Диссертация - Институт биоорганической химии
advertisement
Федеральное агентство научных организаций (ФАНО России) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) На правах рукописи Миронова Кристина Евгеньевна Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфо́ ров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток Специальность 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук Научный руководитель – проф., член-корр. РАН, д.б.н. С.М. Деев Москва - 2015 2 Оглавление 1. ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................... 5 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................... 9 2.1. Механизмы фотосенсибилизации. Фотофизические и фотохимические характеристики фотосенсибилизаторов................................................................................................................... 9 2.2. Низкомолекулярные фотосенсибилизаторы ........................................................................ 11 2.3. Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG ............................................... 13 2.3.1. Получение генетически кодируемого ФС miniSOG...................................................... 13 2.3.2. Кофактор MiniSOG – производное рибофлавина.......................................................... 14 2.3.3. Физико-химические характеристики MiniSOG ............................................................. 17 2.4. Механизм клеточной гибели при воздействии ФС на клетки............................................. 19 2.4.1. Апоптоз ........................................................................................................................... 20 2.4.1.1. Основные пути внутренней передачи сигнала в ответ на ФДТ............................. 21 2.4.1.2. ФДТ-индуцируемый внутренний путь гибели клеток, независимый от каспаз ... 24 2.4.2. Аутофагия ....................................................................................................................... 27 2.4.3. Некроз ............................................................................................................................. 29 2.5. Механизмы клеточной защиты............................................................................................. 31 2.6. Нацеливание фотосенсибилизаторов на рецептор HER2/neu ............................................. 32 2.7. Источники света, используемые для ФДТ, и апконвертирующие нанофосфоры .............. 36 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................... 44 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................... 58 4.1. Разработка генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-miniSOG и характеристика его функциональных свойств............................................................................ 58 4.1.1. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG ........... 58 4.1.2 Характеристика функциональных свойств 4D5scFv-miniSOG ...................................... 60 4.1.2.1 Связывание с рецептором HER2/neu – иммунохимический метод........................ 60 3 4.1.2.2 Спектральные свойства 4D5scFv-miniSOG ............................................................. 61 4.1.2.3 Специфичность связывания с HER2/neu на клетках............................................... 61 4.1.2.4 Конкурентное ингибирование ................................................................................. 62 4.1.2.5 Внутриклеточная локализация 4D5scFv-miniSOG.................................................. 63 4.2. Изучение фотоцитотоксичности полученного белка на линии опухолевых клеток при облучении синим светом ............................................................................................................. 66 4.2.1 Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG in vitro .................................... 66 4.2.2 Сочетанное действие 4D5scFv-miniSOG и таксола®..................................................... 67 4.2.3 Выяснение механизмов гибели клетки под воздействием 4D5scFv-miniSOG .............. 69 4.2.3.1 Микроскопия ............................................................................................................ 69 4.2.3.2 Активность каспазы-3 .............................................................................................. 70 4.2.3.3 Фрагментация ДНК .................................................................................................. 70 4.3. Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров............................................................................................. 72 4.3.1. Создание и исследование донорно-акцепторных пар НАФ:4D5scFv-miniSOG, возбуждаемых ближним ИК-светом........................................................................................ 73 4.3.1.1 Перекрывание спектров ........................................................................................... 73 4.3.1.2 Стабилизация НАФ в водных растворах................................................................. 74 4.3.1.3 FRET ......................................................................................................................... 75 4.3.1.4 Фёрстеровский радиус ............................................................................................. 76 4.3.1.5 Доказательство FRET............................................................................................... 76 4.3.1.6 Конъюгация НАФ с белками ................................................................................... 78 4.3.2. Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом................................................................................................................................. 79 4.3.2. 1 Получение и характеристика адресного белка DARPin-mCherry.......................... 79 4.3.2.2 Получение и характеристика связывания с клетками конъюгатов НАФРМАО:DARPin-mCherry. ..................................................................................................... 83 4.3.2.3 Оценка цитотоксичности конъюгата НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry при облучении ближним ИК-светом.......................................................................................... 84 4.3.3. Оценка использования рибофлавина в качестве ФС..................................................... 91 4 4.3.3.1. Изучение способности рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых клетках.................................................................................................................................. 91 4.3.3.2. Изучение онкоспецифической цитотоксичности рибофлавина при облучении УФА1.................................................................................................................................... 92 Выводы:........................................................................................................................................ 94 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...................................................................................................................... 95 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ............................................ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................... 98 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. ................................................................................................................ 115 ПРИЛОЖЕНИЕ 2. ................................................................................................................ 115 ПРИЛОЖЕНИЕ 3. ................................................................................................................ 116 ПРИЛОЖЕНИЕ 4. ................................................................................................................ 116 ПРИЛОЖЕНИЕ 5. ................................................................................................................ 117 БЛАГОДАРНОСТИ ............................................................................................................. 118 5 1. Введение Актуальность темы исследования В современной онкологии все большее значение приобретают высокотехнологичные методы диагностики и лечения, разработка которых требует объединения химических физических, и биологических подходов для увеличения эффективности и безопасности лечения. Фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой многообещающий и перспективный метод разрушения раковых клеток, который, по сравнению с другими современными методами воздействия на злокачественные новообразования (химиотерапия, лучевая терапия), является наименее агрессивным по отношению к здоровым тканям. ФДТ позволяет воздействовать на опухоль локально, активируя светом предварительно доставленный в опухоль химический фотосенсибилизатор (ФС), что приводит к образованию активных форм кислорода, вызывающих гибель клеток. Препараты, применяемые в ФДТ, были одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) уже 20 лет назад. В России данный вид терапии был внесен в «Перечень видов высокотехнологичной медицинской помощи, оказываемой за счет средств федерального бюджета в федеральных медицинских учреждениях» в 2007 году. На сегодняшний день ФДТ с использованием низкомолекулярных ФС успешно применяется в лечении разных видов опухолей, однако имеет ряд недостатков: только поверхностное воздействие, недостаточная селективность и частое возникновение местных неспецифических реакций. Поэтому актуальной задачей является поиск новых ФС, которые могли бы удовлетворять одновременно нескольким условиям: избирательно накапливаться в опухолевой ткани; не вызывать фотодерматит; иметь высокий квантовый выход образования синглетного кислорода; обладать постоянством состава и свойств как при хранении, так и при введении в организм; не являться токсичными и относительно быстро выводиться из организма. Многие современные подходы к созданию ФС имеют своей целью адресную доставку молекул к опухоли. В настоящее время селективности воздействия добиваются либо путем пассивного преимущественного накопления ФС в опухоли за счет различий в метаболизме и внутриклеточных процессах в опухоли по сравнению со здоровыми тканями, либо путем активной адресной доставки ФС к опухолевым клеткам [1]. Поскольку оба подхода имеют ряд значительных недостатков, создание адресных ФС, избирательно воздействующих только на опухолевые клетки определенного молекулярного профиля, остается весьма актуальной проблемой. 6 Достижения современной молекулярной онкологии в области изучения механизмов опухолевого перерождения и резистентности опухолей к терапии свидетельствуют о необходимости комбинированных подходов к лечению онкологических заболеваний. В клинической практике для усиления эффекта ФДТ часто прибегают к использованию комбинированной терапии в сочетании с цитостатиками. Изучение их совместного действия с разрабатываемыми ФС также представляет актуальную задачу. Используемые сегодня ФС, как правило, возбуждаются коротковолновым светом, не проникающим в глубь тканей, поэтому их применяют для лечения либо небольших поверхностных опухолей на коже и слизистой оболочке, либо опухолей на внутренней поверхности различных органов с локальной доставкой света оптоволокном в сочетании с лапароскопией. Актуальной проблемой является расширение области применения ФС, поиски решения которой лежат в двух направлениях: создание нового поколения ФС с максимумами поглощения в «окне прозрачности» биоткани (750-1000 нм), что позволит воздействовать на патологический очаг на глубине тканей, и поиск альтернативных подходов для доставки коротковолнового света в глубине тканей. Разработка новых адресных ФС с улучшенными фотолюминесцентными характеристиками и поиск альтернативных подходов для доставки возбуждающего света в глубь тканей является важной задачей, решение которой позволит получить новые соединения, перспективные для фундаментальных исследований и терапии социально значимых опухолевых заболеваний, а также позволит создать общую методическую основу для конструирования аналогичных адресных ФС с другими иммунологическими характеристиками. Цель работы: создание и изучение свойств флавинового рекомбинантного ФС, специфичного к опухолевым клеткам аденокарциномы молочной железы, и поиск подходов к доставке возбуждающего УФА1 и синего света вглубь тканей c использованием апконвертирующих нанофосфо́ ров Задачи: 1) Создание, физико-химическая и иммунохимическая характеристика рекомбинантного иммуноФС на основе флавинового белка и адресных мини-антител; 2) Изучение фотоцитотоксичности флавинового белка и рекомбинантного адресных гиперэкспрессирующих опухолевых клеток; иммуноФС, мини-антител, на состоящего линии из HER2/neu- 7 3) Поиск подходов использованием к фотоиндуцированному экзогенных и эндогенных разрушению ФС при опухолевых облучении клеток с ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфо́ ров. а) Создание и исследование донорно-акцепторных пар, возбуждаемых ближним ИКсветом, на основе апконвертирующих нанофосфоров и рекомбинантного флавинового иммуноФС. б) Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом. Научная новизна и практическая значимость Впервые получен и охарактеризован генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFvminiSOG на основе адресных противоопухолевых мини-антител 4D5scFv и фототоксичного белка miniSOG. Показана опосредованная рецептором интернализация иммуноФС 4D5scFvminiSOG и селективная фототоксичность по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека. Впервые изучена возможность доставки УФА1 (340-400 нм) и синего света, возбуждающего флавиновые ФС, к опухолевым клеткам с использованием сочетания адресных флавиновых ФС и апконвертирующих нанофосфо΄ров (НАФ). Впервые показана способность НАФ (донор энергии), характеризующихся УФА1 и синим излучением, передавать энергию возбужденного состояния на фототоксичный белок 4D5scFv-miniSOG (акцептор энергии) по механизму ферстеровского резонансного переноса энергии и вычислен ферстеровский радиус, отделяющий донор от акцептора . Впервые разработан способ адресной доставки НАФ к клеткам аденокарциномы молочной железы человека с помощью адресного полипептида DARPin-mCherry, специфичного к опухолевому рецептору HER2/neu. Впервые показана селективная фотоцитотоксичность адресного ФС НАФ:DARPin-mCherry по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека при облучении ИК-светом. Степень достоверности и апробация работы Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: XI конференция «Лазеры и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и применения» (2014, Шатура); 5th International conference on advanced nanomaterials (2014, Авейру, Португалия); VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (2013, Москва, Россия); Международная молодежная научно-практическая 8 конференция "Биофизика биоэнергетических процессов" (2013, Звенигород, Россия); IV International Symposium «Topical problems of biophotonics – 2013» (2013, Нижний Новгород, Россия); XXIV Зимняя молодежная научная школа ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва, Россия); 16-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (2012, Пущино, Россия). 9 2. Обзор литературы Фотосенсибилизаторы различной природы для фотодинамической терапии рака и их механизмы действия 2.1. Механизмы фотосенсибилизации. Фотофизические и фотохимические характеристики фотосенсибилизаторов ФДТ включает в себя 3 основных фактора: ФС, свет и кислород. Все факторы безопасны сами по себе, но в совокупности обладают цитотоксичностью: в кислородной среде при облучении ФС запускает фотохимическую реакцию с выходом активных форм кислорода (АФК), которые, являясь токсичными, приводят к повреждению клетки. Противоопухолевое действие ФДТ обусловлено тремя взаимосвязанными процессами: прямым токсическим действием АФК на клетки, повреждением сосудов опухоли и запусканием обильной воспалительной реакции, которая способна привести к развитию иммунного ответа. Относительный вклад каждого из этих процессов во многом зависит от типа и дозы ФС, промежутка времени между введением ФС и облучением, дозы и интенсивности облучения, концентрации кислорода в опухоли, а, возможно, и от других, плохо изученных факторов. Однако выбор ФС является наиболее критичным для успешного проведения ФДТ. Как правило, ФС в основном состоянии имеет 2 спаренных электрона с противоположными спинами с суммарным спином S=0 и мультиплетностью, равной 1. Такое состояние называется синглетным, а конфигурация всех электронов на их низшей энергетической орбитали – основным состоянием S0. Поглотив квант света определенной энергии, один из электронов этой пары переходит на более высокую энергетическую орбиталь. В зависимости от энергии, полученной ФС, он переходит в возбужденное синглетное состояние Sx, но сохраняет тот же спин, что и в синглетном состоянии. Такое возбужденное состояние является короткоживущим, и ФС теряет энергию, которая переходит в свет либо в тепло. В возбужденном синглетном состоянии Sx ФС также может запускать процесс так называемой интеркомбинационной конверсии, которая заключается в смене направления спина возбужденного электрона. Это приводит к образованию триплетного состояния ФС (Т*), электроны которого имеют параллельные спины [2]. Именно триплетное возбужденное состояние ФС является фотореакционноспособным., и большинство ФС имеют высокий квантовый выход интеркомбинационной конверсии. Как правило, триплетные состояния характеризуются относительно долгим временем жизни (вплоть до секунд). 10 Находясь в возбужденном триплетном состоянии, ФС может принимать участие в двух типах реакций. В реакциях I типа ФС может передавать электрон (или протон) на кислород или другие близлежащие молекулы, например, на мембрану клетки, формируя анион-радикал или катион-радикал, соответственно (рис. 1, реакции 1-3) [3]. Радикалы с большой вероятностью могут вступать в реакции с кислородом с образованием активных форм кислорода. Зачастую в результате фотохимических реакций I типа путем переноса электрона от ФС на молекулярный −∙ кислород образуется супероксид-анион (О2 ) (рис. 1, реакция 3). В биологических системах О2 −∙ не отличается большой реакционноспособностью, но может в результате реакции, катализируемой SOD, превращаться в перекись водорода (Н2О2), которая легко диффундирует через мембрану клетки (рис. 1, реакция 5). В высоких концентрациях Н2О2 может реагировать с −∙ −∙ О2 , с образованием высокореактивного гидроксильного радикала ОН (реакция Габера-Вейса −∙ (6) на рис. 1). ОН легко диффундирует через мембрану клетки и способен наносить −∙ повреждения далеко за пределами одной клетки. Также ОН может образоваться из супероксид-аниона в результате реакции Фентона в присутствии ионов металлов (железа или меди, рис. 1, реакции 7 и 8) [4]. В реакциях II типа ФС в триплетном состоянии напрямую переносит энергию (не электроны) на молекулярный кислород, который, являясь в основном состоянии триплетным O2(3Σ-g), переходит в возбужденную синглетную форму O2(1Δg или 1O2) (рис. 1, реакция 4). В клетках время жизни 1O2 очень коротко (~ 10-320 нс), что сокращает их диффузию до ~10-55 нм [5, 6]. Поэтому фотодинамическому воздействию подвергаются только те молекулы и структурные элементы клетки, которые оказываются вблизи локализации ФС внутри клетки [5]. Реакции I и II типа могут протекать одновременно и конкурировать между собой в зависимости от природы ФС, его дозы, концентрации кислорода и рН среды [2, 4]. 11 Рисунок 1. Фотохимических реакции в процессе ФДТ. Различные типы первичных и вторичных фотохимических реакций вызывают образование АФК и дозозависимое повреждение клетки. Н2О2 - перекись водорода; O2(1Δg) - синглетный кислород (возбужденное состояние); O2(3Σ-g) −∙ триплетный кислород (основное состояние); О2−∙ - супероксид-анион; ОН - гидроксильный радикал; SOD - супероксиддисмутаза. 2.2. Низкомолекулярные фотосенсибилизаторы Большинство используемых в онкологической практике ФС имеют тетрапиррольную структуру, сходную с протопорфирином гемоглобина. В качестве ФС используют очищенное природное соединение, что позволяет контролировать его качество без лишних затрат на производство, а также гарантирует стабильность вещества при хранении. Первый используемый в лечении рака ФС представлял собой водорастворимую смесь порфиринов, производных гематопорфирина HрD. Их очищенная форма, порфимер натрия, позже стала основой коммерческого препарата Фотофрина. Несмотря на то, что порфимер натрия широко используется и по сей день, он имеет некоторые недостатки: сохранение фоточувствительности кожи в течение длительного времени после отмены препарата и относительно низкая величина поглощения ФС при 630 нм. Исследователями было приложено немало усилий по поиску ФС с улучшенными характеристиками, и было предложено несколько сотен соединений, потенциально пригодных для ФДТ опухолей. В таблице 1 приведены сведения о наиболее перспективных ФС, прошедших клинический контроль (как одобренных, так и испытываемых). На сегодняшний день 5-аминолевулиновая кислота (АЛК), биосинтетический предшественник ФС протопорфирина, нашла множество применений. Так, АЛК или сложные эфиры АЛК могут применяться перорально или местно. Эти вещества являются неактивной 12 формой лекарства, и только в раковых клетках с повышенной активностью 5- аминолевулинатсинтазы преобразуется в активный ФС протопорфирин [7]. Таблица 1. Фотосенсибилизаторы (ФС), используемые в клинической практике (серым цветом выделены ФС, разрешенные к применению в России) [7]. Фотосенсибилизатор Химическое название ФС Длина Список тканей и органов, волны пораженных опухолью, для возбужден лечения которых применяется ФС ия, нм Порфимер натрия Порфирин 630 (Фотофрин) (HPD) Легкие, пищевод, желчный проток, мочевой пузырь, головной мозг, яичники АЛК Предшественник 635 порфирина Сложные эфиры АЛК Предшественник Кожа, мочевой пузырь, головной мозг, пищевод 635 Кожа, мочевой пузырь Темопорфин (Фоскан) Хлорин (mTHPC) 652 Голова и шея, легкие, головной мозг, Вертепорфин Хлорин 690 Глаз, поджелудочная железа, кожа HPPH (производные Хлорин 665 Голова и шея, пищевод, легкие Хлорин 660 Кожа, грудь 660 Печень, толстая кишка, головной мозг Хлорин 660 Носоглотка, головной мозг Фталоцианин 675 Кожа (Т-клеточная лимфома) Padoporfin (TOOKAD) Бактериохлорин 672 Простата Motexafin lutetium 732 Молочная железа порфирина кожа, желчный проток гематопорфирина) SnEt2 (Purlytin) Talaporfin (LS11, MACE, NPe6) Ce6-PVP (Fotolon), Ce6 derivatives (Radachlorin, Photodithazine) Silicon phthalocyanine (Pc4) (Lutex) Таксафирин 13 Важным свойством всех перечисленных низкомолекулярных ФС является их способность неспецифически аккумулироваться в опухоли. Это может быть связано как с повышенной проницаемостью сосудов опухоли и эффектом удерживания (the enhanced permeability and retention effect, EPR-эффект) [8], так и со способностью ФС связываться с липопротеинами низкой плотности (low-density lipoprotein, LDL) и селективно доставляться к опухоли [9]. 2.3. Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG Генетически кодируемые ФС являются новым классом ФС, имеющим белковую природу. На сегодняшний день известно всего два таких белка: KillerRed и miniSOG. Они находят широкое применение в электронной микроскопии, хромофор-ассистируемой световой инактивации (chromophore-assisted light inactivation, CALI) белков и оптогенетике [10]. Использование белков – фотосенсибилизаторов в фотодинамической терапии является новым и перспективным направлением Большим преимуществом белков – фотосенсибилизаторов является возможность их модификации с использованием генно-инженерных методов. В результате становится возможным специфически доставлять модифицированные ФС в различные клеточные компартменты (ядро или лизосомы) либо к различным типам клеток, а также контролировать генерацию АФК как по времени, так и по локализации. Это является основным отличием генетически кодируемых ФС от низкомолекулярных. Генетически кодируемые ФС могут вызывать различные эффекты при облучении, например: предотвращать деление клеток при ядерной локализации [11], вызывать некроз клеток при мембранной локализации [3] или апоптоз при лизосомной локализации [12]. 2.3.1. Получение генетически кодируемого ФС miniSOG На сегодняшний день белковый ФС miniSOG (“mini Singlet Oxygen Generator”) является вторым известным генетически кодируемым ФС после KillerRed. Данный белок был получен в лаборатории Р. Тсиена (R. Tsien) в 2011 году из LOV-домена (light, oxygen, and voltage) фототропина 2 Arabidopsis thaliana (AtPhot2), который отвечает за восприятие синего света [13]. Восприятие синего света обусловлено наличием хромофорной группы флавинмононуклеотида (ФМН) в составе LOV-домена. Под действием синего света ФМН в LOV-домене переходит в возбужденное состояние, энергия которого расходуется на формирование ковалентной связи с 14 цистеином [14]. В результате образуется цистеинил-флавиновый аддукт, который инициирует автофосфорилирование AtPhot2, что определяет роль этого белка как светозависимой протеинкиназы. В темноте ковалентная связь аддукта распадается обратно. Таким образом процесс представляет собой замкнутый фотоцикл [14, 15] (рис. 2). Рисунок 2. Фотохимические и фотофизические превращения хромофорной группы ФМН в составе LOV-домена с образованием цистеинил-флавинового аддукта. Инициируемое светом образование ковалентной связи между цистеином и атомом C(4a) флавина. Энергия фотона синего света обозначена hν, звездочкой обозначено возбужденное синглетное состояние, Т – возбужденное триплетное состояние [4] Чтобы направить энергию возбужденного состояния ФМН на образование синглетного кислорода в последовательности LOV2-домена AtPhot2 была произведена замена Cys426 на Gly c получением мутанта C426G, который лег в основу нового белка miniSOG. MiniSOG имеет 106 а. о., прочно связывается с простетической группой ФМН (KD ~ 170 рM). При индукции экспрессии белка бактериальная клетка поддерживает повышенный уровень синтеза ФМН для того, чтобы miniSOG был насыщен кофактором [13]. Также авторами было показано, что токсичный в условиях освещения белок miniSOG в отсутствие освещения не проявляет токсичности ни на клетках прокариот, ни на клетках эукариот. 