Разработка метода доставки в клетки пептидо

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и
фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
На правах рукописи
Амирханов Ринат Нариманович
Разработка метода доставки в клетки пептидо-нуклеиновых
кислот в составе их композитов с наночастицами диоксида
титана
02.00.10 – биоорганическая химия
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Научный руководитель:
д.х.н., профессор
Зарытова Валентина Филипповна
НОВОСИБИРСК 2015
Содержание
Список сокращений…………………………………………………………………………………..5
Введение………………………………………………………………………………………………..8
Глава 1. Наночастицы и наноконструкции как транспортёры нуклеиновых кислот (обзор
литературы) ……………………………………...…………………………….…………….12
1.1. Органические наночастицы……………………………………………………………………...13
1.1.1. Методы получения органических наночастиц………………………………………………..14
1.2. Неорганические наночастицы…………………………………………………………………...15
1.2.1. Методы получения неорганических наночастиц …………………………………………….17
1.2.2. Способы модификации поверхности неорганических наночастиц………………………….19
1.3. Визуализация наночастиц и наноконструкций на их основе…………………………………..24
1.4. Взаимодействие наночастиц с эукариотическими клетками…………………………………..25
1.4.1. Влияние наночастиц на жизнеспособность эукариотических клеток……………………….26
1.4.2. Защита нуклеиновых кислот наночастицами от действия нуклеаз………………………….28
1.4.3. Транспорт наночастиц, содержащих НК и другие препараты, в эукариотические клетки и
их биологический эффект после доставки ……………………………………………..…....29
1.5. Проблема эффективного выхода НК, доставленных в клетки, из эндосом…………………....40
1.6. Выход НК и других соединений из состава комплекса с наночастицами……………………..43
1.7. Проблемы адресной доставки наночастиц с НК к клеткам-мишеням………………………....44
Заключение к обзору литературы………………………………………………………………….....45
Глава 2. Материалы и методы……………………………………………………………………...47
2.1. Приготовление 0.2 мМ раствора полилизина в воде……………………………………………48
2.2. УФ-спектрометрия ДНК и ПНК олигонуклеотидов…………………………………..………..48
2.3. Флуоресцентная спектрометрия ПНК олигонуклеотидов……………………………………..48
2.4. Обращённо-фазовая ВЭЖХ ПНК олигонуклеотида……………………………………………48
2.5. Обращённо-фазовая ВЭЖХ ДНК олигонуклеотида…………………………………………....49
2.6. Получение ДНК и ПНК олигонуклеотидов……………………………………………..………49
2.7. Введение радиоактивной метки в ДНК олигонуклеотид………………………………...……..49
2.8. Введение флуоресцентной метки в ПНК олигонуклеотид……………………………………50
2.9. Получение ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов………………………………………………….50
2.10. Получение комплексов ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов с полилизином………………....51
2
2.11. Термическая денатурация свободных ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов и их комплексов с
полилизином в растворе……………………………………………………………………....51
2.12. Измерение оптического поглощения смеси ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексов и их
комплексов с полилизином в зависимости от времени ……………………………………..52
2.13. Получение наночастиц диоксида титана………………………………………………………52
2.14. Получение наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином…………………………..52
2.15. Иммобилизация одноцепочечной ДНК на TiO2•PL композитах……………………………..53
2.16. Иммобилизация ДНК/ПНК дуплекса на TiO2•PL композитах………………………………..53
2.17. Исследование температурной зависимости десорбции ПНК из TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита………………………………………………………………………………...53
2.18.
Исследование
временной
зависимости
десорбции
ПНК
из
TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита…………………………………………………………………………….…..54
2.19. Оценка выживаемости клеток MDCK с помощью MTT реагента…..………………………..55
2.20. Исследование способности TiO2•PL• ДНК/FluПНК нанокомпозита проникать в клетки HeLa
с помощью конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии…………..…………..55
2.21. Исследование способности TiO2•PL• ДНК/ПНК нанокомпозита проникать в клетки MDCK
с помощью проточной цитофлуорометрии……………………………………………….....56
2.22. Противовирусная активность TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов…………………………56
Глава 3. Результаты и обсуждения………………………………………………………………...58
3.1. Синтез ПНК……………………………………………………………………………………….59
3.2. Синтез ПНК-олигомера (FluПНК), содержащего флуоресцентную метку……..……………...60
3.3. Комплексообразующие свойства синтезированного олигомера ПНК……………..………….62
3.4. Синтез и характеризация наночастиц диоксида титана………………………………………...63
3.5. Иммобилизация ПНК в составе ДНК/ПНК дуплекса на наночастицах TiO2, покрытых
полилизином…………………………………………………………………………………..64
3.5.1 Оптимизация условий иммобилизации ДНК на наночастицах TiO2, покрытых
полилизином…………………………………………………………………………………..65
3.5.2.
Структуры
TiO2•PL
композитов
в
зависимости
от
мольного
соотношения
PL/TiO2………………………………………………………………………………………...67
3.6. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов в физиологическом
растворе………………………………………………………………………………………..69
3.6.1. Влияние полилизина на термическую денатурацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов…..69
3.6.2. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов с течением
времени………………………………………………………………………………………...72
3
3.6.3. Возможные структуры комплексов, образуемых полилизином с ДНК/ДНК и ДНК/ПНК
дуплексами…………………………………………………………………………...………..73
3.7. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах TiO2, покрытых
полилизином. Зависимость от температуры....……………………………………………...75
3.8. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах TiO2, покрытых
полилизином. Зависимость от времени ………………………...…………………………....79
3.9.
Исследование
влияния
нанокомпозитов
TiO2•PL•ДНК/ПНК
на
жизнеспособность
эукариотических клеток……………………………………………………………………....85
3.10. Способность TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в эукариотические клетки....87
3.11. Испытание биологической активности TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов на примере
клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)…………………..89
Выводы………………………………………………………………………………………………...96
Список литературы…………………………………………………………………………………....97
4
Список сокращений
447
поли(β-амино эфир)
AEEA
аминоэтоксиэтоксиацетил
ALE
алендроновая кислота или алендронат
APTES
3-аминопропилтриэтоксисилан
Bhoc
бензгидрилоксикарбонил
C18 TMS
октадецилтриметоксисилан
CaP
фосфат кальция
Cit
цитраконовый ангидрид
cРНК
РНК комплементарная vРНК
D
ДНК/ДНК дуплекс
DIEA
N,N-диизопропилэтиламин
DODAB
диметилдиоктадециламмоний бромид
DOTAP
N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметаммоний метилсульфат
FA
фолиевая кислота
FITC
флуоресцеинизотиоцианат
Flu
ПНК
флуоресцеиновое производное ПНК, конъюгат ПНК и FITC.
Fmoc
9-флуоренилметилоксикарбонильная группа
GFP
зелёный флуоресцентный белок
GPS
(3-глицидоксипропил) триметоксисилан
HA
гиалуроновая кислота
HATU
2-(7-аза-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний
гексафторфосфат
LF
липофектамин
mРНК
Матричная РНК
mcДНК
миникольцевая ДНК (генетический вектор)
MPTMS
меркаптопропилтриметоксисилан
MTT
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид
MUA
меркаптоундекановая кислота
NMM
N-метилморфолин
5
P
ДНК/ПНК дуплекс
PA
поли-L-аргинин
PAA
полиэтиленгликоль-блок-полиаспаргиновая кислота
PACA
полиалкилцианоакрилат
PAH
полиаллиламин гидрохлорид
PAMA
полиалкилметакрилат
PAMAM
полиамидоамин
PBCA
полибутилцианоакрилат
PBHB
поли-β-гидроксибутират
PDEAEMA
поли(2-(диэтиламино)этилметакрилат)
PDMAEMA
поли(2-(диметиламино)этилметакрилат)
PECA
полиэтилцианоакрилат
PECL
поли-ε-капролактон
PEG
полиэтиленгликоль
PEG-PAA
полиэтиленгликоль-блок-полиаспаргиновая кислота
PEG-PAsp(DET-Aco)
полиэтиленгликоль-блок-поли{N-[N’-(N’’-цис-аконитил-2аминоэтил)-2-аминоэтил]аспартамид}
PEG-PMA
полиэтиленгликоль-блок-полиметакриловая кислота
PEI
полиэтиленимин
PHCA
полигексилцианоакрилат
PICA
полиизобутилцианоакрилат
PL
поли-L-лизин, полилизин
PLA
полилактат
PLGA
полилактат-со-гликолевая кислота
PMMA
полиметилметакрилат
PS
полистирол
PSS
полистиролсульфонат
PTX
паклитаксел
PVP
поливинилпирролидон
pДНК
ДНК плазмида
QD
квантовые точки
6
siРНК
малая интерферирующая РНК
SLN
твёрдые липидные наночастицы
SS37
синтетический полиамидоамин
TEM
трансмиссионная электронная микроскопия
TEOS
тетраэтил ортосиликат
TFA
трифторуксусная кислота
TXM
трансмиссионная рентгеновская микроскопия
XFM
рентгеновская флуоресцентная микроскопия
vРНК
вирусная РНК
ВЭЖХ
высокоэффективная жидкостная хроматография
ДРС
динамическое рассеяние света
МРТ
магнитно-резонансная томография
МУРР
малоугловое рентгеновское рассеяние
НК
нуклеиновая кислота
офВЭЖХ
обращённо-фазовая ВЭЖХ
ПНК
пептидо- нуклеиновая кислота (от англ. peptide nucleic acid)
ПЦР
полимеразная цепная реакция
7
Введение
Активный поиск новых лекарственных препаратов и их широкое распространение
позволили увеличить продолжительность человеческой жизни и уменьшить смертность при
целом ряде заболеваний. К числу перспективных лекарственных препаратов относят
нуклеиновые кислоты и их синтетические аналоги [1-4]. Принцип действия таких препаратов
заключается в образовании комплекса с клеточной РНК или ДНК за счёт образования
комплементарных Уотсон-Криковских пар оснований. С помощью фрагментов нуклеиновых
кислот можно блокировать синтез нежелательных белков в организме или восстановить функции
повреждённых генов, регулируя сплайсинг [2, 5, 6], что помогает облегчить тяжесть течения
врождённых заболеваний. Для того, чтобы воздействовать на новую мишень, достаточно лишь
изменить последовательность нуклеиновой кислоты (НК). Быстрая и легкая адаптация
лекарственных препаратов на основе нуклеиновых кислот или их коротких фрагментов к
постоянно изменяющимся заболеваниям, например, вирусным или генетическим, является их
важным преимуществом по отношению к другим препаратам. Метод использования НК в
качестве лекарственных препаратов получил название антисенс подхода.
Основным препятствием на пути широкого применения НК в биомедицинских целях
является неэффективная доставка НК в клетки-мишени и к самим мишеням внутри клетки.
Эффективность естественного транспорта НК внутрь клетки очень низка [7], поэтому для их
доставки требуется создание эффективных транспортных систем. Одним из путей решения этой
проблемы может быть использование вирусных систем доставки, обладающих высокой
трансфекционной активностью [8]. Однако вирусные векторы представляют потенциальную
опасность для организма, так как могут вызывать нежелательные побочные эффекты: иммунный
ответ [9], воспалительные реакции и даже канцерогенный эффект [10].
Широкое распространение для транспорта НК получили менее эффективные невирусные
системы доставки [11, 12]. Одной из таких систем является транспорт нуклеиновых кислот в
клетки с помощью наночастиц [13-15], которая получила распространение благодаря развитию
нанотехнологии. Данный метод доставки имеет ряд положительных характеристик: наличие у
наночастиц оптических свойств, что позволяет визуализировать их с помощью спектрометрии и
микроскопии [13], их биодеградируемость [16], фотоактивность наночастиц [17, 18] позволяет
активировать их после адресной доставки; наночастицы способны защищать нуклеиновые
кислоты
от
действия
клеточных
ферментов
[19],
что
увеличивает
время
жизни
транспортируемых препаратов. Привлекательной стороной наночастиц является простота их
синтеза и возможность дополнительной модификации. Многие материалы, используемые для
получения наночастиц, уже в течение довольно продолжительного времени применяют в
8
качестве пищевых добавок (например, диоксид титана – добавка E171, золото – добавка E175,
оксид кремния – добавка E551), или, например, антибактериальных средств (золото, серебро),
при протезировании (оксиды титана и кремния, золото) и т.д.
При выборе нуклеиновых кислот для присоединения к наночастицам используют
синтетические олигонуклеотиды - короткие фрагменты ДНК [20] или РНК [21] и их аналоги.
Одним из перспективных аналогов НК, используемых в качестве антисенс препаратов, являются
их пептидные аналоги - пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), в которых углеводофосфатный
остов заменен на псевдопептидный. Благодаря наличию незаряженного скелета ПНК формируют
более стабильные дуплексы с нуклеиновыми кислотами, чем, например, ДНК. Кроме того, ПНК
устойчивы к действию клеточных нуклеаз и пептидаз [22]. В связи с этим пептидные аналоги
нуклеиновых кислот (ПНК), являются перспективными соединениями для разработки
лекарственных препаратов на основе синтетических НК и их аналогов. Однако в случае ПНК
также, как и в случае других НК, остаётся проблема, связанная с их неэффективной доставкой в
клетки.
Целью данного исследования является разработка эффективного метода доставки в
эукариотические клетки пептидо-нуклеиновых кислот в составе их композитов с наночастицами
диоксида титана для эффективного и селективного воздействия ПНК на внутриклеточные
нуклеиновые кислоты-мишени.
В ходе исследования будут решаться следующие задачи:
1. создать TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозиты, в которых пептидо-нуклеиновые кислоты
в виде ДНК/ПНК дуплексов будут нековалентно и обратимо иммобилизованы на наночастицы
TiO2, покрытые полилизином (TiO2•PL);
2. исследовать физико-химические свойства полученных нанокомпозитов:
3. оценить токсичность полученных TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов в культуре
клеток MDCK;
4. оценить способность полученных TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в
эукариотические клетки;
5. исследовать ингибирующее действие ПНК, доставленных в MDCK клетки в составе
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов, на репродукцию вируса гриппа A (H3N2).
Теоретическая и практическая значимость
В данном исследовании разработан новый эффективный метод доставки пептидонуклеиновых кислот в эукариотические клетки, основанный на использовании их композитов с
наночастицами диоксида титана. Создание предлагаемых TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов
9
осуществлено благодаря разработке метода обратимой и контролируемой иммобилизации ПНК
в виде ДНК/ПНК дуплексов на TiO2 наночастицах, покрытых полилизином (TiO2•PL). Фиксация
ДНК/ПНК дуплексов на TiO2 наночастицах осуществлена за счёт электростатических
взаимодействий между отрицательно заряженным остовом ДНК (в составе ДНК/ПНК дуплексов)
и положительно заряженным полилизином (в составе TiO2•PL).
Полученные
результаты
демонстрируют,
что
созданные
TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозиты без использования трансфекционных реагентов и физических методов
воздействия проникают в клетки и накапливаются в них; TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозиты не
проявляют токсичности на модели клеток MDCK; TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозиты проявляют
биологическое действие, выраженное в эффективном подавлении размножения вируса гриппа A/
Aichi/2/68 /H3N2 в клетках MDCK. Таким образом, показано, что ПНК, доставленная в клетки в
составе TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов, эффективно и селективно взаимодействуют с
внутриклеточной мишенью.
Созданный метод доставки ПНК в клетки ранее не был описан в литературе и имеет
широкую практическую значимость, поскольку может использоваться для подавления
размножения не только вируса гриппа, но и других вирусов. Кроме того, разработанная
методология может пригодиться при создании препаратов для лечения не только вирусных, но
также других заболеваний, обусловленных наличием в организме измененных НК.
Методология и методы исследования
В
работе
были
использованы
методы
флуоресцентной
и
УФ-спектрометрии,
колориметрии, офВЭЖХ, конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии, проточной
цитофлуорометрии; был проведён синтез пептидо-нуклеиновых кислот на пептидном
синтезаторе с помощью Fmoc-химии, осуществлена реакция присоединения FITC к молекуле
ПНК олигомера. Разработан метод создания TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Основным препятствием использования олигонуклеотидов и их аналогов в
медицинской практике является отсутствие эффективных и нетоксичных систем их транспорта в
клетки. В рамках данного исследования предложена и разработана новая эффективная система
доставки пептидо-нуклеиновых кислот в эукариотические клетки, основанная на использовании
их композитов с наночастицами диоксида титана.
2. Для создания предлагаемых TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов был разработан метод
обратимой и контролируемой иммобилизации ПНК в виде ДНК/ПНК дуплексов на TiO 2
наночастицах, покрытых полилизином (TiO2 PL). Фиксация ДНК/ПНК дуплексов на TiO2
10
наночастицах осуществлена за счёт электростатических взаимодействий между отрицательно
заряженным остовом ДНК и положительно заряженным полилизином. Связь ПНК с
нанокомпозитом осуществлена за счет комплементарных Уотсон-Криковских взаимодействий с
ДНК.
3. Изучены физико-химические свойства созданных TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов,
исследована роль полилизина при диссоциации ДНК/ПНК дуплекса в растворе и в составе
нанокомпозита.
4. Разработанная обратимая фиксация ПНК на наночастицах диоксида титана
обеспечивает диссоциацию ПНК из состава TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов. Время
высвобождения ПНК из нанокомпозита зависит от числа перекрывающихся комплементарных
пар оснований в дуплексе ДНК/ПНК.
5. Созданные TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозиты проявляют слабую цитотоксичность.
6. Созданные TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозиты проникают в клетки без использования
транcфекционных реагентов.
7. На примере подавления размножения вируса гриппа A/ Aichi/2/68 /H3N2 в клетках
MDCK с помощью нанокомпозитов TiO2•PL•ДНК/ПНК показано, что доставленные в составе
нанокомпозитов ПНК эффективно и селективно взаимодействуют с внутриклеточной
нуклеиновой кислотой-мишенью
11
Глава 1. Наночастицы и наноконструкции как транспортёры нуклеиновых кислот (обзор
литературы)
Свободные НК не способны проникать через клеточную мембрану, поэтому на
сегодняшний день одной из актуальных проблем использования терапевтически значимых НК
является проблема создания систем их транспорта внутрь клеток. Для доставки или транспорта
НК в клетки все большее применение находят наночастицы и наноконструкции [13]. Технологии,
основанные на использовании наночастиц для доставки биологически значимых соединений в
клетки и в организм в целом, можно отнести к одному из видов нанотехнологий, а именно, бионанотехнологии.
Нанотехнология изучает объекты, размер которых по одному из измерений составляет
менее 100 нм, при этом у материалов такого размера появляются новые свойства, которые не
наблюдаются у материалов большего размера [23, 24]. В связи с этим, наночастицы, в качестве
системы доставки НК, обладают разнообразными преимуществами по сравнению с другими
известными системами доставки. Наличие у наночастиц оптических свойств или других
спектрометрических характеристик, позволяет визуализировать их в живой клетке или в
организме в целом с помощью томографии, спектрометрии и/или микроскопии [13]. Это
позволяет использовать их в качестве диагностических средств. Биодеградируемость некоторых
типов наночастиц [16] позволяет решить проблему с их выводом из организма. Фотоактивность
наночастиц [17, 18], позволяют активировать наночастицы после адресной доставки. Большой
коэффициент отношения их площади к объему обеспечивает достаточно высокую ёмкость
посадки препарата на поверхность наночастиц. К тому же наночастицы способны защищать
препараты, в том числе и нуклеиновые кислоты, от разрушительного действия клеточных
ферментов [19], что увеличивает время жизни транспортируемых препаратов. Еще одной из
положительных сторон наночастиц является простота их синтеза и возможность дополнительной
модификации.
На сегодняшний день в литературе описано огромное число различных типов наночастиц
и способов их применения в качестве транспортеров лекарственных препаратов [9, 25-30]. В
основном наночастицы и нанокомпозиты на их основе можно разделить на два класса:
органические и неорганические. Неорганические наночастицы по сравнению с органическими
наночастицами имеют ряд преимуществ, к которым можно отнести их относительную легкость
получения и возможность модификации. Используемые на практике неорганические
наночастицы обладают такими привлекательными свойствами как биодеградируемость (фосфат
кальция, диоксид кремния). Многие из известных неорганических материалов, например, на
основе
диоксида
титана,
в
течение
длительного
12
времени
применяют
в
пищевой
промышленности, в медицине, в производстве бытовых предметов. Диоксид титана и золото
известны своими антибактериальными свойствами.
В настоящем обзоре будут кратко описаны органические наночастицы, затем особое
внимание будет уделено описанию производных неорганических наночастиц сферической
формы, их конъюгатов с низкомолекулярными соединениями и комплексов с органическими
полимерами, а также описанию способов доставки нуклеиновых кислот с помощью
наноконструкций
на
основе
неорганических
наночастиц
в
эукариотические
клетки.
Привлекательными в этом плане являются наночастицы диоксида кремния, диоксида титана,
оксида железа, фосфата кальция и золота, модифицированные полимерами, и наноконструкции,
содержащие различные функциональные группы. Также будут рассмотрены способы получения
и модификации наночастиц, возможность их иммобилизации с терапевтически значимыми НК и
другими биологически важными препаратами. Будут рассмотрены методы визуализации
наночастиц, их комплексов и конъюгатов, токсичность и проявляемая биологическая активность
препаратов, доставляемых с помощью наночастиц.
1.1. Органические наночастицы
Для получения органических наночастиц используют разнообразные полимеры, как
природного, так и искусственного происхождения (Таблица 1.1). В состав одной частицы могут
входить несколько полимеров, образующих композит, при этом линейный размер одного
полимера обычно не превышает 1000 нм [13], который обычно в «свернутом» состоянии
приобретает существенно меньший размер, соответствующий размеру наночастиц. Среди
природных полимеров широко используют углеводы и белки: например, хорошо известные
биополимеры, как хитозан, декстран, альбумин и желатин, которые получают из естественных
источников. Эти полимеры нетоксичны для организма и обладают биодеградируемыми
свойствами.
Биодеградируемыми свойствами могут обладать также и некоторые синтетические
полимеры, например, сополимер полилактат-со-гликолевая кислота (PLGA) или полилактат
(PLA) [13]. Для получения органических наночастиц, состоящих из синтетических полимеров,
используют либо мономеры, получая необходимые наночастицы непосредственно в процессе
полимеризации, либо используют уже сформированные полимеры, применяя различные физикохимические методы, например, наноосаждение [31, 32] или испарение [13].
13
Таблица 1.1. Органические полимеры, используемые для создания наночастиц.
Природные полимеры
Синтетические полимеры
Полисахариды
Белки
Преполимеры
Полимеры
Альгинат
Декстран
Циклодекстрин
Агароза
Пуллулан
Хитозан
Желатин
Альбумин
Вицилин
Лектин
Легумин
PEG
PLA
PLGA
PECL
PS
PBCA
PICA
PHCA
PMMA
PECA
PAMAM
PEG – полиэтиленгликоль, PLA – полилактат, PLGA – полилактат-со-гликолевая кислота, PECL
– поли-ε-капролактон, PS – полистирол, PBCA – полибутилцианоакрилат, PICA –
полиизобутилцианоакрилат, PHCA – полигексилцианоакрилат, PMMA – полиметилметакрилат,
PECA – полиэтилцианоакрилат, PAMAM – полиамидоамин. Использованы данные работы [13].
Органические полимеры, а также и их гибриды с неорганическими наночастицами
способны «собираться» в растворе за счёт слабых электростатических и гидрофобных
взаимодействий,
а
загрузка
лекарственных
препаратов
из
среды
может
проходить
самопроизвольно. Показано, что возможна самопроизвольная сборка наночастиц из дипептидов
[33], также существуют самособирающиеся наночастицы на основе циклодекстрина [34]. В
работе [18] показано, что при смене гидрофильного растворителя на гидрофобный происходит
загрузка лекарственного препарата, а обратная смена растворителя препятствует выходу
препарата из носителя.
1.1.1. Методы получения органических наночастиц
Ниже представлены наиболее распространённые методы получения органических
наночастиц (Таблица 1.2) [13].
Одним из широко используемых способов получения большинства синтетических
полимеров является метод полимеризации. Так, для синтеза дендримеров применяют
расходящийся или сходящийся рост полимера, т.е. либо рост полимера посредством
присоединения новых цепей к уже сформированному ядру наночастицы, либо соединение
предформированных олигомеров в один полимер. Циклодекстрины (циклические полимерные
углеводы), используемые для доставки ДНК, также получают с помощью полимеризации.
Однако комплексы, образуемые циклодекстрином с ДНК плазмидой, не обладают достаточной
стабильностью,
поэтому
были
разработаны
циклодекстринов, например, амфифильных
методы
получения
модифицированных
[25, 35, 36], которые обладают лучшей
растворимостью в воде и в органических растворителях.
14
Таблица 1.2. Методы синтеза органических частиц.
Материал
Методы
Синтетические полимеры
PACA, PBCA, PAMA, PS, PVP
Полимеризациция
PECL, PLA, PLGA, PMMA
Наноосаждение, замена растворителя,
диффузия растворителя
PECL, PLA, PLGA, PBHB, этилцеллюлоза
Испарение растворителя
фталат ацетилцеллюлозы, PAMA,
этилцеллюлоза, PLA, PLGA
Высаливание
Природные полимеры
Альбумин, хитозан, желатин, казеин и т.д.
Коацервация, десольватация, ионное
гелеобразование
SLN (solid lipid nanoparticles, твёрдые
липидные наночастицы)
Гомогенизация высокого давления,
микроэмульсия, испарение эмульсии,
инъекция раствора, двойная эмульсия
Дендримеры
Расходящийся и сходящийся рост полимера,
стратегия ортогонального присоединения
Циклодекстрины
Полимеризация, циклодекстриновые
комплексы лекарственных препаратов в SLN
Амфифильные циклодекстрины
Присоединение различных заместителей к
природным циклодекстринам и их
наночастицам различными методами,
например, наноосаждение.
PACA – полиалкилцианоакрилат, PBCA – полибутилцианоакрилат, PAMA –
полиалкилметакрилат, PS – полистирол, PVP – поливинилпирролидон, PECL – поли-εкапролактон, PLA – полилактат, PLGA – полилактат-со-гликолевая кислота, PMMA –
полиметилметакрилат, PBHB – поли-β-гидроксибутират, SLN – твёрдые липидные наночастицы.
Использованы данные работы [13].
Также для получения органических наночастиц используется метод наноосаждения –
осаждение растворённых материалов в виде наноразмерных частиц при смешивании с раствором
осадителя [32]. Интересный метод получения полимерных наночастиц заключается в испарении
жидкости из капель эмульсии, содержащей полимер [37].
1.2. Неорганические наночастицы
Неорганические наночастицы состоят из различных соединений металлов и неметаллов
таких, как оксиды металлов (оксиды железа, кремния или титана), соли металлов (фосфаты
кальция и магния) или самих металлов (золото, серебро) (Таблица 1.3).
15
Таблица 1.3. Основные свойства неорганических наночастиц, рассматриваемых в обзоре.
Материал
Особенности/свойства
Применение материалов, из
которых состоят наночастицы
Диоксид
титана
Возможность модификации, генерация
активных форм кислорода при
облучении УФ-светом (фотоактивные
свойства), биосовместимость
Антибактериальные средства,
компонент зубных паст,
кремов, средств от загара,
хирургия.
Диоксид
кремния
Биодеградируемость,
биосовместимость, наличие пор
Керамика и стекло,
хроматография, пищевая
промышленность,
микроэлектроника
Оксид
железа
Способность к магнитофекции
Получение чугуна, пищевая
промышленность, керамика,
компонент красок
Золото
Спектрометрические и
фототермические свойства,
возможность модификации, например,
введение тиольных групп
Ювелирные изделия,
антибактериальные средства,
стоматология
Фосфат
кальция
Биодеградируемость,
биосовместимость
Компонент корма для
животных и удобрений,
керамика и стекло, компонент
лекарств.
Помимо наночастиц, состоящих из однородных материалов, могут встречаться и их
комбинированные состояния. Представителями такого типа частиц являются наночастицы типа
«ядро-оболочка» (core-shell), ядро которых состоит из одного материала, а оболочка из другого.
В результате такой конструкции возможно комбинирование свойств составляющих материалов
[38, 39]. Основные типы рассматриваемых в обзоре неорганических наночастиц приведены в
таблице 1.3.
Используемые на практике наночастицы обладают рядом привлекательных свойств, таких
как: биодеградируемость (фосфат кальция, диоксид кремния), что решает проблему вывода
наночастиц из организма; способность к магнитофекции (оксид железа), что позволяет
доставлять лекарственные препараты в нужные участки организма под действием магнитного
поля. Наночастицы золота и диоксида титана обладают фототермическими и фотоактивными
свойствами, соответственно, что позволяет частично разрушать клеточную мембрану [40, 41],
способствуя лучшему проникновению препарата в клетку, или разрывать связь с лекарственным
препаратом после доставки в клетки [42].
16
1.2.1. Методы получения неорганических наночастиц
Наиболее распространенными способами получения неорганических наночастиц является
получение наночастиц, состоящих из однородных материалов (Таблица 1.4). Такие наночастицы
могут быть разделены по структуре на цельные, пористые или полые. Наиболее
распространенными частицами в этом плане являются наночастицы, получаемые на основе
диоксида кремния SiO2. Впервые наночастицы SiO2 были получены в 1968 году [43], размер
таких частиц варьировал от 50 до 2000 нм. Для современных приложений в качестве носителя
лекарственных препаратов такие наночастицы не пригодны из-за большого разброса их
размеров. В современных работах размер, получаемых наночастиц обычно составляет не более
100 нм (Таблица 1.4).
Таблица 1.4. Методы синтеза неорганических наночастиц
Материал
Размер
наночастиц, нм
Методы
Ссылки
TiO2
1) 4-5
2) 10-25
Гидролиз соединений титана
1) TiCl4, Ti(OC4H9)4
2) Ti(OCH(CH3)2)4
1) [44-48]
2) [18, 49, 50]
SiO2
пористые
1) 70-300;
(поры 20)
2) 120; (поры
3.8)
3) 56.7; (поры
2-3)
Синтез по шаблону (template synthesis).
Гидролиз TEOS для образования SiO2
1) [51, 52]
2) [53, 54]
3) [55, 56]
SiO2
1) 1-100
2) 50-2000
Гидролиз TEOS
1) [57-61]
2) [43]
SiO2
(полые)
47.7 (внешний
диаметр), 17.3
(полость)
Получение слоя SiO2 на поверхности
[62]
наночастиц Au и последующее окисление
Au I2 (template synthesis)
Fe3O4
4-12
Термическое разложение солей железа и
жирных кислот и последующее
осаждение, совместное осаждение
хлоридов железа
[63-73]
Au
2-15
Восстановление Au из HAuCl4 цитратом
натрия, NaHB4
[7, 21, 74-86]
Фосфат
кальция
1) 100-300
2) 68
3) 180-280
Самосборка слоя фосфата кальция при
адсорбции на отрицательно заряженной
поверхности;
осаждение из водных растворов и
микроэмульсий «вода в масле»;
1) [16, 87-90]
2) [91-93]
3) [94-100]
17
осаждение из раствора совместно ДНК в
фосфатном буфере (аналогично сборка
многослойных частиц)
Наночастицы смешанного состава
SiO2(Fe3O4)
1) 50-63; (поры
3.6)
2) 400; (поры
13-24)
Самосборка пористых частиц в
присутствии наночастиц Fe3O4,
стабилизируемых ПАВ,
сопровождающаяся гидролизом TEOS.
