У Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXVIII. 2014. №... Д. В. Тюпа
advertisement
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXVIII. 2014. № 5 УДК 579.66 Д. В. Тюпа*, Л. С. Алексеева, С. В. Калёнов, А. Е. Кузнецов Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1 * e-mail: d.tiupa@inbox.ru ПОИСК НАИБОЛЕЕ АКТИВНЫХ МИКРОБНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА С целью выявления биообъектов, способных к максимально быстрому и эффективному синтезу наночастиц серебра, изучено девять культур микроорганизмов, принадлежащих к различным филогенетическим группам (бактерии, микромицеты, дрожжи и микроводоросли). Подобраны оптимальные условия биосинтеза, позволяющие увеличить выход наносеребра. Установлено, что наиболее активными продуцентами наночастиц являются грибы Penicillium glabrum и бактерии Halobacterium salinarum, в течение суток формирующие наносеребро с высоким выходом. Ключевые слова: наночастицы серебра; биосинтез наночастиц; микробиологическое производство наночастиц. метаболизма, биополимеров и вирусных частиц. Однако большинство исследований сводится к демонстрации возможности синтеза НЧ, при этом не определяется степень конверсии сырья в частицы, чистота продукта, динамика образования НЧ и возможность контроля их свойств; большинство методов не находит практического применения [1, 2]. В данной работе изучен процесс биосинтеза НЧ серебра представителями различных филогенетических групп микроорганизмов (бактерий, дрожжей, микромицетов и микроводорослей) с целью выявления наиболее эффективных продуцентов НЧ, способных к быстрому формированию стабильных частиц с высоким выходом. Исследовано 9 культур микроорганизмов, восстанавливающих ионы серебра с образованием металлических частиц: – грамположительные бактерии (Bacillus subtilis, представляющие собой отход производства рибофлавина; азотфиксирующие бактерии Arthrobacter mysorens, полученные из активного ила водоочистных сооружений); – грамотрицательные бактерии (азотфиксаторы активного ила Agrobacterium tumifaciens; галофильные бактерии Halobacterium salinarum КСК-03307 (каталог ВКПМ), используемые в производстве бактериородопсина и каротиноидов); – мицелиальные грибы (Penicillium glabrum, Fusarium nivale и Fusarium oxysporum, выделенные из аэробного активного ила); – дрожжи (Saccharomyces сerevisiae SL-100 – отход спиртового производства); – микроводоросли (Dunaliella salina). Выбор объектов исследования обусловлен способностью выживания в условиях высоких концентраций серебра (защитные полисахаридные капсулы, прочные гранулы биомассы) и Существует множество методов синтеза наночастиц (НЧ), которые подразделяются на физико-химические и зеленые (биологические) методы. Химический синтез НЧ широко распространен, однако биосинтез более перспективен по ряду причин. Зеленый синтез НЧ идет в присутствии кислорода, тогда как для химического синтеза часто необходимы анаэробные условия: реакции проводят под вакуумом либо в атмосфере инертного газа, что удорожает производство НЧ. Полученные биологическими методами частицы стабильны в течение нескольких месяцев, а созданные химическим путем НЧ склонны к агрегации. При биосинтезе НЧ используются природные реагенты, что делает производство безопасным для окружающей среды и человека [1]. Особо важна разработка экологически чистых методов синтеза НЧ серебра, широко применяемых в катализе, электронике и приборостроении. НЧ серебра обладают антимикробной активностью в отношении кишечной палочки, синегнойной палочки, золотистого стафилококка и ряда бактерий, устойчивых к действию антибиотиков, а также противогрибковой активностью в отношении Aspergillus, Mucor, Saccharomyces и Candida. Серебряные НЧ вызывают гибель вирусов герпеса, гепатита В и ВИЧ. Бактерицидное действие наносеребра применяется в производстве столовых приборов, медицинского оборудования, тканей, одежды, косметики, моющих и дезинфицирующих средств, фильтров воды и воздуха, а также мебели и бытовой техники. Уровень производства НЧ серебра составляет более 500 тонн в год и продолжает расти [2]. Разработано много методов зеленого синтеза серебряных НЧ с использованием растительных, грибных или бактериальных клеток, продуктов их 74 Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXVIII. 