2.3.2. Кофактор MiniSOG – производное рибофлавина Флавинмононуклеотид, который включается в состав miniSOG, образуется в клетке из витамина B2, или рибофлавина (Рф) с участием фермента флавокиназы. Далее, в зависимости от нужд клетки, ФМН может преобразовываться в флавинадениндинуклеотид (ФАД) путем 15 присоединения остатка АМФ (рис. 3). Боковая цепь в структуре флавинов играет важную роль в их связывании с флавопротеинами [16], в том числе с miniSOG. Также в связывание большинства флавиновых белков с простетической группой вносят вклад водородные связи, ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса. Формирование вторичных структур происходит с участием укладки Россмана . Рисунок 3. Структура флавиновых производных [6] Основу молекулы рибофлавина составляет изоаллоксазин, в котором сочетаются бензольный, пиразиновый и пиримидиновый циклы и остаток пятиатомного спирта - рибита в положении 10 (рис. 3). Рибофлавин флуоресцирует в желто-зеленой области (λexc ~ 450 нм, λemis 565 нм) с наибольшей интенсивностью при рН 6-8. Рибофлавин стабилен в кислой среде и быстро разрушается в щелочной [17]. Способность рибофлавина легко окисляться и восстанавливаться лежит в основе его биологического действия. Полностью восстановленная форма Рф (два электрона в положениях N(1) и N(5)) не способна к флуоресценции и практически не поглощает видимый свет (рис. 4). 16 Рисунок 4. Спектр поглощения ФМН в окисленной и восстановленной формах. Как и любой ФС, рибофлавин, находясь в возбужденном триплетном состоянии, может вступать в реакции I типа с образованием радикалов кислорода и в реакции II типа с образованием синглетного кислорода по конкурентному механизму. Исход зависит только от микроокружения молекулы - растворителя [18], концентрации кислорода [19] и самого ФС в среде. Так, Crozier-Reabe и соавт. было показано, что при высокой концентрации О2 в среде рибофлавин может служить более эффективным продуцентом синглетного кислорода по сравнению с экзогенным ФС - порфирином, используемым в ФДТ [20]. Данный результат имеет критическое значение для сравнения экспериментов in vitro (парциальное давление кислорода, рО2 ~ 150 мм рт. ст.) и in vivo (рО2 < 20 мм рт. ст.) [20] В условиях хорошей аэрации (концентрация кислорода ~ 280 мкМ) при облучении УФА1 светом Рф эффективно продуцирует синглетный кислород с квантовым выходом ΦΔ= 0.54. При низкой концентрации кислорода (менее 2 мкМ) выход 1O2 уменьшается до ΦΔ< 0.2. Данный результат особенно важно принимать во внимание при исследовании всех эндогенных ФС, поскольку концентрация кислорода внутри клетки составляет не более 7.5 мкМ [21]. Это означает, что, находясь внутри клетки, ФС не способен к продуцировать максимально возможного количества 1O2. В то же время понижение концентрации кислорода может способствовать увеличению образования АФК (I тип реакций). Это предположение подтверждается результатами, полученными на культурах клеток, где авторы показали высокую цитотоксичность Рф для клеток, облученных в условиях гипоксии, в то время как для клеток, облученных в условиях хорошей аэрации, Рф оказался гораздо менее цитотоксичным [22]. Данный результат был зарегистрирован только при использовании низких доз облучения (до 5 кДж/ м2). Авторы объяснили эффект тем, что цитотоксичность обусловлена образованием не синглетного кислорода, а перекиси водорода. 17 2.3.3. Физико-химические характеристики MiniSOG MiniSOG, полученный генно-инженерным способом, имеет молекулярную массу 15.3 кДа, близкую к теоретической, и не склонен к олигомеризации. Как и все флавопротеины, miniSOG при возбуждении синим светом флуоресцирует в зеленой области спектра. Максимум поглощения белка приходится на λ=448 нм с плечом при λ=473 нм, а коэффициенты экстинкции при этих значениях составляют (16.7±0.7)×103 и (13.6±0.5)×103 M-1см-1, соответственно. Максимумы испускания белка находятся в области 500 и 528 нм, а квантовый выход флуоресценции ΦΔ составляет 0.30[13]. Авторами [13] было продемонстрировано, что гибридные белки, состоящие из miniSOG и различных сигналов локализации, надлежащим образом локализуются как в культурах клеток млекопитающих, так и в живых объектах (нематодах, грызунах). Способность miniSOG к продуцированию синглетного кислорода используется для локального преобразования диаминобензидина в осмиофильный осадок, который детектируется в клетке при высоком разрешении. Таким образом, miniSOG позволяет использовать приемы флуоресцентной корреляционной спектроскопии и электронной микроскопии для анализа больших объемов ткани, фиксированной альдегидом, не прибегая к использованию эндогенных лигандов, красителей и детергентов для пермеабилизации. Также авторами [13] было показано, что miniSOG позволяет получать снимки высокого разрешения и информацию о локализации того или иного белка в трехмерном формате. Например, с использованием электронной микроскопии было показано, что близкородственные молекулы клеточной адгезии SynCAM1 и SynCAM2, при раздельном связывании с miniSOG, локализуются преимущественно на пресинаптической и постсинаптической мембранах, соответственно. В то же время локализация данной молекулы клеточной адгезии с использованием антител против SynCAM1 была затруднена [23]. В работе авторов [13] было показано, что при облучении miniSOG способен продуцировать синглетный кислород с квантовым выходом ΦΔ=0.47 ± 0.05 [13], что близко к значению для свободного ФМН (0.51 ±0.07) [20]. В качестве сенсора для измерения данного показателя белка авторы использовали антрацен-9,10-дипропионовую кислоту (ADPA), а в качестве стандарта раствор ФМН. Позже, в 2013 году, группа физиков под руководством C. Flors исследовала кинетику образования и испускания 1О2 в ближней ИК области спектра при λ=1275 нм и показала, что ΦΔ образования синглетного кислорода miniSOG значительно ниже заявленного ранее и составляет 0,03 [24]. То же значение было показано с применением мочевой кислоты в качестве сенсора синглетного кислорода. Примечательно, что проведение 18 эксперимента в дейтериевом PBS (dPBS) не привело к увеличению квантового выхода 1О2, а в случае применения ADPA в качестве сенсора, более того, привело к его снижению (Таблица 2). Таблица 2 Определение квантового выхода синглетного кислорода у белка miniSOG с применением различных методик [24] Способ определения ΦΔ синглетного кислорода PBS dPBS Люминесценция 0.03±0.01 0.03±0.01 Мочевая кислота 0.03±0.01 0.03±0.01 ADPA 0.42±0.02 0.18±0.02 Известно, что флавины способны к переносу энергии не только на 1О2, но и на другие подходящие доноры электронов. Поэтому, в свете полученных результатов, авторы [24] сделали заключение, что помимо образования 1О2 miniSOG способен окислять субстраты под действием света также по I типу фотоокислительных реакций. На рис. 5 представлена структура белка miniSOG, где зеленым цветом обозначены мутации в LOV-домене фототропина 2, специфичные для miniSOG. Рисунок 5. Молекула ФМН (показана красным цветом) в окружении белка miniSOG [25]. Установлено, что образование синглетного кислорода в результате фотореакций протекает в 3 стадии: 1) под действием света из возбужденного синглетного состояния ФС переходит в триплетное состояние, 2) происходит соударение ФС в триплетном состоянии с молекулой кислорода, после чего 3) происходит передача энергии на кислород [26]. В miniSOG некоторые аминокислоты способны выступать акцепторами энергии возбужденного состояния 19 ФМН, влияя тем самым на квантовый выход 1О2, либо «тушить» молекулы 1О2 еще до того, как они диффундируют в раствор [25]. Тушителями 1О2 в белке могут выступать триптофан, гистидин, тирозин, метионин, а также гистидиновый фрагмент рекомбинантного белка. Авторами было показано также, что спектры поглощения и испускания очищенного препарата miniSOG в PBS слегка сдвинуты в синюю область по сравнению с ФМН и имеют вибронную структуру, т.е. характеризуются появлением вторичных пиков на фоне широких полос кривых поглощения, что указывает на прочную связь хромофора с белком (рис. 6) [24]. Рисунок 6. Спектральные характеристики растворов ФМН (синяя кривая) и miniSOG (красная кривая). Сплошной линией обозначены спектры поглощения, пунктиром – нормированные спектры флуоресценции при λexc = 450 нм [24] Позже другим коллективом авторов было проведено комплексное исследование типов фотохимических реакций, в которых принимает участие возбужденная молекула miniSOG [25]. В результате авторы, во-первых, подтвердили факт того, что фотохимические реакции с участием miniSOG протекают по первому типу, а во-вторых, показали, что в результате этих реакций образуется супероксиданион (O2-), из которого может образовываться H2O2. H2O2 в свою очередь диффундирует наружу белка и провоцирует запуск окислительных реакций в клетке, оказывая влияние на ее жизнеспособность. Наконец, для сохранения аббревиатуры miniSOG (mini Singlet Oxygen Generator) авторы [5] предложили переименовать его в mini Super Oxide Generator. 2.4. Механизм клеточной гибели при воздействии ФС на клетки В клетках время жизни 1O2 очень коротко (~ 10-320 нс), что сокращает их диффузию до ~10-55 нм [27]. Таким образом, фотодинамическое повреждение возникает только вблизи мест локализации ФС внутри клетки [28]. Например, порфимер натрия является смесью эфиров, которые способны локализоваться в разных компартментах клетки, однако чаще всего они 20 связываются с липидами мембраны. Другой активно используемый ФС - моно-L-аспирил хлорин е6 (NPe6, талапорфин), воздействует на лизосомы; остатки бензопорфирина (BPD) – на митохондрии; фталоцианин Pc4, имеющий широкий спектр аффинности, также действует в первую очередь на митохондрии [29]. Также существуют агенты, которые имеют несколько мишеней. Специфические пути локализации также могут варьировать в зависимости от различных типов клеток. Выбор мишени в клетке для фотодинамического воздействия может играть определяющую роль в запуске того или иного пути клеточной гибели. Известно, что в результате ФДТ могут запускаться три основных пути клеточной гибели: апоптотоз, некроз и реже аутофагия. Существуют данные, свидетельствующие о том, что гибель клеток путем некроза в результате облучения играют большую роль в стимуляции иммунитета при ФДТ [30]. Другие результаты свидетельствуют о том, что ФС, вызывающие апоптоз и меньшее воспаление, хорошо подходят для лечения опухолей головного мозга, где отек ткани недопустим. Хотя существуют доказательства того, что некоторые механизмы ФДТопосредованного апоптоза высоко иммуногенны и способны запускать не меньший противоопухолевый иммунный ответ, чем некроз [31]. Обычно в клинической практике между введением препарата ФС и облучением оставляют большой промежуток времени, чтобы ФС успел диффундировать из нормальных тканей. Однако в некоторых случаях при проведении облучения до того, как ФС полностью вывелся из стромы опухоли ремиссия опухоли происходит более качественно. Подобный эффект обусловлен повреждением кровеносных сосудов, что в результате провоцирует ишемический некроз всей опухоли. 2.4.1. Апоптоз Апоптоз является первым этапом программируемой клеточной гибели и играет важную роль во многих физиологических и патологических процессах, в связи с чем всегда был объектом подробного изучения [32]. Нарушение апоптотических процессов лежит в основе патогенеза многих болезней, например рака и дегенеративных заболеваниий [33]. На сегодняшний день существует немало работ, описывающих механизмы, посредством которых в процессе апоптоза активируются различные сигнальные пути в гибнущих клетках. Принято выделять два самостоятельных, но пересекающихся сигнальных пути апоптоза: 1) внутренний путь (митохондриальный, или собственный сигнальный путь) и 2) внешний путь (сигнальный путь через рецепторы клеточной гибели) [34]. Компоненты апоптотического пути являются потенциальными мишенями ФДТ и других типов терапии рака. Известно, что ФДТ способна запускать различные апоптотические пути [35, 36] в зависимости от внутриклеточной 21 локализации ФС (Рисунок 7). Благодаря способности быстро вызывать апоптоз ФДТ нашла широкое применение в лечении рака. Лиганд (FasL или TNF-α) Внешний путь Рецептор клеточной гибели FADD DISC катепсины PS Стресс ЭПР Са 2+ ЛИЗОСОМА АПОПТОСОМА Bid Apaf-1 PS tBi d ЦИТОХРОМ С PS Casp-9 АПОПТОЗ МОМР МИТОХОНДРИЯ Casp-3 Bcl-2/Bcl-xL ВН-3 белки IAPs Smac/DIABLO Внутренний путь Рисунок 7. Пересечение внешнего и внутреннего путей апоптоза, запускаемого при облучении ФС в различных компартментах клетки. Активированный светом фотосенсибилизатор обозначен как PS. 2.4.1.1. Основные пути внутренней передачи сигнала в ответ на ФДТ Апоптотический ответ на ФДТ, как правило, инициируется внутренними факторами, определяющую роль среди которых играют митохондрии. Такой путь апоптоза индуцируется различными агентами: сигналами, связанными с клеточным развитием или окружающими условиями, клеточным стрессом, повреждением ДНК, тепловым шоком, истощением питательных веществ и цитотоксическим фактором [37]. Ключевым событием во внутреннем пути передачи является выход белков апоптоза из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль; к таким белкам относятся цитохром С, вторичный митохондриальный активатор каспаз/ прямой ингибитор апоптозного связывающего белка с низким pI (Smac/DIABLO), белок HtrA2, также известный как Omi, фактор индукции апоптоза (AIF) и эндонуклеаза G (EndoG) 22 [38]. В цитозоле холоцитохром с (цитохром с, содержащий группу гема) связывается с фактором, активирующим апоптотические протеазы 1 (Apaf-1), формируя гептамерный комплекс (апоптосому). Затем с комплексом связываются каспазы-9, что приводит к их димеризации и активации. После активации каспаза-9 расщепляет и активирует эффекторные каспазы (например, каспазу 3 и каспазу 7) и запускает апоптоз [39]. Одновременно с высвобождением цитохрома с, Smac/DIABLO и Omi/HtrA2 выходят в цитозоль, где стимулируют апоптоз различных белковых ингибиторов апоптоза (IAPs), что приводит к активации каспаз. С другой стороны AIF и EndoG индуцируют апоптоз путем механизма, который не требует активации каспаз. Они перемещаются из митохондрий в ядро, где служат связующим звеном конденсации хроматина и фрагментации высокомолекулярной ДНК, независимо от каскада каспаз. Как правило, эти события сопровождаются изменением проницаемости внешней митохондриальной мембраны (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP), что ведет к падению мембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) [40]. Целостность митохондриальной мембраны регулируется белками семейства В-клеточной лимфомы 2 (Bcl-2). Эти белки являются основными регуляторами апоптоза и делятся на 3 подсемейства [41]. Они включают антиапоптотические белки (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, A1 и Mcl-1), проапоптотические «мультидоменные» белки (Bax и Bak), которые также обозначаются ВН-1, 2, -3, так как они содержат домены ВН1-3, и проапоптотические ВН-3 (Bid и Bim) белки, содержащие только домен ВН-3. Антиапоптотические белки Bcl-2 содержат домен ВН-4 и предотвращают повышение МОМР, в то время как проапоптотические Bcl-2 не содержат этот домен и повышают МОМР. Белки Bid и Bim, содержащие только домен ВН-3, способствуют апоптозу путем прямого связывания и ингибирования антиапоптотических белков Bcl-2 или путем прямой активации Bax и/или Bak. Предача сигнала к апоптозу начинается с изменения конформации Bax и Bak, встраивания во внешнюю мембрану митохондрий и гомоолигомеризации Bax и Bak [41]. Эти олигомеры собираются на внешней мембране митохондрий, что, по-видимому, приводит к выходу из межмембранного пространства митохондрий апоптотических белков, которые активируют каспазы [42]. На сегодняшний день показано, что в индуцируемый фотодинамической терапией апоптоз вовлечены и проапоптотические и антиапоптотические белки семейства Bcl-2 [43, 44, 45]. Антиапоптотические белки особенно чувствительны к фотоповреждению, которое действует на ЭПР и митохондрии. Так, на нескольких линиях раковых клеточных было показано, что воздействие фотосенсибилизатора фталоцианина Рс4, который связывается с мембранами митохондрий и ЭПР, вызывает повреждение структуры Bcl-2 и Bcl-xL [46]. ФДТ с 23 использованием Рс4 уменьшает уровень Bcl-2, вызывая активацию каспазы-3 и расщепление поли(АДФ-рибоза)полимеразы. С другой стороны, на клеточной линии человека MCF-7c3 было показано, что аналог Рс4, который преимущественно связывается с лизосомами, вызывает гораздо меньшее фотоповреждение Bcl-2 [47]. В работе Маршала и др. исследовалось влияние на Bcl-2 ФC Фоскана, который локализуется преимущественно на ЭПР, и было обнаружено, что ФС не повреждает Bcl-2 в митохондриальной фракции, а только в тотальном клеточном лизате [48]. Также, уменьшение Bcl-2 на поверхности ЭПР и уменьшение объема митохондрий наблюдалось после ФДТ с использованием ФС Порфицена, который преимущественно локализуется на ЭПР [49]. Приведенные результаты доказывают, что белки Bcl-2 находятся на ЭПР и митохондриях, и могут использоваться в качестве мишени для ФС. Важную роль в антиапоптотическом ответе на ФДТ играет другой антиапоптотический белок семейства Bcl-2 белок миелоидной лейкемии-1 (Mcl-1). На нескольких линиях раковых клеток было показано, что Mcl-1 способен расщепляться под фотоиндуцируемым воздействием Pc4 и запускать апоптотический ответ в зависимости от типа клеток [50, 51]. Таким образом, антиапоптотические белки семейства Bcl-2 могут служить мишенью ФДТ и функционировать в качестве основного медиатора индуцируемых ФДТ апоптотических путей. В то же время, было показано, что гиперэкспрессия Bcl-2 усиливает апоптотический ответ на ФДТ [52]. Причиной тому может быть селективное разрушение Bcl-2 и возрастание уровня Bax в результате ФДТ. Это указывает на то, что баланс между проапоптотическими и антиапоптотическими белками Bcl-2 играет важную роль в апоптозе , индуцируемом ФДТ. Как было показано ранее, такие проапоптотические белки семейства Bcl-2, как Bax и Bak, активируют МОМР, чтобы вывести в цитозоль апоптогенные белки [53]. Так, для изучения роли Bax в ФДТ-индуцируемом апоптозе Усуда и др. был поставлен эксперимент на двух клеточных линиях: MCF-7c3 (клетки рака груди человека MCF-7 со стабильной трансфекцией прокаспазы-3) и DU-145 (клетки рака простаты человека, в которых Bax не экспрессируется). Выход цитохрома и ядерная фрагментация в результате ФДТ с Рс4 наблюдались только в клетках MCF-7c3, что указывает на участие Вах в этом событии [54]. Этот результат также был подтвержден с использованием линии клеток рака простаты человека HCT116 с нокаутированным и функционирующим Вах [55]. На модели клеток с функционирующим Вах в результате потери ΔΨm наблюдался выход цитохрома с из митохондрий, что является предвестником ФДТ-индуцированного апоптоза. С другой стороны, на клетках HCT116 с нокаутированным Вах запускался альтернативный механизм каспаз-зависимого апоптоза, что характеризовалось обширной деградацией хроматина и ДНК в отсутствие выхода цитохрома с. 24 В ЭПР и митохондриях Bax и Bak являются основными посредниками в цепи передачи апоптотических сигналов [56]. Так, использование ФС гиперицина на клетках с двойным нокаутом Bax и Bak не приводит к апоптозу, вызванному истощением кальциевых депо в ЭПР [57]. Несмотря на отсутствие Bax и Bak, эти клетки остаются чувствительными к ФДТ и погибают в основном путем аутофагии [58]. Объединяя все вышесказанное, можно утверждать, что белки семейства Bcl-2, в особенности Вах, являются ключевыми медиаторами внутреннего пути апоптоза, запускаемого ФДТ. 2.4.1.2. ФДТ-индуцируемый внутренний путь гибели клеток, независимый от каспаз Семейство каспаз, цистеинсодержащих специфических протеаз, играет ключевую роль в запуске и реализации апоптоза. Это свойство обусловлено способностью расщеплять различные клеточные субстраты, что приводит к превращению погибшей клетки во фрагменты, окруженные мембранами, которые захватываются окружающими клетками. Практически во всех гипотезах, описывающих механизмы апоптотической гибели, сигнальные пути сходятся на активации каспаз [59, 60]. И, тем не менее, при митохондриальном пути апоптоза клетки погибают, даже если блокируется активация каспаз или если эти протеазы разрушаются [61,62]. Не смотря на то, что ФДТ в первую очередь активирует «каспазо-зависимый» апоптотический путь, механизм, ответственный за фотоокислительную гибель клеток, также может задействовать «каспазо-независимый» апоптоз. В зависимости от типа клеток и природы ФС, а также от попавших в цитозоль митохондриальных апоптогенных белков, активируется тот или иной сигнальный каскад. К числу таких белков относятся ДНКаза, AIF, EndoG и Omi. Все они при гиперэкспрессии в клетке способны запускать ее гибель [63, 64, 65]. AIF- это флавопротеин, заякоренный в межмембранном пространстве митохондрий [66, 67]. Во время индукции апоптоза AIF перемещаются из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль и впоследствии достигает ядра [68]. Там AIF индуцирует конденсацию периферических участков хроматина и фрагментацию ДНК «каспазо-независимым» путем [69]. Активность AIF инициируется оксидативным стрессом, Са2+, гипоксией, нарушением функций ЭПР [70-72]. К примеру, ФДТ с использованием ФС гексаминолевулината на клетках лимфобластической лейкемии Reh приводит к перемещению AIF в ядро и, как следствие, к фрагментации высокомолекулярной ДНК, в то время как высвобождения цитохрома с и запуска сигнального каскада AIF не вызывает [73]. Тот же самый эффект наблюдался на клетках MCF7c3 под воздействием фотосенсибилизатора PolI - производного фталоцианина [74]. Таким образом, в отсутствие каспаз AIF запускает резервный механизм клеточной гибели [75]. Существует несколько работ, в которых описывается способность ФДТ индуцировать выход как цитохрома с, так и AIF, что обуславливает возможность атаковать различные клетки 25 [76, 77]. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе индукции обоих сигнальных путей под воздействием ФДТ, еще не до конца изучены. Попытка объяснить механизмы одновременного выхода цитохрома с и AIF под воздействием ФДТ была предпринята Йю и др. Они предположили, что гибель клеток, зависимая от каспаз и AIF, в результате ФДТ с использованием DH-II-24 запускается трансглютаминаза-2-зависимым механизмом, включающим активацию калпаина и перемещением Вах (Рисунок 8) [78]. Свет PS АФК ЭПР TG2 Свет истощение Са2+ депо в ЭПР АФК PS МИТОХОНДРИЯ МОМР AIF ЦИТОХРОМ С Фрагментация ДНК Рисунок 8. Внутренний путь ФДТ-индуцируемого апоптоза. Вышеперечисленные результаты свидетельствуют о том, что ФДТ активирует каспазозависимые механизмы, но в то же время способна запускать каспазо-независимые механизмы в отсутствие каспаз, или запускать оба сигнальных пути одновременно. Тем не менее, эти механизмы не относятся ко всем типам клеток и условиям ФДТ, и это доказывает, что механизмы ФДТ-индуцируемой клеточной гибели зависят от множества факторов. 2.4.1.3. Смена внешнего сигнального пути внутренним при ФДТ Внешний путь, или путь с участием рецепторов клеточной гибели запускается c участием специфического лиганда суперсемейства фактора некроза опухоли (TNF), включающего Fas лиганды [FasL] или TNF-α. Лиганды связываются с рецепторами семейства 26 TNF (Fas или TNF рецептор-1 [TNFR1] или CD95), которые характеризуются наличием домена смерти, расположенного внутри клетки. Он служит для образования комплекса, индуцирующего клеточную гибель (DISC), путем задействования адаптерных молекул, таких как FADD, который отвечает за сборку и активацию каспазы-8. Существует несколько работ, выполненных на разных клеточных линиях, в которых описывается индукция апоптоза (включая передачу сигнала с участием рецепторов клеточной гибели), вызванная ФДТ с использованием ФС, в первую очередь гиперицина [79, 80, 81]. Но следует отметить, что внешний путь не играет ключевой роли в апоптозе, индуцируемом ФДТ. Повышенная экспрессия рецептора клеточной гибели Fas наблюдалась при различных условиях проведения ФДТ in vitro и in vivo [80, 82, 83]. Было показано, что использование Pc4 в ФДТ приводит к мультимеризации Fas и последующему сближению белков FADD и активации каспазы-8, что является доказательством участия рецептора клеточной гибели в апоптозе [84]. На моделях клеток карциномы носоглотки и рака толстой кишки было показано, что гиперицин и кальфостин при фотовозбуждении увеличивают количество белков Fas и/или FasL, которые участвуют во внешнем сигнальном пути апоптоза. В этих экспериментах также наблюдалась потеря ΔΨm и выход цитохрома с из митохондрий [85, 86], и это демонстрирует, что внешний сигнальный путь сменяется внутренним сигнальным путем. На других клеточных линиях ФДТ с использованием разных ФС приводит к образованию укороченных форм Bid, которые функционируют как молекулярные линкеры между внешним и внутренним путями. Тем не менее, укорочение Bid обычно запускается ФС, нацеленными на лизосомы. Следовательно, смена внешнего пути внутренним не является первичным ответом на ФДТ, так как Bid может подвергаться действию лизосомальных протеаз (катепсинов) [87-89]. 2.4.1.4. Внутренний путь передачи сигнала в ответ на ФДТ (лизосомальное повреждение) Существует несколько работ, в которых на раковых клетках исследовалось влияние ФДТ с использованием ФС, нацеленных на лизосомы (80). Например, ФС NPe6 накапливается в лизосомах и запускает апоптоз посредством митохондрий, что включает в себя расщепление Bid, выход цитохрома с из митохондрий и активацию каспаз-9 и -3 [90]. По-видимому, в данном случае Bid расщеплялся протеазами, попавшими в цитозоль в результате разрыва мембран лизосом [91]. Другим примером является использование ФС лизосомальной локализации ATXs10. Апоптоз, вызванный его действием, характеризовался фотоповреждением Bcl-2, которой преимущественно находится на мембране митохондрий. Эти процессы протекают медленнее, чем в случае ФДТ с использованием Pc 4 - ФС, нацеленного на митохондрии, поэтому можно предположить, что индукция апоптоза на клетках MCF-7c3 фотосенсибилизатором ATX-s10 вызвана катепсинами (а именно, катепсином В и D) [92]. В более позднем исследовании на 27 клетках аденокарциномы легкого ASTC-a-1 была предпринята попытка блокировать апоптоз малыми интерферирующими РНК против Bid, и таким образом было показано, что в результате фотодинамической терапии с ФС NPe6 задействуется именно Bid. [93]. Еще в одном исследовании проводилось сравнение двух ФС: Рс 4, который связывается с митохондриями, и его аналога Рс 181, который преимущественно связывается с лизосомами. Для Рс 181 было показано более эффективное проникновение в клетки MCF-7 и большая цитотоксичность под воздействием ФДТ. Таким образом, Bid связывает два процесса: фотоповреждение лизосом и активацию внутреннего пути апоптоза [94]. На клетках эпидермоидной карциномы человека A431 было показано, что ФДТ с Рс 181 в присутствии бафиломицина, ингибитора вакуолярной протонной помпы, ведет к клеточной гибели, запускаемой митохондриями через лизосомы [95]. 