012578 - 1 - Настоящее изобретение относится к транспортному

012578
Настоящее изобретение относится к транспортному белку, который связывается с нейронами с
большим или меньшим сродством, чем нейротоксин, продуцируемый Clostridium botulinum. Транспортный белок предпочтительно захватывается посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Этот
белок находит применение в качестве транспортера, который транслоцирует из кислого эндосомального
компартмента в цитозоль нейронов другие химические вещества (например, протеазы), которые физиологически не могут проникнуть через плазматическую мембрану в цитозоль нервных клеток. Настоящее
изобретение относится, в частности, к применению транспортного белка для введения ингибиторов высвобождения медиаторов.
Нервные клетки высвобождают вещества-медиаторы посредством экзоцитоза. Под экзоцитозом понимают слияние мембраны внутриклеточной везикулы с плазматической мембраной. Одновременно при
этом процессе в синаптическую щель выбрасывается содержимое везикулы. Слияние двух мембран регулируется ионом кальция, который реагирует с белком синаптотагмином. Совместно с другими кофакторами синаптотагмин контролирует состояние трех так называемых белков слияния - SNAP-25, синаптобревина-2 и синтаксина-1А. В то время как синтаксин-1А и синаптобревин-2 встроены в плазматическую мембрану и(или) мембрану везикул, SNAP-25 лишь слабо связан с плазматической мембраной. При
повышении внутриклеточной концентрации кальция эти три белка связываются друг с другом, при этом
обе мембраны сближаются и, в конечном счете, сливаются. В случае холинергических нейронов высвобождается ацетилхолин, который вызывает сокращения мышц, выделение пота и другие холинергически-опосредованные реакции.
Вышеуказанные белки слияния являются целевыми молекулами (субстратами) для легких цепей
(LC) клостридиальных нейротоксинов бактерий С. botulinum, С. butyricum, С. baratii и С. tetani.
Анаэробная грамположительная бактерия С. botulinum продуцирует семь различных серотипов клостридиальных нейротоксинов. Их называют ботулиновыми нейротоксинами (от BoNT/A до BoNT/G). Из
них, в частности, BoNT/A и BoNT/B вызывают у людей и животных нейропаралитическое заболевание,
которое называется ботулизмом. Споры С. botulinum обнаруживаются в земле, но они могут также развиваться в неправильно простерилизованных и закупоренных консервированных продуктах питания домашнего приготовления, которыми объясняют многие случаи ботулизма.
BoNT/A - это самое активное из всех известных биологических веществ. Всего 5-6 пг очищенного
BoNT/A составляют МЛД (медианную летальную дозу). МЛД называют единицу (англ.: Unit, U)
BoNT/A, которая после внутрибрюшинного введения убивает половину самок мышей линии Swiss Webster весом 18-20 г. Было охарактеризовано семь иммунологически различных BoNT. Они обозначены как
BoNT/A, В, С1, D, E, F и G, и их можно различить по нейтрализации серотип-специфическими антителами. Различные серотипы BoNT отличаются по тяжести и длительности вызываемого ими паралича у поражаемых видов животных. Так, например, у крысы BoNT/A действует в 500 раз сильнее в отношении
паралича, чем BoNT/B. К этому надо добавить, что доказано, что BoNT/B у приматов в дозировке, равной 480 Ед/кг веса тела, является нетоксичным. Такое же количество BoNT/A соответствует 12 летальным дозам этого вещества для приматов. Кроме того, у мышей длительность паралича после инъекции
BoNT/A в 10 раз больше, чем после инъекции BoNT/E.
BoNT используются в клинике для лечения нервно-мышечных нарушений, которые характеризуются гиперактивностью скелетных мышц, обусловленной патологически гиперактивными периферическими нервами. Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) США разрешило использовать BoNT/A для лечения блефароспазма, страбизма, гипергидроза, морщин и гемифациальных спазмов.
По сравнению с BoNT/A остальные серотипы BoNT обладают заметно меньшей эффективностью и меньшей длительностью эффекта. Клинические эффекты периферического внутримышечного введения
BoNT/A обычно возникают в течение недели. Длительность подавления симптомов после единственной
внутримышечной инъекции BoNT/A, как правило, составляет примерно от 3 до 6 месяцев.
Клостридиальные нейротоксины специфически гидролизуют различные белки аппарата слияния.
BoNT/A, C1 и Е расщепляют SNAP-25, тогда как BoNT/B, D, F, G и столбнячный тейротоксин (TeNT)
разрушают мембранный белок-2, ассоциированный с везикулами (VAMP-2), который также называют
синаптобревином-2. Кроме того, BoNT/C1 расщепляет синтаксин-1А.
Клостридиальные бактерии выделяют нейротоксины в виде одноцепочечных полипептидов, состоящих из 1251-1315 аминокислот. Затем эндогенные протеазы расщепляют эти протеины в определенном месте на 2 цепи («никинг»), хотя после этого обе цепи еще остаются связанными дисульфидным
мостиком. Эти двухцепочечные протеины называют голотоксинами (см. Shone et al. (1985), Eur. J. Biochem. 151, 75-82). Эти две цепи имеют различные функции. Если меньшая часть (легкая цепь=light
chain=LC)) представляет собой Zn2+-зависимую эндопротеазу, то большая часть (тяжелая цепь=heavy
chain=НС) является транспортером легкой цепи. При обработке тяжелой цепи эндопептидазами образуются два фрагмента по 50 кДа (см. Gimemez et al. (1993), J. Protein Chem. 12, 351-363). При низком значении рН аминотерминальная часть (HN-фрагмент) встраивается в мембраны и транслоцирует легкую цепь
в цитозоль нервной клетки. Карбокситерминальная часть (HC-фрагмент) связывается со сложными полисиалоганглиозидами, присутствующими только в мембранах нервных клеток, и до сих пор с лишь частично идентифицированными белковыми рецепторами (Halpern et al. (1993), Curr Top Microbiol Immunol
-1-
012578
195, 221-241). Это объясняет высокую нейроселективность клостридиальных нейротоксинов. Кристаллические структуры подтверждают, что BoNT/A содержит три домена, которые можно привести в соответствие с тремя этапами механизма действия (см. Lacy et al. (1998), Nat Struct Biol 5, 898-902). Далее эти
данные позволяют сделать вывод о том, что внутри HC-фрагмента существуют две автономные субъединицы (субдомены) размером по 25 кДа. Первое доказательство существования обоих функциональных
субдоменов было получено с использованием аминотерминальной (HCN) и карбокситерминальной (HCC)
частей HC-фрагмента TeNT, которые были рекомбинантно экспримированы, и это позволило узнать, что
с нейроном связывается HCC-, но не HCN-домен (см. Herrreros et al. (2000), Biochem J 347, 199-204). Позже
был локализован и охарактеризован единственный участок связывания с ганглиозидами в HCC-доменах
BoNT/A и В (см. Rummel et al. (2004), Mol. Microbiol. 51, 631-643). Сайт связывания синаптотагминов I и
II, идентифицированных в качестве белковых рецепторов BoNT/B и G, также удалось отнести к области
HCC-доменов BoNT/B и G (см. Rummel et al. (2004), J Biol Chem 279, 30865-70). Однако в этой статье не
были описаны аминокислоты, относящиеся к карману связывания BoNT/B и G.
