда одна из этих
молекул является компонентом или имитирует компонент иммунной системы.
Термин «изолированный» обозначает материал, который в значительной мере или полностью освобожден от компонентов, которые обычно связаны с ним в его нативном состоянии. Например, используемый в изобретении термин «изолированный полинуклеотид» обозначает полинуклеотид, который
очищен от последовательностей, которые фланкируют его в нормальном нативном состоянии, то есть
освобожден от участков ДНК, в норме прилегающих к полинуклеотиду с двух сторон.
Термин «маркерный ген» обозначает ген, который придает отличный фенотип клеткам, экспрессирующим это маркерный ген, что позволяет отличить такие трансформированные клетки от клеток, которые не имеют этого маркера. Селектируемый маркерный ген придает клеткам определенные признаки,
позволяющие проводить «отбор» на основе устойчивости к определенному селективному агенту (например, гербициду, антибиотику, радиации, нагреванию или другим воздействиям, повреждающим нетрасформированные клетки). Маркерный ген для скрининга (или репортерный ген) придает клеткам свойства, которые можно идентифицировать при наблюдении или тестировании, то есть посредством «скрининга» (например, активность Р-глюкуронидазы, люциферазы или другого фермента, который отсутствует в нетрансформированных клетках).
Термин «нуклеом» обозначает все имеющиеся в клетке нуклеиновые кислоты и включает геном,
внехромосомные молекулы нуклеиновых кислот и все молекулы РНК, такие как мРНК, гетерогенная
ядерная РНК (гяРНК), малая ядерная РНК (мяРНК), малая ядрышковая РНК (мнРНК), малая цитоплазматическая РНК (мцРНК), рибосомальная РНК (рРНК), РНК трансляционного контроля (ткРНК), транспортная РНК (тРНК), эРНК, комплементарная матричной РНК интерферирующая РНК (микРНК) или
интерферирующая РНК (иРНК), РНК хлоропластов или пластид (хпРНК) и митохондриальная РНК
(мтРНК).
Термин «функционально связанный» или «функционально сопряженный» и тому подобное обозначает связь полинуклеотидных элементов в функциональном отношении. Последовательность нуклеиновой кислоты является «функционально связанной», когда она вводится в функциональные взаимоотношения с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер является
функционально сопряженным с кодирующей последовательностью, если он изменяет транскрипцию
этой кодирующей последовательности. Термин «функционально связанный» означает, что такие последовательности нуклеиновой кислоты обычно расположены рядом и, где необходимо объединить два участка, кодирующие белок, расположены рядом и в одной рамке считывания. Кодирующая последовательность «функционально связана» с другой кодирующей последовательностью, когда РНК-полимераза будет транскрибировать обе кодирующие последовательности в единую молекулу мРНК, которая затем
будет транслироваться в единую полипептидную цепь, включающую аминокислоты, кодируемые двумя
последовательностями. Кодирующие последовательности не обязательно должны быть расположены
рядом друг с другом, если экспрессируемые последовательности в конечном счете процессируются с
получением нужного белка. «Функциональное сопряжение» промотора с транскрибируемым полинуклеотидом означает, что этот транскрибируемый полинуклеотид (например, кодирующий белок полинуклеотид или другой транскрипт) находится под контролем данного промотора, который регулирует транскрипцию, а иногда и трансляцию этого полинуклеотида. В конструкции, состоящей из комбинации гетерологический промотор/структурный ген, обычно является предпочтительным поместить промотор или
его вариант на определенном расстоянии от участка начала транскрипции транскрибируемого полинуклеотида. Это расстояние примерно соответствует расстоянию между промотором и контролируемым им
геном в нативном состоянии, то есть в том гене, из которого данный промотор был получен. Как известно специалистам в данной области, определенные отклонения в этом расстоянии могут иметь место без
потери функции. Подобно этому, предпочтительное расположение регуляторного элемента последовательности (например, оператора, энхансера и т.д.) по отношению к транскрибируемому полинуклеотиду,
который должен находиться под его контролем, определяется расположением этого элемента в нативном
состоянии, то есть в том гене, из которого он был получен.
Термины «растение» и «дифференцированное растение» используются в изобретении для обозначения целого растения или части растения, состоящей из дифференцированных клеток разного типа, тканей и/или систем органов. Проростки и семена также подпадают под обозначение данными терминами.
Включаемые в объем изобретения растения могут быть любыми растениями, подходящими для приме- 12 -
008669
нения способов трансформации, включая покрытосеменные, голосеменные, однодольные и двудольные.
Термин «растительная клетка» используется в изобретении для обозначения протопластов или других клеток, полученных из растений, клеток, продуцирующих гаметы, и клеток, которые регенерируют в
целое растение. Термин «растительные клетки» обозначает клетки в растениях, а также протопласты или
другие клетки в культуре.
Под термином «растительная ткань» понимается дифференцированная или недифференцированная
ткань, полученная из корней, побегов, плодов, клубней, пыльцы, семян, опухолевой ткани, такой как
верхушечные галлы, или различные формы агрегированных клеток: растений в культуре, такие как зародыши или каллюсы.
Термины «полинуклеотидный вариант» и «вариант» и подобные термины обозначают полинуклеотиды, имеющие последовательность, существенно идентичную последовательности данного полинуклеотида или полинуклеотидов, которые гибридизуются с данной последовательностью в строгих условиях, которые определены здесь далее. Эти термины также включают полинуклеотиды, получаемые из исследуемого нуклеотида путем вставки, делеции или замены по меньшей мере одного нуклеотида. В соответствии с этим термины «полинуклеотидный вариант» и «вариант» включают полинуклеотиды, в которых один или более нуклеотидов было добавлено, или удалено, или заменено на другие нуклеотиды. В
этой связи специалистам в данной области хорошо известно, что в исследуемом полинуклеотиде могут
быть сделаны определенные изменения, включая мутации, вставки, делеции и замены, причем измененный полинуклеотид сохранит биологическую функцию или активность исходного полинуклеотида. Соответственно, данные термины включают полинуклеотиды, которые инициируют транскрипцию РНК,
или такие, которые при слиянии с определенным геном и при введении в растительную клетку вызывают
экспрессию гена на более высоком уровне, чем это возможно в отсутствие таких полинуклеотидов. Термины «полинуклеотидный вариант» и «вариант» также включают встречающиеся в природе аллельные
варианты.
Термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» используются в изобретении для обозначения мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Термин обычно используется для обозначения олигонуклеотида,
имеющего длину не менее чем 30 нуклеотидов.
Взаимозаменяемые термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в изобретении для
обозначения полимера, состоящего из остатков аминокислот, его вариантов и синтетических аналогов.
Таким образом, эти термины применимы к полимерам аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков являются синтетической аминокислотой, в обычных условиях не встречающейся,
например химическим аналогом соответствующей природной аминокислоты, а также к природным аминокислотным полимерам.
Термин «промотор» употребляется в изобретении в своем широком смысле и обозначает участок
ДНК, обычно расположенный против направления транскрипции относительно кодирующего мРНК участка (перед 5'-концом), который контролирует инициацию и уровень транскрипции. Термин «промотор»
должен рассматриваться здесь в своем самом широком смысле, включающем транскрипционные регуляторные последовательности классического геномного гена, в частности последовательности ТАТА-бокс
и ССААТ-бокс, а также дополнительные регуляторные элементы (то есть, расположенные перед кодирующим участком активаторные последовательности, энхансеры и сайленсеры), которые изменяют экспрессию гена в ответ на стимулы, связанные со стадией развития и/или с изменением в окружающей
среде, или тканеспецифичным, или зависимым от типа клеток способом. Обычно, но не обязательно,
промотор располагается перед структурным геном (перед 5'-концом), экспрессию которого он регулирует. Более того, регуляторные элементы, включая промотор, обычно располагаются в пределах 2 т.п.н. от
начала участка начала транскрипции гена. В соответствии с данным изобретением промоторы могут содержать дополнительные специфические регуляторные элементы, расположенные более отдаленно от
начала участка, с целью дальнейшего усиления экспрессии в клетке и/или изменения времени включения
или индуцибельности экспрессии структурного гена, с которым он функционально сопряжен.
Термин «конститутивный промотор» обозначает промотор, который управляет экспрессией функционально связанной с ним транскрибируемой последовательности во многих или во всех тканях растения.
Термин «промотор, специфичный для запасающей ткани» обозначает промотор, который обеспечивает экспрессию функционально связанной с ним транскрибируемой последовательности преимущественно в запасающей ткани растения (например, в тканях плода, ткани корня, ткани клубня, ткани семени,
ткани стебля или запасающей ткани листа) по сравнению с экспрессией в других тканях растения, включая ассимилирующие ткани (например, листа).
Термин «рекомбинантный полинуклеотид» используется в изобретении для обозначения полинуклеотида, полученного in vitro с помощью манипуляций с нуклеиновой кислотой и в природе обычно не
встречающегося. Например, рекомбинантный полинуклеотид может представлять собой вектор экспрессии. Обычно такие векторы экспрессии включают в себя нуклеиновые кислоты, регулирующие транскрипцию и трансляцию, функционально сопряженные с нуклеотидной последовательностью.
Термин «рекомбинантный полипептид» обозначает полипептид, полученный с помощью рекомби- 13 -
008669
нантных методов, то есть при экспрессии рекомбинантного полинуклеотида.
Термин «регенерация» используется в изобретении для обозначения растительного материала, вырастающего в целое, дифференцированное растение из растительной клетки, из группы растительных
клеток, части растения (включая семена) или кусочка растения (например, из протопласта, каллюса или
участка ткани).
Термином «репортерная молекула» в данном изобретении обозначается молекула, которая по своей
химической природе обеспечивает аналитически распознаваемый сигнал, позволяющий обнаружить
комплекс, включающий антигенсвязывающую молекулу и ее антиген-мишень. Термин «репортерная молекула» также распространяется на процессы агглютинации клеток или ингибирования агглютинации,
например на эритроциты, связанные с латексными бусинами, и тому подобное.
Термин «селективная экспрессия» используется в изобретении для обозначения экспрессии почти
исключительно в строго определенном органе растения, включая, но, не ограничиваясь, плоды, клубни,
корни или семена. Данный термин может также применяться для обозначения экспрессии на определенной стадии развития органа, такой как ранний или поздний эмбриогенез или разные стадии зрелости
стебля, или для обозначения экспрессии, которая индуцируется определенными условиями среды или
определенными воздействиями. Таким образом, селективная экспрессия может противопоставляться
конститутивной экспрессии, которая обозначает экспрессию во многих или во всех тканях растения в
большинстве или во всех условиях, испытываемых растением. Селективная экспрессия может также
приводить к компартментализации продуктов экспрессии гена в специфических тканях растения, органах
растения или на определенных стадиях развития. Компартментализация в специфических участках клетки, таких как цитозоль, вакуоль, или апоплазматическое пространство, может достигаться путем включения в структуру генного продукта соответствующей сигнальной последовательности, обеспечивающей
доставку продукта в требуемый компартмент клетки, или, в случае полуавтономных органелл (пластид и
митохондрий), путем интеграции трансгена вместе с соответствующими регуляторными последовательностями непосредственно в геном органеллы.
Термины, используемые для описания взаимного соответствия двух или более полинуклеотидов
или полипептидов, включают термины «ссылочная последовательность», «окно сравнения», «идентичность последовательности», «процент идентичности последовательности» и «существенная идентичность». «Ссылочная последовательность» состоит по меньшей мере из 12, чаще из 15-18, или чаще всего
по меньшей мере из 25 мономерных единиц, коими являются нуклеотиды или остатки аминокислот. Поскольку два полинуклеотида могут содержать в себе (1) последовательность (то есть только часть всей
полинуклеотидной последовательности), которая сходна у двух данных полинуклеотидов, и (2) последовательность, которая различается у двух данных полинуклеотидов, сравнение последовательности двух
(или более) полинуклеотидов обычно проводят, сравнивая последовательность двух полинуклеотидов в
определенном «окне сравнения», чтобы идентифицировать и сравнить локальные участки сходства последовательностей. «Окно сравнения» означает определенный сегмент, состоящий по меньшей мере из
50 соседних позиций, обычно от примерно 50 до примерно 100 позиций, более часто от примерно 100 до
примерно 150 позиций, в пределах которого последовательность с тем же числом соседних позиций
сравнивается со ссылочной последовательностью после оптимального выравнивания двух данных последовательностей. Для оптимального выравнивания двух последовательностей окно сравнения может
включать около 20% или менее вставок или делеций (то есть брешей), по сравнению со ссылочной последовательностью (которая не включает вставок или делеций). Оптимальное выравнивание последовательностей в окне сравнения может производиться с использованием компьютерных алгоритмов (GAP,
BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) или с помощью проверки и наилучшего выравнивания
(то есть приводящего к набольшей степени гомологии в пределах окна сравнения), проводимого любым
из подходящих методов. Можно также сослаться на семейство программ BLAST и привести в качестве
примера работу Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25: 3389. Детальное обсуждение анализа последовательностей можно найти в Разделе 19.3 работы Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15.
Взаимозаменяемые термины «идентичность последовательностей» или «идентичность» используются в изобретении для обозначения степени идентичности последовательностей при сравнении нуклеотидного состава или аминокислотного состава в пределах окна сравнения. Таким образом, «процент
идентичности последовательностей» рассчитывается при сравнении двух оптимально выравненных последовательностей в окне сравнения путем подсчета числа позиций, в которых находятся идентичные
азотистые основания (например, А, Т, С, G, I) или идентичные аминокислотные остатки (например, Ala,
Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys и Met) в обоих последовательностях, подсчета числа таких полных совпадений, деления числа совпадающих позиций на общее число позиций в окне сравнения (то есть на размер окна) и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В объеме настоящего изобретения «идентичность
последовательностей» будет пониматься как «процент совпадений», рассчитанный с помощью компьютерной программы DNASIS (Версия 2.5 для Windows; доступна от Hitachi Software engineering Co., Ltd.,
- 14 -
008669
South San Francisco, California, USA) с использованием стандартных установок по умолчанию, описанных в инструкции к программе.
Термины «запасающая клетка» и «запасающая ткань» обозначают клетки, ткани или органы, в которых во время сбора урожая накапливается органический углерод, который попадает в эти клетки с потоком веществ в форме, отличной от углекислого газа. В растениях к запасающим тканям относятся все
нефотосинтезирующие ткани, а также фотосинтезирующие ткани, которые суммарно накапливают органический углерод, связываемый другими фотосинтезирующими клетками, или получают его из окружающей среды или из внешней среды путем, отличным от прямой фиксации углекислого газа.
Термин «строгость» используется в изобретении для обозначения температурных условий, ионной
силы и присутствия или отсутствия определенных органических растворителей во время гибридизации.
Чем выше строгость условий, тем выше будет степень комплементарности между иммобилизованными
нуклеотидными последовательностями и меченой полинуклеотидной последовательностью.
Термином «строгие условия» обозначаются температурные условия и ионная сила, при которых будут гибридизоваться только нуклеотидные последовательности, имеющие высокое содержание комплементарных оснований. Требуемая строгость условий зависит от нуклеотидной последовательности и от
различных компонентов, присутствующих в среде во время гибридизации. Обычно строгие условия подбираются таким образом, чтобы температура была примерно на 10-20°С ниже, чем температура точки
плавления (Тп) для данной последовательности при определенной ионной силе и рН. Точкой Тп является
температура (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с комплементарным зондом.
Термин «сахара», «производные сахаров» используется в изобретении в своем самом широком значении и включает: моносахариды (альдозы и кетозы), включающие в себя вещества с общей формулой
(СН2О)n, где n = 3 или более; включая тетрозы (например, эритроза, треоза, эритрулоза), пентозы (например, рибоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза, рибулоза, ксилулоза), гексозы (например, аллоза, альтроза,
глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, талоза, псикоза, фруктоза, сорбоза, тагатоза) и более длинные
молекулы, такие как седогептулоза или манногептулоза; олигосахариды, образуемые при соединении
вместе нескольких моносахаридных звеньев посредством гликозидных связей; включая дисахариды (например, мальтоза, лактоза, гентибиоза, мелибиоза, трегалоза, софороза, примовероза, рутиноза, сахароза,
изомальтулоза, трегалулоза, тураноза, мальтулоза, левкроза) и более длинные олигомеры, такие как раффиноза, мелезитоза, бемесиоза или стахиоза; сахароспирты (например, эритрит, рибит, маннит, сорбит);
сахарные кислоты (например, глюконовая кислота, глюкаровая кислота, глюкуроновая кислота); аминосахара (например, глюкозамин, галактозамин); и другие варианты, такие как дезоксисахара, метилированные сахара, сахарофосфаты и УДФ-сахара, некоторые из которых могут превращаться в сахара или
другие производные сахаров, описанные выше, в результате метаболических превращений в растениях.
Термин «трансформация» обозначает изменение генотипа организма, например бактерии или растения, с помощью ведения чужеродной или эндогенной нуклеиновой кислоты. Под «трансформантом»
понимается организм, который был, таким образом, трансформирован.
Используемый в изобретении термин «трансгенный» обозначает генетически модифицированное
растение, эндогенный геном которого дополнен или модифицирован с помощью случайной или сайтнаправленной интеграции или путем стабильного поддержания в способной к репликации неинтегрированной форме введенного чужеродного или экзогенного гена или последовательности. Под «трансгеном»
понимается ген или последовательность, которая введена в растение.
Термин «вектор» обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулу ДНК, полученную, например, из плазмиды, бактериофага или вируса растения, в которую можно встроить или
клонировать последовательность нуклеиновой кислоты. Вектор предпочтительно содержит один или
более уникальных сайтов рестрикции и может быть способен к автономной репликации в определенных
клетках-хозяевах, включая клетку-мишень или ткань-мишень, или их прародительские клетки или ткани,
или может интегрироваться в геном определенного хозяина так, чтобы клонированная последовательность стала воспроизводимой. В соответствии с этим, вектор может представлять собой автономно реплицируемый вектор, то есть вектор, существующий в виде внехромосомной самостоятельной единицы,
репликация которой не зависит от репликации хромосомы, например линейную или замкнутую кольцевую плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может
содержать любые элементы, обеспечивающие саморепликацию. Альтернативно этому, вектор может
быть таким, который после введения в клетку интегрируется в геном клетки-реципиента и реплицируется
вместе с хромосомой (или хромосомами), в которую он встроился. Векторная система может включать
один вектор или плазмиду, два или более векторов или плазмид, которые вместе содержат суммарную
ДНК, которая должна быть введена в геном клетки-хозяина, или транспозон. Выбор вектора обычно зависит от совместимости вектора и клетки, в которую этот вектор должен быть введен. Вектор также может включать в себя селективный маркер, такой как ген устойчивости к антибиотику, который может
быть использован для отбора подходящих трансформантов. Примеры таких генов, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам, хорошо известны специалистам в данной области.
- 15 -
008669
2. Способ изменения общего содержания углеводов или сахаристости в растительной ткани
Настоящее изобретение основывается отчасти на открытии того факта, что экспрессия экзогенного
или чужеродного фермента, метаболизирующего сахар, такого как сахарозоизомераза, в растении (например, в сахарном тростнике) приводящая к превращению части содержащейся в клетке сазарозы в
изомальтулозу (чужеродный сахар, который в норме не производится растением), может приводить к
существенному увеличению общего содержания углеводов в запасающих сахарозу тканях растения. Не
желая быть ограниченным какой-либо одной частной теорией или механизмом действия, отметим, что
специфические изменения метаболизма, вовлекающие превращение сахара, который в норме ощущается
организмом, в новый сахар, который не воспринимается организмом эквивалентным образом, могут изменять метаболизм и приводить к накоплению более высоких концентраций углеводов. Авторы изобретения полагают, что такие специфические изменения на клеточном уровне могут изменять соотношение
производство-запасание на уровне целого растения, приводя к накоплению большего количества углеводов в запасающих тканях вследствие комбинированного воздействия на синтез в производящих тканях,
транспорт между производящими и запасающими тканями и превращение или хранение в запасающих
тканях.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает новые способы для изменения общего содержания углеводов или сахаристости запасающей ткани растения. Способы, как правило, включают
продуцирование в растении фермента, метаболизирующего сахар, который катализирует превращение
эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, который в норме не продуцируется растением на данной стадии развития. Преимущественно, фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется на таком
уровне или с такой функциональной активностью, что содержание углеводов или сахаристость запасающей ткани увеличивается по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения,
которое не продуцирует фермент. В некоторых воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется в растительных клетках посредством экспрессии полинуклеотида, который кодирует фермент.
В этих воплощениях растение является трансгенным растением, которое выбирается из множества
трансгенных растений, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид, кодирующий фермент,
функционально связанный с регуляторным элементом транскрипции. Трансгенное растение выбирается
на основе того, что оно продуцирует фермент, метаболизирующий сахар, на таком уровне или с такой
функциональной активностью, что общее содержание углеводов или содержание растворимых углеводов, или сахаристость запасающей ткани трансгенного растения увеличиваются по сравнению с этими
параметрами соответствующей запасающей ткани контрольного растения.
В некоторых воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных углеводов запасающей ткани увеличено в результате продукции в клетках растения фермента,
метаболизирующего сахар, на таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит
к частичному превращению эндогенного сахара в чужеродный сахар. В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар, имеет подходящий уровень активности в цитоплазме или же фермент распределен между цитоплазмой и другими клеточными компартментами, вовлеченными в запасание и/или
транспорт сахара. Увеличение в содержании растворимых углеводов или сахаристости запасающей ткани обычно достигается в этих воплощениях за счет менее чем около 30, 20 или 15%, и предпочтительно
менее чем около 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар.
Предпочтительно в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого снижения
содержания эндогенных сахаров или углеводов.
В других воплощениях общее содержание углеводов или сахаристость, или содержание эндогенных
углеводов запасающей ткани увеличено посредством адресования фермента, метаболизирующего сахар,
в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахара в растительной клетке (например, вакуоль или апоплазматическое пространство). В этих воплощениях фермент, метаболизирующий сахар,
присутствует в соответствующем субклеточном компартменте в таком количестве или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению значительного количества, которое составляет,
как правило, по меньшей мере около 20, 25 или 30%, но типично по меньшей мере около 40, 45, 50 или
55% и в большинстве случаев по меньшей мере около 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Желательно, чтобы значительное превращение сахара не происходило в тканях, в которых происходит деление клеток и/или рост клеток, обеспечивающие рост растения.
Предпочтительно, в этих воплощениях чужеродный сахар накапливается без соизмеримого уменьшения
содержания эндогенных сахаров или углеводов.
Таким образом, изменение общего содержания углеводов или сахаристости, или содержания эндогенных углеводов в запасающей ткани достигается посредством изменения уровня превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар. Это превращение может быть осуществлено во всех тканях растения, например, при использовании конститутивного промотора для осуществления экспрессии последовательности, кодирующей фермент, метаболизирующий сахар. Альтернативно, оно может быть осуществлено в производящих тканях, в транспортирующих тканях или в запасающих тканях при использовании
регулируемого тканеспецифичного или специфичного для определенной стадии развития промотора.
В некоторых воплощениях уровень превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар изменя- 16 -
008669
ется вследствие увеличения или снижения уровня экспрессии последовательности, кодирующей фермент, метаболизирующий сахар. Например, этого можно достигнуть на уровне транскрипции при использовании промоторов различной силы или индуцибельных промоторов, которые способны контролировать уровень транскриптов экспрессируемой кодирующей последовательности. Альтернативно, уровень экспрессии последовательности, кодирующей фермент, можно модулировать посредством изменения числа копий конструкции, включающей в себя кодирующую последовательность, на клетку и изменения элемента регуляции транскрипции, который функционально связан с ней и который является
функциональным в клетке. Альтернативно, может быть отобрано множество трансформантов и подвергнуто скринингу на подходящий уровень и/или специфичность трансгенной экспрессии, возникающей
под влиянием эндогенных последовательностей, расположенных вблизи сайта интеграции трансгена.
Подходящим уровнем и образцом экспрессии трансгена является такой, который приводит в результате к
существенному увеличению содержания растворимых углеводов или сахаристости тканей, предназначенных для использования. Это может быть определено простым тестированием трансформантов примерно на той стадии развития, на которой растение предназначено для сбора урожая, например, применяя способ, описанный в примере 9. В некоторых воплощениях уровень экспрессии кодирующей последовательности выбирается таким образом, чтобы он был по меньшей мере на примерно 10, 20, 30, 40, 50,
60, 70, 80 или 90%, или даже по меньшей мере на примерно 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или
1000% выше, или по меньшей мере на примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 97, 98 или
99%, или даже по меньшей мере на примерно 99,5, 99,9, 99,95, 99,99, 99,995 или 99,999% ниже, чем уровень экспрессии в контрольном растении.