Удаление ПАВ после синтеза
[63, 64]
1) [67, 101-104]
2) [66]
SiO2@SiO2
100;
(поры 2.6-14.6)
Совместная конденсация TEOS и
C18TMS, создание пор методом
адсорбции/десорбции N2 или обработкой
Na2CO3
[67, 105]
SiO2 с
25-50
добавлением
CdSe/ZnS
QD
Образование пористых наночастиц с
использованием шаблона. Последующий
гидролиз шаблона и введение QD
[106]
Au@SiO2
47.7
Гидролиз TEOS в присутствии
наночастиц Au
[62]
SiO2@Au
80-170
Рост оболочки из золота на полученных
стандартным методом наночастицах SiO2
[20, 42, 107]
Формирование оболочки TiO2 путём
[14]
гидролиза TiCl4 в присутствии
предварительно полученных наночастиц
Fe3O4
Fe3O4@SiO2 и др. – наночастицы «ядро-оболочка». QD – квантовые точки, TEOS – тетраэтил
ортосиликат,
C18TMS
–
октадецилтриметоксисилан,
MPTMS
–
меркаптопропилтриметоксисилан.
Fe3O4@TiO2
6-8
Для получения наночастиц диоксида кремния используют гидролиз соединений кремния,
например, тетрахлорид кремния, тетраэтил ортосиликат (TEOS) или октадецилтриметоксисилан
(C18 TMS) (Таблица 1.4). В последние годы стали широко применятся пористые наночастицы
диоксида кремния. Их преимущество заключается в возможности загрузки лекарственных
препаратов как в поры, так и на поверхность наночастиц, что позволяет либо доставлять два
различных соединения [53], либо защищать от внешнего воздействия соединение в порах. Размер
таких наночастиц варьируется от 60 до 300 нм, а размер пор может составлять от 3-4 до 20 нм
(Таблица 1.4). Общий способ получения таких пористых материалов заключается в добавлении
каких-либо растворимых или легко вымываемых при определенных условиях материалов или
добавок непосредственно в процессе получения наночастиц (например, могут быть
использованы такие добавки, как Na2CO3 или N2 [67, 105]. Внедренные добавки удаляют путем
вымывания каким-либо растворителем, в котором сами наночастицы не растворяются (например,
18
слабая кислота в случае использования Na2CO3) или простым дегазированием, если
используются пузырьки газа [51-56] (Таблица 1.4).
Для получения наночастиц диоксида титана используют гидролиз соединений титана,
например, тетрахлорида, тетрабутилата или тетраизопропилата титана (Таблица 1.4). В
зависимости от используемых исходных соединений образуются наночастицы различного
размера. Распространённым способом получения золотых наночастиц является восстановление
золота из HAuCl4 с помощью боргидрида или цитрата натрия. При восстановлении цитратом
натрия поверхность золота защищена цитрат анионами [78, 85].
Для синтеза магнитных наночастиц оксида железа распространены способы осаждения
различных соединений двух- или трёхвалентного железа: используют совместное осаждение
хлоридов железа Fe(II) и Fe(III) [71], осаждение соли железа (III) и стеариновой кислоты [67]. В
качестве исходных соединений могут быть использованы также и координационные соединения
железа: например, в литературе описан способ получения наночастиц из трисацетилацетоната
железа (III) [68].
Наночастицы фосфата кальция известны своей быстрой агрегацией. Частицы размером
200-300 нм стабильны в течении 3 дней, а при размере частиц 90 нм стабильны всего 6 ч [92].
Наиболее распространённым способом получения таких наночастиц является их осаждение из
раствора фосфата кальция, содержащего необходимую для дальнейшей доставки НК.
Получаемые в результате комплексы наночастиц и НК могут содержать как один слой фосфата
кальция, затем слой НК, так и несколько чередующихся слоёв.
Известны способы синтеза наночастиц, состоящих из нескольких материалов, например,
так называемые наночастицы «ядро-оболочка» (core-shell), а также пористые наночастицы в
поры которых внедрены наночастицы меньшего размера, состоящие из другого материала
(Таблица 1.4). Они сочетают свойства используемых материалов. Например, наночастицы с
ядром из оксида железа способны к магнитофекции, тогда как оболочка из диоксида кремния
защищает их от агрегации и уменьшает токсический эффект оксида железа на клетки.
Таким образом, способы получения органических и неорганических наночастиц имеют
свои различия, особенности, преимущества, достоинства и недостатки, которые следует учесть
при создании и конструировании нанокомпозитов с ожидаемыми или заранее заданными
свойствами.
1.2.2. Способы модификации поверхности неорганических наночастиц
Модификация
поверхности
неорганических
наночастиц
производится
путем
присоединения к наночастицам различных низко- и высокомолекулярных соединений (Таблица
19
1.5). В зависимости от способа присоединения такую модификацию наночастиц можно разделить
на ковалентную и нековалентную.
Таблица 1.5. Смешанные органические и неорганические наночастицы, получаемые путем
поверхностной модификации неорганических наночастиц органическими полимерами, и тип НК,
используемых для доставки.
Материал Примеры соединений,
используемых для модификации
поверхности наночастиц
Тип НК
ссылки
Диоксид
Ендиольные лиганды (допамин,
ализарин, аскорбиновая кислота и
т.д.), PEG, PEI-FA, липиды, PL
ДНК,
ПНК
[15, 18, 108-115]
PEI, PL, DOTAP, PAH, манноза,
введение аминогрупп (-NH2) с
помощью APTES и эпоксигрупп с
помощью GPS
siРНК,
ДНК,
pДНК
[26, 52, 53, 58, 59, 60, 62, 66, 67,
103, 104, 116, 117]
PEI-стеариновая кислота, PEG,
PL, PA
ДНК,
siРНК
[68, 70-72]
PEI, PEG, DODAB, PAH-Cit,
хитозан, введение карбоксильных
групп (-COOH) с помощью MUA
и аминогрупп (-NH2) при синтезе
с помощью гидрохлорида
цистамина
ДНК
[7, 17, 20, 77, 79, 80, 83, 84, 85,
118, 119]
PEI-HA, хитозан, PEI-ALE,
PLGA, PEG-PAA, PEG-PMA,
PEG-PAsp(DET-Aco),
ДНК,
siРНК
титана
Диоксид
кремния
Оксиды
железа
Золото
Фосфат
кальция
siРНК
ПНК
[16, 87, 88, 92, 96-100, 120]
PEI – полиэтиленимин, PEG – полиэтиленгликоль, FA – фолиевая кислота, DOTAP – N[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметаммоний метилсульфат, PL – поли-L-лизин, PA –
поли-L-аргинин, DODAB – диметилдиоктадециламмоний бромид, PAH – полиаллиламин
гидрохлорид, Cit – цитраконовый ангидрид, HA – гиалуроновая кислота, APTES – 3аминопропилтриэтоксисилан, GPS – (3-глицидоксипропил) триметоксисилан, ALE –
алендроновая кислота или алендронат, PLGA – полилактат-со-гликолевая кислота, PEG-PAA –
полиэтиленгликоль-блок-полиаспаргиновая кислота, PEG-PMA – полиэтиленгликоль-блокполиметакриловая кислота, MUA – меркаптоундекановая кислота, PEG-PAsp(DET-Aco) –
полиэтиленгликоль-блок-поли{N-[N’-(N’’-цис-аконитил-2-аминоэтил)-2аминоэтил]аспартамид}.
Присоединение
низкомолекулярных
соединений
к
наночастицам
является
распространённым способом модификаций. Возможно введение таких функциональных групп,
как амино-, эпокси- и карбоксигруппы, к которым возможно, как ковалентное, так и
нековалентное (путём электростатических взаимодействий) присоединение нуклеиновых кислот.
20
Например, поверхность наночастиц диоксида кремния модифицируют, вводя либо положительно
заряженные аминогруппы с помощью обработки аминосиланом (APTES) [58], либо
реакционноспособные эпоксигруппы с помощью обработки эпоксисиланом (GPS) [52]. Первый
способ
позволяет
создавать
положительно
заряженные
наночастицы,
способные
взаимодействовать с отрицательно заряженными НК, а второй – осуществлять дальнейшее
ковалентное присоединение поликатионов посредством эпоксигруппы. В работе [52] было
осуществлено ковалентное присоединение полилизина через его аминогруппу к эпоксигруппе
GPS (Рис. 1.1), при этом модификация происходила не только на поверхности наночастиц, но и
внутри пор.
Рис. 1.1. Схема получения пористых наночастиц диоксида кремния, модифицированных
полилизином и нагруженных siРНК [52].
Наночастицы золота легко вступают в реакцию с тиольными группами (-SH). Один из
вариантов модификаций их поверхности является реакция с меркаптоундекановой кислотой
(MUA), на одном из концов которой находится тиольная группа, а на противоположном карбоксильная [85, 118]. Получившиеся конъюгаты наночастиц золота и MUA способны
21
взаимодействовать с поликатионами. Возможно и прямое присоединение нуклеиновых кислот к
наночастицам золота. В работе [82] использовали дезоксирибоолигонуклеотиды с одной или
четырьмя концевыми тиольными группами. Как и следовало ожидать, наблюдалась обратная
корреляция числа тиольных групп в ДНК и числа, присоединённых к наночастицам цепей
олигомера, т.е. чем больше тиольных групп присоединяются к наночастицам, тем меньше
остаётся сайтов для присоединения последующих тиольных групп. Так для олигонуклеотида с
одной SH-группой количество цепей на поверхности наночастиц составило 110-120, а с четырьмя
– 45-50. Позже сотрудники этой же лаборатории получили конъюгаты наночастиц золота и
siРНК, однако в этом случае использовали модификацию олигоэтиленгликольтиолом по одной
из цепей siРНК [21].
Простой способ был предложен для получения конъюгатов наночастиц золота и пептидонуклеиновых кислот, содержащих остаток цистеина на конце цепи [81].
Модификация наночастиц служит не только для образования связи с нуклеиновыми
кислотами, но и придают им новые свойства. Например, присоединение ализарина к
наночастицам диоксида титана позволяет наблюдать их с помощью флуоресцентной
микроскопии [113, 121], тогда как исходные наночастицы не обладают флуоресцентными
свойствами.
Набор полимеров, применяющихся для модификации наночастиц, довольно разнообразен
и существует множество способов их фиксации на наночастицах. Наиболее простой и часто
используемый способ – смешивание заряженных полимеров с наночастицами. В этом случае
комплекс наночастиц и полимеров собирается самопроизвольно в растворе, в результате
образуются
заряженные
наночастицы,
способные
взаимодействовать
с
отрицательно
заряженными нуклеиновыми кислотами или положительно заряженными полимерами (Таблица
1.5). Помимо обычных полимеров, таких как PEI или PEG применяют и их конъюгаты. Конъюгат
PEI и стеариновой кислоты, которым были покрыты наночастицы оксида железа, использовали
в качестве «протонной губки», что способствовало выходу наночастиц из эндосом при изменении
pH [68], при этом буферная ёмкость конъюгата была выше, чем свободного PEI. Модификация
наночастиц PEI с фолиевой кислотой способствовала проникновению наночастиц в клетки по
механизму рецептор-опосредованного эндоцитоза [18].
Довольно
распространены
полимеры,
меняющие
заряд
с
отрицательного
на
положительный при смене pH [122]. Один из таких полимеров использовали в работах [7, 85].
Наночастицы золота, покрывали несколькими слоями полимеров, первый и последний слои
содержали PEI, а промежуточный отрицательно заряженный конъюгат гидрохлорида
полиаллиламина и цитраконового ангидрида (PAH-Cit). В комплексе с наночастицами эффект
«протонной губки», вызываемый PEI, ослаблен. Однако при смене значения pH от нейтрального
22
до слабокислого (pH 5), который наблюдается в эндосомах, происходил гидролиз связи между
полиаллиламином и цитраконовым ангидридом, что приводило к выходу комплекса PEI и siРНК
из состава наночастиц, увеличению буферной ёмкости PEI и последующему высвобождению из
эндосом (Рис. 1.2а).
Рис. 1.2. а) Высвобождение лекарственного препарата, доставленного золотыми наночастицами,
модифицированными полимером, меняющим заряд [85]. б) Гидролиз связи в PEG-PAsp(DETAco) с образованием PEG-PAsp(DET) при смене pH [99].
Ещё один пример полимера, меняющего заряд – блок-полимер полиэтиленгликоля и
полиаспартата PEG-PAsp(DET-Aco) [98-100]. Этим полимером покрывали биодеградируемые
наночастицы фосфата кальция или диоксида кремния. При попадании в эндосомы и изменении
pH от нейтрального к слабокислому происходил гидролиз цис-аконитинамидной связи, что
вызывало смену заряда с отрицательного на положительный, дестабилизацию эндосом и
высвобождение лекарственного препарата (Рис. 1.2б).
Помимо прямой модификации поверхности существуют методы включения полимеров
при синтезе наночастиц. Например, при смешивании золотохлористоводородной кислоты
HAuCl4 с PEI-SH [84] или DODAB [83] и добавлении восстанавливающего реагента (цитрат или
23
боргидрид натрия) образуются наночастицы золота, поверхность которых модифицирована
поликатионом.
Интересный способ загрузки (сочетающийся с иммобилизацией) лекарственного
препарата представлен в работе [53]: в поры наночастиц диоксида кремния был загружен
доксорубицин, а на поверхность наночастиц с помощью электростатических взаимодействий
иммобилизовали ДНК (Рис. 1.3), в результате чего созданная система обеспечивала совместную
доставку двух лекарственных препаратов. Одновременная доставка нескольких лекарственных
препаратов является преимуществом, поскольку один препарат может усиливать действие
другого. Способ одновременной загрузки двух лекарственных препаратов в пористые
наночастицы диоксида кремния широко используется при создании нанокомпозитов [53, 55,
116].
Рис. 1.3. Пористые наночастицы диоксида кремния. В поры загружен доксорубицин (розовые
сферы), на поверхности иммобилизованы молекулы ДНК (красные кривые) [53].
1.3. Визуализация наночастиц и наноконструкций на их основе
Для того чтобы следить за процессом доставки и локализации наночастиц и
транспортируемых ими лекарственных препаратов в клетки, необходимо иметь возможность их
визуализации [123-125]. Для этой цели чаще всего используют НК, содержащие флуоресцентную
метку, однако возможна визуализация непосредственно самих наночастиц. Так, свободные
магнитные наночастицы оксида железа, а также пористые наночастицы, например, диоксида
кремния, в поры которых загружены наночастицы оксида железа, визуализируют с помощью
МРТ [63, 64, 101, 126]. Введение добавок гадолиния (III) в наночастицы золота и диоксида титана
также даёт возможность использовать МРТ [123, 127, 128]. Универсальными методами
визуализации наночастиц и их производных являются трансмиссионная электронная
микроскопия (TEM) (Рис. 1.4а) и рентгеновская микроскопия [86, 123, 129]. Отдельно следует
24
отметить
один
из
современных
методов
спектроскопии
–
рентгенофлуоресцентную
спектроскопию. При воздействии рентгеновского излучения на образец происходит испускание
фотонов, причём каждому атому соответствует фотон с определённым значением энергии.
Данный метод позволяет изучить локализацию необходимых элементов в клетке. Такой метод
был успешно применён при изучении проникновения наночастиц диоксида титана в раковые
клетки MCF-7/WS8 (Рис. 1.4б) [112].
Рис. 1.4. Визуализация наночастиц в клетках. а) TEM наночастиц золота в комплексе с
поликатионом и НК в клетках глиобластомы человека GBM319 [86]; б) рентгеновская
флуоресцентная микроскопия (XFM) конъюгатов наночастиц TiO2 и ДНК в клетках рака груди
человека MCF7/WS8, приведены данные для P, Ti, Zn и их наложение, числа после символа
элемента показывают концентрацию элемента в мкг/см2 [112]; в) флуоресцентная микроскопия
наночастиц TiO2, модифицированных ализарином, в клетках рака простаты человека PC-3M 9
(возбуждение 543 нм, испускание 560-615 нм) [113].
Визуализация нанокомпозитов также возможна путем модификации поверхности
наночастиц низко- или высокомолекулярными соединениями. Так модификация поверхности
наночастиц TiO2 ализарином [113] (Рис. 1.4в) или полилизином, содержащим флуоресцентную
метку [114], даёт возможность наблюдать их с помощью флуоресцентной микроскопии.
1.4. Взаимодействие наночастиц с эукариотическими клетками
Для
исследования
взаимодействия
наночастиц
с
эукариотическими
клетками
используются как сами наночастицы, так и частицы с уже модифицированной поверхностью, на
которую иммобилизуют важные биологически активные препараты, в том числе и
терапевтически значимые НК. Для конструирования систем доставки НК на основе наночастиц
25
в литературе широко используют наночастицы, покрытые поликатионами [104], например,
полиэтиленимином (PEI) [71, 87], полилизином [52, 66, 115, 130], полиаргинином [72] и другими
[7, 83]. Поликатион, иммобилизованный на поверхности частиц, связывает НК с помощью
электростатических взаимодействий либо препятствует выходу лекарственных препаратов,
загруженных в поры наночастиц [52]. Стоит отметить, что связь поликатиона с НК может быть
ковалентной [115, 131], что увеличивает прочность связывания НК в составе наноконструкций и
биологический эффект [132]. Известны наноконструкции, в которых используется два и более
слоя полимеров для одновременной доставки нескольких типов НК, например, ДНК и siРНК,
либо дополнительный внешний слой, покрывающий всю конструкцию и защищающий её от
внешнего воздействия и способного деградировать в клеточной среде [86]. Помимо
приведённого метода для создания лекарственных препаратов применяют и конъюгаты
наночастиц и НК, присоединённых посредством какой-либо линкерной группы [21, 81, 82, 108,
133, 134], но таких работ значительно меньше.
Эффективность взаимодействия наночастиц и их композитов с клетками может быть
оценена как изучением непосредственно доставки НК в клетки, так и биологической активности,
проявляемой НК, доставленной в клетки. При взаимодействии наночастиц с клетками, сами
наночастицы или их модифицированные формы могут оказывать также заметное токсическое
воздействие на живую клетку.
1.4.1. Влияние наночастиц на жизнеспособность эукариотических клеток
Одной из немаловажных характеристик взаимодействия наночастиц с эукариотическими
клетками является сохранение жизнеспособности клеток. Наночастицы могут способствовать не
только положительной терапевтической активности, но и могут оказывать на клетку
нежелательный токсический эффект. В связи с этим, влияние лекарственных препаратов, в том
числе и наночастиц, на жизнеспособность клеток является одним из важных параметров при
начале биологических испытаний in vivo.
В большей части работ для определения жизнеспособности клеток используют
производные тетразола, одним из которых является MTT. Суть метода определения
жизнеспособности клеток с применением производных тетразола заключается в восстановлении
тетразола до формазана с помощью митохондриальной редуктазы, которая присутствует только
в митохондриях живых клеток. Получаемый в процессе восстановления формазан растворяется
в водных или органических растворах в зависимости от использованного производного
тетразола. Для определения выживаемости клеток проводят измерение оптической плотности
раствора формазана: чем выше количество жизнеспособных клеток, тем выше значения
26
оптической плотности раствора. Такой метод определения выживаемости клеток прост в
использовании и позволяет проводить параллельно анализ большого числа проб.
Рис. 1.5. Сравнение выживаемости клеток в присутствии комплекса наночастиц с поликатионом
и свободного поликатиона. а-б) пористые наночастицы SiO2, покрытые PEI, в комплексе с ДНК,
MPS и PS – пористые наночастицы SiO2, содержащие модифицированный и
немодифицированный маннозой PEI соответственно. а) Мышиные макрофаги Raw264.7, б)
Клетки рака шейки матки человека HeLa [54]. в) Наночастицы золота, покрытые PEI с массой
800 Да, клетки почки обезьяны [84]. г-д) Наночастицы золота, покрытые PEI с массой 25 кДа, в
комплексе с siРНК. г) Клетки рака груди, обладающие множественной лекарственной
устойчивостью, MCF-7R, д) Клетки HeLa [7].
В исследованной литературе преобладают данные, указывающие на то, что наночастицы
не обладают выраженной токсичностью по отношению к клеткам [126, 135], а жизнеспособность
клеток в среднем составляла более 90% при инкубации с наноконструкциями на основе
наночастиц и НК в диапазоне концентраций, обладающих биологической активностью, в течение
1-3 дней. При этом наблюдается любопытная тенденция – модификация наночастиц
поликатионами существенно снижает токсичность последних [7, 54, 57, 84] (Рис. 1.5).
27
При увеличении концентрации свободного поликатиона выживаемость клеток падает до
0-10%, в то время как жизнеспособность клеток в присутствии наночастиц, покрытых
поликатионом, остаётся выше 80% (Рис. 1.5 а-в) [54, 84]. Из проанализированных данных также
следует, что выживаемость для различных культур клеток при одних и тех же условиях может
отличаться [7, 54] (Рис. 1.5а, б, г, д). В работе [7] жизнеспособность клеток HeLa в присутствии
PEI составила 80%, а выживаемость клеток MCF-7R только 60%. Данный факт следует учитывать
при разработке лекарственных препаратов, поскольку смена системы для испытаний препарата
может значительно повлиять на конечный эффект как в положительную, так и в отрицательную
сторону.
1.4.2. Защита нуклеиновых кислот наночастицами от действия нуклеаз
Важной особенностью наночастиц является не только то, что они способны уменьшать
токсичность иммобилизуемых на их поверхность различных поликатионов, но и то, что
наночастицы способны защищать НК, иммобилизованные на их поверхности, от действия
клеточных нуклеаз [94, 95]. Shi M. и соавторы показали, что свободная ДНК плазмида полностью
гидролизуется в среде RPMI-1640 в присутствии 10% сыворотки и её невозможно детектировать
по прошествии 12 ч, в то время как ДНК плазмиду в комплексе с наночастицами можно
детектировать с помощью агарозного гель-электрофореза по прошествии 48 ч [104]. В этой же
работе было показано, что свободная ДНК полностью гидролизуется в присутствии ДНКазы I за
30 мин, а в комплексе с наночастицами остаётся стабильной по прошествии 6 ч. Shi M. и соавторы
предположили, что поликатион, связываясь с ДНК с помощью электростатических
взаимодействий, создаёт своего рода физический щит, защищающий ДНК от действия
ферментов. Аналогичным действием обладают и конъюгаты наночастиц с нуклеиновыми
кислотами. Одним из таких примеров могут послужить работы группы учёных из лаборатории
Северо-Западного университета США [21, 82, 136]. В них было показано, что время жизни НК,
как ДНК, так и РНК, при ковалентном присоединении к поверхности наночастиц золота в
присутствии 10% сыворотки увеличивается в несколько раз. Так, в работе [82] время жизни ДНК
в составе конъюгата выросло в 4.5 раз по сравнению со свободной ДНК, а в [21] время жизни
РНК – в 6 раз и составило 13.5 ч, что, тем не менее, достаточно для доставки в клетку и
проявления биологического эффекта. Конъюгаты ДНК с наночастицами TiO2 также остаются
стабильными и устойчивыми к действию нуклеаз в течение минимум 12 ч [113].
28
1.4.3.
Транспорт
наночастиц,
содержащих
НК
и
другие
препараты,
в
эукариотические клетки и их биологический эффект после доставки
Важной характеристикой взаимодействия наночастиц с клетками является не только
успешная доставка НК с помощью наночастицы-транспортера, но и проявляемый при этом
биологический эффект, вызываемый иммобилизованной на поверхности наночастицы НК. Для
оказания биологического эффекта НК должна провзаимодействовать с НК-мишенью внутри
клетки и блокировать экспрессию целевого гена. Однако эффективная трансфекция НК не всегда
способна вызывать высокий биологический эффект, поскольку проникшая внутрь клетки НК
должна
быть
также
доступной
для
своей
НК-мишени,
поскольку
наночастицы
с
иммобилизованной НК в этом случае могут быть заключены в эндосомные компартменты внутри
клеток [137, 138], либо НК, иммобилизованная на поверхности наночастиц, не доступна мишени
из-за стерических затруднений.
Для оценки прямой доставки наночастиц в клетки применяют рентгеновскую или
трансмиссионную электронную микроскопию, оптическую микроскопию, флуоресцентную
цитометрию и др. Универсальными методами, с помощью которых можно оценить, как
эффективность трансфекции, так и биологическое действие являются флуоресцентная
микроскопия и/или проточная цитофлуориметрия [113, 139, 140]. При использовании данных
методов для оценки трансфекции используется флуоресцентная метка, вводимая как в НК, так и
в наночастицы (п. 1.3.1.). Оценку биологического действия данными методами можно оценить
либо при доставке pДНК, либо при работе с клетками, экспрессирующими зелёный
флуоресцентный белок GFP. Применение GFP наиболее распространённый метод при изучении
биологической активности наночастиц [58, 71, 77, 118]. За экспрессией GFP, а также и
люциферазы, можно следить, измеряя интенсивность флуоресценции или люминесценции,
непосредственно на спектрометре. При выборе других мишеней, отличных от GFP,
количественные изменения экспрессии генов-мишеней определяют с помощью ПЦР, измеряя
уровень mРНК, либо вестерн-блота и иммуноферментного анализа, измеряя уровень белка [62,
67, 101]. Например, данные методы применяли при изучении подавления генов васкулярноэндотелиального фактора роста (VEGF) [98, 99, 101] и Bcl-2 [91, 92]. Примеры других методов,
применяющихся для изучения доставки и биологической активности наночастиц и их
комплексов и конъюгатов с лекарственными препаратами, представлены в таблице 1.6.
29
Таблица 1.6. Доставка и биологическая действие наночастиц и их комплексов и конъюгатов с
лекарственными препаратами в эукариотических клетках
Наночастицы,
их комплексы
и конъюгаты
Размер,
нм
Клетки
Биологическое действие наночастиц на
клетки
Ссылки
TiO2
20
HeLa
C помощью TEM (трансмиссионная [129]
электронная микроскопия) и TXM
(трансмиссионная
рентгеновская
микроскопия) показано, что наночастицы
проникают в клетки.
TiO2
21.2
Ls-174-t,
рак
толстой
кишки
человека
Показаны фотокаталитические свойства [40]
наночастиц при облучении УФ светом,
приводящие к гибели клеток.
TiO2Dopamine-ДНК
3-5
MCF7/WS8,
рак груди
человека;
PC3, рак
простаты
человека;
PC12,
феохромоцитома
крыс
С помощью TEM и XFM (рентгеновская [112]
флуоресцентная микроскопия) показано,
что наноконъюгаты, трансфецируемые
электропорацией,
специфически
накапливаются в митохондриях или ядрах
в зависимости от последовательности
ДНК, присоединённой к наночастицам. В
работе
использовали
25-звенный
олигонуклеотид, комплементарный к
смысловой цепи митохондриального гена
NADH дегидрогеназы 2, и 15-звенный
олигонуклеотид,
комплементарный
антисмысловой
цепи
гена
R18S
рибосомальной РНК.
TiO2•PL-ДНК,
TiO2•PL•ДНК
5
MDCK,
клетки
почки
собаки
Подавление размножения вируса гриппа [132]
A на примере штамма A/Aichi/2/68
(H3N2). Показано, что при доставке ДНК
олигонуклеотида, направленного на 3’конец vРНК сегмента 5, кодирующего
нуклеопротеин, титр вируса снижался на
2.7 lg(TCID50/мл), тогда как при тех же
условиях при использовании ДНК
олигонуклеотида, направленного на 5’конец
mРНК
или
cРНК
(РНК
комплементарная vРНК) титр вируса
снижался на 1.1 lg(TCID50/мл). Показано,
что
увеличение
концентрации
TiO2•PL•ДНК приводит к дальнейшему
снижению титра вируса. TiO2•PL-ДНК, в
котором ДНК присоединена ковалентно к
PL более активно игибирует вирус гриппа
(в 20 раз) по сравнению с TiO2•PL•ДНК, в
30
котором ДНК присоединена нековалентно
к PL.
TiO2•PL-ДНК
5
MDCK,
клетки
почки
собаки
Эффективное подавление размножения [141]
вируса гриппа A на примере штаммов
A/Aichi/2/68(H3N2),
A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1),
A/Salekhard/01/2009 (H1N1). Мишень 3’некодирующий участок vРНК сегмента 5,
кодирующего нуклеопротеин. Снижение
титра вируса более чем в 1000 раз или на
3.0-3.9 lg(TCID50/мл) в зависимости от
штамма
вируса.
Показано,
что
использованная система чувствительна к
наличию
мисматчей:
увеличение
мисматчей на 1, 2 или 3 основания в ДНК
олигонуклеотиде снижает эффективность
ингибирования размножения вируса в 2, 6
и 30 раз соответственно.
TiO2-ализарин
3
Семена
Arabidopsis
Наноконъюгаты
проникают
и [121]
удерживаются в семенах Arabidopsis.
Наноконъюгаты
зафиксированы
в
клеточных
вакуолях
и
ядрах
микроскопией.
TiO2-ализарин
6
PC3M, рак Показано,
что
в
проникновении [139]
простаты
наноконъюгатов в клетки участвуют три
человека
главных пути эндоцитоза пути: клатрин- и
кавеолин-опосредованный
эндоцитоз,
макропиноцитоз.
Результаты
подтвердили проточной цитометрией,
используя специфические ингибиторы
для каждого из путей.
TiO2(PTX)•
PEI-FA
150;
KB, рак
носоглотки
человека;
A549, рак
лёгких
человека
Использовали противораковый препарат [18]
паклитаксел (PTX), загруженный в поры
наночастиц. Показано, что проникновение
в клетки KB было в 5 раз выше, чем в
клетки A549 за счёт большей экспрессии
рецепторов
к
фолиевой
кислоте.
Происходило высвобождение препарата
при облучении клеток УФ светом и
снижение выживаемости клеток KB с 81%
до 27% в присутствии противоракового
препарата. Значительно меньший эффект
на клетках A549. Результаты получены с
использованием
флуоресцентной
конфокальной микроскопии.
U2OS,
остеосар-
В клетки предварительно ввели ДНК [57]
плазмиду, экспрессирующую Firefly и
(поры
2-3)
SiO2•PEI•
siРНК
34
31
кома
млекопитающих
Renilla люциферазы. Мишенью siРНК
являлась Firefly люцифераза, Renilla
люциферазу использовали в качестве
контроля. Наблюдали уменьшение уровня
экспрессии Firefly люциферазы в ~10 раз,
тогда как уровень экспрессии Renilla
люциферазы оставался постоянным.
SiO2(Fe3O4)
(siРНК)•
PEI-KALA
50
(поры
3.6)
A549, рак Использовали
магнитные
пористые [101]
лёгких;
наночастицы SiO2, покрытые конъюгатом
HeLa
PEI и пептида KALA. Пептид способен
сливаться с клеточной мембраной и
обеспечивать
выход
из
эндосом,
высвобождая siРНК в цитоплазму. siРНК
загружали в поры наночастиц, что
обеспечивало её защиту от действия
клеточных ферментов. В клетках A549 по
данным проточной цитофлуорометрии
происходило подавление экспрессии GFP
на
80%.
Подавление
экспрессии
васкулярно-эндотелиального
фактора
роста (VEGF) на ~85% в клетках A549, на
~30% в клетках HeLa по данным
иммуноферментного
анализа.
При
доставке с липофектамином наблюдали
сравнимое
понижение
уровней
экспрессии генов.
SiO2-NH3+•
ДНК
47.7
C166,
эндотелиальные
клетки
мыши
Подавление уровня экспрессии mРНК [62]
GFP в 2.5 раза. Оценку уровня экспрессии
mРНК проводили ПЦР в реальном
времени.