В физиологических условиях тяжелая цепь (НС) связывается с HC-фрагментом нейронального ганглиозида, посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза поступает внутрь клетки и через эндосомальный компартмент поступает в естественный круговорот везикул. В кислой среде ранних эндосом
HN-фрагмент проникает в мембрану везикул и образует пору. Любое вещество (X), которое связано с НС
дисульфидным мостиком, будет отделяться от НС при помощи внутриклеточных окислительновосстановительных систем, которые получают доступ к дисульфидному мостику и восстанавливают его.
В конечном итоге, X появляется в цитозоле.
В случае клостридиальных нейротоксинов НС является переносчиком LC, которая на конечной стадии расщепляет свой специфический субстрат в цитозоле. Цикл образования и диссоциации комплексов
белков слияния прерывается, и за счет этого подавляется выделение ацетилхолина. Вследствие этого поперечно-полосатые мышцы расслабляются, а потовые железы прекращают секрецию. Длительность эффекта отдельных серотипов BoNT различна и зависит от присутствия интактных LC в цитозоле. Так как
все нейроны имеют рецепторы клостридиальных нейротоксинов, влияние может быть оказано не только
на выделение ацетилхолина, но потенциально также и на выделение субстанции Р, норадреналина,
ГАМК, глицина, эндорфинов и других медиаторов и гормонов.
То, что преимущественно блокируется холинергическая передача, может объясняться тем, что НС
проникает в периферическую часть нейрона. Центральные синапсы защищены гематоэнцефалическим
барьером, который не могут преодолеть белки.
В исследовании взаимодействия «лиганд-рецептор» была произведена замена определенных аминокислотных остатков в HCC-доменах BoNT/B и G с целью идентификации и определения характеристик
кармана связывания белка-рецептора с тем, чтобы попытаться изменить сродство к белку-рецептору.
Сродство мутированных HC-фрагментов BoNT/B и G было определено в экспериментах с обработкой
синаптотагмина глутатион-S-трансферазой (GST-pulldown). Затем НС с этими мутациями соединяли с
LC-B или LC-G. Эффективность этих конструкций анализировали с помощью изолированного нервномышечного препарата мыши (анализ на гемидиафрагме = HDA). В этом препарате содержится Nervus
phrenicus, который состоит из холинергических мотонейронов и представляет собой важнейшую физиологическую мишень клостридиальных нейротоксинов. Затем в HCC-доменах BoNT/A в углублении, которое находится в том же месте, что и карманы связывания с белком-рецептором в BoNT/B и G, были заменены отдельные аминокислоты. После этого отдельные мутанты BoNT/A полной длины анализировали с помощью HDA-анализа на предмет изменения их эффективности, что свидетельствует об изменении
взаимодействий типа «лиганд-рецептор».
BoNT/A-комплекс, который также называют предшественником токсина А, в недавнем прошлом
использовали для лечения моторных дистоний, а также для подавления избыточной симпатической активности (см. Benecke et al. (1995), Akt. Neurol. 22, 209ff) и для облегчения болей и мигреней (см. Sycha
et al. (2004), J. Neural. 251, 19-30). Этот комплекс состоит из нейротоксина, различных гемагглютининов
и одного не токсичного и не гемагглютинирующего белка. При физиологических значениях рН комплекс
диссоциирует за несколько минут. Выделяющийся при этом нейротоксин является единственной составной частью комплекса, которая имеет терапевтическое значение и обеспечивает облегчение симптомов.
Так как лежащее в основе неврологическое заболевание не излечивается, необходимо повторно инъецировать комплекс с интервалами в три-четыре месяца. В зависимости от количества введенного чужеродного белка у некоторых пациентов образуются специфические антитела к BoNT/A. Эти пациенты становятся устойчивыми к нейротоксину. Если антиген-чувствительные клетки хотя бы один раз распознали
нейротоксин и образовали антитела, соответствующие клетки памяти сохраняются в течение многих лет.
Поэтому принято лечить пациентов препаратами с максимальной активностью в как можно меньших
дозировках. Кроме того, препараты не должны содержать других белков бактериального происхождения,
так как они могут действовать как иммуноадъюванты. Такие вещества привлекают макрофаги, которые
распознают как иммуноадъюванты, так и нейротоксины, и представляют их лимфоцитам, которые отвечают на это образованием иммуноглобулинов. Вследствие этого для лечения следует использовать только продукты высочайшей чистоты, которые не содержат чужеродных белков. Устойчивость пациентов к
-2-
012578
нейротоксину связана, с молекулярной точки зрения, главным образом, с наличием нейтрализующих
антител.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает транспортный белок (Trapo), который дает
возможность преодолеть вышеуказанные проблемы уже известных способов.
Эта задача была решена за счет нового транспортного белка, который можно получить посредством
модификации тяжелой цепи нейротоксинов, синтезируемых Clostridium botulinum, причем:
(1) белок связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем нативный
нейротоксин;
(2) белок обнаруживает по сравнению с нативным нейротоксином повышенную или пониженную
нейротоксичность; при этом нейротоксичность предпочтительно определяют в анализе на гемидиафрагме; и/или
(3) белок по сравнению с нативным нейротоксином обладает меньшим сродством к нейтрализующим антителам.
Согласно предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен транспортный белок, который связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем синтезируемый С. botulinum нативный нейротоксин.
Согласно следующей предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен транспортный белок, который получен посредством модификации НС нейротоксина, синтезируемого
С. botulinum, причем этот белок специфически связывается с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем нативный нейротоксин. Предпочтительно транспортный белок поглощается этими
клетками посредством эндоцитоза.
Согласно следующей предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен транспортный белок, который получен посредством модификации НС нейротоксина, синтезируемого
С. botulinum, причем этот белок в результате замены обращенных к поверхности аминокислот, главным
образом в карманах связывания с ганглиозидными и белковыми рецепторами, больше не способен к связыванию с нейтрализующими антителами.
Далее будет определено, как следует понимать некоторые термины в контексте настоящего изобретения.