2.4.2. Аутофагия На современном этапе изучения механизмов индуцируемой ФДТ клеточной гибели аутофагия признана альтернативным путем [80, 96-98] Аутофагия является консервативным механизмом переработки клеточного содержимого и играет важную роль в развитии и гомеостазе. Так, аутофагия запускается в период истощения питательных запасов клеткой и обеспечивает вещества для синтеза белков, а также она служит для деградации не связавшихся или агрегированных белков и поврежденных органелл (ЭПР и митохондрий). Помимо участия в физиологических процессах клетки, аутофагия играет роль в развитии нейродегенеративных заболеваний и в онкологии [99]. Отличительной особенностью аутофагии является наличие аутофагосом - везикул, заключенных в двойную мембрану [100, 101], которые отличаются от везикул эндосом, лизосом и апоптотических пузырьков [102]. Формирование аутофагосом происходит в начальной фазе аутофагии в области сборки фагофора путем элонгации и слияния двойных мембран (фагофор) [103], произошедших из ЭПР [104], внешней мембраны митохондрий [105], и плазматической мембраны [106]. Образовавшиеся аутофагосомы сливаются с лизосомами и образуют аутолизосомы, в которых происходит деградация компонентов клетки и органелл лизосомальными ферментами [107, 108]. Эти процессы контролируются многочисленными белками Atg-семейства (autophagosome-related proteins) [109] и являются атрибутом макроаутофагии, наиболее изученным типом аутофагии. Аутофагия также считается защитным механизмом, который способствует выживанию клетки в неблагоприятных условиях. Поэтому, роль аутофагии в процессе клеточной гибели остается спорной. Отличительную роль аутофагия играет в прогрессии опухоли. Под воздействием внутреннего метаболического стресса аутофагия может запускать прогрессию новообразования 28 за счет активной переработки метаболитов и поставки питательных веществ и энергии [110]. Также, аутофагия способна защищать раковые клетки от радиотерапии, химиотерапии и некоторых видов направленной терапии рака [111, 112]. Тем не менее, неумеренная или ослабленная аутофагия может в конечном итоге привести к клеточной гибели ввиду массовой деградации цитоплазматического материала. С другой стороны, аутофагия может усиливать цитотоксичность противораковых препаратов и на сегодняшний день является потенциальной мишенью в противораковой терапии [113-116]. Активация аутофагии в ответ на ФДТ была показана на примере Baх-дефицитных клеток простаты DU145. С использованием электронного микроскопа авторы работы наблюдали формирование везикул, а также преобразование маркера аутофагии LC-I в LC-II [117]. Однако ингибирование фосфоинозитид-3-киназы, необходимой для формирования аутофагосом, блокировало образование аутофагосом. Полученные результаты указывают на то, что аутофагия при ФДТ индуцируется независимо от Вах (Рисунок 9). Также, на разных клеточных линиях и с использование различных ФС независимыми исследовательскими группами было показано, что очень часто аутофагия запускается параллельно с апоптозом. Однако динамика развития каждого из механизмов гибели клетки в ответ на ФДТ зависит от типа клеток, природы ФС и дозы облучения. 29 Bax/Bak Свет PS АФК Свет Свет АФК PS PS PS Bcl-2/Bcl-xL Свет истощение Са2+ депо в ЭПР АУТОФАГОСОМА Гибель клеток путем автофагии Рисунок 9. Индукция аутофагии в результате вызванного ФДТ повреждения органелл. Окислительное повреждение митохондрий, ЭПР и лизосом запускает аутофагию как механизм гибели клетки или как механизм выживания. В клетках, дефицитных по проапоптотическому мультидоменному белку Вах/Вак (т.е. в клетках, не способных к апоптозу), ФДТ вызывает аутофагию. Также к аутофагии может привести фотоповреждение антиапоптотических белков Bcl-2/Bcl-xL. 2.4.3. Некроз Некроз – это неконтролируемая катастрофическая гибель клетки, которая обычно рассматривается как многоступенчатый, неуправляемый, саморазвивающийся процесс, не поддающийся фармакологической коррекции. Как правило, некроз возникает в результате биоэнергетических нарушений в метаболизме, которые сопровождаются стремительным истощением запасов АТФ в клетке [118-120] Если клетка погибает путем некроза, сначала происходит ее набухание, а также набухание ее органелл, после чего плазматическая мембрана повреждается и содержимое цитозоля «выливается» в межклеточное пространство. Это позволяет отличить некротическую клетку от нормальной по морфологическим признакам. В частности, в клетке происходит падение ионных градиентов, ионы кальция выходят в цитозоль, после чего происходит 30 активация кальций-зависимых фосфолипаз, протеиназ и нуклеаз. Происходит инактивация ферментов, торможение биосинтетических процессов и снижение общего уровня метаболизма. Для поддержания клеточной энергетики одновременно активируется гликолиз, но после исчерпания запасов гликогена производство АТФ быстро падает. Также происходит разрушение цитоскелета, что вызывает округление клетки. Перечисленные повреждения взаимно усиливают друг друга и происходят необратимо. В отличие от некроза и аутофагии, на начальном этапе апоптоза содержимое цитозоля надежно изолировано неповрежденной мембраной, а в дальнейшем фагоцитирутся макрофагами. Некроз способен вызывать резкую воспалительную реакцию на уровне целого организма, усиливать действие иммунной системы и привлекать лейкоциты в место опухоли, тем самым осуществляя презентацию антигена. Это свойство может быть полезным для достижения окончательного результата ФДТ [121]. Следует отметить, что в отличие от апоптоза, некроз невозможно детектировать биохимическими маркерами. Единственным надежным показателем некроза является нарушение проницаемости, а затем и целостности плазматической мембраны. О нем можно судить по высвобождению из клетки витальных красителей или некоторых цитоплазматических ферментов, а также по входу в клетку красителей, например йодида пропидия. Однако следует иметь ввиду, что эти особенности могут быть свойственны и клеткамв поздних стадиях апоптоза. Поэтому для доказательства некроза необходима характеристика различных параметров клетки, исключающих вклад других типов гибели клетки. Например, может быть измерена активность каспаз и изучена фрагментация ДНК, для того, чтобы исключить возможность апоптоза. Вопрос о том, как именно повреждаются клеточные мембраны при некрозе, на сегодняшний день остается открытым. Существует 5 основных гипотез, описывающих данный механизм [122]: 1) перекисное окисление липидов под влиянием АФК с последующим образованием дефектов мембранных пор; 2) повреждение мембранных белков в результате окисления аминокислот, образования липид-белковых, внутри- или межбелковых сшивок, которое приводит к инактивации мембранных белков, нарушению межклеточных взаимодействий и ионного гомеостаза; 3) протеолитическое разрушение внутриклеточных доменов мембранных белков активированными протеазами, например, катепсинами и кальпаинами; 4) ферментативное разрушение мембранных липидов фосфолипазами, среди которых выделяют фосфолипазы А2, С и D; 5) повреждения цитоскелета, вызывающие изменение формы напряжения и разрывы мембран, связанных с цитоскелетом. клетки, локальные 31 Некроз может неспецифически запускаться разными повреждающими факторами: осмотическим лизисом, активными формами кислорода (АФК) и факторами, вызывающими повышение уровня ионов Ca2+ в цитозоле. Однако существуют исследования, которые свидетельствуют о том, что некроз может запускаться и в результате особых механизмов, например, в результате передачи сигнала от таких белков как RIP1, циклоспорин Д, и даже фактора индукции апоптоза AIF [123]. При ФДТ, как правило, некроз индуцируется в случае немитохондриальной локализации ФС, высокой дозы ФС, недостатка глюкозы. Также в некоторых типах клеток может запускаться преимущественно некроз , а не апоптоз и аутофагия. Так как АФК, образуемые при ФДТ, имеют короткий реакционный радиус, механизм гибели клетки в большей степени зависит от места в клетке, в котором произошла фотохимическая реакция, а значит от внутриклеточной локализации ФС. Время инкубации клеток с ФС считается одним из основных параметров, влияющих на механизм гибели клетки в ответ на ФДТ. Например, двухчасовая инкубация клеток с фталоцианином цинка (ZnPc) с последующим облучением приводит к повреждению мембраны клетки и истощению внутриклеточного АТФ, в то время как при инкубации клеток в течение 24 ч авторы наблюдали апоптоз [124]. Баланс между апоптозом и некрозом при ФДТ зависит от дозы ФС и света, концентрации кислорода, типа клеток, а также от внутриклеточной локализации ФС. Чаще всего некрозу способствуют высокая доза ФС и облучения, так как это приводит к повышению количества АФК и Са2+ в клетке и к истощению запасов АТФ. На примере клеток мочевого пузыря было показано, что ФДТ с использованием низких концентраций ФС хлориновой природы DHII-24 в сочетании с низкой дозой облучения запускает апоптоз, в то время как высокие дозы ФДТ приводят к некрозу за счет увеличения уровня Ca2+ в цитозоле. При подборе специфическую условий проведения чувствительность ФДТ важно используемого типа принимать клеток во к внимание также фотодинамическому воздействию. 2.5. Механизмы клеточной защиты Существует несколько работ, описывающих цитопротекторные механизмы, запускаемые раковыми клетками с целью избегания цитотоксического действия ФДТ [80]. Большое разнообразие антиоксидантных молекул, экспрессируемых в раковых клетках, было первым из описанных механизмов [125]. В раковых клетках были обнаружены в различных количествах и водорастворимые антиоксиданты (некоторые аминокислоты, глутатион (GSH), или витамин С) 32 и жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е), что объясняет большие различия в чувствительности клеток к ФДТ [126]. Второй механизм связан с экспрессией в раковых клетках ферментов, которые могут устранить АФК. Хотя специального клеточного фермента, который может напрямую обезвредить синглетный кислород, не существует, а на цитотоксичность ФДТ могут повлиять ферменты, участвующие в других типах метаболизма АФК. Например, было показано, что гиперэкспрессия супероксиддисмутазы (SOD) или обработка миметиками SOD препятствует цитотоксическому действию ФДТ [127]. Увеличение активности SOD было показано в различных типах раковых клеток, подвергнутых фотодинамическому воздействию, и это было связано с уменьшением глутатионпероксидазной и каталазной активности [128]. Белки, чьи кодирующие гены сами по себе индуцируются ФДТ, составляют третий цитопротекторный механизм. Можно выделить несколько категорий, но большинство из этих белков являются частью сигнального пути, запускаемого ФДТ и регулирующего апоптоз, или принимающих участие в восстановлении повреждений, индуцируемых оксидативным стрессом. Увеличение склонности раковых клеток к апоптозу, индуцируемому ФДТ, может обуславливаться ингибированием NF-jB путем гиперэкспрессии супер-репрессора IjBa или путем использования фармакологических ингибиторов [129]. Другими индуцируемыми ФДТ транскрипционными факторами являются белок-активатор 1 АР-1, индуцируемый гипоксией фактор HIF, или ядерный фактор 2 Nrf2. Было показано, что ФДТ увеличивает экспрессию оксигеназы гема HO-1, и этот механизм зависит от внутриядерного содержания Nrf2, а также от содержания митоген-активируемой протеинкиназы р38 (р38МАРК) и от активности фосфоинозитол 3-киназы PI3K. Так как НО-1 обладает антиоксидантной активностью, вполне можно представить, что Nrf2-зависимая передача сигнала может контролировать защиту клетки от цитотоксического действия, запускаемого ФДТ. 2.6. Нацеливание фотосенсибилизаторов на рецептор HER2/neu Было предпринято немало попыток объяснить проникновение ФС в опухоль. Для некоторых лекарственных веществ реализуется EPR-эффект, за счет которого осуществляется селективная доставка по механизму «пассивного нацеливания». Этот эффект обусловлен повышенной проницаемостью и извилистостью сосудов опухоли ввиду неоваскуляризации и отсутствия лимфатического дренажа [130, 132]. Наиболее эффективные препараты связываются преимущественно с LDL, что указывает на важность обнаруженных в опухоли LDLрецепторов. Огромный интерес на сегодняшний день представляет направленная ФДТ. В целом ряде исследований было показано сродство ФС, ковалентно связанных с различными 33 нацеливающими молекулами, к рецепторам, экспрессирующимся на различных видах опухолей. Нацеливающими молекулами могут служить моноклональные антитела, фрагменты антител, пептиды, белки (трансферрины, эпидермальный фактор роста и инсулин), LDL, различные углеводы, соматостатин, фолиевая кислота и многие другие. Опухолевый маркер HER2/neu является значимой и наиболее хорошо изученной мишенью для создания новых противоопухолевых соединений (на основе наночастиц, лентивирусов и пр.) [133-137]. Онкомаркер HER2/neu относится к семейству рецепторов эпидермального фактора роста HER 1-4 и гиперэкспрессируется клетками рака молочной железы, яичников, легких, желудка, простаты и других видов рака [138]. Механизм канцерогенеза рецептора заключается в неконтролируемом формировании гомо- и гетеродимеров HER2/neu, что способствует повышению пролиферации и миграции клеток, торможению апоптоза, неоангиогенезу и в конечном итоге приводит к формированию опухоли и метастазированию [139, 140]. Поэтому у женщин с положительным HER2/neu-статусом рака молочной железы заболевание носит, во-первых, более агрессивный характер, а во-вторых, чаще сопровождается рецидивами по сравнению с HER2/neu-отрицательными случаями. Одним из наиболее распространенных клинически одобренных препаратов, основанных на использовании рецептора HER2/neu, является герцептин®. Данный препарат представляет собой полноразмерное моноклональное антитело IgG1 и назначается женщинам с HER2/neu положительным статусом опухоли молочной железы. Также герцептин® активно используется в качестве направляющей молекулы для различных цитотоксических и визуализирующих агентов [141]. Развитие методов генетической инженерии позволило получать укороченные производные антител в бактериальных штаммах. Так, 4D5scFv – это одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv, single chain variable fragment) антитела IgG1, специфичного к рецептору HER2/neu. Данный фрагмент кодируется одним геном и содержит только один антиген-связывающий участок, состоящий из вариабельных доменов легкой (VL) и тяжелой (VH) цепей, соединенных гибким пептидным линкером (рис. 10). Маленький размер делает эти молекулы удобными для доставки токсичных агентов к клетке. Важным преимуществом таких мини-антител является их совместимость с бактериальными системами уменьшенная иммуногенность и отсутствие эффекторных функций [142]. экспрессии, 34 Рис. 10. Формат антител. Полноразмерное антитело IgG (слева) и мини-антитело scFv (справа) [12] На сегодняшний день с использованием 4D5scFv в качестве нацеливающей молекулы было создано множество конструкций, обладающих различными свойствами. Например, 4D5scFv использовали для увеличения селективности доставки ФС пирофеофорбида А и вертепорфина путем формирования ковалентной связи между ФС и направляющим миниантителом. Было показано, что полученные конъюгаты эффективно проникают в HER2/neuположительные клетки SKOV-3, а также удерживаются внутри клетки значительно дольше по сравнению с неконъюгированными ФС [143]. Новым и перспективным направлением в этой области является создание генетически кодируемых иммунофотосенсибилизаторов (иммуноФС). Такие молекулы, так же как и вышеописанные конъюгаты, состоят из двух модулей: направляющего (мини-антитело) и эффекторного (фотосенсибилизатор), и представляют собой рекомбинантный белок, оба модуля в котором соединены друг с другом прочной пептидной связью. Это обеспечивает генетически кодируемым иммуноФС строгое постоянство состава, свойств и характеристик и, следовательно, строгую воспроизводимость функциональных свойств. На базе нашей лаборатории был создан первый генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-KillerRed [144]. Нацеливающий домен в полученном белке был представлен антиHER2/neu-миниантителом 4D5scFv, а эффекторный – фототоксичным красным флуоресцентным белком KillerRed, способным производить активные формы кислорода при облучении зеленым светом. Максимумы поглощения и эмиссии KillerRed составляют 585 и 610 нм соответственно. В опытах KillerRed демонстрирует фототоксичность, как минимум в 1000 раз превышающую токсичность всех других исследованных хромо- и флуоресцентных белков. Исследования показали существенную фототоксичность KillerRed при экспрессии в клетках млекопитающих. Так, нами было показано, что белок 4D5-KillerRed специфически 35 связывается с опухолевыми клетками SKOV-3, гиперэкспрессирующими опухолевый маркер HER2/neu, и обладает избирательной фототоксичностью по отношению к данным клеткам [144]. Другим примером нацеливающих молекул для специфического воздействия на рецептор HER2/neu опухолевых клеток в качестве мишени противоопухолевой терапии являются пептиды неиммуноглобулиновой природы. Несколько лет назад в лаборатории проф. А. Plückthun путем отбора из библиотек анкириновых повторов белков с помощью технологий рибосомного или фагового дисплея был разработан новый класс таких молекул, которые получили название DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) [145, 146]. Структура DARPin включает различное число анкириновых повторов, обычно от 4 до 6, формирующих связывающий домен. Один анкириновый повтор состоит, как правило, из 33 а.о., образующих β-поворот и две антипараллельные α-спирали (Рисунок 11). Располагаясь друг над другом, анкириновые повторы образуют правозакрученный соленоид, в котором имеется протяженный гидрофобный кор и гидрофильная поверхность, доступная растворителю [147]. Рисунок 11. 3D-модель гибридного белка DARPin (18) В природе такие белки с высокой аффинностью связываются с определенной мишенью, что приводит к запуску различных механизмов в клетке, от ингибирования ферментов до связывания белков друг с другом. В отличие от антител, DARPins имеют на порядок меньшие размеры (14-20 кДа vs 150 кДа), высоко стабильны и хорошо растворимы, что позволяет нарабатывать большие количества белка в гетерологичной системе экспрессии. DARPins не проявляют тенденции к агрегации и не требуют использования шаперонов для рефолдинга. Более того, было показано, что псевдотипирование лентивирусов белком DARPin приводит к большей специфичности их накопления в опухоли по сравнению с лентивирусами, псевдотипированными гликопротеином [148]. Таким образом, все вышеперечисленные свойства позволяют говорить о DARPin как об альтернативе антителам и мини-антителам. 36 2.7. Источники света, используемые для ФДТ, и апконвертирующие нанофосфоры На сегодняшний день не существует идеального источника света, удовлетворяющего требованиям всех типов ФДТ. Тем не менее, источник света необходимо выбирать в зависимости от абсорбции ФС (флуоресцентного поглощения и спектра действия), заболевания (локализации, размера новообразования, доступности и характеристик ткани), соотношения цена/качество и размера. Клинический эффект ФДТ зависит от комплексной дозиметрии: общей дозы облучения, времени облучения светом и порядка доставки света (единично, импульсно или равномерно). Плотность потока также оказывает влияние на исход ФДТ [149]. Системы, позволяющие измерять светорассеяние и плотность потока как интерстициально, так и на поверхности ткани, подвергаемой воздействию, к настоящему моменту используются только в экспериментальных работах. В ФДТ используются такие источники света как лазеры и лампы накаливания, и эффективность их примерно одинакова [150]. В отличие от крупных и малоэффективных лазеров на красителях с накачкой, диодные лазеры имеют небольшие размеры и более рентабельны. Такие лазеры просты в обращении, имеют автоматическую дозиметрию и возможность калибровки, а также длительный срок службы. Светоизлучающие диоды (light emitting diodes, LEDs) являются альтернативными источниками с относительно узкой полосой испускания и высокой плотностью потока энергии [151, 152]. Лазеры могут объединяться в пучки с рассеивающимися концами (ЗАО «БИОСПЕК»), что позволяет воздействовать на опухоли в мочевом пузыре и пищеварительном тракте. Существуют также специальные надувные баллоны, сделанные из рассеивающего материала, которые помещают внутрь органа [153]. Вполне возможно имплантировать источник света в паренхиматозный орган глубоко внутрь тела. Перечень аппаратуры ФДТ с использованием синего света достаточно объемен и разнообразен. Такие аппараты можно разделить на группы по способу доставки света [154]: 1. Аппаратура для облучения поверхности тела и полостей: лампа Минина, аргоновые лазеры, гелий-кадмиевые лазеры, светодиодные аппараты на основе LEDs (Рисунок 12) 37 Рисунок 12. Универсальный физиотерапевтический комплекс АФС «Солярис» с различными насадками (ООО «Полироник») 2. Аппараты для облучения поверхности тела синим светом в сочетании с водной средой 3. Аппараты для чрескожного облучения крови (светоизлучающие браслеты) 4. Аппаратура для экстракорпорального и внутрисосудистого облучения крови. Например, в ООО «Полироник» разработан аппарат «Солярис», который предназначен для внутрисосудистого облучения крови за счет проведения оптического волокна непосредственно внутрь иглы. При необходимости данный подход может быть использован для облучения опухоли, расположенной внутри полости тела. Таким образом, выбор оптимальной комбинации ФС, источника света, а также других параметров лечения является решающим для успешного исхода ФДТ [154]. Известно, что синий свет наименее эффективно проникает сквозь ткань, а наиболее глубоко проходят красные и инфракрасные лучи (Рисунок 13), поэтому интервал между 600 и 1200 нм называется оптическим окном биоткани. 38 Рисунок 13. Прохождение света сквозь ткани млекопитающих [57] Последние годы было предпринято немало попыток для использования ИК-света в ФДТ. Преимуществом ИК-света в ФДТ является не только его способность проникать вглубь ткани, но и низкая фототоксичность по отношению к здоровым клеткам и тканям. Новой технологией в ФДТ, получившей развитие относительно недавно, является двухфотонное фотовозбуждение ФС. В таком подходе высокоэнергетическим молекула видимым ФС переходит светом, а в возбужденное одновременным состояние поглощением не двух низкоэнергетических ИК-фотонов. Однако данная технология требует использования лазеров, работающих в импульсном режиме. Такие лазеры способны передавать ФС достаточную для возбуждения энергию, необходимую для двухфотоного процесса, но возбуждают при этом ограниченную область. Поэтому их применение в экспериментах in vivo будет очень времязатратным и сложным в исполнении. Другим новым подходом к доставке света вглубь ткани при ФДТ является использование апконвертирующих нанофосфоров, выступающих в роли доноров энергии за счет поглощения ИК-света. Апконвертирующие нанофосфоры Кристаллы апконвертирующих нанофосфоров (НАФ), легированные трехвалентными редкоземельными ионами (Yb3+, Tm3+, Er3+), являются агентами нового поколения, применяемыми для целей диагностики и терапии. Такие нанокристаллы способны эффективно преобразовывать возбуждающее излучение ближнего инфракрасного диапазона в 39 фотолюминесценцию видимого и ультрафиолетового диапазонов. В отличие от квантовых точек, НАФ не проявляют токсичности в опытах in vivo (), имеют стабильное узкополосное излучение при возбуждении в ближнем ИК диапазоне[155, 156]. В отличие от двухфотонной ФДТ, НАФ могут применяться в паре с обычными лазерами со значительно меньшей плотностью потока энергии, что позволяет возбуждать бо́ льшую область клеток [157]. Феномен апконверсионной люминесценции активно исследовался последние десятилетия. Впервые идея была изложена Блумбергеном в 1959 г [158], где автор утверждал, что ИК-свет возможно детектировать посредством последовательной ступенчатой адсорбции ионов твердых металлов. Среди них редкоземельные ионы, допированные в кристаллической решетке, привлекали внимание большинства исследовательских групп. Большое время жизни возбужденного состояния делает редкоземельные ионы незаменимыми для возбуждения люминесценции в процессе апконверсии. Данное свойство является ключевым для увеличения вероятности последовательного возбуждения. Чаще всего НАФ получаются высокотемпературным синтезом в виде кристаллов соли NaYF4, содержащих на своей поверхности остатки олеиновой кислоты, прикрепленные к поверхности электронно-донорными координационными взаимодействиями. Такие кристаллы гидрофобны и хорошо растворимы в неполярных органических растворителях, таких как гексан или хлороформ. Для эффективной апконверсионной фотолюминесценции очень важную роль играет микроокружение НАФ, так как лантаноиды, находящиеся на поверхности частиц, вместо люминесценции могут передать энергию возбужденного состояния на какой-либо акцептор. Чаще всего таким акцептором выступает вода, в которой растворяют НАФ, и поэтому для повышения квантового выхода люминесценции используется методика покрытия «активных» частиц «неактивной» оболочкой, состоящей из NaYF4 без включения лантаноидов, или core/shell технология [157]. Акцептором энергии также может выступать какой-либо фотосенсибилизатор, спектр поглощения которого перекрывается со спектром люминесценции НАФ. В данном случае в результате последовательной цепочки событий: облучение ИК-светом, возбуждение НАФ, передача энергии на молекулу ФС, передача энергии на кислород или другие близлежащие молекулы, может образоваться синглетный кислород или другие АФК, необходимые для ФДТ. При соблюдении определенных условий процесс передачи энергии от возбужденной наночастицы на ФС происходит по механизму фёрстеровского резонансного переноса энергии, или FRET. По сравнению с излучательным переносом энергии, т.е. посредством фотонов (LRET), эффективность передачи энергии при FRET значительно выше. Именно поэтому при разработке фотодинамических систем, основанных на использовании НАФ, авторы стремятся создавать именно FRET-пары НАФ и ФС (далее НАФ:ФС). 40 Существует ряд основных условий протекания FRET. Во-первых, это перекрывание спектров испускания донора и поглощения акцептора (рис.14А). Во-вторых, ориентация дипольных моментов донора и акцептора должна совпадать (рис.14Б). Третьим важным условием является близость донора и акцептора, т.к. вероятность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния, и расстояние в ~5 нм является критичным (рис.14В). При соблюдении всех условий происходит тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции акцептора, что свидетельствует о FRET [159]. Рисунок 14. Условия, необходимые для прохождения FRET. Очевидно, что образование синглетного кислорода в донорно-акцепторной паре НАФ:ФС будет напрямую зависеть от эффективности FRET. На сегодняшний день описан ряд НАФ:ФС систем, основанных на FRET или LRET от НАФ (синих, зеленых и красных) на ФС с соответствующим поглощением. К примеру, зеленые НАФ со структурой NaYF4:Yb3+/Er3+, использованные в паре с мезо-тетрафенилпорфирином, вызывали 75% гибель клеток HeLa. Подобные работы проводились с использованием Znфталоцианина [160] тетрафенилпорфиина[161], пирофеофорбида [162]. 