SiO2•PL•siРНК;
SiO2-NH3+
•siРНК
100-200
(поры
20)
HeLa;
KHOS,
остеосаркома
Использовали наночастицы, 1) покрытые [52]
поли-L-лизином, 2) модифицированные
введением аминогрупп на поверхность. С
помощью флуоресцентной микроскопии
показано увеличение эффективности
доставки
siРНК
и
увеличение
биологического эффекта в случае
наночастиц, покрытых PL. Биологический
эффект выражался в снижении уровня
экспрессии белков (polo-like киназы 1
(PLK1), minibrain-related киназы (Mirk)),
жизненно важных для роста клеток
KHOS. Подавление экспрессии белков
приводило
к
снижению
жизнеспособности
клеток
KHOS
максимум на 30% в случае наночастиц,
покрытых полилизином, и на 15% в
32
случае наночастиц, модифицированных
введением аминогрупп.
SiO2-NH3+
•ДНК
25
SiO2(доксоруби 120
цин)-NH3+
• (поры
ДНК
3.8)
SiO2(Fe3O4)•
PEI•siРНК
SiO2(хлорохин)
•PEG•
(PDMAEMA
или
PDEAEMA)•
(pДНК
siРНК)
HeLa
Показано снижение уровня экспрессии [58]
GFP
на
70%.
При
доставке
липофектамином – снижение уровня
экспрессии GFP на 50%.
HeLa
Использовали пористые наночастицы, [53]
покрытые ДНК, в поры загружали
противораковый препарат доксорубицин.
Показана более эффективная доставка
доксорубицина, выраженная в снижении
выживаемости клеток: до 40% в случае
доставки с наночастицами, до 85% в
случае
использования
свободного
доксорубицина в той же концентрации, до
75% в случае наночастиц, покрытых ДНК,
без доксорубицина.
Не
HEK293T
указан
размер
(поры
2.6-14.6)
Использовали
магнитные
пористые [67]
наночастицы SiO2 (в поры загружены
наночастицы
железа
в
качестве
контрастного реагента для МРТ). С
помощью
вестерн-блота
показано
уменьшение экспрессии гена GAPDH,
выраженное в снижении наработки белка
на
64%.
При
трансфекции
липофектамином
количество
белка
уменьшилось на 80%.
56.7
B16F10,
меланома
мыши
Происходит высвобождение наночастиц [55]
из эндосом благодаря загруженному в
поры хлорохину.
8-130
CHO,
клетки
яичника
китайского хомяка
Показано проникновение в клетки с [117]
помощью конфокальной микроскопии.
При увеличении размера наночастиц от 30
до 130 нм эффективность проникновения
уменьшилась в ~10 раз.
60-130
HeLa; Raw
264.7,
мышиные
макрофаги
Показано,
что
эффективность [54]
проникновения в клетки Raw 264.7
наночастиц, содержащих маннозу, в ~20
раз выше, чем наночастиц без маннозы.
Эффективность проникновения в клетки
HeLa не зависела от наличия маннозы в
составе
наночастиц.
Различия
в
или
SiO2•DOTAP•
ДНК
SiO2•маннозаPEI•ДНК
33
проникновении
связаны
с
гиперэкспрессией рецепторов маннозы на
поверхности клеток Raw 264.7 по
сравнению с клетками HeLa.
Fe3O4@SiO2•
PAH•pДНК
50 (ядро HeLa
15)
Доставка ДНК плазмиды, кодирующей [104]
GFP. Наблюдали экспрессию GFP. При
воздействии
магнитным
полем
экспрессию белка наблюдали в центре
магнитного поля, это может быть вызвано
увеличением количества наночастиц в
центре магнитного поля и соответственно
уменьшением на краях.
pДНК•PEI•
HA•CaP
Общий
200
B16,
клетки
меланомы
мыши.
Внешняя оболочка наночастиц - фосфат [87]
кальция. Доставка ДНК плазмиды,
кодирующей
GFP.
С
помощью
конфокальной микроскопии показано, что
происходило изменение экспрессии белка
GFP, которая достигала своего максимума
на четвёртый день после трансфекции, а
затем уменьшалась. Данная зависимость
связана с постепенной деградацией
внешней оболочки наночастиц.
CaP•bpPEG•
Общий
(ДНК
или 130-180
siРНК)
PC-3,
клетки
аденокарциномы
простаты
[92]; HeLa
[91]
Мишень – mРНК гена Bcl-2, избыточная [91, 92]
экспрессия которого наблюдается в
некоторых раковых клетках. С помощью
ПЦР в реальном времени и вестерн блота
показано уменьшение в 6 раз уровня
экспрессии
mРНК
и
белка,
соответствующих гену Bcl-2. При
доставке с помощью липофектамина
получили
аналогичные
результаты.
Система
на
основе
наночастиц
чувствительней к мисматчам.
CaP•siРНК•
Общий
(PEG-PAA или 180-280
PEG-PMA)
HEK293,
Клетки содержали плазмиды pGL3 и pRL- [96, 97]
TK,
экспрессирующие
люциферазу.
Показано
уменьшение
экспрессии
Photinus pyralis GL3 люциферазы на 60%,
на фоне неизменной экспрессии Renilla
reniformis RL-TK люциферазы/
CaP•PEGPAsp(DETAco)•siРНК
PanC-1,
клетки
рака
поджелудочной
железы
Использовали полимер, меняющий заряд [98, 99]
и
способствующий
высвобождению
наночастиц из эндосом при изменении pH
среды, Показано снижение уровня
экспрессии mРНК гена VEGF на 82% с
помощью ПЦР в реальном времени
Общий
42, 100
34
Fe3O4•PEISA•mcДНК
10.4
(общий
64)
MCF-7,
Показано
окраской
с
клетки
берлинской
лазури
рака груди наночастиц в цитоплазме.
человека
Fe3O4•поликатион•pДНК
Общий
13-34
Hep G2,
клетки
рака
печени
человека
Доставка ДНК плазмиды, кодирующей β- [70]
галактозидазу.
Исследовали
эффективность трансфекции, анализируя
активность β-галактозидазы. Показано,
что воздействие магнитного поля
повышает эффективность трансфекции.
Fe3O4•PEG•
12
(PA, или PL,
или PEI)•siРНК
C6,
рак
мозга;
MCF-7,
рак груди;
TC2, рак
простаты
Показано уменьшение эффективности [72]
экспрессии GFP на 30-80% в зависимости
от типа клеток, выражающееся в
снижении интенсивности флуоресценции,
нормированной на число выживших
клеток.
Au-siРНК
13
HeLa
Показано уменьшение активности Firefly [21, 82]
люциферазы в присутствии наночастиц на
73%, а в присутствии свободной siРНК на
33%. Уровень контрольной Renilla
люциферазы не изменялся.
Au-NH3+•
pДНК
1.4
C2C12,
(общий мышиные
200-600) миобласты
Доставка ДНК плазмиды, кодирующей [17]
мышиный интерлейкин 2. С помощью
ПЦР в реальном времени, показано, что
при доставке с помощью наночастиц
уровень mРНК в 6.4 раза выше по
сравнению с доставкой PEI (25 кДа), а
иммуноферментным анализом показано,
что экспрессия белка интерлейкина 2 в 3.2
раза
выше.
Наблюдали
концентрационную
зависимость,
выражающуюся в увеличении экспрессии
mРНК интерлейкина 2 при увеличении
количества siРНК, иммобилизованной на
наночастицах.
Au•pДНК•
Lipofectamine2000
15, 30, A549,
50, 80
клетки
рака
лёгких
человека
Использовали
ДНК
плазмиду, [19]
кодирующую GFP. Доставка pДНК в
составе Au•pДНК•Lipofectamine-2000 в
1.5-4
раза,
чем
в
составе
pДНК•Lipofectamine-2000. Выживаемость
клеток при трансфекции с наночастицами
составила 80-100%, с липофектамином –
40%.
Au•DODAB•
pДНК
14
Использовали
ДНК
плазмиду, [83]
кодирующую GL3 люциферазу. С
помощью сканирующей электронной
HEK 293
35
помощью [68]
накопление
микроскопии
(SEM)
показано
проникновение в клетки. Для оценки
биологического действия интенсивность
люминесценции
нормировали
на
количество белка люциферазы. Показано
увеличение эффективности трансфекции
в ~10 раз по сравнению с DODAB•ДНК.
Au•PEI•
PAH-Cit•PEI•
pДНК
15
HeLa
Использовали
ДНК
плазмиду, [85]
кодирующую GL3 люциферазу. Для
оценки
биологического
действия
интенсивность
люминесценции
нормировали на количество белка
люциферазы.
Показано,
что
эффективность трансфекции в 3-4 раза
выше при использовании комплекса на
основе наночастиц, чем при трансфекции
ДНК плазмиды с помощью PEI или
липофектамина. Данные подтвердили с
помощью флуоресцентной микроскопии
при трансфекции pДНК, кодирующей
GFP.
Au-CS•
PAH-Cit•PEI•
siРНК
46.9
(общий
88.5)
HeLa,
MCF-7R
Использовали
полимер
(PAH-Cit), [7]
меняющий заряд при изменении значений
pH среды. Мишень – mРНК гена MDR1,
кодирующего P-гликопротеин, избыточно
экспрессирующийся в клетках MCF-7R,
обладающих
множественной
лекарственной
устойчивостью.
Поглощение доксорубицина клетками
увеличилось в 20 раз после обработки
комплексом
с
наночастицами,
содержащими siРНК, и в 2-2.5 раза, по
сравнению с PEI, и с комплексом
наночастиц, содержащим полимер, не
меняющий
заряд
(PSS).
Уровень
экспрессии
mРНК
гена
MDR1
уменьшился на 80% по данным ПЦР.
Au•PEI•siРНК•
PEI
15.5
CHO-K1,
клетки
яичника
китайского хомяка
Показана концентрационная зависимость [118]
уменьшения
экспрессии
GFP
от
количества siРНК. При увеличении
концентрации siРНК от 0.15 нМ до 0.37
нМ, экспрессия GFP уменьшилась на 80%,
по
сравнению
с
контролем
(некомплементарная siРНК).
SiO2@Au82 (ядро H1299,
(ДНК/ДНК или 60)
клетки
siРНК)
рака
Показаны фототермические свойства [20, 42]
наночастиц золота. Экспрессия GFP
уменьшалась на 50% в клетках,
обработанных
наночастицами,
36
Au•PEI•pДНК• 17-27
SS37•
(общий
siРНК•447
200)
SS37, 447 –
синтетические
полимеры
лёгких
человека
содержащими НК, при облучении лазером
на длине волны 800 нм, без облучения – на
25%.
GBM319,
клетки
глиобластомы
человека.
Использовали
клетки,
как
GFP [86]
положительные,
так
и
GFP
отрицательные;
ДНК
плазмиду,
кодирующую
GFP.
Конструкция
комплекса
позволяет
доставлять
одновременно две разных НК, siРНК и
ДНК плазмиду. Показано уменьшение
экспрессии GFP, производимого клетками
в~10 раз в GFP положительных клетках
(эффект siРНК), увеличение экспрессии
GFP в ~10 раз в GFP отрицательных
клетках (эффект ДНК плазмиды).
Символом «•» обозначена нековалентная связь, символом «-» – ковалентная связь. Fe3O4@SiO2,
SiO2@Au – наночастицы «ядро-оболочка».
TEM – трансмиссионная электронная микроскопия, TXM – трансмиссионная рентгеновская
микроскопия, XFM – рентгеновская флуоресцентная микроскопия, МРТ – магнитнорезонансная томография, ПЦР – полимеразная цепная реакция.
CaP – фосфат кальция, PTX – паклитаксел, PEI – полиэтиленимин, FA – фолиевая кислота, PL
– поли-L-лизин, PA – поли-L-аргинин, GFP – зелёный флуоресцентный белок, PEG –
полиэтиленгликоль, bpPEG – бифосфонатное производное PEG, PDMAEMA – поли(2(диметиламино)этилметакрилат), PDEAEMA – поли(2-(диэтиламино)этилметакрилат), DOTAP
– N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметаммоний метилсульфат, PAH – полиаллиламин
гидрохлорид, Cit – цитраконовый ангидрид, HA – гиалуроновая кислота, PEG-PAA –
полиэтиленгликоль-блок-полиаспаргиновая кислота, PEG-PMA – полиэтиленгликоль-блокполиметакриловая кислота, PEG-PAsp(DET-Aco) – полиэтиленгликоль-блок-поли{N-[N’-(N’’цис-аконитил-2-аминоэтил)-2-аминоэтил]аспартамид, DODAB – диметилдиоктадециламмоний
бромид, CS – хитозан, SS37 – синтетический полиамидоамин, 447 – поли(β-амино эфир), pДНК
– ДНК плазмида, mcДНК – миникольцевая ДНК (генетический вектор).
Помимо
методов,
непосредственно
регистрирующих
биологическое
действие,
выраженное в уменьшении или в увеличении (доставка pДНК) экспрессии гена, возможно
определить наличие биологического эффекта косвенным путём, не измеряя каким-либо образом
изменение экспрессии гена-мишени (Таблица 1.6). В работе [52] мишенью являлись гены pololike киназы 1 (PLK1), minibrain-related киназы (Mirk). Белки, экспрессируемые данными генами,
важны для роста клеток KHOS. Ингибирование экспрессии этих генов при доставке siРНК,
доставляемой наночастицами SiO2, приводило к снижению жизнеспособности клеток на 30%,
тогда как в отсутствии siРНК жизнеспособность клеток уменьшалась на 10%. Аналогичного
эффекта добились в работе [7], в которой исследовали доставку siРНК, направленной на ген
MDR1, кодирующий P-гликопротеин, избыточно экспрессирующийся в клетках MCF-7R,
обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Такие клетки устойчивы к действию
противоракового препарата доксорубицина, благодаря тому, что P-гликопротеин выполняет роль
37
откачивающего насоса и удаляет доксорубицин из клеток. После обработки клеток
наночастицами золота, в состав которых была включена siРНК, проникновение доксорубицина
увеличилось в 20 раз, по сравнению с системой в отсутствии siРНК. С помощью ПЦР было
подтверждено, что уровень mРНК гена MDR1 уменьшился на 80% по сравнению с системой
доставки, содержащей неспецифичную для гена MDR1 siРНК.
Эффективность доставки и биологического действия НК, доставляемых с помощью
наночастиц, хорошо иллюстрируется в сравнении с широко известными транспортёрами НК.
Одним из таких транспортёров является
Lipofectamine 2000 (далее липофектамин),
формирующий липосомы в водных растворах (Таблица 1.6).
Эффективность конечного биологического воздействия, достигаемого при трансфекции с
помощью наночастиц, обычно не хуже или сравним с аналогичной эффективностью, получаемой
при традиционной трансфекции с использованием липофектамина [58, 67, 91, 92, 101]. Например,
в работе [58] при доставке олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН) при помощи наночастиц SiO2,
содержащими аминогруппы на поверхности, показано снижение уровня экспрессии GFP на 70%,
тогда как при использовании липофектамина – на 50%. В работе [67] при доставке siРНК с
помощью пористых наночастиц SiO2, покрытых PEI, в поры которых были загружены магнитные
наночастицы оксида железа, наблюдается обратный порядок значений. С помощью вестернблота показано уменьшение экспрессии гена GAPDH на 64% при использовании наночастиц в
качестве транспортёра, в случае липофектамина экспрессия уменьшилась на 80%. Как видно из
приведённых примеров, различие в оказываемом биологическом действии между НК,
доставленными с помощью комплексов с наночастицами или с липофектамином, не велико.
При этом наночастицы обладают и другими полезными свойствами, помимо
проявленного эффекта. Так описанные выше пористые наночастицы SiO2, содержащие
магнитные наночастицы оксида железа [67], возможно визуализировать при помощи МРТ и
локализовать доставку в определённой области по средствам магнитного поля. Помимо этого,
возможна
дальнейшая
модификация наночастиц,
что
также позволит
улучшить
их
биологическую активность.
При сравнении эффекта, оказываемого siРНК на экспрессию гена Bcl-2 в раковых клетках
PC-3, также, как и в предыдущих работах не было выявлено существенных различий при
доставке с помощью системы на основе наночастиц фосфата кальция или липофектамина [92].
Однако система доставки на основе наночастиц оказалась значительно чувствительней к
наличию мисматчей и, таким образом, её действие было более специфичное. Так замена 13
нуклеотидов из 21 в siРНК привела к увеличению экспрессии гена Bcl-2 при использовании
системы доставки на основе наночастиц по сравнению с той же системой, содержащей siРНК без
38
замен нуклеотидов, тогда как при доставке с помощью липофектамина были замечены меньшие
изменения в экспрессии гена (Рис. 1.6).
В работе [19] показано, что система доставки с помощью комплекса наночастиц с
липофектамином
существенно
увеличивает
биологический
эффект
по
сравнению
с
использованием свободного липофектамина. Авторы использовали комплекс наночастиц золота
и pДНК, покрытый липофектамином. Такая транспортная система позволила увеличить
экспрессию GFP, кодируемого доставляемой pДНК, в 1.5-4 раза (в зависимости от количества
липида) по сравнению с доставкой с помощью свободного липофектамина, при этом токсичность
конструкции на основе наночастиц была значительно ниже.
Так жизнеспособность клеток при трансфекции комплекса наночастиц с липофектамином
составила 80-100%, а со свободным липофектамином – 40%. Полученные данные согласуются с
результатами, обсуждаемыми в п. 1.4.1 и демонстрирующими, что наночастицы снижают
токсичность иммобилизованного на них поликатиона.
Рис. 1.6. Относительный уровень экспрессии mРНК (а) или белка (б) Bcl-2 в клетках,
обработанных наночастицами фосфата кальция, покрытых bpPEG (НЧ), или липофектамином
(LF), загруженных siРНК, направленной против гена Bcl-2. Уровень экспрессии mРНК
определён методом ПЦР, белка – вестерн блотом. Уровень экспрессии определяли относительно
β-актина. Концентрация siРНК 10 (а) и 30 нМ (а, б). Использовали siРНК длиной 21 нуклеотид и
аналогичную siРНК, содержащую 13 мисматчей (мм). Клетки аденокарциномы PC-3 [92].
При
испытании
системы
транспортировки
короткого
фрагмента
ДНК
(ДНК
комплементарна 3’-концу РНК вируса гриппа A, кодирующей NP белок) с помощью наночастиц
диоксида титана, покрытых конъюгатом полилизина с ДНК (PL-ДНК), обнаружили, что
олигонуклеотид, доставленный с помощью такой конструкции (TiO2•PL-ДНК), способен
понижать титр вируса гриппа A на 3.9 lg(TCID50/мл) или в 8000 раз при сравнении с контрольной
популяцией клеток, необработанной образцами (Рис. 1.7) [131], при этом эффективность
39
действия препарата была сравнима при доставке перед и после заражения клеток. Использование
комплекса ДНК с липофектамином снизило титр вируса на 2.4 lg(TCID50/мл) или в 250 раз, что
значительно уступает результатам, полученным при использовании комплекса с наночастицами.
При этом олигонуклеотид, не комплементарный генам вируса гриппа, доставленный
аналогичными способами не оказал существенного влияния на титр вируса гриппа. Следует
отметить, что высокий эффект проявлялся именно при доставке с помощью наночастиц, а при
использовании конъюгата PL-ДНК наблюдаемый биологический эффект был низким (Рис. 1.7).
Рис. 1.7. Ингибирование вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в клетках MDCK, обработанных
наночастицами TiO2, наночастицами, покрытыми полилизином (PL) TiO2•PL, свободной ДНК,
конъюгатом PL-ДНК, комплексом ДНК и липофектамина LF (LF•ДНК), наночастицами TiO2,
покрытыми конъюгатом PL-ДНК (TiO2•PL-ДНК). Чёрные столбцы – ДНК, комплементарная 3’концу гена NP вируса; светлые столбцы – ДНК, не комплементарная генам вируса. Концентрация
5 мкг/мл по наночастицами TiO2 и 0.1 мкМ по фрагменту ДНК. Титр вируса определён по
реакции гемагглютинации [131].
Таким образом, приведённые выше примеры демонстрируют, что системы транспорта НК
на основе наночастиц не только не уступают коммерчески доступным системам транспорта, но
даже и превосходят их, о чём говорит больший биологический эффект, оказываемый НК, более
низкая токсичность наночастиц и чувствительность к мисматчам.
1.5. Проблема эффективного выхода НК, доставленных в клетки, из эндосом
Одной из проблем при доставке НК в клетки является их эффективный выход из эндосом.
НК в составе наночастиц, попадая внутрь клеток, оказываются внутри эндосом и остаются
недоступными для своих мишеней. В литературе описаны различные способы решения этой
проблемы. Так, например, существуют данные, что поликатионы способны сливаться как с
40
клеточной мембраной, так и с мембраной эндосом. Это приводит, во-первых, к улучшению
проникновения наночастиц внутрь клеток, а, во-вторых, к дестабилизации мембраны эндосом и
успешному выходу наночастиц из эндосом в цитозоль [52]. Таким образом, поликатионы
способствуют улучшению доставки наночастиц, а сами наночастицы в свою очередь снижают
токсичность иммобилизованного на них поликатиона, что было рассмотрено выше (см. раздел
1.4.1).
Стоит отметить, что наночастицы, покрытые поликатионами, более эффективно
доставляют НК, по сравнению с наночастицами, модифицированными низкомолекулярными
соединениями, вводящими положительный заряд, например, в виде аминогрупп. Данный эффект
объясняется наличием большего числа сайтов, доступных для посадки НК, в результате чего
происходит увеличение биологического эффекта. Например, в работе [52] сравнивали
наночастицы SiO2, покрытые полилизином и модифицированные введением аминогрупп.
Наблюдали уменьшение экспрессии жизненно важных для роста клеток белков polo-like киназы
1 (PLK1) и minibrain-related киназы (Mirk), что выражалось в снижении жизнеспособности
клеток. В первом случае жизнеспособность клеток упала на 30%, тогда как во втором – на 15%.
Не исключено также, что такой эффект понижения эффективности может быть связан не только
с большим количеством положительно заряженных аминогрупп групп в поликатионе, но и с
более эффективным связыванием НК с самим поликатионом, чем с отдельными положительно
заряженными аминогруппами, иммобилизованными на поверхности наночастиц.
Рис. 1.8. Экспрессия GFP после трансфекция клеток HeLa Au•PEI•PAH-Cit•PEI•pДНК с
различным весовым соотношением наночастиц Au и pДНК (верхняя секция); PEI•pДНК,
Lipofectamine•pДНК, Au•PEI•pДНК, Au•PEI•PSS•PEI•pДНК использовали в качестве контроля,
соотношение наночастиц Au и pДНК 7.5:1 (нижняя секция). Данные флуоресцентной
микроскопии. Масштаб 30 мкм. [85].
41
В литературе описаны и другие способы решения проблемы повышения эффективности
выхода наночастиц из эндосом. Одним из таких способов является использование полимеров,
меняющих заряд при изменении pH. В работах [7, 85] исследовали комплексы на основе
наночастиц золота, покрытых полимером. Данный комплекс состоял из нескольких слоёв: PEI,
покрывавший
непосредственно
иммобилизованной
на
ней
наночастиц
siРНК,
золота,
внешний
промежуточный
слой
–
слой
содержал
конъюгат
PEI
с
гидрохлорида
полиаллиламина и цитраконового ангидрида (PAH-Cit). При попадании этих комплексов в
эндосомы и изменении pH от нейтрального до слабокислого происходит гидролиз связи между
PAH и Сit. Разрыв связи приводит к высвобождению комплекса PEI•siРНК из состава наночастиц
и улучшению выхода siРНК из эндосом, что скорее всего объясняется усилением эффекта
«протонной губки», оказываемого PEI после высвобождения. С помощью флуоресцентной
микроскопии авторы продемонстрировали, что использование полимера, меняющего заряд,
существенно увеличивает эффективность трансфекции в клетках HeLa (Рис. 1.8). Действенность
данного подхода была подтверждена на клетках HEK 293T.
Аналогичный
эксперимент,
но
с
использованием
обычного
полианиона
(полистиролсульфонат, PSS) вместо PAH-Cit продемонстрировал низкую эффективность
трансфекции такого комплекса. Это свидетельствует в пользу проявления эффекта «протонной
губки» после разрыва связи в PAH-Cit при кислом pH, что приводит к высвобождению комплекса
PEI•pДНК из состава наночастиц и более эффективному разрушению мембраны эндосом, тогда
как в случае PSS отсутствует кислотолабильная связь и, следовательно, высвобождение
PEI•pДНК из состава комплекса с наночастицами не происходит.
Рис. 1.9. а) Активность ДНК плазмиды люциферазы, доставленной наночастицами с/без
хлорохина в клетках. б) Кинетика высвобождения хлорохина из наночастиц, весовое
соотношение наночастицы:ДНК равно 20. Клетки B16F10. CQ – хлорохин; PMSN – наночастицы
SiO2, покрытые PEG; PDEAEMA и PDMAEMA – катионные полимеры. [55].
42
Для разрушения эндосом можно использовать пористые наночастицы, в поры которых
введены низкомолекулярные соединения, способствующие разрушению мембран. В работе [55]
в качестве такого соединения использовали известный лизосомотропный реагент – хлорохин,
который препятствует закислению среды в эндосомах. Доставку хлорохина осуществляли в
порах наночастиц SiO2, а на поверхности наночастиц была иммобилизована ДНК плазмида,
кодирующая люциферазу. Эффективность экспрессии люциферазы при использовании
наночастиц с хлорохином и без него различалась не более, чем в ~5 раз, в зависимости от
использованного поликатиона, которым покрывали наночастицы (Рис. 1.9 а). Следует отметить,
что иммобилизация pДНК значительно снижала выход хлорохина из пор, что вполне ожидаемо,
поскольку pДНК, иммобилизованная на поверхности наночастиц, создавала ещё одно
препятствие на пути препарата (Рис. 1.9 б).
1.6. Выход НК и других соединений из состава комплекса с наночастицами
Возможность выхода лекарственных препаратов из состава комплекса с наночастицами
играет не менее важную роль чем их доставка и выход из эндосом. Это объясняется тем, что
связанный с транспортёром лекарственный препарат обладает меньшим числом степеней
свободы, чем не связанный. В работах [20, 42] были продемонстрированы фототермические
свойства наночастиц золота, выражающиеся в локальном увеличении температуры поверхности
наночастиц при облучении лазером в ИК диапазоне. При облучении конъюгата наночастиц
золота и ДНК/ДНК или РНК/РНК дуплекса наблюдали диссоциацию дуплекса, в результате чего
олигонуклеотид, не связанный с наночастицами ковалентно, оказывался свободным, что
увеличивало эффективность взаимодействия с мишенью. Показано, что облучение лазером на
длине волны 800 нм приводило к снижению экспрессии GFP на 50%, в то время как без облучения
лазером уровень экспрессии снижался только на 25% [20]. Фотоактивные свойства наночастиц
TiO2 [40, 142] также могут быть использованы для высвобождения лекарственных препаратов из
состава комплекса с наночастицами. Так в работе [18] противораковый препарат паклитаксел
(PTX) загружали в поры наночастиц TiO2, покрытых конъюгатом PEI-FA. После доставки
наночастиц в клетки, их облучали УФ светом, что приводило к разрушению связи между TiO2 и
PEI и последующему высвобождением препарата. Этот эффект подтверждается данными по
уменьшению жизнеспособности клеток, которая снижалась на 81% в присутствии препарата, а в
его отсутствии всего на 27%. Таким образом, фотоактивные свойства наночастиц могут быть
использованы для эффективного высвобождения лекарственного препарата от наночастицытранспортера.
43
Высвобождение НК из состава наночастиц может осуществляться и при разрыве какойлибо связи в многослойном комплексе, например, как в случае полимера PAH-Cit [7, 85],
описанного в разделе 1.5.
Использование полимеров или наночастиц способных, соответственно, гидролизоваться
или растворяться в клеточной среде является перспективным направлением. Применение таких
наночастиц и полимеров может временно защитить доставляемые препараты, которые находятся
внутри формируемого комплекса, а также обеспечить их высвобождение с течением времени. В
работе [86] использовали комплекс наночастиц золота, покрытый слоем полимеров,
гидролизующихся в клеточной среде, который защищал НК при доставке и деградировал после
доставки в клетку, освобождая НК и давая возможность проявления биологической активности,
которая выражалась либо в подавлении целевого гена, либо в экспрессии доставленной pДНК.
Также важным примером может послужить работа [87], в которой авторы покрывали
комплекс pДНК•PEI•HA оболочкой из фосфата кальция. Проникая в клетки такой комплекс
попадает в эндосомы, где при кислом pH фосфат кальция постепенно растворяется, высвобождая
комплекс pДНК•PEI•HA. Такой комплекс обладает эффектом «протонной губки» и способен
выходить из эндосом после чего возможна экспрессия pДНК и увеличение количества GFP,
максимум которого наблюдали на четвёртый день после трансфекции, после чего уровень GFP
стал уменьшался (Рис. 1.10), что было связано с гидролизом самой pДНК.
Рис. 1.10. Кинетика экспрессии гена GFP в клетках B16. HA – гиалуроновая кислота, CaP –
фосфат кальция [87].
1.7. Проблемы адресной доставки наночастиц с НК к клеткам-мишеням
Помимо проблемы, связанной с высвобождением лекарственных препаратов, что
способствует увеличению биологического эффекта, существует проблема адресной доставки
наночастиц с НК к определенным клеткам в организме. Решение данной проблемы позволит
более эффективно доставлять лекарственные препараты к своим клеткам-мишеням, а значит
усилить биологический эффект. Проблему адресной доставки обычно решают, используя
44
наночастицы, содержащие лиганды к определенно выбранным клеточным рецепторам. В уже
описанной выше работе [18] использовали наночастицы TiO2, покрытые конъюгатом PEI-FA
(FA-фолиевая кислота), где фолиевая кислота выступала в качестве лиганда. При доставке в
клетки рака носоглотки KB, характеризующиеся гиперэкспрессией рецепторов фолиевой
кислоты, степень трасфекции увеличивалась в 5 раз по сравнению с клетками рака лёгких A549,
имеющих меньшее количество рецепторов фолиевой кислоты.
Park I.Y. и соавторы использовали наночастицы SiO2, покрытые конъюгатом PEI-манноза
[54]. При трансфекции клеток Raw 264.7, содержащих большое число рецепторов маннозы,
эффективность проникновения наночастиц, с включённой в состав маннозой, увеличивалась в 20
раз по сравнению с транспортёром без маннозы. Тогда как эффективность проникновения в
клетки HeLa, не имеющих ярко выраженной экспрессии маннозных рецепторов, была одинакова
в обоих случаях. Аналогичный процесс происходил в описанной выше работе [18], однако в
данном случае в качестве лиганда использовали фолиевую кислоту.
Как видно из приведённых работ, включение в состав наночастиц лигандов к клеточным
рецепторам значительно увеличивает эффективность доставки в специфичные к лигандам клетки
и тем самым увеличивают избирательность воздействия препарата на определенные
специфически выбранные клетки.
Заключение к обзору литературы
Таким образом, из проведенного обзора литературы видно, что на настоящий момент
отработаны методы синтеза различных типов наночастиц и получения их модификаций с
полимерами и нуклеиновыми кислотами, в частности с их короткими фрагментами,
олигонуклеотидами, и имеющими большой размер ДНК плазмидами. Полученные системы на
основе наночастиц широко применяются для доставки НК, как в виде конъюгатов наночастиц и
НК, так и в виде комплексов наночастиц с поликатионами и НК, собирающихся на основе
электростатических взаимодействий. Последний способ широко используется из-за простоты
сборки конструкции, поскольку для создания конечного комплекса достаточно смешать все
компоненты в правильном порядке. Таким образом, можно заключить, что одним из
распространенных, доступных, легких и эффективных способов доставки НК в клетки является
способ электростатической иммобилизации отрицательно заряженных НК на положительно
заряженные молекулами или наночастицы.