«Связывание с нервными клетками с большим или меньшим сродством, чем у нативного нейротоксина». Нативный нейротоксин при этом предпочтительно является нативным нейротоксином С.
botulinum. Предпочтительно при этом нативный нейротоксин является ботулиновым нейротоксином А,
и/или ботулиновым нейротоксином В, и/или ботулиновым нейротоксином G из С. botulinum. Полученный рекомбинантным способом из Е. coli ботулиновый нейротоксин, который, в частности, имеет последовательность аминокислот, идентичную последовательности аминокислот нативного ботулинового
нейротоксина, ведет себя с фармакологической точки зрения идентично нативному ботулиновому нейротоксину и называется рекомбинантным ботулиновым нейротоксином дикого типа. Упомянутыми выше
нервными клетками являются холинергические мотонейроны. Предпочтительно транспортный белок
специфически связывается с молекулами, ассоциированными с плазматической мембраной, трансмембранными белками, белками синаптических везикул, белком из семейства синаптотагминов или гликопротеином-2 синаптических везикул (SV2), предпочтительно с синаптотагмином I, и/или синаптотагмином II, и/или SV2A, SV2B или SV2C; особо предпочтительно с синаптотагмином I человека, и/или с синаптотагмином II человека, и/или с SV2A, SV2B или SV2C человека. Связывание предпочтительно определяется in vitro. Особо предпочтительным является определение с помощью анализа GST-pull-down,
который подробно описан в примерах.
«Белок обнаруживает повышенную или пониженную нейротоксичность по сравнению с нативным
нейротоксином». Нативным нейротоксином при этом является нативный нейротоксин С. botulinum.
Предпочтительно нативный нейротоксин является ботулиновым нейротоксином А, и/или ботулиновым
нейротоксином В, и/или ботулиновым нейротоксином G из С. botulinum. Полученный рекомбинантным
способом из Е. coli ботулиновый нейротоксин, который, в частности, имеет последовательность аминокислот, идентичную последовательности аминокислот нативного ботулинового нейротоксина, ведет себя
с фармакологической точки зрения идентично нативному ботулиновому нейротоксину и называется рекомбинантным ботулиновым нейротоксином дикого типа. Упомянутыми выше нервными клетками являются холинергические мотонейроны. Нейротоксичность предпочтительно определяют с помощью соответствующего современному уровню техники анализа на гемидиафрагме (HDA). Нейротоксичность
мутеина предпочтительно можно определить, как описано в работе Habermann et al., Naunyn Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 311 (1980), 33-40.
«Нейтрализующие антитела». Нейтрализующие антитела к ботулиновому нейротоксину хорошо известны (Goschel H., Wohlfarth K., Frevert J., Dengler R., Bigalke H. Botulinum A toxin therapy: neutralizing
and nonneutralizing antibodies - therapeutic consequences, Exp. Neural. 1997 Sep; 147(1):96-102). Было обнаружено, что антитела, нейтрализующие нейротоксин, преимущественно реагируют с активными центрами нейротоксинов, например с карманами связывания ганглиозидных и белковых рецепторов в пределах
HCC-доменов. Если в нейротоксине поверхности, окружающие карманы связывания, изменены посредст-3-
012578
вом замены аминокислот без негативного влияния на их функциональность, нейтрализующие антитела
теряют сайты связывания, и мутированный нейротоксин больше не нейтрализуется.
Выражение «модификация тяжелой цепи нейротоксинов, образуемых С. botulinum». Последовательность аминокислот и/или нуклеотидов тяжелой цепи (НС) нейротоксинов, образуемых С. botulinum,
обычно можно получить из общедоступных банков данных для каждого из известных серотипов A-G
(см. также таблицу). Модификация при этом означает, что по меньшей мере одна аминокислота удалена,
добавлена или вставлена в последовательность аминокислот, или что по меньшей мере одна аминокислота нативного нейротоксина заменена другой природной или не существующей в природе аминокислотой, и/или что одна аминокислота в данной последовательности аминокислот модифицирована после
трансляции. При этом посттрансляционные модификации охватывают гликозилирование, ацетилирование, ацилирование, дезаминирование, фосфорилирование, изопренилирование, гликозилфосфатидилинозитолирование и другие модификации, известные специалисту в данной области техники.
НС нейротоксинов, образуемых С. botulinum, содержит три субдомена, а именно аминотерминальный транслокационный домен HN размером 50 кДа, прилегающий к нему HCN-домен размером 25 кДа и
расположенный карбокситерминально НСС-домен размером 25 кДа. HCN- и HCC-домены совместно называют HC-фрагментом. Соответствующие участки последовательностей аминокислот этих субдоменов для
отдельных серотипов и их вариантов можно видеть в таблице.
«Ганглиозидный рецептор». НС ботулиновых нейротоксинов обладают высоким сродством к клеткам периферической нервной системы, которое преимущественно обусловлено взаимодействием со
сложными полисиалоганглиозидами - это гликолипиды, состоящие более чем из одной сиаловой кислоты
(Halpern et al. (1995), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 195, 221-41; WO 2006/02707). Вследствие этого связанные с ними LC доходят только до клеток такого типа и эффективны только в этих клетках. BoNT/A и
В связываются только с одной молекулой ганглиозида GT1b.
В случае BoNT/B и BoNT/G белковыми рецепторами являются синаптотагмин I и синаптотагмин II.
В случае BoNT/A белковыми рецепторами являются гликопротеины-2 синаптических везикул (SV2),
предпочтительно SV2A, SV2B и SV2C.
В настоящее время известны 13 изоформ, относящихся к семейству синаптотагминов. Все они отличаются двумя карбокситерминальными Са2+-связывающими С2-доменами, центральным трансмембранным доменом (TMD), который фиксирует синаптотагмин в мембране синаптической везикулы, и
одним аминотерминальным доменом различной длины. Входящий Са2+-ток инициирует слияние синаптической везикулы с плазматической мембраной, после чего внутрипросветная аминотерминаль синаптотагмина презентируется во внеклеточное пространство и используется в качестве рецептора, фиксирующего BoNT/B и G. Аналогично четвертый внутрипросветный домен SV2-изоформ после экзоцитоза
становится доступным с внешней стороны клетки для взаимодействия с BoNT/A.
Посредством направленного мутагенеза характер отдельных аминокислот кармана связывания был
изменен так, чтобы связывание с белковым рецептором было затруднено или устранено. Для этого HCфрагменты BoNT/B и BoNT/G были рекомбинантно в виде дикого типа или с отдельными заменами аминокислот (мутациями/замещениями) в указанном кармане связывания экспримированы в Е. coli и изолированы. Для GST-Pull-down анализа с целью исследования взаимодействия in vitro между BoNT/B или
BoNT/G и синаптотагмином I или синаптотагмином II соответствующий слитый белок, состоящий из
GST и синаптотагмина, инкубировали с различными количествами HC-фрагментов BoNT/B или BoNT/G
и проводили фазовое разделение. Свободный HC-фрагмент оставался в отделенном супернатанте, тогда
как связанный HC-фрагмент BoNT обнаруживался в твердой фазе совместно со слитым белком «GSTсинаптотагмин». Замена соответствующего HC-фрагмента на полноразмерные BoNT/B и BoNT/G в GSTPull-down анализе дала такие же результаты.