В другом воплощении уровень экспрессии кодирующей последовательности может быть изменен
на посттранскрипционном уровне при использовании последовательностей, расположенных в транскрибируемом гене (цис-РНК последовательности) или при использовании независимо транскрибируемых
последовательностей (транс-РНК последовательности), которые влияют на процессинг или стабильность
мРНК, кодирующей фермент, метаболизирующий сахар. Например, цис-РНК последовательности могут
изменять вторичную структуру нетранслируемой лидерной последовательности или включать стартовые
кодоны, не попадающие в рамку считывания, или неоптимальный контекст стартового кодона, или редкий кодон для контроля скорости трансляции; они могут включать также последовательности с некоторым подобием сайтов сплайсинга интрона или сигналов полиаденилирования, что приводит к ошибкам в
процессинге РНК или уменьшает стабильность мРНК. Примеры транс-РНК последовательностей включают совместно экспрессируемые антисмысловые молекулы или рибозимы, которые препятствуют экспрессии или ингибируют ее. Альтернативно, молекулы РНК, включающие примерно 21-23 нуклеотида,
которые запускают расщепление специфической мРНК, которой они соответствуют, как описано, например Tuschl et al. in U.S. Patent Application No. 20020086356, могут быть использованы для запуска
механизма РНК-интерференции (РНКи) для модуляции экспрессии кодирующей фермент последовательности.
В другом воплощении уровень превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар изменяется
при использовании ферментов, метаболизирующих сахар, с разной функциональной активностью. Такое
изменение может являться следствием различий в специфических активностях или стабильности ферментов в клеточных компартментах, в которых завершается превращение сахара. В некоторых воплощениях активность фермента, метаболизирующего сахар, который используется для превращения эндогенного сахара в чужеродный сахар по меньшей мере примерно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%, или
даже по меньшей мере примерно на 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000% выше, или по
меньшей мере примерно на 10, 20, 30 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 97, 98 или 99%, или даже по меньшей мере примерно на 99,5, 99,9, 99,95, 99,99, 99,995 или 99,999% ниже, чем контрольного фермента.
Ферменты, метаболизирующие сахар с различными активностями, могут быть получены из природных
источников, либо с использованием синтетических или рекомбинантных методов, например, путем модификации каталитического сайта или какого-либо другого сайта (например, субстратсвязывающего сайта, кофакторсвязывающего сайта), соответствующего либо исходного фермента. Как правило, модификация достигается посредством замены, добавления, либо делении по меньшей мере одной аминокислоты в последовательности родительского фермента с использованием, например, подходящих или специально разработанных методов мутагенеза либо комбинаторной химии, которые хорошо известны специалистам в данной области. Различные метаболизирующие сахара ферменты могут включать в себя
консервативные аминокислотные замены. «Консервативные аминокислотные замены» - это такие замены, при которых аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь. Исследователями в данной области были охарактеризованы семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми группами (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми радикалами (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми группами
(например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми
цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковы- 17 -
008669
ми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный
остаток в родительском ферменте подходящим образом заменен другим аминокислотным остатком, относящимся к семейству с похожими боковыми цепями. Альтернативно, в другом воплощении настоящего изобретения мутации могут быть внесены случайно по всей длине, либо в определенный участок полинуклеотида, кодирующего соответствующий фермент, с использованием, например, насыщающего
мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут быть протестированны на ферментативную активность с целью идентификации мутантов, имеющих активность, отличную от активности родительского
фермента. Интересующие ферменты могут быть протестированы для сравнения активности, например, с
использованием способа, изложенного в примере 2, модифицированного посредством инкубации неочищенных либо очищенных препаратов фермента до и/или во время эксперимента в условиях, сходных с
условиями во внутриклеточным компартменте растительной клетки, где должны происходить превращения сахаров; это используется в качестве дополнительного теста на стабильность и специфическую активность фермента в данных условиях.
В другом воплощении настоящего изобретения уровень и локализация превращения эндогенного
сахара в чужеродный сахар модулируется с использованием метаболизирующего сахар фермента, направляемого в различные функциональные внутриклеточные компартменты. В иллюстративных примерах активность направлена в цитозоль, как в компартмент первичного метаболизма. Это может быть достигнуто посредством экспрессии ядерного гена, приводящего к синтезу внутри цитозоля формы фермента, не имеющей сигнальной последовательности, необходимой для транспорта в другие компартменты
клетки. В других иллюстративных примерах активность направлена в запасающий компартмент, такой
как вакуоль, либо в запасающий и транспортный компартмент, такой как внеклеточное пространство
(апоплазма), посредством включения в последовательность фермента сигнала, необходимого для транспорта фермента из цитозоля в нужный клеточный компартмент. Определенные сигнальные последовательности могут привести к распределению ферментативной активности между двумя и более клеточными компартментами (Small et al., 1998). Так, например, сигнал NTPP, описанный в примере 4 (SEQ ID
NO:7), с высокой эффективностью направляет белки в вакуоль сахарного тростника, в то время как сигнал СТРР, описанный в примере 5 (SEQ ID NO:8 плюс SEQ ID NO:9), может привести к распределению
белка в клетках сахарного тростника между цитозолем и секреторным путем (включающим вакуоль, систему внутренних мембран, и апоплазму) (Gnanasambandam and Birch 2004).
Другие факторы могут влиять на изменение содержания растворимых углеводов либо сахаристость
запасающих тканей, включая содержание доступного субстрата (то есть эндогенного сахара). Количество
субстрата, доступного метаболизирующему сахар ферменту может зависеть от видов растений, которые
использовались как объекты для модификаций (включая внутривидовые мутанты), типа ткани, в которой
происходит экспрессия, внутриклеточной локализации экспрессии и от стадии развития конкретного
растения. Стабильность введенного белка может также зависеть от количества субстрата. Тем не менее
считается, что любая оптимизация, которая окажется в данном случае необходимой, может быть легко
достигнута с применением рутинных методов, включая методы, описанные выше.
Эндогенные сахара, продуцируемые различными растениями, могут различаться и, таким образом,
эндогенный сахар одного растения может являться чужеродным для другого растения. Следовательно,
необходимо определить, какие сахара эндогенно продуцируются выбранным растением, чтобы таким
образом установить, какие сахара являются чужеродными для растения и какой тип метаболизирующего
сахар фермента(ов) может быть полезным для продуцирования чужеродного сахара в данном растении.
Типы сахаров, эндогенно продуцируемых растениями, могут быть определены с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Данные методы включают разделение сахаров
либо производных сахаров посредством электрофореза либо хроматографических методов (включая бумажную хроматографию, тонкослойную хроматографию, газовую хроматографию, газожидкостную
хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию). Разделенные компоненты, как
правило, идентифицируют путем сравнения профиля разделения со стандартами известных образцов
либо при помощи аналитических техник, таких как масс-спектрометрия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса. Например, отсылка может быть сделана к примеру 9, Robinson 1980, The Organic
Constituents of Higher Plants, Cordus Press, North Amherst, USA; Adams et al. 1999, Anal. Biochem. 266: 7784; Veronese and Perlot 1999, Enz. Microbial Tech. 24: 263-269; Hendrix and Salvucci 2001, J. Insect Physiol.
47: 423-432; Thompson et al. 2001, Carbohydrate Res. 331: 149-161; и к ссылкам, цитируемым в них.
Знание того, какие эндогенные сахара продуцирует растение, позволяет установить соответствующий метаболизирующий сахар фермент, который превращает один эндогенный сахар или более в чужеродный сахар, либо производное сахара. Например, метаболизирующий сахар фермент может катализировать реакцию, выбранную из реакций окисления, реакций восстановления, дегидрогеназных реакций,
реакций гидрогенирования, изомеризации, реакций присоединения, включающих, но не ограничивающихся ими, ацетилирование, карбоксилирование, глюкуронидирование, присоединение глицина, метилирование (О-, N-, или S-метилирование), фосфорилирование и присоединение сульфата, или реакций
гидролиза. Примеры ферментов, которые могут катализировать желаемые превращения, включают изомеразы, эпимеразы, мутазы, киназы, альдолазы, трансферазы, транскетолазы, фосфатазы, синтазы, кар- 18 -
008669
боксилазы, дегидрогеназы и гидролазы.
Эндогенные и чужеродные сахара подходящим образом выбираются из моносахаридов, олигосахаридов, сахароспиртов, сахарных кислот, аминосахаров и других вариантов, таких как дезоксисахара, метилированные сахара, и тому подобные. Примеры моносахаридов включают вещества с формулой
(СН2О)n, где n = 3 или более, но обычно менее чем 10; включая вещества, содержащие тетрозы (например, эритроза, треоза, эритрулоза), пентозы (например, рибоза, арабиноза, ксилоза, ликсоза, рибулоза,
ксилулоза), гексозы (например, аллоза, альтроза, глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, талоза, псикоза, фруктоза, сорбоза, тагатоза), и более длинные молекулы, такие как седогептулоза или манногептулоза. Олигосахариды, которые образуются посредством соединения с образованием гликозидных связей
вместе двух или большего числа моносахаридных звеньев, могут быть выбраны из дисахаридов (например, мальтоза, лактоза, гентиобиоза, мелибиоза, трегалоза, сефароза, примовероза, рутиноза, сахароза,
изомальтулоза, трегалулоза, тураноза, мальтулоза, леукроза) и более длинных олигемеров, таких как
раффиноза, мелезитоза, бемизиоза или стахиоза. Примеры сахароспиртов включают в себя, но не ограничиваются эритритом, рибитом, маннитом, сорбитом. Не ограничивающие примеры сахарных кислот
включают глюконовую кислоту, глюкаровую кислоту, глюкуроновую кислоту. Не ограничивающие
примеры аминосахаров включают в себя глюкозамин, галактозамин. Эндогенные или чужеродные сахара
также могут быть выбраны из других вариантов, таких как дезоксисахара и метилсахара, некоторые из
которых могут быть превращены в описанные выше производные сахаров в процессе функционирования
метаболизма растения. В определенных воплощениях настоящего изобретения чужеродный сахар представляет собой изомер эндогенного сахара. В одном из примеров настоящего воплощения эндогенным
сахаром является сахароза и метаболизирующим сахар ферментом является сахарозоизомераза, которая
посредством изомеризации превращает сахарозу в чужеродный сахар, выбираемый из изомальтулозы и
трегалулозы.
В соответствии с настоящим изобретением, частичное превращение эндогенного сахара в чужеродный сахар при помощи фермента, метаболизирующего сахар, увеличивает в растении общее содержание
углеводов или сахаристость растения или собираемой как урожай части растения, по сравнению с соответствующей тканью контрольного растения, которое не продуцирует фермент. Типичные углеводы
включают, но не ограничиваются, простыми сахарами, такими как глюкоза, фруктоза и сахароза, так же
как и определенные растворимые полимеры, и другие растворимые компоненты клетки. В одном воплощении способ позволяет получить запасающую ткань, имеющую повышенное содержание углерода в
виде растворимых углеводов - то есть увеличенную долю растворимых углеводов на единицу веса запасающей ткани по сравнению с измеренной в контрольных растительных клетках. Углеводы могут быть
измерены с использованием стандартных протоколов, хорошо известных специалистам в данной области.
3. Способ увеличения содержания желаемых метаболитов в организмах
Принципы и способы, детально разработанные в данном изобретении, для увеличения содержания
углеводов в растениях могут быть использованы для увеличения содержания углеводов в других организмах, в которых преобладают разные запасные углеводы, такие как трегалоза в грибах и гликоген у
животных. Эти приемы и способы могут также быть использованы для увеличения содержания в организме других классов желательных метаболитов, таких как липиды, аминокислоты и пептиды, или вторичные метаболиты. Специалистам в данной области будет понятно, что вариации методов увеличения
содержания углеводов в растениях, изложенных в деталях в данном изобретении в качестве примеров,
могут сделать возможным увеличение содержания в организме желаемых метаболитов других классов.
Соответственно, настоящее изобретение охватывает в широком смысле плане экспрессию в организме
введенных генов, приводящую к частичному превращению эндогенного вещества-субстрата, которое в
норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, что в результате изменяет метаболические потоки и приводит к аккумуляции в больших
количествах желаемых эндогенных веществ.
4. Конструкции нуклеиновых кислот
В некоторых воплощениях метаболизирующий сахар фермент продуцируется в клетках растения
посредством экспрессии чужеродного или экзогенного полинуклеотида, который кодирует фермент. Как
правило, чужеродный или экзогенный полинуклеотид является функционально связанным с регуляторным элементом транскрипции в конструкции нуклеиновой кислоты. Регуляторный элемент транскрипции обязательно включает промотор и необязательно цис-действующую последовательность, каждый из
которых компонентов является функциональным в клетках растения. Преимущественно конструкция
включает один или оба из следующих элементов: 3'-нетранслируемая область и маркерный ген.
4.1 Элементы контроля транскрипции
Последовательности промоторов, описываемых в настоящем изобретении, могут быть нативными
для трансформированного растения-хозяина или могут происходить из альтернативного источника, когда этот промотор является функциональным в растении-хозяине. Другие источники промоторов включают гены Т-ДНК Agrobacterium, это промоторы для биосинтеза нопалина, октапина, маннопина или
других опиновых промоторов, промоторы из растений, такой как промотор убиквентина; тканеспеци- 19 -
008669
фичные промоторы (см., например, U.S. Pat. No. 5459252 на имя Conkling et al.; WO 91/13992 на имя Advanced Technologies); а также промоторы из вирусов (включая специфичные для вируса-хозяина) или
частично или полностью синтетические промоторы. Многочисленные промоторы, которые являются
функциональными в одно- и двудольных растениях хорошо известны специалистам в данной области
(см., например, Greve, 1983, J. Mol. Appl. Genet. 1: 499-511; Salmon et al., 1984, EMBO J. 3: 141-146;
Garfinkel et al., 1983, Cell 27: 143-153; Barker et al., 1983, Plant Mol. Biol. 2: 235-350); включая различные
промоторы, изолированные из растений (такие как промотор Ubi из гена ubi-1 кукурузы, Christensen and
Quail, 1996) (см., например, U.S. Pat. No. 4,962,028) и вирусов (такие как промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S).
Последовательности промоторов могут включать цис-действующие последовательности, которые
регулируют транскрипцию, где регуляция вовлекает, например, химическую или физическую репрессию
или индукцию (например, регуляция основана на метаболитах, свете или других физико-химических
факторах; см., например, WO 93/06710, где обнаружен чувствительный к нематоде промотор), или регуляция основана на клеточной дифференциации (например, связанная с листьями, корнями, семенами или
тому подобным в растениях; см., например, U.S. Pat. No. 5459252, где обнаружен специфичный для корня промотор). Следовательно, участок промотора или регуляторная порция такого участка могут быть
получены из соответствующего гена, который регулируется таким образом. Например, ген 1,5рибулозобифосфат карбоксилазы является светоиндуцируемым и может быть использован для инициации транскрипции. Известны другие гены, которые индуцируются стрессом, температурой, повреждением, патогенными воздействиями и др.
Другие цис-действующие последовательности, которые могут быть использованы, включают энхансеры транскрипции и/или трансляции. Эти энхансерные области хорошо известны специалистам в
данной области и могут включать инициирующий кодон АТГ и примыкающие последовательности.
Инициирующий кодон должен попадать в рамку считывания кодирующей последовательности, соответствующей чужеродному или экзогенному полинуклеотиду, для обеспечения трансляции полноразмерной
последовательности. Сигналы, контролирующие трансляцию, и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, они могут быть как природными, так и синтетическими. Участки, обеспечивающие инициацию трансляции, могут происходить из источника участка инициации транскрипции или из
чужеродного или экзогенного полинуклеотида. Последовательность также может происходить из того же
источника, что и промотор, выбранный для осуществления транскрипции, и может быть специфически
модифицирована с целью увеличения эффективности трансляции мРНК.
Примеры энхансеров транскрипции включают, но ими не ограничиваются, элементы из промотора
CaMV 35S и генов октопинсинтазы как, например, описано в работе Last et al. (U.S. Patent No. 5290924,
которая включена в данное описание посредством отсылки). Предполагается, что использование энхансерного элемента, такого как ocs элемент, и в особенности многочисленных копий элемента, будет увеличивать уровень транскрипции с прилежащих промоторов, когда это касается трансформированных
растений. Альтернативно, omega последовательность, происходящая из гена белка оболочки вируса табачной мозаики (Gallie et al., 1987) может быть использована для увеличения эффективности трансляции
мРНК, транскрибируемой с полинуклеотида в соответствии с изобретением.
В некоторых воплощениях регуляторный элемент транскрипции представляет собой конститутивный промотор. Среди известных последовательностей, применяемых с целью обеспечения конститутивной экспрессии генов, есть регуляторные участки, связанные с генами Agrobacterium, такими как, например, гены, кодирующие нопалинсинтазу (Nos), маннопинсинтазу (Mas) или октопинсинтазу (Ocs), также
как и участки, кодирующие экспрессию вирусных генов, таких как участки 35S и 19S вируса мозаики
цветной капусты (CaMV). Термин конститутивный, который здесь используется, не обязательно указывает на то, что ген является экспрессируемым на одном и том же уровне во всех типах клеток, но что ген
экспрессируется в широком диапазоне типов клеток, хотя часто обнаруживаются некоторые вариации в
эффективности экспрессии.
В других воплощениях регуляторный элемент транскрипции является тканеспецифичным промотором. Например, при обеспечении экспрессии метаболизирующих сахара ферментов по разным причинам
может быть желательным ограничить экспрессии этих ферментов растительными клетками, которые
функционируют как запасники углерода. С этой целью можно идентифицировать подходящие участки
инициации транскрипции, которые обеспечат экспрессию предпочтительно в специфических типах тканей, таких как корни, клубни, семена или плоды. Эти последовательности могут быть идентифицированы, например, из библиотек кДНК, при использовании различных способов отбора, или могут быть выведены из последовательностей, описанных в литературе.
Известно много тканеспецифичных промоторных участков, таких как промотор малой субъединицы Rubisco, который предпочтительно экспрессируется в ткани листа, промотор пататина, который преимущественно экспрессируется в клубнях картофеля. Другие области инициации транскрипции, которые
предпочтительно обеспечивают транскрипцию в определенных тканях или при определенных условиях
роста, включают такие области из напина, АСР семян или листьев, зеина, и тому подобных. Также известны промоторы, специфичные для плодов, одним из таких промоторов является промотор Е8, опи- 20 -
008669
санный в работах Deikman et al., (1988., EMBO J. 2: 3315-3320) и DellaPenna et al. (1989, Plant Cell 1: 5363). В одном воплощении этого типа конструкция Е8 (специфичный для плодов промотор)сахарозоизомераза будет экспрессировать сахарозоизомеразу специфичным для плодов образом, где
уровни сахарозы, продуцируемой в плодах, могут быть увеличены. Альтернативно, могут быть использованы промоторы, которые избирательно экспрессируют кодирующие последовательности в запасающих сахарозу тканях (таких как зрелые стебли сахарного тростника и клубни сахарной свеклы). Например, промоторы, специфичные для зрелых стеблей сахарного тростника, описаны в секции 6 данного
изобретения и в международной публикации WO 01/18211.
Альтернативно, промотор является индуцибельным промотором, который способен контролировать
экспрессию полинуклеотида, кодирующего фермент, на соответствующей стадии развития растения. В
этом последнем из названных воплощений элементом регуляции транскрипции является, соответственно, связанный с развитием организма регулируемый промотор, координирующий время экспрессии.
Осуществляя регулирование во времени экспрессии сахар-метаболизирующих ферментов, полезно принимать во внимание изменение концентрации сахара, которое имеет место в процессе развития растения.
Значение сахара внутри ткани может также изменяться во времени и в этой связи в процессе развития
концентрации сахарозы в запасающей ткани могут изменяться. Например, концентрация сахарозы в определенных плодах, таких как сладкие дыни, изменяется в процессе созревания плодов. Сахара-гексозы
накапливаются на ранних стадиях развития, за этим следует накопление высоких уровней сахарозы на
более поздних стадиях (Schaffer et al., 1987, Phytochemistry 26: 1883-1887). В развивающемся эндосперме
кукурузы концентрация сахарозы увеличивается с 8 по 12 день после опыления и затем падает более чем
в десять раз до 28 дней после опыления (Tsai et al., 1970, Plant Phys. 46: 299-306). Кроме того, концентрация сахарозы в семенах сои значительно изменяется в процессе развития, так, например, содержание
раффинозных сахаридов разительно увеличивается спустя 53 дня после цветения (Amuti, 1977, Phytochemistry 16: 529-532). В семенах гороха содержание сахарозы драматически падает в процессе развития
(Holl and Vose, Can. 1980, J. Plant Sci. 60: 1109-1114). Эти примеры иллюстрируют желательность выбора
промотора для регулируемой во времени специфической экспрессии гена фермента для получения нужного результата с учетом изменяющихся пулов сахарозы.
4.2 3'-Нетранслируемая область
Конструкция нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может включать 3'-нетранслируемую
последовательность. 3'-Нетранслируемая последовательность является той порцией гена, включающей
сегмент ДНК, которая содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы,
способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию гена. Сигнал полиаденилирования характеризуется тем, что он обеспечивает присоединение тяжа полиадениловой кислоты к 3'-концу предшественника
мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно узнаются по наличию гомологии с канонической формой
5'-ААТААА-3', хотя нередко встречаются вариации.
3'-Нетранслируемая регуляторная последовательность ДНК обычно включает от примерно 50 до
1000 пар нуклеотидов и может содержать растительные последовательности, терминирующие транскрипцию и трансляцию, в дополнение к сигналу полиаденилирования и любым другим регуляторным
сигналам, способным воздействовать на процессинг мРНК или экспрессию гена. Примеры пригодных 3'нетранслируемых последовательностей включают 3'-транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования из гена нопалинсинтазы (nos) Agrobacterium tumefaciens (Bevan et
al., 1983, Nucl. Acid Res., 11: 369) и терминатор для Т7 транскрипта из гена октопинсинтазы Agrobacterium tumefaciens. Альтернативно, пригодные 3'-нетранслируемые последовательности могут происходить
из растительных генов, как например, 3'-конец генов ингибитора протеазы I или II из картофеля или томата, генов запасного белка сои и гена гороха Е9, кодирующего малую субъединицу рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы (ssRUBISCO), хотя также могут быть использованы другие 3'-элементы, известные специалистам в данной области. Альтернативно, 3'-нетранслируемые регуляторные последовательности могут быть получены de novo, как, например, описано в работе An (1987, Methods in Enzymology,
153: 292), которая включена в данное описание путем отсылки.
4.3 Дополнительные последовательности
Так как последовательность ДНК, встроенная между сайтом инициации транскрипции и сайтом
старта кодирующей последовательности, то есть нетранслируемая лидерная последовательность, может
влиять на экспрессию гена, можно также использовать особую лидерную последовательность. Подходящими лидерными последовательностями являются такие, которые включают последовательности, способные управлять оптимальной экспрессией чужеродной или эндогенной последовательности ДНК. Например, такие лидерные последовательности включают предпочтительную консенсусную последовательность, которая может увеличивать или поддерживать стабильность мРНК и предотвращать несоответствующую инициацию трансляции, как, например, описано в работе Joshi (1987, Nucl. Acid Res., 15:
6643). Однако другие лидерные последовательности, например лидерная последовательность RTBV,
имеют высокоупорядоченную вторичную структуру, которая, как ожидается, понижает стабильность
мРНК и/или снижает уровень трансляции мРНК. Таким образом, лидерные последовательности (i) которые не имеют высокоупорядоченной вторичной структуры, (ii) которые имеют высокоупорядоченную
- 21 -
008669
вторичную структуру и вторичная структура не понижает стабильность мРНК и/или не уменьшает эффективность трансляции, или (iii) которые происходят из генов, которые эффективно экспрессируются в
растениях, будут более предпочтительными.
Регуляторные элементы, такие как интрон сахарозосинтазы, могут быть также использованы как,
например, описано в работе Vasil et al. (1989, Plant Physiol, 91: 5175), интрон Adh I, как, например, описано в работе Callis et al. (1987, Genes Develop., II), или элемент omega TMV как, например, описано в
работе Gallie et. al. (1989, The Plant Cell, 1: 301), где это желательно. Специалистам в данной области известны другие такие регуляторные элементы, пригодные при осуществлении данного изобретения.
Дополнительно, для адресования фермента, кодируемого чужеродным или экзогенным полинуклеотидом, во внутриклеточный компартмент внутри растительных клеток или во внеклеточную среду могут
быть применены адресующие последовательности. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность транзитного или сигнального пептида может быть функционально
слита с последовательностью, которая кодирует выбранный фермент данного изобретения таким образом, что после трансляции транзитный или сигнальный пептид может транспортировать фермент в определенный внутриклеточный или внеклеточный компартмент, а затем может быть факультативно посттрансляционно удален. Транзитные или сигнальные пептиды действуют, облегчая транспорт белков через внутриклеточные мембраны, например эндоплазматического ретикулума, вакуолей, везикул, пластид, митохондриальные мембраны и мембраны плазмалеммы. Например, адресующая последовательность может направлять желаемый белок в определенную органеллу, такую как вакуоль или пластида
(например, хлоропласт), предпочтительнее, чем в цитозоль. Таким образом, конструкция нуклеиновой
кислоты настоящего изобретения может дополнительно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей транзитный пептид пластид, функционально связанный с промоторной областью и
чужеродным или экзогенным полинуклеотидом. Например, можно сослаться на работы Heijne et al.