Применение комплексов наночастиц с поликатионами имеет и ещё одно преимущество
помимо простой иммобилизации НК: токсичность наночастиц, покрытых поликатионом
значительно понижается по сравнению со свободным поликатионом, а сам поликатион
способствует более эффективной доставке наночастиц [52, 54].
45
Такой способ иммобилизации НК на наночастицах может быть использован при
разработке
метода
обратимой
регулируемой
иммобилизации
НК
или
их
аналогов,
присоединенных к комплементарной НК посредством Уотсон-Криковских взаимодействий.
Наиболее привлекательным в этом плане может быть использование пептидных нуклеиновых
кислот ПНК [22], у которых отсутствует отрицательный заряд, исключающий взаимодействия с
наночастицей,
покрытой
поликатионом.
ПНК
к
тому
же
обладают
повышенной
термостабильностью дуплексов, образуемых с одноцепочечными ДНК- и особенно РНКпоследовательностями.
Как было показано в обзоре, существуют конъюгаты ПНК с наночастицами золота [81] и
диоксида титана [133], однако данные о доставке таких нанокомпозитов в клетки и данные об
использовании их в биологических системах довольно скудные и такие работы не нашли своего
дальнейшего развития. Как правило, для доставки ПНК широко применяются конъюгаты с
пептидами, проникающими в клетки (cell penetrating peptide или CPP) [143], и другими
низкомолекулярными соединениями [144], которые, однако вовлекаются в эндосомные
компартменты и остаются в них, препятствуя доступу к НК-мишени, что является также
проблемой для данного типа конъюгатов [145, 146].
В настоящей работе предлагается оригинальный подход по доставке ПНК в клетки в
составе гибридных ДНК/ПНК-дуплексов с помощью наночастиц, покрытых поликатионами.
Такой метод имеет ряд преимуществ, которые будут изложены в следующих разделах.
Предлагаемый в данной работе метод создания системы доставки ПНК ранее описан не был.
46
Глава 2. Материалы и методы
Реагенты, использованные в работе
В работе использовали флуоресцеинизотиоцианат (FITC) (90%) (Sigma-Aldrich, США),
ацетонитрил (о.с.ч.) (Криохром, Россия), DMSO (х.ч.) (Реахим, Россия), DMF (о.с.ч.) (Реахим,
Россия), N-метилморфолин (99%) (Acros Organics, Бельгия), трифторуксусная кислота (TFA)
(HPLC grade) (Fisher Chemicals, Бельгия), м-крезол (99%), (Sigma-Aldrich, США). Tris (ultra-pure
grade) (Helicon, Россия), NaCl (USP grade) (Helicon, Россия), фермент полинуклеотидкиназа фага
Т4 (Сибэнзим, Россия), [γ32P] ATP с удельной активностью ~ 4000 Кю/моль (Биоссан, Россия),
хлорид магния (ч.д.а.) (Реахим, Россия), гидроксид калия (ч.д.а.) (ЗАО Мосреактив, Россия),
перхлорат лития (ч.д.а.) (Реахим, Россия), гидрофосфат калия (99%.) (Panreac, Испания);
гидробромид поли-L-лизина (MW 15 000-30 000, степень полимеризации 71-144) (Sigma-Aldrich,
США), MTT (98%, TLC) (Sigma, Германия), 37% раствор формальдегида (Sigma, Германия).
Реагенты для пептидного синтеза ПНК
В работе использовали реактивы для пептидного и ПНК-олигомерного синтеза: 2-(7-аза1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат (HATU) (Applied Biosystems,
США), 0.4M N-метилморфолин в DMF (Protein Technologies, США), 20% пиперидин в ДМФ
(Protein Technologies, США), полистирольный полимер 855013 Novabiochem® NovaSyn®TG
Sieber resin функционализированный 9-Fmoc-амино-ксантен-3-илоксильным фрагментом (200
ммоль/г) (Merck Schuchardt OHG, Германия), ПНК-мономеры (ASM Research Chemicals,
Германия).
Буферы
В работе использовали буферы:
0.01 М KH2PO4, 0.14 М NaCl, pH 7.5 (PBS);
0.01 М Трис-HCl, 0.14 М NaCl, pH 7.5 (TBS).
Клеточные работы. Проточная цитофлуориметрия, цитотоксичность
PBS в таблетках (0.01 М KH2PO4, 0.14 М NaCl, pH 7.4) (MP Biomedicals, Франция),
эмбриональная бычья сыворотка (HyClone, Великобритания), антибиотики (пенициллин,
стрептомицин, амфотерицин) (MP Biomedicals, Франция), трипсин (0.26% раствор) (MP
Biomedicals, Франция), TPCK-трипсин (Sigma, США), питательная среда IMDM, клетки MDCK
(ЛБНК, ИХБФМ СО РАН).
47
Клеточные работы. Конфокальная лазерная флуоресцентная микроскопия
Питательная среда IMDM, содержащая 10% эмбриональную бычью сыворотку и
антибиотики (100 ед/мл пенициллина, 0.1 мкг/мл стрептомицина), клетки HeLa (банк клеточных
культур Института Цитологии РАН, Санкт-Петербург).
Вирусологические работы
Трипсин (Sigma, США), антибиотики (БиоЛот, Россия), эмбриональная телячья сыворотка
(Gibco, США), питательная среда RPMI-1640 (БиоЛот, Россия), L-глутамин, эритроциты петуха,
клетки MDCK (коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), вирус гриппа А
Aichi/2/68 (H3N2) (коллекция микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия).
2.1. Приготовление 0.2 мМ раствора полилизина в воде
Навеску гидробромида поли-L-лизина (4.5 мг) растворяли в 1 мл воды, получали 21.6 мМ
раствор в расчете на мономерную единицу гидробромида лизина (МW = 209) или на 1 свободную
аминогруппу. Принимая во внимание среднюю молекулярную массу используемого полилизина
равной 22500 и, соответственно, степень полимеризации полилизина равной 108, считали
концентрацию раствора полилизина равной 0.2 мМ.
2.2. УФ-спектрометрия ДНК и ПНК олигонуклеотидов
УФ-спектры водных растворов ПНК- и ДНК-олигонуклеотидов регистрировали на
спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония). Концентрацию ДНК и ПНК олигонуклеотидов
определяли спектрофотометрически, используя суммарные величины молярных коэффициентов
поглощения моно и динуклеотидов при длине волны 260 нм ε260 [147].
2.3. Флуоресцентная спектрометрия ПНК олигонуклеотидов
Флуоресценцию ПНК олигонуклеотидов регистрировали на спектрофотометре Varian
Cary Eclipse Fluorescence (Varian, США). Возбуждение на длине волны λex, равной 495 нм,
испускание на длине волны λem, равной 521 нм.
2.4. Обращённо-фазовая ВЭЖХ ПНК олигонуклеотида
Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на хроматографе Waters 600E с использованием
детектора Waters 484 (Waters, США) на колонке Altima C18 5u (10×250 мм) (Alltech, США).
Хроматографию проводили в линейном градиенте ацетонитрила от 20% до 50% в 0.1 % TFA в
течении 30 мин при скорости потока 3 мл/мин, детекцию проводили при 260 нм. Растворы после
48
хроматографии концентрировали упариванием на вакуумном ротационном концентраторе
Eppendorf Concentrator 5301 (LabWrench, Канада).
2.5. Обращённо-фазовая ВЭЖХ ДНК олигонуклеотида
Обращенно-фазовую ВЭЖХ ДНК проводили на хроматографе Waters 600E с
использованием детектора Waters 484 (Waters, США) на колонке Nucleosil 100-5C18-2739
(4.6x200 мм) (Hichrom, Англия). Хроматографию проводили в линейном градиенте ацетонитрила
от 0% до 50% в 0.05 М LiClO4 в течении 30 мин при скорости потока 1 мл/мин, детекцию
проводили при 260 нм. Растворы после хроматографии концентрировали упариванием на
вакуумном ротационном концентраторе Eppendorf Concentrator 5301 (Lab Wrench, Канада).
2.6. Получение ДНК и ПНК олигонуклеотидов
ДНК олигонуклеотиды (Таблица 2.1) синтезировали в лаборатории медицинской химии
ИХБФМ СО РАН на твердофазном синтезаторе ASM 800 (Biosset, Новосибирск) стандартным
фосфитамидным
методом
и
очищали
обращённо-фазовой
хроматографией.
Чистоту
олигонуклеотидов проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих
условиях, визуализацию олигонуклеотидов в геле проводили с помощью окраски “Stains-All”.
ПНК олигонуклеотиды (Таблица 2.1) синтезировали на пептидом синтезаторе PS3 (Protein
Technologies, США), приспособленном для синтеза ПНК, стандартным твердофазным методом с
использованием Fmoc-стратегии [22] по ранее описанному способу [108, 148]. На каждой стадии
деблокирования определяли количество отщепившихся Fmoc-групп с растущей цепи ПНК
олигомера, замеряя количество образованного фульвен-пиперидинового аддукта [149] методом
УФ-спектрометрии (ε301 = 7800 M-1см-1). По завершении синтеза ПНК олигомеры удаляли с
носителя и деблокировали по стандартной методике обработкой полимерного носителя 20%
раствором м-крезола в трифторуксусной кислоте при комнатной температуре в течение 2 ч с
последующим высаживанием неочищенного продукта ПНК в диэтиловый эфир. Целевой
продукт после удаления с полимерного носителя и полного деблокирования групп очищали
офВЭЖХ, собирая нужные фракции, анализируя их методом MALDI-TOF-масс спектроскопии.
2.7. Введение радиоактивной метки в ДНК олигонуклеотид
Введение радиоактивной метки в ДНК-олигонуклеотиды проводили с использованием
полинуклеотидкиназы фага Т4 (10 ед.акт.), 1-4МБк [γ-32P] ATP в буфере, содержащем 0.8 M TrisHCl (pH 7.6), 0.1 M MgCl2, 0.05 M спермидин, (общий объем 15 мкл) [150]. Меченую ДНК
выделяли при помощи офВЭЖХ.
49
Таблица 2.1. Структуры олигонуклеотидов, использованных в работе.
Число
Шифр Тип
Последовательность
звеньев
ПНК1
ПНК NCAA CTC CAT ATG CCA TC
16
ПНК2
грипп
ПНК2Tat
грипп
ДНК1
ДНК2
ДНК3
ДНК4
ДНК5
ПНК
N
ПНК
N
ДНК
ε260
М-1∙см-1
149600
GCA AAA GCA GGG TAG AC
16
173200
GCA AAA GCA GGG TAG A-RKKRRQRRR С
16
173200
5’
CAA CTC CAT ATG CCA T3’
16
149600
ДНК
5’
18
170200
ДНК
5’
20
190100
ДНК
5’
22
210400
ДНК
5’
22
219400
TAT GGA GTT GAT CTT TTT3’
CAT ATG GAG TTG ATC TTT TT3’
GGC ATA TGG AGT TGA TCT TTT T3’
TAC ATG GCA TAT GGA GTT GAT C3’
ДНК6
ДНК 5’CTG CTT TTG CTT TTT3’
15
120000
грипп
ДНК7
ДНК 5’TTA TCT ACC CTG CTT TTG CGT T 3’
22
189000
грипп
Олигонуклеотиды ПНК2, ПНК2-Tat и ДНК6 использовали в экспериментах с вирусом гриппа. Nи C-концы цепей ПНК соответствуют 5’- и 3’-концам ДНК [22].
2.8. Введение флуоресцентной метки в ПНК олигонуклеотид
Введение флуоресцентной метки в ПНК олигонуклеотид осуществляли путем реакции
изотиоцианатной группы FITC и N-концевой первичной аминогруппы ПНК. К 26 мкл раствора
ПНК (4 ОЕ260, 35.8 нмоль) в 50 % CH3CN добавляли 50 мкл DMSO, 5 мкл диизопропилэтиламина
и перемешивали. После этого к раствору добавляли 21.6 мкл раствора FITC (215 нмоль) в DMSO
(шестикратный мольный избыток FITC по отношению к ПНК). Смесь инкубировали в темноте в
течение 1-2 ч при комнатной температуре. Затем проводили выделение ПНК, содержащей
флуоресцентную метку, с помощью офВЭЖХ. После хроматографии фракции, содержащие
целевой продукт объединяли и упаривали досуха, после чего растворяли в 50% CH3CN и
записывали УФ-видимый спектр (max = 260 нм и 495 нм).
2.9. Получение ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов
ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексы (Таблица 2.2) готовили путем смешивания эквимольных
количеств исходных олигонуклеотидов в буфере (PBS или TBS). Концентрации дуплексов
составляла от 2 до 20 мкМ. Смеси инкубировали 5 мин при 90 0C, затем охлаждали до 25 0C в
течение 30 мин и хранили их во льду до использования. Для приготовления дуплексов
50
использовали также флуоресцентное производное ПНК и ДНК, с введённой радиоактивной
меткой.
Таблица 2.2. Структуры ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов, использованных в работе.
Длина
ОлигоСтруктура дуплекса
Дуплекс перекрыTm, 0C
мер
вания, п.о.
N
C
ПНК1
CAACTCCATATGCCAT
P1
10
51.0
3’
ДНК2
TTTTTCTAGTTGAGGTAT5’
5’
ДНК1
CAACTCCATATGCCAT3’
D1
10
34.3
3’
ДНК2
TTTTTCTAGTTGAGGTAT5’
N
ПНК1
CAACTCCATATGCCATC
P2
12
60.5
3’
ДНК3
TTTTTCTAGTTGAGGTATAC5’
5’
ДНК1
CAACTCCATATGCCAT3’
D2
12
42.8
3’
ДНК3
TTTTTCTAGTTGAGGTATAC5’
N
ПНК1
CAACTCCATATGCCATC
P3
14
72.2
3’
ДНК4
TTTTTCTAGTTGAGGTATACGG5’
5’
ДНК1
CAACTCCATATGCCAT3’
D3
14
55.4
3’
ДНК4
TTTTTCTAGTTGAGGTATACGG5’
N
ПНК1
CAACTCCATATGCCATC
P4
16
73.8
3’
ДНК5
CTAGTTGAGGTATACGGTACAT5’
5’
ДНК1
CAACTCCATATGCCAT3’
D4
16
57.9
3’
ДНК5
CTAGTTGAGGTATACGGTACAT5’
N
ПНК2
GCAAAAGCAGGGTAGAC
P5
10
64.5
3’
ДНК6
TTTTTCGTTTTCGTC5’
N
ПНК2
GCAAAAGCAGGGTAGAC
P6
16
83.4
3’
ДНК7
TTGCGTTTTCGTCCCATCTATT 5’
Жирным курсивом обозначены комплементарные перекрывания в дуплексах. Значения
температуры плавления Tm получены при концентрации дуплексов 2 мкМ в PBS буфере. Ошибка
измерений Tm составляет ± 0.5 0C. N- и C-концы цепей ПНК соответствуют 5’- и 3’-концам ДНК,
соответственно [22].
2.10. Получение комплексов ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов с полилизином
Тройные комплексы ДНК/ДНК•PLи ДНК/ПНК•PL дуплексов с полилизином получали,
добавляя к 120 мкл 2 мкМ раствора ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплекса в PBS буфере 1 мкл 200
мкМ водного раствора полилизина PL при комнатной температуре.
Получали 2 мкМ раствор тройных комплексов в расчёте на дуплекс (олигонуклеотид) или
1.7 мкМ в расчёте на PL.
2.11. Термическая денатурация свободных ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов и их
комплексов с полилизином в растворе
Готовили в PBS буфере 2 мкМ растворы ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексов или 2 мкМ
растворы тройных комплексов олигонуклеотидов с полилизином в расчёте на олигонуклеотид
(1.7 мкМ в пересчёте на полилизин). Термическую денатурацию дуплексов проводили с
51
использованием системы анализа температуры плавления нуклеиновых кислот TMSPC-8
(Shimadzu, Япония), оборудованной терморегулируемым восьмисекционным держателем,
измеряя изменения оптического поглощения раствора при его нагревании от 5 до 95 0C или
охлаждением от 95 до 5 0C при длине волны 260 нм. Скорость изменения температуры составляла
0.5 0C/мин.
2.12. Измерение оптического поглощения смеси ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексов
и их комплексов с полилизином в зависимости от времени
Измерение оптического поглощения смеси ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексов в
присутствии или отсутствие полилизина проводили с использованием приставки TMSPC-8,
оборудованной терморегулируемым восьмисекционным держателем. Значения оптического
поглощения раствора замеряли каждые 10 мин при длине волны 260 нм на УФ-спектрофотометре
UV-1800 (Shimadzu, Япония) в течение 5-6 ч при 37 0C в PBS-буфере.
2.13. Получение наночастиц диоксида титана
Наночастицы диоксида титана были получены гидролизом TiCl4 в воде по стандартной
методике [110]. Наночастицы были охарактеризованы методами малоуглового рентгеновского
рассеяния (МУРР) Шикиной Н.В. (ИК СО РАН) на малоугловом рентгеновском дифрактометре
(Siemens, Германия) и динамического рассеяния света (ДРС) [151, 152] на приборе Zetasizer Nano
ZS (Malvern, Англия). Анализ методом МУРР проводили в PBS, анализ методом ДРС проводили
в водеРазмер наночастиц, концентрация наночастиц в обоих случаях была 1 мг/мл. Размер
наночастиц определённый методом МУРР, составил 5.4 нм, методом ДРС – 5.1 нм. Исходя из
того факта, что наночастицы TiO2, размером 5 нм, содержат около 1500 молекул TiO2 [110], масса
одного моля наночастицы будет составлять 1500 * 79.9 = 119850 г, а одного наномоля - 0.11985
мг. Таким образом, в 1 мг TiO2-наночастиц будет содержаться 1/0.11985 = 8.3 нмоль этих
наночастиц (8.3 нмоль/мг). Полученную величину (8.3 нмоль/мг) далее использовали для расчета
количества TiO2 наночастиц в наномолях, исходя из массы наночастиц в мг.
2.14. Получение наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином
Наночастицы, покрытые полилизином PL, или TiO2•PL композиты с разными мольными
соотношениями PL/TiO2 получали смешиванием TiO2 и PL в PBS или TBS буфере. Для
приготовления 1 мл TiO2•PL композита (в мольном соотношении TiO2/PL = 1:1) смешивали 0.2
мл 5 мг/мл суспензии наночастиц TiO2 (8.3 нмоль/мг, 1 мг) и 41.5 мкл 0.2 мМ PL (8.3 нмоль) в
буфере. Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 10-20 с, выдерживали 10-20 мин при
постоянном
перемешивании
при
комнатной
52
температуре,
затем
осадок
отделяли
центрифугированием в течение 5 мин при скорости вращения ротора центрифуги 7 тыс.об./мин.
Осадок дважды промывали 1 мл соответствующего буфера и затем его суспендировали 1 мл
используемого буфера (PBS или TBS). Концентрация полученного композита по TiO2
наночастицам 1 мг/мл (8.3 нмоль/мл) и по PL 8.3 нмоль/мл. Аналогично были получены и
остальные образцы TiO2•PL композитов с мольными соотношениями TiO2/PL, равными 1:0.1,
1:0.5, 1:2 и 1:5.
2.15. Иммобилизация одноцепочечной ДНК на TiO2•PL композитах
Иммобилизацию одноцепочечной ДНК на TiO2•PL композитах проводили в 200 мкл PBS
или TBS буфера. К 20 мкл разбавленного TiO2•PL композита с концентрацией по TiO2 0.5 мг/мл
(4.15 нмоль/мл, 10 мкг, 0.083 нмоль) и различным мольным соотношением TiO2/PL добавляли
10-50 мкл (1 нмоль) ДНК олигонуклеотида, добавляли 20 мкл соответствующего десятикратного
буфера (PBS или TBS) и доводили объем реакционной смеси водой до 200 мкл. Пробы
обрабатывали ультразвуком в течение 10-20 с, выдерживали 5 мин при постоянном
перемешивании при комнатной температуре, затем осадок отделяли центрифугированием в
течение 5 мин при скорости вращения ротора центрифуги 12 тыс.об./мин. Супернатант собирали
и измеряли его оптическое поглощение при 260 нм. По полученной величине вычисляли
количество
не
иммобилизовавшейся
ДНК
и,
соответственно,
количество
ДНК,
иммобилизовавшейся на TiO2•PL композите, зная исходное количество ДНК.
2.16. Иммобилизация ДНК/ПНК дуплекса на TiO2•PL композитах
Иммобилизацию ДНК/ПНК дуплекса на TiO2•PL композитах проводили аналогично
иммобилизации одноцепочечной ДНК в 200 мкл PBS или TBS буфера. К 10 мкл охлажденного
до 0 °С TiO2•PL композита с концентрацией по TiO2 1 мг/мл (8.3 нмоль/мл, 20 мкг, 0.166 нмоль)
и мольным соотношением TiO2/PL 1:2 добавляли 10 мкл заранее приготовленного охлажденного
20 мкМ (2 нмоль) ДНК/ПНК дуплекса и доводили объем реакционной смеси соответствующим
буфером до 200 мкл. Пробы обрабатывали ультразвуком в течение 10-20 с, выдерживали 5 мин
при постоянном перемешивании во льду.
При иммобилизации ДНК/ПНК на TiO2•PL композите также использовали ПНК с
флуоресцентной меткой и радиоактивномеченную ДНК.
2.17.
Исследование
температурной
зависимости
десорбции
ПНК
из
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита
Проводили иммобилизацию ДНК/ПНК дуплекса на TiO2•PL композите по описанному
выше методу. Для образования ДНК/ПНК дуплекса использовали ПНК, содержащую
53
флуоресцентную метку, получая TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозит. Полученную суспензию
нанокомпозита делили на аликвоты по 50 мкл, которые хранили во льду.
Каждую из аликвот TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозитов с концентрацией 2 мкМ по
ДНК/ПНК дуплексу и 0.1 мг/мл по TiO2 выдерживали отдельно при определенной
фиксированной температуре (с интервалом 5º от 20 до 90 ºC) в течение 10 мин при постоянном
перемешивании. Затем каждую пробу быстро разбавляли до 500 мкл охлажденным до 0 ºС PBS
или TBS буфером и центрифугировали в течение 2 мин при скорости вращения ротора
центрифуги 14 тыс. об/мин. Супернатант над осадком аккуратно собирали пипеткой и измеряли
его интенсивность флуоресценции. Измеряли интенсивность флуоресценции исходного 2 мкМ
ДНК/FluПНК
дуплекса,
приготовленного
в
растворе
аналогично
приготовлению
TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозиту, но без добавления TiO2•PL композита. Эту калибровочную
величину интенсивности флуоресценции в растворе принимали за 100 %. Далее по
соотношениям интенсивности флуоресценции супернатанта и интенсивности флуоресценции
контрольного
калибровочного
раствора
вычисляли
долю
TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозита и, соответственно, долю
ПНК
Flu
отделившейся
от
ПНК, оставшейся на
TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозите. По полученным данным строили кривые температурной
зависимости десорбции ПНК из исследуемого композита. За температуру плавления дуплексов,
иммобилизованных на частицах TiO2 принимали точку перегиба на полученной кривой.
2.18. Исследование временной зависимости десорбции ПНК из TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита
Проводили иммобилизацию ДНК/ПНК дуплекса на TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозите по
описанному выше методу. Для образования ДНК/ПНК дуплекса использовали ПНК,
содержащую
флуоресцентную
метку,
и/или
радиоактивномеченную
ДНК,
получая
TiO2•PL•[32P]ДНК/FluПНК или TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозиты. Полученную суспензию
нанокомпозита делили на аликвоты по 50 мкл, которые хранили во льду.
Каждую из аликвот выдерживали при 35 0C в течение определенного фиксированного
времени (от 0 до 180 мин) при постоянном перемешивании. Затем каждую пробу быстро
разбавляли до 500 мкл охлажденным до 0 ºС PBS или TBS буфером и центрифугировали в
течение 2 мин при 14 тыс. об/мин. Супернатант аккуратно собирали пипеткой. Измеряли уровень
радиоактивности супернатанта и осадка, а затем измеряли интенсивность флуоресценции
супернатанта. Отдельно измеряли интенсивность флуоресценции контрольного образца
ДНК/FluПНК-дуплекса,
приготовленного
в
растворе
аналогично
приготовлению
TiO2•PL•ДНК/FluПНК-нанокомпозита, но без добавления TiO2•PL композита. Эту калибровочную
величину интенсивности флуоресценции в растворе принимали за 100 %. Далее по
54
соотношениям интенсивностей флуоресценции супернатанта и контрольного калибровочного
раствора вычисляли долю ПНК, отделившейся от TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита, и долю
ПНК, оставшуюся на TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозите. По полученным данным строили
кривые десорбции ПНК из исследуемого комплекса в зависимости от времени. Данные по
радиоактивности служили для контроля уровня смывания ДНК с TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита. По соотношению уровней радиоактивности супернатанта и суммарной
радиоактивности
супернатанта
и
осадка
вычисляли
долю
ДНК,
отделившейся
от
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита.
2.19. Оценка выживаемости клеток MDCK с помощью MTT реагента
Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты (TPP, Швейцария) в объёме 100 мкл, 25 000
клеток на лунку в среде IMDM, содержащей 10% сыворотку, 1 % антибиотик, и инкубировали
при 37 0C, 5% CO2. Через сутки, после образования сплошного монослоя, среду заменили на
образцы в среде IMDM без сыворотки и антибиотиков. Образцы готовили непосредственно перед
экспериментом. Образцы перемешали в лунках аккуратно покачивая планшет, инкубировали 4 ч
при 37 0C, 5% CO2. После инкубации добавили сыворотку, конечное содержание сыворотки 10%
по объёму, затем инкубировали сутки при 37 0C, 5% CO2. После инкубации в лунки добавили
раствор MTT в PBS, конечная концентрация MTT 0.5 мг/мл, инкубировали 4 ч при 37 0C, 5% CO2.
После инкубации слили супернатант из лунок, добавили по 100 мкл DMSO (х.ч.) и инкубировали
30 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряли на планшетном фотометре
Multiskan RC (Thermo Labsystems, Финляндия) при 570 нм (поглощение формазана,
получившегося при восстановлении тетразола, MTT) и при 620 нм (фон). При расчёте
использовали разницу значений оптического поглощения, полученных при 570 нм и 620 нм.
Клетки без образцов служили в качестве контроля, выживаемость таких клеток принимали за
100%.
2.20. Исследование способности TiO2•PL• ДНК/FluПНК нанокомпозита проникать в
клетки HeLa с помощью конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии
Для конфокальной микроскопии живых (нефиксированных) клеток использовали 8луночные планшеты Lab-Tek™ Chambered Coverglass (Nunc GmbH & Co. KG, Германия).
Исследование образцов с помощью конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии
проводил Байбородин С.И. (ИЦиГ СО РАН).
Клетки HeLa сеяли в 8-луночные планшеты Lab-Tek™ Chambered Coverglass (Nunc GmbH
& Co. KG, Германия) в объёме 100 мкл, 8 000 клеток на лунку в среде IMDM, содержащей 10%
сыворотку и антибиотик, и инкубировали при 37 0C, 5% CO2. Через сутки после инкубации
55
клетки промыли PBS и средой IMDM без сыворотки и антибиотиков. Затем к клеткам добавили
по 500 мкл предварительно приготовленного TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозита в среде
IMDM. Конечная концентрация пробы составляла 0.2 мг/мл по TiO2 и 2 мкМ по ПНК или
ДНК/ПНК дуплексу, соотношение TiO2/PL=1:2. Клетки с образцами инкубировали в течение
суток при 37 0C, 5% CO2, затем их промывали средой IMDM и инкубировали следующие сутки в
среде IMDM, содержащей 10% сыворотку и антибиотики. Клетки промывали средой IMDM без
сыворотки и антибиотиков. Цитозоль клеток окрашивали красным флуоресцентным красителем
Cell Tracker Red CMTPX (Invitrogen, США). Затем окрашивали ядра клеток с синим
флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (Invitrogen, США). Живые клетки сразу после
окрашивания анализировали конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопией на приборе
LSM 510 Meta (Zeiss, Германия). Использовали объектив 40x/1.30 Oil DIC и для сканирования
лазерные линии 405, 488 и 543 нм; фильтры BP 420–480, BP 505–530, LP 560. Толщина
оптических срезов 0.21мкм.
Аналогичным
образом
проводили
контрольные
эксперименты
с
клетками
с
использованием свободной FluПНК.
2.21. Исследование способности TiO2•PL• ДНК/FluПНК нанокомпозита проникать в
клетки MDCK с помощью проточной цитофлуорометрии
Клетки MDCK сеяли в 24-луночные планшеты (TPP, Швейцария) в объёме 400 мкл, 40 000
клеток на лунку в среде IMDM, содержащей 10% сыворотку, 1 % антибиотик и инкубировали
при 37 0C, 5% CO2. Через двое суток, после образования сплошного монослоя, клетки промыли
два раза PBS, один раз средой IMDM и добавили по 400 мкл образцов в среде IMDM без
сыворотки и антибиотика. Образцы готовили непосредственно перед экспериментом. Образцы в
лунках перемешали аккуратно покачивая планшет. Инкубировали образцы 4 ч при 37 0C, 5% CO2.
После инкубации клетки сняли с помощью трипсина, клеточную суспензию в PBS перенесли в
пробирки в объёме 300 мкл. Для дальнейшей фиксации клеток к их суспензии в PBS добавили
равное количество по объёму 4% формальдегида в PBS и быстро перемешали. Полученные
образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics FC 500.
2.22. Противовирусная активность TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов
Работу с вирусом проводила Мазуркова Н.А (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).
Клетки MDCK сеяли в 96-луночные планшеты (Greiner Bio-One, США) в объёме 100 мкл,
10 000 клеток на лунку в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотку, 1 % антибиотик и
инкубировали при 37 0C, 5% CO2. Через двое суток, после образования 80% клеточного монослоя,
клетки промыли PBS и средой RPMI-1640. Вирус A/Aichi/2/68 вносили в среде RPMI-1640,
56
содержащей 2 мкг/мл трипсина, при множественности инфицирования 0.1 TCID50/кл в объеме
100 мкл/лунку (множественность инфицирования – количество вирусных частиц на одну клетку
в единицах TCID50; TCID50 – тканевая цитопатическая доза вируса, при которой погибает 50%
клеток). В контроле вносили среду RPMI-1640, содержащую 2 мкг/мл трипсина, в объеме 100
мкл/лунку. Через 1 ч после заражения вирусом при 37 0C, 5% CO2 вируссодержащую жидкость
удаляли, клеточный монослой промывали средой RPMI-1640 без трипсина, затем вносили
исследуемый препарат в среде RPMI-1640 без трипсина в количествах 10, 5, 1, 0.5 или 0.1 мкг в
объеме 100 мкл/лунку. Через 4 ч инкубации при 37 0C, 5% CO2 среду с препаратами удаляли,
клетки промывали средой RPMI-1640 без трипсина и вносили среду RPMI-1640 с трипсином в
объеме 100 мкл/лунку. Планшеты помещали в СО2-инкубатор при температуре 37 0C, 5% CO2.
Через 48 ч инкубации десятикратные разведения культуральной вируссодержащей жидкости (с
10–1 до 10–8) из каждой лунки вносили на клетки MDCK, инкубировали в течение 48 ч и затем
определяли титр вируса. Наличие вируса определяли визуально под микроскопом по
цитопатическому действию и в реакции гемагглютинации, используя 1%-ную суспензию
эритроцитов петуха. Титр вируса определяли в единицах TCID50/мл или lg(TCID50/мл).