При этом было обнаружено, что BoNT/B дикого типа связывается с синаптотагмином I с трансмембранным доменом только в присутствии сложных ганглиозидов, тогда как с синаптотагмином II он связывается как при наличии или в отсутствие трансмембранного домена, так и в присутствии или в отсутствие сложных ганглиозидов. За счет направленной замены аминокислот внутри сайта связывания белкового рецептора BoNT/B можно заметно усилить или ослабить взаимодействие с молекулами обоих
синаптотагминов (фиг. 1).
Кроме того, для BoNT/G дикого типа была показано, что как в присутствии, так и в отсутствие
сложных ганглиозидов происходит его связывание с синаптотагмином I и синаптотагмином II с трансмембранными доменами или без трансмембранных доменов. За счет направленной замены аминокислот,
гомологичных BoNT/B, внутри сайта связывания белкового рецептора BoNT/G можно было заметно
усилить или ослабить взаимодействие с молекулами обоих синаптотагминов (фиг. 2).
Эффективность полномерных форм BoNT/A, В и G диких типов была определена посредством
HDA при помощи кривой «доза-эффект» (фиг. 3 и 6). Затем посредством HDA была определена эффективность различных единичных мутантов полномерных форм BoNT/A, В и G (фиг. 6) и с помощью аппроксимированной кривой эффективности определено ее соотношение с эффективностью диких типов
BoNT/B и G (фиг. 4 и 5). Например, замена в BoNT/B аминокислоты валина в положении 1118 на аспартат или лизина в положении 1192 на глутамат приводила к резкому снижению эффективности до <2%. В
-4-
012578
противоположность этому мутация тирозина в положении 1183 до лейцина или аргинина приводила к
заметному увеличению эффективности BoNT/B (фиг. 4). Модификация тирозина в положении 1256 до
фенилаланина в BoNT/G также приводит к снижению эффективности, тогда как мутация глутамина в
положении 1200 до глутамата, лизина или тирозина вызывает значительное увеличение эффективности
BoNT/G (фиг. 5). В случае BoNT/A модификация серина в положении 1207 до аргинина или тирозина
приводит к повышению эффективности, тогда как мутация лизина в положении 1260 до глутамата вызывает резкое снижение эффективности BoNT/A (фиг. 6).
Согласно одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения транспортный
белок обнаруживает по меньшей мере на 15% большее сродство или по меньшей мере на 15% меньшее
сродство, чем нативный нейротоксин. Предпочтительно транспортный белок обнаруживает по меньшей
мере на 50% большее или меньшее сродство, особенно предпочтительно по меньшей мере на 80% большее или меньшее сродство, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере на 90% большее или меньшее сродство, чем нативный нейротоксин.
Согласно одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения производится
модификация НС в области HC-фрагмента соответствующего нейротоксина. Поскольку модификация
охватывает замену, делецию, инсерцию или добавление аминокислот, она может быть осуществлена,
например, посредством направленного мутагенеза, способы которого известны специалистам в данной
области техники. При этом содержащиеся в нативном нейротоксине аминокислоты заменяют либо существующими в природе, либо не существующими в природе аминокислотами. Принципиально аминокислоты можно разделить на различные физико-химические группы. К отрицательно заряженным аминокислотам относятся аспартат и глутамат. К положительно заряженным аминокислотам относятся гистидин, аргинин и лизин. К полярным аминокислотам относятся аспарагин, глутамин, серин, треонин, цистеин и тирозин. К неполярным аминокислотам относятся глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин и триптофан. Ароматические боковые группы обнаруживаются у аминокислот гистидина, фенилаланина, тирозина и триптофана.
В целом, предпочтительно, чтобы аминокислота была заменена на аминокислоту, которая относится к другой физико-химической группе.
Согласно предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения транспортный белок
представляет собой ботулиновый нейротоксин серотипов A-G. При этом аминокислотные последовательности нативных нейротоксинов, приведенные ниже, можно получить из общедоступных банков данных.
Номера аминокислотных последовательностей в банках данных и
распределение субдоменов семи ботулиновых нейротоксинов
-5-
012578
Что касается HC-фрагмента этих ботулиновых нейротоксинов, то для модификации предпочтительны аминокислоты в следующих положениях:
с 876 по 1296 для нейротоксина С. botulinum серотипа А,
с 866 по 1291 для нейротоксина С. botulinum серотипа В,
с 864 по 1291 или 1280 для нейротоксина С. botulinum серотипа С1,
с 860 по 1276 или 1285 для нейротоксина С. botulinum серотипа D,
с 843 по 1251 или 1252 для нейротоксина С. botulinum или С. butyricum серотипа Е,
с 861 по 1274, с 862 по 1280 или 1278 и с 854 по 1268 для нейротоксина С. botulinum или С. baratii
серотипа F,
с 861 по 1297 для нейротоксина С. botulinum серотипа G.
Поэтому предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна аминокислота в вышеуказанных положениях была посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или
заменена аминокислотой, имеющей естественное или искусственное происхождение.
Согласно одной из предпочтительных форм осуществления изобретения нейротоксин является ботулиновым нейротоксином серотипа А. Предпочтительно при этом по меньшей мере одна аминокислота в
положениях Треонин 1195, Аспарагин 1196, Глутамин 1199, Лизин 1204, Изолейцин 1205, Лейцин 1206,
Серин 1207, Лейцин 1209, Аспартат 1213, Лейцин 1217, Фенилаланин 1255, Аспарагин 1256, Изолейцин
1258 и/или Лизин 1260 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа А посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или искусственное происхождение. Особо предпочтительны положения Аспарагин 1196, Глутамин 1199, Серин 1207, Фенилаланин 1255, Изолейцин 1258 и/или Лизин 1260 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа А. Наиболее предпочтительны положения
Серин 1207, который заменяют на Аргинин или Тирозин, и Лизин 1260, который заменяют на Глутамат.