(1989, Eur. J. Biochem., 180: 535) и Keegstra et al. (1989, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 40:471).
В некоторых воплощениях сахароза (то есть эндогенный сахар), хранящаяся в клетках запасающей
ткани, превращается в изомальтулозу и/или трегалулозу (то есть чужеродный сахар) в результате введения гена бактерий с промотором, специфичным для запасающей ткани, и регуляторной последовательностью, обеспечивающей цитозольную локализацию сахарозоизомеразы. В этих воплощениях авторы изобретения выбирают цитозоль для экспрессии гена сахарозоизомеразы, поскольку он является ключевым
компартментом клетки, вовлеченным в многочисленные процессы промежуточного метаболизма и в поток множества метаболитов. В других воплощениях они выбирают вакуоль как место локализации сахарозоизомеразной активности, поскольку она является первичным запасающим компартментом для сахаров в таких растениях, как сахарный тростник. В еще других воплощениях авторы выбирают распределение активности сахарозоизомеразы между компартментами для достижения максимального эффекта в
общей аккумуляции сахаров. В других воплощениях продукт экспрессии гена может быть направлен в
другие клеточные компартменты, такие как вакуоли, лизосомы, пероксисомы, пластиды, митохондрии,
эндоплазматический ретикулум, ядра или внеклеточное пространство, как подходит для представляющих интерес исследователей метаболических путей.
Конструкция нуклеиновой кислоты данного изобретения может быть введена в вектор, такой как
плазмида. Плазмидные вектора, например, сконструированные на основе таких векторов, как pUC, pSK,
pGEM, pSP или pBS, включают дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты, которые
обеспечивают облегчение селекции, амплификации и трансформации экспрессионной кассеты в прокариотические и эукариотические клетки. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот
включают ориджины репликации для обеспечения автономной репликации вектора, гены селектируемых
маркеров, предпочтительно кодирующие гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотику или гербициду, уникальные множественные сайты для клонирования, что обеспечивает множество сайтов для
встраивания последовательностей нуклеиновых кислот или генов, закодированных в конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые увеличивают эффективность трансформации прокариотических и эукариотических (особенно растительных) клеток.
Вектор предпочтительно содержит один или более элементов, обеспечивающих либо интеграцию
вектора в геном клетки-хозяина, либо автономную репликацию вектора в клетке, независимо от клеточного генома. Вектор может интегрироваться в геном клетки-хозяина после его введения в клеткухозяина. Интеграция вектора может зависеть от имеющейся в нем чужеродной или экзогенной полинуклеотидной последовательности или от любых других элементов вектора, которые обеспечивают его стабильную интеграцию в геном за счет гомологичной рекомбинации. Альтернативно этому, вектор может
содержать дополнительные последовательности нуклеиновой кислоты, обеспечивающие направленную
гомологичную рекомбинацию вектора в геном клетки-хозяина. Дополнительные последовательности
нуклеиновой кислоты обеспечивают интеграцию вектора в геном клетки-хозяина в строго определенное
место в хромосоме. Чтобы увеличить вероятность встраивания в геном клетки-хозяина в строго определенное место, интеграционные элементы должны предпочтительно содержать достаточное количество
нуклеиновых кислот, такое как от 100 до 1500 пар оснований, предпочтительно от 400 до 1500 пар оснований, и наиболее предпочтительно от 800 до 1500 пар оснований, которые имеют высокую степень го- 22 -
008669
мологии с соответствующей последовательностью-мишенью для увеличения вероятности гомологичной
рекомбинации. В качестве интеграционных элементов могут выступать любые последовательности, которые гомологичны последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Более того, интеграционными
элементами могут быть как некодирующие, так и кодирующие последовательности нуклеиновой кислоты.
Для целей клонирования и субклонирования вектор может также включать в себя ориджин репликации, что обеспечивает вектору возможность автономно реплицироваться в клетке-хозяине, такой как
бактериальная клетка. Примерами бактериальных ориджинов репликации являются ориджины репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, обеспечивающие репликацию в Е. coli, и pUB110,
pE194, рТА1060 и pAMβ31, обеспечивающие репликацию в Bacillus. Ориджин репликации может также
содержать определенную мутацию, которая делает ее функционирование в клетках Bacillus температурно-чувствительным (см., например, Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433),
4.4 Маркерные гены
Для облегчения идентификации трансформантов, в конструкцию нуклеиновой кислоты включается
желаемый селектируемый или пригодный для скрининга маркерный ген, или в дополнение к этому чужеродный или экзогенный полинуклеотид. Конкретный выбор маркера принципиально не важен, если он
является функциональным (то есть, селектируемым) в интересующих растительных клетках. Маркерный
ген и чужеродный или экзогенный полинуклеотид не обязательно должны быть слиты, поскольку совместная трансформация неслитыми генами также эффективна при трансформации растений, как, например,
это описано в U.S. Pat. No. 4399216.
Определяемые терминами «селектируемые» или «пригодные для скрининга» маркерные гены - это
гены, кодирующие «секретируемый маркер», секреция которого может детектироваться для идентификации или отбора трансформированных клеток. Примеры включают маркеры, которые кодируют секретируемый антиген, идентифицируемый по взаимодействию с соответствующими антителами, или секретируемые ферменты, детектируемые по их каталитической активности. Секретируемые белки включают,
но ими не ограничиваются, белки, которые встраиваются в клеточную стенку или захватываются клеточной стенкой (например, белки, имеющие лидерную последовательность, такую как обнаруженная в экспрессируемой единице белка экстензина или PR-S табака); небольшие способные к диффузии белки, которые можно детектировать, например, с помощью ELISA, и небольшие активные ферменты, активность
которых определяется во внеклеточном растворе (например, α-амилаза, β-лактамаза, фосфинотрицинацетилтрансфераза).
4.4.1 Селектируемые маркеры
Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются гены dal из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis, или маркеры, которые обеспечивают устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин, канамицин, эритромицин, хлорамфеникол или тетрациклин. Типичными селектируемыми маркерами для отбора растительных траснформантов являются, но ими не ограничиваются, ген hyg, который
обеспечивает устойчивость к гигромицину В, ген неомицинфосфотрансферазы (nео), придающий устойчивость к канамицину, паромомицину, G418 и подобным соединениям, описанным, например, в работе
Potrykus et al. (1985, Mol. Gen. Genet. 199: 183); ген глутатион-S-трансферазы из печени крысы, придающий устойчивость к обладающим гербицидной активностью производным глутатиона, как, например,
описано в ЕР-A 256 223; ген глутаминсинтетазы, обеспечивающий при суперэкспрессии устойчивость к
ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, как, например, описано в WO87/05327, ген
ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, придающий устойчивость к селективному агенту
фосфинотрицину, как, например, описано в ЕР-А 275957, ген, кодирующий 5-енолшикимат-3фосфатсинтазу (EPSPS), придающий устойчивость к N-фосфонометилглицину, как, например, описано в
работе Hinchee et al. (1988, Biotech, 6: 915), ген bar, придающий устойчивость к биалафосу, как, например, описано в WO91/02071; ген нитрилазы, например ген bхn из Klebsiella ozaenae, который придает
устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al., 1988, Science, 242: 419); ген дигидрофолатредуктазы
(DHFR), придающий устойчивость к метотрексату (Thillet et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 12500); мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), который придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ингибирующим ALS соединениям (ЕР-А-154204); мутантный ген антранилатсинтазы, который придает устойчивость к 5-метилтриптофану; или ген далапондегалогеназы, который придает устойчивость к гербициду.
4.4.2 Маркеры, пригодные для скрининга
Предпочтительные маркеры, пригодные для скрининга, включают, но ими не ограничиваются, ген
uidA, кодирующий фермент Р-глюкуронидазу (GUS), для которого известны многочисленные хромогенные субстраты; ген β-галактозидазы, кодирующий фермент, для которого известны хромогенные субстраты; ген экворина (Prasher et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. Comm., 126: 1259), который может использоваться для детекции кальций-чувствительной биолюминесценции; ген зеленого флуоресцентного
белка (Niedz et al., 1995 Plant Cell Reports, 14: 403); ген люциферазы (luc) (Ow et al., 1986, Science, 234:
856), который позволяет проводить биолюминесцентную детекцию; ген β-лактамазы (Sutcliffe, 1978,
- 23 -
008669
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737), кодирующий фермент, для которого известны многочисленные хромогенные субстраты (например, PADAC, хромогенный цефалоспорин); ген R-локуса, кодирующий продукт, который регулирует образование антоциановых пигментов (красная окраска) в тканях растений
(Dellaporta el al., 1988, in Chromosome Structure and Function, pp. 263-282); ген а-амилазы (Ikuta et al.,
1990, Biotech, 8:241); ген тирозиназы (Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol, 129:2703), который кодирует
фермент, способный окислять тирозин до допа и допахинона, который в свою очередь конденсируется с
образованием легко детектируемого вещества меланина; или ген xylE (Zukowsky et al., 1983, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80: 1101), который кодирует катехиндиоксигеназу, способную превращать хромогенные
катехины.
5. Введение конструкции нуклеиновой кислоты в клетки растений
Для введения молекул нуклеиновой кислоты в растительную клетку-хозяина доступны многочисленные методы. Существует много методов трансформации растительных клеток, хорошо известных
специалистам в данной области, и постоянно предлагаются новые методы. Практический выбор способа
трансформации будет определяться его эффективностью при трансформации конкретных видов растений, а также опытом и предпочтениями того специалиста, который будет использовать настоящее изобретение в соответствии с определенной выбранной методологией. Опытному специалисту должно быть
очевидно, что конкретный выбор способа трансформации для введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетки растения не является принципиальным или ограничивающим данное изобретение; он должен
обеспечивать приемлемый уровень переноса нуклеиновой кислоты. Практические рекомендации для
применения систем для трансформации с целью усовершенствования растений изложены в Birch (1997,
Аnnu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48: 297-326).
В принципе, как двудольные, так и однодольные растения, подходящие для трансформации, могут
быть модифицированы с помощью введения конструкции нуклеиновой кислоты в соответствии с данным
изобретением в клетку-реципиент и выращивания нового растения, которое несет в себе и экспрессирует
полинуклеотид в соответствии с данным изобретением.
Введение и экспрессию чужеродных или экзогенных полинуклеотидов в двудольных (широколиственных) растениях, таких как табак, картофель или люцерна можно произвести, как было показано, с
использованием Т-ДНК индуцирующей опухоли (Ti) плазмиды из Agrobacterium tumefaciens (см., например, Umbeck, U.S. Patent No. 5004863, и международную заявку PCT/US93/02480). Конструкция из данного изобретения может быть введена в клетку растения с использованием A. tumefaciens, содержащей Ti
плазмиду. При использовании культуры A. tumefaciens в качестве средства для трансформации, наиболее
выгодным является использование неонкогенного штамма Agrobacterium в качестве переносчика вектора, чтобы была возможной нормальная неонкогенная дифференцировка трансформируемых тканей.
Предпочтительно, чтобы Agrobacterium содержала бинарную систему плазмиды Ti.
Такая бинарная система включает в себя (1) первую Ti плазмиду, имеющую участок вирулентности,
необходимый для интродукции транспортной ДНК (Т-ДНК) в растения, и (2) химерную плазмиду. Химерная плазмида содержит в себе по меньшей мере один пограничный участок Т-ДНК плазмиды Ti дикого типа, фланкирующий нуклеиновую кислоту, которая должна быть перенесена. Было показано, что
системы бинарных Ti плазмид являются эффективными для трансформации растительных клеток, как,
например, описано в работах De Framond (1983, Biotechnology, 1:262) и Hoekema et al. (1983, Nature,
303:179). Такие бинарные системы являются предпочтительными inter alia, поскольку они не требуют
интеграции в Ti плазмиду Agrobacterium.
Методы с использованием Agrobacterium включают, но ими не ограничиваются:
(а) совместное выращивание Agrobacterium с культурой изолированных протопластов;
(б) трансформацию растительных клеток или тканей Agrobacterium; или
(в) трансформацию семян, верхушечных точек или меристем Agrobacterium.
Рис и кукуруза, относящиеся к однодольным, как было показано, также восприимчивы к трансформации Agrobacterium. Однако многие другие культурные однодольные растения, включая овес, сорго,
просо и рожь, пока не удалось успешно трансформировать с использованием Agrobacterium. Тем не менее Ti плазмида может в будущем использоваться в качестве вектора для работы с этими однодольными
растениями. Кроме того, используя Ti плазмиду в качестве модельной системы, возможно удастся искусственно создать вектор для трансформации этих растений. Плазмида Ti может также быть интродуцирована в однодольные растения искусственными методами, такими как микроинъекция или слияние протопластов однодольного растения и сферопластов бактерии, содержащей Т-участок, который затем может
быть интегрирован в ядерную ДНК растения.
Кроме того, перенос гена может быть осуществлен с помощью in situ трансформации
Agrobacterium, как описано Bechtold et al. (1993, C.R. Acad. Sci. Paris, 316: 1194). Этот подход основывается на вакуумной инфильтрации суспензии клеток Agrobacterium.
Альтернативно этому, химерная конструкция может быть введена с использованием в качестве векторов индуцирующих корни (Ri) плазмид Agrobacterium.
Вирус мозаики цветной капусты (CaMV) может также использоваться в качестве вектора для интродукции экзогенных нуклеиновых кислот в клетки растений (U.S. Pat. No. 4407956). ДНК генома
- 24 -
008669
CaMV включается в родительскую бактериальную плазмиду, при этом создается рекомбинантная молекула ДНК, которая может размножаться в бактерии. После клонирования рекомбинантная плазмида снова может быть клонирована и в дальнейшем модифицирована путем введения в нее желаемой последовательности нуклеиновой кислоты. Модифицированная вирусная часть рекомбинантной плазмиды затем
вырезается из родительской бактериальной плазмиды и используется для введения в растительные клетки или в растения.
Конструкция нуклеиновой кислоты может также вводиться в растительные клетки способом электропорации, как, например, описано Fromm et al. (1985, Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A, 82: 5824) и Shimamoto et al. (1989, Nature 338: 274-276). При использовании этой техники растительные протопласты подвергают электропорации в присутствии векторов или нуклеиновых кислот, содержащих необходимые
последовательности нуклеиновых кислот. Электрические импульсы с высокой напряженностью поля
делают мембраны обратимо проницаемыми, обеспечивая проникновение нуклеиновых кислот. Подвергнутые электропорации протопласты растений восстанавливают клеточную стенку, делятся и формируют
каллюс.
Другим методом введения конструкции нуклеиновой кислоты в клетку растения является высокоскоростное баллистическое обстреливание мелкими частицами (известное также как бомбардировка частицами или бомбардировка микроснарядами) с предназначенными для введения нуклеиновыми кислотами, которые введены внутрь матрицы или закреплены на поверхности таких микробусинок или частиц,
как, например, описано Klein et al. (1987, Nature 327: 70). Хотя обычно требуется введение в клетку только одной последовательности нуклеиновой кислоты, данный метод, в частности, предусматривает множественное введение.
Альтернативно этому, конструкция нуклеиновой кислоты может быть введена в растительную
клетку контактным способом с использованием механических или химических методов. Например, нуклеиновая кислота может быть механически перенесена непосредственно в растительную клетку посредством микроинъекции с использованием микропипетки. Альтернативно этому, нуклеиновая кислота может быть внесена в растительную клетку с использованием полиэтиленгликоля, который образует с генетическим материалом преципитирующий комплекс, захватываемый клеткой.
В настоящее время известно много разных методов для трансформации однодольных растений.
Чаще всего такими методами трансформации однодольных являются бомбардировка микрочастицами
эксплантов или суспензии клеток, перенос генов с использованием Agrobacterium и прямое поглощение
ДНК или электропорация, как, например, описано Shimamoto et al. (1989, supra). Трансгенные растения
кукурузы были получены посредством введения bar гена Streptomyces hygroscopicus в зародышевые
клетки кукурузы, культивируемые в суспензии, с помощью бомбардировки микрочастицами (GordonKamm, 1990, Plant Cell, 2: 603-618). О введении генетического материала в алейроновые протопласты
других однодольных злаков, таких как пшеница и ячмень, сообщалось в литературе (Lee, 1989, Plant Mol.
Biol. 13: 21-30). Растения пшеницы регенерировали из эмбриогенных суспензионных культур посредством отбора достигших определенного возраста компактных и имеющих почковидную форму эмбриогенных каллюсных тканей для установления эмбриогенных суспензионных культур (Vasil, 1990,
Bio/Technol. 8: 429-434). Комбинация с системами трансформации для этих зерновых делает возможным
применение данного изобретения для однодольных растений. Эти методы также могут использоваться
для трансформации и регенерации двудольных растений. Трансгенные растения сахарного тростника
были регенерированы из эмбриогенного каллюса, как, например, описано Bower et al. (1996, Molecular
Breeding 2: 239-249).
Альтернативно этому, можно использовать комбинацию разных подходов для усиления эффективности процесса трансформации, например бомбардировку микрочастицами, покрытыми Agrobacterium
(EP-A-486234), или бомбардировку микроснарядами для нанесения ран с последующим совместным
культивированием с Agrobacteriun (EP-A-486233).
Предпочтительными растениями для настоящего изобретения являются виды, выращиваемые или
собираемые для получения ценных веществ, включая растворимые углеводы, которые используются,
например, как продукты питания, корма, для ферментативной переработки или в качестве промышленного сырья и для других целей. Примеры таких видов включают содержащие сахар культуры, такие как
сахарный тростник, сахарная свекла, сладкое сорго и цикорий; плоды, такие как виноград, цитрусовые,
семечковые плоды, косточковые плоды и орехи; овощи, выращиваемые для использования листьев,
стеблей, корней, клубней, плодов, стручков или семян; а также кормовые травы.
6. Промоторные последовательности настоящего изобретения
Настоящее изобретение также обеспечивает промоторную последовательность для стебельспецифичной экспрессии химерных и гетерологичных генов в растениях, главным образом в однодольных растениях, и более предпочтительно в травянистых однодольных растениях, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:10. Эта промоторная последовательность также называется в изобретении промотором Р67В. Настоящее изобретение также включает в себя биологически активные части последовательности SEQ ID NO:10 и варианты полинуклеотидной последовательности.
Специалисты в данной области должны понимать, что биологически активная часть или фрагмент про- 25 -
008669
моторной последовательности, слитые с определенным геном и введенные в клетку растения, обеспечивают экспрессию гена на уровне, который выше уровня экспрессии в отсутствие такого фрагмента. Согласно настоящему изобретению в промотор могут быть включены один или более биологически активных участков, например один или более мотивов могут быть соединены в «минимальный» промотор.
Такие мотивы могут придавать промотору Р67В такие функции промотора, как способность к увеличенной эффективности в стеблях однодольных растений и особенно травянистых однодольных растений,
иллюстративные примеры которых включают сахарный тростник, рис, пшеницу, сорго, ячмень, рожь,
кукурузу и тому подобное.
Активность промотора может быть определена методами, хорошо известными специалистам. Например, уровень активности промотора поддается количественной оценке по определению количества
мРНК, синтезируемой при транскрипции с данного промотора или по количеству белкового продукта,
образуемого при трансляции мРНК, синтезируемой при транскрипции с данного промотора. Количество
специфической мРНК, присутствующей в системе экспрессии, может быть определено, например, с использованием специфических олигонуклеотидов, способных гибридизоваться с данной мРНК, которые
помечены, или могут использоваться для специфической реакции амплификации, такой как ПЦР. Использование репортерного гена облегчает определение активности промотора в результате продукции
определенного белка. Методы измерения активности промотора, которыми набор возможных методов не
ограничивается, раскрыты в работах Medberry et al. (1992, Plant Cell 4: 185; 1993, The Plant J. 3: 619),
Sambrook et al. (1989, supra) и McPherson et al. (U.S. Patent No. 5164316).
Настоящее изобретение также включает варианты промотора, которые, по существу, комплементарны ссылочному промотору настоящего изобретения. В целом, эти варианты промотора будут включать участки, которые демонстрируют по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности со ссылочной полинуклеотидной последовательностью идентичного размера (в пределах «окна сравнения») или при сравнении выровненных последовательностей, когда выравнивание производится с помощью компьютерных программ для определения степени гомологии, известных специалистам в данной области. Подходящие варианты могут выбираться с использованием стандартных методов. Например, полинуклеотиды, соответствующие SEQ ID NO:10, могут быть подвергнуты случайному мутагенезу (например, транспозонному мутагенезу), олигонуклеотид-опосредованному
(или сайт-направленному) мутагенезу, ПЦР-мутагенезу и кассетному мутагенезу предварительно подготовленного варианта или безвариантной версии изолированного природного промотора настоящего изобретения с применением стандартных процедур, известных специалистам в данной области. Альтернативно этому, варианты промоторной последовательности могут быть получены в соответствии со следующим способом:
(а) получение экстракта нуклеиновой кислоты из подходящего организма, который предпочтительно относится к однодольным, и предпочтительно к травянистым однодольным, таким как сахарный тростник;
(б) конструирование праймеров, фланкирующих по меньшей мере часть последовательности ссылочного промотора настоящего изобретения; и
(в) с использованием праймеров для амплификации, посредством метода амплификации нуклеиновой кислоты получение по меньшей мере одного продукта амплификации из экстракта нуклеиновой кислоты, где продукт амплификации соответствует варианту промотора настоящего изобретения.
Подходящими методами для амплификации нуклеиновой кислоты являются хорошо известные
специалистам методы, которые включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), как, например, описано в Ausubel et al. (supra); амплификацию с вытеснением цепи (strand displacement amplification (SDA)),
как, например, описано в U.S. Patent No 5422252; репликацию по типу катящегося кольца (rolling circle
replication (RCR)), как, например, описано в Liu et al, (1996, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594 и International application WO 92/01813) и Lizardi et al. (International Application WO 97/19193); амплификацию на
основе последовательности нуклеиновой кислоты (nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)),
как, например, описано Sooknanan et al. (1994, Biotechniques 17: 1077-1080); и амплификацию с репликазой Q-β (Q-β replicase amplification), как, например, описано Tyagi et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93: 5395-5400).
7. Использование промотора настоящего изобретения
Последовательность изолированного промотора настоящего изобретения может использоваться, inter alia, для обеспечения экспрессии чужеродной или эндогенной последовательности ДНК. Чужеродная
или эндогенная последовательность ДНК может включать участок, транскрибируемый в молекулу РНК,
которая модулирует экспрессию соответствующего гена-мишени. Такая модуляция экспрессии может
достигаться, например, с использованием антисмысловой технологии, рибозимной технологии и косуппрессии или зависимого от гомологии сайлесинга гена, что хорошо известно специалистам в данной
области. В соответствии с этим, транскрипт может включать в себя антисмысловую молекулу РНК, или
рибозим, или другой транскрипт (такой как инвертированные повторы и дцРНК, как, например, сказано
ниже) с целью понижающей регуляции экспрессии соответствующего гена-мишени.
Таким образом, в некоторых воплощениях транскриптом является антисмысловая молекула РНК,
- 26 -
008669
которая непосредственно блокирует трансляцию мРНК, транскрибируемой с гена-мишени, за счет связывания с этой мРНК и предотвращения трансляции белка. Там, где это применимо, антисмысловые РНК
должны иметь в длину по меньшей мере около 10-20 нуклеотидов или более, и быть по меньшей мере на
75% комплементарными их генам-мишеням или транскриптам генов, так чтобы предотвращать экспрессию гомологичных последовательностей-мишеней.
В других воплощениях транскрипт представляет собой рибозим, функция которого заключается в
ингибировании трансляции мРНК гена-мишени. Рибозимы - это обладающие энзиматической активностью молекулы РНК, способные катализировать специфическое расщепление мРНК. Механизм действия
рибозимов включает последовательность-специфичную гибридизацию молекулы рибозима с комплементарной РНК-мишенью с последующим эндонуклеолитическим расщеплением. В объем настоящего изобретения входят сконструированные молекулы рибозимов, содержащие мотивы, имеющие форму молотка, которые специфически и эффективно катализируют эндонуклеолитическое расщепление последовательностей РНК генов-мишеней. Участки специфического расщепления рибозимами в потенциальной
молекуле-мишени РНК могут быть заранее найдены с помощью сканирования молекулы-мишени для
поиска сайтов расщепления рибозимами, которые включают последовательности GUA, GUU и GUC. В
случае идентификации такого сайта могут быть сконструированы короткие последовательности РНК
размером от 15 до 20 рибонуклеотидов, соответствующие участку гена-мишени, содержащему такой
сайт расщепления, для предсказания особенностей их структуры, например вторичной структуры, которые могут сделать олигонуклеотидную последовательность неподходящей. В случае использования подходящие рибозимы могут быть подобраны из группы, состоящей из имеющих форму молотка рибозимов,
имеющих форму топора рибозимов, саттелитных рибозимов тритона, рибозимов из Tetrahymena и РНКазы Р, и далее сконструированы с помощью известных специалистам в данной области методов на основании конкретной последовательности гена-мишени (например, см. U.S. Pat. № 5741679). Пригодность
предполагаемых мишеней может быть также проверена по их доступности для гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами при проведении экспериментов, предусматривающих защиту от рибонуклеаз.