41 Выбор способа создания стабильного комплекса НАФ с молекулами фотосенсибилизаторов является определяющим для эффективного переноса энергии от донора на акцептор в возбуждаемых ИК-светом НАФ:ФС системах. В литературе описаны три наиболее часто используемых подхода: (1) включение в оболочку из оксида кремния, (2) физиосорбция за счет координационных связей и (3) конъюгирование с образованием устойчивой ковалентной связи между ФС и НАФ (Таблица 2) Таблица 3. Примеры создания комплексов НАФ-ФС разными научными группами Автор Размер,нм Тип оболочки ФС Способ Ссыл создания ка Quian и соавт. 60-120 SiO2 Мероцианин-540 (1) [163] Guo и соавт. 60 SiO2 фталоцианин цинка (1) [164] и 50 ПЕИ фталоцианин цинка (2) [165] и 280 ПЭГ тетрафенилпорфирин (2) [161] ~20 АЭФ (2- Бенгальский розовый (3) [166] Chatterjee соавт. Ungun соавт. Liu и соавт. аминоэтилдигидрофосфа т) Shan и соавт. ~100 ПЭГ мезо-тетрафенилпорфирин (2) [167] Qiao и соавт. 22 SiO2 силикона-фталоцианина- (1) [168] дигидроксид (SPCD) и гематопорфирин (HP) Zhao и соавт. 38 SiO2 AlC4Pc (1) [169] Zhou и соавт. 53 ПЕИ Пирофеофорбид (3) [162] Wang и соавт. 30 ПЭГ Хлорин е6 (2) [170] Chen и соавт. 38 SiO2 Метиленовый миний (1) [171] Cui и соавт. 55 Амфифильны фталоцианин цинка оболочка [172] й SOC SOC Park и соавт. 66 ПЭГ Хлорин е6 Idris и соавт. 100 SiO2 Мероцианин-540 фталоцианин цинка (2) и (3) и (1) [173] [174] 42 К недостаткам существующих FRET пар на основе апконвертирующих нанофосфоров можно отнести низкий квантовый выход фотолюминесценции (менее 1 %) при умеренной интенсивности возбуждения, что накладывает ограничения на их применение. Тем не менее, эксперименты, выполненные в вышеуказанных работах, показали обнадеживающие результаты по применению наноконструкций для фотодинамической терапии рака ИК излучением, что говорит о перспективах исследований в этой области. И для улучшения апконвертирующего ФДТ эффекта требуется разработка стратегий по увеличению «нагруженности» НАФ фотосенсибилизаторами. Физиосорбция молекул ФС на поверхности НАФ – это один из наиболее простых методов связывания молекул ФС с поверхностью НАФ, который применялся, к примеру, в группе проф. Liu [170]. Нерастворимые НАФ, имеющие олеиновую кислоту на своей поверхности, переводили в водную фазу при помощи ПЭГ таким образом, что на поверхности полученных частиц остался небольшой слой гидрофобного олеата, но располагался под оболочкой ПЭГ. Это позволяло присоединить к поверхности НАФ такие гидрофобные молекулы, как депротонированный доксорубицин или хлорин е6, которые эффективно адсорбировались на гидрофобный слой НАФ (рис. 15). А остатки ПЭГ позволили провести конъюгацию с адресными молекулами, например, фолиевой кислотой. Рисунок 15. Схематичное изображение системы ФС-НАФ, основанное на физиосорбции ФС Се6 на поверхности НАФ (UCNP) [170] Включение ФС в оболочку из оксида кремния и нековалентная физиосорбция на поверхности НАФ не гарантируют стабильности такого комплекса, а значит, и эффективности терапии с его использованием. Ковалентное связывание молекул ФС с НАФ позволяет преодолеть указанные недостатки. Zhang применял такую стратегию для связывания бенгальского розового, модифицированного гиалуронойвой кислотой с аминогруппами на поверхности НАФ. Такой подход позволил авторам добиться значительно большего включения ФС в состав НАФ и 43 повысить уровень FRET [166]. В работе Zhou и соавт. для модификации НАФ использовали хитозан, что позволило создать ковалентную связь между адресным белком и ФС пирофеофорбидом-а с поверхностью НАФ. Они показали, что ковалентное связывание молекул ФС не только стабилизировало комплексы, но и позволило сохранить их спектральные и функциональные свойства для адресной ФДТ, использующей ближний ИК свет. Эффективность такого подхода ФДТ также исследовалась in vivo. В работе Liu и соавт. была показана возможность использования хлорина е6, ковалентно связанного с βNaYF4:Yb3+/Er3+ НАФ, покрытых амфифильным полимером. Такие комплексы вводили мышам прицельно в опухоль, облучали лазером с длиной волны 980нм, после чего наблюдали значительную регрессию опухоли. Недостатком данной работы являлось то, что комплексы доставляли в опухоль не через кровеносную систему. Избирательное накопление НАФ:ФС достигается путем присоединения адресных лигандов к поверхности наноконструкций, что обеспечивает высокое накопление комплекса в опухоли за счет специфического распознавания рецептором раковой клетки. Перспективным подходом, решающим задачу целевого связывания и селективного накопления нанокомплекса в раковых клетках может служить создание FRET-пары НАФ и белка-иммуноФС, например, 4D5scFv-miniSOG. Во-первых, это позволит создать стабильный комплекс за счет формирования ковалентной связи между аминогруппами белка и карбоксильными группами модифицированных НАФ. Во-вторых, за счет того, что белок имеет в своем составе адресный модуль, это позволит селективно доставить комплекс в опухолевые клетки. И в-третьих, подобный конъюгат позволит проводить ФДТ в глубине ткани, не прибегая к инвазивным методам доставки света. 44 3. Материалы и методы 3.1.Материалы Оборудование Шейкер-инкубатор (innova 43); настольный платформенный шейкер-инкубатор (Heidolph); спектрофотометр (Shumadzu UV-1650PC); Вортекс (IKA); multi-vortex V-32 (Biosan); pH- метр (Mettler Toledo); магнитная мешалка (Tomix); Zetasizer Nano ZS (Malvern); спектрофлуориметр Fluorolog-3 (Horiba Jobin Yvon); флуоресцентный инвертированный микроскоп Motic AE31E Series с эпифлуоресцентной приставкой EF-INV-II; ультразвуковая ванна RK 31H (Bandelin Sonorex); CO2-инкубатор Galaxy® 14 S (Eppendorf); CO2-инкубатор MCO175 (Sanyo), ламинарный бокс (Nuaire Bio Safety cabimets); источник синего света – аппарат АФС-450 и источник УФА света аппарат - АФС-365 (Полироник, Москва); хроматографическая система ÄKTAexplorer™ Pump P-900 (GE Healthare); инвертированный флуоресцентный микроскоп Axiovert 200 (Carl Zeiss); инвертированный флуоресцентный микроскоп с конфокальной лазерной сканирующей приставкой LSM 510 (Carl Zeiss); камера AxioCam HRs (Carl Zeiss); система гель-документирования Transilluminator MultiDoc-It Digital Imaging system (UVP); проточные цитофлуориметры FACSCalibur (Becton Dickinson) и BD Accuri C6 (Becton Dickinson,).; планшетный спектрофотометр Stat Fax-2100 (Awareness Technology); настольные центрифуги 5430R, 5415D и 5417R (Eppendorf), форезная камера Mini-PROTEAN (BioRad); Центрифуга (Thermo KR25i); Центрифуга; Стряхиватель (BioSan); 24-ячеечный термостат 5320 (Eppendorf); центрифуга Allegra-21R (Beckman Coulter), мультифункциональная центрифуна BR4i (Jouan); ротатор (VWR); миксер-ротатор lntelli-Mixer RM-1L (ELMI); водяной термостат, суховоздушный термостат, сухожаровой шкаф; автоклав; ультразвуковой дезинтегратор УЗДНА, источники тока, наборы электрофореза; весы лабораторные, холодильники специальные и бытовые поддерживающие температуру +40, -200 и -700 и -1400. Также использовались: камеры Горяева, хроматографические колонки и носители (GE Healthcare); обессоливающие колонки NAP-5 и PD-10 (GE Healthcare), фильтры для концентрирования белков (Vivaspin 500 µl); бумажные фильтры c размером пор 0,22 мкм и 0.45 мкм (Millipore), стерильные фильтры с размером пор 0.22 мкм (Millipore), мембрана для переноса Immobilon-P (Millipore), парафилм, центрифужные пробирки; автоматические пипетки, пластиковые пробирки на 0.5, 1.5, 2.0, 15 и 50 мл; пробирки для ÄKTAexplorer™ (GE Healthcare), пробирки для проточного цитофлуориметра, криопробирки, насадки для автоматических пипеток, культуральные и микробиологические чашки Петри, пластиковые 45 культуральные флаконы и культуральные планшеты (Corning), планшеты для ИФА, кюветы для спектрофотометра и флуориметра; стеклянные шпатели, стерильные одноразовые шприцы. Реактивы В работе использовали следующие реактивы отечественного производства (категории «х.ч» и «ос.ч.»): рибофлавин мононуклеотид (Фармстандарт), агароза, азид натрия, поли-Lлизин гидробромид, формалин, этиловый спирт, метиловый спирт, изобутиловый спирт, соляная кислота, хлорная кислота, уксусная кислота, серная кислота, лимонная кислота, ортофосфорная кислота, хлорид кальция, хлорид калия, хлорид натрия, хлорид магния, хлорид никеля, гидроксид натрия, карбонат и гидрокарбонат натрия, фосфат натрия, дигидроортофосфат и гидроортофосфат натрия, сульфат аммония, ацетат аммония, ацетат калия, глицин, мочевина, гуанидин гидрохлорид, пероксид водорода (ЛабТех и РеаХим); трипановый синий, краситель Хекста, L-глутамин, трипсин, раствор Версена, ампицилин, гентамицин и пенницилин-стрептамицин (ПанЭко); иммерсионное масло для микроскопа (Апекслаб). В работе использовали следующие реактивы зарубежного производства: рибофлавин (Applichem), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide - EDC (Sigma), дитиотриэтол - DTT, трис (Merck); диметилсульфоксид - DMSO, глицерин, полиэтиленимин, имидазол, додецилсульфат натрия - SDS, -меркаптоэтанол, орто-фенилендиаминдигидрохлорид - ОФД (Sigma); динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты - EDTA (Fluka); акриламид, N,N'-метилен-бисакриламид, персульфат аммония - APS, Tween20 (Serva); N,N,N,N- тетраметилэтилендиамин - ТEMED (Reanal); краситель кумасси G250, бромистый этидий, 3(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиумбромид - MTT, краситель Хекста (ПанЭко, США); бромфеноловый синий (Koch Light), бычий сывороточный альбумин - БСА (Bio-Rad); бакто-агар, бакто-триптон, дрожжевой экстракт (Difco); агароза (Chemapol); изопропил-1-тио-вD-галактозид - ИПТГ (Fermentas), натриевая соль N-гидроксисульфосукцинимида - NHSS, нитротеразолий синий - NBT, 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-фосфат - BCIP (Invitrogen); обезжиренное сухое молоко для блотов (Tesco), эмбриональная сыворотка теленка (HyClone), MOPS (Fluka), MES (Sigma). Также использовали наборы: для очистки ДНК на колонках (Promega); BCA Protein Assay (Pierce), PE AnnexinV Apoptosis detection Kit (BD Biosciences), Caspase 3 Assay Kit (Sigma), LysoTrackerRed, LysoTrackerGreen, MitoTrackerRed (Life Technologies), маркер для электрофореза нуклеиновых кислот, цветной маркер для электрофореза белков (BioLabs); козьи анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, анти-HIS антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой (Abcam), MicoKill (PAA Labs), Taxol. 46 Растворы Раствор для трансформации E. coli TF (50 мМ CaCl2, 10мМ MgCl2) агаризованая среда LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1.5% агар) жидкая среда LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) среда YTPS (1% триптон, 1% дрожжевой экстракт, 45 мM K2HPO4, 5 мM KH2PO4, 100 мM NaCl, 2 мM MgCl2) буфер Т2 (200 мM NaCl, 30 мM NaH2PO4, 2 мM Tris, pH 8.1) раствор акриламида AA (29% aкриламид, 1% N,N'-метилен-бисакриламид); 12% разделяющий гель (0.4% AA, 0.375 М трис-HCl (pH 8.8), 0.1% SDS, 0.1% APS, 0.01% TEMED); 4% концентрирующий гель (0.13% АА, 0.125 М трис-HCl (pH 6.8), 0.1% SDS, 0.1% APS, 0.01% TEMED); Электродный буфер (25 мМ трис-HCl, 0.1%SDS, 0.25 М глицин, рН 8.3); Буфер для нанесения образцов 2x (трис-HCl (pH 6.8) 0,125 М, SDS 2%, 200мМ дитиотриэтола, 0.1% бромфеноловый синий, 10% глицерин) раствор Кумасси G-250 (сульфат аммония 8%, фосфорная кислота 1.6%, Кумасси G-250 0.08%, этанол 20%) Буфер для переноса при вестерн-блоттинге (192 мМ глицин, 25 мМ трис-HCl, 20% этанол); TBST (50 мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl, 0.2% Tween20, pH 7.0); TBS (50 мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl, pH 7.0); AP (100 мМ трис-HCl, 100 мМ NaCl, 5мМ MgCl2, pH 8.8). окрашивающий раствор (0.48 мM NBT, 0.56 мM BCIP,100 мМ Трис HCl, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2) раствор Mowiol для полимеризации стекол (2.5М глицерин, 2.9мМ поливиниловый спирт (Mw ~31,000), 0.02% NaN3, 90мМ Трис HCl, pH 8.5) буфер для хранения белков PS: 20 мM KH2PO4 , 20 мM HEPES, 10 мM EDTA, 0.5 M NaCl, 10% глицерин, 0.1% твин20, pH 8.0 3.2. Методы Трансформация клеток E. coli высевали на чашку Петри, содержавшую свежую агаризованную среду LB, инкубировали 16 ч при 37°С в темноте. После этого петлёй отбирали 2х2 мм2 клеток с чашки и переносили в 2 мл жидкой среды LB и растили 1,5 часа на качалке при 37°С. Культуру осаждали при 5000g в течение 1 мин, супернатант сливали, а осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл ледяного раствора TF, повторяли процедуру и ресуспендировали в конечном объеме раствора TF 100 мкл. К клеткам добавляли 1 нг плазмидной ДНК и инкубировали 30 мин на ледяной бане. Затем клетки в течение 1 мин инкубировали при 42°С, выдерживали 1 мин на ледяной бане, заменяли раствор CaCl2 свежей средой и оставляли на 15 мин при 37°С в темноте. 47 Трансформированные клетки рассевали на чашки Петри с селективной средой LB, содержащей антибиотик ампициллин в концентрации 100 мг/л и инкубировали 16 ч при 37°С. Экспрессия и очистка рекомбинанных белков 4D5scFv-miniSOG Для наработки биомассы, содержащей 4D5scFv-miniSOG, клетки E. coli штамма SB536 трансформировали плазмидой pSD-4D5scFv-miniSOG. Полученные колонии трансформантов переносили в питательную среду LB и культивировали при 37 оС до достижения стационарной фазы роста. Ночную культуру разводили в 100 раз средой LB, содержащей ампициллин, и культивировали при +28оС до достижения культурой разных оптических плотностей (OD600): от 0.5 до 1.2. Было показано, что наибольший выход целевого белка достигается при индукции синтеза целевого белка при OD600 равной 0.7-0.8. Чтобы индуцировать синтез целевого белка в культуру добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ, после чего клетки культивировали при тех же условиях дополнительно 3, 6 или 18 ч для того, чтобы оценить оптимальное время экспрессии 4D5scFv-miniSOG. Для анализа относительного количества растворимого белка в каждом экспериментальном случае бактериальная культура в объеме 1 мл была разбавлена до показания оптической плотности (OD600), равной единице, и центрифугирована (5000 g, 5 мин). Осажденные бактериальные клетки были лизированы при помощи раствора B-PER (Thermo Scientific) согласно инструкции производителя. Последующий анализ фракций белка проводили с использованием электрофореза в 12.5% ПААГ в денатурирующих условиях на приборе Mini-PROTEAN “Bio-Rad”. В эксперименте по выявлению оптимального времени индукции было показано, что наибольший уровень экспрессии целевого белка достигался через 18 ч, однако доля растворимого белка при этом оказалась незначительной: почти весь белок за это время выпадал в осадок в тельца включения. Через 3 и 6 ч после индукции относительное количество телец включения было незначительным, а доля растворимого белка оказалась большей через 6 ч. Таким образом, оптимальным временем индукции 4D5scFv-miniSOG было выбрано 6 ч. Оптимальные условия экспрессии, подбор которых описан выше, были использованы в дальнейшей работе для наработки большого количества целевого рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG, необходимого для дальнейших экспериментов с культурами эукариотических клеток. Трансформированные клетки E. coli выращивали в колбах с общим объемом культуральной среды LB 2 л, экспрессию целевого белка индуцировали в условиях, описанных выше. Клетки отделяли от культуральной среды центрифугированием при 6000 g в течение 10 мин при 4C. Затем клетки ресуспендировали в буфере Т2 и разрушали ультразвуком. Полученный клеточный экстракт отделяли центрифугированием в течение 1 ч при 15000 g. pH 48 надосадочной жидкости, содержащей растворимую форму целевого белка, доводили до значения 8.1 при помощи 0.5M NaOH и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0ю22 мкм при 4°С. Обязательным условием всех манипуляций с белком 4D5scFv-miniSOG было соблюдение темновых условий. Полученный раствор, содержащий целевой белок, очищали методом металл-аффинной хроматографии в нативных условиях на колонке «HisTrap FF 1 мл» (GE Healthcare), содержащей Ni2+–NTA сефарозу, согласно инструкциям производителя. Раствор наносили на колонку со скоростью 0,7 мл/мин. После этого колонку промывали 20 мл того же буфера Т2 и элюировали целевой белок сначала 80 мМ, а затем 250 мМ раствором имидазола, приготовленным на буфере Т2 при скорости потока жидкости 0.1 мл/мин. DARPin-mCherry Штамм E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой pDARP-mCherry. Единичную колонию засевали в 2 мл среды YTPS с 0.1 г/л ампициллина и растили в течение ночи при 37С на качалке. Затем ночную культуру разбавляли в 50 раз средой YTPS и далее культивировали в тех же условиях до среднелогарифмической фазы (OD600 ~ 0.5–0.7), температуру культивации понижали до 25C и добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ. Индукцию проводили в течение 8 ч. После этого клетки охлаждали и осаждали центрифугированием при 6000g в течение 10 мин при 4С. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере Т2 (pH 8.3), клетки разрушали на ледяной бане с помощью ультразвукового дезинтегратора (продолжительность УЗ обработки 5-7 раз по 45 с). Клеточный дебрис отдаляли центрифугированием при 15000g в течение 30 мин. Супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и наносили на колонку «HisTrap FF 1 мл» (GE Healthcare Life Sciences) согласно протоколу производителя. Белки, не связавшиеся с сорбентом, удаляли при промывании колонки буфером Т2. Связавшиеся белки элюировали буфером Т2 с 150 мМ имидазолом. Выход очищенного белка составил 40 мг с литра культуры. Вертикальный гель-электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях Белки E.coli анализировали ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях в 12% геле. Электрофорез проводили в течение 1 ч при плотности тока 45 мA/см2. После окончания электрофореза гель окрашивали раствором Кумасси G-250 в течение 1 ч. Избыток краски отмывали раствором 10%-ной уксусной кислоты при покачивании до прозрачного фона. В качестве белков-стандартов использовали окрашенный маркер (BioLabs), а также маркер, приготовленный из белков, выделенных в нашей лаборатории: BSA 64кДа 0.33 мкг/мкл; ETA 42 кДа 0.67 мкг/мкл; 49 4D5 29 кДа 0.17 мкг/мкл; lysozyme 14.4 кДа 0.67 мкг/мкл; Смена имидазолсодержащего буфера Для тестирования цитотоксичности фракции белков переводили в буфер для хранения белков PS либо в буфер PBS (рН7.4) (ПанЭко) при помощи обессоливающих колонок NAP-5 и PD-10 (GE Healthcare), согласно инструкциям производителя. В случаях, когда требовалось концентрирование белка, использовали центриконы Vivaspin 500 MWCO 10000 (GE Healthcare Life Sciences) согласно инструкции производителя. Вестерн блоттинг Белки после электрофоретического разделения в ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану Immobilon-P (Millipore) полусухим методом с помощью графитовых электродов. Для этого мембрану, предварительно смоченную 80% метанолом, отмытую водой, а затем буфером для переноса и воде, помещали на анод. Гель располагали между слоями ватмана (Whatman 3MM Chr), смоченного тем же буфером. Сверху помещали катод и плотно прижимали его. Перенос проводили 40 мин при силе тока 70 мА. Иммунодетекцию белков на мембране проводили следующим образом. Мембрану инкубировали 1 ч в 5%ном растворе сухого молока на основе TBST для ингибирования неспецифического связывания антител. Затем мембрану отмывали буферами TBST, TBS по 5 мин при покачивании и инкубировали в течение часа с мышиными анти- His6-tag антителами, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Abcam) в 0,5%ном молоке на основе TBST. Повторяли процедуру отмывки и затем проводили визуализацию. Для этого готовили окрашивающий раствор и инкубировали в нем мембрану до проявления окрашенных полос. Мембрану снимали на камеру (Canon) в высоком разрешении. Измерение поглощения и испускания 4D5scFv-miniSOG Спектры поглощения очищенного препарата белка 4D5scFv-miniSOG в концентрации 10 мкМ проводили на спектрофотометре Hitachi U-3400 (ИОФ РАН им. Прохорова). Спектры испускания записывали на лазерном сканирующем микроскопе Carl Zeiss LSM-710-NLO при возбуждении лазером на длине волны 457 нм. Определение константы связывания белков 4D5scFv-miniSOG и DARPin-mCherry с рецептором HER2/neu 50 Константу диссоциации комплекса белков 4D5scFv-miniSOG и DARPin-mCherry c внеклеточным доменом рецептора HER2/neu определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса на приборе BIAcore (GE Healthcare Life Sciences). Сенсорные чипы СМ5 покрывали рекомбинантным антигеном HER2/neu с плотностью 1500 и 5000 в случае 4D5scFv-miniSOG и 4500 резонансных единиц в случае DARPin-mCherry. Белок 4D5scFvminiSOG наносили на чип в объеме 30 мкл в концентрации 5 мкМ, DARPin-mCherry - в концентрациях 0.1, 0.2 и 0.4 мкМ. Константу диссоциации рассчитывали исходя из полученной сенсограммы, используя программу BIAevaluation 3.0(GEHealthcareLifeSciences). Полученную сенсограмму использовали для расчета константы диссоциации в программе BIAevaluation 3.0(GEHealthcareLifeSciences). Культивирование клеточных линий Клетки SKBR-3 и фибробласты человека выращивали в среде McCoy’s 5A, клетки CHO – в среде RPMI-1640 с 10 % эмбриональной сывороткой теленка и 2 мМ L-глутамином. Клетки культивировали при +37оС в атмосфере с 5% СО2. Для предотвращения ферментативного удаления поверхностных рецепторов, снятие клеток с подложки проводили раствором Версена, без использования трипсина. Изучение специфичности связывания и интернализации 4D5scFv-miniSOG Для культивации клеток SK-BR-3 и СНО использовали стерильные слайдеры со стеклянным дном (Nalge Nunc International). Для увеличения адгезии клеток ко дну слайдеров последние предварительно обрабатывали стерильными растворами поли-А-лизина (0.01%) или желатина (0.1%). Клетки инкубировали в течение 1-2 суток, затем отмывали от сыворотки и добавляли 500 нМ раствор 4D5scFv-miniSOG в холодном PBS в темноте. Для определения связывания белка с поверхностью клеток слайдеры помещали на 1 ч в холодильник на +4°C. Для изучения интернализации комплекса рецептор:4D5scFv-miniSOG клетки отмывали от несвязавшегося белка и помещали в CO2-инкубатор на 30 мин. Специфичность связывания мини-антитела в составе 4D5scFv-miniSOG оценивали также методом конкурентного ингибирования со свободным антителом 4D5scFv в эквимолярном соотношении. Так, клетки инкубировали в среде, содержащей 500 мкМ 4D5scFv и 500 мкМ 4D5scFv-miniSOG одновременно, в течение 1 ч при 37°C. Интенсивность суммарного сигнала флуоресценции в опыте по конкурентному ингибированию сравнивали с интенсивностью, полученной на клетках, инкубированных с 500 мкМ 4D5scFv-miniSOG без 4D5scFv. Затем все экспериментальные образцы клеток фиксировали холодным 10% раствором формалина, приготовленным на PBS, в течение 1 ч и отмывали PBS. После этого предметное 51 стекло слайдера отделяли от камеры, наносили на его поверхность ~30 мкл раствора Mowiol, накрывали покровным стеклом и оставляли при комнатной температуре на 2 ч. Анализ препаратов проводили на лазерном сканирующем микроскопе Carl Zeiss LSM-710-NLO (ИОФ РАН им. Прохорова). Изучение внутриклеточной локализации Клетки SK-BR-3 культивировали на слайдерах (Nalge Nunc International), отмывали от сыворотки и добавляли 500 нM 4D5scFv-miniSOG при 4°C в темноте. Клетки инкубировали с белком в течение 1 ч, отмывали от несвязавшегося белка и добавляли растворы красителей, приготовленные на среде McCoy’s 5A. Инкубацию клеток при 37°C со специфическим красителем на лизосомы LysoTracker Red (Invitrogen) проводили в течение 3 ч со специфическим красителем на митохондрии MitoTracker Red (Invitrogen) – в течение 20 мин. По окончании облучения нефиксированные клетки анализировали на лазерном сканирующем микроскопе Carl Zeiss LSM-710-NLO. Флуоресценцию 4D5scFv-miniSOG возбуждали излучением лазера 458 нм. Флуоресценцию красителей MitoTracker Red и LysoTracker Red возбуждали излучением лазера 561 нм. Анализ коэффициентов колокализации проводили при помощи программного обеспечения Carl Zeiss LSM-710-NLO. Определение плотности мощности светодиода В качестве источника синего излучения с максимумом на длине волны 465 нм использовалась матрица светодиодов 5х5 см. Для обеспечения требуемых режимов облучения клеточных культур были выполнены измерения плотности мощности (ПМ). Калибровка выполнялась при помощи измерителя мощности FieldMaxII (Coherent). Для определения ПМ головка измерителя мощности устанавливался на разные расстояния от источника света. Калибровка была выполнена по шести точкам. Для учета ослабления излучения крышкой планшета при выполнении измерений она помещалась на сенсор измерительной головки PM3. Полученные экспериментальные значения ПМ при изменении расстояния от источника излучения аппроксимировались степенной функцией (рис. 1). 52 Рисунок 1. Зависимости плотности мощности источника излучения от расстояния Полученные экспериментальные значения описываются степенной функцией близкой к функции, дающей изменение интенсивности точечного источника света от расстояния (I~1/r2). Отклонение от закона вызвано тем, что в нашем случае в качестве источника света использовалась матрица светодиодов. Исходя из экспериментальных данных следует, что для получения плотности мощности 55мВт/см2 на дне планшета с закрытой крышкой необходимо устанавливать планшет на расстоянии от источника света в 7.8 см. MTT-тест Одним из наиболее распространенных и простых методов анализа цитотоксичности является тест MTT. МТТ - это 3[4,5-диметилтиазол--2-yl]-2,5 дифенилтетразолиумбромид, тетразоловый краситель, который под воздействием ферментов митохондрий приобретает синюю окраску. Только клетки с функционирующими митохондриями могут осуществлять эту реакцию, следовательно, интенсивность окраски прямо связана со степенью неповрежденности этих органелл. Клетки рассевали на 96-луночный планшет в количестве 2.5х104 (SK-BR-3) и 2.0х104 (CHO). После культивирования клеток при 37°С в СO2-инкубаторе в течение ночи среду удаляли и к клеткам добавляли PBS (контроль) либо PBS, содержащий тестируемые белки в разных концентрациях в конечном объеме 100 мкл на лунку. Для исследования цитотоксичности 4D5scFv-miniSOG в сочетании с таксолом® клетки преинкубировали с цитостатиком в течение 1ч и добавляли белок. Добавление экспериментальных растворов к клеткам проводили в темноте с лампой красного света и стерильно. Затем клетки инкубировали при тех же условиях 53 1 ч, отмывали от несвязавшегося белка и добавляли PBS, после чего облучали в течение 10 мин (плотность мощности синего света 55 Вт/cм2). Затем добавляли полную питательную среду и инкубировали при 37°С в СO2-инкубаторе в течение 2 суток. Затем среду удаляли, клетки отмывали 1 раз средой без сыворотки. После этого в лунки вносили по 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл), приготовленного на среде RPMI-1640, и инкубировали 2 ч при 37°С в атмосфере с 5% СO2. По истечении этого времени раствор МТТ удаляли и к содержимому лунок добавляли по 100 мкл ДМСО, планшет встряхивали на шейкере до полного растворения кристаллов формазана. Измерение оптической плотности содержимого каждой лунки проводили на планшетном спектрофотометре Stat Fax-2100 при длине волны 540 нм в сравнении с 690 нм. Выживаемость клеток оценивали в процентах по величине оптической плотности раствора формазана в экспериментальных пробах по сравнению с контролем. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Результаты представлены средними значениями ± стандартное отклонение. Статистические отклонения между группами анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (P<0.05). Активность каспазы-3 Измерение активности каспазы-3 проводили набором Caspase 3 Assay Kit (Sigma). Согласно инструкции производителя клетки SK-BR-3 культивировали до необходимого количества. Далее клетки инкубировали с 500 нМ белка 4D5scFv-miniSOG, облучали синим светом (465 нм, 55 мВт/см2, 30 мин) и инкубировали при 37С в атмосфере 5% СО2 в течение 3 ч. После этого клетки осаждали центрифугированием, суспендировали в буфере для лизиса из расчета 104 клеток/мкл буфера и инкубировали на льду в течение 20 мин. Затем клеточный дебрис центрифугировали, отбирали супернатант и добавляли к нему субстрат для каспазы-3. Количество образовавшегося п-нитроанилина оценивали спектрофотометрически по поглощению при длине волны 405 нм. Активность каспазы-3 (нмоль/мин/мл) определяли по формуле: , где OD – поглощение субстрата, d - фактор разбавления, mM =10.5, v – объем образца (мл), t – время реакции (мин). В качестве положительного контроля популяции апоптотических клеток в работе использовали клетки SK-BR-3, обработанные 2 мМ CaCl2, в качестве отрицательного – клетки SK-BR-3 в PBS. 54 Определения фракции клеток с фрагментированной хромосомной ДНК Процент гипоплоидных клеток (Sub-G1-фракция) определяли с помощью проточного цитометра FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Для этого клетки SK-BR-3 обрабатывали иммунотоксином 4D5scFv-miniSOG (500 нМ), подвергали облучению синим светом (465 нм, 55 мВт/см2) в течение 30 мин при 37C, дважды промывали PBS и фиксировали 70% этанолом 30 мин при 4°C. Клетки инкубировали 30 мин в темноте в растворе, содержащем 50 мг/мл йодида пропидия и 50 мкг/мл РНКазы А, после чего анализировали на проточном цитометре. В качестве положительного контроля апоптоза использовали популяцию клеток SK-BR-3, обработанных 2 мМ CaCl2, в качестве отрицательного контроля использовали популяцию клеток SK-BR-3 в PBS. Процент sub-G1-фракции определяли на основе гистограмм, полученных с помощью программы FlowJo 7.6 (TreeStar, Ashland, OR, USA). Измерение размера и дзета-потенциала НАФ Гидродинамический размер частиц определяли методом динамического рассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZS. Для этого использовали следующие оптические характеристики НАФ: коэффициент адсорбции 0.01% и коэффициент преломления (refractive index, RI) равный 1.47. Среднее значение размера и индекс полидисперсности (Polydispersity Index, Pdi) рассчитывались программой на основе кумулятивного анализа. В работе использовали только те значения среднего размера (Z, или z-average), которые были рассчитаны по средней интенсивности сигнала, но не по средней массе или количеству частиц. В основе определения дзета-потенциала частиц лежит измерение скорости направленного движения частиц в электрическом поле (phase analysis light scattering). Для измерения водную дисперсию НАФ в концентрации 10 мкг/мл помещали в одноразовую U-образную капиллярную кювету, после чего проводили измерения на приборе. Конъюгация UCNPs с белками Для конъюгации с белками использовали НАФ, покрытые сополимером малеинового ангидрида и октодецена - PMAO. Полученные наночастицы, содержащие на поверхности карбоксильные группы, ковалентно связывали с белками с использованием EDС и sulfo-NHS в качестве сшивающих реагентов (Рисунок 2) согласно протоколу [175] 55 Рисунок 2. Схема реакции конъюгации наночастиц, имеющих на поверхности карбоксильные группы, с белками с использованием EDC и sulfo-NHS [176] Несвязавшийся белок отделяли от конъюгатов несколькими циклами центрифугирования в PBS, каждый раз подвергая НАФ ультразвуковой обработке, и конечный осадок конъюгатов разводили в 50 мкл PBS. Так как все используемые для конъюгации белки обладали флуоресценцией в видимой области спектра, эффективность конъюгации оценивали, во-первых, по окрашиванию бесцветного осадка UCNP. Во-вторых, для количественного определения связавшегося с частицами белка использовали колориметрический метод определения белка с бицинхониновой кислотой (BCA Protein Assay, Pierce), согласно протоколу производителя. Физиосорбция белков на UCNP UCNP, переведенные в водную фазу при помощи ТМАГ, смешивали с 0,6 мM раствором белка DARPin-miniSOG и оставляли на сутки в темноте при температуре 40С до снятия спектров люминесценции. Спектроскопия комплексов Спектры люминесценции всех вышеописанных комплексов получали с использованием спектрофлуориметра Fluorolog-3 при возбуждении cw- полупроводниковым лазером с длинной волны 975 нм. Обработку результатов проводили в программе Origin. Регистрация наработки синглетного кислорода Для регистрации наработки синглетного кислорода при облучении системы ИК-светом использовали реактив Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) в концентрации 5 мкM. Данный реактив имеет максимум возбуждения на длине волны 504 нм и максимум спектра люминесценции на длине волны 525 нм (в результате взаимодействия с 1O2). Поскольку 56 miniSOG флуоресцирует в зеленой области спектра, то при измерениях интенсивность собственной люминесценция белка принималось за точку отсчета. При облучении образца ИК лазерным облучением записывалось нарастание сигнала флуоресценции SOSG на длине волны 525 нм во времени. Возбуждение флуоресценции красителя происходило посредством синих линий люминесценции апконвертирующих наночастиц. Наработку 1O2 системой НАФ/miniSOG оценивали в присутствии и в отсутствие ингибитора синглетного кислорода NaN3. Определение связывания DARPin-mCherry методом проточной цитофлуориметрии Для количественной оценки связывания белка DARPin-mCherry в популяции клеточных линий SKBR-3 (HER2/neu-гиперэкспрессирующих) и CHO (HER2/neu-отрицательных) клетки инкубировали во флаконах и снимали с подложки раствором Версена (без использования трипсина). Клетки инкубировали с 1 мкM раствором DARPin-mCherry в течение 15 мин при 4°С, дважды отмывали холодным PBS и проводили измерения на приборе FACS Scan Calibur (Becton-Dickinson). Данные анализировали с помощью программы WinMDI 2.8 (Scripps Research Institute) Анализ выживаемости клеток методом проточной цитофлуориметрии Фибробласты кожи человека и клеточные линии SKBR-3 и CHO выращивали до плотности 80% от монослоя и снимали с подложки раствором Версена (ПанЭко). Затем суспензию клеток в культуральной среде делили на экспериментальные группы по 100000 клеток и добавляли НАФ-PMAO до конечной концентрации 50 мкг/мл. В контрольные группы клеток наночастицы не добавляли. Последующую инкубацию клеток проводили в течение 24 ч при 37С в атмосфере 5% СО2. По истечении времени инкубации клетки промывали PBS, ресуспендировали в 100 мкл PBS и в каждую пробу добавляли йодид пропидия до конечной концентрации 5 мкМ. Клетки инкубировали 15 мин в темноте, после чего анализировали пробы на проточном цитофлуориметре (BD Accuri C6). Процент некротических клеток определяли на основе полученных гистограмм с помощью программы FlowJo™. В каждой пробе анализировали 10000 клеток. Определение температуры нагревания воды в ячейке 96-луночного планшета при облучении клеток ИК лазером Подбор параметров облучения клеток излучением ИК-лазера выполнялся с учетом нагрева воды в ячейке 96-луночного планшета. Так как при длине волны 975 нм вода имеет поглощение, непрерывное облучение может вызвать перегрев. Для оценки температуры в процессе облучения в лунку погружалась микротермопара диаметром 80 мкм. Термопара 57 устанавливалась вне зоны облучения. В процессе облучения выполнялись измерения температуры. 58 4. Результаты и обсуждение 4.1. Разработка генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-miniSOG и характеристика его функциональных свойств Одной из актуальных задач современной фотодинамической терапии (ФДТ) является разработка «адресных» фотосенсибилизаторов (ФС) для селективного воздействия на опухоль. Для этого ФС химически присоединяют к «адресной» молекуле, например, к моноклональному антителу, обладающему специфической аффинностью к определенному поверхностному опухолевому маркеру. В нашей лаборатории предложена концепция создания генетически кодируемых иммунофотосенсибилизаторов (иммуноФС) – гибридных белков, состоящих из адресного полипептидного домена (мини-антитела, DARPin) и цитотоксического эффекторного домена (фототоксичные белки). Так, в 2009 году впервые в мире был создан адресный генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-KillerRed, способный селективно поражать раковые клетки при возбуждении зеленым светом [143] В данной работе нами был сконструирован генно-инженерным способом, получен в бактериальной экспрессионной системе и охарактеризован новый иммуноФС 4D5scFvminiSOG. Эффекторный домен в молекуле иммуноФС представлен флавопротеином miniSOG (mini Singlet Oxygen Generator), который способен продуцировать активные формы кислорода (АФК) при облучении синим светом [13]. Данное свойство обусловлено наличием в составе флавопротеина простетической группы - окисленного флавинмононуклеотида (ФМН), который образуется в клетке из рибофлавина (Рф, витамина B2). Адресная часть иммуноФС представлена рекомбинантным гуманизированным миниантителом 4D5scFv, специфичным к рецептору эпидермального фактора роста человека HER2/neu и содержащим в составе единой полипептидной цепи вариабельные фрагменты легкой и тяжелой цепей молекулы иммуноглобулина. Домены 4D5scFv и miniSOG в сконструированном гибридном белке соединены при помощи гибкого пептидного линкера. ИммуноФС снабжен на С-конце пентагистидиновым пептидом. 4.1.1. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG Для наработки рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG клетки E. coli штамма SB536 трансформировали полученной нами плазмидой pSD-4D5scFv-miniSOG, содержащей ген 59 целевого белка под контролем lac-промотора. После оптимизации условий культивирования штамма был получен белок 4D5scFv-miniSOG с выходом 1.5 мг на 1 л культуры бактерий. Наличие гистидиновой метки на С-конце белка позволило очистить белок при помощи Ni2+–NTA металл-аффинной хроматографии. Элюцию белка с колонки проводили растворами имидазола разных концентраций. На рисунке 1А представлены профили элюции 80 мМ имидазолом (фракции 1-10) и 250 мМ имидазолом (фракции 11-16). Анализ фракций №№ 1-6 и №№11-15 белка проводили с использованием электрофореза в 12.5% ПААГ в денатурирующих условиях (Рис. 1Б) и вестерн-блот-гибридизации с антигистидиновыми антителами (Рис. 1В). Рисунок 1. Очистка препарата белка 4D5scFv-miniSOG с помощью металл-аффинной хроматографии на колонке с аффинным носителем Ni2+-NTA. А- профиль элюции целевого белка 80 мМ имидазолом (фракции 1-10) и 250 мМ имидазолом (фракции 11-16), записанный при λ=280 нм (номера фракций препарата обозначены красными цифрами). Б - электрофорез в 12,5% SDS-ПААГ фракций №№1-6 и №№11-15, отобранных после металл-аффинной хроматографии. В - результаты вестерн-блот-гибридизации с антигистидиновыми антителами фракций белка №№1-6 и №№11-15. Так как фракции белка № 12 и 13 имеют наибольшую концентрацию белка при наименьшем количестве примесей (Рис. 1Б, В), их использовали для дальнейших исследований. 60 На рисунке 2А представлены результаты гель-электрофореза бактериального лизата до и после индукции экспрессии 4D5scFv-miniSOG (дорожки 1 и 2), а также очищенного препарата белка (дорожка 3). Показано, что белок имеет молекулярную массу, близкую к расчетной (42 кДа). Также, из рисунка видно, что в результате индукции часть белка находится в нерастворимой фракции (дорожка 4). Аутентичность очищенного белка подтвердили вестерн-блот гибридизацией с антигистидиновыми антителами (Рис. 2Б) и секвенированием белковой полосы с помощью MALDI–TOF масс-спектрометрии (Рис. 2В). Рисунок 2. Доказательства аутентичности выделенного белка: А – результат электрофореза в 12% ПААГ-SDS препаратов белка 4D5scFv-miniSOG: 1- полный клеточный лизат до индукции, 2 - лизат клеток после индукции; 3 – очищенная фракция 4D5scFv-miniSOG; 4 - нерастворимая фракция; 5 - маркер молекулярных масс Page RulerUnstained protein ladder (Fermentas); Б – результат вестерн блот гибридизации полного клеточного лизата до (дорожка 1) и после (дорожка 2) индукции 4D5scFv-miniSOG с антигистидиновыми антителами; В аминокислотная последовательность белка 4D5-miniSOG. Зеленым цветом выделены пептиды, идентифицированные в молекуле белка в ходе анализа с помощью MALDI-TOF массспектрометрии. 4.1.2 Характеристика функциональных свойств 4D5scFv-miniSOG Для использования рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG в качестве адресного иммуноФС необходимым условием является сохранение функций исходных модулей в сконструированном белке, а именно: способность специфически связываться с рецептором HER2/neu противоопухолевого антитела и фотохимические свойства белка miniSOG. Было изучено, насколько сохранились свойства направляющего и действующего модулей в составе рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG. 4.1.2.1 Связывание с рецептором HER2/neu – иммунохимический метод Способность полученного белка связываться с рецептором HER2/neu оценили методом поверхностного плазмонного резонанса (Рис. 3А). Расчет показал, что константа диссоциации комплекса 4D5scFv-miniSOG с HER2/neu составляет 10±2 нM, что близко к значению этого же 61 показателя для свободного мини-антитела 4D5scFv (9±2 нM). Таким образом, было доказано, что адресная часть бифункционального рекомбинантного белка сохраняет свои свойства. Рисунок 3. Характеристика белка 4D5scFv-miniSOG. А – сенсограмма связывания белка 4D5scFv-miniSOG с рецептором HER2/neu, нанесенным на сенсорный чип CM-5 в различных количествах. Б – спектры поглощения и эмиссии белков miniSOG и 4D5scFvminiSOG. 4.1.2.2 Спектральные свойства 4D5scFv-miniSOG Анализ спектров поглощения и испускания белка 4D5scFv-miniSOG в сравнении с оптическими характеристиками исходного белка miniSOG (Рис. 3Б) показал, что при возбуждении 4D5scFv-miniSOG синим светом наблюдается его флуоресценция в зеленой области с максимумами 500 и 526 нм, что соответствует спектру испускания свободного miniSOG. Таким образом, показано, что действующий модуль также сохраняет свои фотохимические свойства в составе рекомбинантного белка. 4.1.2.3 Специфичность связывания с HER2/neu на клетках Для исследования фототоксического действия полученного белка 4D5scFv-miniSOG в качестве модели для экспериментов in vitro использовали линию клеток аденокарциномы молочной железы человека (SK-BR-3) c повышенным уровнем экспрессии онкомаркера HER2/neu (~1x106 молекул HER2/neu на клетку). Гиперэкспрессия этого маркера характерна также для клеток ряда опухолей яичников, легких, желудка, простаты и др. В качестве контроля использовали HER2/neu-отрицательную линию клеток китайского хомяка CHO. Предварительно провели оценку связывания иммуноФС 4D5scFv-miniSOG с поверхностью опухолевых клеток SK-BR-3 при помощи конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710-NLO (совместно с ИОФ РАН им. А.М. Прохорова). Было продемонстрировано, что 62 при инкубации клеток SK-BR-3 с иммуноФС в течение 1 ч при +4ОС (условия, при которых исключена рецептор-опосредованная интернализация белка) 4D5scFv-miniSOG эффективно связывается с поверхностью клеток SK-BR-3 (рис. 4А). После дополнительных 30 мин инкубации при +37ОС происходит проникновение 4D5scFv-miniSOG внутрь клетки (рис. 4Б), о чем свидетельствует равномерный флуоресцентный сигнал внутри клеток. В то же время на клетках CHO, которые не несут на своей поверхности рецептор HER2/neu, флуоресцентного сигнала не наблюдали (Приложение 1). Рисунок 4. Конфокальные изображения клеток SK-BR-3 после инкубации с 4D5scFvminiSOG при 4C (A) и после дополнительных 30 мин инкубации при 37C (Б). Левая панель соответствует изображениям клеток в проходящем свете, средняя панель – флуоресцентные изображения в зеленом канале, правая панель – наложение флуоресцентных изображений в зеленом и синем каналах. Ядра клеток окрашены красителем Hoechst 33342 4.1.2.4 Конкурентное ингибирование Специфичность связывания белка 4D5scFv-miniSOG с рецептором HER2/neu на поверхности клетки была также подтверждена в опыте по конкурентному ингибированию рецептор-опосредованной интернализации иммуноФС. Действительно, при одновременной инкубации клеток с 4D5scFv-miniSOG и со свободным мини-антителом 4D5scFv наблюдали снижение общей интенсивности флуоресцентного сигнала в поле (Рис. 5). 63 Рисунок 5. Конкурентное ингибирование связывания 4D5scFv-miniSOG с рецептором HER2/neu на поверхности клеток SK-BR-3. Клетки инкубировали с 500 нM 4D5scFvminiSOG (A) или со смесью 500 нM 4D5scFv-miniSOG и 500 нM 4D5scFv (Б) в течение 1 ч при 37C. Интегральный сигнал флуоресценции в обоих случаях измеряли с помощъю конфокального микроскопа и представляли в виде гистограммы (В): красным цветом обозначен сигнал от клеток, обработанных 4D5scFv-miniSOG, черным – от клеток обработанных смесью 4D5scFv-miniSOG и 4D5scFv. Полученные данные свидетельствуют о том, что связывание 4D5scFv-miniSOG с клетками, гиперэкспрессирующими опухолевый маркер HER2/neu, является специфическим к данному рецептору. Показано, что 4D5scFv-miniSOG имеет флуоресцентный сигнал, незначительно превосходящий аутофлуоресценцию клеток и слабо детектируется флуоресцентным микроскопом. Но учет всех контролей и тщательный подбор параметров фотодетекции позволяют проводить оценку связывания белка при помощи конфокального микроскопа. Эти данные являются подтверждением результата о специфическом связывании антитела в составе молекулы 4D5scFv-miniSOG с антигеном HER2/neu, полученного нами при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса. 4.1.2.5 Внутриклеточная локализация 4D5scFv-miniSOG Ранее показано, что анти-HER2/neu-конъюгаты, и в том числе анти-HER2/neu рекомбинантные токсины, проникают в клетку рецептор-опосредованным эндоцитозом, после чего направляются в эндосомы и лизосомы [177-180]. В то же время фотосенсибилизаторы без «адреса», например, пирофеофорбид-а и вертепорфин, преимущественно поступают в митохондрии [180, 181]. Для определения внутриклеточной локализации адресного иммуноФС 4D5scFv-miniSOG исследовали его колокализацию с лизосомами и митохондриями – органеллами клетки, куда предположительно может поступать белок после интернализации. Для этого клетки линии SKBR-3 инкубировали с иммуноФС, обрабатывали красителями органелл MitoTrackerRed (митохондрии) и LysoTracker Red (лизосомы) и помещали в СО2-инкубатор на 20 мин и 3 ч, соответственно. На рис. 6А видно, что бо́ льшая часть 4D5scFv-miniSOG в результате такой 64 обработки попадает в лизосомы. Количественный анализ коэффициентов колокализации был выполнен с помощью пакета программ Carl Zeiss LSM-710-NLO. Коэффициенты колокализации позволяют оценить вклад флуоресцентных сигналов в зеленом и красном каналах по отношению к средней интенсивности сигнала одного из каналов, то есть количественно оценить колокализацию белка 4D5scFv-miniSOG (зеленый канал) и красителей органелл (красный канал) [183]. Нами было показано, что через 3 ч после инкубации с 4D5scFv-miniSOG 72% лизосом клетки содержат белок (коэффициент колокализации Ch1-T1; рис.6В), и эти данные служат дополнительным подтверждением рецептор-опосредованного эндоцитоза белка. В то же время количество белка в лизосомах составляет всего 21% от его общего содержания в клетке (коэффициет Ch2-T1, рис 6), что говорит о том, что большая часть 4D5scFv-miniSOG находится не в кислой среде лизосом, а, предположительно, в эндосомах. Аналогичный анализ колокализации белка с MitoTrackerRed выявил, что 28% митохондрий клетки содержат белок (рис.6Г) и 23% белка колокализуется с митохондриями. 65 Рисунок 6. Определение внутриклеточной локализации 4D5scFv-miniSOG в клетках SK-BR3, окрашенных красителем митохондрий MitoTrackerRed (А) и лизосом LysoTracker Red (Б). Представлены микрофотографии флуоресценции 4D5scFv-miniSOG (i, зеленый канал), окрашенных органелл (ii, красный канал), наложение микрофотографий флуоресценции зеленого и красного каналов (iii), Количественный анализ коэффициентов колокализации 4D5scFv-miniSOG с LysoTrackerRed (В) и MitoTrackerRed (Г) с диаграммами рассеяния по частоте и интенсивности сигналов флуоресценции белка и окрашенных органелл. Таким образом, мы показали, что бо́ льшая часть полученного нами анти-HER2/neu белка 4D5scFv-miniSOG направляется в лизосомы, что служит косвенным доказательством того, что эндоцитоз происходит посредством рецептора HER2/neu. В ряде работ было показано, что HER2/neu локализуется преимущественно в липидных рафтах плазматической мембраны и 66 входит в состав крупных кластеров, которые при активации HER2/neu увеличиваются в размерах[184, 185]. Поэтому повреждение самого рецептора HER2/neu в плазматической мембране может отразиться на мобильности HER2/neu или повлиять на димеризацию с его партнерами, что может препятствовать взаимодействию рецепторов и эндоцитозу [186]. Ингибирование эндоцитоза HER2/neu при ФДТ может происходить в результате окисления липидов мембран. Тем не менее перекисное окисление липидов считается относительно медленным процессом, который проявляется через 30 мин после облучения [186]. Было показано, что усиленное перекисное окисление липидов при ФДТ происходит в лизосомах, так как, во-первых, эти органеллы имеют низкий рН, а во-вторых, высокие концентрации Fe(II) и Fe(III). Выступая катализаторами (реакция Фентона), ионы железа могут запускать автокатализируемое перекисное окисление липидов, усугубляя окислительное повреждение клеток [187]. Таким образом, мы полагаем, что в последующих экспериментах по изучению фотоиндуцируемой цитотоксичности белка облучение культуры необходимо проводить на момент локализации белка внутри клетки. В случае локализации 4D5scFvminiSOG с внешней стороны мембраны на момент облучения эффект может быть менее выражен, так как фотодинамическое воздействие может предотвратить эндоцитоз. 4.2. Изучение фотоцитотоксичности полученного белка на линии опухолевых клеток при облучении синим светом 4.2.1 Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG in vitro Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG проводили in vitro с помощью стандартного МТТ-теста на клетках SK-BR-3, инкубированных в течение 1 ч при 37°C с белком 4D5scFv-miniSOG в диапазоне концентраций от 1 нM до 500 нM (Рис. 7). Для облучения клеток использовали источник синего света, который обеспечивает плотность потока энергии на дне планшета, равную 55 мВт/см2. Было показано, что дозозависимое снижение жизнеспособности клеток SK-BR-3 происходит после обработки их иммуноФС 4D5scFv-miniSOG с последующим облучением в течение 10 мин, в то время как в отсутствие облучения токсичность не проявляется (Рис. 7, розовая и синяя кривые). Относительная фототоксичность IC50 (концентрация вещества, вызывающая 50% гибель клеток) белка 4D5scFv-miniSOG на клетках SK-BR-3 составила 160 нM. Было показано также, что при наибольшей исследованной концентрации белка 4D5scFv-miniSOG - 500 нМ количество выживших клеток составило 21%. 67 Рисунок 7. Концентрационные кривые цитотоксичности 4D5scFv-miniSOG на клетках SKBR-3 в отсутствие облучения, при облучении и при добавлении таксола®. В сравнении с анти-HER2/neu scFv-ФС конъюгатами, полученный нами белок в 8 раз эффективнее, чем анти-HER2/neu-пирофеофорбид-а и в 30 раз эффективнее, чем анти-HER2/neu вертепорфин [188]. Так как большинство ФС, используемых в клинической практике, являются гиброфобными/ липофильными, они склонны к агрегации в водных растворах, что создает трудности при конъюгации с антителами. К тому же такие иммуноконъюгаты фотосенсибилизаторов не всегда характеризуются постоянством состава. Так как 4D5scFvminiSOG является гибридным белком, полученным генно-инженерным способом, он имеет постоянное соотношение модулей ФС и мини-антитела, которые прочно соединены между собой. К тому же, такой способ исключает наличие примесей каждого из доменов белка и позволяет нарабатывать конечный продукт в бактериальном штамме в активной форме. 4.2.2 Сочетанное действие 4D5scFv-miniSOG и таксола® В современной онкологии для увеличения эффективности лечения используют комбинированное воздействие на опухоль агентов с различным механизмом действия. Это позволяет значительно понизить дозу каждого из компонентов системы и избежать нежелательных побочных эффектов. Считается, что допустимый уровень IC50 цитотоксического вещества лежит в наномолярных концентрациях и ниже. Препараты, которые оказывают терапевтический эффект в микромолярных концентрациях являются опасными для применения, так как в такой концентрации могут вызвать в организме нежелательные побочные эффекты. 68 Кроме того, долгое использование одного препарата значительно повышает риск возникновения устойчивости к нему. Так, в клинической практике для увеличения эффекта ФДТ часто используют цитостатики – препараты, воздействующие на быстро делящиеся клетки. Для увеличения эффективности созданного нами иммуноФС мы использовали цитостатик паклитаксел (таксол®), который ингибирует клеточный цикл в фазе G2 и М [189, 190]. Предварительно была определена цитотоксичность таксола® при помощи МТТ-теста на клетках SK-BR-3. Показано, что 1нM таксол® вызывает гибель 40% клеток (Приложение 2). Данная концентрация таксола® была выбрана нами для изучения совместного действия последнего с белком 4D5scFv-miniSOG. Для этого клетки преинкубировали с цитостатиком, добавляли белок и проводили облучение. В данном случае также показана выраженная дозовая зависимость жизнеспособности клеток от концентрации 4D5scFv-miniSOG в интервале концентраций от 0 до 500 нм (Рис. 7, черная кривая). 100% гибели опухолевых клеток после облучения удалось достичь при использовании комбинации 1 нМ таксола® и 250 нМ иммуноФС 4D5scFv-miniSOG (Рис. 7). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, обработанные отдельными компонентами сконструированного иммуноФС – мини-антителом 4D5scFv и фототоксичным белком miniSOG, а также его кофактором ФМН (Рис. 8А). В качестве контроля HER2/neuотрицательных клеток использовали линию CHO. Было показано, что 4D5scFv-miniSOG не влияет на их жизнеспособность (Рис. 8Б). В случае CHO сочетанное применение 4D5scFvminiSOG не усиливало действия 1 нМ таксола® (Рис. 8Б). Таким образом, мы показали, что цитотоксическое действие 4D5scFv-miniSOG было избирательным по отношению к клеткам, гиперэкспрессирующим HER2/neu, как при облучении, так и при сочетанном применении с таксолом®. 