Согласно другой предпочтительной форме осуществления изобретения нейротоксин является ботулиновым нейротоксином серотипа В. Предпочтительно при этом по меньшей мере одна аминокислота в
положениях Лизин 1113, Аспартат 1114, Серин 1116, Пролин 1117, Валин 1118, Треонин 1182, Тирозин
1183, Фенилаланин 1186, Лизин 1188, Глутамат 1191, Лизин 1192, Лейцин 1193, Фенилаланин 1194, Фенилаланин 1204, Фенилаланин 1243, Глутамат 1245, Лизин 1254, Аспартат 1255 и Тирозин 1256 белковой
последовательности ботулинового нейротоксина серотипа В посттрансляционно модифицирована, и/или
добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или
искусственное происхождение. Особо предпочтительны положения Валин 1118, Тирозин 1183, Глутамат
1191, Лизин 1192, Глутамат 1245 и Тирозин 1256 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа В. Наиболее предпочтительны положения Тирозин 1183 и Глутамат 1191, которые заменяют на Лейцин.
Согласно следующей предпочтительной форме осуществления изобретения нейротоксин является
ботулиновым нейротоксином серотипа G. Предпочтительно при этом по меньшей мере одна аминокислота в положениях Фенилаланин 1121, Лизин 1123, Алании 1124, Серин 1125, Метионин 1126, Валин
-6-
012578
1190, Лейцин 1191, Серин 1194, Глутамат 1196, Треонин 1199, Глутамин 1200, Лейцин 1201, Фенилаланин 1202, Фенилаланин 1212, Фенилаланин 1248, Лизин 1250, Аспартат 1251 и Тирозин 1262 белковой
последовательности ботулинового нейротоксина серотипа G посттрансляционно модифицирована, и/или
добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, имеющей естественное или
искусственное происхождение. Особо предпочтительны положения Метионин 1126, Лейцин 1191, Треонин 1199, Глутамин 1200, Лизин 1250 и Тирозин 1262 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа G. Наиболее предпочтительно положение Тирозин 1262, который заменяют на Фенилаланин.
Полученный в настоящем изобретении транспортный белок обнаруживает повышенное или пониженное специфическое сродство своего протеинсвязывающего домена, в частности, к молекулам из семейства синаптотагминов или гликопротеинов-2 синаптических везикул.
Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к конструкции, которая содержит транспортный белок согласно настоящему изобретению и по меньшей мере одну переносимую
внутрь клетки молекулу (X). Переносимая молекула может быть мелкой органической молекулой, пептидом или протеином; предпочтительно она присоединена ковалентной связью, например пептидной,
простой эфирной, сложноэфирной, сульфидной, дисульфидной или углерод-углеродной связью.
Термин «переносимая молекула» охватывает также все известные терапевтически эффективные
вещества. Предпочтительными при этом являются цитостатики, антибиотики, виростатики и иммуноглобулины.
В одной из предпочтительных форм осуществления настоящего изобретения белок является протеазой, расщепляющей один или несколько белков аппарата высвобождения нейромедиаторов, причем
протеаза выбрана из группы нейротоксинов, которая состоит из LC нейротоксинов С. botulinum, в частности серотипов А, В, С1, D, E, F и G, или протеолитически активного фрагмента LC нейротоксинов С.
botulinum, в частности серотипов А, В, С1, D, E, F и G, причем фрагмент обнаруживает не менее 0,01%
протеолитической активности нативной протеазы, предпочтительно не менее 5%, особо предпочтительно
не менее 50% и наиболее предпочтительно не менее 90%. Предпочтительно транспортный белок и протеаза происходят от одного серотипа нейротоксина С. botulinum, особо предпочтительно HN-домен
транспортного белка и протеза происходят от нейротоксина С. botulinum серотипа А. Последовательности протеаз общеизвестны из банков данных, и их номера в банках данных приведены в таблице. Протеолитическую активность протеаз определяют на основании кинетики расщепления субстрата (см. Binz et
al. (2002), Biochemistry 41(6), 1717-23).
Согласно следующей форме осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ получения транспортного белка. На первой стадии при этом получают нуклеиновую кислоту, кодирующую
транспортный белок. Кодирующая нуклеиновая кислота при этом может быть РНК, ДНК или их смесью.
Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть модифицированы в отношении их резистентности к нуклеазам, например, посредством вставки фосфотиоатных связей. Нуклеиновая кислота может быть получена из исходной нуклеиновой кислоты, при этом исходная нуклеиновая кислота может быть получена,
например, посредством клонирования нуклеиновых кислот из геномных банков или банков кДНК. Также
нуклеиновая кислота может быть получена непосредственно путем твердофазного синтеза. Подходящие
способы известны специалисту в данной области техники. Если исходить из исходной нуклеиновой кислоты, то можно, например посредством сайт-направленного мутагенеза, провести целенаправленное
изменение, которое на уровне аминокислот приведет по меньшей мере к одной добавке, вставке, делеции
и/или замене. Затем нуклеиновые кислоты оперативно соединяют с подходящим промотором. Промоторы, подходящие для экспрессии в известных системах экспрессии, известны специалисту в данной области техники. Выбор промотора зависит при этом от используемой для экспрессии системы экспрессии.
В целом, предпочтительны конститутивные промоторы, однако находят применение и индуцируемые
промоторы. Полученная таким образом конструкция включает в себя по меньшей мере часть вектора, в
частности регуляторные элементы, причем вектор выбирают, например, из λ-производных, аденовирусов, бакуловирусов, вакциниявирусов, SV40-вирусов и ретровирусов. Вектор предпочтительно способен
к экспрессии нуклеиновых кислот в определенной клетке-хозяине.
Далее изобретение предусматривает клетки-хозяева, которые содержат вектор и которые пригодны
для экспрессии вектора. На современном уровне техники известны многочисленные прокариотические и
эукариотические системы экспрессии, при этом клетки-хозяева выбраны, например, из прокариотических клеток, таких как Е. coli или B. subtilis, или эукариотических клеток, таких как S. cerevisiae и P. pastoris. Хотя можно использовать и клетки эукариот, находящихся на более высоких уровнях развития,
например клетки насекомых или клетки млекопитающих, все же предпочтительны такие клетки-хозяева,
которые, также как и С. botulinum, не используют аппарат гликозилирования.
Согласно предпочтительной форме осуществления изобретения нуклеиновая кислота кодирует HCфрагмент нейротоксина С. botulinum. Эта нуклеиновая кислота содержит сайты рестрикции эндонуклеазой, которые фланкируют нуклеиновую кислоту, кодирующую HC-фрагмент, при этом сайты рестрикции
эндонуклеазой должны быть совместимыми с сайтами рестрикции других HC-фрагментов из нейротоксинов С. botulinum, чтобы была возможна легкая замена модулей в гене, кодирующем транспортный бе-7-
012578
лок, с сохранением сходства последовательности аминокислот.