57
Глава 3. Результаты и обсуждения
В обзоре литературы были подробно рассмотрены неорганические наночастицы и
использование их в качестве транспортёров нуклеиновых кислоты. В большинстве случаев
используют
наночастицы,
покрытые
одним
слоем
поликатиона
либо
несколькими
чередующимися слоями полианионов и поликатионов. Иммобилизация НК при этом происходит
за счёт электростатических взаимодействий с поликатионом. Такой метод сборки системы
доставки НК относительно прост: достаточно смешать необходимые компоненты в нужной
последовательности. Поликатионы, иммобилизованные на наночастицах, способны облегчить
проникновение в клетки и выход из эндосом, сливаясь с мембраной [52] либо за счёт эффекта
«протонной губки», в случае PEI [68, 85]. Наночастицы в свою очередь значительно снижают
токсичность, иммобилизованных поликатионов.
Для усиления биологического эффекта воздействия коротких фрагментов НК на
внутриклеточную мишень в литературе было предложено использовать различные аналоги НК,
которые обладают рядом преимуществ перед природными НК. Одним из таких перспективных
аналогов НК являются пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) [22]. ПНК, как и многие другие
аналоги НК, обладают высокой устойчивостью к действию клеточных нуклеаз, при этом они
образуют существенно более стабильные дуплексы с НК, что увеличивает прочность связывания
их с НК-мишенью в клетке. Однако цепь ПНК, в отличие от природных НК, не имеет
отрицательного заряда, поскольку в ПНК межнуклеотидные фософдиэфирные связи заменены на
псевдопептидные, и поэтому не могут быть присоединены электростатически к наночастицам,
покрытым поликатионами.
Широко распространены методы доставки ПНК в клетки с использованием их конъюгатов
с пептидами [143, 153], основным недостатком которых является попадание таких коньюгатов в
эндосомы и затрудненность воздействия на свои НК-мишени. Известны также методы синтеза
конъюгатов ПНК и неорганических наночастиц, таких как золото [81] и диоксид титана [133].
Однако работы, в которых были получены такие конъюгаты не получили дальнейшего
продолжения.
Мы предложили разработать новый метод доставки ПНК с использованием их композитов
с неорганическими наночастицами, покрытыми поликатионами. В качестве наночастиц для
иммобилизации ПНК были выбраны наночастицы диоксида титана TiO2, которые легко могут
быть получены путем простого гидролиза широко доступного соединения - тетрахлорида титана.
Поскольку ПНК не имеют отрицательного заряда, необходимого для электростатического
связывания с поликатионом, фиксацию ПНК осуществляли в виде ДНК/ПНК дуплексов.
Связывание дуплекса и наночастиц осуществляли за счет электростатических взаимодействий
58
между ДНК/ПНК дуплексом и поликатионом (полилизином), иммобилизованным на
наночастицах. Прочность связывания ПНК и наночастиц обусловлена комплементарными
взаимодействиями между ПНК и ДНК в составе дуплекса и может легко регулироваться
количеством
нанокомпозита
комплементарных
должна
пар.
позволить
Конструкция
ПНК
выходить
образующегося
из
его
состава
TiO2•PL•ДНК/ПНК
при
нарушении
термодинамического равновесия за счёт диссоциации дуплекса. Свободная ПНК способна более
эффективно взаимодействовать с мишенью, а значит проявлять лучший биологический эффект,
чем ПНК в составе конъюгатов и комплексов.
Условно работу можно разделить на три части:
1. создание нанокомпозитов, содержащих ПНК;
2. исследование их физико-химических свойств;
3. исследование созданных нанокомпозитов в клеточных системах:
а) оценка токсичности и способности нанокомпозитов доставлять ПНК в клетки;
б) демонстрация способности, доставленной в клетки ПНК, эффективно и селективно
взаимодействовать с НК-мишенью.
3.1. Синтез ПНК
Синтез ПНК проводили стандартным твердофазным методом с использованием Fmocстратегии [22, 148, 154] на твердофазном пептидом синтезаторе PS3, который был приспособлен
для синтеза пептидо-нуклеиновых кислот (Рис. 3.1). Структура синтезированного олигомера
включала в себя 16-звенную последовательность ПНК (Таблица 2.1), содержащую на N- и Cконцах цепи по две 2-(2-аминоэтокси)этоксиацетильных (AEEA) линкерных группы (Рис. 3.1).
Введение AEEA-групп необходимо было для придания ПНК большей растворимости в воде.
Средний выход присоединения одного мономерного звена, определяемый путем измерения
количества удаляемых Fmoc-групп на каждой стадии конденсации, составил 95-98%. Конечный
выход олигомера ПНК после 20 шагов конденсации на твердофазном носителе составил 42.7 %.
Целевой продукт после удаления с полимерного носителя и деблокирования всех защитных
групп очищали офВЭЖХ, собирая нужные фракции. Молекулярная масса ПНК олигомера при
анализе методом MALDI TOF масс-спектроскопии составила 4838.0, что соответствовало
расчётной массе, равной 4838.4.
59
H
N
O
Fmoc-XAL-PEG-PS
O
H
N
Fmoc
1
O COOH + H2N
O
Fmoc-AEEA-OH
2
O
H2N
O
O
C
HN
3
Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc Bhoc
H (AEEA)2
C
A
A
C T C
C
A T A T G
C
C
A T
H
N
(AEEA)2
4
O
H2N
O C
O
N
H
O
O C
O
H
N
O
H
N
CAACTCCATATGCCAT
O
O C
N
H
O
NH2
O C
O
ПНК
5
HO
H
N
O
H
N
O C
O
C
N
H
O
O C
O
S
H
N
O
H
N
CAACTCCATATGCCAT
O
O C
N
H
O
O C
O
NH2
FluПНК
O
O
O
HO
HN
CHO-OCHPh2
N
N
N
Ph2CHO-OCH
N
O
N
H
N
H
N
N
N
O
O
N
H
O
N
O
N
CHO-OCHPh2
HN
O
HN
HN
N
O
O
N
O
O
N
O
N
N
H
Bhoc
Bhoc
Bhoc
A
G
C
N
H
O
N
T
HO
N
O
O
C
S
O
O
Bhoc
HO
O
FITC
Рис. 3.1. Схема твердофазного синтеза ПНК-олигомера (стадии 1-4) и его флуоресцентного
производногоFluПНК (стадия 5). 1) пиперидин/DMF (1:5). 2) шаг 1 - HATU, NMM, DMF; шаг 2 Ac2O/NMM/DMF; шаг 3 - пиперидин/DMF (1:5). 3) Повторяющиеся циклы: шаг 1 - мономер
(Fmoc-AEEA-OH, Fmoc-T-OH, Fmoc-ABhoc-OH, Fmoc-GBhoc-OH или Fmoc-CBhoc-OH), HATU,
NMM, DMF; шаг 2 - Ac2O/NMM/DMF; шаг 3 - пиперидин/DMF (1:5). 4) TFA/м-крезол. 5) FITC,
DMSO/CH3CN/H2O, DIEA.
3.2. Синтез ПНК-олигомера (FluПНК), содержащего флуоресцентную метку
Для оценки эффективности иммобилизации ПНК на наночастицах и исследования
способности создаваемых TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в клетки, в состав ПНК
60
была
введена
флуоресцентная
метка
(Flu).
В
качестве
метки
использовали
флуоресцеинизотиоцианат (FITC).
Перед началом реакции провели полное деблокирование и удаление ПНК с полимерного
носителя (Рис. 3.1). FITC вводили в ПНК путём реакции свободной аминогруппы ПНК с
изотиоцианатной группой FITC в водно-органической смеси (DMSO/CH3CN/H2O) в присутствии
диизопропилэтиламина (DIEA), необходимого для депротонирования N-концевой аминогруппы
ПНК.
Использование смеси органических растворителей и воды было обусловлено, с одной
стороны, необходимостью предотвращения выпадения в осадок ПНК в безводном органическом
растворителе (DMSO), с другой – необходимостью максимально уменьшить содержание воды в
реакционной смеси для предотвращения гидролиза FITC в водном растворе. После проведения
реакции осуществляли очистку и выделение конечного продукта
Flu
ПНК с помощью офВЭЖХ,
собирая фракции со временем удерживания на колонке 17.7 мин, время удерживания исходной
ПНК в этих же условиях составляло 13.4 мин (Рис. 3.2). Выход реакции составил 52.3%
относительно исходной ПНК. На профиле хроматограммы (Рис. 3.2а) видно, что пик,
соответствующий исходной ПНК (Рис. 3.2а, кривая 1, полностью исчезает и появляется новый
пик с большим временем удерживания, соответствующий целевой
Flu
ПНК (Рис. 3.2а, кривая 2).
Полученные данные свидетельствуют, что в условиях реакции происходит практически
количественное превращение ПНК в её флуоресцентное производное FluПНК.
Рис. 3.2. Профиль офВЭЖХ: а) кривая 1 – исходный (неочищенный) ПНК олигомер до реакции
с FITC, кривая 2 – реакционная смесь, содержащая флуоресцентное производное FluПНК, после
реакции ПНК с FITC; (б) кривая 3 – очищенное офВЭЖХ флуоресцентное производное FluПНК.
Увеличение
времени
удерживания
производного
Flu
ПНК,
по
сравнению
с
некодифицированной ПНК, происходило из-за того, что FITC, присоединяемый к ПНК,
61
гидрофобный. Такое свойство позволило использовать ПНК без предварительной очистки перед
синтезом FluПНК, что существенно сократило время получения целевого продукта.
Рис. 3.3. Спектры оптического поглощения FITC, FluПНК, очищенной с помощью офВЭЖХ,
исходной ПНК (до реакции с FITC). Спектры снимали в PBS, содержащем 50% CH3CN.
Чтобы подтвердить, что в процессе офВЭЖХ нами было выделено флуоресцентное
производное, были получены спектры оптического поглощения ПНК (Рис. 3.3). Было
подтверждено, что спектр FluПНК имеет характерные максимумы поглощения для FITC при 495
нм и для ПНК при 260 нм. При этом исходная ПНК не имеет поглощения в области 495 нм, а
свободный FITC не имеет характерного для НК максимума поглощения при 260 нм.
3.3. Комплексообразующие свойства синтезированного олигомера ПНК
Важной особенностью молекул ПНК является их способность образовывать прочные
комплементарные комплексы с НК [155, 156]. С использованием синтезированных ПНК
олигомеров и комплементарных им дезоксирибоолигонуклеотидов получены гибридные
ДНК/ПНК-дуплексы и изучена их термическая стабильность.
Полученные данные показывают, что термостабильность исследованных ДНК/ПНК
дуплексов выше термостабильности соответствующих ДНК/ДНК дуплексов, что выражается в
больших значениях температур плавления Tm (Таблицы 2.2). Разница между Tm двух типов
дуплексов, имеющих одинаковый нуклеотидный состав, достигает 16-18 0C (Таблица 3.1), что
хорошо согласуются с литературными данными [155, 156] и косвенно подтверждают структуру
синтезированного олигомера ПНК, т.е. цепь ПНК связывается с цепью ДНК с помощью
комплементарных взаимодействий.
62
Таблица 3.1. Разница температур плавления модельных ДНК/ПНК и ДНК/ДНК дуплексов (на
основании данных таблицы 2.2)
Длина
Дуплексы
перекрыΔTm(P-D), 0С
вания,п.о.
10
P1-D1
16.7
12
P2-D2
17.7
14
P3-D3
16.8
16
P4-D4
15.9
Буквой «P» - обозначены ДНК/ПНК дуплексы, буквой «D» - ДНК/ДНК дуплексы, ΔTm – разница
между температурами плавления ДНК/ПНК и соответствующими ДНК/ДНК дуплексами.
Значения температур плавления Tm получены при концентрации дуплексов 2 мкМ в PBS. Ошибка
измерений составляет ±0.5 0С.
3.4. Синтез и характеризация наночастиц диоксида титана
Синтез наночастиц диоксида титана TiO2 проводили путём гидролиза TiCl4 при
постоянном перемешивании и охлаждении по методике [110]. Получили прозрачный раствор с
pH ≈ 3. Следует отметить, что при таком методе синтеза получается диоксида титана в форме
анатаза. Шикиной Н.В. (ИК СО РАН) методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)
были получены экспериментальные рентгенограммы от образцов наночастиц. Из полученных
рентгенограмм
была
рассчитана
функция
распределения
размеров
наночастиц
TiO2
(неоднородностей электронной плотности, Dv(d)) (Рис. 3.4). По результатам анализа радиус
частиц в сферическом приближении составил 2.7 нм, а размер частиц, соответственно, 5.4 нм.
Рис. 3.4. Функция распределения размеров наночастиц диоксида титана TiO2 по данным метода
малоуглового рентгеновского рассеяния. Для анализа использовали суспензию наночастиц TiO2
с концентрацией 1 мг/мл в PBS.
Далее полученные наночастицы были проанализированы методом динамического
рассеяния света (ДРС). По результатам данного анализа размер наночастиц TiO2 составил 5.1 нм
(Рис. 3.5а). Также были проведены измерения ζ-потенциала наночастиц, средняя величина
которого составила -34±16 мВ (Рис. 3.5б).
63
Рис. 3.5. Результаты анализа наночастиц диоксида титана TiO2 методом динамического
светорассеяния, зависимость интенсивности сигнала от размера наночастиц (а) и от ζ-потенциала
наночастиц (б). Для анализа использовали суспензию наночастиц TiO2 с концентрацией 1 мг/мл
в H2O (а) и в PBS (б).
Таким образом, нами были получены наночастицы диоксида титана, размер которых
такой же, как и в используемой методике их синтеза, а величина ζ-потенциала отрицательна при
pH 7.5, что коррелирует с литературными данными [157], при этом в приведённом источнике
значение ζ-потенциала составило примерно -10 мВ.
3.5. Иммобилизация ПНК в составе ДНК/ПНК дуплекса на наночастицах TiO2,
покрытых полилизином
Сами по себе ДНК, ПНК или их гибридные ПНК/ДНК дуплексы плохо фиксируются на
наночастицах TiO2. В нашем случае ёмкость таких олигомерных композитов не превышала
величины 1-2 нмоль на 1 мг частиц, что примерно на порядок меньше максимально возможной
стерически доступной емкости для частиц размером 5 нм [110].
Известно, что электрокинетический потенциал (ζ-потенциал) TiO2 наночастиц при
нейтральных или физиологических значениях рН 7─8 [157] отрицателен. В нашем случае,
среднее значение этой величины составило -34 мВ при pH 7.5 (см. раздел 3.4). Это свойство
наночастиц TiO2 позволяет эффективно иммобилизовать на их поверхности положительно
заряженные поликатионы, например, полилизин, с образованием TiO2•PL композита [114, 115,
158]. Связывание PL c TiO2 в этом случае нековалентное, но достаточно прочное, а размер
получившегося в итоге TiO2•PL композита увеличивается по сравнению с размером свободных
наночастиц TiO2 всего на 1-2 нм [115]. Формируемый, таким образом, TiO2•PL композит в
нейтральных условиях содержит положительно заряженные аминогруппы лизина и может быть
использован для электростатических взаимодействий с отрицательно заряженными фосфатными
группами нуклеиновых кислот [114].
64
Поскольку молекулы ПНК не имеют заряда и не могут быть иммобилизованы на TiO2•PL
композите напрямую, мы предложили проводить связывание ПНК с TiO2•PL опосредованно,
используя предформированный гибридный ДНК/ПНК дуплекс (Рис. 3.6). В данном случае
присоединение
ДНК/ПНК
дуплекса
к
TiO2•PL
композиту
осуществляли
за
счет
электростатических взаимодействий отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК (в составе
дуплекса ДНК/ПНК) и положительно заряженных аминогрупп полилизина (в составе TiO 2•PL),
а удерживание ПНК в составе нанокомпозита в общем виде осуществляли за счет нековалентных
Уотсон-Криковских взаимодействий между ПНК и комплементарной ДНК (Рис. 3.6). Прочность
фиксации ПНК в составе полученного TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита должна зависеть от
числа перекрывающихся комплементарных пар оснований в гибридном ДНК/ПНК дуплексе (или
от термостабильности используемого ДНК/ПНК дуплекса) и при конструировании может легко
регулироваться изменением длины этого перекрывания.
Рис. 3.6. Схема иммобилизации ПНК в виде гибридного ДНК/ПНК дуплекса на
наночастицах TiO2, покрытых полилизином PL. Знаком “+” обозначены положительные заряды
на полилизине. Знаком “-” обозначены отрицательные заряды межнуклеотидных фосфатных
групп ДНК и поверхности наночастиц TiO2.
3.5.1 Оптимизация условий иммобилизации ДНК на наночастицах TiO2, покрытых
полилизином
Эффективность иммобилизации НК напрямую связана с количеством аминогрупп
полилизина в TiO2•PL композите. С целью выяснить какой вклад вносит этот параметр было
изучено влияние мольного соотношения наночастиц TiO2 и PL на эффективность иммобилизации
ДНК. Исследование проводили в различных буферных системах при фиксированном 10-кратном
65
мольном избытке ДНК относительно наночастиц TiO2, варьируя мольное соотношение PL/TiO2.
Для оценки эффективности иммобилизации ДНК использовали соотношение количества
суммарной ДНК и ДНК, не связавшейся с TiO2•PL композитом. Для того, чтобы определить
количество не связавшейся ДНК, проводили осаждение сформированного TiO2•PL•ДНК
композита, затем отделяли супернатант и проводили измерение его оптической плотности.
Рис. 3.7. Зависимость эффективности иммобилизации ДНК на TiO2•PL композите от мольного
соотношения PL/TiO2 и состава буфера. В качестве буферов использовали PBS (0.01 М KH2PO4,
0.14 М NaCl, pH 7.5), TBS (0.01 М Tris-HCl, 0.14 М NaCl, pH 7.5)
Выяснили, что степень иммобилизации ДНК олигомера при соотношении PL/TiO2,
равном 0.1:1, составляет около 5 нмоль ПНК на 1 мг наночастиц TiO2, а при соотношении
PL/TiO2, равном 0.5:1 и 1:1, эта величина медленно возрастает, достигая максимального значения
29 нмоль/мг при соотношении 2:1 в TBS (0.01 М Tris-HCl, 0.14 М NaCl, pH 7.5) (Рис. 3.7).
Дальнейшее увеличение доли PL в TiO2•PL композите не приводит к увеличению степени
иммобилизации. Отсюда следует, что при соотношении PL/TiO2, равном 1:2, происходит
насыщение TiO2•PL композита ДНК, и дальнейшее увеличение доли PL в TiO2•PL композите не
приводит к увеличению эффективности иммобилизации ДНК. При таком соотношении PL/TiO2
на 1 мг наночастиц приходится около 16 нмоль полилизина, что коррелирует с литературными
данным [115], в которых на 1 мг наночастиц диоксида титана приходилось 10-20 нмоль
полилизина. Таким образом, ёмкость и прочность фиксации ДНК зависит от соотношения
PL/TiO2 и, следовательно, прочность фиксации ПНК в составе полученного TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита зависит не только от исходной стабильности ДНК/ПНК, но и от от эффективности
электростатического связывания ДНК с поверхностью TiO2•PL композита.
На эффективность иммобилизации ДНК существенное влияние оказывает также тип
используемого буфера. Например, максимальная емкость иммобилизации дуплекса в PBS (0.01
66
М KH2PO4, 0.14 М NaCl, pH 7.5) достигает 8-9 нмоль/мг (Рис. 3.7), тогда как в TBS или воде
емкость иммобилизации ДНК увеличивается и может достигать величины 27-30 нмоль/мг (Рис.
3.7), причём различий в значениях ёмкости иммобилизации ДНК в воде и TBS не наблюдается.
Вероятно, значительно меньшая ёмкость иммобилизации ДНК в PBS обусловлена наличием в
растворе бидентантных лигандов, в роли которых выступают фосфат-анионы. Такие лиганды
конкурируют с ДНК за сайты связывания с полилизином и из-за своего меньшего размера и
большей степени свободы способны вытеснять ДНК.
Известно, что в масса 8.3 нмоль наночастиц составляет 1 мг (учитывая, что наночастицы
TiO2 размером 5 нм содержат около 1500 молекул, а 1 мг – 8.3 нмоль [110], материалы и методы
п. 2.13), также показано, что ёмкость иммобилизации ДНК в PBS составляет 8.4 нмоль на 1 мг
наночастиц при соотношении PL/TiO2, равным 1:1 (Рис. 3.7). Из этих данных следует, что в PBS
на одну наночастицу TiO2 приходится 1 молекула ДНК. Следовательно, при иммобилизации
ПНК в виде ДНК/ПНК дуплекса на одну наночастицу TiO2 приходится не менее одного дуплекса.
Исходя из размеров наночастиц TiO2 (5-6 нм) и диаметра двойной спирали ДНК/ДНК или
ДНК/ПНК дуплекса (2.5 нм [110]), это вполне разумная емкость нанокомпозита, поскольку в
среднем каждая отдельно взятая частица связывается, по крайней мере, с одной молекулой
дуплекса. Таким образом, из полученных экспериментальных данных видно, что на
эффективность иммобилизации ДНК влияет мольное соотношение полилизина к количеству
наночастиц (PL/TiO2) в получаемом TiO2•PL композите.
3.5.2. Структуры TiO2•PL композитов в зависимости от мольного соотношения
PL/TiO2
В зависимости от соотношения PL/TiO2 можно отобразить несколько возможных структур
нанокомпозита, образующихся при иммобилизации ДНК или гибридного ДНК/ПНК дуплекса на
TiO2•PL композите.
Так, например, при молярном избытке наночастиц по отношению к молекулам
полилизина (PL/TiO2 < 1) наиболее вероятной структурой может быть структура «бусинок» (Рис.
3.8а, структуры 1-3), когда несколько наночастиц TiO2 прикреплены к одной молекуле
полилизина путем обматывания цепи полилизина поочередно вокруг каждой отдельно взятой
наночастицы TiO2. В этом случае большая часть положительно заряженных аминогрупп
полилизина расходуется на связывание с поверхностью наночастиц. Поэтому ёмкость таких
нанокомпозитов в расчёте на количество иммобилизованной на них ДНК, должна быть
относительно небольшой. Такое предположение согласуется с экспериментальными данными
(Рис. 3.7), где эффективность иммобилизации ДНК на TiO2•PL композите при соотношениях
67
PL/TiO2, равных 0.1:1 и 0.5:1 составляет 5-8 нмоль/мг независимо от типа использованного
буфера.
Рис. 3.8. Возможные структуры комплексов TiO2•PL, образуемые при молярном избытке
наночастиц (TiO2/PL ≥ 1) (а) и при молярном избытке полилизина (TiO2/PL ≤ 1) (б).
Возможна также структура TiO2•PL композита в виде «клубка», когда вокруг одной
частицы TiO2 полностью обмотана одна или несколько молекул полилизина (Рис. 3.8б, структуры
4). Однако, структура «клубка» для связывания с отрицательной цепью ДНК представляется
маловероятной, поскольку одни и те же положительно заряженные аминогруппы полилизина не
могут использоваться одновременно для образования электростатического комплекса с ДНК и с
поверхностью наночастиц TiO2.
Можно предположить, что для эффективного связывания ДНК часть цепи полилизина
должна свободно свисать с поверхности частицы. Такой вариант может реализоваться при
эквимолярном соотношении PL/TiO2 (Рис. 3.8б, структура 5) или молярном избытке полилизина
относительно наночастиц (Рис. 3.8, структура 6-7). Вероятнее всего, в этих случаях ДНК/ДНК и
ДНК/ПНК
дуплексы,
иммобилизованные
на
TiO2•PL
композите,
располагаются
перпендикулярно поверхности наночастиц, поскольку это наиболее энергетически выгодное
состояние (из-за взаимного отталкивания отрицательно заряженных цепей ДНК). При этом
вокруг одной наночастицы диаметром 5 нм, исходя из геометрических соображений и принимая
во внимание, что диаметр двойной спирали ДНК или ДНК/ПНК дуплекса составляет около 2.5
68
нм, свободно могут «уместиться», без каких-либо стерических затруднений или дополнительных
энергетических затрат, около 4-5 молекул ДНК/ПНК дуплексов.
Судя по экспериментальным данным при соотношении PL/TiO2 ≥ 1 эффективность
иммобилизации ДНК составила 8-30 нмоль на 1 мг (или 8.3 нмоль) наночастиц TiO2 (Рис. 3.7),
что соответствует 1-4 молекулам ДНК на одну наночастицу. Вероятно, такая же структура
TiO2•PL композита со свисающим концом PL будет предпочтительной для эффективной
иммобилизации ДНК/ПНК или ДНК/ДНК дуплексов.
Таким образом, на данном этапе работы был разработан метод эффективной
иммобилизации
ДНК
молекул
на
TiO2•PL
композите
за
счет
электростатического
взаимодействия отрицательно заряженных фосфатных групп ДНК с положительно заряженными
аминогруппами полилизина в TiO2•PL композите. Аналогично должна проходить и
иммобилизация ДНК/ПНК дуплекса, поскольку сформированный дуплекс также обладает
отрицательным зарядом и способен взаимодействовать с полилизином.
3.6. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов в
физиологическом растворе
Конструкция системы доставки в виде TiO2•PL•ДНК/ПНК композита предполагает
свободный выход ПНК в раствор. Однако неизвестно какое влияние будет оказывать полилизин
на диссоциацию ДНК/ПНК дуплекса в составе композита. В связи с этим важно было изучить и
сравнить между собой влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ПНК дуплексов в растворе и в
составе TiO2•PL•ДНК/ПНК композита. Известно, что влияние полилизина PL на образование и
распад дуплексов в растворе можно нивелировать увеличением ионной силы раствора, например,
увеличением концентрации NaCl до 1 М и выше [130, 159-161].
Однако такие условия неприемлемы для клеточных систем и живого организма в целом,
поскольку создаваемые нанокомпозиты должны быть пригодны для использования в
физиологических условиях, где концентрация NaCl составляет примерно 0.14 М. В дальнейшем
в качестве такого приемлемого физиологического буфера мы использовали PBS или TBS.
3.6.1. Влияние полилизина на термическую денатурацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК
дуплексов
Сначала исследовали возможность термической денатурации ДНК/ПНК и, для сравнения,
ДНК/ДНК дуплексов в растворе в присутствии PL (Рис. 3.9). Перед началом эксперимента
получали ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексы, а затем добавляли PL. За процессом следили по
изменению оптического поглощения соответствующих растворов.
69
Рис. 3.9. Кривые изменения оптического поглощения смеси ДНК/ДНК (а-г) и ДНК/ПНК
олигомеров (е-з) в отсутствии (чёрные кривые) и в присутствии (красные кривые) полилизина PL
в зависимости от температуры. Сплошные кривые получены при увеличении, а пунктирные –
при уменьшении температуры. ДНК/ДНК (D) и ДНК/ПНК (P) дуплексы D1, P1, D2, P2, D3, P3, D4,
P4 с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 10, 12, 14 и 16
соответственно (Таблица 2.2). Эксперимент повторяли два раза.
Полученные данные показывают, что полилизин в растворе существенно влияет на
характер кривых термической денатурации как ДНК/ДНК, так и гибридных ДНК/ПНК
70
дуплексов. В обычных условиях при нагревании обоих типов дуплексов в отсутствие PL
оптическое поглощение раствора увеличивается с возрастанием температуры и имеет
характерный температурный переход в области температуры плавления дуплекса (Рис. 3.9,
чёрные сплошные кривые). Увеличение оптического поглощения раствора связано в этом случае
с уменьшением гипохромного эффекта, обусловленного плавлением дуплекса. При добавлении
PL после формирования ДНК/ДНК дуплекса наблюдали понижение кривой зависимости
оптического поглощения от температуры. Однако в случае ДНК/ПНК дуплексов не было падения
оптической плотности с ростом температуры и даже был заметен её рост (Рис. 3.9д-з, красные
сплошные кривые), что может быть связано с частичным плавлением дуплекса в комплексе с
полилизином.
Процесс
диссоциации
дуплекса
обычно
является
обратимым.
Доказательством
обратимости служит совпадение формы кривых плавления дуплексной системы при повышении
температуры, а затем при ее охлаждении. В отсутствие PL наблюдается обратимый процесс
термической денатурации D и P дуплексов, с одинаковым температурным переходом как на
кривых, полученных при повышении температуры (диссоциация дуплексов) (Рис. 3.9а-з, чёрные
сплошные кривые), так и на кривых, полученных при снижении температуры (ассоциация
дуплексов) (Рис. 3.9а-з, чёрные пунктирные кривые). Некоторое смещение кривых диссоциации
относительно друг друга в этом случае связаны с незначительным увеличением концентрации
раствора в оптической кювете плавления из-за несущественного испарения раствора в процессе
нагревания.
Однако при добавлении PL к растворам сформированных D или P дуплексов наблюдаются
различный характер кривых в зависимости от типа дуплексов. В случае D дуплексов наличие PL
приводит к постоянному уменьшению оптического поглощения, независимо от повышения (Рис.
3.7а-г, красные сплошные кривые) или понижения температуры (Рис. 3.7а-г, красные пунктирные
кривые). В случае P дуплексов добавление PL приводит к небольшому увеличению оптического
поглощения с ростом температуры (Рис. 3.7д-з, красные сплошные кривые), которое
возвращается к своему исходному значению при уменьшении температуры (Рис. 3.7д-з, красные
пунктирные кривые). Однако в присутствии PL формы кривых зависимости оптического
поглощения P дуплексов при повышении и при понижении температуры не имеют четкого
температурного перехода, характеризующего плавление дуплекса. Кривые не совпадают друг с
другом и с кривыми плавления P дуплексов в отсутствие полилизина.
Таким образом, можно заключить, что в случае как D, так и P дуплексов процесс
изменения оптического поглощения в присутствии PL в физиологическом растворе носит
необратимый характер, поскольку кривые изменения оптической плотности растворов при
повышении и понижении температуры не совпадают.
71
3.6.2. Влияние полилизина на диссоциацию ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов с
течением времени
Рис. 3.10. Кривые изменения оптического поглощения смеси ДНК/ДНК (а-г) и ДНК/ПНК
олигомеров (е-з) в отсутствии (чёрные кривые) и в присутствии (красные кривые) полилизина PL
в зависимости от времени при 37 0C. ДНК/ДНК (D) и ДНК/ПНК (P) дуплексы D1, P1, D2, P2, D3,
P3, D4, P4 с числом перекрывания комплементарных пар оснований равным 10, 12, 14 и 16
соответственно (таблица 2.2). Эксперимент повторяли два раза.
72
Аномальный характер изменения оптического поглощения для D дуплексов в
присутствии PL наблюдается не только для зависимости от температуры, но и для временной
зависимости (Рис. 3.10).
В отсутствии PL значения оптического поглощения раствора D дуплексов практически не
изменяются во времени (Рис. 3.10а-г, чёрные кривые), тогда как присутствие PL приводит к
существенному уменьшению значений оптического поглощения (Рис. 3.10а-г, красные кривые).
Добавление PL к P дуплексам не приводит к изменению значений оптического поглощения (Рис.
3.10 д-з, красные кривые).
3.6.3. Возможные структуры комплексов, образуемых полилизином с ДНК/ДНК и
ДНК/ПНК дуплексами
Постоянное уменьшение оптического поглощения раствора в случае D дуплексов в
присутствии PL, скорее всего, связано с агрегацией образующегося комплекса PL•ДНК/ДНК и
выпадением его в осадок. Такая агрегация комплекса ДНК с полилизином вероятно вызвана
электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженными межнуклеотидными
фосфатными группами в ДНК/ДНК дуплексе и положительно заряженными боковыми
первичными аминогруппами в PL. Высказанное предположение согласуется с литературными
данными [160, 161], свидетельствующими, что способность ДНК/ДНК дуплексов к диссоциации,
а также их способность образовывать малорастворимые в воде коагуляты или мицеллы в
присутствии PL, зависят от ионной силы раствора [130, 160, 161].