В других воплощениях транскриптом является молекула РНК, которая обеспечивает интерференцию РНК (РНКи) гена-мишени или транскрипта гена. РНКи обозначает взаимодействие с продуктом или
разрушение продукта гена-мишени за счет введения одноцепочечной, или обычно двухцепочечной РНК
(дцРНК), которая гомологична транскрипту гена-мишени. Таким образом, в некоторых воплощениях
дцРНК per se и особенно дцРНК-производящие конструкции, соответствующие по меньшей мере части
гена-мишени, могут использоваться для уменьшения уровня и/или функциональной активности его продукта. Опосредованное РНКи ингибирование экспрессии гена может быть достигнуто с использованием
любого метода, известного специалистам, например, путем трансфекции конструкцией нуклеиновой кислоты, кодирующей структуру РНК стебель-петля или шпилька, в геном клетки-хозяина, или путем экспрессии конструкции трансфицированной нуклеиновой кислоты, гомологичной гену-мишени, между
конвергентными промоторами, или за счет дупликации «голова к голове» или «хвост к хвосту» позади
единственного промотора. Любая подобная конструкция может быть использована, если она обеспечивает получение одиночной РНК, способной замыкаться сама на себя и формировать дцРНК, или если она
обеспечивает получение двух отдельных транскриптов РНК, которые отжигаются и образуют дцРНК,
гомологичную гену-мишени.
Из литературы известно, что для РНКи не требуется абсолютной гомологии, нижний порог гомологии составляет около 85% для дцРНК длиной около 200 пар оснований (Plasterk and Ketting, 2000, Current
Opinion in Genetics and Dev. 10: 562-67). Таким образом, в зависимости от длины дцРНК, РНКикодирующие нуклеиновые кислоты могут варьировать по своему уровню гомологии с транскриптом гена-мишени, то есть дцРНК длиной от 100 до 200 пар оснований должна иметь по меньшей мере около
85% гомологии с геном-мишенью, а более длинные дцРНК, то есть длиной от 300 до 400 пар оснований
должны иметь по меньшей мере около 75% гомологии с геном-мишенью. РНК-кодирующие конструкции, которые экспрессируют одиночный РНК-транскрипт, предназначенный для отжига с отдельно экспрессируемой РНК, или одиночные конструкции, экспрессирующие отдельные транскрипты с конвергентных промоторов, предпочтительно имеют в длину по меньшей мере около 100 нуклеотидов. РНКкодирующие конструкции, которые экспрессируют одиночную РНК, сконструированную для формирования дцРНК за счет внутреннего фолдинга, предпочтительно имеют в длину по меньшей мере около 200
нуклеотидов.
Промотором, используемым для экспрессии конструкции, формирующей дцРНК, может быть промотор любого типа, если образующаяся дцРНК является специфичной по отношению к продукту гена,
предназначенному для разрушения, в данной линии клеток. Альтернативно этому, промотор может быть
специфичен к определенной линии клеток, если он экспрессируется в этой линии на определенной стадии развития. Может оказаться выгодным, если наблюдается некоторое перекрывание в гомологии с геном, который экспрессируется в линии клеток, не являющихся мишенью. Промотор также может индуцироваться посредством контролируемых внешних факторов, или за счет эндогенных вызываемых
внешней средой факторов.
- 27 -
008669
В другом воплощении изобретения для обеспечения РНКи могут использоваться молекулы РНК
длиной от примерно 21 до примерно 23 нуклеотидов, которые обеспечивают расщепление специфической мРНК, которой они соответствуют, как, например, описано Tuschl et al. в U.S. Patent Application No.
20020086356. Такие 21-23-нуклеотидные молекулы РНК могут содержать 3'-гидроксильную группу, могут быть одноцепочечными или двухцепочечными (как две 21-23-нуклеотидные РНК), причем молекулы
дцРНК могут иметь тупые концы или содержать выступающие концы (например, 5', 3').
В других своих воплощениях чужеродная или эндогенная последовательность ДНК кодирует: детектируемый или измеряемый продукт, например р-глюкуронидазу или люциферазу; селектируемый
продукт, например неомицинфосфотрансферазу (nptII), обеспечивающую устойчивость к аминогликозидным антибиотикам, таким как Geneticin® или паромомицин; продукт, обеспечивающий устойчивость
к гербицидам, например устойчивость к глифосату или устойчивость к глюфосинату; продукт, изменяющий биосинтез или модификацию крахмала, например крахмал-ветвящий фермент, крахмалсинтазу,
АДФ-глюкозопирофосфорилазу; продукт, участвующий в биосинтезе жирных кислот, например десатуразу или гидроксилазу; продукт, придающий устойчивость к насекомым, например кристаллический
белковый токсин из Bacillus thuringiensis; продукт, обеспечивающий устойчивость к вирусам, например
белок оболочки вируса; продукт, обеспечивающий устойчивость к грибам, например хитиназу, β-1,3глюканазу или фитоалексины; продукт, изменяющий метаболизм сахарозы, например инвертазу или сахарозосинтазу; ген, кодирующий ценные фармацевтические вещества, например антибиотики, вторичные метаболиты, фармацевтические пептиды или вакцины.
Последовательность чужеродной или эндогенной ДНК включает, но не ограничивается, ДНК из генов растений и генов нерастительных организмов, таких как бактерии, дрожжи, животные или вирусы.
Более того, в объем настоящего изобретения включается выделение последовательности чужеродной или
эндогенной ДНК из данного генотипа растения, последующее введение размноженных копий этой последовательности в тот же самый генотип, например, для усиления производства продукта определенного гена. Вводимая ДНК может содержать модифицированные гены, части генов, химерные гены, включая гены из того же или другого растительного генотипа.
К показательным агрономическим свойствам, кодируемым чужеродной или эндогенной последовательностью ДНК, относятся, но ими не ограничиваются, свойства, желательные для производителей растительной продукции, такие как устойчивость к недостатку воды, устойчивость или невосприимчивость
к вредителям, устойчивость или невосприимчивость к гербицидам, устойчивость или невосприимчивость
к болезням (например, устойчивость к вирусным или грибным патогенам), невосприимчивость к стрессу
(повышенная устойчивость к засолению) и повышенное содержание полезных веществ или повышенная
урожайность; свойства, желательные для потребителей сельскохозяйственной продукции, получаемой из
растений, такие как повышенное содержание питательных веществ в продуктах питания человека или
кормах животных, или преимущества в производстве пищевых продуктов, такие как улучшенная перерабатываемость. При таком применении трансгенные растения, содержащие промотор данного изобретения, как правило, выращиваются для использования их семян, плодов или других частей растений, включая стебли, оболочки, вегетативные части и тому подобное в качестве продуктов питания человека или
кормов животных, включая их использование для силосования кормов для животных или в декоративных целях. Часто химические компоненты зерновых культур экстрагируются для использования в качестве продуктов питания или для промышленного использования, поэтому могут быть созданы трансгенные растения, имеющие повышенное или измененное содержание таких компонентов.
Изолированная последовательность промотора данного изобретения может также найти применение в коммерческом производстве белков или других веществ, если интересующее вещество экстрагируется или очищается из частей растения, семян и тому подобное. Такие белки и другие вещества включают, но ими не ограничиваются, иммуногенные молекулы для использования в качестве вакцин, цитокины и гормоны.
Можно также культивировать клетки или ткани из растений, выращивая их in vitro, или проводить
ферментацию для получения нужных веществ.
Трансгенные растения, содержащие изолированную последовательность промотора из настоящего
изобретения, могут также использоваться для целей промышленного разведения, или могут скрещиваться с сельскохозяйственными растениями близких видов. Улучшенные свойства, закодированные в чужеродной или эндогенной последовательности ДНК, могут быть перенесены, например, из клеток одних
видов растений в клетки друтих видов растений, например, путем слияния протопластов.
Трансгенные растения, содержащие изолированную последовательность промотора из настоящего
изобретения, могут также использоваться в различных целях в исследовательской работе или в разведении, включая создание новых мутантных растений посредством инсерционного мутагенеза, чтобы выявить желательные мутантные формы, которые в будущем могут быть получены путем традиционного
мутагенеза и отбора. Примером такого использования может быть введение рекомбинантной последовательности ДНК, кодирующей мобильный элемент, который может использоваться для создания генетических вариаций, или введения уникальной «идентификационной последовательности-подписи», или
других маркерных последовательностей, которые могут использоваться для идентификации являющихся
- 28 -
008669
собственностью линий или разновидностей.
8. Получение и характеристика дифференцированных трансгенных растений
8.1 Регенерация
Способы, используемые для регенерации трансформированных клеток в дифференцированные растения, не являются принципиальными для данного изобретения, поэтому может использоваться любой
из способов, подходящих для растения-мишени. Обычно после процесса трансформации клетки растения
регенерируют для получения целого растения.
Регенерация растения из протопластов варьирует от вида к виду растения, но обычно вначале получают суспензию протопластов. Для некоторых видов можно вслед за этим индуцировать образование
зародыша из суспензии протопластов, вплоть до стадии созревания и прорастания, как у настоящего зародыша. Культуральная среда обычно содержит различные аминокислоты и гормоны, необходимые для
роста и регенерации. Примеры используемых гормонов включают ауксины и цитокинины. Иногда предпочтительным является введение в среду глутаминовой кислоты и пролина, особенно для таких видов,
как кукуруза и люцерна. Эффективность регенерации будет зависеть от состава среды, генотипа, и от
предыстории культуры. Если контролировать эти составляющие, регенерация является воспроизводимой. Регенерация также осуществляется из каллюса эксплантов, органов или частей растения. Трансформацию можно проводить в контексте регенерации органа или части растения, как, например, описано
в Methods in Enzymology, Vol. 118 и Klee et al. (1987, Annual Review of Plant Physiology, 38: 467); данные
работы включаются в изобретение путем отсылки. При использовании метода трансформациирегенерации листового диска, предложенного Horsch et al. (1985, Science, 227: 1229, включается в изобретение путем отсылки), диски культивируются на селективной среде, после чего в течение примерно 24 недель появляются ростки. Развивающиеся ростки вырезаются из каллюсов и помещаются на подходящую селективную среду, стимулирующую образование корней. Укорененные растеньица после появления корней как можно быстрее переносятся в почву. По мере необходимости растения пересаживают
до достижения ими зрелости.
У вегетативно размножающихся культур взрослые трансгенные растения размножают с помощью
черенкования или с использованием техники культуры ткани для получения множества идентичных растений. После этого производят отбор желаемых трансформантов, получают новые разновидности и вегетативно размножают их для коммерческого использования.
У культур, размножающихся семенами, взрослые трансгенные растения могут подвергать самоопылению для получения инбредных гомозиготных растений. Инбредное растение дает семена, содержащие новый интродуцированный ген или гены. Из этих семян выращивают растения, которые будут
обладать определенным фенотипом, например рано зацветать.
Части, получаемые из регенерированных растений, такие как цветы, семена, листья, ветки, плоды и
тому подобное, входят в состав настоящего изобретения, при условии, что они включают клетки, которые трансформированы описанным способом. Потомство, варианты и мутанты регенерированных растений также включаются в объем изобретения, при условии, что эти части также включают в себя введенные последовательности нуклеиновой кислоты.
Необходимо учитывать, что в литературе постоянно появляется множество описаний новых методов для регенерации все новых видов растений. Поэтому любой специалист в данной области может подобрать в литературе подходящий для его конкретных целей метод, не тратя времени на чрезмерное экспериментирование.
Характеристика
Для того чтобы подтвердить присутствие в регенерированном растении чужеродного или экзогенного полинуклеотида, может быть использовано много разных методов. Такие методы включают, например, «молекулярно-биологические» анализы, хорошо известные специалистам, такие как Саузерн- и нозерн-блоттинг и ПЦР; методы для определения активности ферментов, метаболизирующих сахара; а
также иммунологические методы, позволяющие определить наличие или количество экспрессированного
фермента. После того, как наличие интересующего фермента в растении подтверждено, растение выращивается. Необходимо вырастить два и более поколений, чтобы с уверенностью подтвердить, что определенная фенотипическая характеристика растения является устойчивой и передается по наследству.
Для идентификации желаемых фенотипических характеристик, трансгенные растения, которые содержат и экспрессируют данный фермент, метаболизирующий сахар, сравниваются с контрольными растениями. Соответственно, трансгенные растения отбираются с помощью измерения активности фермента
в выбранных запасающих тканях, например в тканях клубней, плодов и/или корней. Активность фермента, метаболизирующего сахар, может периодически измеряться на разных стадиях роста и старения и
сравниваться с таковой в контрольных растениях. Растения или части растений, имеющие повышенный
или пониженный уровень активности фермента по сравнению с контролем, обираются на одной или нескольких стадиях развития. Активность может сравниваться по одному или нескольким параметрам,
включая тип фермента, тип контрольного элемента транскрипции, тип инициации трансляции, тип участка терминации, число копий трансгена, инсерцию и расположение трансгена.
При определении фенотипических характеристик, связанных с ферментативной активностью,
- 29 -
008669
трансгенные и контрольные растения желательно выращивать в камере для выращивания, теплице, камере без крыши и/или в полевых условиях. Идентификация определенной фенотипической характеристики и сравнение с контролем основывается на рутинном статистическом анализе и подсчете. Статистические различия между линиями растений могут определяться путем сравнения в линиях растений активности фермента, метаболизирующего сахар, в каждой ткани, экспрессирующей фермент. Экспрессия
и активность сравниваются с параметрами роста, развития и урожайности, которые включают морфологию частей растения, цвет, число, размеры, сухой и сырой вес, созревание, соотношение биомасс надземной и подземной частей, время наступления, скорости и длительность разных стадий роста и старения, включая вегетативный рост, плодоношение, цветение, содержание растворимых углеводов, включая
сахарозу, глюкозу, фруктозу, уровни крахмала и уровни других эндогенных сахаров, а также уровни чужеродных сахаров. Для идентификации трансгенных растений, имеющих другие характеристики, растения могут тестироваться на их фотосинтетическую и метаболическую активность, а также на синтез конечных продуктов. Например, материал, выделенный из таких клеток и частей трансгенного растения,
как клубни, плоды или корни, анализируется на содержание таких конечных продуктов, как крахмал,
сахароза, глюкоза, фруктоза, сахароспирты, а также другие эндогенные и чужеродные сахара с помощью
стандартных методик. Сахаристость, основанная на содержании сахаров, в частности фруктозы и сахарозы, также может быть измерена. У некоторых растений для получения фенотипического эффекта может
потребоваться изменение условий роста. Например, кислород, углекислый газ и свет могут контролироваться и измеряться в специальной открытой газовой камере, и распределение углерода может измеряться с помощью использования меченого С14 углекислого газа или других субстратов метаболизма. Включение углерода также может измеряться в экстрактах из плодов, листьях и/или корней с помощью хроматографии или по методу Брикса с помощью сахарного рефрактометра. Эти характеристики можно сравнивать для разных линий в разных условиях роста, меняя в камере параметры газообмена, количество и
качество света, температуру, субстрат или влажность.
9. Получение продуктов ферментации
Растворимые углеводы, подуцируемые трансгенными растениями из настоящего изобретения, будут включать сбраживаемые углеводы, которые затем могут использоваться в качестве промышленного
сырья для ферментации с целью производства спирта и спирт-содержащих напитков, и других продуктов
ферментации, таких как продукты питания, пищевые добавки, ферменты и материалы для промышленности. Методы ферментации с использованием растительных углеводов в качестве промышленного сырья, предназначенные для получения различных конечных продуктов сбраживания, хорошо известны
специалистам в данной области (см., например, Vogel et al. 1996, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, Process Design, and Equipment, Noyes Publications, Park Ridge, N.J., USA и цитированные там ссылки). В одном из воплощений изобретения растворимые углеводы могут экстрагироваться путем выжимания из растения или посредством диффузии из тканей растения в воду или другой
подходящий растворитель. Получаемый сок или экстракт, содержащий растворимые углеводы, может
прямо использоваться как субстрат для ферментации или биопревращения в периодическом непрерывном процессе или процессе с использованием иммобилизованных клеток. Альтернативно этому, часть
растворимых углеводов может извлекаться для других целей, а неизвлеченные компоненты могут использоваться как промышленное сырье для ферментации, как это имеет место в случае патоки после извлечения большей части сахарозы путем кристаллизации.
Для лучшего понимания данного изобретения и его быстрого внедрения в практику, его некоторые
предпочтительные воплощения будут описаны ниже в виде примеров, которыми изобретение не ограничивается.
Примеры
Пример 1. Экспрессия трех генов сахарозоизомеразы (SI) в E.coli
Последовательности генов сахарозоизомеразы UQErw (Erwinia rhapontici), UQ14S и UQ68J описаны
в работе Бирч и By (Birch and Wu (2002)). Для субклонирования трех генов сахарозоизомеразы (SI) в вектор для экспрессии рЕТ 24b (Novagen) были сконструированы три пары праймеров. При использовании
полимеразной цепной реакции были удалены некодирующие области и лидерные последовательности и
был введен искусственный стартовый кодон.
Каждый прямой праймер 1) включает в себя стартовый кодон, 2) создает подобный существующему в растениях контекст для начала трансляции, 3) включает сайт рестрикции ВаmHI для облегчения
клонирования и совпадения открытой рамки считывания гена. Каждый обратный праймер включает сайт
рестрикции КрnI и стоп-кодон.
Последовательности праймеров представлены ниже в табл. 1.
- 30 -
008669
Таблица 1
Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали функционирующую с высокой
точностью ДНК-полимеразу pfu (Stratagene). Продукты полимеразной цепной реакции прямо клонировали в вектор pCR® 2.1, используя набор для клонирования ТОРО™ТА Cloning® Kit (Invitrogen). Три гена
сахарозоизомеразы, встроенные в pCR®2.1, вырезали из данных векторов и клонировали в вектор
pGEM®-3Zf(+), а затем в вектор рЕТ 24b (Novagen) для осуществления экспрессии в штамме Е.coli
BL21(DE3).
Пример 2. Эффективность превращения сахарозы в изомальтулозу сахарозоизомеразами, экспрессируемыми в Е.coli
Пятнадцать культур клеток BL21(DE3) на одну плазмидную конструкцию с геном SI (из примера 1)
были выращены в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина. Клетки росли при 37°С при перемешивании со скоростью 225 об./мин. От шести до десяти культур на конструкцию, выросших до значения оптической плотности культуры OD600 1,000 ± 0,005, были отобраны для последующей индукции.
После того, как из каждой культуры было отобрано 0,5 мл, в культуру добавляли IPTG до конечной концентрации 1,0 мМ. Культуры продолжали инкубировать еще 3 ч. В дальнейшем для количественного
определения эффективности превращения сахарозы в изомальтулозу отбирали индуцированные культуры только с величиной ОD600 1,750 ± 0,005, учитывая анализ трех повторов культур на конструкцию.
Аликвоты каждой культуры объемом 1,0 мл центрифугировали, затем осадок ресуспендировали в
0,4 мл 50% раствора сахарозы, забуференного 35,8 мМ цитратом Na и 128,4 мМ фосфатом Na (pH 6,0).
Суспензию инкубировали при 37°С в течение 48 ч при перемешивании со скоростью 225 об./мин. Был
проведен количественный анализ реакции образования изомальтулозы при помощи СЕ анализа, как описано ниже (примеры 12 и 13). Эффективность превращения, выраженную как соотношение изомальтулоза/(изомальтулоза + сахароза) х 100, рассчитывали из площади пика сахарозы и площади пика изомальтулозы, нормализованных по стандартам с известной концентрацией, используя компьютерные программы Beckman P/ACE 5000 Series СЕ System.
Пример 3. ДНК-конструкция для экспрессии адресуемых в цитозоль генов SI, находящихся под
контролем промотора Ubi (pU3ZErw, pU3Z14S или pU3Z68J)
При конструировании был использован промотор Ubi из гена ubi-1 кукурузы (Christensen and Quail,
1996, Transgen. Res. 5, 213-218). Для экспрессии гена в цитоплазме клеток сахарного тростника вставки
различных SI генов из векторов рЕТ 24b (пример 1) далее клонировали между Ubi промотором и участком полиаденилирования Agrobacterium nos (Bevan et al., 1983, Nature 304, 184-187) в плазмидный вектор
pU3Z с целью конструирования плазмид pU3ZErw, pU3Z14S или pU3Z68J.
Пример 4. ДНК-конструкция, включающая лидерный пептид, адресующий в эндоплазматический
ретикулум (ER), адресующий в вакуоли сигнал-N-концевой пропетид (NTPP), и ген UQ68J SI, несущий
или не несущий метку 6xHis, находящаяся под контролем промотора Ubi (pU3ZERsN68J или
pU3ZERsN68J-His)
Получение вектора
Вектор с промотором Ubi, лидерным пептидом спорамина, включающим 21 аминокислоту, адресующим в эндоплазматический ретикулум, адресующим в вакуоли сигнальным пептидом NTPP спорамина, включающим 16 аминокислот, репортерным геном MGUS и участком полиаденилирования Agrobacterium nos (Gnanasambandam & Birch, 2004) частично переваривали эндонуклеазами рестрикции NcoI
и SacI, и результирующий фрагмент, включающий каркас вектора с промотором Ubi, ER лидерным пептидом и NTPP, очищали гель-электрофорезом.
Получение вставки методом ПЦР
Прямой праймер, имеющий на 5'-конце сайт рестрикции BglII (gta gat ctC GCA ACG AAT ATA
CAA AAG TCC G), обратный праймер, имеющий на 5'-конце сайт рестрикции SacI (aag agc TCA GTT
CAG CTT ATA GAT CCC), и обратный праймер с 6-тью остатками гистидина и находящимся на 5'-конце
сайтом рестрикции SacI (aag agc TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTT CAG CTT ATA GAT CCC)
были сконструированы для амплификации гена UQ68J SI без лидерной последовательности, адресующей
в периплазму. Ген UQ68J SI, встроенный в вектор рЕТ24b, использовали как ДНК-матрицу. Для проведения полимеразной цепной реакции использовали работающую с высокой точностью Pfu ДНКполимеразу (Stratagene), прямой праймер и один из обратных праймеров. Продукты полимеразной цепной реакции прямо клонировали в вектор pCR®2.1, используя набор для клонирования ТОРО™ТА Clon- 31 -
008669
ing® Kit (Invitrogen). Вставку вырезали из вектора pCR®2.1 по BglII и SacI сайтам рестрикции и очищали
при помощи гель-электрофореза.
Получение линкера
Прямой одноцепочечный олигонуклеотид (GAT Ggt cga aac tcc agt а) и обратный одноцепочечный
олигонуклеотид (са gct ttg agg tca tCA TG) были сконструированы для получения линкера с липкими
концами Ncol и BglII. Смесь из 5 мкл раствора каждого олигонуклеотида с концентрацией 500 мкМ нагревали при 95°С в течение 5 мин, затем охлаждали до комнатной температуры в течение 3 ч.
Лигирование и трансформация
Вектор, вставку и линкер лигировали и переносили в компетентные клетки Е.coli Тор 10
(Invitrogen).
Пример 5. ДНК-конструкция, включающая лидерный пептид ER, ген UQ68J SI и С-концевой сигнальный пропептид (СТРР), несущая или не несущая метку 6xHis, находящаяся под контролем промотора Ubi (pU3ZERc68JC или pU3ZERc68JC-His)
Получение вставки - гена UQ68J SI с находящимся на-конце СТРР
Прямой праймер с сайтом рестрикции BglII (gta gat ctC GCA ACG AAT ATA CAA AAG TCC G),
обратный праймер, включающий 21 нуклеотид, кодирующий 7 аминокислот (GLLVDTM) адресующего в
вакуоль сигнала с сайтом рестрикции SacI (g agc TCA CAT AGT АТС GAC TAA GAG ACC GTT CAG
CTT ATA GAT CC), и обратный праймер, кодирующий GLLVDTM с His-меткой, с сайтом рестрикции
SacI (g agc TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CAT AGT АТС GAC TAA GAG ACC GTT CAG CTT
ATA GAT CC) были сконструированы для амплификации UQ68J SI гена без периплазматической лидерной последовательности. Ген UQ68J SI, встроенный в вектор рЕТ24b, использовали как ДНК-матрицу.