Поскольку получена конструкция согласно настоящему изобретению, которая наряду с транспортным белком содержит по меньшей мере одну переносимую молекулу, и эта переносимая молекула представляет собой пептид или протеин, функционализированный карбокситерминальным цистеином или
меркаптогруппой, то аналогично тому, как описано выше, этот пептид или протеин можно получить рекомбинантным методом, например с использованием бинарных векторов или различных клеток-хозяев.
Поскольку эти клетки-хозяева используются для экспрессии как транспортного белка, так и пептида или
протеина, межмолекулярную дисульфидную связь предпочтительно образуют in situ. Для более эффективной продукции в той же клетке-хозяине нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или протеин, может быть транслирована вместе с транспортным белком в одних и тех же рамках считывания, так что
образуется одноцепочечный полипептид. При этом предпочтительно образуется внутримолекулярная
дисульфидная связь in situ. Для простого гидролиза существующей пептидной связи между транспортным белком и пептидом или протеином к аминотерминали транспортного белка присоединяют последовательность аминокислот, которая специфически распознается и расщепляется либо протеазой тромбином, либо специфической эндопротеазой клетки-хозяина.
Неожиданно было обнаружено, что последовательность-вставка CXXXZKTKSLVPRGSKBXXC
(SEQ ID NO:1), в которой X обозначает любую аминокислоту, a Z и В независимо выбраны из аланина,
валина, серина, треонина и глицина, эффективно расщепляется in vivo эндогенной протеазой бактериихозяина, предпочтительно Е. coli. Поэтому внедрение этой последовательности-вставки между аминокислотной последовательностью транспортного белка и другим пептидом или протеином дает преимущество, состоящее в том, что не требуется дальнейшей обработки на следующей стадии, например тромбином. Особенно предпочтительной является Е. coli штамма K12.
Последовательность-вставка предпочтительно является частью петли, предпочтительно состоящей
из 18-20 аминокислот.
Если это невозможно, то после раздельной очистки транспортного белка и протеина можно получить соответствующую межмолекулярную дисульфидную связь с использованием известного специалисту в данной области техники окислительного способа. Пептид или протеин также можно получить прямо посредством синтеза или конденсации фрагментов. Соответствующие способы известны специалисту
в данной области техники.
Затем транспортный белок и пептид или протеин очищают. При этом можно использовать известные специалисту в данной области техники способы, например хроматографический способ или электрофорез.
Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит транспортный белок или конструкцию и, возможно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
Фармацевтическая композиция пригодна для орального, внутривенного, подкожного, внутримышечного и местного применения. При этом предпочтительным является внутримышечное введение.
Единица дозировки фармацевтической композиции содержит приблизительно от 0,1 пг до 1 мг транспортного белка и/или конструкции согласно настоящему изобретению.
Фармацевтическая композиция пригодна для лечения нарушений высвобождения медиаторов и таких заболеваний, как, например, гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, блефароспазм, спастики, дистонии, мигрени, боли, заболевания шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм,
гиперсаливация, заживление ран, храп и депрессии.
Следующая форма осуществления настоящего изобретения представляет собой косметическую
композицию, которая содержит транспортный белок и косметически приемлемый носитель, разбавитель
и/или аддитив. Косметическая композиция пригодна для лечения гипергидроза и морщин на лице.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - исследование посредством GST-Pull-down анализа связывания in vitro HC-фрагментов
BoNT/B дикого типа и мутированных с укороченными слитыми белками GST-Syt I и GST-Syt II в присутствии и в отсутствие сложных ганглиозидов.
Фиг. 2 - исследование посредством GST-Pull-down анализа связывания in vitro HC-фрагментов
BoNT/G дикого типа и мутированных с укороченными слитыми белками GST-Syt I и GST-Syt II в присутствии и в отсутствие сложных ганглиозидов.
Фиг. 3 - кривая «доза-эффект» для BoNT/B и G, полученная посредством HDA. Аппроксимированные функции эффективности дают возможность относительного сравнения длительностей паралича, вызываемого отдельными мутантами и соответствующими дикими типами.
Фиг. 4 - снижение и повышение нейротоксичности отдельных мутантов BoNT/B по сравнению с
диким типом, определенные посредством HDA.
Фиг. 5 - снижение и повышение нейротоксичности отдельных мутантов BoNT/G по сравнению с
диким типом, определенные посредством HDA.
Фиг. 6 - кривые «доза-эффект» для диких типов BoNT/A и отдельных мутантов BoNT/A, полученные посредством HDA.
-8-
012578
Более конкретно, настоящее изобретение охватывает транспортный белок (Trapo), который получают посредством модификации НС нейротоксина, продуцируемого С. botulinum, который предпочтительно специфически связывается с нейронами и который предпочтительно попадает внутрь клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза и транслоцируется из кислого эндосомального компартмента в цитозоль нейронов. Этот белок используется в качестве транспортера для переноса в клетки
связанных с ним протеаз и других веществ, которые физиологически не могут проникнуть через плазматическую мембрану и попасть в цитозоль нервных клеток. Субстратами протеаз являются расположенные внутри клетки протеины и пептиды, которые участвуют в высвобождении медиаторов. После расщепления субстрата блокируются специфические функции нейронов, при этом сами клетки не повреждаются. Одной из этих функций является экзоцитоз, который обеспечивает высвобождение медиатора.
Если высвобождение медиаторов подавляется, блокируется передача сигналов от клетки к клетке. Например, если подавляется высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах, расслабляются
поперечно-полосатые мышцы. Этот эффект можно использовать в терапевтических целях, если наносить
транспортный белок на нервные окончания спастичных или дистоничных мышц. Другими активными
веществами являются, например, активные вещества с противовирусным эффектом. Их используют для
лечения вирусных инфекций нервной системы в виде конъюгатов с транспортным белком. Настоящее
изобретение относится также к применению транспортного белка для подавления высвобождения нейромедиаторов.
Транспортные белки с меньшим сродством связываются с нервными клетками, но не поглощаются
ими. Поэтому такие транспортные белки пригодны для использования в качестве специфических транспортеров веществ к поверхности нервных клеток.
При лечении пациентов предшественниками токсинов А и В из С. botulinum инъекция этих чужеродных для человека белков, несмотря на низкую дозировку, вызывает образование антител, так что лечение не приносит эффекта, и поэтому его приходится прекращать во избежание возникновения в конечном итоге анафилактического шока. Если же вводить вещество с тем же механизмом действия, но с более высокой эффективностью транспорта ферментативной активности, дозу можно резко снизить, и не
произойдет образования антител. Эти свойства принадлежат транспортному белку, описанному в данном
изобретении.