2014. № 5 доступностью (биомасса является отходом биотехнологического производства, требующим утилизации). По завершении культивирования биомассу микроорганизмов отделяли от питательной среды центрифугированием в течение 10 минут при 7000 об/мин и переносили в растворы нитрата серебра, содержащие от 10 до 1000 мг/л Ag+. Параллельно проводились эксперименты, в которых растворы соли серебра вносили непосредственно в культуральную жидкость с биомассой. В первом случае исключали воздействие компонентов питательной среды на процесс восстановления ионов серебра, а во втором – сохраняли условия, оптимальные для жизнедеятельности микроорганизмов. Смеси клеток и ионов серебра инкубировали на вращательной качалке при 150 об/мин и 27°С, срок инкубации составлял от 1 до 72 ч. Образование серебряных частиц фиксировали визуально (по окрашиванию растворов и биомассы в желтый и бурый цвета, характерные для НЧ серебра, и по выпадению осадка крупных серебряных частиц). Биомассу и крупные кристаллы серебра удаляли путем центрифугирования при 7000 об/мин в течение 10 минут. По окраске супернатанта делали вывод о наличии либо отсутствии в нем наносеребра и проводили спектроскопический анализ растворов. По высоте пиков поглощения при длинах волн 400-430 нм судили о концентрации серебряных НЧ и степени превращения ионов металла в целевой продукт. Предварительно строили калибровочную кривую для определения концентрации НЧ серебра с использованием стандартизованных растворов НЧ. Биомассу микроорганизмов, изменившую цвет в процессе инкубирования с ионами серебра, а также окрашенные варианты супернатанта анализировали с помощью световой микроскопии. По результатам наблюдений делали выводы о размере, форме и локализации в клетках микрочастиц серебра (от 0.3 до 15 мкм). Анализ морфологии, линейных размеров, и расположения на клетках частиц размером менее 200 нм трансмиссионной проводили методом электронной микроскопии (ТЭМ). При этом использовали быструю и эффективную методику исследования биогенных металлических НЧ [3]. Все культуры восстанавливают серебро из ионной формы с образованием НЧ, но наряду с наносеребром формируются микрочастицы диаметром от 1 до нескольких мкм и более крупные быстро оседающие частицы. Для большинства культур доля НЧ серебра мала (менее 10% от всего серебра). На рис. 1 и 2 приведены, соответственно, электронные микрофотографии НЧ серебра и спектры поглощения растворов этих НЧ. Высота пиков поглощения сильно меняется от культуры к культуре, поскольку процент НЧ от общего количества восстановленного серебра различен для разных микроорганизмов. При одинаковой исходной концентрации ионов серебра (100 мг/л) Dunaliella salina образует вдвое меньше НЧ, чем Fusarium nivale, и втрое меньше, чем Penicillium glabrum (рис. 2). Средние размеры частиц серебра сильно отличаются даже для культур, принадлежащих к одному роду, как в случае грибов Fusarium (рис. 1А и 1В). В таблице 1 представлены данные о типе частиц серебра, образуемых клетками, а также процент выхода наносеребра. Рис. 1. Электронные микрофотографии НЧ серебра, синтезированных культурами Fusarium nivale (А), Fusarium oxysporum (В) и Penicillium glabrum (С) 75 Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXVIII. 2014. № 5 Рис. 2. Спектры поглощения растворов биогенных НЧ серебра (исходная концентрация Ag + 100 мг/л). 