Для проведения полимеразной цепной реакции использовали функционирующую с высокой точностью
ДНК-полимеразу Pfu (Stratagene), прямой праймер и один из обратных праймеров. Продукты полимеразной цепной реакции прямо клонировали в вектор pCR®2.1, используя набор для клонирования ТОРО™ТА Cloning® Kit (Invitrogen). Вставку вырезали из вектора pCR®2.1 по BgRlII сайту и по SacI сайту и
очищали гель-электрофорезом.
Лидерный пептид, адресующий в эндоплазматический ретикулум, полученный с помощью результата
полимеразной цепной реакции и встроенный в pSE420 для получения промежуточного вектора
В соответствии с последовательностью ДНК лидерного пептида ER хитиназы табака были сконструированы прямой праймер с сайтом рестрикции BатHI (aag gat ссА ATG AGG CTT TGA ААА) и обратный праймер с сайтом рестрикции BglII (aaa gat ctC GCC GAG GCA GAA AGC AG). Для амплификации
ДНК, кодирующей лидерную ER последовательность, включающую 23 аминокислоты, использовали
высоко точную Pfu ДНК-полимеразу (Stratagene) и в качестве матрицы - pER-RGUS-CTPP (Gnanasambandam & Birch, 2004). Продукты полимеразной цепной реакции очищали, осаждая этанолом, переваривали ВатHI и BglII, обрабатывали щелочной фосфатазой из кишечника теленка и очищали электрофорезом в 1,5% агарозном геле. Продукт лидировали, встраивая в вектор pSE420 (Invitrogen) по ВаmHI и BglII
сайтам, и запланированную ориентацию вставки подтверждали секвенированием ДНК. Полученную
плазмиду далее переваривали BglII и SacI, и самый большой фрагмент использовали как промежуточный
продукт для встраивания гена UQ68J SI.
Лигирование UQ68JSIc СТРР в промежуточный вектор pSE420-ER и трансформация
Ген 68J SI, несущий на конце СТРР, лигировали в промежуточный вектор, по ходу транскрипции от
ER лидерного пептида. Продукты лигирования переносили в компетентные клетки Тор 10 (Invitrogen).
Полученную плазмиду переваривали ферментами рестрикции ВатHI и SacI и вставку отделяли для лигирования.
Получение вектора pU3Z с промотором Ubi и участком полиаденилирования Agrobacterium nos
Вектор pU3Z68J (пример 3) переваривали, используя эндонуклеазы рестрикции ВаmHI и SacI.
Фрагмент, включающий каркас вектора с промотором Ubi и участком полиаденилирования Agrobacterium nos отделяли далее для лигирования.
Лигирование вставки, включающей фрагменты, кодирующие ER лидерную последовательность,
UQ68J SI и СТРР, в pU3Z вектор и трансформация
Фрагмент ER-68J-CTPP из промежуточного вектора встраивали в pU3Z вектор между ВатHI и SacI
сайтами. Продукты лигирования переносили в компетентные клетки Тор 10.
Пример 6. ДНК-конструкция, включающая лидерный пептид ER, вакуолярный адресующий сигнал
NTPP, ген UQ68J SI и СТРР сигнал, находящаяся под контролем промотора Ubi (pU3ZERsN68JC)
Получение вектора
Плазмидную конструкцию pU3ZERsN68J, полученную, как описано в примере 4, переваривали
BglII и SacI. Фрагмент, содержащий каркас вектора, лидер ER, NTPP и участок полиаденилирования
Agrobacterium nos, отделяли для лигирования.
Получение вставки
Плазмидную конструкцию pU3ZERc68JC, полученную, как описано в примере 5, переваривали
BglII и SacI. Фрагмент, содержащий ген UQ68J SI, несущий на конце СТРР, использовали для лигирования.
- 32 -
008669
Лигирование и трансформация
Упомянутые выше фрагменты вектора и вставки, лигировали и переносили в компетентные клетки
Тор 10.
Пример 7. Клонирование промотора 67В, специфичного для стебля сахарного тростника
Исходя из последовательности ДНК промотора Р67, специфичного для стебля сахарного тростника
(Birch & Potier, 2000), были сконструированы прямой праймер (tgg agc tcg atg gga ggt gct cg) с сайтом
рестрикции SacI и обратный праймер (atg gat cct gta cta gtt atg gca gct ас) с сайтом рестрикции ВатHI,
предназначенные для амплификации потенциальных гомологов промотора при использовании геномной
ДНК из культивара Q117 сахарного тростника в качестве матрицы. Суммарную геномную ДНК выделяли из молодых листьев Q117 согласно By с сотр. (Wu et al. 2000, Plant Journal, 22: 495-502) с некоторыми
модификациями. Кратко, 2 г листьев растирали в жидком азоте. Замороженный порошок суспендировали
в 14 мл буфера для экстракции (1,4М NaCl, 20 мМ EDTA, 0,1 М Tris-HCl, рН 8,0, 3% СТАВ и 1% 2меркаптоэтанол) при 65°С в течение 30 мин. Затем добавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), перемешивали, далее центрифугировали 10 мин при 10000 х g и температуре 4°С. Водную фазу смешивали с равным объемом изопропанола и осаждали ДНК центрифугированием при 15000 х g в течение 15 мин при 4°С. Осадок промывали 70% этанолом, быстро сушили для
удаления остатков этанола и растворяли в ТЕ буфере. Продукты, полученные в результате трех независимых амплификаций с использованием высоко точной ДНК-полимеразы Pfu (Stratagene) прямо клонировали в вектор pCR®2.1, используя набор the TOPO™TA Cloning® Kit (Invitrogen). Плазмидные ДНК из
15 трансформированных колоний бактерий выделяли и секвенировали. Результаты секвенирования показали, что 5 из 15 колоний имели идентичную последовательность, которая отличается от последовательности Р67, изолированной Birch & Potier (2000). Последовательность, изолированная Birch & Potier
(2000), обозначена здесь как промотор 67А. Последовательность, дополнительно представленная здесь,
обозначена как промотор 67В.
Пример 8. ДНК-конструкция с репортерным геном GUS под контролем промотора 67В (p67BGUS)
Плазмида pCR®2.1, несущая вставку (приготовлена, как описано в примере 7), была рестрицирована
ВаmHI и SacI для выделения промотора 67В, который использовали для замены промотора 67А в плазмиде p67AGUS (Birch & Potier, 2000).
Пример 9. ДНК-конструкция с геном UQ68J SI, находящимся под контролем промотора 67В
(p67B68J)
Получение вставки
Ген UQ68J SI вырезали по ВаmHI и Крn I сайтам из промежуточной плазмиды pCR® 2.1, описанной
в примере 1, и использовали для лигирования.
Получение вектора с промотором 67В, множественным сайтом для клонирования и участком полиаденилирования Agrobacterium nos
(i) Промотор 67В из примера 7 встраивали по ВаmHI и SacI сайтам в вектор pSE420 (Invitrogen), затем вырезали последовательность между ВаmHI и HindIII сайтами и использовали ее для лигирования.
(ii) Участок полиаденилирования Agrobacterium nos вырезали из вектора pBI101(Clontech) по Sacl и
EcoRI сайтам и встраивали по тем же сайтам в вектор pGEM®3Zf(+). (iii) Последовательность Р67В из (i)
была встроена по сайтам ВаmHI и HindIII в промежуточный вектор из (ii). Результирующий вектор - с
каркасом pGEM®3Zf(+), промотором 67В, множественным сайтом для клонирования и участком полиаденилирования Agrobacterium nos - расщепляли рестриктазами ВаmHI и КрnI и использовали для лигирования.
Лигирование и трансформация
Ген UQ68J SI лигировали между промотором 67В и участком полиаденилирования в промежуточный вектор для получения p67B68J, который переносили в компетентные клетки Тор 10.
Пример 10. ДНК-конструкция с геном UQ68J SI, находящимся под контролем промотора 67А
(p67A68J)
Получение промотора 67А методом ПЦР
Использовали те же прямой праймер и обратный праймер, что и для клонирования промотора 67В в
примере 7. Промотор 67А в составе p67AGUS (Birch & Potier, 2000) использовали как ДНК-матрицу. Для
проведения реакции ПЦР использовали высоко точную Pfu ДНК-полимеразу (Stratagene). Продукты полимеразной цепной реакции прямо клонировали в вектор pCR®2.1, используя набор ТОРО™ТА Cloning®
Kit (Invitrogen). Промотор 67А вырезали из вектора pCR®2.1 по сайтам BamHI и SacI и использовали для
лигирования.
Получение каркаса вектора с геном SI посредством расщепления
Плазмида p67B68J, полученная как описано в примере 9, была частично переварена ВаmHI и SacI.
Фрагмент, включающий каркас вектора с геном UQ68J SI и участком полиаденилирования Agrobacterium
nos, использовали далее для лигирования.
Лигирование и трансформация
Промотор 67А лигировали в вектор против хода транскрипции от гена UQ68J SI. Продуктами лигирования трансформировали компетентные клетки Тор 10.
- 33 -
008669
Пример 11. Бомбардировка частицами
Плазмиды с генами SI (pU3ZErw, pU3Z14S, pU3Z68J, pUERsN68J, pUERsN68J-His, pUERc68JC,
pUERc68JC-His, pUERsN68JC, p67A68J или p67B68J) и aphA конструкция pEmuKN (как маркер для селекции) были выделены методом щелочной экстракции и растворены в ТЕ буфере. Интактность плазмид
и отсутствие геномной ДНК или РНК проверяли гель-электрофорезом, концентрацию определяли спектрофотометрически.
Генетическую конструкцию с Ubi-сахарозоизомеразой (UbiSI) и конструкцию с селективным маркером соосаждали на вольфрамовых микроснарядах и вводили их в каллюс сахарного тростника, затем
проводили селекцию на трансформированные каллюсы и регенерацию трансгенных растений, по существу, как описано ранее (Bower et al., 1996; Birch, 2000).
Реакции осаждения проводили, добавляя в мл микроцентрифужную пробирку на 1,5 при 4°С по
очереди следующие компоненты: 5 мкл плазмидной ДНК pEmuKN (1 мг/мл), 5 мкл плазмидной ДНК
UbiSI (1 мкг/мкл), 50 мкл вольфрама (Bio-Rad M10, 100 мкг/мкл), 50 мкл СаСl2 (2,5 М), 20 мкл спермидина (100 мМ свободное основание). Препарат немедленно перемешивали после добавления каждого
реагента, с минимальной задержкой между добавлением СаСl2 и спермидина. Вольфраму затем предоставляли возможность осаждаться в течение 5 мин во льду, перед удалением 100 мкл супернатанта и ресуспендированием вольфрама посредством плавного покачивания пробирки, помещенной в штатив.
Суспензии использовали в пределах 15 мин при нагрузке 4 мкл/на бомбардировку, частицы ресуспендировали непосредственно перед отбором каждой аликвоты. Предполагая, что ДНК полностью осаждается
в течение реакции, количество используемых компонентов эквивалентно 1,3 мкг ДНК/на бомбардировку
и 667 мкг вольфрама/на бомбардировку.
Для бомбардировки использовали эмбриогенный каллюс из культивара Q117 сахарного тростника.
Частицы ускоряли в потоке гелия, проходящем сквозь конструкцию держателя фильтра для шприцов в
мишень - каллюс в вакуумной камере. Ткань была осмотически уравновешена в течение четырех часов
перед и после бомбардировки. После 48 ч восстановления на твердой среде без антибиотиков, бомбардированный каллюс переносили в среду с 45 мг/л Geneticin® для селекции, развития каллюса и регенерации растения.
Пример 12. Условия роста сахарного тростника и измерение скорости роста
Культивар Q117 сахарного тростника и его трансгенные линии, экспрессирующие ген SI, растили в
цветочных горшках диаметром 20 см, содержащих помещенную в горшки смесь В для выращивания от
UC (1м-1 песок, 0,5 м-1 торф и 12,45 кг смеси-удобрения, включающей по весу 12 частей костно-кровяной
муки : 2 части нитрата калия : 1 часть сульфата калия : 12 частей суперфосфата : 20 частей доломита : 12
частей гидратированной извести : 6 частей гипса : 2,4 части 'micromax'); в изолирующей теплице при естественном освещении, при 28°С с поливом дважды в день. Растения, регенерировавшие из каллюса
(первая вегетативная генерация) или выросшие из полученных черенков стебля (вторая и третья вегетативные генерации), выращивали только по одному растению на один горшок. Для растений - корневых
отпрысков после срезки изначально выросших стебельков на поверхности горшка из подземных почек
позволяли расти двум стебелькам без пересаживания в новый горшок (также получая вторую и третью
вегетативные генерации). Каждый горшок удобряли, внося Osmocote® в количестве 5 г в месяц в течение
первого и второго месяцев, а затем 10 г в месяц. Высоту (от поверхности горшка до верхней видимой
листовой обертки), диаметр стебля (первое междоузлие над грунтом), количество узлов (считая узлом
номер 1 узел, стягивающий лист с верхней видимой листовой оберткой) и вес сырой ткани регистрировали ежемесячно в течение первых трех месяцев, затем каждые две недели.
Пример 13. Приготовление образца для капиллярного электрофореза
Для удаления ионных супернатанты культур и экстракты растительной ткани пропускали через
сильные катионо- и анионообменные колонки (Varian Bond Elut-SCX и SAX). Пробы и промывки продавливали через колонки с помощью шприца.
Колонки предварительно уравновешивали одним объемом метанола, а затем одним объемом воды.
Супернатант бактериальной культуры (из примера 2) разводили в 150 раз, используя стерильную воду
Milli-Q (SMQ), затем 1 мл разведенного супернатанта пропускали через SAX и SCX колонки и неадсорбировавшийся элюат собирали в пробирки объемом 1,5 мл.
Пример 14. Капиллярный электрофорез
Разделение методом капиллярного электрофореза высокого разрешения (high performance capillary
electrophoresis, HPCE) проводили на Beckman P/ACE 5000 Series СЕ System, используя для детекции пробы поглощение при 254 нм. Капилляры без покрытия из плавленого кварца с внутренним диаметром 50
мкм, внешним диаметром 363 мкм (Supelco Cat. # 70550-U). Общая длина капилляров составляла 77 см, а
расстояние до окна детектора составляло 69 см. Окно капиллярного детектора было сделано посредством
удаления облицовки капилляра в пламени спички и протирания метанолом.
Щелочной электродный буфер с сульфатом меди (ЕВ, состоящий из 6 мМ сульфата меди (II) и 500
мМ аммония, рН 11,6) применяли для разделения сахарозы и изомальтулозы, а также других сахаров,
включая глюкозу и фруктозу, которые могут присутствовать в клеточных экстрактах. Разделение и прямая UV детекция нейтральных сахаров облегчается за счет реакции хелатообразования сахаров с медью
- 34 -
008669
(II) в щелочных условиях. В начале каждого дня готовили свежий буфер ЕВ, который дегазировали под
вакуумом за 15 мин до использования.
Для достижения максимальной воспроизводимости времен миграции, капилляры ежедневно стандартизовали перед использованием с помощью следующих процедур промывания: 2 мин водой, 10 мин
0,1 М НСl, 2 мин водой, 10 мин 0,1 М NaOH, 2 мин водой, 15 мин 0,5 М аммонием и 2 мин водой. Все
растворы растворяли/разводили в воде SMQ и фильтровали через фильтр Micropore с размером пор 0,45
мкм. Затем капилляры промывали буфером ЕВ в течение 15 мин перед первой пробой и по 10 мин между
пробами. Разделение проводили в течение 30 мин при 25KV. Стандарты (состоящие из сахарозы и изомальтулозы и других сахаров, необходимых для эксперимента) разгоняли перед первой и после последней пробы в каждой группе, так что отличия во временах миграции вследствие таких факторов, как истощение ЕВ буфера или нагревание капилляра, могли быть измерены и скорректированны. Концентрация каждого сахара в пробах была рассчитана из сравнения площади пика сахара с площадью пиков
стандартов с известной молярной концентрацией.
Пример 15. Приготовление образца из внутриклеточного и внеклеточного пространств трех радиальных зон ткани стебля сахарного тростника для ВЭЖХ-ED
Срез длиной 1,5 см вырезали из середины междоузлия и отбирали образцы из трех радиальных зон
(центральной, средней и внешней). Центральная зона представляла собой цилиндр с диаметром 6 мм, ее
отбирали с помощью острой полой трубки, используемой для проделывания дырок в пробках. Средняя
зона была близлежащей полосой шириной 4 мм, полученной с помощью аналогичной трубки диаметром
10 мм. Внешнюю зону собирали, вырезая полосу толщиной 4 мм сразу же под корой. Вырезанные зоны
помещали по отдельности в GelSpin™ filters (Mo Bio Laboratories) без мембран для отделения жидкостей
с помощью центрифугирования. Для удаления жидкостей из разрезанных клеток поверхности образца
центрифугировали при 150 х g в течение 10 мин при температуре 4°С и фильтрат отбрасывали. После
следующего центрифугирования 600 х g в течение 4 мин при 4°С фильтрат собирали как жидкость из
внеклеточных пространств. Для того чтобы избежать загрязнения внутриклеточных жидкостей, пробы
центрифугировали при 1500 х g в течение 5 мин при температуре 4°С и фильтрат отбрасывали. Затем для
разрушения клеточных мембран пробы замораживали в жидком азоте и нагревали до комнатной температуры, далее центрифугировали при 10000 х g в течение 10 мин при 4°С. Этот фильтрат собирали как
внутриклеточную жидкость. Обе, внутри- и внеклеточные жидкости, после того, как они были получены,
нагревали при 100°С в течение 5 мин и центрифугировали при 15000 х g в течение 10 мин для удаления
нерастворимого материала. Супернатант разводили в 1000 раз, используя стерильную воду Milli-Q, и
анализировали посредством ВЭЖХ-Е.
Пример 16. Измерение концентраций сахаров методом ВЭЖХ-ED
Разделение и количественное определение сахарозы, изомальтулозы, трегалюлозы, глюкозы и
фруктозы проводили с помощью изократической ВЭЖХ при высоком рН (100 ммоль л-1 КОН), используя систему Dionex BioLC с аналитической анионообменной колонкой РА20 и импульсной электрохимической детекцией, которую калибровали, используя серии разведений стандартов сахаров для каждой
группы проб (Wu & Birch, 2004). Этот метод использовали для всех экспериментов с геном SI, слитым с
сигналами NTPP и/или СТРР, и для всех экспериментов с геном SI, находящимся под контролем промотора Р67. Концентрации сахаров были пересчитаны с учетом разведения в процессе определения, чтобы
получить данные, соответствующие их концентрации в соке растения.
Пример 17. Определение концентраций сахаров в тканях сахарного тростника методом капиллярного электрофореза
Пробы тканей сахарного тростника отбирали, взвешивали, разрушали замораживанием в жидком
азоте, затем добавляли 3 мкл воды SMQ на мг сырого веса ткани (FW) и пробирку кипятили в течение 20
мин (в верхней части микроцентрифужной пробирки прокалывали маленькое отверстие с целью предотвращения «соскакивания» крышки). После кратковременного центрифугирования, проводимого для того,
чтобы собрать всю жидкость на дне пробирки, раствор переносили в чистую пробирку и центрифугировали при 16000 х g в течение 10 мин при 4°С для удаления денатурированных белков. Супернатант пропускали через BondElut™ SCX и SAX и проводили СЕ анализ, как описано в примере 14. Этот метод использовали для экспериментов с трансформантами, несущими Ubi-промотор/цитозольная SI, и концентрации сахаров были пересчитаны с учетом разведения в процессе определения, чтобы получить данные,
соответствующие их концентрации в соке растения.
Пример 18. Определение содержания хлорофилла в листьях, сырого веса ткани, сухого веса и содержания воды
Листья сахарного тростника и соответствующие узлы были пронумерованы от верхушки до низа,
принимая за номер 1 лист с верхней видимой листовой оберткой. Измерения проводили по меньшей мере
на трех повторах растений на линию. Для каждого повтора измерения хлорофилла или веса брали четыре
диска из листовой пластинки на расстоянии 1/10 длины листа от листовой обертки, полученные при использовании полой трубки диаметром 5 мм. Четыре диска помещали в предварительно взвешенную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, которую немедленно взвешивали и помещали в жидкий
азот.
- 35 -
008669
Для определения сухого веса и содержания воды диски листа выдерживали в сушильном шкафу
при 70°С до достижения постоянного сухого веса. Содержание воды рассчитывали как
(сырой вес - сухой вес)/сырой вес х 100
Для определения количества хлорофилла замороженные листовые диски растирали в порошок, экстрагировали 80% ацетоном в темноте и затем центрифугировали при 12000 х g в течение 10 мин при 4°С.
Поглощение измеряли при длинах волн 664 нм и 647 нм. Концентрации хлорофилла а, хлорофилла b и
суммарную концентрацию хлорофилла (Graan and Ort, 1984) рассчитывали как
Хлорофилл а (мМ) = 13,19 A664 - 2,57 A647
Хлорофилл b (мМ) = 22,10 A647 - 5,26 A664
Суммарный хлорофилл (мМ) = 7,93 A664 + 19,53 A647
Пример 19. Скорость транспорта электронов фотосистемы II в листьях сахарного тростника
Скорость фотосинтетического транспорта электронов оценивали из кривой интенсивности флуоресценции, генерируемой при использовании оптического волокна MINI-PAM/F (Heinz Walz GmbH,
Germany) и держателя листьев 2030-В, расположенного на расстоянии 1/10 длины листа от обертки. Параметры на MINI-PAM - интенсивность света, интенсивность насыщающего пульса, ширина насыщающего пульса, коэффициент поглощения листа и время освещения, были заданы как 8, 8, 0,8, 0,84 и 10 с,
соответственно. В процессе измерения внутреннюю температуру MINI-PAM поддерживали между 2530°С. Флуоресценцию измеряли на равноценных листьях из по меньшей мере трех повторов растений
каждой линии.
Пример 20. Скорость фиксации СO2 листьями сахарного тростника
Портативную систему для исследования фотосинтеза LI-6200 (LI-COR, USA) с камерой для листа
объемом 250 см3 использовали для измерения скоростей фиксации СO2 в тех же листьях, которые были
использованы для измерений флуоресценции.
Пример 21. Экстракция суммарной РНК из тканей сахарного тростника и гель-блот анализы РНК
Суммарную РНК выделяли из листьев номер 1-2 или стеблей номер 3-4 6-месячных растений сахарного тростника, используя метод Бугоса с сотр. (Bugos et al. 1995). Коротко, 10 г замороженной ткани
растирали в жидком азоте до мелкодисперсного порошка. Добавляли буфер для экстракции (20 мл 100
мМ Tris-HCl pH 9,0, 200 мМ NaCl, 15 мМ EDTA, 0,5% Саркозил, 100 мМ 2-меркаптоэтанол), затем гомогенизировали в течение 5 мин. К смеси добавляли фенол, уравновешенный буфером (20 мл), и 4 мл смеси
хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), затем пробу гомогенизировали в течение 2 мин. Добавляли ацетат
натрия (1,4 мл 3 М, рН 5,2) и гомогенизировали в течение 30 с. Экстракт охлаждали во льду 15 мин и
центрифугировали при 10000 х g в течение 10 мин при 4°С. Водную фазу переносили в чистую пробирку, добавляли равный объем изопропанола. После центрифугирования пробы при 10000 х g в течение 10
мин при 4°С образовавшийся осадок промывали 70% этанолом и высушивали под вакуумом.
Осадок растворяли в воде и добавляли 8М LiCl до конечной концентрации 2М. После инкубации на
льду в течение 3 ч РНК осаждали центрифугированием при 14000 х g в течение 10 мин при 4°С. Осадок
РНК промывали 70% этанолом, высушивали под вакуумом, растворяли в воде и измеряли концентрацию
РНК на спектрофотометре.
Тридцать мкг суммарной РНК наносили на дорожку, фракционировали электрофорезом в 2,2 М
формальдегиде и 1,0%-ном агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану Hybond N+ (Amersham Pharmacia BioTech). Блот предварительно гибридизовали с модифицированным гибридизационным
раствором по Church and Gilbert (7% SDS, 10 мМ EDTA и 0,5 M фосфатный буфер, рН 7,2) в течение 2 ч,
затем гибридизовали с 32Р-мечеными пробами, полученными с помощью случайной затравки при использовании полноразмерной кДНК UQ68J SI, при 65°С в течение ночи. После гибридизации мембрану
отмывали 2xSSC, 0,1% SDS при 23°С, далее промывали при 65°С 15 мин 2xSSC, 0,1% SDS, 15 мин
1xSSC, 0,1% SDS и 15 мин 0,lxSSC, 0,1% SDS, заворачивали в эластичную пленку и выдерживали на экране фосфоимиджера (Molecular Dynamics) в течение ночи для аккумуляции скрытого изображения.