Даже в тех случаях, когда приводятся примеры применения, подходящий способ применения и дозировка обычно индивидуально определяются лечащим врачом. Такие решения приходится принимать в
повседневной практике каждому врачу, занимающемуся профессиональной деятельностью. Так, например, способ применения и дозировку нейротоксина согласно настоящему изобретению можно выбрать на
основании таких критериев, как растворимость выбранного нейротоксина или интенсивность болей, на
которые необходимо воздействовать.
В настоящее время интервал между циклами лечения нативными BoNT/A и В в среднем составляет
от трех до четырех месяцев. Увеличение этого интервала снизило бы риск образования антител и обеспечило бы большую длительность лечения с использованием BoNT. Увеличение концентрации LC в цитозоле увеличило бы время ее распада и за счет этого увеличило бы длительность эффекта. Описанный в
данной работе транспортный протеин обладает большим сродством и большей скоростью поступления в
клетку, чем нативная НС.
Приведенный ниже пример служит исключительно для целей разъяснения, и его не следует рассматривать как ограничивающий изобретение.
Описание примера осуществления изобретения
Материалы и методы.
Конструирование плазмид и получение рекомбинантных белков.
Плазмиды для экспрессии в Е. coli рекомбинантных HC-фрагментов BoNT/B и BoNT/G и полномерных форм BoNT/A, В и G с карбокситерминальным StrepTag для аффинной очистки были получены
ПЦР-методами с использованием подходящих праймеров, хромосомных ДНК, кодирующих BoNT/A
(AAA23262), BoNT/B (AAA23211) и BoNT/G (CAA52275), и вектора экспрессии pQe3 (Qiagen AG) в качестве исходного вектора. Укороченные варианты синаптотагмина I (Syt I) крысы (аминокислоты 1-53;
аминокислоты 1-82) и синаптотагмина II (Syt II) крысы (аминокислоты 1-61; аминокислоты 1-90) были
клонированы в GST-кодирующий вектор pGEX-2T (Amersham Biosciences AB). Последовательности
нуклеиновых кислот всех плазмид были подтверждены посредством ДНК-секвенирования. Рекомбинантные HC-фрагменты и HC-фрагменты полномерных форм BoNT были получены в Е. coli, штамм М15
[pRep4] (Qiagen), в ходе десятичасовой индукции при комнатной температуре и очищены на StrepTactinматриксе (IBA GmbH) согласно рекомендациям производителя. Полученные из Е. coli, штамм BL21,
GST-содержащие слитые белки были выделены при помощи глутатиона, иммобилизированного на сефарозных гранулах. Фракции, содержавшие желаемые белки, очищали и подвергали диализу против ТрисNaCl-тритонового буфера (20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 0,5% Тритон Х-100, рН 7,2).
GST-Pull-down анализ.
GST-содержащие слитые белки (в каждом случае по 0,12 нмоль), иммобилизированные на 10 мкл
глутатион-сефарозных микрогранул, инкубировали с HC-фрагментами (0,1 нмоль) в отсутствие или в
-9-
012578
присутствии смеси ганглиозидов из мозга коров (18% GM1, 55% GD1a, 2% прочих ганглиозидов; Calbiochem; в каждом случае по 20 мкг) в TpHC-NaCl-тритоновом буфере с общим объемом 180 мкл в течение
2 ч при 4°С. Гранулы отделяли посредством центрифугирования, надосадочную жидкость удаляли, а отделенные гранулы три раза промывали 400 мкл такого же буфера. Промытые фракции гранул кипятили в
буфере для разведения проб с додецилсульфатом натрия и исследовали совместно с фракциями надосадочной жидкости посредством SDS-PAGE электрофореза с окрашиванием кумасси синим.
BoNT/B дикого типа связывается только в присутствии сложных ганглиозидов и синаптотагмина I с
трансмембранным доменом, тогда как синаптотагмин II связывается как при наличии, так и в отсутствие
трансмембранного домена, а также в присутствии или в отсутствие сложных ганглиозидов. Посредством
направленной замены аминокислот внутри сайта связывания белкового рецептора BoNT/B взаимодействие с обеими молекулами синаптотагмина можно заметно усилить (E1191L; Y1183L) или ослабить
(V1118D; K1192Е) (фиг. 1).
Для BoNT/G дикого типа было показано, что как в присутствии, так и в отсутствие сложных ганглиозидов происходит связывание с синаптотагмином I и синаптотагмином II, причем как при наличии,
так и в отсутствие трансмембранного домена. Посредством направленной замены аминокислот внутри
сайта связывания белкового рецептора BoNT/G взаимодействие с обеими молекулами синаптотагмина
можно заметно усилить (Y1262F) или ослабить (Q1200E) (фиг. 2).
Благодаря полученным доказательствам связывания рекомбинантных HC-фрагментов BoNT/B и G с
изолированными, иммобилизированными ганглиозидами, удалось исключить нарушение функции соседнего кармана связывания ганглиозидов за счет мутаций, внедренных в Syt-карман связывания, и сделать убедительные выводы об интактности третичной структуры HC-фрагментов. Эти результаты подтверждаются КД-спектроскопическими исследованиями и экспериментами с термической денатурацией,
которые также продемонстрировали интактные третичные структуры мутированных HC-фрагментов
BoNT/B и G.
Анализ на гемидиафрагме мыши (HDA).
Нейротоксичность мутеинов BoNT/A, В и G была определена, как описано в работе Habermann et
al., Naunyn Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 311 (1980), 33-40.
Эффективность полномерных форм BoNT/A, В и G дикого типа была определена в HDA с помощью кривых «доза-эффект» (фиг. 3 и 6). Затем посредством HDA была определена эффективность различных единичных мутантов полномерных форм BoNT/A, В и G (фиг. 6) и с помощью аппроксимированной функции эффективности было определено ее соотношение с эффективностью BoNT/B и G дикого
типа (фиг. 4 и 5). Так, замена аминокислоты валина в положении 1118 на аспартат или лизина в положении 1192 на глутамат в BoNT/B приводит к резкому снижению эффективности до <2%. В противоположность этому мутация тирозина в положении 1183 на лейцин или аргинин приводит к явному повышению эффективности BoNT/B (фиг. 4). Модификация тирозина в положении 1256 на фенилаланин в
BoNT/G также приводит к повышению эффективности, тогда как мутация глутамина в положении 1200
на глутамат, лизин или тирозин приводит к значительному снижению эффективности BoNT/G (фиг. 5). В
случае BoNT/A модификация серина в положении 1207 на аргинин или тирозин вызывает повышение
эффективности, тогда как мутация лизина в положении 1260 на глутамат приводит к резкому снижению
эффективности BoNT/A (фиг. 6).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Транспортный белок, который может быть получен посредством модификации тяжелой цепи
нейротоксинов, образуемых Clostridium botulinum серотипа А, где по меньшей мере одна аминокислота в
положениях с 876 по 1296 посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или
вставлена, и/или заменена аминокислотой, существующей в природе, либо не имеющей естественного
происхождения, причем
(1) белок связывается с белковыми рецепторами нервных клеток с большим или меньшим сродством, чем нативный нейротоксин; и/или
(2) белок обнаруживает повышенную или пониженную нейротоксичность по сравнению с нативным нейротоксином; при этом нейротоксичность предпочтительно определяют в анализе на препарате
гемидиафрагмы.