В образуемых относительно прочных тройных комплексах
PL•ДНК/ДНК или
PL•ДНК/ПНК полилизин может препятствовать диссоциации ДНК/ДНК или ДНК/ПНК
дуплекса. В случае D и P дуплексов в присутствии полилизина возможно образование тройных
монокомплексов типа 1, состоящих из одной цепи полилизина и одного или нескольких (n)
дуплексов, соответственно PL•(ДНК/ДНК)n или PL•(ДНК/ПНК)n (Рис. 3.11, структура 1) или
поликомплексов типа 2, состоящих из m молекул полилизина, соединенных m молекулами
дуплексов, соответственно, (PL•ДНК/ДНК)m или (PL•ДНК/ПНК)m (Рис. 3.11, структура 2).
В физиологических условиях в случае D дуплексов наиболее вероятной структурой
образуемого тройного комплекса PL•ДНК/ДНК является поликомплекс типа 2. Именно при
такой структуре тройного комплекса существует вероятность агрегации и выпадения комплекса
в осадок с течением времени, что соответствует падению оптического поглощения,
наблюдаемым в эксперименте (Рис. 3.10а-г, красные кривые).
73
Рис. 3.11.Возможные структуры тройных комплексов, образуемых с участием полилизина PL и
ДНК/ДНК или ДНК/ПНК дуплексов в физиологическом растворе. 1 –тройной монокомплекс
PL•(ДНК/ДНК)n или PL•(ДНК/ПНК)n, 2 – тройной поликомплекс (PL•ДНК/ДНК)m или
(PL•ДНК/ПНК)m.
Добавление полилизина к P дуплексам, хотя и исключает нормальную термическую
денатурацию (Рис. 3.9д-з, красные кривые), обычно проявляемую в виде типичного S-образного
характера кривой плавления, но, в отличие от D дуплексов, не приводит к уменьшению
оптического поглощения раствора при выдерживании во времени при постоянной температуре
(Рис. 3.10д-з, красные кривые). Структура тройного поликомплекса типа 2 для ДНК/ПНК
дуплекса является маловероятной, поскольку цепь ПНК в ДНК/ПНК дуплексе не имеет
отрицательно заряженных групп, а значит количество отрицательных зарядов в таком дуплексе
в два раза меньше, по сравнению с ДНК/ДНК дуплексом. Поэтому электростатические
взаимодействия в гибридном ДНК/ПНК дуплексе с концевыми участками PL в виде тройного
поликомплекса (PL•ДНК/ПНК)m слишком слабы по сравнению с ДНК/ДНК дуплексом. Однако,
структура тройного монокомплекса PL•(ДНК/ПНК)n в физиологическом растворе достаточно
прочная, чтобы не плавиться при нагревании и вместе с этим не выпадать в осадок.
Таким образом, вероятно, что в присутствии полилизина в случае ДНК/ДНК дуплексов
образуется тройной поликомплекс типа 2, способный агрегировать и выпадать в осадок [160,
161], а в случае ДНК/ПНК дуплексов, скорее всего, такой поликомплекс не образуется, а
74
формируется монокомплекс типа 1 (Рис. 3.11), который лишь препятствует нормальной
диссоциации дуплекса, но не выпадает в осадок.
Таким образом, показано, что полилизин в растворе препятствует нормальной
диссоциации как ДНК/ПНК дуплекса, так и диссоциация ДНК/ДНК дуплекса. Далее важно было
выяснить, влияет ли полилизин в составе нанокомпозита TiO2•PL•ДНК/ПНК на диссоциацию
ДНК/ПНК дуплекса.
3.7. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах TiO2,
покрытых полилизином. Зависимость от температуры
Для исследования влияния полилизина в составе нанокомпозитов на диссоциацию
дуплексов были сконструированы модельные нанокомпозиты TiO2•PL•ДНК/ПНК, содержащие
дуплексы P1, P2, P3 и P4 с различным числом перекрывания комплементарных пар оснований
(Таблица 2.2).
За процессом диссоциации ДНК/ПНК дуплексов наблюдали по десорбции ПНК из
нанокомпозита TiO2•PL•ДНК/ПНК в PBS или TBS. Для этой цели использовали ДНК/FluПНК
дуплекс, иммобилизованный при пониженной температуре на наночастицах TiO2•PL с
образованием TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозита. В процессе эксперимента проводили
нагревание аликвоты нанокомпозита в течение 10 мин при разных температурах в интервале от
20 до 90 0C, после чего образцы разбавляли соответствующим буфером, охлажденным до 0 0C,
центрифугировали, при этом нанокомпозит выпадал в осадок, а диссоциировавшая ПНК
оставалась в растворе. Проводили разделение осадка и супернатанта и оценивали содержание
десорбированной от носителя FluПНК в супернатанте. Степень десорбции ПНК определяли путем
соотношения количества
Flu
ПНК в супернатанте к общему количеству
Flu
ПНК, использованной
изначально для иммобилизации. По полученным данным строили кривые зависимости
десорбции FluПНК из нанокомпозита TiO2•PL•ДНК/ПНК от температуры.
Получили кривую термической десорбции
Flu
ПНК1 из состава нанокомпозита
TiO2•PL•ДНК2/FluПНК1. (Рис. 3.12, кривая 1). Видно, что кривая термической десорбции ПНК
имеет характерный S-образный вид, типичный для кривых плавления дуплексов в растворе (Рис.
3.9, чёрные кривые) с характерным температурным перегибом, соответствующим значению
температуры плавления дуплекса. Полученный вид кривой десорбции
что осуществлена диссоциация
Flu
Flu
ПНК1 свидетельствует,
ПНК1 из состава нанокомпозита за счет денатурации
иммобилизованного на нем дуплекса ДНК2/FluПНК1.
75
Рис. 3.12. Кривая десорбции FluПНК1 из нанокомпозита TiO2•PL•ДНК2/FluПНК1 (кривая 1) в
зависимости от температуры, контроль с FluПНК2, некомплементарной ДНК2 (кривая 2). Образцы
приготовлены в PBS.
Для дополнительного подтверждения характера десорбции (именно за счет диссоциации
дуплекса), был проведён аналогичный эксперимент по десорбции контрольного флуоресцентномеченного олигомера
Flu
ПНК2, в котором вместо последовательности ПНК1 была использована
ПНК2 с некомплементарной последовательностью
GCAAAAGCAGGGTAGAC (Рис. 3.12,
N
кривая 2). В этом случае зависимость интенсивности флуоресценции от температуры получена в
виде прямой линии, то есть значения интенсивности флуоресценции не меняются с ростом
температуры. Изменения значений интенсивности флуоресценции от температуры в случае
комплементарной ПНК свидетельствует о том, что десорбция ПНК из TiO2•PL•ДНК2/FluПНК1
нанокомпозита происходит именно за счет распада комплементарного ДНК/ПНК-дуплекса.
Таким образом, в отличие от влияния PL на диссоциацию дуплекса ДНК/ПНК в растворе,
наличие полилизина в «твердофазной» системе TiO2•PL•ДНК/ПНК не препятствует
диссоциации ДНК/ПНК дуплекса, нековалентно иммобилизованного на поверхности наночастиц
TiO2.
Из кривых десорбции FluПНК из нанокомпозитов в зависимости от температуры для всех
исследованных ДНК/ПНК дуплексов P1, P2, P3 и P4 (с числом перекрывания комплементарных
пар оснований, равных 10, 12, 14 и 16 п.о. соответственно, (Таблица 2.2), иммобилизованных на
TiO2•PL композите (Рис. 3.13), видно, что все кривые, независимо от числа перекрываний
комплементарных пар оснований, имеют типичный вид кривых плавления с характерным
температурным переходом в точке перегиба, соответствующей Tm дуплекса. Как и в растворе
(Рис. 3.14, таблица 3.1) величина Tm исследованных дуплексов в составе нанокомпозитов
76
закономерно увеличивается с возрастанием числа перекрываний комплементарных пар
оснований.
Рис. 3.13. Кривые десорбции FluПНК из TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозитов в зависимости от
температуры в TBS. Tm – значения температур плавления для ДНК/ПНК дуплексов (Таблица 2.2)
в составе нанокомпозитов.
На рис. 3.14 представлены значения температуры плавления Tm всех исследованных
дуплексов, как в растворе (в гомогенной фазе), так и на твёрдой фазе (в составе нанокомпозитов)
в зависимости от числа перекрывания комплементарных пар оснований в дуплексе.
Видно, что прочность ДНК/ПНК дуплексов на твёрдой фазе в составе нанокомпозитов в
зависимости от числа перекрывания комплементарных пар оснований увеличивается в такой же
закономерности, как и в растворе (Рис. 3.14). Другими словами, чем прочнее дуплекс в растворе,
тем стабильнее он в составе TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита.
Таким образом, несмотря на заметное ингибирование полилизином диссоциации
ДНК/ПНК дуплексов в растворе, будучи нековалентно иммобилизованным на твердой фазе, он
очень
слабо
влияет
на
диссоциацию
ДНК/ПНК
дуплекса
в
составе
исследуемого
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита, который способен «отпускать» ПНК в раствор в зависимости
от прочности самого исходного ДНК/ПНК дуплекса.
77
Полученные данные свидетельствуют, что нековалентная иммобилизация ПНК в виде
гибридного ДНК/ПНК-дуплекса на наночастицах диоксида титана, покрытых полилизином,
является обратимой.
Рис. 3.14. Сравнение температур плавления Tm для ДНК/ДНК и ДНК/ПНК дуплексов (Таблица
2.2), полученных в растворе и на твёрдой фазе в составе нанокомпозитов TiO2•PL•ДНК/ПНК в
зависимости от различного числа перекрывания комплементарных пар оснований в дуплексе.
Причина различного влияния полилизина на процесс диссоциации ДНК/ПНК дуплексов в
растворе и в иммобилизованном виде в составе TiO2•PL•ДНК/ПНК композита, вероятно,
заключается в разном структурном взаимодействии полилизина с двойной спиралью в растворе
и на твердой фазе. В растворе, вероятнее всего, полилизин, обладающий большей степенью
свободы, способен «обвиваться» вокруг двойной спирали в ДНК/ПНК дуплексе и тем самым
прочно блокировать или стабилизировать диссоциацию дуплекса не только за счет
электростатических взаимодействий, но и за счет уменьшения энтропии такой системы, т.е. за
счет простого механического обвивания полилизина вокруг дуплекса.
В свою очередь, на твердой фазе, PL обладает гораздо меньшей степенью свободы
вследствие достаточно прочной его фиксации на поверхности наночастиц TiO2. Это приводит к
тому что молекулы полилизина, не способны в большой степени «обвивать» двойную спираль
дуплекса ДНК/ПНК и взаимодействуют с цепью ДНК лишь электростатически.
Другая причина слабого воздействия PL на прочность ДНК/ПНК дуплексов,
иммобилизованных на TiO2•PL композитах, может заключаться и в том, что «эффективный»
положительный заряд полилизина, иммобилизованного на наночастицах, гораздо меньше, чем в
случае нахождения полилизина в растворе, поскольку часть положительных зарядов полилизина
при этом затрачивается на электростатическую связь с поверхностью наночастиц TiO2. Известно,
что дополнительная стабильность дуплексов, приобретаемая при добавлении в систему
78
полилизина, существенно зависит от соотношения положительно заряженных аминогрупп
полилизина и отрицательно заряженных межнуклеотидных фосфатных остатков ДНК [160, 161].
Вследствие этого, полилизин на твердой фазе может влиять на дополнительную стабилизацию
дуплекса в гораздо меньшей степени, чем в растворе.
Таким образом, показано, что в физиологическом растворе PL существенно блокирует
ассоциацию и диссоциацию ДНК/ПНК и, особенно сильно, ДНК/ДНК дуплексов, а его влияние
на диссоциацию ДНК/ПНК дуплексов в составе нанокомпозитов слабое. Это приводит к тому,
что за счет диссоциации ДНК/ПНК дуплексов в составе получаемых TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозитов иммобилизация ПНК в виде гибридных ДНК/ПНК дуплексов на наночастицы
TiO2, покрытые полилизином, является обратимой.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования предлагаемых
нанокомпозитов
TiO2•PL•ДНК/ПНК
в
качестве
носителей
с
обратимой
привязкой
терапевтически значимых ПНК.
Таким образом, исследование термодинамики диссоциации ДНК/ПНК дуплексов,
иммобилизованных на наночастицах TiO2, покрытых полилизином показали, что обратимость
фиксации ПНК обеспечивается за счет диссоциации иммобилизованного ДНК/ПНК дуплекса, а
прочность фиксации ПНК регулируется за счет изменения термостабильности такого дуплекса,
то есть простым изменением числа комплементарных пар оснований в нем. Однако для
конструирования композитов с оптимальной скоростью высвобождения препарата недостаточно
знать лишь термодинамические характеристики удерживания ПНК-препарата на носителе.
Необходимо знание конкретных кинетических параметров удерживания или высвобождения
ПНК олигомера из нанокомпозита.
3.8. Диссоциация ДНК/ПНК дуплексов, иммобилизованных на наночастицах TiO2,
покрытых полилизином. Зависимость от времени
Контроль скорости высвобождения препарата необходим для доставки терапевтического
препарата к мишени в составе композита и последующего эффективного его воздействия на
мишень. Преждевременная диссоциация препарата может отрицательно сказаться на общей
эффективности доставки нуклеотидного материала в клетки, а чрезмерная стабильность его
фиксации на носителе - на эффективности его воздействия на внутриклеточную мишень. Для
обеспечения
необходимого
баланса
между
двумя
состояниями
препарата
требуется
определенная (оптимальная) прочность фиксации препарата на носителе.
В связи с этим далее была исследована кинетика десорбции ПНК из состава
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов и проведена оценка величин наблюдаемых констант
скоростей диссоциации и времени полуудерживания ПНК в составе нанокомпозитов в
79
зависимости от числа комплементарных пар оснований в иммобилизованном ДНК/ПНК
дуплексе. Как было показано выше, при увеличении числа перекрывающихся комплементарных
оснований в дуплексе температуры плавления дуплексов (Tm) как в растворе, так и на твердой
фазе закономерно увеличиваются (Рис. 3.14).
Для исследования кинетики десорбции ПНК из TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита
использовали
содержащий
флуоресцентную
метку
ДНК/FluПНК
дуплекс,
который
иммобилизовали при пониженной температуре на TiO2•PL композите с образованием
TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозита. Для того чтобы одновременно следить за поведением ДНК
в составе нанокомпозита, на 5’-конец ДНК олигомера вводили фосфат, содержащий
радиоактивный
P (см. методы). При этом обеспечивалась возможность параллельной
32
регистрации флуоресцентной и радиоактивной метки TiO2•PL•[32P]ДНК/FluПНК нанокомпозита.
Аликвоты полученных нанокомпозитов выдерживали при фиксированной температуре в
течение различного времени. Количество десорбированной с носителя
Flu
ПНК или [32P]ДНК
оценивали после центрифугирования суспензии нанокомпозита, измеряя интенсивность
соответственно флуоресценции или радиоактивности в супернатанте. Степень десорбции ПНК
определяли как отношение количества
Flu
ПНК в супернатанте к общему количеству
Flu
ПНК,
использованной изначально для иммобилизации. Степень десорбции ДНК определяли, измеряя
количество радиоактивности, обнаруженной в супернатанте и в осадке. По полученным данным
строили кривые зависимости десорбции FluПНК и [32P]ДНК из TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита
от времени. Из рис. 3.15 видно, что с течением времени происходит десорбция
Flu
ПНК1, а
радиоактивность в растворе остаётся постоянной. Это свидетельствует о том, что в основном в
раствор уходит FluПНК1, а радиоактивная [32P]ДНК2 остаётся на твёрдой фазе.
Таким образом, полученные кинетические данные свидетельствуют, что десорбция ПНК
из
состава нанокомпозита происходит
не за счет
десорбции
ДНК/ПНК
дуплекса,
иммобилизованного на наночастицах TiO2, а за счет денатурации этого дуплекса, с
высвобождением в раствор ПНК.
Для того чтобы определить скорость десорбции ПНК из нанокомпозитов в зависимости
от
числа
перекрывающихся
комплементарных
оснований
в
ДНК/ПНК
дуплексе,
иммобилизованном на наночастицах, была исследована кинетика десорбции ПНК из модельных
нанокомпозитов TiO2•PL•P1, TiO2•PL•P2, TiO2•PL•P3 и TiO2•PL•P4, содержащих гибридные
ДНК/ПНК дуплексы P1, P2, P3 и P4 (Таблица 2.2) с различной длиной перекрывания
комплементарных пар оснований.
80
Рис. 3.15. Зависимость интенсивности флуоресценции (кривая 1) и радиоактивности (2) от
времени при выдерживании нанокомпозита TiO2•PL•[32P]ДНК2/FluПНК1 во времени при 35ºС в
PBS. Кривая 1 отображает десорбцию FluПНК1, кривая 2 – десорбцию радиоактивно меченой
[32P]ДНК2.
При нарушении термодинамического равновесия ДНК/ПНК дуплекс в составе
TiO2•PL•ДНК/ПНК-нанокомпозита должен диссоциировать с образованием свободной ПНК и
композита TiO2•PL•ДНК с некоторой кажущейся (наблюдаемой) константой скорости
диссоциации k:
k
TiO2•PL•ДНК/ПНК
ПНК + TiO2•PL•ДНК
(3.1)
Нарушение термодинамического равновесия в этом случае может быть достигнуто,
например, многократным разбавлением исходного нанокомпозита соответствующим буфером.
Предполагается, что обратная ассоциация ПНК из раствора с комплементарной ДНК,
иммобилизованной на носителе, затруднена из-за стерических трудностей, обусловленных
свойствами самого носителя [42].
Далее, полагая, что TiO2•PL•ДНК/ПНК = AB, TiO2•PL•ДНК = B, ПНК = A, уравнение (3.1)
может быть переписано в виде:
AB
k
A+B
(3.2)
Принимая во внимание принятую схему процесса десорбции (3.2), кинетическое
уравнение накопления продукта А (ПНК) в растворе может быть выражено в нелинейном
(экспоненциальном) (3.3) или линейном (3.4) относительно времени t видах:
 A   A0   AB0    AB0 ekt
(3.3)
  A   AB 0   A 
ln  0
  kt

 AB0


(3.4)
81
где [A]0 и [AB]0 начальные концентрации ПНК в растворе и суспензии TiO2•PL•ДНК/ПНК.
Время полуудерживания или время полудиссоциации ПНК (τ1\2) в составе нанокомпозита
в этом случае может быть вычислено по уравнению:
τ1/2 =
ln2
(3.5)
k
В данных уравнениях в качестве текущей концентрации продукта A (ПНК) в растворе
можно использовать любой нормируемый параметр, например, для флуоресцентно меченной
ПНК - величину интенсивности флуоресценции, измеряемую в растворе. Величины [A]0 и [AB]0,
т.е. соответственно начальные концентрации свободной ПНК и TiO2•PL•ДНК композита, в
данном случае будут варьируемыми параметрами.
Для вычисления кажущихся констант скоростей диссоциации k, вначале при
определённой температуре проводили измерения зависимости интенсивности флуоресценции от
времени. В качестве [A]0 принимали значения интенсивности флуоресценции в растворе до
начала кинетических измерений, в качестве [AB]0 - значения интенсивности флуоресценции в
растворе при «бесконечном» времени выдерживания реакционной смеси. Далее путём
аппроксимации экспериментальных значений к теоретической кривой, построенной с
использованием кинетических уравнений (3.3) или (3.4), варьируя параметры [A]0 и [AB]0,
определяли кажущиеся константы скорости диссоциации k (Рис. 3.16, таблица 3.2) и далее по
уравнению (3.5) определяли времена полуудерживания τ1\2 ПНК в составе нанокомпозита (Рис.
3.17). За время полуудержания ПНК мы принимали время, за которое половина ПНК-препарата
остается в составе нанокомпозита, а другая половина десорбирована в раствор. Следует отметить
относительно хорошую корреляцию полученных экспериментальных данных как с нелинейной
(экспоненциальной) (Рис. 3.16а-г), так и с линеаризованной формой теоретических кривых (Рис.
3.16д), построенных согласно соответствующим уравнениям (3.3) и (3.4).
На
рис.
3.16
представлены
кинетические
кривые
десорбции
Flu
ПНК
из
TiO2•PL•ДНК/FluПНК-нанокомпозитов для всех исследованных ДНК/ПНК-дуплексов P1, P2, P3 и
P4 (с числом комплементарных пар оснований равным 10, 12, 14 и 16 п.о. соответственно,
(Таблица 2.2). На кривых зависимости десорбции от времени, полученных в экспоненциальной
(нелинейной) форме видно, что с ростом числа комплементарных пар в дуплексе наклон кривых
в начальный момент времени понижается (Рис. 3.16а-г). В той же мере понижается наклон и
линеаризованных кинетических кривых (Рис. 3.16д), характеризующих величину константы
скорости диссоциации.
82
Рис. 3.16. Кинетические кривые десорбции FluПНК из TiO2•PL•ДНК/FluПНК-нанокомпозитов:
TiO2•PL•P1, TiO2•PL•P2, TiO2•PL•P3 и TiO2•PL•P4, выраженные в экспоненциальной (а–г) и в
линеаризованной формах (д), в соответствии с кинетическими уравнениями (3.3) или (3.4).
Приведены вычисленные значения времени полудиссоциации ПНК (τ1\2) из состава
соответствующих TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов (а–г).
На рис. 3.17 в виде диаграмм изображены зависимости полученных констант скоростей
диссоциации ДНК/ПНК дуплексов в составе соответствующих нанокомпозитов от числа
комплементарных пар оснований в иммобилизованном ДНК/ПНК-дуплексе. Представлены
также вычисленные по этим данным величины времени полуудерживания 1/2 ПНК в составе
нанокомпозита. Из этих данных видно, что скорость десорбции ПНК из твердофазного
TiO2•PL•ДНК/ПНК-нанокомпозита или время полуудерживания ПНК в нанокомпозите
83
находятся в прямой зависимости от термостабильности дуплекса или числа комплементарных
пар оснований в гибридном ДНК/ПНК-дуплексе (Рис. 3.16). Другими словами, чем более
термостабилен ДНК/ПНК-дуплекс в составе нанокомпозита, тем меньше скорость десорбции
ПНК и тем больше время удерживания ПНК в составе нанокомпозита.
Таблица 3.2. Кажущиеся константы скорости диссоциации (k) и кажущиеся времена
полудиссоциации (1/2) ПНК/ДНК-дуплексов P1, P2, P3 и P4 в составе TiO2•PL•ДНК/ПНКнанокомпозитов при 35 0С в TBS буфере, вычисленные из экспериментальных кинетических
кривых, приведенных на рис. 3.16.
Число
Дуплексы
k, мин-1
1/2, мин
комплементарных п.о.
P1
10
(6.6 ± 0.9)∙10-2
10.6 ± 1.4
P2
12
(4.9 ± 0.5)∙10-2
14.1 ± 1.4
P3
14
(3.1 ± 0.4)∙10-2
22.2 ± 2.9
P4
16
(9.6 ± 1.0)∙10-3
70.7 ± 7.4
Рис. 3.17. Зависимость значений логарифма кажущихся констант скоростей диссоциации (ln(k))
ДНК/ПНК дуплексов в составе TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов от числа перекрывания
комплементарных пар оснований в дуплексе, полученных с использованием нанокомпозитов,
содержащих ДНК/ПНК дуплексы P1, P2, P3 и P4 (Таблица 2.2) при 35 оС. Над столбцами указаны
соответствующие
кажущиеся
времена
полудиссоциации
ПНК
из
соответствующегоTiO2•PL•ДНК/ПНК-нанокомпозита.
Таким образом, можно заключить, что, меняя длину комплементарного перекрывания в
ДНК/ПНК дуплексе, можно регулировать не только прочность связывания ПНК в составе
нанокомпозита TiO2•PL•ДНК/ПНК, но и скорость отщепления ПНК от TiO2-носителя. Изменяя
число комплементарных нуклеотидных пар в ДНК/ПНК-дуплексе, можно заранее задавать
необходимую скорость отщепления ПНК из состава TiO2•PL•ДНК/ПНК-нанокомпозитов, что в
дальнейшем позволит конструировать и создавать нанокомпозиты с оптимальным временем
удерживания ПНК-препарата в составе нанокомпозита при его доставке в клетку.
84
Известно, что доставка лекарственного препарата в клетки через кровяное русло [154, 162,
163] с дальнейшим захватом [164] и поглощением его клетками обычно достигается в течение
30–60 мин, а полное насыщение клеток препаратом достигается в течение 1-4 часов [154, 163165]. Времена полуудерживания ПНК в исследованных нами нанокомпозитах расположены
практически в этом же временном диапазоне. Можно полагать, что некоторая доля ПНК, в
зависимости от времени полудиссоциации, будет успешно доставлена в клетку в составе
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита.
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что в созданных нами
нанокомпозитах
TiO2•PL•ДНК/ПНК
терапевтически
значимые
ПНК-препараты
иммобилизованы обратимо и с контролируемой скоростью десорбции. В перспективе
предложенный тип нанокомпозитов может быть использован для доставки не только ПНКолигонуклеотидов, но также и других лекарственных препаратов, присоединенных к ПНК.
3.9.
Исследование
влияния
нанокомпозитов
TiO2•PL•ДНК/ПНК
на
жизнеспособность эукариотических клеток
Одной из важных характеристик лекарственного препарата является его цитотоксичность,
которая для клеточных культур может быть определена как концентрация или доза препарата,
под воздействием которой погибает или теряет свою жизнеспособность половина клеток (50%ная цитотоксическая концентрация, TC50). Значение 50%-ной цитотоксической концентрации
препарата могут быть получены из соответствующей кривых зависимости жизнеспособности
клеток в зависимости от концентрации препарата, находящегося в культуральной среде.
Из литературных данных было известно, что свободный полилизин оказывает
значительное токсическое действие на клетки. Таким образом, немаловажным было определение
влияния полилизина, иммобилизованного на наночастицы TiO2, не только на диссоциацию
иммобилизованных дуплексов, но также и на жизнеспособность клеток. В связи с этим далее
было проведено исследование влияния TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов, а также наночастиц
TiO2 и свободного полилизина, на жизнеспособность клеток MDCK. В процессе эксперимента
нанокомпозиты инкубировали с клетками в среде IMDM без сыворотки 4 ч, затем добавляли
сыворотку и инкубировали сутки. Жизнеспособность клеток определяли с помощью MTT. Для
этого инкубировали клетки с MTT в течение 4 ч, в результате выпадали кристаллы формазана.
Полученные кристаллы растворяли в DMSO и измеряли оптическое поглощение раствора на
планшетном колориметре. По экспериментальным данным построили кривые зависимости доли
выживших клеток от количества внесённого образца (Рис. 3.18).
85
Рис. 3.18. Жизнеспособность клеток MDCK в присутствии наночастиц TiO2 (а, б), полилизина
PL (а, б), TiO2•PL (а, б) и TiO2•PL•ДНК/ПНК (б) композитов. Концентрация 0.1 мг/мл по TiO2
соответствует 2 мкМ концентрации по ПНК, изменение концентрации TiO2 пропорционально
изменению концентрации по ПНК, мольное соотношение TiO2:PL = 1:2. Инкубировали 4 ч в
среде IMDM без сыворотки, затем внесли сыворотку и инкубировали сутки. Данные приведены
в логарифмической шкале (а).
Из рис. 3.18 видно, что жизнеспособность клеток уменьшается с ростом концентрации
внесённых образцов. Влияние на жизнеспособность клеток TiO2 наночастиц и TiO2•PL композита
практически не отличается друг от друга, т.е. TiO2 наночастицы и TiO2•PL композит не
оказывают существенного влияния на выживаемость клеток, в том числе и в области
планируемой рабочей концентрации (0.1 мг/мл). Аналогичные выводы можно сделать и при
сравнении цитотоксичности TiO2 наночастиц и TiO2•PL композита с цитотоксичностью
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита (Рис. 3.18 б).
Полилизин напротив, как и ожидалось, оказывает значительное влияние на выживаемость
клеток, уменьшая количество живых клеток вплоть до нуля, в то время как в присутствии
наночастиц и нанокомпозита доля живых клеток составляет 80-90%.
Таким образом, из приведенных данных можно заключить, что иммобилизация
полилизина на наночастицах TiO2 значительно уменьшает его токсичность, что согласуется с
литературными данными, приведёнными в разделе 1.4.1, а сам нанокомпозит не проявляет
существенной токсичности по отношению к клеткам MDCK и, таким образом, пригоден для
дальнейших биологических испытаний.
Низкая токсичность TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита не позволила определить точное
значение 50%-ной цитотоксической концентрации TC50 с помощью MTT. Мазурковой Н.А.
86
(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») с помощью окраски клеток трипановым синим была получена TC50
для TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита, которая составила 1.2 мг/мл в расчёте на наночастицы
TiO2.
3.10. Способность TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов проникать в эукариотические
клетки
Известно, что TiO2 наночастицы проникают в клетки млекопитающих [142, 166].
Предстояло выяснить, сохранят ли они эту способность после нековалентной иммобилизации на
них ДНК/ПНК дуплекса с образованием TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита.
Рис.
3.19.
Конфокальная
лазерная
флуоресцентная
микроскопия
суспензии
TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1 нанокомпозита в PBS буфере в бесклеточной среде. Концентрация
пробы 0.2 мг/мл по TiO2 и 2 мкМ по ДНК/ПНК дуплексу, мольное соотношение TiO2:PL=1:2.
Для наблюдения за поведением в клетке ПНК в составе TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита была использована ПНК, содержащая флуоресцентную метку (FluПНК).
Транспорт полученных нанокомпозитов в клетки исследовали с использованием конфокальной
лазерной сканирующей микроскопии. TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1 нанокомпозит получали, смешивая
предварительно полученный ДНК5/
Flu
ПНК1 дуплекс с заранее приготовленным TiO2•PL
композитом и перед обработкой клеток нанокомпозиты проверяли на возможность
детектироваться конфокальной лазерной сканирующей микроскопией вне клеток (Рис. 3.19).
Исследование образцов методом конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии
проводил Байбородин С.И. (ИЦиГ СО РАН).
TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1
нанокомпозиты,
содержащие
флуоресцентную
метку,
инкубировали с клетками HeLa в течение 24 ч в отсутствие сыворотки, затем клетки отмывали
от избытка не связавшегося нанокомпозита и дополнительно выдерживали в течение 24 ч в
87
культуральной среде. В завершение, живые клетки без фиксации на слайдах были
проанализированы конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопией (Рис. 3.20 а-г).
Рис. 3.20. Конфокальная лазерная флуоресцентная микроскопия клеток HeLa, обработанных
TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1 нанокомпозитом (2 мкМ по ПНК, 0.2 мг/мл по TiO2) (a–г) или свободной
Flu
ПНК1(2 мкМ) (д–з). Инкубация 24 ч в среде IMDM без сыворотки, промывка, инкубация 24 ч
в среде IMDM с сывороткой. Ядра клеток окрашены синим красителем Hoechst33342 (а, д);
цитозоль клеток окрашена красным красителем CellTracker Red CMTPX (в, ж), FluПНК,
содержащая FITC, отображена зелёным цветом (б, е); г, з - наложение а, б, в или д, е, ж
соответственно. Масштаб – 20 мкм.