69 Рисунок 8. Концентрационные кривые цитотоксичности отдельно взятых 4D5scFv, miniSOG и FMN на клетках SK-BR-3 (А). Концентрационные кривые цитотоксичности 4D5scFv-miniSOG на клетках CHO (контроль) в условиях наличия и отсутствия облучения и при добавлении таксола® (Б). 4.2.3 Выяснение механизмов гибели клетки под воздействием 4D5scFv-miniSOG Важной и актуальной проблемой при создании нового ФС является выяснение механизмов гибели клетки при его фотоиндуцированном воздействии, которая может проходить по типу некроза или апоптоза. Чаще всего в результате фотодинамического воздействия в клетке инициируется апоптоз (см. главу «обзор литературы»). В зависимости от внутриклеточной локализации ФС ФДТ способна запускать различные апоптотические пути. Также тип клеточной гибели может варьировать в зависимости от линии клеток, от количества адресного рецептора и от скорости его интернализации [191]. Для определения типа клеточной гибели мы изучили морфологические изменения клеток под воздействием 4D5scFv-miniSOG в эксперименте, аналогичном МТТ-тесту. Также изучили такие биохимические показатели клеток, как активность каспазы-3 и фрагментация ДНК, которые являются основными маркерами апоптоза. 4.2.3.1 Микроскопия Морфологию опухолевых клеток, обработанных иммуноФС 4D5scFv-miniSOG, изучали непосредственно после облучения под микроскопом. Было обнаружено, что через 30 мин происходит увеличение клеток в размере и нарушение целостности клеточной мембраны (Рисунок 9А,Б). Известно, что такое грубое нарушение целостности клетки, которое, как правило, наблюдается сразу после воздействия, характерно для некроза. Клетки, не обработанные иммуноФС 4D5scFv-miniSOG, но облученные в том же режиме, не проявляли видимых морфологических изменений (данные не приведены). Также HER2/neu-отрицательные клетки яичников китайского хомяка CHO, использованные в качестве контроля, не изменили свою морфологию после обработки белком и последующего облучения (Рис. 9В,Г). Полученные результаты позволили нам предположить, что обработка клеток иммуноФС 4D5scFv-miniSOG с последующим облучением избирательно вызывает некроз опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих HER2/neu. 70 Рисунок 9. Морфология клеток SKBR-3 (А, Б) и CHO (В, Г) до облучения (А, В) и через час после облучения (Б, Г). 4.2.3.2 Активность каспазы-3 Для более тонкого изучения механизма цитотоксического действия иммуноФС 4D5scFvminiSOG был использован колориметрический метод определения уровня активности эффекторной каспазы-3, которая на сегодняшний день является достоверным маркером апоптоза [192, 193]. Как видно на Рисунке 10А, в клетках SK-BR-3, обработанных иммунотоксином 4D5scFv-miniSOG, уровень активности каспазы-3 сравним с отрицательным контролем (клетки SK-BR-3 в PBS). В то же время на клетках SK-BR-3, обработанных индуктором апоптоза - 2 мМ CaCl2, активность каспазы-3 увеличивается на порядок по сравнению с отрицательным контролем. Таким образом, полученный нами результат доказывает, что путь гибели клеток SK-BR-3 под воздействием белка 4D5scFv-miniSOG не является апоптотическим. 4.2.3.3 Фрагментация ДНК В качестве еще одного независимого метода определения типа клеточной гибели был использован цитометрический метод определения фракции клеток с фрагментированной хромосомной ДНК (фракции гипоплоидных клеток, или subG1-фракции). В данном эксперименте было показано, что популяция клеток SK-BR-3, обработанная иммуноФС 4D5scFv-miniSOG с последующим облучением, не содержала значимого количества 71 фрагментированной хромосомной ДНК (Рис. 10Б), что является еще одним доказательством неапоптозного механизма клеточной гибели. А Б Рисунок 10. Изучение механизма токсического действия 4D5scFv-miniSOG. А – Определение активности каспазы-3 на линии клеток SK-BR-3, обработанных 4D5scFv-miniSOG, CaCl2 и буфером PBS. Б - Цитометрическое определение доли sub-G1-фракции ДНК в популяции клеток SK-BR-3, обработанных 4D5scFv-miniSOG, CaCl2 и буфером PBS, после окрашивания клеток йодидом пропидия. Полученные данные свидетельствуют в пользу клеточной гибели при фотоиндуцированном воздействии сконструированного иммуноФС 4D5scFv-miniSOG по типу некроза. Известно, что в организме некроз вызывает резкую воспалительную реакцию и привлечение репаративных механизмов, которые являются нежелательными для многих клинических случаев при опухолевом процессе. С другой стороны, этот тип клеточной гибели может быть преимуществом при лечении опухолей небольшого размера, так как некроз усиливает действие иммунной системы и привлекает лейкоциты в место опухоли, тем самым осуществляя презентацию антигена [194]. Поэтому мы полагаем, что полученный нами белок может найти применение среди противоопухолевых агентов направленного действия. В результате данного этапа работы нами был получен и охарактеризован новый уникальный белок - иммунофотосенсибилизатор 4D5scFv-miniSOG, который специфически связывается с HER2/neu-гиперэкспрессирующими клетками аденокарциномы молочной железы человека, интернализуется и вызывает их фотоиндуцированный некроз при облучении синим светом. Также, с использованием 1нМ концентрации цитостатика таксола® удалось добиться 100% гибели клеток. Способность некоторых ФС повреждать плазматическую мембрану клеток последние годы используется для высвобождения цитотоксических агентов, захватываемых клеткой в эндосому, непосредственно в цитозоль. Данным метод получил название фотохимической интернализации (ФХИ) и основан на использовании ФС, локализованных преимущественно в 72 эндосомах и лизосомах клеток, которые разрушают эти структуры под действием света, что приводит к высвобождению захваченных при эндоцитозе макромолекул в цитозоль[195]. Такая технология специально разрабатывалась для доставки в клетки лекарств и генов. Под действием света, направленного на опухолевую ткань, ФС усиливает захват клетками гидрофильных противоопухолевых препаратов, например блеомицина, которые легко метаболизируются. Подобный подход позволяет в значительной степени повысить биодоступность лекарства и эффективность его доставки, усиливая тем самым терапевтическое действие. Поэтому мы предполагаем, что способность 4D5scFv-miniSOG повреждать плазматическую мембрану, а также его способность проникать в лизосомы клетки при его сочетанном применении может значительно повысить селективность воздействия многих противоопухолевых препаратов с применением ФХИ. 4.3. Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИКсветом с использованием апконвертирующих нанофосфоров Сконструированный нами иммуноФС 4D5scFv-miniSOG, а также используемые в клинике низкомолекулярные ФС возбуждаются видимым светом, не проникающим на глубину тканей. Такие ФС применяют для лечения либо небольших поверхностных опухолей на коже и слизистой оболочке, либо опухолей на внутренней поверхности различных органов с локальной доставкой света оптоволокном в сочетании с лапароскопией. Из литературы известны низкомолекулярные ФС, применяемые для визуализации и терапии с возбуждением в ближней ИК-области спектра [196, 197]. Однако следует отметить, что их применение ограничено системной цитотоксичностью и невысоким выходом АФК. Нетривиальным решением данной проблемы является использование неорганических наноразмерных люминесцирующих частиц – нанофосфо́ ров (НАФ). Такие наночастицы обладают уникальным свойством апконверсионной люминесценции, которое заключается в конверсии низкоэнергетических фотонов (ближний ИК) в высокоэнергетические фотоны (УФ и видимый) посредством мультифотонных процесов [198, 157]. В настоящей работе была изучена возможность использования этого эффекта для фотоиндуцированного разрушения клеток ИК-светом, хорошо проникающим в ткани, путем возбуждения сконструированного иммуноФС, а также присутствующих в опухолях эндогенных ФС, в том числе флавиновой природы. Для этого необходимо было, во-первых, создать и исследовать донорно-акцепторные пары, в которых НАФ выступают в роли донора возбуждающей энергии, а сконструированный нами флавиновый иммуноФС 4D5scFv-miniSOG 73 – в роли акцептора, а во-вторых, разработать способы доставки НАФ в опухолевую клетку и изучить их потенциал в качестве ФС при облучении ИК-светом, а также изучить возможность фототоксичного действия эндогенных ФС на опухолевые клетки на примере рибофлавина. 4.3.1. Создание и исследование донорно-акцепторных пар НАФ:4D5scFvminiSOG, возбуждаемых ближним ИК-светом Мы предположили, что для разрушения опухолевых клеток сконструированным иммуноФС 4D5scFv-miniSOG путем фотоиндукции ИК-светом необходимо создать подходящую донорноакцепторную пару НАФ:ФС, способную к эффективному переносу энергии НАФ на ФС. Среди подобных пар на основе НАФ, описанных в литературе, наибольшей эффективностью отличаются те, в которых ФС переходит в возбужденное состояние посредством фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET) от возбужденной частицы [199]. Эффективность FRET определяется тем, что возбужденный НАФ передает энергию на ФС за счет безызлучательного переноса энергии, т.е. без испускания фотонов. В результате такого процесса энергия возбужденного состояния наночастицы переносится на ФС, который в свою очередь передает энергию на молекулярный кислород, переводя его из основного триплетного состояния в цитотоксичное синглетное. Для того чтобы донорно-акцепторная пара обменивалась энергией по FRET механизму, необходимо соблюдение следующих важных условий: 1) перекрывание спектров испускания донора и поглощения акцептора; 2) относительная близость донора и акцептора (~5 нм), так как вероятность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между ними; 3) совпадение ориентации дипольного момента донора и акцептора; 4) достаточное время жизни возбужденного состояния донора [200]. 4.3.1.1 Перекрывание спектров Спектр поглощения 4D5scFv-miniSOG находится в УФА1 (350-400 нм) и синей областях с максимумом на длине волны 450 нм. В качестве донора для 4D5scFv-miniSOG были подобраны апконвертирующие неорганические наночастицы NaYF4, солегированные редкоземельными элементами Tm3+ и Yb3+ (далее НАФ(Tm3+)), со средним размером 80 нм (Рис. 11А), синтезированные А.В. Нечаевым, МИТХТ им.М.В. Ломоносова. Полученные совместно с ИПЛИТ РАН данные о спектральных характеристиках НАФ(Tm3+) и 4D5scFv-miniSOG свидетельствуют, что данная донорно-акцепторная пара удовлетворяет первому условию (Рис. 11Б). При возбуждении излучением с длиной волны 975 нм НАФ(Tm3+) имеют несколько основных линий люминесценции с максимумами на длинах волн 345, 360, 450, 475 и 800 нм (Рис. 11Б, черная линия), первые четыре из которых перекрываются со спектром возбуждения 74 сконструированного нами иммуноФС 4D5scFv-miniSOG (Рис. 11Б, голубая штриховая линия). По тушению флуоресценции донора и возникновению более длинноволновой флуоресценции акцептора (стоксов сдвиг) можно оценивать FRET. Рисунок 11. Фотофизическая характеристика НАФ(Tm3+). А- фотография апконвертирующих нанофосфоров НАФ(Tm3+), полученная при помощи просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ); Б - Спектр антистоксовой люминесценции НАФ при возбуждении излучением лазера на длине волны 975 нм (черная линия) и спектр поглощения (голубая штриховая линия) и флуоресценции (зеленая линия) 4D5scFv-miniSOG. Выполнение трех других условий возникновения FRET для донорно-акцепторной пары НАФ(Tm3+)-4D5scFv-miniSOG предстояло выяснить экспериментальным путем. 4.3.1.2 Стабилизация НАФ в водных растворах Поскольку изначально синтезированные частицы покрыты олеатной оболочкой и гидрофобны, для получения FRET-пары на основе НАФ(Tm3+) в биосовместимом виде нам потребовалось решить проблему стабилизации этих наночастиц в водных дисперсиях. Для этого А.Н. Генераловой (ИБХ РАН) была проведена гидрофилизация их поверхности с использованием реакции с гидроксидом тетраметиламмония (ТМАГ), которая позволяет частично удалить координационно-связанный олеат, стабилизируя наночастицу в буферных и водных растворах [17] Методом динамического рассеяния света нами было показано, что полученные водорастворимые НАФ являются монодисперсными и имеют размер ~80 нм. Методом электрофоретического рассеяния света было показано, что дзета-потенциал поверхности НАФ(Tm3+), гидрофилизованных ТМАГ, стабильности частиц в водных растворах. составляет -20 мВ, что свидетельствует о 75 4.3.1.3 FRET Далее изучили возможность FRET от НАФ(Tm3+) на 4D5scFv-miniSOG. Для этого к водной дисперсии модифицированных наночастиц в концентрации 80 мкг/мл добавляли 20 мкМ 4D5scFv-miniSOG, после чего проводили измерение спектров люминесценции донорноакцепторной пары, сформированной за счет физиосорбции белка на поверхности наночастицы. На Рисунке 12 представлен спектр фотолюминесценции комплекса НАФ(Tm3+)-4D5scFvminiSOG при возбуждении на длине волны 975 нм. В спектре фотолюминесценции регистрируется широкая полоса флуоресценции 4D5scFv-miniSOG, а линии люминесценции наночастиц, попадающие в полосу поглощения белка, теряют энергию, что служит косвенным доказательством того, что созданная нами донорно-акцепторная пара НАФ(Tm3+):4D5scFvminiSOG обменивается энергией по механизму FRET. Рисунок 12. Спектр излучения комплекса НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG в PBS при возбуждении на длине волны 975 нм. Для количественной оценки эффективности процесса FRET требуется измерение времени жизни люминесценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора [159]. Это позволяет рассчитать эффективность процесса FRET (η) по следующей формуле: η=1 - (tDA/tD) где tDA – время жизни донора в присутствии акцептора и tD – время жизни донора в отсутствие акцептора. Эффективность FRET также может быть выражена в процентах: η%= η*100%. В результате измерения времен жизни возбужденного состояния совместно с ИПЛИТ РАН было показано, что наибольшая эффективность FRET для донорно-акцепторной пары НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG характерна для перехода энергии на длине волны 475 нм и составляет 11%. На длине волны 360 нм эффективность переноса составила 3%. Также было показано, что на длинах волн 450 и 345 нм переноса энергии не происходит. 76 4.3.1.4 Фёрстеровский радиус Как было сказано выше, вторым условием, ограничивающим эффективный FRET, является расстояние между донором и акцептором (R). Определить расстояние можно, вычислив значение фёрстеровского радиуса (RО), который является максимальным расстоянием между молекулами донора и акцептора, при котором будет происходить передача энергии по механизму FRET на уровне 50%. Как правило, значение RО не превышает 6 нм [159]. Для двух длин волн, при которых происходит процесс переноса энергии: 475 и 360 нм, были вычислены значения фёрстеровских радиусов донорно-акцепторной пары НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG. R0475нм =2.7 нм и R0360нм =2.0 нм. Зная эффективность FRET и RО, можно определить фактическое расстояние между донором и акцептором (R) по формуле: R = R0 • [(1/ η) - 1]1/6 Таким образом, было рассчитано, что фактическое расстояние между донором и акцептором в донорно-акцепторной паре НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG составляет для длины волны 475 нм R475nm ≈ 3.8 нм и для длины волны 360 нм R360nm ≈ 3.6 нм. Расхождение в оценках, полученное для двух длин волн, может быть связано с ошибками при измерениях времени жизни люминесценции донора. 4.3.1.5 Доказательство FRET Для эффективной апконверсионной фотолюминесценции очень важную роль играет поверхность НАФ, так как на ней находится множество ионов Tm3+ и Yb3+, которые могут передавать возбуждение на воду, что вызывает тушение люминесценции. Для устранения эффекта тушения при получении НАФ(Tm3+) использовали методику покрытия «активных» частиц «неактивной» оболочкой NaYF4, или core/shell-технологию. За счет того, что активная поверхность НАФ отделена от воды оболочкой (shell), не содержащей лантаноиды, большая часть энергии расходуется на люминесценцию. Расчет расстояния между донором и акцептором (R) указывает на то, что толщина «неактивной» оболочки НАФ(Tm3+) в среднем составляет 3.7 нм. Однако для того, чтобы в донорно-акцепторной паре НАФ(Tm3+):4D5scFvminiSOG происходила эффективная передача энергии по типу FRET, толщина неактивной оболочки у наночастицы не должна превышать 2.7 нм (значение фёрстеровского радиуса для длины волны 475 нм). Для того, чтобы доказать возможность генерации синглетного кислорода во FRET-паре НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG при возбуждении ближним ИК, мы использовали флуоресцентный сенсор синглетного кислорода Singlet oxygen sensor green (SOSG, Life Scienсes, USA). SOSG специфически взаимодействует с синглетным кислородом с 77 образованием продукта реакции, обладающего флуоресценцией с максимумом на длине волны 525 нм при облучении синим светом . Данное свойство сенсора мы использовали для определения динамики наработки синглетного кислорода в водной дисперсии пары НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG. Поскольку miniSOG флуоресцирует в зеленой области спектра, то при измерениях интенсивность собственной флуоресценции белка принимали за точку отсчета. При добавлении к водной дисперсии НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG реактива SOSG до конечной концентрации 5 мкМ мы регистрировали рост интенсивности флуоресценции с течением времени при облучении на длине волны 975 нм, что доказывает наработку синглетного кислорода (Рис. 13). Рисунок 13. Регистрация образования синглетного кислорода при облучении FRET-пары НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG Нам удалось ингибировать данный процесс тушителем образования синглетного кислорода - азидом натрия (NaN3) [202]. При добавлении NaN3 к водной дисперсии смеси НАФ(Tm3+) и 4D5scFv-miniSOG было зарегистрировано прекращение роста интенсивности флуоресценции, что свидетельствует об ингибировании процесса образования синглетного кислорода. В результате мы доказали способность НАФ(Tm3+) к безызлучательной передаче энергии на 4D5scFv-miniSOG в водной дисперсии смеси донора и акцептора за счет FRET-механизма с последующим образованием синглетного кислорода. Стоит отметить, что на сегодняшний день только в одной работе описан FRET от НАФ на флавопротеин. Peter Harvey с соавт. показали возможность наблюдения за окислительновосстановительным статусом флавопротеина пентаэритритолтетранитратредуктазы (PETNR) при помощи НАФ Gd4O2S:Yb:Tm, спектры люминесценции которых перекрывались со спектром возбуждения флавопротеина [203]. Из-за наличия/отсутствия поглощения 78 флавинового кофактора при окислении/восстановлении фермента FRET между донором и акцептором либо включался, либо выключался. Двухэлектронное восстановление молекулы ФМН вызывало потерю ее поглощения при 460 нм и обесцвечивание раствора, что предотвращало FRET. Таким образом, по уменьшению пика эмиссии НАФ при добавлении ФМН и возвращению эмиссии на прежний уровень при восстановлении ФМН авторы судили о включении/выключении FRET. «Вернуть» FRET получалось при встряхивании пробы на воздухе с целью реокисления ФМН. Циклы окисления/восстановления можно было проводить более трех раз, и это не сказывалось на спектральных свойствах флавина. Таким образом, авторами был описан способ использования НАФ для наблюдения за функционированием биологических систем, а в частности за окислительно-восстановительным состоянием флавопротеинов. Полученный авторами результат подтверждает определяющую роль кислорода в эффективности протекания FRET в системе НАФ:флавин. 4.3.1.6 Конъюгация НАФ с белками Для дальнейших исследований эффекта FRET на опухолевых клетках и животных моделях необходимо было получить стабильный биосовместимый комплекс НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG. Одним из эффективных способов конъюгации наночастиц с белками является формирование устойчивой ковалентной связи между карбоксильной группой полимерной оболочки НАФ и аминогруппой белка [175]. Для конъюгации с белком НАФ(Tm3+) предварительно покрыли устойчивой полимерной оболочкой, представляющей собой амфифильный чередующийся сополимер октадецена-1 и малеинового ангидрида (PMAO), что обеспечило наличие свободных карбоксильных групп на поверхности НАФ(Tm3+). Прежде чем проводить биоконъюгацию модифицированных НАФ(Tm3+)-РМАО с белком 4D5scFv-miniSOG, мы исследовали спектры люминесценции данной донорноакцепторной пары в растворе в том же соотношении, что описано для НАФ(Tm3+):4D5scFvminiSOG выше. В результате при возбуждении ИК-излучением мы не наблюдали появления полосы флуоресценции 4D5scFv-miniSOG и потери энергии линий люминесценции наночастиц. Полученный результат говорит о том, что обмен энергией по механизму FRET в данной донорно-акцепторной паре не реализуется. Вероятно, при покрытии НАФ(Tm3+) дополнительной полимерной оболочкой PMAO расстояние между донором НАФ(Tm3+) и акцептором 4D5scFv-miniSOG превысило максимальное расстояние, необходимое для возникновения FRET. Поскольку принципиальная возможность к безызлучательной передаче энергии в донорно-акцепторной паре НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG с последующим образованием синглетного кислорода была нами ранее показана для частиц без полимерной 79 оболочки, наиболее перспективным направлением дальнейших исследований является усовершенствование структуры неактивной оболочки (shell) наночастиц НАФ(Tm3+), которые могут использоваться в паре с 4D5scFv-miniSOG, а также с другими флавиновыми ФС. Нами установлено, что, для того чтобы добиться 50% эффективности FRET в данной системе и позволить проводить модификацию поверхности НАФ полимерами, суммарная толщина двух оболочек (полимерной и shell) NaYF4 не должна превышать 2.7 нм. 4.3.2. Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом Известно, что в клетках содержится множество эндогенных ФС, в том числе флавиновой природы, спектры возбуждения которых также могут перекрываться со спектром антистоксовой люминесценции НАФ(Tm3+). Поэтому представлялось перспективным создать адресные НАФ(Tm3+), специфично взаимодействующие с опухолевыми клетками, и изучить их цитотоксичность, фотоиндуцируемую ИК-светом. Для нацеливания НАФ(Tm3+) на клетки аденокарциномы молочной железы и другие опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие поверхностный маркер HER2/neu мы, во-первых, планировали создать и охарактеризовать бифункциональный адресный белок DARPin-mCherry и провести его конъюгацию с поверхностью НАФ(Tm3+), покрытых полимерной оболочкой РМАО. Второй важной задачей являлось изучение фототоксичности конъюгата НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry на клетках SK-BR-3 и разработка контролей, позволяющих оценить вклад каждого компонента такой сложной системы в снижение жизнеспособности раковых клеток. 4.3.2. 1 Получение и характеристика адресного белка DARPin-mCherry В состав бифункционального белка DARPin-mCherry в качестве адресного модуля, способного с высокой селективностью узнавать поверхностный маркер HER2/neu, входит белок DARPin9-29, принадлежащий к новому классу нацеливающих молекул неиммуноглобулиновой природы, в качестве детектирующего модуля применен красный флуоресцентный белок mCherry. Устойчивость к изменениям рН, размер (46 кДа) и отрицательный заряд DARPin-mCherry (pI=5.1) [72] определяют пригодность данного белка для проведения процедуры 80 биоконъюгации с отрицательно заряженными НАФ(Tm3+), покрытыми PMAO (дзета-потенциал -30, Приложение 3). Кроме того, флуоресцентное мечение частиц предпочтительно для наблюдения их локализации в клетке. Поскольку DARPin-mCherry является конечным целевым рекомбинантным продуктом, он характеризуется постоянством состава и воспроизводимостью оптических характеристик. Для получения целевого гибридного белка DARPin-mCherry была создана генетическая конструкция pDARP-mCherry, несущая под контролем индуцируемого промотора фага Т7 ген рекомбинантного белка DARPin-mCherry, содержащего в составе единой полипептидной цепи адресный модуль неиммуноглобулиновой природы DARPin9-29 [206], высокоаффинный к онкомаркеру HER2/neu, красный флуоресцентный белок mCherry [207, 208], а также гексагистидиновую последовательность на 3'-конце. С-концевой домен адресного модуля DARPin9-29 соединен с N-концевым доменом флуоресцентного модуля mCherry через гибкий шарнироподобный линкер PKPSTPPGSS. В результате экспрессии созданной генетической конструкции в штамме E.coli BL21(DE3) и последующей очистки из растворимой фракции клеточного лизата получили гибридный белок DARPin-mCherry. Яркая красная окраска белка mCherry позволила визуально отслеживать как его экспрессию в процессе культивирования штамма-продуцента, так и очистку гибридного белка с помощью металлоаффинной хроматографии. Анализ состава индуцированной культуры в 12% ПААГ показал высокий уровень экспрессии белка в растворимой форме, что значительно упростило процедуру его очистки. Белок был очищен в одну стадию при помощи металлоаффинной хроматографии, анализ полученного препарата показал отсутствие примесей других белков (Рис. 14А). Выход очищенного белка составил 40 мг с литра жидкой культуры. По данным электрофореза, молекулярная масса белка составляет 46 кДа, что соответствует расчетному значению. 81 Рисунок 14. Характеристика гибридного белка DARPin-mCherry. А – электрофорез в 12% SDSПААГ очищенного препарата белка DARPin-mCherry. М – маркер молекулярных масс (10250кДа, Сибэнзим); Б – сенсограмма связывания белка DARPin-mCherry с сенсорным чипом CM-5. Линии сенсограммы отражают связывание DARPin-mCherry при трех различных концентрациях с чипом, покрытым рекомбинантным антигеном p185HER/2-ECD (внеклеточный домен рецептора HER2/neu) Согласно литературным данным [209, 210], DARPin9-29 взаимодействует с субдоменом I рецептора HER2/neu на поверхности раковых клеток с аффинностью KD=3.8 нM [210]. Константу диссоциации комплекса гибридного белка DARPin-mCherry с внеклеточным доменом HER2/neu измеряли на приборе BIAcore. Для этого рекомбинантный антиген HER2/neu иммобилизовали на поверхности СМ-5 сенсорного чипа с плотностью 4500 резонансных единиц. Константу диссоциации рассчитывали исходя из данных сенсограммы (Рис. 14Б) с использованием пакета программ BIAevaluation 3.0 software, она составила 4.5 нM, что незначительно превышает значение для свободного DARPin9-29 [210]. Характеристику специфичности связывания рекомбинантного белка DARPin-mCherry с клетками, гиперэкспрессирующими онкомаркер HER2/neu проводили с использованием конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710-NLO (совместно с ИОФ РАН им. А.