2. Транспортный белок по п.1, где этот белок специфически связывается с SV2C человека.
3. Транспортный белок по п.1 или 2, где этот белок обнаруживает сродство по меньшей мере на
15% большее или по меньшей мере на 15% меньшее, чем у нативного нейротоксина, предпочтительно по
меньшей мере на 50% большее или меньшее, особо предпочтительно по меньшей мере на 80% большее
или меньшее, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% большее или меньшее.
4. Транспортный белок по п.1, где по меньшей мере одна аминокислота в положениях Треонин
1195, Аспарагин 1196, Глутамин 1199, Лизин 1204, Изолейцин 1205, Лейцин 1206, Серин 1207, Лейцин
1209, Аспартат 1213, Лейцин 1217, Фенилаланин 1255, Аспарагин 1256, Изолейцин 1258 и/или Лизин
1260 белковой последовательности ботулинового нейротоксина серотипа А посттрансляционно модифи- 10 -
012578
цирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой, существующей в природе, либо не имеющей естественного происхождения.
5. Транспортный белок по п.4, где по меньшей мере одна аминокислота в положениях Аспарагин
1196, Глутамин 1199, Серин 1207, Фенилаланин 1255, Изолейцин 1258 и/или Лизин 1260 посттрансляционно модифицирована, и/или добавлена, и/или удалена, и/или вставлена, и/или заменена аминокислотой,
существующей в природе, либо не имеющей естественного происхождения.
6. Транспортный белок по п.4 или 5, где аминокислота серин в положении 1207 заменена на аргинин или тирозин.
7. Транспортный белок по п.4 или 5, где аминокислота лизин в положении 1260 заменена на глутамат.
8. Композиция, содержащая транспортный белок по любому из пп.1-7 и по меньшей мере одну переносимую молекулу.
9. Композиция по п.8, где переносимая молекула ковалентно связана с транспортным белком пептидной, простой эфирной, сложноэфирной, сульфидной, дисульфидной или углерод-углеродной связью.
10. Композиция по п.8 или 9, где переносимая молекула является органической молекулой с низкой
молекулярной массой, пептидом или белком.
11. Композиция по п.10, где органическая молекула с низкой молекулярной массой является виростатиком, цитостатиком, антибиотиком или иммуноглобулином.
12. Композиция по п.10, где белок является протеазой.
13. Композиция по п.12, где протеза содержит одну или несколько легких цепей (LC) нейротоксинов Clostridium botulinum серотипов А, В, С1, D, E, F и/или G.
14. Композиция по п.12, где протеаза содержит протеолитически активный фрагмент, который ведет свое происхождение от легкой цепи (LC) нейротоксинов Clostridium botulinum серотипов А, В, С1, D,
E, F и/или G и характеризуется тем, что он обнаруживает по меньшей мере 0,01% протеолитической активности нативной протеазы, предпочтительно по меньшей мере 50% протеолитической активности нативной протеазы.
15. Композиция по п.13 или 14, где протеза специфически расщепляет определенные субстраты
внутри холинергических мотонейронов.
16. Композиция по п.15, где субстраты выбраны из белков, которые участвуют в высвобождении
нейромедиаторов в нервных клетках, и белков, которые способны к каталитическим реакциям в нервной
клетке.
17. Композиция по п.13 или 14, где протеаза и транспортный белок ковалентно связаны через последовательность аминокислот, которая специфически распознается и расщепляется эндопептидазой.
18. Композиция по п.17, где последовательность аминокислот включает в себя последовательность
CXXXZKTKSLVPRGSKBXXC, где X является любой аминокислотой, a Z и В независимо друг от друга
выбраны из аланина, валина, серина, треонина и глицина.
19. Композиция по п.17, где после расщепления эндопептидазой протеза и транспортный белок остаются связанными дисульфидным мостиком, что снова приводит к возникновению активного голотоксина.
20. Фармацевтическая композиция, которая содержит транспортный белок по любому из пп.1-7 или
композицию по любому из пп.8-19, а также, возможно, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
21. Применение фармацевтической композиции по п.20 для лечения расстройств и заболеваний, при
которых показано лечение ботулиновым нейротоксином.
22. Применение по п.21, где расстройство или заболевание является одним из следующих: гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, блефароспазм, спастики, дистонии, мигрени, боли, заболевания шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм, гиперсаливация, храп, заживление ран и
депрессивные заболевания.
23. Косметическая композиция, которая содержит транспортный белок по любому из пп.1-7 или
композицию по любому из пп.8-19, а также, возможно, косметически приемлемый носитель, разбавитель
и/или добавку.
24. Применение косметической композиции по п.23 для лечения косметических показаний, гипергидроза и морщин на лице.
25. Способ получения транспортного белка по любому из пп.1-7 или композиции по любому из
пп.8-19 посредством рекомбинации согласно известным способам.
26. Способ получения транспортного белка по п.25, где ген HC-фрагмента фланкирован двумя нуклеиновыми кислотами, содержащими сайты рестрикции эндонуклеазами, причем сайты рестрикции эндонуклеазами совместимы с сайтами рестрикции других HC-фрагментов из нейротоксинов Clostridium
botulinum, чтобы обеспечить легкий обмен модулями с сохранением сходства последовательности аминокислот.
27. Способ получения композиции по п.25, где ген протеазы фланкирован двумя нуклеиновыми кислотами, содержащими сайты рестрикции эндонуклеазами, причем сайты рестрикции эндонуклеазами
- 11 -
012578
совместимы с сайтами рестрикции других протеазных доменов из нейротоксинов Clostridium botulinum,
чтобы обеспечить легкий обмен модулями с сохранением сходства последовательности аминокислот.
28. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор экспрессии, причем вектор экспрессии кодирует транспортный белок по любому из пп.1-7 или композицию по любому из пп.8-19.
29. Клетка-хозяин по п.28, где клетка-хозяин может быть клеткой Escherichia coli, в частности Е.
coli штамма K12, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris или Bacillus megaterium.
30. Вектор экспрессии, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую транспортный белок
по любому из пп.1-7 или композицию по любому из пп.8-19.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 12 -
012578
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
- 13 -
012578
Фиг. 6
- 14 -
012578
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 15 -