Ядра клеток непосредственно перед анализом конфокальной микроскопией были
окрашены с синим флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (Рис. 3.20а). Цитозоль клеток
была окрашена красным флуоресцентным красителем Cell Tracker Red (Рис. 3.20в). Как видно из
рис. 3.20б, вся зеленая окраска, соответствующая флуоресцеинмеченой ПНК, перекрывается с
красной окраской цитозоля (Рис. 3.20в, г,) и не перекрывается с синей окраской ядер (Рис. 3.20а,
г), что свидетельствует о том, что молекулы ПНК сосредоточены внутри клеток (и/или на
поверхности мембран), но при этом не фиксируются в ядрах клеток. Допуская, что это
конфокальный снимок с довольно тонким срезом (200-300 нм), а размер клеточных ядер равен
около 10 мкм, можно заключить, что молекулы
Flu
ПНК в основном локализованы в цитоплазме
клеток. Параллельно в контрольных экспериментах с клетками, использовали свободную FluПНК
без ее фиксации на наночастицах TiO2 (Рис. 3.20д-з). Показано, что такая
Flu
ПНК, не
иммобилизованная на наночастицах TiO2 (Рис. 3.20д-з), не проникает через клеточные мембраны
(Рис. 3.20е). Полученные данные свидетельствуют, что молекулы ПНК сами по себе или за счет
флуоресцентного красителя не способны проникать в клетки. Они проникают только в составе
TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозита и в таком виде накапливаются внутри клеток.
88
Чтобы подтвердить количественно возможность ПНК, иммобилизованной в составе
нанокомпозита, накапливаться и удерживаться в эукариотических клетках нами был проведён
эксперимент с использованием метода проточной цитофлуорометрии (Рис. 3.21).
Рис. 3.21. Проточная цитофлуориметрия клеток MDCK. Доля клеток, обладающих
флуоресценцией (а), интенсивность флуоресценции клеток (б). 1 – контроль (клетки без
нанокомпозита), 2 - TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1 (0.1 мг/мл TiO2, 1 мкМ FluПНК1), 3 TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1 (0.01 мг/мл TiO2, 0.1 мкМ FluПНК1), 4 - TiO2 (0.1 мг/мл), 5 - TiO2 (0.01
мг/мл), 6 - FluПНК1 (1 мкМ), 7 - FluПНК1 (0.1 мкМ). Инкубация 4 ч в среде IMDM без сыворотки.
Показано, что более 90% TiO2•PL•ДНК5/FluПНК1 нанокомпозита накапливается в клетках
MDCK, при этом наблюдается концентрационная зависимость накопления нанокомпозита. При
уменьшении концентрации нанокомпозита в 10 раз интенсивность флуоресценции падает
приблизительно в два раза. Свободная FluПНК1, не связанная с TiO2–частицами, как и ожидалось
не проникает в клетки.
Таким образом, разработан метод иммобилизации ПНК в составе гибридного ДНК/ПНК
дуплекса на поверхности наночастиц диоксида титана, покрытых полилизином, с образованием
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов, способных транспортировать ПНК в эукариотические
клетки и накапливаться в них без использования специальных трансфекционных агентов и
вспомогательных процедур.
3.11. Испытание биологической активности TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов на
примере клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)
После демонстрации возможности обратимой иммобилизации ПНК на наночастицы TiO2
и возможности проникновения сконструированных нами нанокомпозитов в эукариотические
клетки необходимо было проверить способность иммобилизованной ПНК в составе
89
TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов подавлять экспрессию чужеродных генов в клеточной
системе.
В качестве модели для проведения биологических испытаний был выбран вирус гриппа
A. Известно, что геном вируса гриппа A постоянно подвергается точечным мутациям, что
приводит к появлению новых штаммов, устойчивых к созданным лекарственным препаратам
[167]. При использовании антисенс олигонуклеотидов в качестве мишеней могут быть выбраны
наиболее консервативные участки генома вируса гриппа A [141, 168].
Известно, что геном вируса гриппа А состоит из 8 одноцепочечных (-) РНК [169]. После
заражения клеток вирусом гриппа вирусные (-) РНК (vРНК) транскрибируются в матричные
mРНК и реплицируются в комплементарные (+) РНК (cРНК) [169-171].
Ранее для подавления вирусной активности в литературе был использован 22-звенный
антисенс
морфолиновый
олигомер
с
последовательностью
5’-
AGCAAAAGCAGGGTAGATAATC-3’, комплементарный 3'-некодирующему участку vРНК
сегмента 5, кодирующей нуклеопротеин (NP) [170]. Известно, что этот белок защищает вирусную
РНК и играет ключевую роль в инкорпорации вирусного генома в клеточные ядра
инфицированного организма, тем самым, способствуя дальнейшей репликации и сборке
вирусных частиц [132].
Поскольку олигодезоксинуклеотид с последовательностью GCAAAAGCAGGGTAGA,
электростатически и нековалентно иммобилизованный на TiO2•PL наночастицы, показал
хорошие результаты при подавлении размножения вируса гриппа А и снизил его титр на 3
lg(TCID50/мл) [132], на основе этой последовательности был сконструирован и синтезирован 16звенный ПНК-олигомер (ПНК2) с последовательностью NGCAAAAGCAGGGTAGAC. Следует
отметить, что длина выбранного нами для этой цели ПНК олигомера несколько короче, чем
длина аналогичного морфолинового олигомера, поскольку 16-мерный ПНК олигомер образует
довольно прочный дуплекс (Тm = 83.4 0С) достаточный и сравнимый по термостабильности с
более протяженным аналогичным 22-звенным ДНК или морфолиновым олигомером.
Таким образом, для воздействия на геном вируса гриппа А был использован олигомер
ПНК2, комплементарный 3'-некодирующему участку гена NP вируса гриппа А человека (H3N2).
В
качестве
контрольного
фрагмента
использовали
олигомер
ПНК1
со
случайной
последовательностью. Для иммобилизации ПНК1 или ПНК2 на наночастицы TiO2 использовали
соответствующие комплементарные ДНК олигомеры ДНК2 или ДНК6 (Рис. 3.22, таблица 2.2).
90
Рис. 3.22. Структура TiO2•PL•ДНК2/ПНК1 и TiO2•PL•ДНК6/ПНК2, содержащих 16-звенные ПНК
олигомеры, иммобилизованные в виде гибридных ДНК2/ПНК1 или ДНК6/ПНК2 дуплексов с
числом комплементарных пар оснований равным 10. Нанокомпозит TiO2•PL•ДНК2/ПНК1
содержит олигомер ПНК1 со случайной последовательностью, который не образует
комплементарного комплекса с vРНК. Нанокомпозит TiO2•PL•ДНК6/ПНК2 содержит олигомер
ПНК2, компмлементарный 3’-концу vРНК сегмента 5. Знаком «-» обозначены отрицательные
заряды межнуклеотидных фосфатов в ДНК; знаком «+» обозначены положительные заряды
аминогрупп лизина; n – число комплементарных пар оснований в дуплексе.
Исследуемые ПНК олигомеры были иммобилизованы в виде комплементарных ДНК/ПНК
дуплексов на TiO2•PL наночастицах за счет электростатического взаимодействия между
положительно заряженными аминогруппами полилизина в составе TiO2•PL и отрицательно
заряженными фосфатными группами углеводофосфатного остова ДНК (Рис. 3.22). ПНК в составе
нанокомпозитов удерживается за счет комплементарных взаимодействий в дуплексе с ДНКфрагментом длиной в 10 п.о. Созданный нанокомпозит TiO2•PL•ДНК6/ПНК2 содержал
комплементарный vРНК 16-звенный олигомер ПНК2. В качестве контроля получен
нанокомпозит, содержащий некомплементарную РНК вируса гриппа последовательность ПНК1.
(Рис. 3.22).
Следует отметить, что длина ПНК и структура ДНК/ПНК дуплекса была выбрана таким
образом, чтобы перекрывание комплементарных пар оснований в составе TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита было минимальным (10 п.о., Рис. 3.22), что способствует более легкому
высвобождению ПНК. С другой стороны, длина перекрывания ПНК с комплементарной цепью
vРНК максимальна и составляет 16 п.о., что, в свою очередь, обеспечивает прочную связь ПНК
с vРНК в клеточной среде (Рис. 3.22). Действительно, температура плавления дуплексов
91
ПНК2/ДНК6 (P5) и ПНК2/ДНК7 (P6) с числом перекрывания 10 и 16 п.о. составляла 64.5 и 83.4 0C
соответственно (Таблица 2.2).
В качестве контрольного образца, не содержащего наночастицы TiO2, использовали
конъюгат
ПНК2-Tat,
содержащий
пептидный
фрагмент
транспортного
белка
Tat,
обеспечивающий доставку молекул ПНК в клетки [172]. Другим контрольным образцом,
содержащим комплементарную ПНК-последовательность ПНК2, но не содержащим в своем
составе наночастицы TiO2, был фрагмент нанокомпозита – комплекс PL•ДНК6/ПНК2.
Дальнейшие испытания противовирусной активности и все работы с вирусом с
использованием сконструированных нами препаратов были осуществлены Мазурковой Н.А.
(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»).
Работа с клеточными культурами MDCK и вирусными частицами были проведены по
следующей схеме. Клетки MDCK заражали вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) с
множественностью заражения 0.1 TCID50/клетка (TCID50 – тканевая цитопатическая доза вируса,
при которой погибает 50% клеток) в среде RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Через 1 ч
после заражения клетки промывали и вносили образцы в среде RPMI-1640. Через 4ч инкубации
клетки промывали, добавляли среду RPMI-1640, содержащую 2 мкг/мл трипсина, и
инкубировали в течение двух суток при 37
0
C. Титр вируса определяли в реакции
гемагглютинации, используя 1%-ную суспензию эритроцитов петуха.
Олигомер ПНК2, комплементарный vРНК, в составе нанокомпозита TiO2•PL•ДНК6/ПНК2
подавляет размножение вируса на 2.7 lg(TCID50/мл) или в 500 раз (Рис. 3.23). Нанокомпозит
TiO2•PL•ДНК2/ПНК1, несущий олигонуклеотид со случайной последовательностью, не проявил
заметной активности. Заметного влияния на титр вируса не оказал и ПНК2 олигомер,
доставленный в клетки в виде конъюгата с белком-транспортёром Tat (ПНК2-Tat) или с помощью
тройного комплекса PL•ДНК6/ПНК2, значения титра вируса, полученные для данных образцов,
практически не отличаются от контроля (необработанные клетки).
92
Рис. 3.23. Ингибирование роста вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в клетках MDCK в
присутствии различных образцов. Заражение вирусом 1 ч, затем после промывки обработка
образцами 4 ч и, наконец, после промывки дальнейшая инкубация в течение 48 ч. Титр вируса
определён по реакции гемагглютинации. Контроль – клетки MDCK без добавления образцов.
Концентрация 0.1 мг/мл по наночастицами TiO2 соответствовала концентрации 2 мкМ по ПНК.
Следует отметить, что конъюгат ПНК с белком Tat способен эффективно проникать в
эукариотические клетки [143]. Эти данные были подтверждены нами с помощью проточной
цитофлуорометрии (Рис. 3.24). В связи с этим низкая биологическая активность данного
конъюгата может быть связан с низкой эффективностью выхода из эндосом. [146]. Отсутствие
заметной противовирусной активности в случае PL•ДНК6/ПНК2 комплекса, не содержащего в
своем составе TiO2-наночастиц, вероятно, также связано с недостаточной эффективностью
доставки ПНК в клетки с помощью PL. Также отсутствие видимого эффекта может быть
объянено более прочным свзяыванием ДНК/ПНК дуплекса со свободным полилизином,
следовательно, выход ПНК из такого комплекса затруднён и эффективного связывания с vРНК
не происходит.
Таким образом, эти данные свидетельствуют о существенной роли TiO2•PL композитов
как транспортеров ПНК в эукариотические клетки. Только ПНК, комплементарная вирусной
РНК и иммобилизованная на наночастицах в составе TiO2•PL•ДНК6/ПНК2 нанокомпозита,
способна эффективно и сайт-специфично подавлять репродукцию вируса гриппа А. Следует
отметить, что фрагмент ДНК6 может вносить вклад в противовирусную активность, однако, в
силу того, что этот фрагмент направлен на другие мишени (mРНК и cРНК), его активность не
очень высока, как это следует из данных работы [132]. Таким образом, эффективность препарата
в основном определяется наличием ПНК.
93
Рис. 3.24. Проточная цитофлуориметрия клеток MDCK обработанных конъюгатом FluПНК2-Tat
при различных концентрациях в среде. Инкубация 4 ч в среде IMDM без сыворотки.
Одной из количественных характеристик биологической активности лекарственного
препарата является его 50%-ная ингибирующая концентрация (IC50), т.е. такая концентрация
препарата, при которой проявляется 50%-ое подавление биологической активности. Для
определения
50%-ной
ингибирующей
концентрации
(IC50)
для
TiO2•PL•ДНК6/ПНК2
нанокомпозита была построена кривая зависимости степени ингибирования роста вируса гриппа
в клетках MDCK от концентрации используемого нанокомпозита (Рис. 3.25).
Ингибирование, %
Ингибирование, %
100
75
TiO2•PL•ДНК1/ПНК1
50
IC50 < 3 мкг/мл
25
0
0
20
40
60
80
TiO2, мкг/мл
100
TiO2, мкг/мл
Рис. 3.25. Зависимость степени ингибирования размножения вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2)
в клетках MDCK от концентрации TiO2•PL•ДНК6/ПНК2 нанокомпозита.
94
Исходя из этих данных, величина IC50 для TiO2•PL•ДНК6/ПНК2 нанокомпозита в
пересчете на концентрацию TiO2 наночастицы составила менее 0.003 мг/мл или в эквиваленте
ПНК 0.03 мкМ с учётом, что ёмкость нанокомпозита по ДНК или ДНК/ПНК дуплексу равна
приблизительно 10 нмоль/мг в PBS или в клеточной среде.
Значение индекса селективности (SI) для нанобиокомпозита TiO2•PL•ДНК1/ПНК,
определяемое как отношение величины TC50 к IC50, равно 400 (SI = TC50/IC50 > 1200/3 = 400).
Другими словами, токсическая доза нашего препарата намного превышает (в 400 раз) его
биологически активную дозу. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что
предлагаемого нами TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозиты обладают слабой токсичностью и
высокой противовирусной активностью.
Следует отметить, что предлагаемые нами нанобиокомпозиты TiO2•PL•ДНК/ПНК имеют
свои преимущества по сравнению с ПНК-пептидными коньюгатами [172], не содержащими
наночастицы, используемыми для тех же целей. Например, получение TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозита не требуют введения специальных молекул-транспортеров (коротких пептидов,
например,
Tat-пептида),
поскольку
могут
быть
получены
простым
смешиванием
соответствующих количеств ДНК/ПНК-дуплекса и нанокомпозита TiO2•PL (так называемый
метод “mix-and-go”, подразумевающий смешивание всех компонентов с дальнейшим
использованием образцов без их дополнительной обработки). К тому же, при одних и тех же
концентрациях TiO2•PL•ДНК6/ПНК2 нанокомпозит подавляет размножение вируса на 2.5
lg(TCID50/мл) или в 300 раз больше по сравнению с конъюгатом ПНК2-Tat, имеющим ту же
самую последовательность ПНК (Рис. 3.23).
Таким образом, сконструированные нами TiO2•PL•ДНК/ПНК нанобиокомпозиты на
основе наночастиц диоксида титана, несущие фрагменты ПНК, способны не только проникать
через клеточные мембраны, но и проявлять высокую специфическую антисенс-активность, не
вызывая при используемых концентрациях токсического воздействия на живые клетки.
95
Выводы
1. Предложена и разработана новая и эффективная система доставки пептидонуклеиновых кислот (ПНК) в эукариотические клетки, основанная на использовании их
композитов с наночастицами диоксида титана. Для создания предлагаемых TiO 2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозитов был разработан метод обратимой и контролируемой иммобилизации ПНК в
виде ДНК/ПНК дуплексов на TiO2 наночастицы, покрытые полилизином (TiO2•PL).
2. Изучены физико-химические свойства созданных TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозитов.
Показано, что полилизин не оказывает заметного влияния на диссоциацию ДНК/ПНК дуплекса
в составе TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита, что позволяет осуществлять регулируемую и
обратимую диссоциацию ПНК из состава TiO2•PL•ДНК/ПНК нанокомпозита.
3.
Продемонстрирована
низкая
цитотоксичность
созданных
TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозитов, их TC50, определенная с помощью окраски клеток трипановым синим,
составляет 1200 мкг/мл в расчёте на наночастицы TiO2.
4. С помощью конфокальной лазерной флуоресцентной микроскопии показано, что
TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозиты способны проникать в клетки HeLa без использования
транcфекционных
реагентов.
Методом
проточной
цитофлуорометрии
показана
концентрационная зависимость накопления TiO2•PL•ДНК/FluПНК нанокомпозитов в клетках
MDCK.
5. На примере подавления размножения вируса гриппа A/ Aichi/2/68 /H3N2 в клетках
MDCK продемонстрирована высокая биологическая активность созданных TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозитов. Титр вируса был снижен на 2.7 lg(TCID50/мл) или в 500 раз. IC50 - эффективная
концентрация используемого нанокомпозита - составила менее 3 мкг/мл, индекс селективности
SI ≥ 400. Разработанная система доставки ПНК в клетки с использованием TiO2•PL•ДНК/ПНК
нанокомпозитов,
обеспечивает
эффективное
и
внутриклеточной нуклеиновой кислотой-мишенью.
96
селективно
взаимодействие
ПНК
с
Список литературы
1. Li J., Wang Y., Zhu Y., Oupický D.J. Recent advances in delivery of drug-nucleic acid
combinations for cancer treatment // Control Release. – 2013. V. 172. – N. 2. – P. 589-600.
2. Järver P., O'Donovan L., Gait M.J. A chemical view of oligonucleotides for exon skipping and
related drug applications // Nucleic Acid Ther. – 2014. V. 24. – N. 1. – P. 37-47.
3. Lebleu B., Moulton H.M., Abes R., Ivanova G.D., Abes S., Stein D.A., Iversen P.L.,
Arzumanov A.A., Gait M.J. Cell penetrating peptide conjugates of steric block oligonucleotides // Adv
Drug Deliv Rev. – 2008. – V. 60. – N. 4-5. – P. 517-529.
4. Torres A.G., Threlfall R.N., Gait M.J. Potent and sustained cellular inhibition of miR-122 by
lysine-derivatized peptide nucleic acids (PNA) and phosphorothioate locked nucleic acid (LNA)/2'-Omethyl (OMe) mixmer anti-miRs in the absence of transfection agents // Artif DNA PNA XNA. – 2011.
V. 2. – N. 3. – P. 71-78.
5. Kole R., Krainer A.R., Altman S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense
oligonucleotides // Nat Rev Drug Discov. – 2012. – V. 11. – N. 2. – P. 125-140.
6. Bestas B., Moreno P.M., Blomberg K.E., Mohammad D.K., Saleh A.F., Sutlu T., Nordin J.Z.,
Guterstam P., Gustafsson M.O., Kharazi S., Piątosa B., Roberts T.C., Behlke M.A., Wood M.J., Gait
M.J., Lundin K.E., El Andaloussi S., Månsson R., Berglöf A., Wengel J., Smith C.I. Splice-correcting
oligonucleotides restore BTK function in X-linked agammaglobulinemia model // J Clin Invest. – 2014.
– V. 124. – N. 9. – P. 4067-4081.
7. Han L., Zhao J., Zhang X., Cao W., Hu X., Zou G., Duan X., Liang X.J. Enhanced siRNA
delivery and silencing gold-chitosan nanosystem with surface charge-reversal polymer assembly and
good biocompatibility // ACS Nano. – 2012. – V. 6. – N. 8. – P. 7340-7351.
8. Couto L.B., High K.A. Viral vector-mediated RNA interference // Curr Opin Pharmacol. –
2010. – V. 10. – N 5. – P. 534-542.
9. Al-Dosari M.S., Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress //
AAPS J. – 2009. – V. 11. – N. 4. – P. 671-681.
10. Bouard D., Alazard-Dany D., Cosset F.L.Viral vectors: from virology to transgene expression
// Br J Pharmacol. – 2009. – V. 157. – N. 2. – P. 153-165.
11. Ogris M., Oupicky D. Nanotechnology for nucleic acid delivery. Methods and protocols.
New York: Humana Press, 2013.
12. Le Doux J.M. Gene therapy protocols. Volume 1: Production and in vivo applications of gene
transfer vectors. Totowa: Humana Press, 2008.
97
13. Petkar K.C., Chavhan S.S., Agatonovik-Kustrin S., Sawant K.K. Nanostructured materials in
drug and gene delivery: a review of the state of the art // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. – 2011. – V.
28. – N. 2. – P. 101-164.
14. Arora H.C., Jensen M.P., Yuan Y., Wu A., Vogt S., Paunesku T., Woloschak G.E.
Nanocarriers enhance Doxorubicin uptake in drug-resistant ovarian cancer cells // Cancer Res. – 2012.
– V. 72. – N. 3. – P. 769-778.
15. Sette A., Spadavecchia J., Landoulsi J., Casale S., Haye B., Crociani O., Arcangeli A.
Development of novel anti-Kv 11.1 antibody-conjugated PEG-TiO2 nanoparticles for targeting
pancreatic ductal adenocarcinoma cells // J Nanopart Res. – 2013. – V. 15, p. : 2111.
16. Hou S., Ma H., Ji Y., Hou W., Jia N. A calcium phosphate nanoparticle-based biocarrier for
efficient cellular delivery of antisense oligodeoxynucleotides // ACS Appl Mater Interfaces. – 2013. –
V. 5. – N. 3. – P. 1131-1136.
17. Noh S.M., Kim W.K., Kim S.J., Kim J.M., Baek K.H., Oh Y.K. Enhanced cellular delivery
and transfection efficiency of plasmid DNA using positively charged biocompatible colloidal gold
nanoparticles // Biochim Biophys Acta. – 2007. V. 1770. – N. 5. – P. 747-752.
18. Wang T., Jiang H., Wan L., Zhao Q., Jiang T., Wang B., Wang S. Potential application of
functional porous TiO2 nanoparticles in light-controlled drug release and targeted drug delivery // Acta
Biomater. – 2015. – V. 13. – P. 354-363.
19. Rhim W.K., Kim J.S., Nam J.M. Lipid-gold-nanoparticle hybrid-based gene delivery //
Small. – 2008. – V. 4. – N. 10. – P. 1651-1655.
20. Huschka R., Barhoumi A., Liu Q., Roth J.A., Ji L., Halas N.J. Gene silencing by gold
nanoshell-mediated delivery and laser-triggered release of antisense oligonucleotide and siRNA // ACS
Nano. – 2012. – V. 6. – N. 9. – P. 7681-7691.
21. Giljohann D.A., Seferos D.S., Prigodich A.E., Patel P.C., Mirkin C.A. Gene regulation with
polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates // J Am Chem Soc. – 2009. – V. 131. – N. 6. – P. 2072-2073.
22. Nielsen P.E. Peptide nucleic acids. Protocols and applications. Wymondham: Horizon
Bioscience, 2004.
23. http://www.nano.gov/nanotech-101/what/definition.
24. https://en.wikipedia.org/wiki/Nanotechnology.
25. Lai W.F. Cyclodextrins in non-viral gene delivery // Biomaterials. – 2014. – V. 35. – N. 1. –
P. 401-411.
26. Yanes R.E., Tamanoi F. Development of mesoporous silica nanomaterials as a vehicle for
anticancer drug delivery // Ther Deliv. – 2012. – V. 3. – N. 3. – P. 389-404.
27. Mao S., Sun W., Kissel T. Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA //
Adv Drug Deliv Rev. – 2010. – V. 62. – N. 1. – P. 12-27.
98
28. Wagner D.E., Bhaduri S.B. Progress and outlook of inorganic nanoparticles for delivery of
nucleic acid sequences related to orthopedic pathologies: a review // Tissue Eng Part B Rev. – 2012. –
V. 18. – N. 1. –P. 1-14.
29. Sokolova V., Epple M. Inorganic nanoparticles as carriers of nucleic acids into cells // Angew
Chem Int Ed Engl. – 2008. – V. 47. – N. 8. – P. 1382-1395.
30. Wagner E. Polymers for nucleic acid transfer-an overview // Adv Genet. – 2014. – V. 88. –
P. 231-261.
31. Zhou P., An T., Zhao C., Li Y., Li R., Yang R., Wang Y., Gao X. Lactosylated PLGA
nanoparticles containing ϵ-polylysine for the sustained release and liver-targeted delivery of the
negatively charged proteins // Int J Pharm. – 2015. – V. 478. – N. 2. – P. 633-643.
32. Schubert, Delaney Jr J.T., Schubert U.S. Nanoprecipitation and nanoformulation of
polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid) // Soft Matter. – 2011. – V. 7.
– N. 5. – P. 1581-1588.
33. Panda J.J., Varshney A., Chauhan V.S. Self-assembled nanoparticles based on modified
cationic dipeptides and DNA: novel systems for gene delivery // J Nanobiotechnology. – 2013. – V.
11:18.
34. Raemdonck K., Martens T.F., Braeckmans K., Demeester J., De Smedt S.C. Polysaccharidebased nucleic acid nanoformulations // Adv Drug Deliv Rev. – 2013. – V. 65. – N. 9. – P. 1123-1147.
35. Lakkakula J.R., Maçedo Krause R.W. A vision for cyclodextrin nanoparticles in drug
delivery systems and pharmaceutical applications // Nanomedicine (Lond). – 2014. – V. 9. – N. 6. – P.
877-894.
36. Ali Demir S. Recent advances in novel drug carrier systems. Rijeka: InTech, 2012.
37. Staff R.H., Schaeffel D., Turshatov A., Donadio D., Butt H.J., Landfester K., Koynov K.,
Crespy D. Particle formation in the emulsion-solvent evaporation process // Small. – 2013. – V. 9. – N.
20. – P. 3514-3522.
38. Mélinon P., Begin-Colin S., Duvail J., Gauffre F., Boime N.H., Ledoux G., Plain J., Reiss P.,
Silly F., Warot-Fonrose B. Engineered inorganic core/shell nanoparticles // Physics Reports. – 2014. –
V. 543. – N. 3. – P. 163-197.
39. http://en.wikipedia.org/wiki/Nanoshell.
40. Zhang A.P., Sun Y.P. Photocatalytic killing effect of TiO2 nanoparticles on Ls-174-t human
colon carcinoma cells // World J Gastroenterol. – 2004. – V. 10. – N. 21. – P. 3191-3193.
41. Huang N., Min-Hua X., Yuan C., Rui-Rong Y. The study of the photokilling effect and
mechanism of ultrafine TiO2 particles on U937 cells // J Photochem Photobiol A Chem. – 1997. – V.
108. – N. 2–3. – P. 229-233.
99
42. Barhoumi A., Huschka R., Bardhan R., Knight M.W., Halas N.J. Light-induced release of
DNA from plasmon-resonant nanoparticles: Towards light-controlled gene therapy // Chem Phys Lett.
– 2009. – V. 482. – N. 4–6. – P. 171-179.
43. Stöber W., Fink A. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range
// J Colloid Interface Sci. – 1968. – V. 26. – N. 1. – P. 62–69.
44. Rajh T., Ostafin A.E., Micic O.I., Tiede D.M., Thurnauer M.C. Surface modification of small
particle TiO2 colloids with cysteine for enhanced photochemical reduction: an EPR study // J Phys
Chem. – 1996. – V. 100. – N. 11. – P. 4538–4545.
45. Thurnauer M.C., Rajh T., Tiede D.M. Surface modification of TiO2: correlation between
structure, charge separation and reduction properties // Acta Chemica Scandinavica. – 1997. – V. 51. –
P. 610-618.
46. Charbonneau C., Gauvin R., Demopoulos G.P. Aqueous solution synthesis of crystalline
anatase nanocolloids for the fabrication of DSC photoanodes // J Electrochem Soc. – 2011. – V. 158. –
N. 3. – P. H224-H231.
47. Yin D., Zhang L., Song K., Ou Y., Wang C., Liu B., Wu M. ZnO nanoparticles co-doped
with Fe3+ and Eu3+ ions for solar assisted photocatalysis // J Nanosci Nanotechnol. – 2014. – V. 14. –
N. 8. – P. 6077-6083.
48. Liu H., Ma L., Zhao J., Liu J., Yan J., Ruan J., Hong F. Biochemical toxicity of nano-anatase
TiO2 particles in mice // Biol Trace Elem Res. – 2009. – V. 129. – N. 1-3. – P. 170-180.
49. Barbé C.J., Arendse F., Comte P., Jirousek M., Lenzmann M., Shklover V., Grätzel M.
Nanocrystalline titanium oxide electrodes for photovoltaic applications // J Am Ceram Soc. – 1997. –
V. 80. – N. 12. – P. 3157–3171.
50. Spadavecchia J., Boujday S., Landoulsi J., Pradier C.M. nPEG-TiO₂ nanoparticles: a facile
route to elaborate nanostructured surfaces for biological applications // ACS Appl Mater Interfaces. –
2011. – V. 3. – N. 7. – P. 2637-2642.
51. Gao F., Botella P., Corma A., Blesa J., Dong L. Monodispersed mesoporous silica
nanoparticles with very large pores for enhanced adsorption and release of DNA // J Phys Chem B. –
2009. – V. 113. – N. 6. – P. 1796-1804.
52. Hartono S.B., Gu W., Kleitz F., Liu J., He L., Middelberg A.P., Yu C., Lu G.Q., Qiao S.Z.
Poly-L-lysine functionalized large pore cubic mesostructured silica nanoparticles as biocompatible
carriers for gene delivery // ACS Nano. – 2012. – V. 6. – N. 3. – P. 2104-2117.
53. Ma X., Nguyen K.T., Borah P., Ang C.Y., Zhao Y. Functional silica nanoparticles for redoxtriggered drug/ssDNA co-delivery // Adv Healthc Mater. – 2012. – V. 1. – N. 6. – P. 690-697.
100
54. Park I.Y., Kim I.Y., Yoo M.K., Choi Y.J., Cho M.H., Cho C.S. Mannosylated
polyethylenimine coupled mesoporous silica nanoparticles for receptor-mediated gene delivery // Int J
Pharm. – 2008. – V. 359. – N. 1-2. – P. 280-287.
55. Bhattarai S.R., Muthuswamy E., Wani A., Brichacek M., Castañeda A.L., Brock S.L.,
Oupicky D. Enhanced gene and siRNA delivery by polycation-modified mesoporous silica nanoparticles
loaded with chloroquine // Pharm Res. – 2010. – V. 27. – N. 12. – P. 2556-2568.
56. You Y., Kalebaila K.K., Brock S.L., Oupický D. Temperature-controlled uptake and release
in PNIPAM-modified porous silica nanoparticles // Chem Mater. – 2008. – V. 20. – N. 10. – P. 33543359.
57. Buchman Y.K., Lellouche E., Zigdon S., Bechor M., Michaeli S., Lellouche J.P. Silica
nanoparticles and polyethyleneimine (PEI)-mediated functionalization: a new method of PEI covalent
attachment for siRNA delivery applications // Bioconjug Chem. – 2013. – V. 24. – N. 12. – P. 20762087.
58. Malvindi M.A., Brunetti V., Vecchio G., Galeone A., Cingolani R., Pompa P.P. SiO2
nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing // Nanoscale. – 2012.
– V. 4. – N. 2. – P. 486-495.
59. Peng J., He X., Wang K., Tan W., Li H., Xing X., Wang Y. An antisense oligonucleotide
carrier based on amino silica nanoparticles for antisense inhibition of cancer cells // Nanomedicine. –
2006. – V. 2. – N. 2. – P. 113-120.