Пример 22. Гены, отличные от генов сахарозоизомераз, которые могут быть использованы для осуществления изобретения на практике
Для осуществления частичного превращения вещества-субстрата, который организмом в норме
ощущается, в вещество-продукт, которое не воспринимается организмом эквивалентным образом, что
приводит в результате к изменению метаболических потоков и к накоплению большего количества желательных соединений, в организм могут быть введены различные гены.
В том случае, когда желательными соединениями являются углеводы, пригодными генами могут
быть такие, которые кодируют ферменты, участвующие в метаболизме углеводов (http://afmb.cnrsmrs.fr/~cazy/CAZY/index.html), например изомеразы (КФ 5.4), трансгликозидазы (КФ 3.2) или гликозилтрансферазы (КФ 2.4), включая глюкозилтрансферазы и фруктозилтрансферазы, такие как амилосахараза
(КФ 2.4.1.4), декстрансахараза (КФ 2.4.1.5), левансахараза (КФ 2.4.1.10) или циклодекстринглюкозилтрансфераза (КФ 2.4.1.19), и варианты этих ферментов, которые предпочтительно синтезируют олигосахариды, чужеродные для модифицированного организма (Demuth et al. 2002; Martin et al. 2004; Park et al.
2003; Plou et al. 2002; van der Veen et al. 2004).
Альтернативно, могут оказаться пригодными гены, кодирующие ферменты, которые осуществляют
- 36 -
008669
частичную конверсию сахаров или производных эндогенных сахаров в чужеродные организму производные сахаров, такие как сахароспирты (Saha 2004; Zhifang and Loescher 2003). Выбор гена должен быть
основан на анализе доступности и метаболической роли в организме-мишени соответствующих субстратов и кофакторов и способности организма узнавать и метаболизировать продукт. Изобретение может
быть применено в организмах с существенно различающейся физиологией, и специалистам в данной
области будет очевидно, что оптимальные условия экспрессии альтернативных генов, которые могут
быть введены для достижения цели изобретения в организмы разных видов, могут быть установлены в
результате рутинных экспериментов.
Пример 23. Растения, отличные от сахарного тростника, которые могут быть пригодны для осуществления изобретения на практике
Изобретение может быть также использовано на практике в других растениях, культивируемых для
получения растворимых сахаров, в таких, например, как сладкое сорго или сахарная свекла, или в растениях, где сладкий вкус, обусловленный наличием растворимых сахаров, является важной характерной
особенностью, к ним относятся, например, зерновые, такие как сладкая кукуруза, бобовые, такие как горох, и фрукты, такие как виноград, томаты и бананы. Способы введения генов для экспрессии в эти растения подробно документированы в общедоступных источниках, например методы представлены в работах (Cortina 2004; Ganapathi et al. 2001; Grant et al. 2003; Hermann et al. 2001; Jeoung et al. 2002; Joersbo et
al. 2000; Polowick et al. 2002; Tadesse et al. 2003; Vidal et al. 2003; Zhang et al. 2001; Zhang et al. 2002), и
хорошо известны специалистам в данной области.
Растение сладкого сорго может быть трансформировано конструкциями для экспрессии, описанными здесь в примерах, представленных с использованием сахарного тростника в качестве модельного вида
разновидности растения. В других видах могут быть использованы конструкции, полученные посредством замены промоторов и сигнальных последовательностей на подходящие для данного растения. Например, для конститутивной экспрессии у видов двудольных может быть применен промотор CaMV 35S.
Может быть использован также подходящий промотор, который является предпочтительно экспрессируемым в желательной ткани; например, для экспрессии в запасающем корне сахарной свеклы - промотор пататина В33, или специфический для фруктов промотор, или связанный с созреванием промотор
для других видов (Lessard et al. 2002). Для распределения продукта гена в разном соотношении между
запасающим сахарозу компартментом и метаболическим компартментом внутри клетки могут быть использованы другие сигнальные последовательности, например, NTPP из гена В33 пататина или другие
известные вакуолярные сигналы (Vitale and Raikhel 1999).
Результаты и дискуссия, относящиеся к примерам
Экспрессия адресуемой в цитозоль SI, находящейся под контролем промотора Ubi
Изомальтулоза была обнаружена во всех тканях линий трансгенного Ubi-SI сахарного тростника,
экспрессирующих гены UQ14S и UQ68J, но только в ткани стебля трансгенных линий, экспрессирующих
UQErw
Были отобраны трансгенные линии культивара Q117 сахарного тростника, которые экспрессировали гены SI UQErw (11 линий), UQ14S (11 линий) или UQ68J (9 линий), введенные по ходу транскрипции
относительно промотора Ubi. Известно, что этот промотор контролирует устойчивую 'конститутивную'
экспрессию в большей части тканей сахарного тростника, характеризующуюся самыми высокими уровнями экспрессии, индуцируемыми тепловым шоком и некоторыми другими стрессовыми воздействиями
окружающей среды (Hansom et al., 1999). У выращенных в теплице растений 6-месячного возраста с 1215 узлами изомальтулоза обнаружена в ткани листа, корня и стебля в pUbil4S и pUbi6SJ линиях, но только в ткани стебля в линиях pUbiErw (фиг. 1). Результаты подтверждают, что введенные гены SI являются
функциональными в сахарном тростнике и показывают, что UQ68J дает наибольшую эффективность
превращения сахарозы в изомальтулозу в зрелых растениях сахарного тростника (фиг. 2), как это было
предварительно продемонстрировано в Е.coli и в трансгенном каллюсе сахарного тростника (Birch and
Wu, 2002).
Конститутивная сверхэкспрессия адресуемого в цитозоль UQ68J SI задерживала рост, изменяла
морфологию и ингибировала накопление сахарозы в трансгенных растениях сахарного тростника.
Все pUbiErw и pUbil4S трансгенные линии сахарного тростника были фенотипически неотличимы
от контрольных растений Q117, выросших в тех же самых условиях (табл. 2). Девять трансгенных линий
сахарного тростника pUbi68J могут быть классифицированы (фиг. 3) как
1) 'Нормальные'. Пять линий (подобно pUbi68J2.36) были фенотипически неотличимы от контроля
Q117.
2) 'Слабая главная жилка'. Одна линия (pUbi68J1.2) имела похожее развитие и размер с Q117, за исключением того, что в полностью расправленных листьях нечетко выражены главные жилки.
3) 'Низкорослые'. Три линии продемонстрировали замедленный рост, растения имели короткие,
тонкие междоузлия и маленькие листья. Из них жизнеспособной оказалась только линия pUbi68J2.22.
- 37 -
008669
Таблица 2. Фенотипические свойства контрольного растения Q117 и репрезентативных линий трансгенного сахарного тростника, выращенных в течение 6 месяцев в условиях теплицы
Нозерн-анализ РНК репрезентативных линий pUbi68J2.36 (нормальные), pUbi68J1.2 (слабая главная
жилка) и pUbi68J2.22 (низкорослые) показал наиболее высокий уровень транскриптов UQ68J в низкорослых растениях, тогда как другие две категории имели более низкий уровень экспрессии гена SI (фиг.
4). Высокий уровень транскриптов UQ68J согласовался с высокой эффективностью превращения сахарозы в изомальтулозу (вплоть до 96, 90 и 69% в листе, корне и стебле, фиг. 5) и приводил к существенному
снижению концентрации сахарозы в стеблях (табл. 3).
Таблица 3. Эффективность превращения эндогенной сахарозы в изомальтулозу (ИМ) и концентрации сахара в
контрольных Q117 и трансгенных растениях, выращенных в течение 6 месяцев в условиях теплицы1
1
Сахара количественно определяли с помощью СЕ-анализа после пропускания через ионообменные
фильтры (SCX и SAX), с последующей коррекцией на известное разведение и определенные потери сахаров в процессе работы, чтобы представить результаты, эквивалентные концентрации сахаров в соке
растения. Эффективность превращения выражена как соотношение изомальтулоза/(сахароза + изомальтулоза).
Распределение накопления сахарозы не изменяется неблагоприятным образом при продукции изомальтулозы в трансгенных линиях с низким уровнем экспрессии генов SI, адресованной в цитозоль
Содержание сахаров на разных стадиях развития растений трансгенной линии с низким уровнем
транскриптов UQ68J демонстрирует распределение накопления сахарозы, близкое к таковому у растений
контрольной линии Q117 (фиг. 6). Концентрация изомальтулозы также увеличивается по мере созревания стебля (фиг. 7). Эти результаты говорят о том, что превращение сахарозы в изомальтулозу до определенного порога, даже в цитоплазме, не влияет на транспорт и накопление сахарозы. Кроме того, изомальтулоза является стабильной и может накапливаться в сахарном тростнике.
Эти результаты показывают, что:
(i) Ген UQ68J имеет преимущество перед другими протестированными SI-генами в плане экспрессии в растениях, предназначенных для эффективного превращения сахарозы в изомальтулозу. Это является очень перспективным для такого промышленного применения, как использование растений в качестве биофабрик для производства изомальтулозы.
(ii) Поскольку изомальтулоза не метаболизируется растениями, она может выступать в качестве запасного сахара, удаляемого из «футильного цикла» синтеза и расщепления сахарозы, который может
лимитировать предельные уровни накопления сахаров в растениях, и из повторной мобилизации запасенной сахарозы при определенных внешних условиях, которые могут уменьшать собираемый урожай
сахара. Таким образом, подходящее распределение активности SI-генов имеет определенный потенциал
для возможного увеличения общего выхода сахаров в растениях путем превращения части пула сахаров
в неметаболизируемый запас. Это эффективно превращает процесс аккумуляции сахаров в «односторонний клапан» в направлении накопления пула изомальтулозы для его последующего использования. Более
того, вероятно, что накопление пула изомальтулозы может быть достигнуто без соизмеримого уменьшения остального пула растворимых сахаров. Практическое достижение таких взаимосвязанных потенциальных возможностей является очень желательным для индустриального применения, например, использования растений в качестве биофабрик для накопления максимально возможного выхода запасных растворимых сахаров.
- 38 -
008669
(iii) Высокий уровень конститутивной экспрессии гена для эффективных, адресуемых в цитозоль SI
значительно ингибирует рост растений за счет превращения необходимой для роста сахарозы в изомальтулозу, которая недоступна для метаболизма растения. Это крайне нежелательно для промышленного
применения, поскольку рост растений необходим для создания резервуаров для запасания достаточных
количеств желательных продуктов: изомальтулозы и других растворимых сахаров. Ниже авторы данного
изобретения предлагают решение этого ключевого ограничения, демонстрируя, что для оптимального
промышленного получения изомальтулозы экспрессия введенного гена SI должна регулироваться таким
образом, чтобы в значительной степени ограничивать активность SI в пределах определенного субклеточного компартмента, предназначенного для хранения сахара, такого как вакуолярный компартмент
клеток запасающей паренхимы сахарного тростника в зрелых стеблях.
Общее содержание растворимого сахара увеличивается в стеблях некоторых трансгенных линий с
низким уровнем экспрессии генов адресованной в цитозоль SI
В трансгенной линии pUbi68J2.36 общая концентрация растворимого сахара (выраженная в глюкозных эквивалентах) увеличивалась в 1,9 раза в зрелых стеблях (междоузлия # 12 и 13) и в 2,4-3,0 раза в
листьях 6-месячных растений по сравнению с контрольной линией Q117 (фиг. 8). В другой трансгенной
линии pUbi68J2.28 общая концентрация сахаров в глюкозных эквивалентах увеличивалась в 1,6 раза в
зрелых стеблях (междоузлие # 18) 9-месячных растений по сравнению с контрольными растениями
Q117. При исследовании одиночных стеблей растений линий pUbil4S2.27, pUbiErw2.1 и pUbiErW3.7 9месячного возраста было обнаружено, что в междоузлиях # 20 концентрация сахаров в глюкозных эквивалентах в 1,5-1,6 раз выше, чем в Q117 контроле. Растения этих трансгенных линий морфологически не
отличались от контрольных растений сахарного тростника линии Q117. Концентрации изомальтулозы в
этих линиях обычно были низкими по сравнению с концентрациями сахарозы, составляя от менее чем от
1 до 5% от общего содержания сахаров в зрелых стеблях.
Более высокое содержание растворимых сахаров обеспечивается, главным образом, за счет увеличения содержания сахарозы, глюкозы и фруктозы скорее, чем изомальтулозы. Например, в трансгенной
линии pUbi68J2.36 процентное соотношение в глюкозных эквивалентах в зрелом стебле было таковым:
сахароза (80%), изомальтулоза (3%), фруктоза (6%) и глюкоза (11%). В отличие от этого, в контрольных
растениях Q117 процентное соотношение было следующим: сахароза (98%), фруктоза (1%) и глюкоза
(1%). Необходимо отметить, что, несмотря на то, что содержание сахарозы составляет всего 80% в трансгенной линии pUbi68J2.36 против 98% в контроле Q117, абсолютная концентрация сахарозы в трансгенной линии была в 1,3 раза выше, чем в контроле Q117 (табл. 2). Таким образом, эти линии обладают огромным потенциалом для промышленного использования, особенно для использования в качестве сырья
для ферментации при производстве этанола.
Относящиеся к фотосинтезу показатели улучшаются параллельно с увеличением концентрации
доступного для ферментации сахара в трансгенных линиях с низким уровнем адресной экспрессии
генов адресованной в цитозоль SI
С целью дальнейшего выяснения механизма увеличения общей концентрации сахаров в трансгенных линиях с низким уровнем экспрессии генов SI, были измерены скорости фотосинтеза и связанные с
фотосинтезом индексы. По сравнению с контролем Q117 большинство листьев линии pUbi6SJ2.36 демонстрировало более высокую скорость фиксации СО2, особенно в случае более старых листьев (фиг. 9).
Содержание хлорофилла и скорости транспорта электронов были также выше в трансгенной линии,
и опять различия были более выражены в случае более старых листьев (фиг. 10). Соотношение хлорофиллов а/b в контрольных листьях Q117 было таким же или выше, чем в большинстве листьев трансгенной линии (фиг. 11). Скорость транспорта электронов фотосистемой II, измеренная по флуоресценции
хлорофилла, частично отражает различия в эффективности фотосинтеза между трансгенными и контрольными растениями, демонстрируя более высокую кривую ответа на свет для большинства листьев
линии pUbi68J2.36 по сравнению с контролем Q117 (фиг. 12).
Эти данные свидетельствуют, что:
(i) Экспрессия гена сахарозоизомеразы в растениях, приводящая к превращению части пула сахарозы растения в изомер, который не воспринимается контрольными системами растения эквивалентно сахарозе, может приводить к накоплению более высоких общих уровней сахаров в растительных тканях.
(ii) Специфические изменения метаболизма, включающие превращение эндогенного сахара, в норме ощущаемого организмом, в новый сахар, который не распознается растением эквивалентным образом,
может сдвигать метаболизм в сторону накопления более высоких концентраций растворимых углеводов
благодаря комбинированному влиянию на синтез в производящих тканях, на транспорт между производящими и запасающими тканями и на превращение или хранение сахаров в запасающих тканях.
Экспрессия SI, адресованная в вакуоли, под контролем промотора Ubi
Здоровые растения с высокими выходами изомальтулозы были получены с помощью адресной доставки продуктов гена SI в вакуоли.
Были отобраны трансгенные линии сахарного тростника, в которых продукт гена SI UQ68J был адресно направлен в вакуоли культивара сахарного тростника Q117 с помощью слияния гена с NTPP спорамина сладкого картофеля (22 линии только с NTPP, 9 линий с NTPP и с His-меткой), с СТРР из хитина- 39 -
008669
зы табака (7 линий только с СТРР, 11 линий с СТРР и с His-меткой), или с обоими сигнальными пептидами NTPP и СТРР без His-метки (9 линий). Выращенные в теплице 8-месячные растения имели примерно от 20 узлов (растения, выращенные из одноглазковых черенков) до 30 узлов (растения, выращенные
из корневых отпрысков); в тканях стеблей этих растений была обнаружена изомальтулоза около 80% из
тестированных линий pU3ZERsN68J, pU3ZERc68JC, pU3ZERsN68J-His, pU3ZERc68JC-His и
pU3ZERsN68JC (детали представлены в следующих секциях).
Самая высокая концентрация изомальтулозы была обнаружена в тканях зрелых стеблей линии
pU3ZRsN68JHis3.2 и составила 756 мМ. Уровень накопления изомальтулозы варьировал у разных трансгенных линий, что хорошо согласуется с известной вариабельностью в экспрессии, связанной с независимостью событий вставки трансгена (Matzke & Matzke, 1998; Peach & Velten, 1991), а также с потенциальным влиянием микроокружения на индуцибельный промотор Ubi (Hansom et al., 1999). Концентрация
изомальтулозы увеличивалась по мере созревания стебля, чго хорошо согласуется с естественной динамикой накопления сахара сахарным тростником; при этом соотношение изомальтулозы и других сахаров
варьировало в разных трансгенных линиях (фиг. 15).
Тринадцать из 20 протестированных трансгенных линий растений (65%) дали положительную реакцию на присутствие изомальтулозы в корнях, однако концентрация изомальтулозы в них была ниже
1мМ, за исключением линий pU3ZERsN68J1.4 и pU3ZERsN68JHisl.3 (фиг. 13). В листьях изомальтулоза
обнаруживалась в определяемых количествах только в тех растениях, которые накапливали высокие
уровни изомальтулозы в тканях зрелых стеблей. В растениях этих линий содержание изомальтулозы постепенно увеличивалось с увеличением возраста листьев, оставаясь менее 1 мМ до восьмого листа (фиг.
14). Другие протестированные линии (например, линии с высоким содержанием сахарозы, описанные
ниже) давали отрицательную реакцию на присутствие изомальтулозы в тканях листьев.
Все полученные трансгенные линии растений выглядели здоровыми и не имели видимых морфологических отличий от контрольных растений Q117 (табл. 4).
Таблица 4. Фенотипические характеристики контрольных растений Q117 и репрезентативных трансгенных линий сахарного тростника с адресованной в вакуоль SI, выращенных в течение 8 месяцев в условиях теплицы
а
Растения, выращенные из одноглазковых черенков;
Растения, выращенные из корневых отпрысков.
Эти данные свидетельствуют, что:
(i) Даже при конститутивной экспрессии под контролем промотора Ubi, адресующего продукт
трансгена SI в вакуоль, наблюдается значительная аккумляция изомальтулозы в запасающих тканях
стебля сахарного тростника, без заметных нежелательных эффектов на рост и развитие растения.
(ii) Известно, что вакуоли сахарного тростника враждебны по отношению к большинству вводимых
белков (Gnanasambandam & Birch, 2004), поэтому маловероятно, что SI накапливается в этом компартменте. Однако при постоянной доставке высокоэффективной SI, такой как UQ68J, в запасающие сахарозу вакуоли, можно обеспечить постепенное накопление изомальтулозы в процессе развития растения с
высоким конечным выходом.
б
- 40 -
008669
(iii) Эффективное адресование в вакуолярный путь убирает активность SI из метаболически активного цитозольного компартмента, преобладающего в клетках активно растущих тканей, что обеспечивает отсутствие нежелательных эффектов на рост растений. Это является очень желательным для промышленного использования, включающего превращение сахарозы в вещества, которые не могут эффективно
метаболизироваться растением.
Изомальтулоза была выявлена как во внутриклеточном, так и во внеклеточном пространстве у
трансгенных линий с адресной доставкой в вакуоли
Изомальтулоза была обнаружена как во внеклеточной, так и во внутриклеточной жидких фракциях
в примерно одинаковых концентрациях. Этот феномен являлся общим для всех адресуемых в вакуоль
конструкций, содержащих сигнал NTPP, СТРР или оба сигнала (фиг. 16). Концентрации сахарозы в этих
фракциях также были примерно одинаковыми, но большая часть сахара находилась во внутриклеточном
(вакуоль) компартменте, поскольку этот компартмент имеет гораздо больший объем. Известно, что небольшая часть адресуемого в вакуоль белка может проходить через секреторный путь во внеклеточное
пространство, где белок может оказаться более стабильным, чем в вакуоли (Gnanasambandam & Birch,
2004). Предполагается, что растения не могут обеспечивать транспорт изомальтулозы между компартментами, следовательно, за наблюдаемое накопление внеклеточной изомальтулозы, вероятно, отвечает
секретируемая из клетки SI.
Во всех линиях, используемых в настоящем исследовании, не было обнаружено нежелательных
эффектов накопления изомальтулозы в растениях, что является выгодным для их промышленного использования в том случае, когда максимально высокое общее превращение сахарозы является желательным для максимального выхода продукта превращения.
Общее содержание сахара увеличивается разными путями.
Основываясь на различии используемых конструкций и на профилях накопления изомальтулозы и
сахарозы в стеблях сахарного тростника, линии трансгенного сахарного тростника с высокой общей концентрацией сахара по отношению к контролю Q117 можно разделить на четыре группы:
1. Линии с конструкцией NTPP-SI с высокой концентрацией изомальтулозы (>70 мМ), в которых
изомальтулоза вносит значительный вклад в общее содержание сахара, которое выше, чем в контроле
Q117.
2. Линии с конструкцией NTPP-SI со средней концентрацией изомальтулозы (20-70 мМ), в которых
более высокое общее содержание сахара достигается, главным образом, за счет более высокой концентрации сахарозы, чем в контроле Q117.
3. Линии с конструкцией NTPP-SI с содержанием изомальтулозы ниже порога чувствительности
метода определения, в которых концентрация сахарозы в зрелых стеблях увеличивается до уровней, превышающих таковые в контроле Q117.
4. Линии с конструкцией SI-CTPP плюс 6 х His с низкой концентрацией изомальтулозы (< 10 мМ), в
которых более высокое содержание сахара достигается, главным образом, за счет более высокой концентрации сахарозы, чем в контроле Q117.
Высокая концентрация изомальтулозы вносит значительный вклад в увеличение общего содержания растворимого сахара в зрелых стеблях растений некоторых трансгенных линий с NTPP-SI
В трансгенной линии pU3ZERsN68J3.2 (в следующих разделах обозначается как N3.2) 8-месячные
растения, выращенные из одноглазковых черенков, накапливают 108 мМ изомальтулозы во внутриклеточном пространстве в зоне 2 междоузлия 26, что эквивалентно 14% от общего содержания сахара. Корневые отпрыски накапливают 286 мМ изомальтулозы в 22-ом междоузлии, что эквивалентно 47% от общего содержания сахара. Корневые отпрыски линии pU3ZERsN68J3.2His (в дальнейшем сокращается как
N3.2His) с 35 узлами накапливают 756 мМ изомальтулозы, что эквивалентно 67% от общего содержания
сахара, в 33-ем междоузлии.
В контроле Q117 общая концентрация сахара варьирует от 369 мМ до 490 мМ (сахарозные эквиваленты) в 20-ых междоузлиях разных стеблей. По сравнению с самым высоким общим содержанием сахара, наблюдаемом в контрольных растениях Q117 (490 мМ), общая концентрация сахара в 20-ом междоузлии увеличивается на 29% в N3.2, на 24% в корневых отпрысках N3.2 и на 20% в корневых отпрысках
N3.2His. В 33-ем междоузлии общая концентрация сахара в корневом отпрыске N3.2His была в 2,7 раз
выше, чем в контроле Q117 (фиг. 17).
Высокие концентрации изомальтулозы не были обнаружены в трансгенных линиях с сигналом
СТРР или с двойным адресующим сигналом NTPP+CTPP. Сигнал NTPP может обеспечивать более высокую эффективность адресной доставки активного продукта гена SI в запасающие сахарозу компартменты сахарного тростника.
Высокая концентрация сахарозы вносит значительный вклад в увеличенное общее содержание
сахара в зрелых стеблях растений трансгенных линий с NTPP-SI со средними концентрациями
изомальтулозы
Трансгенные линии, такие как pU3ZERsN68J1.17 (в дальнейшем сокращается как N1.17) и
pU3ZERsN68J1.2 (в дальнейшем сокращается как N1.2), накапливали сахарозу в 1,1-1,6 раза больше, чем
- 41 -
008669
контроль Q117. Концентрация сахарозы в 20-ом междоузлии N1.17 была увеличена на 28% в самом растении сахарного тростника и на 56% в корневом отпрыске сахарного тростника по отношению к контролю Q117. В корневом отпрыске N1.2 содержание сахарозы было увеличено на 20% по сравнению с контролем Q117. Доля сахарозы в общей концентрации сахара в зрелых междоузлиях указанных выше трех
стеблей трансгенных растений составила 95, 90 и 91%, соответственно. Концентрация изомальтулозы в
этих линиях была 25, 8 и 48 мМ, что составило только 5, 1 и 9% от общего содержания растворимых сахаров (фиг. 18).