М. Прохорова) (рис. 15). Для этого линию клеток аденокарциномы молочной железы человека SKBR-3, гиперэкспрессирующую рецептор HER2/neu, инкубировали с 1 мкM раствором белка. Анализ клеток проводили после трехкратной отмывки их в PBS от несвязавшегося белка. Яркий флуоресцентный сигнал на поверхности клеток линии SK-BR-3 свидетельствует о том, что белок DARPin-mCherry эффективно связывается с рецептором HER2/neu (рис. 15б). В качестве 82 контроля специфичности связывания белка DARPin-mCherry с рецептором HER2/neu мы использовали клетки линии CHO, которые не экспрессируют данный онкомаркер на своей поверхности. Отсутствие флуоресцентного сигнала на поверхности клеток CHO (рис. 15а) является доказательством селективного взаимодействия гибридного белка DARPin-mCherry c онкомаркером HER2/neu на поверхности раковых клеток. Рисунок 15. Детекция связывания гибридного белка DARPin-mCherry с HER2/neuположительными клетками. Представлены конфокальные изображения клеток CHO (а, в) и SKBR-3 (б, г), обработанных белком DARPin-mCherry; изображения а, б, сделанные в красном канале флуоресценции, соответствуют изображениям в, г, полученным в проходящем свете. Результаты проточной цитофлуориметрии клеток CHO (д) и SK-BR-3 (е) до обработки белком DARPin-mCherry (графики с серой заливкой) и после инкубации с белком DARPin-mCherry (графики с красной заливкой). Также, с использованием проточной цитофлуориметрии нами было показано достоверное возрастание средней интенсивности флуоресценции детектируемых событий в популяции клеток SK-BR-3, инкубированных с белком DARPin-mCherry, по сравнению с клетками в контроле (рис. 15е). В то же время в популяции клеток CHO подобного эффекта не наблюдали (рис. 15д). Таким образом, был получен новый флуоресцентный гибридный белок DARPin-mCherry, который с высоким выходом наработан в бактериальной системе экспрессии и очищен в одну стадию при помощи металлоаффинной хроматографии. Охарактеризованы специфичность и 83 аффинность белка DARPin-mCherry к рецептору HER2/neu. Полученный препарат белка переводили в буфер PBS и использовали для конъюгации с НАФ-PMAO. 4.3.2.2 Получение и характеристика связывания с клетками конъюгатов НАФРМАО:DARPin-mCherry. Конъюгацию НАФ(Tm3+)-РМАО с адресным белком DARPin-mCherry, специфичным к опухолевому маркеру HER2/neu, осуществляли с использованием EDC (1-этил-3-(3- диметиламинопропил)карбодиимид) в качестве сшивающего реагента. Несвязавшийся белок отделяли с помощью нескольких циклов центрифугирования. Специфичность связывания полученных конъюгатов с клетками изучали на HER2/neuположительных клетках SK-BR-3 в сравнении с HER2/neu-отрицательными клетками СНО, не гиперэкспрессирующими рецептор HER2/neu на своей поверхности. Для этого добавляли конъюгаты НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry к клеткам, инкубировали 5 мин, после чего отмывали и анализировали на флуоресцентном микроскопе. Визуализацию связывания проводили в красном канале флуоресценции, который перекрывается со спектром эмиссии флуорофора mCherry, на микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss). Было показано, что конъюгаты связываются с мембраной клеток SK-BR-3 (рис. 16 Б), в то время как на мембранах СНО не было обнаружено флуоресцентного сигнала (рис. 16 Г). При помещении клеток в CO2инкубатор на 30 мин происходит интернализация рецептора, и флуоресцентный сигнал детектируется уже внутри клетки в виде ярких отчетливых точек. Рисунок 16. Детекция связывания нанокомплекса НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry с HER2/neu-положительными клетками. Представлены флуоресцентные изображения клеток SKBR-3 (А, Б) и СНО (В, Г), обработанных нанокомплексом; изображения А, В, сделанные в проходящем свете, соответствуют изображениям Б, Г, полученным в красном канале флуоресценции. 84 Методом колокализации было показано, что через 2 ч после инкубации конъюгаты НАФ(Tm3+)-РМАО:DARPin-mCherry попадают в лизосомы, о чем свидетельствует желтый сигнал, полученный в результате наложения красного флуоресцентного сигнала конъюгатов и зеленого сигнала лизосом, окрашенных красителем LysoTracker Green DND-26 (рис.17). А В Б Г 3+ Рисунок 17. Внутриклеточная локализация НАФ(Tm )РМАО:DARPin-mCherry. А- светлопольное изображение; Б - наложение изображений В и Г (желтый сигнал); В - лизосомы SK-BR-3, покрашенные 3+ LysoTracker Green DND-26 (зеленый флуоресцентный сигнал); Г - НАФ(Tm )РМАО:DARPin-mCherry (красный флуоресцентный сигнал) Таким образом, были созданы конъюгаты НАФ(Tm3+)-РМАО, функционализированные белком DARPin-mCherry, и показано, что в составе конъюгатов белок сохраняет свои функциональные свойства, а именно, взаимодействует с рецептором HER2/neu на поверхности опухолевых клеток и способствует проникновению наночастиц внутрь клетки. 4.3.2.3 Оценка цитотоксичности конъюгата НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry при облучении ближним ИК-светом. 4.3.2.3.1 Прямая токсичность НАФ(Tm3+)-РМАО и НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry без облучения Для того, чтобы оценить цитотоксичность НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherr была изучена прямая цитотоксичность НАФ(Tm3+)-РМАО. Для этого использовали линии клеток SK-BR-3 и CHO, а также первичную культуру фибробластов человека. Клетки инкубировали с 5% раствором НАФ(Tm3+)-РМАО, приготовленным на культуральной среде, в течение 1 и 24 ч. Анализ выживаемости клеток проводили при помощи проточного цитофлуориметра с 85 использованием маркера целостности клеточной мембраны йодида пропидия (PI). Было показано, что НАФ, покрытые полимерной оболочной РМАО, не оказывают влияния на выживаемость фибробластов человека ни через 1 ч, ни через сутки инкубации с наночастицами (Рис. 18). Выживаемость SK-BR-3 и CHO через 24 ч воздействия снизилась незначительно: до 96% и 98%, соответственно. Однако при одночасовом воздействии НАФ(Tm3+)-РМАО снижения выживаемости SK-BR-3 и CHO зарегистрировано не было. Рисунок 18. Выживаемость различных типов клеток после инкубации с НАФ(Tm3+)-РМАО в течение 1 ч и 24 ч. Данный результат свидетельствует о том, что НАФ, имеющие полимерное покрытие РМАО, при использовании в концентрации 5% не оказывают существенного цитотоксического воздействия на данные линии клеток, и поэтому 5% концентрацию НАФ использовали в последующих опытах на клетках. Для изучения цитотоксичности НАФ(Tm3+)-РМАО:DARPin-mCherry клетки SK-BR-3 культивировали в ячейках 96-луночного планшета, инкубировали их с конъюгатами в течение 5 мин, тщательно отмывали PBS и добавляли PI. Анализ проводили на флуоресцентном микроскопе Axiovert200. Было показано, что в отсутствие облучения клетки сохраняли целостность мембраны в течение, как минимум, 3 ч. 4.3.2.3.2 Фотоиндуцируемая ИК-светом цитотоксичность Фотоиндуцируемую ИК-светом цитотоксичность НАФ(Tm3+)-РМАО:DARPin-mCherry по отношению к опухолевым клеткам SK-BR-3 изучали на разработанном в ИПЛИТ РАН эпилюминесцентном инвертированном микроскопе с возможностью возбуждения и регистрации сигнала как от апконвертирующих наночастиц, так и от стоксовых флюорофоров. Собранная установка позволяет проводить облучение клеточной культуры и детектировать 86 люминесцентный сигнал НАФ на длине волны 975 нм в ячейке стандартного 96-луночного планшета (Приложение 4). Для того, чтобы исключить возможность гибели клеток за счет перегрева при облучении, был подобран режим работы лазера, исключающий тепловой шок в клетках. В эксперименте с использованием термопары было показано, что импульсно-периодический режим с частотой повторения импульсов 6 Гц при средней мощности облучения 4 Вт/см2 не вызывает изменения температуры 150 мкл воды в лунке 96-луночного планшета выше 370С (Рис. 19). Поэтому данный режим работы лазера использовали для облучения клеток во всех последующих экспериментах, варьируя исключительно время облучения. Рисунок 19. Нагрев дистиллированной воды в ячейке 96-луночного планшета при облучении на оптическом люминесцентном микроскопе на длине волны 975 нм. В результате 40-мин облучения контрольных клеток, без добавления конъюгатов, в данном режиме никаких морфологических изменений на клетках SK-BR-3 не наблюдали как минимум в течение 3 ч. Снимки клеток в проходящем свете и в красном канале флуоресценции получали при помощи черно-белой камеры каждые 30 мин. Морфология клеток, преинкубированных с конъюгатами, уже через 20 мин после окончания облучения начинала изменяться. В течение часа после начала облучения мы наблюдали появление слабого флуоресцентного сигнала в цитоплазме клеток, что может объясняться связыванием PI с РНК цитоплазмы и свидетельствует о нарушении целостности мембран клеток (рис. 20). В то же время ядра некоторых клеток начинали окрашиваться, и клетки приобретали округлую форму. Через 2 ч после начала облучения можно заметить, что в зоне облучения практически все клетки приобрели округлую форму, как в эксперименте с использованием 4D5scFv-miniSOG в качестве ФС (рис. 9), и стали проницаемы для PI, что, вероятнее всего, говорит о некрозе. 87 А) Б) В) Рисунок 20. Морфологические изменения клеток SK-BR-3, инкубированных с конъюгатами НАФ(Tm3+)-РМАО:DARPin-mCherry и облучаемых ИК-лазером в течение 40 мин. Снимки клеток сделаны в трех каналах: проходящий свет (А), красный флуоресцентный канал (Б), канал люминесценции НАФ(В). Таким образом, повреждение мембран клеток могло произойти либо за счет локального нагрева частиц, либо за счет их фототоксичности, так как данные НАФ(Tm3+) имеют УФА1 линии люминесценции. Известно, что в тканях человека имеется множество хромофоров, которые особенно сильно поглощают в УФА1 и синем видимом спектре. Такие эндогенные ФС представлены различными химическими соединениями, которые различаются путями образования и локализацией в клетке, а также фотохимическим механизмом действия. Чтобы установить, причастно ли ультрафиолетовое воздействие к полученному эффекту мы проделали аналогичный эксперимент с НАФ, дапированными ионами Er3+ вместо Tm3+. Так как НАФ(Er3+) не имеют УФА/синих линий люминесценции, а характеризуются наличием линий люминесценции в зеленой области спектра за счет ионов эрбия, мы предположили, что цитотоксический эффект в данном случае не проявится. По аналогии с НАФ(Tm3+) НАФ(Er3+) покрывали полимерной оболочкой PMAO и конъюгировали с DARPin-mCherry. В результате эксперимента, проведенного в тех же условиях, что и с использованием НАФ(Tm3+), 88 практически все клетки сохранили целостность мембраны, за исключением трех, ядра которых окрасились (Область лунки планшета с поврежденными клетками представлена на Рис. 21). А) Б) В) Рисунок 21. Морфологические изменения клеток SK-BR-3, инкубированных с НАФ(Er3+)РМАО:DARPin-mCherry и облучаемых ИК-лазером в течение 40 мин. Снимки клеток сделаны в трех каналах: проходящий свет (А), красный флуоресцентный канал (Б), канал люминесценции НАФ (В). Наличие трех некротических клеток мы связываем с их чувствительностью именно к термическому воздействию от локально нагретых НАФ(Er3+). Ранее в некоторых работах уже обсуждалось использование НАФ в фототермической терапии (ФТТ) [211, 212]. ФТТ заключается в фотоабсорбции с последующей генерацией тепла из поглощенного света, что приводит с термической абляции раковых клеток. Но так как ионы лантаноидов имеют низкий коэффициент экстинкции, или слабое оптическое поглощение, НАФ, как правило, имеют ограниченную способность конвертировать свет напрямую в тепло[157], что подтверждается нашим экспериментом. Таким образом, сравнение полученных результатов по цитотоксичности НАФ, испускающих в зеленой и УФА1/синей областях спектра, говорит в пользу того, что действие последних обусловлено именно фототоксичностью, но не термическим эффектом. 89 Очевидно, что облучение клеток, преинкубированных с НАФ(Tm3+)-РМАО:DARPinmCherry, в течение 40 мин оказало очень грубое воздействие на целостность клеток, так как эффект проявился через ~20 мин после окончания облучения. В попытке снизить воздействие на клетки с целью запуска более тонких программируемых механизмов гибели клетки, мы сократили время облучения до 10 мин. В результате такого эксперимента мы не наблюдали каких-либо изменений в морфологии клеток в течение 90 мин после облучения. Однако через 2.5 ч после облучения было обнаружено, что мембраны большинства клеток нарушены, а ядра окрасились PI (Приложение 5). Таким образом, эффект оказался отложен, что, возможно, говорит об апоптотическом пути гибели. К сожалению, на данном этапе работы, изучение механизма гибели клеток при облучении в данной системе было затруднено. Это связано с тем, что мы имеем возможность облучать ИК-лазером только ограниченную зону клеток, а именно область, находящуюся в поле зрения (Рис. 22). Практически все методы исследования механизма гибели клетки требуют либо хорошего оптического оснащения с регистрацией флуоресценции отдельных ключевых молекул (например, Вах, слитых с GFP), либо требуют большого количества клеток, суспензию которых возможно анализировать, например, на проточном цитофлуориметре. Суммируя результаты данного раздела, можно сделать ряд заключений: 1. Был подобран режим работы ИК-лазера, при котором в высокой мощности (4Вт/см2) он не вызывает нарушений в целостности клеток 2. Было показано, что при краткосрочной инкубации с клетками НАФ(Tm3+)-РМАО не вызывают изменений в жизнеспособности клеток 3. Показано, что обработка клеток НАФ(Tm3+), имеющими УФА/синие линии люминесценции, при облучении ИК-лазером с плотностью мощности 4 Вт/см2 в течение 40 мин приводит к нарушению целостности практически всех клеток в зоне облучения (Рис. 22В,Г) 4. НАФ(Er3+), имеющие зеленые линии люминесценции, не вызывает существенных изменений в целостности клеток (Рис. 22А,Б) 5. Понижение времени облучения до 10 мин привело к менее выраженному отложенному эффекту НАФ(Tm3+) на клетки (Рис. 22Д,Е) 90 Рисунок 22. Изображения клеток SK-BR-3, инкубированных с НАФ(Tm3+) (УФА1/синие) и НАФ(Er3+) (зеленые), конъюгированными с DARPin-mCherry через 150 минут после облучения (длительность облучения 40 или 10 мин) Таким образом, мы доказали, что НАФ(Tm3+) при облучении являются цитотоксичными, что обусловлено УФА1 светом, излучаемым в процессе апконверсии за счет включения в состав НАФ ионов тулия. На сегодняшний день только несколько работ посвящены использованию НАФ, легированных тулием, в паре с акцепторами УФА света, например, с ДНК или с цитостатиком доксорубицином [213], однако ни в одной из них не описывается их фототоксичность. Ключевыми посредниками фотооксидативного повреждения под воздействием УФА света на клетку являются возбужденные состояния эндогенных тканевых сенсибилизаторов [214]. В тканях человека имеется множество хромофоров, которые особенно сильно поглощают в УФ-А и синей области спектра. К основным эндогенным ФС относят порфирины, билирубин, меланин, флавины, витамины В6 и К, триптофан и некоторые другие. Мы предполагаем, что при повышении количества одного из указанных эндогенных ФС внутри клетки чувствительность культуры к облучению может существенно повыситься. Так, 91 мы предполагаем, что использование рибофлавина в паре с НАФ(Tm3+) может представлять собой очень перспективную систему воздействия на опухолевые клетки, инициируемую ИКсветом. 4.3.3. Оценка использования рибофлавина в качестве ФС В ряде работ последних десятилетий рибофлавину (Рф) приписывается роль в прогрессировании рака молочной железы. Во-первых, было показано, что в опухоли молочной железы мышей, выросших при недостатке Рф, уровень флавинов падал значительно в меньшей степени, чем в печени или мышцах животных; также, злокачественные ткани оказались гораздо устойчивее к рибофлавиновому голоданию, чем другие ткани организма [215]. Во-вторых, в плазме крови пациентов с раком молочной железы было отмечено повышение уровня белкатранспортера рибофлавина RСР (riboflavin carrier protein) по сравнению со здоровыми пациентами [216]. В то же время у больных было отмечено уменьшение концентрации Рф в плазме крови [217]. В-третьих, с использованием анти-RCP- специфичных мини-антител было продемонстрировано повышение накопления RCP в опухоли [218]. Способность рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых клетках молочной железы была успешно применена для доставки цитостатика митомицина С к клеткам аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, причем рибофлавин использовали в качестве адресной молекулы [34]. Авторы продемонстрировали бо́ льшую эффективность интернализации при использовании рибофлавина в сравнении с распространенной адресной молекулой - фолиевой кислотой. На примере опухолевых клеток молочной железы SK-BR-3 мы изучили способность Рф селективно накапливаться и вызывать гибель клеток при облучении. 4.3.3.1. Изучение способности рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых клетках Способность Рф селективно накапливаться в опухолевых клетках изучали на культурах клеток при помощи проточной цитофлуориметрии по флуоресценции Рф в канале FL1. Для этого клетки инкубировали в среде, содержащей повышенные концентрации рибофлавина (2 и 30 мкМ), в течение 90 мин. После этого культуру отмывали от Рф, не проникшего внутрь клеток, холодным PBS и сразу анализировали на проточном цитофлуориметре BD Accuri C6. Для клеток SK-BR-3 было показано повышенное накопление Рф по сравнению с клетками яичника китайского хомяка (СНО) и фибробластами человека как при концентрации рибофлавина 2 мкМ, так и при концентрации 30 мкМ (рис.23). Интенсивность флуоресценции SK-BR-3 в результате инкубации клеток с 30 мкМ Рф выросла в 4 раза по сравнению с 92 клетками, инкубированными в среде (~0.5 мкМ рибофлавина). В то же время интенсивность флуоресценции СНО осталась практически на том же уровне. Примечательно, что при концентрации Рф 30 мкМ интенсивность флуоресценции фибробластов, выделенных из кожи человека, также возросла в ~2.5 раза. Поэтому мы предполпгаем, что, как и все низкомолекулярные ФС, рибофлавин имеет тенденцию к накоплению в клетках кожи. Рисунок 23. Способность различных клеточных линий к накоплению рибофлавина, выраженная через сигнал флуоресценции в зеленом канале, относительно сигнала флуоресценции клеток, инкубированных в среде без добавления рибофлавина. 4.3.3.2. Изучение онкоспецифической цитотоксичности рибофлавина при облучении УФА1 Онкоспецифическую цитотоксичность Рф исследовали на линиях клеток SK-BR-3 и СНО при облучении УФА1 (365 нм). Для этого клетки инкубировали с рибофлавином, аналогично эксперименту 4.3.3.1, после чего отмывали от избытка Рф и облучали источником УФА1-света АФС-365 (Полироник) с плотностью мощности 7 мВт/см2 в течение 10 мин. Было показано, что происходит дозозависимое снижение жизнеспособности клеток SK-BR-3, которое достигает 47% при инкубации клеток с 30 мкМ Рф (Рис.24). В то же время достоверного снижения жизнеспособности СНО не наблюдали. 93 Рисунок 24. Дозозависимая цитотоксичность рибофлавина, вызываемая в результате его накопления клетками, при последующем облучении Таким образом, показано, что Рф является природным ФС, обладающим селективной фотоцитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам. При использовании в паре с НАФ(Tm3+) Рф может стать хорошим кандидатом для ФДТ опухолей молочной железы человека без применения инвазивных методов доставки света. В настоящее время фототерапия УФА1 (340-400 нм) успешно применяется в лечении таких кожных деструктивных заболеваний, как очаговая склеродермия, атопическая экзема и др. Считается, что ключевым механизмом образования АФК под действием света УФА1 является фотосенсибилизация эндогенных хромофоров, что приводит к фотооксидативному повреждению. В отличие от химиотерапии, фототерапия позволяет избежать многих системных побочных эффектов. Однако ввиду того, что УФА1-свет фактически не проникает в ткань, область применения фототерапии ограничена поверхностными кожными заболеваниями [69]. Мы считаем, что с применением НАФ, функционализированных адресным молекулами, фототерапия может найти применение и в лечении онкологических заболеваний, а одновременная доставка в опухолевые клетки ФС, возбуждаемых УФА1/синим светом, например рибофлавина или 4D5scFv-miniSOG, может повысить эффективность такой терапии. 94 Выводы: 1. Получен и охарактеризован генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-miniSOG; показано его специфическое связывание с рецептором HER2/neu (константа диссоциации 10±2 нM) и опосредованная рецептором интернализация в клетки аденокарциномы молочной железы человека с преимущественной локализацией в лизосомах. 2. Показано, что иммуноФС 4D5scFv-miniSOG оказывает избирательное цитотоксическое действие на клетки аденокарциномы молочной железы человека (IC50 = 160 нM) при облучении синим светом, вызывая гибель по типу некроза. Достигнута 100 % гибель опухолевых клеток при сочетанном применении 4D5scFv-miniSOG в концентрации 250 нМ и цитостатика таксола® в концентрации 1 нМ. 3. Получены и исследованы донорно-акцепторные пары, включающие НАФ в качестве доноров возбуждающей энергии и флавиновый белок 4D5scFv-miniSOG в качестве акцептора энергии; показано, что фёрстеровский резонансный перенос энергии реализуется в указанных парах только в отсутствие полимерной оболочки на поверхности НАФ, фёрстеровский радиус составяет 2-2.7 нм. 4. Получен иммуноФС НАФ:DARPin-mCherry, представляющий собой НАФ, конъюгированный с адресным полипептидом DARPin-mCherry, и показано его специфическое связывание с поверхностью клеток аденокарциномы молочной железы человека с последующей интернализацией и локализацией в лизосомах. 5. Показано, что полученный иммуноФС НАФ:DARPin-mCherry вызывает гибель опухолевых клеток при облучении ближним ИК-светом, что обусловлено его апконверсией в УФА1-свет, возбуждающий эндогенные клеточные ФС. 95 Заключение В работе предложены методы создания фототоксичных агентов направленного действия, основанные на использовании УФА1/синего света, для адресной терапии опухолей. Использование апконвертирующих нанофосфóров было предложено как способ доставки УФА1/синего света в глубь ткани. Для воздействия на HER2/neu-гиперэкспрессирующие клетки был создан фототоксичный флавиновый белок 4D5scFv-miniSOG, представляющий собой альтернативу химическим конъюгатам фотосенсибилизаторов с адресными молекулами. Доказана селективность связывания белка 4D5scFv-miniSOG с опухолевыми клетками и цитотоксическое действие на них при облучении синим светом. С применением цитостатика таксола удалось добиться 100% поражения опухолевых клеток. С целью разработки способа возбуждения 4D5scFv-miniSOG в глубине ткани, куда синий свет имеет ограниченное проникновение, была исследована возможность создания FRET-пары белка 4D5scFv-miniSOG и апконвертирующих нанофосфóров НАФ(Tm3+), люминесцирующих в УФА1/синей области спектра при возбуждении ИК-светом, проникающим в ткань. Было показано, что данная донорно-акцепторная пара удовлетворяет всем условиям для безызлучательной передачи энергии, если толщина неактивной оболочки НАФ(Tm3+) не превышает 2-2.7 нм. Впервые разработан подход к адресной доставке апконвертирующих нанофосфóров НАФ(Tm3+) к HER2/neu-гиперэкспрессирующим опухолевым клеткам при помощи DARPin и показана селективная фотоцитотоксичность НАФ(Tm3+) при облучении ИК-светом со строгой дозовой зависимостью. В настоящее время фототерапия УФА1 успешно применяется в лечении кожных заболеваний. Считается, что ключевым механизмом образования АФК под действием УФА1-света является фотосенсибилизация эндогенных хромофоров, что приводит к фотооксидативному повреждению. В отличие от химиотерапии, фототерапия позволяет избежать многих системных побочных эффектов. Однако ввиду того, что УФА1 свет фактически не проникает в ткань, область применения фототерапии ограничена поверхностными кожными заболеваниями. Результаты настоящей работы показывают, что эта область может быть расширена. С применением апконвертирующих нанофосфóров, на поверхности которых иммобилизованы адресные молекулы, фототерапия может найти применение также в лечении онкологических заболеваний, а одновременная доставка в опухолевые клетки фотосенсибилизаторов, возбуждаемых УФА1/синим светом, например рибофлавина или белка 4D5scFv-miniSOG, может значительно повысить эффективность такой терапии. 96 Список сокращений и условных обозначений ADPA - антрацен-9,10-дипропионовая кислота AIF – фактор индукции апоптоза Apaf-1 - фактор активации апоптотической протеазы Apaf-1/Omi – митохондриальная сериновая протеаза AtPhot2 - фототропин 2 Arabidopsis thaliana Bcl-2 - белки семейства В-клеточной лимфомы 2. Включают в себя антиапоптотические белки Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, A1 и Mcl-1, проапоптотические «мультидоменные» белки Bax и Bak, которые также обозначаются ВН-1, -2, -3, и проапоптотические Bid и Bim (ВН-3) белки. DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) - класс адресных молекул, состоящих из анкириновых повторов EDC - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид EndoG - эндонуклеаза G EPR-эффект – эффект повышенной проницаемости сосудов опухоли и удерживания FRET - фёрстеровский резонансный перенос энергии HER2/neu – Human Epidermal growth factor Receptor 2 HpD – производное гематопорфирина IAPs - белковые ингибиторы апоптоза IgG – иммуноглобулин класса G LDL - липопротеины низкой плотности LEDs - light emitting diodes miniSOG – белок-фотосенсибилизатор «mini Singlet Oxygen Generator» MOMP - проницаемость внешней митохондриальной мембраны PBS – фосфатно-солевой буфер PETNR - флавопротеина пентаэритритол тетранитрат редуктаза PI - йодид пропидия PMAO - амфифильный чередующийся сополимер октадецена-1 и малеинового ангидрида scFv (single chain variable fragment) - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела Smac/DIABLO - second mitochondria-derived activator of caspases, вторичный митохондриальный активатор каспаз/ прямой ингибитор апоптозного связывающего белка с низким pI SOD – супероксиддисмутаза SOSG - Singlet oxygen sensor green reagent TNF – фактор некроза опухоли 97 ΔΨm – мембранный потенциал митохондрий λemis – длина волны испускания λexc – длина волны возбуждения ΦΔ – квантовый выход образования синглетного кислорода АЛК - 5-аминолевулиновая кислота АФК – активные формы кислорода ДМСО - диметилсульфоксид ИК-инфракрасный иммуноФС – адресный фотосенсибилизатор (направленного действия) НАФ – апконвертирующие неорганические наночастицы/нанофосфоры, солегированные какими-либо редкоземельными элементами НАФ(Er3+) – апконвертирующие нанофосфоры, солегированные редкоземельными элементами Er 3+ и Yb3+ НАФ(Tm3+) - апконвертирующие нанофосфоры, солегированные редкоземельными элементами Tm3+ и Yb3+ НАФ(Tm3+):4D5scFv-miniSOG – нестабильный комплекс, состоящий из НАФ(Tm3+), стабилизированных ТМАГ, с сорбированным на поверхности белком 4D5scFv-miniSOG НАФ-РМАО - апконвертирующие неорганические нанофосфоры, солегированные какими-либо редкоземельными элементами и покрытые полиметной оболочкой PMAO ПААГ – полиакриламидный гель ПМ – плотность мощности ПЭИ – полиэтиленимин рО2 - парциальное давление кислорода Рф – рибофлавин Се6 – фотосенсибилизатор хлорин е6 ТМАГ - тетраметиламмоний гидроксид УФА1, или УФ-А1 – свет с длиной волны от 340 до 400 нм ФДТ – фотодинамическая терапия ФМН – флавинмононуклеотид ФС – фотосенсибилизатор ФС:НАФ – стабильный комплекс, состоящий из НАФ и ФС ФТТ - фототермическая терапия ФХИ - фотохимическая интернализация ЭПР – эндоплазматический ретикулум 98 Список литературы 1. Lamberti, M.J. Breast cancer as photodynamic therapy target: Enhanced therapeutic efficiency by overview of tumor complexity / M.J. Lamberti [et al] // World J Clin Oncol. - 2014. - Vol. 5, № 5.