60. Zhu S.G., Xiang J.J., Li X.L., Shen S.R., Lu H.B., Zhou J., Xiong W., Zhang B.C., Nie X.M.,
Zhou M., Tang K., Li G.Y. Poly(L-lysine)-modified silica nanoparticles for the delivery of antisense
oligonucleotides // Biotechnol Appl Biochem. – 2004. – V. 39. – N. 2. – P. 179-187.
61. Kneuer C., Sameti M., Haltner E.G., Schiestel T., Schirra H., Schmidt H., Lehr C.M. Silica
nanoparticles modified with aminosilanes as carriers for plasmid DNA // Int J Pharm. – 2000. – V. 196.
– N. 2. – P. 257-261.
62. Young K.L., Scott A.W., Hao L., Mirkin S.E., Liu G., Mirkin C.A. Hollow spherical nucleic
acids for intracellular gene regulation based upon biocompatible silica shells // Nano Lett. – 2012. – V.
12. – N. 7. – P. 3867-3871.
63. Plank C., Zelphati O., Mykhaylyk O. Magnetically enhanced nucleic acid delivery. Ten years
of magnetofection-progress and prospects // Adv Drug Deliv Rev. – 2011. – V. 63. – N. 14-15. – P.
1300-1331.
64. McBain S.C., Yiu H.H., Dobson J. Magnetic nanoparticles for gene and drug delivery // Int
J Nanomedicine. – 2008. – V. 3. – N. 2. – P. 169-180.
65. Zhang L., He R., Gu H. Oleic acid coating on the monodisperse magnetite nanoparticles //
Appl Surf Sci. – 2006. – V. 253. – N. 5. – P. 2611–2617.
101
66. Liu J., Wang B., Hartono S.B., Liu T., Kantharidis P., Middelberg A.P., Lu G.Q., He L., Qiao
S.Z. Magnetic silica spheres with large nanopores for nucleic acid adsorption and cellular uptake //
Biomaterials. – 2012. – V. 33. – N. 3. – P. 970-978.
67. Chen Y., Chu C., Zhou Y., Ru Y., Chen H., Chen F., He Q., Zhang Y., Zhang L., Shi J.
Reversible pore-structure evolution in hollow silica nanocapsules: large pores for siRNA delivery and
nanoparticle collecting // Small. – 2011. – V. 7. – N. 20. – P. 2935-2944.
68. Wan Q., Xie L., Gao L., Wang Z., Nan X., Lei H., Long X., Chen Z.Y., He C.Y., Liu G., Liu
X., Qiu B. Self-assembled magnetic theranostic nanoparticles for highly sensitive MRI of minicircle
DNA delivery // Nanoscale. – 2013. – V. 5. – N. 2. – P. 744-752.
69. Sun S., Zeng H., Robinson D.B., Raoux S., Rice P.M., Wang S.X., Li G. Monodisperse
MFe2O4 (M = Fe, Co, Mn) nanoparticles // J Am Chem Soc. – 2004. – V. 126. – N. 1. – P. 273-279.
70. Chen J.T., Ahmed M., Liu Q., Narain R. Synthesis of cationic magnetic nanoparticles and
evaluation of their gene delivery efficacy in Hep G2 cells // J Biomed Mater Res A. – 2012. – V. 100. –
N. 9. – P. 2342-2347.
71. Kamau S.W., Hassa P.O., Steitz B., Petri-Fink A., Hofmann H., Hofmann-Amtenbrink M.,
von Rechenberg B., Hottiger M.O. Enhancement of the efficiency of non-viral gene delivery by
application of pulsed magnetic field, p. // Nucleic Acids Res. – 2006. – V. 34. – N. 5. – P. e40.
72. Veiseh O., Kievit F.M., Mok H., Ayesh J., Clark C., Fang C., Leung M., Arami H., Park J.O.,
Zhang M. Cell transcytosing poly-arginine coated magnetic nanovector for safe and effective siRNA
delivery // Biomaterials. – 2011. – V. 32. – N. 24. – P. 5717-5725.
73. Fang C., Bhattarai N., Sun C., Zhang M. Functionalized nanoparticles with long-term stability
in biological media // Small. – 2009. – V. 5. – N. 14. – P. 1637-1641.
74. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold
suspensions // Nature physical science. – 1973. – V. 241. – P. 20-22.
75. Grabar K.C., Freeman R.G., Hommer M.B., Natan M.J. Preparation and characterization of
Au colloid monolayers // Anal Chem. – 1995. – V. 67. – N. 4. – P. 735-743.
76. Storhoff J.J., Elghanian R., Mucic R.C., Mirkin C.A., Letsinger R.L. One-pot colorimetric
differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes // J Am
Chem Soc. – 1998. – V. 120. – N. 9. – P. 1959-1964.
77. Lee S.H., Bae K.H., Kim S.H., Lee K.R., Park T.G. Amine-functionalized gold nanoparticles
as non-cytotoxic and efficient intracellular siRNA delivery carriers // Int J Pharm. – 2008. – V. 364. –
N. 1. – P. 94-101.
78. Ghosh P., Han G., De M., Kim C.K., Rotello V.M. Gold nanoparticles in delivery applications
// Adv Drug Deliv Rev. – 2008. – V. 60. – N. 11. – P. 1307-1315.
102
79. Sandhu K.K., McIntosh C.M., Simard J.M., Smith S.W., Rotello V.M. Gold nanoparticlemediated transfection of mammalian cells // Bioconjug Chem. – 2002. – V. 13. – N. 1. – P. 3-6.
80. Thomas M., Klibanov A.M. Conjugation to gold nanoparticles enhances polyethylenimine's
transfer of plasmid DNA into mammalian cells // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2003. – V. 100. – N. 16.
– P. 9138-9143.
81. Chakrabarti R., Klibanov A.M. Nanocrystals modified with peptide nucleic acids (PNAs) for
selective self-assembly and DNA detection // J Am Chem Soc. – 2003. – V. 125. – N. 41. – P. 1253112540.
82. Rosi N.L., Giljohann D.A., Thaxton C.S., Lytton-Jean A.K., Han M.S., Mirkin C.A.
Oligonucleotide-modified gold nanoparticles for intracellular gene regulation // Science. – 2006. – V.
312. – N. 5776. – P. 1027-1030.
83. Li P., Li D., Zhang L., Li G., Wang E. Cationic lipid bilayer coated gold nanoparticlesmediated transfection of mammalian cells // Biomaterials. – 2008. – V. 29. – N. 26. – P. 3617-3624.
84. Hu C., Peng Q., Chen F., Zhong Z., Zhuo R. Low molecular weight polyethylenimine
conjugated gold nanoparticles as efficient gene vectors // Bioconjug Chem. – 2010. – V. 21. – N. 5. – P.
836-843.
85. Guo S., Huang Y., Jiang Q., Sun Y., Deng L., Liang Z., Du Q., Xing J., Zhao Y., Wang P.C.,
Dong A., Liang X.J. Enhanced gene delivery and siRNA silencing by gold nanoparticles coated with
charge-reversal polyelectrolyte // ACS Nano. – 2010. – V. 4. – N. 9. – P. 5505-5511.
86. Bishop C.J., Tzeng S.Y., Green J.J. Degradable polymer-coated gold nanoparticles for codelivery of DNA and siRNA // Acta Biomater. – 2015. – V. 11. – P. 393-403.
87. Ito T., Koyama Y., Otsuka M. Preparation of calcium phosphate nanocapsule including
deoxyribonucleic acid-polyethyleneimine-hyaluronic acid ternary complex for durable gene delivery //
J Pharm Sci. – 2014. – V. 103. – N. 1. – P. 179-184.
88. Tang J., Chen J.Y., Liu J., Luo M., Wang Y.J., Wei X.W., Gao X., Wang B.L., Liu Y.B., Yi
T., Tong A.P., Song X.R., Xie Y.M., Zhao Y., Xiang M., Huang Y., Zheng Y. Calcium phosphate
embedded PLGA nanoparticles: a promising gene delivery vector with high gene loading and
transfection efficiency // Int J Pharm. – 2012. – V. 431. – N. 1-2. – P. 210-221.
89. Yang Y.W., Yang J.C. Calcium phosphate as a gene carrier: electron microscopy //
Biomaterials. – 1997. – V. 18. – N. 3. – P. 213-217.
90. Pedraza C.E., Bassett D.C., McKee M.D., Nelea V., Gbureck U., Barralet J.E. The
importance of particle size and DNA condensation salt for calcium phosphate nanoparticle transfection
// Biomaterials. – 2008. V. 29. – N. 23. – P. 3384-3392.
103
91. Giger E.V., Puigmartí-Luis J., Schlatter R., Castagner B., Dittrich P.S., Leroux J.C. Gene
delivery with bisphosphonate-stabilized calcium phosphate nanoparticles // J Control Release. – 2011. –
V. 150. – N. 1. – P. 87-93.
92. Giger E.V., Castagner B., Räikkönen J., Mönkkönen J., Leroux J.C. siRNA transfection with
calcium phosphate nanoparticles stabilized with PEGylated chelators // Adv Healthc Mater. – 2013. –
V. 2. – N. 1. – P. 134-144.
93. Liu T., Tang A., Zhang G., Chen Y., Zhang J., Peng S., Cai Z. Calcium phosphate
nanoparticles as a novel nonviral vector for efficient transfection of DNA in cancer gene therapy //
Cancer Biother Radiopharm. – 2005. – V. 20. – N. 2. – P. 141-149.
94. Sokolova V.V., Radtke I., Heumann R., Epple M. Effective transfection of cells with multishell calcium phosphate-DNA nanoparticles // Biomaterials. – 2006. – V. 27. – N. 16. – P. 3147-3153.
95. Welzel T., Radtk I., Meyer-Zaika W., Heumann R., Epple M. Transfection of cells with
custom-made calcium phosphate nanoparticles coated with DNA // J Mater Chem. – 2004. – V. 14. – P.
2213-2217.
96. Kakizawa Y., Furukawa S., Kataoka K. Block copolymer-coated calcium phosphate
nanoparticles sensing intracellular environment for oligodeoxynucleotide and siRNA delivery // J
Control Release. – 2004. – V. 97. – N. 2. – P. 345-356.
97. Kakizawa Y., Furukawa S., Ishii A., Kataoka K. Organic-inorganic hybrid-nanocarrier of
siRNA constructing through the self-assembly of calcium phosphate and PEG-based block aniomer // J
Control Release. – 2006. – V. 111. – N. 3. – P. 368-370.
98. Pittella F., Zhang M., Lee Y., Kim H.J., Tockary T., Osada K., Ishii T., Miyata K., Nishiyama
N., Kataoka K. Enhanced endosomal escape of siRNA-incorporating hybrid nanoparticles from calcium
phosphate and PEG-block charge-conversional polymer for efficient gene knockdown with negligible
cytotoxicity // Biomaterials. – 2011. – V. 32. – N. 11. – P. 3106-3114.
99. Pittella F., Miyata K., Maeda Y., Suma T., Watanabe S., Chen Q., Christie R.J., Osada K.,
Nishiyama N., Kataoka K. Pancreatic cancer therapy by systemic administration of VEGF siRNA
contained in calcium phosphate/charge-conversional polymer hybrid nanoparticles // J Control Release.
– 2012. – V. 161. – N. 3. – P. 868-874.
100. Suma T., Miyata K., Anraku Y., Watanabe S., Christie R.J., Takemoto H., Shioyama M.,
Gouda N., Ishii T., Nishiyama N., Kataoka K. Smart multilayered assembly for biocompatible siRNA
delivery featuring dissolvable silica, endosome-disrupting polycation, and detachable PEG // ACS Nano.
– 2012. – V. 6. – N. 8. – P. 6693-6705.
101. Li X., Chen Y., Wang M., Ma Y., Xia W., Gu H. A mesoporous silica nanoparticle--PEI-fusogenic peptide system for siRNA delivery in cancer therapy // Biomaterials. –2013. – V. 34. – N. 4.
– P. 1391-1401.
104
102. Li X., Zhang J., Gu H. Adsorption and desorption behaviors of DNA with magnetic
mesoporous silica nanoparticles // Langmuir. – 2011. – V. 27. – N. 10. – P. 6099-6106.
103. Zhang L., Wang T., Li L., Wang C., Su Z., Li J. Multifunctional fluorescent-magnetic
polyethyleneimine functionalized Fe3O4-mesoporous silica yolk-shell nanocapsules for siRNA delivery
// Chem Commun (Camb). – 2012. – V. 48. – N. 69. – P. 8706-8708.
104. Shi M., Liu Y., Xu M., Yang H., Wu C., Miyoshi H. Core/shell Fe3O4 @SiO2 nanoparticles
modified with PAH as a vector for EGFP plasmid DNA delivery into HeLa cells // Macromol Biosci. –
2011. – V. 11. – N. 11. – P. 1563-1569.
105. Büchel G., Unger K.K., Matsumoto A., Tsutsumi K. A Novel Pathway for Synthesis of
Submicrometer-Size Solid Core/Mesoporous Shell Silica Spheres // Adv Mater. – 1998. – V. 10. – N.
13. – P. 1036-1038.
106. Bardi G., Malvindi M.A., Gherardini L., Costa M., Pompa P.P., Cingolani R., Pizzorusso
T. The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles
with primary neural cells and their gene carrying carrying performance // Biomaterials. – 2010. – V. 31.
– N. 25. – P. 6555-6566.
107. Oldenburg S.J., Westcott S.L., Averitt R.D., Halas N.J. Surface enhanced Raman scattering
in the near infrared using metal nanoshell substrates // J Chem Phys. – 1999. V. 111. – N. 10. – P. 47294735.
108. Paunesku T., Rajh T., Wiederrecht G., Maser J., Vogt S., Stojićević N., Protić M., Lai B.,
Oryhon J., Thurnauer M., Woloschak G. Biology of TiO2-oligonucleotide nanocomposites // Nat Mater.
– 2003. – V. 2. – N. 5. – P. 343-346.
109. Rajh T., Chen L.X., Lukas K., Liu T., Thurnauer M.C., Tiede D.M. Surface restructuring of
nanoparticles: an efficient route for ligand-metal oxide crosstalk // J. Phys. Chem. B. – 2002. – V. 106.
– N. 41. – P. 10543-10552.
110. Rajh Y., Saponjic Z., Liu J., Dimitrijevic N.M., Scherer N.F., Vega - Arroyo M.V., Zapol
P., Curtiss L.A., Thurnauer M.C. Charge transfer across the nanocrystalline-DNA interface: probing
DNA recognition // Nano Letters. – 2004. – V. 4. – N. 6. – P. 1017-1023.
111. Thurn K., Brown E., Wu A., Vogt S., Lai B., Maser J., Paunesku T., Woloschak G.E.
Nanoparticles for applications in cellular imaging // Nanoscale Res Lett. – 2007. – V. 2. – N. 9. – P. 430441.
112. Paunesku T., Vogt S., Lai B., Maser J., Stojićević N., Thurn K.T., Osipo C., Liu H., Legnini
D., Wang Z., Lee C., Woloschak G.E. Intracellular distribution of TiO2-DNA oligonucleotide
nanoconjugates directed to nucleolus and mitochondria indicates sequence specificity // Nano Lett. –
2007. – V. 7. – N. 3. – P. 596-601.
105
113. Thurn K.T., Paunesku T., Wu A., Brown E.M., Lai B., Vogt S., Maser J., Aslam M., Dravid
V., Bergan R., Woloschak G.E. Labeling TiO2 nanoparticles with dyes for optical fluorescence
microscopy and determination of TiO2-DNA nanoconjugate stability // Small. – 2009. – V. 5. – N. 11.
– P. 1318-1325.
114. Зарытова В.Ф., Зиновьев В.В., Исмагилов З.Р., Левина А.С., Репкова М.Н., Шикина
Н.В., Евдокимов А.А., Беланов Е.Ф., Балахнин С.М., Серова О.А., Байбородин С.И., Малыгин
Э.Г., Загребельный С.Н. Исследование проникновения наночастиц диоксида титана и их
коньюгатов с олигонуклеотидами в эукариотические клетки // Росс нанотехнологии. – 2009. – Т.
4. – С. 160-163.
115. Levina A., Ismagilov Z., Repkova M., Shatskaya N., Shikina N., Tusikov F., Zarytova V.
Nanocomposites consisting of titanium dioxide nanoparticles and oligonucleotides // J Nanosci
Nanotechnol. – 2012. – V. 12. – N. 3. – P. 1812-1820.
116. Fang I.J., Trewyn B.G. Application of mesoporous silica nanoparticles in intracellular
delivery of molecules and proteins // Methods Enzymol. – 2012. – V. 508. – P. 41-59.
117. Liu J., Stace-Naughton A., Brinker C.J. Silica nanoparticle supported lipid bilayers for gene
delivery // Chem Commun (Camb). – 2009. – N. 34. – P. 5100-5102.
118. Elbakry A., Zaky A., Liebl R., Rachel R., Goepferich A., Breunig M. Layer-by-layer
assembled gold nanoparticles for siRNA delivery // Nano Lett. – 2009. – V. 9. – N. 5. – P. 2059-2064.
119. Kim S.T., Chompoosor A., Yeh Y.C., Agasti S.S., Solfiell D.J., Rotello V.M. Dendronized
gold nanoparticles for siRNA delivery // Small. – 2012. – V. 8. – N. 21. – P. 3253-3256.
120. Sun Y., Li X., Liang X., Wan Z., Duan Y. Calcium phosphate/octadecyl-quatemized
carboxymethyl chitosan nanoparticles: an efficient and promising carrier for gene transfection // J
Nanosci Nanotechnol. – 2013. – V. 13. – N. 8. – P. 5260-5266.
121. Kurepa J., Paunesku T., Vogt S., Arora H., Rabatic B.M., Lu J., Wanzer M.B., Woloschak
G.E., Smalle J.A. Uptake and distribution of ultrasmall anatase TiO2 Alizarin red S nanoconjugates in
Arabidopsis Thaliana // Nano Lett. – 2010. – V. 10. – N. 7. – P. 2296-2302.
122. Jain K.K. Drug delivery systems. Totowa: Human Press, 2008.
123. Cormode D.P., Naha P.C., Fayad Z.A. Nanoparticle contrast agents for computed
tomography: a focus on micelles // Contrast Media Mol Imaging. – 2014. – V. 9. – N. 1. – P. 37-52.
124. Wang K., He X., Yang X., Shi H. Functionalized silica nanoparticles: a platform for
fluorescence imaging at the cell and small animal levels // Acc Chem Res. – 2013. – V. 46. – N. 7. – P.
1367-1376.
125. Heuer-Jungemann A., Harimech P.K., Brown T., Kanaras A.G. Gold nanoparticles and
fluorescently-labelled DNA as a platform for biological sensing // Nanoscale. – 2013. – V. 5. – N. 20. –
P. 9503-9510.
106
126. Prijic S., Sersa G. Magnetic nanoparticles as targeted delivery systems in oncology // Radiol
Oncol. – 2011. – V. 45. – N. 1. – P. 1-16.
127. Endres P.J., Paunesku T., Vogt S., Meade T.J., Woloschak G.E. DNA-TiO2 nanoconjugates
labeled with magnetic resonance contrast agents // J Am Chem Soc. – 2007. – V. 129. – N. 51. – P.
15760-15761.
128. Chandran P., Sasidharan A., Ashokan A., Menon D., Nair S., Koyakutty M. Highly
biocompatible TiO₂:Gd³⁺ nano-contrast agent with enhanced longitudinal relaxivity for targeted cancer
imaging // Nanoscale. – 2011. – V. 3. – N. 10. – P. 4150-4161.
129. Zhang J., Cai X., Zhang Y., Li X., Li W., Tian Y., Li A., Yu X., Fan C., Huang Q. Imaging
cellular uptake and intracellular distribution of TiO2 nanoparticles // Anal Methods. – 2013. – V. – N.
23. – P. 6611-6616.
130. Левина А.С., Исмагилов З.Р., Репкова М.Н., Шикина Н.В., Байбородин С.И., Шацкая
Н.В., Загребельный С.Н., Зарытова В.Ф. Создание TiO2~DNA-нанокомпозитов, способных
проникать в клетки // Биоорг химия. – 2013. – Т. 39. – № 1. – С. 87-98.
131. Levina A.S., Repkova M.N., Ismagilov Z.R., Shikina N.V., Malygin E.G., Mazurkova N.A.,
Zinov'ev V.V., Evdokimov A.A., Baiborodin S.I., Zarytova V.F. High-performance method for specific
effect on nucleic acids in cells using TiO2~DNA, p. nanocomposites // Sci Rep. – 2012. – V. 2:756.
132. Левина А.С., Репкова М.Н., Исмагилов З.Р., Шикина Н.В., Мазуркова Н.А., Зарытова
В.Ф.
Эффективное
ингибирование
вируса
гриппа
А
человека
олигонуклеотидами,
электростатически фиксированными на полилизинсодержащих TiO2-наночастицах // Биоорг
химия. – 2014. – Т. 40. – № 2. – С. 196-202.
133. Brown E.M., Paunesku T., Wu A., Thurn K.T., Haley B., Clark J., Priester T., Woloschak
G.E. Methods for assessing DNA hybridization of peptide nucleic acid-titanium dioxide nanoconjugates
// Anal Biochem. – 2008. – V. 383. – N. 2. – P. 226-235.
134. Cutler J.I., Zheng D., Xu X., Giljohann D.A., Mirkin C.A. Polyvalent oligonucleotide iron
oxide nanoparticle "click" conjugates // Nano Lett. – 2010. – V. 10. – N. 4. – P. 1477-1480.
135. Yin Z.F., Wu L., Yang H.G., Su Y.H. Recent progress in biomedical applications of titanium
dioxide // Phys Chem Chem Phys. – 2013. – V. 15. – N. 14. – P. 4844-4858.
136. Seferos D.S., Giljohann D.A., Hill H.D., Prigodich A.E., Mirkin C.A. Nano-flares: probes
for transfection and mRNA detection in living cells // J Am Chem Soc. – 2007. – V. 129. – N. 50. – P.
15477-15479.
137. Ding Y., Jiang Z., Saha K., Kim C.S., Kim S.T., Landis R.F., Rotello V.M. Gold
nanoparticles for nucleic acid delivery // Mol Ther. – 2014. – V. 22. – N 6. – P. 1075-1083..
138. Majzoub R.N., Chan C.L., Ewert K.K., Silva B.F., Liang K.S., Safinya C.R. Fluorescence
microscopy colocalization of lipid-nucleic acid nanoparticles with wildtype and mutant Rab5-GFP: A
107
platform for investigating early endosomal events // Biochim Biophys Acta. – 2015. – V. 1848. – N 6. –
P. 1308-1318..
139. Thurn K.T., Arora H., Paunesku T., Wu A., Brown E.M., Doty C., Kremer J., Woloschak
G. Endocytosis of titanium dioxide nanoparticles in prostate cancer PC-3M cells // Nanomedicine. –
2011. – V. 7. – N. 2. – P. 123-130.
140. Kovtun A., Heumann R., Epple M. Calcium phosphate nanoparticles for the transfection of
cells // Biomed Mater Eng. – 2009. – V. 19. – N. 2-3. – P. 241-247.
141. Levina A.S., Repkova M.N., Mazurkova N.A., Makarevich E.V., Ismagilov Z.R., Zarytova
V.F. Knockdown of different influenza A virus subtypes in cell culture by a single antisense
oligodeoxyribonucleotide // Int J Antimicrob Agents. – 2015. – V. 46. – N. 1. – P. 125-128.
142. Cai R., Hashimoto K., Itoh K., Kubota Y., Fujishima A. Photokilling of malignant cells with
ultrafine TiO2 powder // Bull Chem Soc Jpn. – 1991. – V. 64. – N. 4. – P. 1268-1273.
143. Lee S.H., Castagner B., Leroux J.C. Is there a future for cell-penetrating peptides in
oligonucleotide delivery? // Eur J Pharm Biopharm. – 2013. – V. 85. – N. 1. – P. 5-11.
144. Marlin F., Simon P., Bonneau S., Alberti P., Cordier C., Boix C., Perrouault L., Fossey A.,
Saison-Behmoaras T., Fontecave M., Giovannangeli C. Flavin conjugates for delivery of peptide nucleic
acids // Chembiochem. – 2012. – V. 13. – N. 17. – P. 2593-2598.
145. Said Hassane F., Saleh A.F., Abes R., Gait M.J., Lebleu B. Cell penetrating peptides:
overview and applications to the delivery of oligonucleotides // Cell Mol Life Sci. – 2010. – V. 67. – N.
5. – P. 715-726.
146. Shiraishi T., Nielsen P.E. Photochemically enhanced cellular delivery of cell penetrating
peptide-PNA conjugates // FEBS Lett. – 2006. – V. 580. – N. 5. – P. 1451-1456.
147. Fasman G.D. Richards E. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology: Nucleic
Acids. Cleavland: CRC Press, 1975.
148. Amirkhanov N.V., Zhang K., Aruva M.R., Thakur M.L., Wickstrom E. Imaging human
pancreatic cancer xenografts by targeting mutant KRAS2 mRNA with [(111)In]DOTA(n)poly(diamidopropanoyl)(m)-KRAS2 PNA-D(Cys-Ser-Lys-Cys) nanoparticles // Bioconjug Chem. –
2010. – V. 21. – N. 4. – P. 731-740.
149. Chan W.C., White P.D. Fmoc solid phase peptide synthesis. A practical approach. NewYork: Oxford University Press Inc., 2000.
150. Perbal B. A Practical Guide to Molecular Cloning. New York: Academic Press Inc., 1984.
151. Tadjiki S., Assemi S., Deering C.E., Veranth J.M., Miller J.D. Detection, separation, and
quantification of unlabeled silica nanoparticles in biological media using sedimentation field-flow
fractionation // J Nanopart Res. – 2009. – V. 11. – N. 4. – P. 981-988.
108
152. Kaszuba M., McKnight D., Connah M.T., McNeil-Watson F.K., Nobbmann U. Measuring
sub nanometre sizes using dynamic light scattering // J Nanopart Res. – 2008. – V. 10. – N. 5. – P. 823829.
153. Nielsen P.E. Gene targeting and expression modulation by peptide nucleic acids (PNA) //
Curr Pharm Des. – 2010. – V. 16. – N. 28. – P. 3118-3123.
154. Amirkhanov N.V., Dimitrov I., Opitz A.W., Zhang K., Lackey J.P., Cardi C.A., Lai S.,
Wagner N.J., Thakur M.L., Wickstrom E. Design of (Gd-DO3A)n-polydiamidopropanoyl-peptide
nucleic acid-D(Cys-Ser-Lys-Cys) magnetic resonance contrast agents // Biopolymers. – 2008. – V. 89.
– N. 12. – P. 1061-1076.
155. Egholm M., Buchardt O., Christensen L., Behrens C., Freier S.M., Driver D.A., Berg R.H.,
Kim S.K., Norden B., Nielsen P.E. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the
Watson-Crick hydrogen-bonding rules // Nature. – 1993. – V. 365. – N. 6446. – P. 566-568.
156. Giesen U., Kleider W., Berding C., Geiger A., Orum H., Nielsen P.E. A formula for thermal
stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes // Nucleic Acids Res. – 1998. – V. 26. – N. 21. – P.
5004-5006.
157. Kotsokechagia T., Cellesi F., Thomas A., Niederberger M., Tirelli N. Preparation of ligandfree TiO2 (anatase) nanoparticles through a nonaqueous process and their surface functionalization //
Langmuir. – 2008. – V. 24. – N. 13. – P. 6988-6997.
158. Roddick-Lanzilotta A.D., McQuillan A.J. An in situ infrared spectroscopic investigation of
lysine peptide and polylysine adsorption to TiO2 from aqueous solutions // J Colloid Interface Sci. –
1999. – V. 217. – N. 1. – P. 194-202.
159. Matsuo K., Tsuboi M. Interaction of poly-L-lysine with nucleic acids. V. Effect of salt
concentration // Biopolymers. – 1969. – V. 8. – N. 1. – P. 153–155.
160. Shapiro J.T., Leng M., Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acid-polylysine complexes.
Structure and nucleotide specificity // Biochemistry. –1969. – V. 8. – N. 8. – P. 3219-3232.
161. Liu G., Molas M., Grossmann G.A., Pasumarthy M., Perales J.C., Cooper M.J., Hanson
R.W. Biological properties of poly-L-lysine-DNA complexes generated by cooperative binding of the
polycation // J Biol Chem. – 2001. – V. 276. – N. 37. – P. 34379-34387.
162. Franano F.N., Edwards W.B., Welch M.J., Brechbiel M.W., Gansow O.A., Duncan J.R.
Biodistribution and metabolism of targeted and nontargeted protein-chelate-gadolinium complexes:
evidence for gadolinium dissociation in vitro and in vivo // Magn Reson Imaging. – 1995. – V. 13. – N.
2. – P. 201-214.
163. Kobayashi H., Sato N., Kawamoto S., Saga T., Hiraga A., Haque T.L., Ishimori T., Konishi
J., Togashi K., Brechbiel M.W. Comparison of the macromolecular MR contrast agents with
109
ethylenediamine-core versus ammonia-core generation-6 polyamidoamine dendrimer // Bioconjug
Chem. – 2001. – V. 12. – N. 1. – P. 100-107.
164. Godbey W.T., Wu K.K., Mikos A.G. Tracking the intracellular path of
poly(ethylenimine)/DNA complexes for gene delivery // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1999. – V. 96. –
N. 9. – P. 5177-5181.
165. Wong H.L., Bendayan R., Rauth A.M., Xue H.Y., Babakhanian K., Wu X.Y. A mechanistic
study of enhanced doxorubicin uptake and retention in multidrug resistant breast cancer cells using a
polymer-lipid hybrid nanoparticle system // J Pharmacol Exp Ther. – 2006. – V. 317. – N. 3. – P. 13721381.
166. Suzuki H., Toyooka T., Ibuki Y. Simple and easy method to evaluate uptake potential of
nanoparticles in mammalian cells using a flow cytometric light scatter analysis // Environ Sci Technol.
– 2007. – V. 41. – N. 8. – P. 3018-3024.
167. Giannecchini S., Wise H.M., Digard P., Clausi V., Del Poggetto E., Vesco L., Puzelli S.,
Donatelli I., Azzi A. Packaging signals in the 5'-ends of influenza virus PA, PB1, and PB2 genes as
potential targets to develop nucleic-acid based antiviral molecules // Antiviral Res. – 2011. – V. 92. –
N. 1. – P. 64-72.
168. Stein D.A. Inhibition of RNA virus infections with peptide-conjugated morpholino
oligomers // Curr Pharm Des. – 2008. – V. 14. – N. 25. – P. 2619-2634.
169. Ильичева Т.Н., Нетесов С.В., Гуреев В.Н. Практикум по микробиологии. Вирусы
гриппа. Методическое пособие. Часть I. Новосибирск: Новосибирский государственный
университет, 2012.
170. Ge Q., Pastey M., Kobasa D., Puthavathana P., Lupfer C., Bestwick R.K., Iversen P.L.,
Chen J., Stein D.A. Inhibition of multiple subtypes of influenza A virus in cell cultures with morpholino
oligomers // Antimicrob Agents Chemother. – 2006. – V. 50. – N. 11. – P. 3724-3733.
171. Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., Straus S.B.
Fundamental Virology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001.
172. Bendifallah N., Rasmussen F.W., Zachar V., Ebbesen P., Nielsen P.E., Koppelhus U.
Evaluation of cell-penetrating peptides (CPPs) as vehicles for intracellular delivery of antisense peptide
nucleic acid (PNA) // Bioconjug Chem. – 2006. – V. 17. – N. 3. – P. 750-758.
110