Высокая концентрация сахарозы в зрелых стеблях растений трансгенных линий с NTPP-SI, изомалътулоза в которых не определяется
Трансгенные линии, такие как pU3ZERsN68J1.10 (в дальнейшем сокращается как N1.10) имеют
другой профиль распределения сахаров. Изомальтулоза в тканях стеблей, листьев или корней не была
выявлена с помощью ВЭЖХ-ED, хотя ген SI был выявлен с помощью ПЦР. В зрелом стебле N1.10 накапливалось в 1,5 раза больше сахарозы, чем в контроле Q117 (табл. 5).
Таблица 5. Сравнение профилей сахаров в 20-ых междоузлиях корневых отпрысков растений тростника
трансгенной линии N1.10 и контрольных Q117
1
Для этой и последующих таблиц содержание сахаров определяли с помощью анализа HPAE-PAD,
с последующей коррекцией на разведение и определенные потери сахаров в ходе работы, чтобы представить результаты, эквивалентные коцентрациям сахаров в соке растения.
Высокая концентрация сахарозы в зрелых стеблях растений трансгенных линий с SI-CTPPHis с
низкой концентрацией изомальтулозы
Три из 11 протестированных трансгенных линий с сигналом SI-CTPPHis продуцировали менее чем
2 мМ изомальтулозы в зрелых стеблях и накапливали больше общих растворимых сахаров, чем контроль
Q117. Трансгенные линии pU3ZERc68JCl.3His (в дальнейшем сокращается как C1.3His),
pU3ZERc68JC3.7His (в дальнейшем сокращается как C3.7His) и pU3ZERc68JC3.8His (в дальнейшем сокращается как C3.8His) накапливали в 1,8, 1,9 и 1,6 раза больше сахарозы, чем контроль Q117, а также
имели более высокое содержание глюкозы и фруктозы (табл. 6). В трансгенной линии C3.7His изомальтулозу обнаружить не удалось. В этих линиях не только зрелые стебли накапливают большее общее количество растворимых сахаров по сравнению с контролем Q117, но и изменяется профиль накопления
сахара во время развития: концентрация сахара увеличивается уже в молодых растущих междоузлиях и
достигает высоких концентраций, наблюдаемых в зрелых междоузлиях (фиг. 19).
В отличие от этого, ни одна из семи протестированных линий с SI-CTPP без метки 6 х His не продемонстрировала увеличенного уровня накопления сахарозы.
Таблица 6. Высокое содержание сахарозы в 20-ых междоузлиях корневых отпрысков линий с SI-CPTT
плюс 6 х His
Конструирование и отбор конструкций SI u трансгенных линий растений с фенотипом высокого
общего содержания сахара
На основе изучения репортерных конструкций можно сделать вывод, что сигнал СТРР, видимо, является менее эффективным, чем сигнал NTPP, для адресной доставки SI в вакуоли сахарного тростника,
при этом сохраняется значительная активность SI в цитозоле (Gnanasambandam & Birch, 2004). Даже в
случае сигнала NTPP часть сцепленного с ним белка может оставаться в цитозоле или неправильно адресоваться в другие клеточные компартменты при определенных условиях развития или физиологических
состояниях (Gnanasambandam & Birch, 2004). Эти эффекты могут быть более выражены в некоторых
- 42 -
008669
трансформантах по сравнению с другими за счет влияния различных окружающих ген последовательностей и различного расположения инсертированной последовательности при разных событиях трансформации. Вероятно, наличие метки 6 х His влияет на транспорт, стабильность и/или активность белка SI в
разных компартментах, хотя на уровне белка подробности этих эффектов пока не исследованы.
Благодаря комбинации таких эффектов, разные конструкции для экспрессии SI могут обеспечивать
получение определенной доли трансформантов с таким распределение активности SI, которое приводит
к развитию фенотипа с высоким общим уровнем сахара. В настоящем изобретении показано, что это возможно сделать через конструирование и отбор конструкций SI с целью увеличения пропорции трансформантов с разным составом полезных сахаров в пределах фенотипа с высоким содержанием сахара.
Например, NTPP-SI конструкции являются предпочтительными для отбора линий с высоким содержанием изомальтулозы, а конструкции SI-CTPPHis являются многообещающими для отбора линий с высоким
содержанием сахарозы в процессе развития стебля.
Скрининг трансформантов для отбора образцов желаемой категории их фенотипа высокого содержания сахаров является рутинной процедурой. Представленные здесь результаты получены с использованием корневых отпрысков сахарного тростника, отобранных при содержании в условиях теплицы на
ранних вегетативных генерациях после регенерации трансгенных линий сахарного тростника из каллюса
в ростки. Подобный скрининг возможен и для других видов растений, при этом начальные стадии отбора
будут обычно сопровождаться анализом размноженных растений, выращенных в условиях изолирующей
теплицы, и/или апробацией в полевых испытаниях.
Настоящее изобретение предусматривает и другие вариации в конструкциях SI для повышения частоты встречаемости и степени выраженности желательного фенотипа высокого содержания сахаров среди трансформантов. В частности, предусматривается предпочтительная экспрессия гена SI в определенных тканях, таких как запасающие ткани, и/или в определенных типах клеток, таких как запасающая паренхима, в комбинации с адресной доставкой белка SI в определенные клеточные компартменты, такие
как запасающие компартменты, для высокого выхода изомальтулозы или в метаболические компартменты для высокого выхода сахарозы. Оптимальные уровни активности SI будут варьировать в зависимости
от желаемой категории фенотипа высокого содержания сахаров. Например, относительно высокая активность в вакуолях зрелых стеблей может быть достигнута посредством соответствующего усиления
экспрессии и модификации белка SI для обеспечения устойчивости к протеазам, чтобы увеличить выход
изомальтулозы. Альтернативно этому, низкая активность в цитозоле может быть получена при использовании слабого промотора и/или модифицированной последовательности гена для создания мРНК и/или
белка с низкой стабильностью. Приведенные ниже в качестве примера конструкции сконструированы
для относительно слабой экспрессии, уровень которой изменяется по мере созревания стебля.
Клонирование и характеристика стебель-специфичного промотора Р67В
Последовательность и репортерная активность GUS в сахарном тростнике под контролем второго
гомолога промотора гена 67, специфичного для зрелых стеблей сахарного тростника
Ген 67 был описан ранее (Birch & Potier, 2000) как специфически экспрессирующийся в зрелых
стеблях сахарного тростника, что было показано с помощью Нозерн-блот анализа, однако соответствующая промоторная последовательность, выделенная из генома сахарного тростника, обеспечивала
экспрессию репортерного гена GUS преимущественно в незрелых стеблях. Используя геномную ДНК в
качестве матрицы для высокоточной ПЦР с праймерами, сконструированными на основе известного
промотора (обозначается как Р67А), был получен другой предполагаемый промотор, обозначенный
Р67В, имеющий 987 п.н., что на 60 п.н. короче, чем Р67А. Выравнивание двух версий промотора демонстрирует 92,98% идентичности между ними с четырьмя делециями (49 п.н. + 4 п.н. +1 п.н. + 1 п.н.), 2
инсерциями (1 п.н. + 1 п.н.) и 18 точечными мутациями в Р67В по сравнению с Р67А.
В 11 трансгенных линиях сахарного тростника с репортерными конструкциями P67B-GUS с использованием гистохимического и флуоресцентного анализа GUS не было обнаружено ее активности в
тканях листьев или корней. Активность GUS едва детектировалась с помощью гистохимического анализа в тканях стебля, что указывало на низкий уровень ее экспрессии. Флуоресцентный анализ с увеличением времени инкубации для повышения чувствительности метода показал увеличение активности по
мере созревания стеблей по меньшей мере в одной линии P67B-GUS, в противоположность более высокому уровню экспрессии в более молодых междоузлиях линии P67A-GUS (фиг. 20). Такой контраст в
характере экспрессии между этими линиями сохранялся в течение двух протестированных вегетативных
поколений.
Цитоплазматическая экспрессия гена UQ6SJ SI под контролем промоторов 67А и 67В
Высокая концентрация сахарозы была выявлена в некоторых растениях трансгенных линий с рекомбинантным геном UO68J SI под контролем промотора 67В. В листьях или корнях растений трансгенных линий, дающих положительный ответ в ПЦР-тестах на присутствие введенного гена SI под контролем промоторов Р67А и Р67В, изомальтулоза не была обнаружена. Она была выявлена в низких концентрациях (< 3 мМ) в тканях зрелых стеблей в 3/9 протестированных линий P67A-SI и в 8/18 протестированных линий P67B-SI, которые все демонстрировали нормальный рост и развитие.
Все отрицательные по изомальтулозе линии и восемь из одиннадцати положительных по изомаль- 43 -
008669
тулозе линий имели сходное общее содержание сахаров в зрелых междоузлиях по сравнению с контролем Q117. Три линии с геном SI под контролем промотора 67В (P67B68J1.5, P67B68J2.5 и P67B68J2.6)
накапливали примерно в 1,8 раз больше caxapa по сравнению с уровнем в контроле Q117. Увеличение
обеспечивалось преимущественно за счет повышения содержания сахарозы с разным вкладом за счет
увеличения содержания глюкозы и фруктозы (табл. 7).
Таблица 7. Содержание сахаров в двадцатых междоузлиях положительных по изомальтулозе растений
трансгенных линий с геном SI под контролем промоторов 67А или 67В и в контроле Q117
Раскрытие любого патента, заявки на патент и публикации, процитированных в данном изобретении, включается в настоящее изобретение во всей своей полноте путем отсылки.
Цитирование любой ссылки в настоящем изобретении не должно истолковываться как допущение,
что такая ссылка является «уровнем техники» по отношению к данной заявке.
Повсюду в описании изобретения основной целью было описание предпочтительных воплощений
изобретения без ограничения изобретения любым из этих воплощений или специфическим набором деталей. Специалисты в данной области должны принимать во внимание, в свете данного раскрытия изобретения, что в конкретные воплощения изобретения, приведенные в качестве примеров, могут быть
внесены различные модификации и изменения без отклонения от объема настоящего изобретения. Все
такие модификации и изменения должны рассматриваться как входящие в объем прилагаемой формулы
изобретения.
Список литературы
Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, eds (1990) Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons.
Bevan MW, Flavell RB, Chilton M-D (1983) A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker
for plant cell transformation. Nature 304,184-187.
Birch RG (1997) Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Molec. Biol. 48, 297-326.
Birch RG (2000) Sugarcane transformation: microprojectile bombardment of embryogenic callus & geneticin selection, www.botany.uq.edu.au/people/rbirch/scshooting.pdf (accessed 5 May 2004).
Birch RG, Potier BAM (2000) Sugarcane plant promoters to express heterologous nucleic acids. International Patent Specification PCT/AU99/01033; WO 01/18211 Al. Assigned to: The University of Queensland.
Birch RG, Wu L (2002) Sucrose isomerases. International Patent Specification WO 02/18603 Al publ.
7MAR2002. [US2004005589 Al 08JAN2004; AU 8160901 13MAR2002; PCT/AU01/01084 filed 29AUG2001;
AU PQ 9768 filed 29AUG2000] (Assigned to: University of Queensland).
Börnke F, Sonnewald U (2001a) Production of non-cariogenic sugars in transgenic plants. International
Patent Specification PCT/EP01/01603 AU200135474 lapsed 18DEC2003; WO 01/59136 Al publ. 16AUG2001
(De); PCT/EP01/01603 filed 14FEB2001 (De); DE 100 06 462.0 filed 14FEB2000 (De)].
Börnke F, Sonnewald U (2001b) Method for influencing the pollen development by modifying the sucrose
metabolism. Application: DE 100 06 413.2, 100 45 113.6, 14/2/2000, 13/9/2000. International Patent Application PCT/EPO/01412, WO 01/59135 Al, issued 16 August 2001.
Börnke F, Hajirezaei M, Heineke D, Melzer M, Herbers K, Sonnewald U (2002a) High-level production of
the non-cariogenic sucrose isomer palatinose in transgenic tobacco plants strongly impairs development. Planta
- 44 -
008669
214, 356-364.
Börnke F, Hajirezaei M, Sonnewald U (2002b) Potato tubers as bioreactors for palatinose production. J.
Biotechnol. 96, 119-124.
Botha FC, Sawyer BJB, Birch RG (2001) Sucrose metabolism in the culm of transgenic sugarcane with reduced soluble acid invertase activity. In Proceedings of the International Society of Sugarcane Technologists
XXIV Congress, Brisbane, September 2001, Volume II (Hogarth DM, ed) Mackay: ASSCT, pp. 588-591.
Bower R, Elliott AR, Potier BAM, Birch RG (1996) High-efficiency, microprojectile-mediated cotransformation of sugarcane, using visible or selectable markers. Molec. Breed. 2, 239-249.
Bradford M (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein
using the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Bugos RC, Chiang VL, Zhang XH, Campbell ER, Podila GK, Campbell WH (1995) RNA isolation from
plaint tissues recalcitrant to extraction in guanidine. BioTechniques 19, 734-737.
Christensen AH, Quail PH (1996) Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable
and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgen. Res. 5, 213-218.
Cortina C, Culianez-Macia FA (2004) Tomato transformation and transgenic plant production. Plant Cell
Tissue and Organ Culture 76, 269-275.
Demuth K, Jordening HJ, Buchholz K (2002) Oligosaccharide synthesis by dextransucrase: new unconventional acceptors. Carbohydrate Research 337, 1811-1820.
Fernie, AR, Roessner, U, Geigenberger, P (2001) The sucrose analog palatinose leads to a stimulation of
sucrose degradation and starch synthesis when supplied to discs of growing potato tubers. Plant Physiol. 125,
1967-1977.
Fernie AR, Willmitzer L, Trethewey RN (2002) Sucrose to starch: a transition in molecular plant physiology. Trends in Plant Science 7, 35-41.
Ganapathi TR, Higgs NS, Balint-Kurti PJ, Arntzen CJ, May GD, Van Eck JM (2001) Agrobacteriummediated transformation of embryogenic cell suspensions of the banana cultivar Rasthali (AAB). Plant Cell Reports 20, 157-162.
Gnanasambandam A, Birch RG (2004) Efficient developmental mis-targeting by the sporamin NTPP
vacuolar signal to plastids in young leaves of sugarcane and Arabidopsis. Plant Cell Reports Submitted.
Graan T, Ort DR (1984) Quantitation of the rapid electron donors to P700, the functional plastoquinone
pool, and the ratio of the photosystems in spinach chloroplasts. J. Biol. Chem. 259, 14003-14010.
Grant JE, Thomson LMJ, Pither-Joyce MD, Dale TM, Cooper PA (2003) Influence of Agrobacterium tumefaciens strain on the production of transgenic peas (Pisum sativum L.). Plant Cell Reports 21, 1207-1210.
Hansom S, Bower R, Zhang L, Potier B, Elliott A, Basnayake S, Cordeiro G, Hogarth DM, Cox M,
Berding N, Birch RG (1999) Regulation of transgene expression in sugarcane. In Proceedings of the International Society of Sugarcane Technologists XXIII Congress, New Delhi, February 1999, pp. 278-290. Edited by
V. Singh. New Dehli: STAI.
Hermann SR, Harding RM, Dale JL (2001) The banana actin 1 promoter drives near-constitutive transgene
expression in vegetative tissues of banana (Musa spp.). Plant Cell Reports 20, 525-530.
Jeoung JM, Krishnaveni S, Muthukrishnan S, Trick HN, Liang GH (2002) Optimization of sorghum transformation parameters using genes for green fluorescent protein and beta-glucuronidase as visual markers. Hereditas 137, 20-28.
Joersbo M, Mikkelsen JD, Вrunstedt J (2000) Relationship between promoter strength and transformation
frequencies using mannose selection for the production of transgenic sugar beet. Molecular Breeding 6, 207-213.
Kunz M, Mattes R, Munir M, Vogel M (2002) Transgenic plants which produce isomalt. International Patent Specification WO 02/27003 Al publ. 4APR2002 (De). [USA 2004/0064851 Al publ. 01APR2004 (En);
AU200176398 examination direction 18MAR2004; PCT/EP01/08055 filed 12JUL2001 (De); DE 100 47 286.9
filed 20SEP2000 (De)].
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227, 680-685.
Lessard PA, Kulaveerasingam H, York GM, Strong A, Sinskey AJ (2002) Manipulating gene expression
for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering 4, 67-79.
Loreti E, Alpi A, Perata P (2000) Glucose and disaccharide-sensing mechanisms modulate the expression
of alpha-amylase in barley embryos. Plant Physiol. 123, 939-948.
Martin MT, Cruces MA, Alcalde M, Plou FJ, Bernabe M, Ballesteros A (2004) Synthesis of maltooligosyl
fructofuranosides catalyzed by immobilized cyclodextrin glucosyltransferase using starch as donor. Tetrahedron
60, 529-534.
Mattes R, Klein K, Schiweck H, Kunz M, Munir M (1995) Preparation of acariogenic sugar substitutes. International Patent Specification WO 95/20047 A3 publ. 27JUL1995. [USA 2003207437 06NOV2003; USA
2003203468 30OCT2003; USA 2003087416 08MAY2003; USA 5985622 16NOV1999; USA 5786140
27JUL1998; AU 688848 19MAR1998; PCT/EP95/00165 filed 18JAN1995; DE 44 14 185 filed 22APR1994;
DE 44 01 451 filed 19JAN1994] (Assigned to: Sudzucker Aktiengellschaft).
Matzke AJM, Matzke MA (1998) Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes. Current
- 45 -
008669
Opinion in Plant Biology 1, 142-148.
Moore PH (1995) Temporal and spatial regulation of sucrose accumulation in the sugarcane stem. Australian Journal of Plant Physiology 22, 661-679.
Nguyen-Quoc B, Foyer CH (2001) A role for 'futile cycles' involving invertase and sucrose synthase in sucrose metabolism of tomato fruit. Journal of Experimental Botany 52, 881-889.
Park HE, Park NH, Kim MJ, Lee TH, Lee HG, Yang JY, Cha J (2003) Enzymatic synthesis of fructosyl
oligosaccharides by levansucrase from Microbacterium laevaniformans ATCC 15953. Enzyme and Microbial
Technology 32, 820-827.
Peach C, Velten J (1991) Transgene expression variability (position effect) of CAT and GUS reporter
genes driven by linked divergent T-DNA promoters. Plant Molecular Biology 17, 49-60.
Plou FJ, Martin MT, de Segura AG, Alcalde M, Ballesteros A (2002) Glucosyltransferases acting on starch
or sucrose for the synthesis of oligosaccharides. Canadian Journal of Chemistry-Revue Canadienne De Chimie
80, 743-752.
Polowick PL, Vandenberg A, Mahon JD (2002) Field assessment of outcrossing from transgenic pea
(Pisum sativum L.) plants. Transgenic Research 11, 515-519.
Saha BC (2004) Purification and characterization of a novel mannitol dehydrogenase from Lactobacillus
intermedius. Biotechnology Progress 20, 537-542.
Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn. New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Sinha AK, Hofmann MG, Romer U, Kockenberger W, Elling L, Roitsch T (2002) Metabolizable and nonmetabolizable sugars activate different signal transduction pathways in tomato. Plant Physiol. 128, 1480-1489.
Small I, Wintz H, Akashi K, Mireau H (1998) Two birds with one stone: genes that encode products targeted to two or more compartments. Plant Molecular Biology 38, 265-277.
Tadesse Y, Sagi L, Swennen R, Jacobs M (2003) Optimisation of transformation conditions and production
of transgenic sorghum (Sorghum bicolor) via microparticle bombardment. Plant Cell Tissue and Organ Culture
75, 1-18.
van der Veen BA, Potocki-Veronese G, Albenne C, Joucla G, Monsan P, Remaud-Simeon M (2004) Combinatorial engineering to enhance amylosucrase performance: construction, selection, and screening of variant
libraries for increased activity. FEBS Letters 560, 91-97.
Veronese T, Perlot P (1999) Mechanism of sucrose conversion by the sucrose isomerase of Serratia plymuthica ATCC 15928. Enzyme. Microb. Technol. 24, 263-269.
Vidal JR, Kikkert JR, Wallace PG, Reisch BI (2003) High-efficiency biolistic co-transformation and regeneration of 'Chardonnay' (Vitis vinifera L.) containing npt-II and antimicrobial peptide genes. Plant Cell Reports 22, 252-260.
Vitale A, Raikhel NV (1999) What do proteins need to reach different vacuoles? Trends in Plant Science 4,
149-155.
Wu L, Birch RG (2004) Characterisation of Pantoea dispersa UQ68J: producer of a highly efficient sucrose
isomerase for isomaltulose biosynthesis. Journal of Applied Microbiology. In press.
Wu L, Joshi CP, Chiang VL (2000) A xylem-specific cellulose synthase gene from aspen (Populus tremuloides) is responsive to mechanical stress. Plant Journal 22, 495-502.
Zhang CL, Chen DF, McCormac AC, Scott NW, Elliott MC, Slater A (2001) Use of the GFP reporter as a
vital marker for Agrobacterium-mediated transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.). Molecular Biotechnology 17, 109-117.
Zhang S, Williams-Carrier R, Lemaux PG (2002) Transformation of recalcitrant maize elite inbreds using
in vitro shoot meristematic cultures induced from germinated seedlings. Plant Cell Reports 21, 263-270.
Zhifang G, Loescher WH (2003) Expression of a celery mannose 6-phosphate reductase in Arabidopsis
thaliana enhances salt tolerance and induces biosynthesis of both mannitol and a glucosyl-mannitol dimer. Plant
Cell and Environment 26, 275-283.
- 46 -
008669
- 47 -
008669
- 48 -
008669
- 49 -
008669
- 50 -
008669
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения растения с запасающей тканью, которая имеет повышенное общее содержание
углеводов, или повышенное общее содержание запасных или неструктурных углеводов, или повышенное
содержание растворимых углеводов или повышенную сахаристость с повышенным содержанием эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения, включающий отбор из множества трансгенных растений, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид,
функционально связанный с регуляторным элементом транскрипции и кодирующий метаболизирующий
сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар,
трансгенного растения, которое продуцирует фермент, метаболизирующий сахар, на таком уровне или с
такой функциональной активностью, что общее содержание углеводов или общее содержание запасных
или неструктурных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения является увеличенным или
содержание растворимых углеводов, или сахаристость запасающей ткани трансгенного растения является увеличенным вместе с увеличением содержания эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения.
2. Способ получения растения, имеющего запасающую ткань с повышенным содержанием сахаро- 51 -
008669
зы, или повышенным содержанием эндогенных углеводов без снижения общего содержания углеводов
или накоплением чужеродного сахара с меньшим, чем соизмеримое, снижением содержания эндогенных
углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения, включающий
отбор из множества трансгенных растений, которые имеют в своем нуклеоме полинуклеотид, функционально связанный с регуляторным элементом транскрипции и кодирующий метаболизирующий сахар
фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, трансгенного растения, которое продуцирует фермент, метаболизирующий сахар, на таком уровне или с такой
функциональной активностью, что содержание сахарозы в запасающей ткани трансгенного растения является увеличенным, или содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения
является увеличенным без снижения общего содержания углеводов, или чужеродный сахар накапливается в запасающей ткани трансгенного растения с меньшим, чем соизмеримое, снижением содержания эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения.
3. Способ по п.1 или 2, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется в клетках растения на
уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
4. Способ по любому из пп.1-3, где метаболизирующий сахар фермент включает в себя адресующий
сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент растения, используемый для запасания сахаров.
5. Способ по п.4, где метаболизирующий сахар фермент распределяется между цитозолем и запасающими компартментами.
6. Способ по п.4, где метаболизирующий сахар фермент, по существу, заключен в запасающий компартмент.
7. Способ по любому из пп.4-6, где запасающий компартмент выбирают из вакуоли или из вакуоли
и апоплазматического пространства.
8. Способ по любому из пп.1 или 2 и 4-7, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется
клетками растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению по
меньшей мере около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
9. Способ по п.8, где превращение осуществляется в тканях, в которых, по существу, прекращены
клеточное деление и/или клеточный рост и которые предназначены для запасания углеводов.
10. Способ по п.9, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется клетками растения на
уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар в тканях, претерпевающих клеточное деление и/или клеточный
рост, обеспечивающие рост растения.
11. Способ по п.1 или 2, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется клетками растения
за счет экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент.
12. Способ по п.11, где полинуклеотид, кодирующий фермент, экспрессируется конститутивно.
13. Способ по п.11, где полинуклеотид, кодирующий фермент, экспрессируется селективно.
14. Способ по п.11, где полинуклеотид, кодирующий фермент, селективно экспрессируется в запасающей ткани растения.
15. Способ по п.1 или 2, где запасающую ткань выбирают из тканей корней, клубней, побегов, стеблей, плодов или семян.
16. Способ по п.1 или 2, где растение способно накапливать сахарозу или другие сахара в качестве
запасных продуктов.
17. Способ по п.1 или 2, где растение выбирают из трав, овощных, зерновых, бобовых или плодовых культур.