1 – Halobacterium salinarum КСК-03307; 2 – Penicillium glabrum; 3 – Fusarium nivale; 4 – Dunaliella salina Таблица 1 Типы частиц серебра, образуемых микроорганизмами (исходная концентрация Ag+ 100 мг/л), и доля НЧ от общего количества серебра Таксон Бактерии Археи Грибы Дрожжи Водоросли Микроорганизм Bacillus subtilis Agrobacterium tumifaciens Arthrobacter mysorens Halobacterium salinarum Fusarium oxysporum Fusarium nivale Penicillium glabrum Saccharomyces сerevisiae Dunaliella salina Преобладающий тип частиц Agº Микрочастицы Микрочастицы Крупные частицы Наночастицы Микрочастицы Микрочастицы Наночастицы Крупные частицы Микрочастицы Серебро переходит из наноразмерного состояния в микро- и макрочастицы, поскольку не все микроорганизмы способны к выработке достаточного количества стабилизирующих частицы белков. НЧ, образовавшиеся на первой стадии восстановления ионов серебра, продолжают неограниченно расти, формируя агрегаты. Для многих микроорганизмов образование НЧ не является основным способом защиты от воздействия ионов токсичных металлов. Они образуют капсулы из внеклеточных полисахаридов, осуществляют биотрансформацию металлов с образованием их нерастворимых соединений, осаждение крупных частиц металла на клеточной стенке либо в специальных вакуолях. Поэтому способность микроорганизмов к восстановлению ионов металла далеко не всегда свидетельствует об их способности к формированию именно НЧ. Из всех изученных культур наиболее активно формируют НЧ серебра грибы Penicillium glabrum Выход НЧ, % 3 9 3 31 5 15 23 3 7 и бактерии Halobacterium salinarum. При подобранных в ходе исследования оптимальных условиях биосинтеза (концентрация Ag+ 100 мг/л, время контакта клеток с ионами серебра 24 ч, проведение реакции в культуральной жидкости для Penicillium glabrum и в дистилляте – для Halobacterium salinarum) культуры образуют наносеребро с выходом 23 и 31% соответственно. Причем вторая культура пригодна только для ведения непродолжительного периодического процесса получения НЧ, поскольку активно формирует наносеребро лишь при переносе биомассы из богатой солями культуральной жидкости в дистиллят, что вызывает гибель клеток в результате осмотического шока. Напротив, культура Penicillium glabrum сохраняет жизнеспособность в среде с высоким содержанием серебра и является перспективной для организации непрерывного производства серебряных НЧ живыми клетками. 76 Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXVIII. 2014. № 5 Тюпа Дмитрий Валериевич аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Алексеева Людмила Сергеевна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Калёнов Сергей Владимирович к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Кузнецов Александр Евгеньевич к.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Литература 1. Gericke M., Pinches A. Biological synthesis of metal nanoparticles // Hydrometallurgy. 2006. Vol. 83. P. 132-140. 2. Tolaymat T.M., Badawy A.M., Suidan M. An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticles in syntheses and applications: a systematic review and critical appraisal of peer-reviewed scientific papers // Sci. Total Environ. 2010. Vol. 408. P. 999-1006. 3. Складнев Д.А., Сорокин В.В., Гальченко В.Ф. Микротехника для исследования биогенных наноразмерных частиц металлов // Нанотехника. – 2013. – №2. – С. 12-18. Tyupa Dmitry Valerievich*, Alexeeva Lyudmila Sergeevna, Kalenov Sergei Vladimirovich, Alexander Yevgenievich Kuznetsov D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: d.tiupa@inbox.ru SEARCH OF THE MOST ACTIVE MICROBIAL PRODUCENTS OF SILVER NANOPARTICLES Abstract In order to find biological objects capable of the most rapid and efficient synthesis of silver nanoparticles nine cultures of microorganisms belonging to different phylogenetic groups (bacteria, fungi are, yeast and microalgae) was studied. Optimal conditions of biosynthesis allowing to increase the output of nanosilver was selected. It was found that the most active producents of nanoparticles are fungi Penicillium glabrum and bacteria Halobacterium salinarum which form nanosilver with the high yield during the day. Key words: silver nanoparticles; biosynthesis of nanoparticles; microbiological production of nanoparticles. 77