18. Способ по п.17, где растение выбирают из сахарного тростника, сахарной свеклы, сладкого сорго, сладкой кукурузы, гороха, винограда, томатов или бананов.
19. Способ по п.1 или 2, где эндогенный сахар и чужеродный сахар выбирают из моносахаридов,
олигосахаридов и производных сахаров.
20. Способ по п.19, где производные сахаров выбирают из сахароспиртов, сахарных кислот, аминосахаров, дезоксисахаров, метилсахаров, сахарофосфатов и УДФ-сахаров.
21. Способ по п.1 или 2, где эндогенный сахар является сахарозой и чужеродный сахар выбирают из
изомальтулозы и трегалулозы.
22. Способ по п.21, где метаболизирующим сахар ферментом является сахарозоизомераза.
23. Способ по п.21, где метаболизирующим сахар ферментом является изомальтулозосинтаза.
24. Способ по п.21, где метаболизирующим сахар ферментом является UQ68J.
25. Способ по п.1 или 2, где растворимые углеводы выбирают из сахарозы, глюкозы и фруктозы.
26. Запасающая клетка трансгенного растения, которая имеет повышенное общее содержание углеводов, или повышенное содержание запасных или неструктурных углеводов, или повышенное содержание растворимых углеводов с повышенным содержанием эндогенных углеводов по сравнению с клеткой
контрольного растения, содержащая в своем нуклеоме регуляторный элемент транскрипции, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим метаболизирующий сахар фермент, который ката- 52 -
008669
лизирует превращение эндогенного сахара в растительной клетке в чужеродный сахар, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что
общее содержание углеводов или общее содержание запасных или неструктурных углеводов в клетке
трансгенного растения является увеличенным, или содержание растворимых углеводов в запасающей
ткани трансгенного растения является увеличенным вместе с увеличением содержания эндогенных углеводов по сравнению с таковыми клетки контрольного растения.
27. Запасающая клетка трансгенного растения, которая имеет повышенное содержание сахарозы
или повышенное содержание эндогенных углеводов без снижения содержания общих углеводов или накопление чужеродного сахара с менее чем соизмеримым уменьшением содержания эндогенных углеводов по сравнению с клеткой контрольного растения, содержащая в своем нуклеоме полинуклеотид,
функционально связанный с регуляторным элементом транскрипции и кодирующий метаболизирующий
сахар фермент, который катализирует превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар,
где метаболизирующий сахар фермент продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что содержание сахарозы в запасающих клетках трансгенного растения является увеличенным, или содержание эндогенных углеводов в запасающих клетках трансгенного растения является увеличенным без снижения общего содержания углеводов, или чужеродный сахар накапливается в запасающей клетке трансгенного растения с менее чем соизмеримым, снижением содержания эндогенных
углеводов по сравнению с запасающей клеткой контрольного растения.
28. Запасающая клетка трансгенного растения по п.26 или 27, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется клеткой растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят
к превращению менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
29. Клетка трансгенного растения по любому из пп.26-28, где метаболизирующий сахар фермент
включает в себя адресующий сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент растения, используемый для запасания сахаров.
30. Клетка трансгенного растения по п.29, где метаболизирующий сахар фермент распределяется
между цитозолем и запасающими компартментами.
31. Клетка трансгенного растения по п.29, где метаболизирующий сахар фермент, по существу, заключен в запасающий компартмент.
32. Клетка трансгенного растения по любому из пп.29-31, где запасающий компартмент выбирают
из вакуоли или из вакуоли и апоплазматического пространства.
33. Клетка трансгенного растения по любому из пп.26, 27 и 29-32, где метаболизирующий сахар
фермент продуцируется на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению по меньшей мере около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
34. Клетка трансгенного растения по п.33, где превращение осуществляется в тканях, в которых, по
существу, прекращены клеточное деление и/или клеточный рост и которые предназначены для запасания
углеводов.
35. Клетка трансгенного растения по п.34, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется
клетками растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению
менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар в тканях, претерпевающих клеточное деление и/или клеточный рост, обеспечивающие рост растения.
36. Клетка трансгенного растения по любому из пп.26-35, где клетка растения является клеткой
стебля растений.
37. Клетка трансгенного растения по п.36, где растением является сахарный тростник.
38. Клетка трансгенного растения по п.26 или 27, где растворимые углеводы выбирают из простых
сахаров.
39. Клетка трансгенного растения по п.38, где простой сахар выбирают из сахарозы, глюкозы и
фруктозы.
40. Трансгенное растение, имеющее запасающую ткань с повышенным общим содержанием углеводов, или с повышенным общим содержанием запасных или неструктурных углеводов, или повышенным содержанием растворимых углеводов или сахаристости с повышенным содержанием эндогенных
углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения, содержащее
клетки, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид, который кодирует метаболизирующий сахар
фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, где полинуклеотид функционально связан с регуляторным элементом транскрипции, являющимся функциональным
в клетках растения, и где метаболизирующий сахар фермент продуцируется на таком уровне или с такой
функциональной активностью, что общее содержание углеводов или общее содержание запасных или
неструктурных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения является увеличенным, содержание растворимых углеводов или сахаристость запасающей ткани трансгенного растения являются увеличенными вместе с увеличением содержания эндогенных углеводов по сравнению с таковыми соответствующей запасающей ткани контрольного растения.
41. Трансгенное растение, имеющее запасающую ткань, которая имеет повышенное содержание сахарозы или повышенное содержание эндогенных углеводов без снижения общего содержания углеводов,
- 53 -
008669
или накопление чужеродного сахара с менее чем соизмеримым уменьшением содержания эндогенных
углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения, содержащее
клетки, имеющие в своем нуклеоме полинуклеотид, который кодирует метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, где полинуклеотид функционально связан с регуляторным элементом транскрипции, являющимся функциональным в
клетках растения, и где метаболизирующий сахар фермент продуцируется на таком уровне или с такой
функциональной активностью, что содержание сахарозы в запасающей ткани трансгенного растения является увеличенным, или содержание эндогенных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения
является увеличенным без снижения общего содержания углеводов, или чужеродный сахар накапливается в запасающей ткани трансгенного растения с менее чем соизмеримым снижением содержания эндогенных углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного растения.
42. Трансгенное растение по п.40 или 41, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется
клетками растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению
менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
43. Трансгенное растение по любому из пп.40-42, где метаболизирующий сахар фермент включает в
себя адресующий сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент растения, используемый для запасания сахара.
44. Трансгенное растение по п.43, где метаболизирующий сахар фермент распределяется между цитозолем и запасающими компартментами.
45. Трансгенное растение по п.43, где метаболизирующий сахар фермент, по существу, заключен в
запасающий компартмент.
46. Трансгенное растение по любому из пп.43-45, где запасающий компартмент выбирают из вакуоли или из вакуоли и апоплазматического пространства.
47. Трансгенное растение по любому из пп.40, 41 и 43-46, где метаболизирующий сахар фермент
продуцируется клетками растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к
превращению по меньшей мере около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
48. Трансгенное растение по п.47, где превращение осуществляется в тканях, в которых, по существу, прекращены клеточное деление и/или клеточный рост и которые предназначены для запасания углеводов.
49. Трансгенное растение по п.48, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется клетками
растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению менее чем
около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар в тканях, претерпевающих клеточное деление и/или
клеточный рост, обеспечивающие рост растения.
50. Трансгенное растение по любому из пп.40-49, где клетки растения являются клетками стебля
растения.
51. Трансгенное растение по п.50, где растением является сахарный тростник.
52. Трансгенное растение по п.40 или 41, где растворимые углеводы выбирают из простых сахаров.
53. Трансгенное растение по п.52, где простые сахара выбирают из сахарозы, глюкозы и фруктозы.
54. Запасающая ткань трансгенного растения, имеющая повышенное общее содержание общих углеводов, или повышенное общее содержание общих запасных или неструктурных углеводов, или повышенное содержание растворимых углеводов или сахаристость с повышенным содержанием эндогенных
углеводов по сравнению с запасающей тканью контрольного растения, содержащая клетки, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид, который кодирует метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, где полинуклеотид функционально связан с регуляторным элементом транскрипции, являющимся функциональным, по меньшей
мере, в некоторых клетках растения, и где метаболизирующий сахар фермент продуцируется в производящей и/или запасающей тканях на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее
содержание углеводов или общее содержание запасных или неструктурных углеводов в запасающей ткани трансгенного растения является увеличенным, или содержание растворимых углеводов или сахаристость трансгенной запасающей ткани являются увеличенными вместе с увеличением содержания эндогенных углеводов по сравнению с таковыми запасающей ткани контрольного растения.
55. Запасающая ткань трансгенного растения, имеющая повышенное содержание сахарозы или повышенное содержание эндогенных углеводов без снижения содержания общих углеводов, или накопление чужеродного сахара с менее чем соизмеримым уменьшением содержания эндогенных углеводов по
сравнению с запасающей тканью контрольного растения, содержащая клетки, содержащие в своем нуклеоме полинуклеотид, который кодирует метаболизирующий сахар фермент, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, где полинуклеотид функционально связан с
регуляторным элементом транскрипции, являющимся функциональным, по меньшей мере, в некоторых
клетках растения, и где метаболизирующий сахар фермент продуцируется в производящих и/или запасающих тканях на таком уровне или с такой функциональной активностью, что содержание сахарозы в
трансгенной запасающей ткани является увеличенным, или содержание эндогенных углеводов в трансгенной запасающей ткани является увеличенным без снижения общего содержания углеводов, или чуже- 54 -
008669
родный сахар накапливается в трансгенной запасающей ткани с менее чем соизмеримым снижением содержания эндогенных углеводов по сравнению с запасающей тканью контрольного растения.
56. Запасающая ткань трансгенного растения по п.54 или 55, где запасающая ткань выбирается их
тканей плодов, семян, побегов, стеблей, клубней или корней.
57. Запасающая ткань трансгенного растения по любому из пп.54-56, где метаболизирующий сахар
фермент продуцируется клетками растения на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
58. Запасающая ткань трансгенного растения по любому из пп.54-57, где метаболизирующий сахар
фермент включает в себя адресующий сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент растения, используемый для запасания сахаров.
59. Запасающая ткань трансгенного растения по п.58, где метаболизирующий сахар фермент распределяется между цитозолем и запасающими компартментами.
60. Запасающая ткань трансгенного растения по п.58, где метаболизирующий сахар фермент, по
существу, заключен в запасающий компартмент.
61. Запасающая ткань трансгенного растения по любому из пп.58-60, где запасающий компартмент
выбирают из вакуоли или из вакуоли и апоплазматического пространства.
62. Запасающая ткань трансгенного растения по любому из пп.54, 55 и 57-61, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется клетками растения на уровне или с функциональной активностью,
которые приводят к превращению по меньшей мере около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
63. Запасающая ткань трансгенного растения по п.62, где превращение осуществляется в тканях, в
которых, по существу, прекращены клеточное деление и/или клеточный рост и которые предназначены
для запасания углеводов.
64. Запасающая ткань трансгенного растения по п.63, где метаболизирующий сахар фермент продуцируется на уровне или с функциональной активностью, которые приводят к превращению менее чем
около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар в тканях, претерпевающих клеточное деление и/или
клеточный рост, обеспечивающие рост растения.
65. Запасающая ткань трансгенного растения по любому из пп.54-64, где клетки растения являются
клетками стебля растения.
66. Запасающая ткань трансгенного растения по п.65, где растением является сахарный тростник.
67. Запасающая ткань трансгенного растения по п.54 или 55, где растворимые углеводы выбирают
из простых сахаров.
68. Запасающая ткань трансгенного растения по п.67, где простые сахара выбирают из сахарозы,
глюкозы и фруктозы.
69. Способ получения растворимых углеводов, включающий выделение растворимых углеводов из
растения по любому из пп.40-53 или из запасающей ткани по любому из пп.54-68.
70. Способ по п.69, где растворимые сахара выбирают из простых сахаров, включая сахарозу, глюкозу и фруктозу.
71. Способ получения продукта путем ферментации, включающий ферментацию углеводов, которые являются субстратами для ферментации и которые получены способом по п.69.
72. Способ по п.71, где образующийся продукт ферментации включает по меньшей мере одно вещество, выбираемое из этанола, метанола, 1,3-пропандиола, уксусной кислоты, лимонной кислоты, янтарной кислоты, молочной кислоты, сорбита, лизина, полигидроксиалканоата, двуокиси углерода, использующихся в промышленности фермента или полимера, включающего любое из указанных веществ.
73. Запасающая клетка трансгенного растения, которая содержит чужеродный сахар, где трансгенное растение содержит в своем нуклеоме регуляторный элемент транскрипции, функционально связанный с полинуклеотидом, который кодирует фермент, метаболизирующий сахар, который катализирует
превращение эндогенного сахара растения в чужеродный сахар, где фермент, метаболизирующий сахар,
содержит адресующий сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахара в клетке растения, что приводит к накоплению чужеродного сахара с менее
чем соизмеримым снижением в растении содержания эндогенных углеводов.
74. Клетка трансгенного растения по п.73, где субклеточный компартмент выбирается из вакуоли
или вакуоли и апоплазматического пространства.
75. Трансгенное растение, имеющее запасающую ткань, которая содержит чужеродный сахар,
включающее клетки, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид, который кодирует фермент,
метаболизирующий сахар, катализирующий превращение эндогенного сахара растения в чужеродный
сахар, и который функционально связан с регуляторным элементом транскрипции, который является
функциональным в клетках растения, где фермент, метаболизирующий сахар, содержит адресующий
сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахара
в клетке растения, что приводит к накоплению чужеродного сахара с менее чем соизмеримым снижением в растении содержания эндогенных углеводов.
76. Трансгенное растение по п.75, где субклеточный компартмент выбирают из вакуоли или вакуоли и апоплазматического пространства.
- 55 -
008669
77. Способ увеличения общего содержания растворимых углеводов запасающей ткани сахарного
тростника, включающий продуцирование в клетках сахарного тростника фермента сахарозоизомеразы,
который катализирует превращение сахарозы в чужеродный сахар, который в норме не продуцируется в
сахарном тростнике на той же стадии развития, где чужеродный сахар выбирают из изомальтулозы и
трегалулозы и где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание растворимых углеводов в запасающей ткани сахарного тростника является повышенным по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного сахарного тростника.
78. Способ по п.77, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой
функциональной активностью, которая приводит к превращению менее чем около 20% сахарозы в чужеродный сахар.
79. Способ по п.77 или 78, где фермент сахарозоизомераза включает адресующий сигнал, который
направляет фермент в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахара.
80. Способ по п.79, где фермент сахарозоизомераза распределяется между цитоплазмой и запасающими компартментами.
81. Способ по п.79, где фермент сахарозоизомераза, по существу, заключен в запасающий компартмент.
82. Способ по любому из пп.79-81, где запасающий компартмент выбирают из вакуоли или вакуоли
и апоплазматического пространства.
83. Способ по любому из пп.77 и 79-82, где фермент сахарозоизомераза продуцируется в клетках
растения на таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению
по меньшей мере около 20% сахарозы в чужеродный сахар.
84. Способ по п.83, где превращение осуществляется в тканях, в которых, по существу, прекращены
клеточное деление и/или клеточный рост и которые предназначены для запасания углеводов.
85. Способ по п.84, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой
функциональной активностью, которая приводит к превращению менее чем около 20% сахарозы в чужеродный сахар в ткани, претерпевающей клеточное деление и/или клеточный рост, обеспечивающие рост
растения.
86. Способ по любому из пп.77-85, где чужеродный сахар накапливается с менее чем соизмеримым
снижением содержания эндогенных сахаров или углеводов.
87. Запасающая клетка трансгенного сахарного тростника, которая имеет повышенное общее содержание растворимых углеводов по сравнению с запасающей клеткой контрольного сахарного тростника, содержащая в своем нуклеоме регуляторный элемент транскрипции, функционально связанный с полинуклеотидом, который кодирует фермент сахарозоизомеразу, катализирующий превращение сахарозы
в чужеродный сахар, который не продуцируется в тех же условиях клеткой контрольного сахарного тростника, которая не продуцирует сахарозоизомеразу, где чужеродный сахар выбирается из изомальтулозы
и трегалулозы, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание растворимых углеводов в клетке запасающей ткани сахарного тростника является увеличенным по сравнению с таковым в клетке соответствующей запасающей
ткани контрольного сахарного тростника.
88. Трансгенная клетка сахарного тростника по п.87, где фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению менее чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
89. Трансгенная клетка сахарного тростника по п.87 или 88, где фермент сахарозоизомераза включает адресующий сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент, используемый для
запасания сахара.
90. Трансгенная клетка сахарного тростника по п.89, где фермент сахарозоизомераза распределяется между цитоплазмой и запасающими компартментами.
91. Трансгенная клетка сахарного тростника по п.89, где фермент сахарозоизомераза, по существу,
заключен в запасающий компартмент.
92. Трансгенная клетка сахарного тростника по любому из пп.89-91, где запасающий компартмент
выбирают из вакуоли или вакуоли и апоплазматического пространства.
93. Трансгенная клетка сахарного тростника по пп.87 и 89-92, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению по меньшей мере около 20% сахарозы в чужеродный сахар, где клетка, по существу, прекратила
клеточное деление и/или клеточный рост и является функциональной в отношении запасания углеводов.
94. Трансгенная клетка сахарного тростника по пп.87 и 89-92, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, которые приводят к превращению менее чем около 20% сахарозы в чужеродный сахар, где клетки претерпевают клеточное деление
и/или рост.
95. Трансгенная клетка сахарного тростника по любому из пп.87-94, где чужеродный сахар накапливается с менее чем соизмеримым снижением содержания эндогенных сахаров или углеводов.
- 56 -
008669
96. Трансгенная клетка сахарного тростника по любому из пп.91-95, где клеткой сахарного тростника является клетка побега.
97. Трансгенная клетка сахарного тростника по п.96, где клеткой сахарного тростника является
клетка паренхимы.
98. Трансгенный сахарный тростник, запасающая ткань которого имеет повышенное содержание
общих растворимых углеводов по сравнению с соответствующей запасающей тканью контрольного сахарного тростника, содержащий клетки, которые содержат в своем нуклеоме полинуклеотид, который
кодирует фермент, метаболизирующий сахар, катализирующий превращение сахарозы в чужеродный
сахар, который не продуцируется эндогенно соответствующими клетками контрольного сахарного тростника, не продуцирующего такой фермент, где чужеродный сахар выбирают из изомальтулозы и трегалулозы, и где полинуклеотид функционально связан с регуляторным элементом транскрипции, который
является функциональным в клетках растения, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком
уровне или с такой функциональной активностью, что общее содержание растворимых сахаров в запасающей ткани сахарного тростника является увеличенным по сравнению с соответствующей запасающей
тканью контрольного сахарного тростника.
99. Трансгенный сахарный тростник по п.98, где фермент, метаболизирующий сахар, продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, которые приводят к превращению менее
чем около 20% эндогенного сахара в чужеродный сахар.
100. Трансгенный сахарный тростник по п.98 или 99, где фермент сахарозоизомераза включает адресующий сигнал, который направляет фермент в субклеточный компартмент, используемый для запасания сахара.
101. Трансгенный сахарный тростник по п.100, где фермент сахарозоизомераза распределяется между цитоплазмой и запасающими компартментами.
102. Трансгенный сахарный тростник по п.100, где фермент сахарозоизомераза, по существу, заключен в запасающий компартмент.
103. Трансгенный сахарный тростник по любому из пп.100-102, где запасающий компартмент выбирают из вакуоли или вакуоли и апоплазматического пространства.
104. Трансгенный сахарный тростник из пп.98 и 100-103, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на таком уровне или с такой функциональной активностью, которые приводят к превращению по
меньшей мере около 20% сахарозы в чужеродный сахар.
105. Трансгенный сахарный тростник по п.104, где превращение осуществляется в тканях, которые
по существу прекратили деление клеток и/или рост клеток и которые функциональны в отношении запасания углеводов.
106. Трансгенный сахарный тростник по п.104, где фермент сахарозоизомераза продуцируется на
таком уровне или с такой функциональной активностью, которая приводит к превращению менее чем
около 20% сахарозы в чужеродный сахар в тканях, претерпевающих деление клеток и/или рост клеток,
обеспечивающие рост растения.
107. Трансгенный сахарный тростник по любому из пп.98-106, где чужеродный сахар накапливается с менее чем соизмеримым снижением содержания эндогенных сахаров или углеводов.
108. Трансгенный сахарный тростник по любому из пп.98-107, где запасающей тканью является
ткань побега.
109. Изолированная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, которая соответствует или является комплементарной последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, или ее
биологически активной части, или её варианту, имеющему последовательность, идентичную по меньшей
мере на около 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности, представленной в SEQ ID NO:10.
110. Изолированная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, которая соответствует или является комплементарной последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, или ее
варианту, имеющему последовательность, идентичную по меньшей мере на около 93% последовательности, представленной в SEQ ID NO:10.
111. Изолированная молекула ДНК, включающая нуклеотидную последовательность, которая не
содержит последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, и которая гибридизуется в условиях, по
меньшей мере, средней строгости с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:10.
112. Химерная ДНК-конструкция, включающая молекулу ДНК по любому из пп.109-111, функционально связанную с чужеродной или эндогенной нуклеотидной последовательностью, подлежащей
транскрипции.
113. Способ получения трансформированных растительных клеток, включающий введение в способные к регенерации клетки растения химерной ДНК-конструкции по п.112 для получения трансформированных растительных клеток и идентификацию или отбор трансформированных растительных клеток.
114. Способ отбора стабильных генетических трансформантов из трансформированных растительных клеток, включающий введение в способные к регенерации клетки растения химерной ДНКконструкции по п.112 для получения трансформированных растительных клеток и идентификацию или
- 57 -
008669
отбор линии трансформированных растительных клеток из трансформированных растительных клеток.
115. Способ получения дифференцированного трансгенного растения, включающий введение химерной ДНК-конструкции по п.112 в способные к регенерации клетки растения для получения способных к регенерации трансформированных растительных клеток и идентификацию или отбор популяции
трансформированных клеток и регенерацию дифференцированного трансгенного растения из популяции.
116. Клетка растения, включающая химерную ДНК-конструкцию по п.112.
117. Дифференцированное растение, включающее клетку, которая содержит химерную ДНКконструкцию по п.112.
118. Способ получения повышенных выходов желаемого метаболита, включающий экспрессию в
организме введенного полинуклеотида, кодирующего фермент, который катализирует превращение эндогенного вещества-субстрата, которое в норме ощущается организмом, в вещество-продукт, которое не
воспринимается организмом эквивалентным образом, что приводит к изменению метаболических потоков и накоплению повышенных количеств желаемых эндогенных веществ.
119. Способ по п.118, где вещество-продукт не метаболизируется организмом.
120. Способ по п.118 или 119, где вещество-продукт является изомером вещества-субстрата, которое организм в норме ощущает.
121. Способ по любому из пп.119-120, где продукт введенного гена распределяется между метаболически активным компартментом цитозоля и компартментами запасания метаболитов.
122. Способ по п.121, где компартмент запасания метаболитов выбирают из вакуоли или вакуоли и
внеклеточных пространств.
123. Способ по любому из пп.118-122, где активность, обеспечивающая превращение, селективно
включается в запасающие ткани организма, но не в ткани, претерпевающие активный рост и в качестве
предшественников запасающих тканей.
124. Способ по любому из пп.118-123, где желаемые метаболиты включают эндогенные веществасубстраты.
125. Способ получения изомальтулозы, включающий экспрессию в растении, которое в норме накапливает сахарозу в качестве запасного резерва, введенного полинуклеотида, который кодирует сахарозоизомеразу UQ68J, которая при необходимости модифицирована для селективного ограничения активности сахарозоизомеразы в запасающем сахарозу компартменте.
126. Способ по п.125, где растение выбирают из сахарного тростника, сорго или сахарной свеклы.
127. Способ по п.125, где запасающий сахарозу компартмент выбирают из запасающей сахарозу вакуоли или вакуоли и внеклеточного пространства.
128. Способ по п.125, где экспрессия полинуклеотида предпочтительно осуществляется в зрелых
запасающих сахарозу тканях, включая побег растения.
129. Способ по любому из пп.125-128, дополнительно включающий выделение изомальтулозы из
растения.
Фиг. 1
- 58 -
008669
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
- 59 -
008669
Фиг. 5
Фиг. 6
- 60 -
008669
Фиг. 7
Фиг. 8
- 61 -
008669
Фиг. 9
Фиг. 10
Фиг. 11
- 62 -
008669
Фиг. 12
Фиг. 13
- 63 -
008669
Фиг. 14
Фиг. 15
Фиг. 16
- 64 -
008669
Фиг. 17
Фиг. 18
- 65 -
008669
Фиг. 19
Фиг. 20
- 66 -
008669
Фиг. 21
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 67 -