- P. 901-7. 2. Robertson, C.A. Photodynamic therapy (PDT): a short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT / C.A. Robertson [et al] // J Photochem Photobiol B. 2009. - Vol. 96, № 1. - P. 1-8. 3. Girotti, A.W. Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathways, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms / A.W. Girotti // J Photochem Photobiol B. - 2001. Vol. 63, № 1-3 - P. 103-13. 4. Plaetzer, K. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: fundamental aspects / K. Plaetzer [et al] // Lasers Med Sci. - 2009. - Vol. 24, №2 - P. 259-68. 5. Dysart, J.S. Characterization of Photofrin photobleaching for singlet oxygen dose estimation during photodynamic therapy of MLL cells in vitro/ J.S. Dysart and M.S. Patterson // Phys Med Biol. - 2005. - Vol. 50, № 11 - P. 2597-616. 6. Миронов, А.Ф. Фотодинамическая терапии рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей / А. Ф. Миронов // Сорос.образоват. журн. - 1996. № 8. - С. 32 – 40 7. Agostinis, P. Photodynamic therapy of cancer: An update / P. Agostinis [et al]// CA: A Cancer Journal for Clinicians. - 2011. - Vol. 61, № 4 - P. 250-281. 8. Iyer, A.K. Polymeric micelles of zinc protoporphyrin for tumor targeted delivery based on EPR effect and singlet oxygen generation / A.K. Iyer [et al] // J Drug Target. - 2007. - Vol. 15, № 78 - P. 496-506. 9. Kessel, D. The role of low-density lipoprotein in the biodistribution of photosensitizing agents / D. Kessel [et al] // J Photochem Photobiol B. - 1992. - Vol. 14, № 3 - P. 261-2. 10. Serebrovskaya, E.O. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein / E.O. Serebrovskaya [et al]// Biochem J. - 2011. - Vol.435, № 1 - P. 65-71. 11. Bulina, M.E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed / M.E. Bulina [et al] // Nat Protoc. - 2006. - Vol. 1, № 2 - P. 947-53. 99 12. Serebrovskaya, E.O. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed /E.O. Serebrovskaya [et al] // J Biomed Opt. - 2014. - Vol.19, № 7 P. 1-4. 13. Shu, Х. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms / Xiaokun Shu [et al] // PLoS Biol. – 2011. – Vol. 9, № 4. – Р. 110. 14. Katsura, H. Oligomeric structure of LOV domains in Arabidopsis phototropin / H. Katsura // FEBS Lett. - 2009. - Vol. 583, № 3 - P. 526-30. 15. Crosson, S. The LOV domain family: photoresponsive signaling modules coupled to diverse output domains / S. Crosson, S. Rajagopal and K. Moffat // Biochemistry. - 2003. - Vol. 42, №1 - P. 2-10. 16. Chapman, S.K. Flavoprotein Protocols / S.K. Chapman and G. A.Reid // Methods in Molecular Biology. - 2010 - Springer-Verlag New York. LLC. - 246p. 17. Crozier-Reabe, K. Form follows function: structural and catalytic variation in the class a flavoprotein monooxygenases / K. Crozier-Reabe and G.R. Moran // Int J Mol Sci. - 2012. Vol.13, № 12 - P. 15601-39. 18. Vakrat-Haglili, Y. The microenvironment effect on the generation of reactive oxygen species by Pd-bacteriopheophorbide / Y. Vakrat-Haglili [et al] // J Am Chem Soc. - 2005. - Vol. 127, № 17 - 6487-97. 19. Engl, R. Singlet Oxygen Generation by 8-Methoxypsoralen in Deuterium Oxide: Relaxation Rate Constants and Dependence of the Generation Efficacy on the Oxygen Partial Pressure / R. Engl [et al] // The Journal of Physical Chemistry B. - 2002. - Vol. 106, № 22 - P. 5776-5781. 20. Baier, J. Singlet oxygen generation by UVA light exposure of endogenous photosensitizers / J. Baier [et al] // Biophys J. - 2006. - Vol. 91, № 4 - P. 1452-9. 21. Baumgartel, H. A. Clinacal oxygen pressure measurement ed. / H. A. Baumgartel, K. Ehrly, S. Lorenz and D. Lubbers // Renate Huch. - 1987: Springer. 22. Minami, H. Hypoxia potentiates ultraviolet A-induced riboflavin cytotoxicity / H. Minami [et al] // J Invest Dermatol. - 1999. - Vol. 113, № 1 - P. 77-81. 23. Biederer, T. SynCAM, a synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly / T. Biederer [et al] // Science. - 2002. - Vol. 297, № 5586 - P. 1525-31. 24. Ruiz-Gonzalez, R. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG / R. Ruiz-Gonzalez // J Am Chem Soc. - 2013. - Vol. 135, № 26 - P. 9564-7. 25. Pimenta, F.M. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a proteinencased flavin / F.M. Pimenta [et al] // Photochem Photobiol. - 2013. - Vol. 89, № 5 - P. 111626. 100 26. Nonell, S. Time-resolved singlet oxygen detection / S. Nonell and S.E. Braslavsky // Methods Enzymol. - 2000. - Vol. 319 - P. 37-49. 27. Dysart, J.S. Characterization, of Photofrin photobleaching for singlet oxygen, dose estimation during photodynamic, therapy of MLL cells in vitro / J.S. Dysart and M.S. Patterson // Phys Med Biol. - 2005. - Vol. 50 - P. 2597-2616 28. Moan, J. Intracellular, localization of photosensitizers / J. Moan, [et al] // Ciba, Found Symp. 1989. – Vol. 146 - P. 95-11. 29. Allison, R.R. Oncologic photodynamic, therapy photosensitizers: a clinical, review / R.R. Allison and C.H. Sibata // Photodiagnosis Photodyn Ther. - 2010. – Vol. 7 - P. 61-75. 30. Korbelik, M. Induction of tumor immunity by photodynamic therapy / M. Korbelik // J. Clin. Laser Med. Surg. 1996. – Vol. 14 - P. 329–334. 31. Garg, A.D. Immunogenic cell death, DAMPs and anticancer therapeutics: an emerging amalgamation / A.D. Garg, D. Nowis, J. Golab, P. Vandenabeele, D.V. Krysko, P. Agostinis // Biochim Biophys Acta. - 2010. – Vol. 1805 - P. 53-71. 32. Danial, N.N. Cell death: critical control points. / N.N. Danial and S.J. Korsmeyer // Cell. 2004. – Vol. 116 - P. 205–219. 33. Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes. / A. Degterev and J. Yuan // Nat. Rev., Mol. Cell Biol. - 2008. – Vol. 9 - P. 378–390. 34. Tait, S.W. Mitochondria and celld eath: outer membrane permeabilization and beyond / S.W. Tait and D.R. Green // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. – Vol. 11 - P. 621–632. 35. Buytaert, E. Role of endoplasmic reticulum depletion and multidomain proapoptotic BAX and BAK proteins in shaping cell death after hypericin-mediated photodynamic therapy / E. Buytaert [et al] // FASEB J. - 2006. – Vol. 20 - P. 756–758. 36. Ortel, B. Molecular mechanisms of photodynamic therapy / B.Ortel, C.R. Shea and P. Calzavara-Pinton // Front. Biosci. - 2009. – Vol. 14 - P. 4157–4172, 37. Tait, S.W. Caspase-independent cell death: leaving the set without the final cut / S.W. Tait and D.R. Green // Oncogene - 2008. – Vol. 27 - P. 6452–61. 38. Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes / A. Degterev and J. Yuan // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. – Vol. 9 - P. 378–90. 39. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death / S. Elmore [et al] // Toxicol Pathol. 2007. – Vol. 35 - P. 495-516 40. Льюин Б. Клетки / под ред. Б. Льюин и др.; пер. с англ.- Л48: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – 951 с. 41. Youle, R.J. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death / R.J. Youle and A. Strasser // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. – Vol. 9 - P. 47–59. 101 42. Westphal, D. Molecular biology of Bax and Bak activation and action / D. Westphal, G. Dewson, P.E. Czabotar and R.M. Kluck // Biochim. Biophys. Acta. -2011. – Vol. 1813 - P. 521–31. 43. Almeida, R.D. Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy / R.D. Almeida [et al] // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. – Vol. 1704 - P. 59–86. 44. Buytaert, E. Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy / E. Buytaert, M. Dewaele and P. Agostinis // Biochim. Biophys. Acta. – 2007. – Vol. 1776. – P. 86-107. 45. Ortel, B. Molecular mechanisms of photodynamic therapy / B. Ortel, C.R. Shea and P. Calzavara-Pinton // Front. Biosci. - 2009. – Vol. 14 - P. 4157–72. 46. Xue, L.Y. Photodamage to multiple Bcl-xL isoforms by photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc / L.Y. Xue, S.M. Chiu, A. Fiebig, D.W. Andrews and N.L. Oleinick // Oncogene - 2003. – Vol. 22 - P. 9197–04. 47. Rodriguez, M.E. Structural factors and mechanisms underlying the improved photodynamic cell killing with silicon phthalocyanine photosensitizers directed to lysosomes versus mitochondria / M.E. Rodriguez [et al] // Photochem. Photobiol. - 2009. – Vol. 85 - P. 1189– 1200. 48. Marchal, S. Relationship, between subcellular localisation of Foscan and caspase activation in photosensitised, MCF-7 cells / S. Marchal, A. Francois, D. Dumas, F. Guillemin and L. Bezdetnaya // Br. J. Cancer - 2007. – Vol. 96 - P. 944–51. 49. Kessel, D. Ruthenium red-mediated suppression of Bcl-, 2 loss and Ca(2) release initiated by photodamage to the endoplasmic reticulum:, scavenging of reactive oxygen species / D. Kessel, M. Castelli and J.J. Reiners // Cell Death Differ. - 2005. – Vol. 12 - P. 502–11. 50. Ke, M.S. Apoptosis mechanisms related to the increased sensitivity of Jurkat T-cells vs A431, epidermoid cells to photodynamic therapy with the phthalocyanine Pc 4 / M.S. Ke [et al] // Photochem. Photobiol. - 2008. – Vol. 84 - P. 407–14. 51. Xue, L.Y. Differential responses of Mcl-1 in photosensitized, epithelial vs lymphoid-derived human cancer cells / L.Y. Xue, S.M. Chiu and N.L. Oleinick // Oncogene- 2005. – Vol. 24- P. 6987–92. 52. Kim, H.R. Enhanced apoptotic response to photodynamic, therapy after bcl-2 transfection / H.R. Kim, Y. Luo, G. Li and D. Kessel // Cancer Res. - 1999. – Vol. 59 - P. 3429–32. 52. Buytaert, E. Molecular effectors of multiple cell death, pathways initiated by photodynamic therapy / E. Buytaert [et al] // Biochim. Biophys. Acta - 2007. – Vol. 1776 - P. 86–107. 102 54. Usuda, J. Promotion of photodynamic therapy-induced apoptosis by the mitochondrial protein, Smac/DIABLO: dependence on Bax / J. Usuda [et al] // Photochem. Photobiol. - 2002. – Vol. 76 _ P. 217–23. 55. Chiu, S.M. Photodynamic therapyinduced, death of HCT 116 cells: apoptosis with or without Bax expression / S.M. Chiu, L.Y. Xue, K. Azizuddin and N.L. Oleinick // Apoptosis - 2005. – Vol. 10 - P.1357–68. 56. Scorrano, L. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca(2): a control point for, apoptosis / L. Scorrano [et al] // Science - 2003. – Vol. 300 - P.135–9. 57. Buytaert, E. Deficiency in, apoptotic effectors Bax and Bak reveals an autophagic cell death pathway initiated by, photodamage to the endoplasmic reticulum / E. Buytaert [et al] // Autophagy - 2006. – Vol. 2 - P. 238–40. 58. Chiu, S.M. Photodynamic therapyinduced, death of HCT 116 cells: apoptosis with or without Bax expression / S.M. Chiu, L.Y. Xue, K. Azizuddin and N.L. Oleinick // Apoptosis. - 2005. – Vol. 10 - P. 1357–68. 59. Kurokawa, M. Caspases and kinases in a death grip / M. Kurokawa [et al] // Cell - 2009. – Vol. 138 - P.838–54. 60. Youle, R.J. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate, cell death / R.J. Youle and A. Strasser // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. – Vol. 9 - P. 47–59. 61. Chipuk, J.E. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell, death? / J.E. Chipuk and D.R. Green // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2005. - Vol. 6 - P. 268–75. 62. Tait, S.W. Caspase-independent cell death: leaving the set without the, final cut / S.W. Tait and D.R. Green // Oncogene - 2008. - Vol. 27 - P. 6452–61. 63. Galluzzi, L. Mitochondrial apoptosis without VDAC / L. Galluzzi and G. Kroemer // Nat. Cell Biol. - 2007. Vol. 9 - P. 487–9. 64. Lorenzo, H.K. Therapeutic potential of AIF-mediated caspase-independent, programmed cell death / H.K. Lorenzo and S.A. Susin // Drug Resist. Updat. - 2007. -Vol. 10 - P. 235–55. 65. Ly, J.D. The mitochondrial membrane potential (deltapsi, (m)) in apoptosis: an update / J.D. Ly, D.R. Grubb and A. Lawen // Apoptosis- 2003. -Vol. 8 - P. 115–28. 66. Norberg, E. An increase in intracellular Ca(2) is required for the activation of mitochondrial calpain to release AIF during cell death / E. Norberg [et al] // Cell Death Differ. - 2008. - Vol. 15 - P. 1857–64. 67. Vahsen, N. AIF, deficiency compromises oxidative phosphorylation / N. Vahsen [et al] // EMBO J. - 2004. - Vol. 23 - P. 4679–46. 68. Green, D.R. The pathophysiology of mitochondrial cell death / D.R. Green and G. Kroemer // Science - 2004. - Vol. 305 - P. 626–29. 103 69. Lorenzo, H.K. Therapeutic potential of AIF-mediated caspase-independent, programmed cell death / H.K. Lorenzo and S.A. Susin // Drug Resist. Updat. - 2007. - Vol. 10 - P. 235–55. 70. Norberg, E. An, increase in intracellular Ca(2) is required for the activation of mitochondrial calpain to, release AIF during cell death / E. Norberg [et al] // Cell Death Differ. - 2008. - Vol. 15 - P. 1857–64. 71. Sanges, D. Cross-talk between two apoptotic pathways activated by, endoplasmic reticulum stress: differential contribution of caspase-12 and AIF / D. Sanges and V. Marigo // Apoptosis 2006 - Vol. 11 - P. 1629–41. 72. Zhu, C. Apoptosis inducing factor is a major contributor to neuronal loss induced by neonatal cerebral hypoxia-ischemia / C. Zhu [et al] // Cell Death Differ. - 2007. - Vol. 14 - P. 775–84. 73. Furre, I.E. Targeting PBR by hexaminolevulinate-mediated photodynamic therapy induces apoptosis, through translocation of apoptosis-inducing factor in human leukemia cells / I.E. Furre [et al] // Cancer Res. - 2007 - Vol. 65 - P. 11051–60. 74. Vittar N. B. Caspase-independent apoptosis, in human MCF-7c3 breast cancer cells, following photodynamic therapy, with a novel, water-soluble phthalocyanine / N.B. Vittar [et al] // Int. J. Biochem. Cell Biol. 42, P. 1123–1131., 75. Yuan, J. Alternative cell death mechanisms in development and, beyond / J. Yuan and G. Kroemer // Genes Dev. - 2010. - Vol. 24 - P. 2592–2602. 76. Chung, P.S. Photodynamic, therapy with 9-hydroxypheophorbide alpha on AMC-HN-3 human head and neck, cancer cells: induction of apoptosis via photoactivation of mitochondria and endoplasmic, reticulum / P.S. Chung, P. He, J.I. Shin, H.J .Hwang, S.J. Lee and J.C. Ahn // Cancer Biol. Ther. - 2009. - Vol. 8 - P. 1343–51. 77. Karmakar, S. 5-Aminolevulinic acid-based, photodynamic therapy suppressed survival factors and activated proteases for apoptosis, in human glioblastoma U87MG cells / S. Karmakar, N.L. Banik, S.J. Patel and S.K.Ray // Neurosci. Lett. - 2007. - Vol. 415 - P. 242–7. 78. Yoo, J.O. Transglutaminase 2 promotes both, caspase-dependent and -independent apoptotic cell death via the calpain/Bax signaling, pathway / J.O. Yoo, Y.C. Lim, Y.M. Kim and K.S. Ha // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Vol. 287 - Р. 14377-88. 79. Almeida, R.D. Intracellular signaling, mechanisms in photodynamic therapy / R.D. Almeida, B.J. Manadas, A.P. Carvalho and C.B. Duarte // Biochim. Biophys. Acta - 2004. - Vol. 1704 P. 59–86. 80. Buytaert, E. Molecular effectors of multiple cell death, pathways initiated by photodynamic therapy / E. Buytaert, M. Dewaele and P. Agostinis // Biochim. Biophys. Acta - 2007. - Vol. 1776 - P. 86–107. 104 81. Ortel, B. Molecular mechanisms of photodynamic, therapy / B. Ortel, C.R. Shea and P. Calzavara-Pinton // Front. Biosci. - 2009. - Vol. 14 - P. 4157–72. 82. Chen, B. Photodynamic therapy, with hypericin induces vascular damage and apoptosis in the RIF-1 mouse tumor model / B. Chen, T. Roskams, Y. Xu, P. Agostinis and P.A. de Witte // Int. J. Cancer - 2002. - Vol. 98 - P. 284–90. 83. Oleinick, N.L. The role of apoptosis in response to, photodynamic therapy: what, where, why, and how / N.L. Oleinick, R.L. Morris and I. Belichenko // Photochem. Photobiol. Sci. - 2002. Vol. 1 - P. 1–21. 84. Ahmad, N. Involvement of Fas (APO-1/CD-, 95) during photodynamic-therapy-mediated apoptosis in human epidermoid carcinoma, A431 cells / N. Ahmad, S. Gupta, D.K. Feyes and H. Mukhtar // J. Invest. Dermatol. - 2000. - Vol. 115 - P. 1041–46. 85. Ali, S.M. Photodynamic therapy induced Fasmediated, apoptosis in human carcinoma cells / S.M. Ali, S.K. Chee, G.Y. Yuen and M. Olivo // Int. J. Mol. Med. - 2002. - Vol. 9 - P. 257–70. 86. Olivo, M. Apoptosis signalling mechanisms in human cancer cells, induced by Calphostin-PDT / M. Olivo, M. Ali-Seyed // Int. J. Oncol. - 2007. - Vol. 30 - P. 537–48. 87. Billen, L.P. Bid: a Bax-like BH3 protein / L.P. Billen [et al] // Oncogene - 2008. - Vol. 27 - P. 93–S104. 88. Cirman, T. Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of, Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins./ T. Cirman [et al] // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279 - P. 3578–3587. 89. Kantari, C. Caspase-8 and bid: caught in the act between death, receptors and mitochondria. / C. Kantari and H. Walczak //Biochim. Biophys. Acta - 2011. - Vol. 1813 - P. 558–563. 90. Reiners Jr., J.J. Release of cytochrome c and activation of pro-caspase-9 following lysosomal photodamage, involves Bid cleavage./ J.J. Reiners Jr., J.A. Caruso, P. Mathieu, B. Chelladurai, X.M. Yin, D. Kessel // Cell Death Differ. - 2002. - Vol. 9 - P. 934–44. 91. Stoka, V. Lysosomal protease pathways to apoptosis. Cleavage of bid, not pro-caspases, is the, most likely route. / V. Stoka [et al] // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276 - P. 3149–57. 92. Ichinose, S. Lysosomal cathepsin initiates apoptosis, which is regulated by photodamage to Bcl-2 at, mitochondria in photodynamic therapy using a novel photosensitizer, ATX-s10 (Na). / S. Ichinose [et al]// Int. J. Oncol. - 2006. - Vol. 29 - P. 349–55. 93. Wan, Q. Bid is required in NPe6-PDT-induced, apoptosis. / Q. Wan, L. Liu, D. Xing and Q. Chen // Photochem. Photobiol. - 2008. - Vol. 84 - P. 250–57. 94. Chiu, S.M. A requirement for bid for induction of apoptosis by photodynamic therapy with a, lysosome- but not a mitochondrion-targeted photosensitizer. / S.M. Chiu [et al] // Photochem. Photobiol. - 2010. - Vol.86 - P. 1161–73. 105 95. Quiogue, G. Signaling from lysosomes enhances mitochondria-mediated photodynamic therapy, in cancer cells. / G. Quiogue [et al] // Proc. Soc. Photo Opt. Instrum. Eng. - 2009. Vol. 7380 P. 1–8. 96. Agostinis, P. Photodynamic Therapy of Cancer: An Update / P. Agostinis [et al] // CA Cancer J Clin. – 2011. – Vol. 61, № 4. – P. 250-81 97. Kessel, D. Initiation of apoptosis and autophagy by, photodynamic therapy. / D. Kessel, M.G. Vicente, J.J. Reiners Jr. // Lasers Surg. Med. - 2006. - Vol. 38 - P. 482–8. 98. Reiners Jr., J.J. Assessing autophagy, in the context of photodynamic therapy. / J.J. Reiners Jr., P. Agostinis, K. Berg, N.L. Oleinick and D. Kessel // Autophagy - 2010. - Vol. 6 - P. 7–18. 99. Hotchkiss, R.S. Cell death. / R.S. Hotchkiss [et al] // N. Engl. J., Med. - 2009. - Vol. 361 - P. 1570–83. 100. Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes. / A. Degterev and J. Yuan // Nat. Rev., Mol. Cell Biol. - 2008. - Vol. 9 - P. 378–90. 101. Janku, F. Autophagy as a target for, anticancer therapy. / F. Janku, D.J. McConkey, D.S. Hong and R. Kurzrock // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2011. - Vol. 8 - P. 528–39. 102. Tasdemir, E. Methods for assessing autophagy and autophagic cell death. / E. Tasdemir [et al] // Methods Mol. Biol. - 2008. - Vol. 445 - P. 29–76. 103. Janku, F., McConkey, D.J., Hong, D.S., Kurzrock, R., 2011. Autophagy as a target for, anticancer therapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 528–539. 104. Hayashi-Nishino, M. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome, formation. / M. Hayashi-Nishino [et al] // Nat. Cell Biol. - 2009. - Vol. 11 - P. 1433–37. 105. Hailey, D.W. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during, starvation. / D.W. Hailey [et al] // Cell - 2010. - Vol. 141 - P. 656–67. 106. Ravikumar, B. Plasma membrane, contributes to the formation of pre-autophagosomal structures. / B. Ravikumar, K. Moreau, L. Jahreiss, C. Puri, D.C. Rubinsztein // Nat. Cell Biol. 2010. - Vol. 12 - P. 747–57. 107. Yang, Z. Mammalian autophagy: core molecular machinery and, signaling regulation. / Z. Yang and D.J. Klionsky // Curr.Opin. Cell Biol. - 2010. - Vol. 22 - P. 124–31. 108. Mizushima, N., Autophagy: process and function. / Genes Dev. - 2007. - Vol. 21, 2861–2873., 109. Debnath, J., Baehrecke, E.H., Kroemer, G.,. Does autophagy contribute to cell death?, Autophagy 2005. - Vol. 1, 66–74., 110. Morselli, E., Galluzzi, L., Kepp, O., Vicencio, J.M., Criollo, A., Maiuri, M.C., et al.,., Anti- and pro-tumor functions of autophagy. Biochim.Biophys. Acta. - 2009. - Vol. 1793, 1524–1532., 106 111. Apel, A., Herr, I., Schwarz, H., Rodemann, H.P., Mayer, A.,. Blocked autophagy, sensitizes resistant carcinoma cells to radiation therapy. Cancer Res. - 2008. - Vol. 68, 1485–1494., 112. Qadir, M.A., Kwok, B., Dragowska, W.H., To, K.H., Le, D., Bally, M.B., et al.,., Macroautophagy inhibition sensitizes tamoxifen-resistant breast cancer cells and enhances, mitochondrial depolarization. Breast Cancer Res. Treat. - 2008. - Vol. 112, 389–403., 113. Kim, K.W., Hwang, M., Moretti, L., Jaboin, J.J., Cha, Y.I., Lu, B.,. Autophagy upregulation by inhibitors of caspase-3 and mTOR enhances radiotherapy in a mouse model of lung cancer. Autophagy. - 2008. - Vol. 4, 659–668. 114. Kondo, Y., Kondo, S.,. Autophagy and cancer therapy. Autophagy 2006. - Vol. 2, 85–90. 115. Kondo, Y., Kanzawa, T., Sawaya, R., Kondo, S.,. The role of autophagy in cancer development and response to therapy. Nat. Rev. Cancer. - 2005. - Vol. 5, 726–734. 116. Moretti, L., Yang, E.S., Kim, K.W., Lu, B.,. Autophagy signaling in cancer and its potential as novel target to improve anticancer therapy. Drug Resist. Updat. - 2007. - Vol. 10, 135–143. 117. Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J.A.,. Autophagy facilitates the, development of breast cancer resistance to the anti-HER2 monoclonal antibody trastuzumab., PLoS One. - 2009. - Vol. 4, e6251. 118. Golstein P., Kroemer G. Cell death by necrosis: .towards a molecular definition // TiBS. -. 2006. - Vol. 32. P. 37–43 119. Proskuryakov S.Ya., Konoplyannikov A.G., Gabai V.L. Necrosis: a specific form of programmed cell death? // Exp. Cell Res. - 2003. - Vol. 283. P. 1–16. 120. Zong W.(X., Thompson C.B. Necrotic death as a cell fate // Genes Dev. - 2006. V. 20. P. 1–15) 121. BaldeaI, Filip AG. Photodynamic therapy in melanoma – an update. J Physiol Pharmacol. 2012. - Vol. 63(2):109–118.,). 122. Узденский, А. Б. Управляемый некроз / А. Б. Узденский // Биологические мембраны 2010. - Т. 27, № 1. - С. 7-17 123. Galluzzi, L., Kroemer, G.,. Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis.Cell. 2008. - Vol. 135, 1161–1163 124. Fabris, C., Valduga, G., Miotto, G., Borsetto, L., Jori, G., Garbisa, S., et al.,. Photosensitization with zinc (II) phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis. Cancer Res. - 2001. - Vol. 61, 7495–7500). 125. Sattler UG, Mueller-Klieser W. The antioxidant, capacity of tumour glycolysis. Int, J Radiat Biol. - 2009. - Vol. 85:963-971., 126. Frank J, Flaccus A, Schwarz C, Lambert C,, Biesalski HK. Ascorbic acid suppresses, cell death in rat DS-sarcoma cancer cells, induced by 5-aminolevulinic acid-based, photodynamic therapy. Free Radic Biol, Med. - 2006. - Vol. 40:827-836., 107 127. Golab J, Nowis D, Skrzycki M, et al. Antitumor, effects of photodynamic therapy are, potentiated by 2-methoxyestradiol. A, superoxide dismutase inhibitor. J Biol, Chem. - 2003. Vol. 278:407-414., 128. Hadjur C, Richard MJ, Parat MO, Jardon, P, Favier A. Photodynamic effects of hypericin, on lipid peroxidation and antioxidant, status in melanoma cells. Photochem, Photobiol. - 1996. Vol. 64:375-381., 129. Matroule JY, Bonizzi G, Morliere P,, et al. Pyropheophorbide-a methyl estermediated, photosensitization activates, transcription factor NF-kappaB through, the interleukin-1 receptor-dependent signaling, pathway. J Biol Chem. - 1999. - Vol. 274:, 2988-3000., 130. Хлусова М.Ю., Антипов С.А., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц., Федущак Т.А. Новые методы биотерапии рака пищеварительного тракта. Патофизиологические и клинические аспекты (обзор) // Сибирский медицинский журнал. - 2009. № 6. С.31-36 131. Sibani SA, McCarron PA, Woolfson AD,, Donnelly RF. Photosensitiser delivery for, photodynamic therapy. Part 2: systemic, carrier platforms. Expert Opin Drug Deliv. - //2008. Vol. 5:1241-1254 132. Sorkin, A., Goh, L.K. Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs // Exp. Cell. Res 2009. - Vol.315, 683-696. 133. Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network // Nat. Rev. Mol.. -Cell Biol., 2001. - Vol. 2,127–137. 134. Arteaga, C.L., Engelman, J.A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics // Cancer Cell. - 2014. - Vol.5,282-303. 135. http://www.biooncology.com/therapeutic-targets/her2 136. Slamon, D. J., Godolphin, W., Jones, L. A., Holt, J. A., Wong, S. G., Keith, D. E., Levin, W. J., Stuart, S. G., Udove, J., Ullrich, A., Press, M. // Science, 1989. - Vol. 244, 707–712. 137. Поляновский, О.Л., ErbB-онкогены - мишени моноклональных антител / Поляновский, О.Л., Лебеденко, Е.Н., Деев, С.М. // Биохимия, 2013. - Vol. 77, 289–311. 138. Citri, A., Gan, J., Mosesson, Y., Vereb, G., Szollosi, J., Yarden, Y. // EMBO Rep., 2004. - Vol. 5, 1165–1170. 139. Sliwkowski MX, Lofgren JA, Lewis GD, et al: Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab (Herceptin). // Semin Oncol 1999. - Vol. 26:60-70, 140. Деев С.М., Лебеденко Е.Н. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения. // Acta Naturae. 2009. № 1. С. 32-50 141. Peterson, E. Monoclonal antibody form and function: manufacturing the right antibodies for treating drug abuse / E. Peterson , S.M. Owens, R.L. Henry // AAPS J. – 2006. – Vol. 26, № 8(2). - P.383-390. 108 142 Kuimova, M.K., Bhatti, M., Deonarain, M., Yahioglu, G., Levitt, J.A., Stamati, I., et al.,. Fluorescence characterisation of multiply-loaded anti-HER2 single chain Fv-photosensitizer conjugates suitable for photodynamic therapy. // Photochem. Photobiol.Sci. 2007. - Vol. 6, 933–939 143 Serebrovskaya, E. Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein / Ekaterina O. Serebrovskaya [et al] // PNAS USA. – 2009. – Vol. 106, № 23. – P. 9221-9225 144 KasparBinz, H., Stumpp, M.T., Forrer, P., Amstutz, P., Plückthun A J. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins // Mol. Biol., 2003. - Vol. 332, 489–503. 145 Tamaskovic, R., Simon, M., Stefan, N., Schwill, M., Plückthun, A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy // Methods Enzymol., 2012. - Vol. 503, 101–134. 146 Kobe, B., Kajava, A. When protein folding is simplified to protein coiling: the continuum of solenoid protein structures // Trends Biochem. Sci., 2000. - Vol. 25, 509-515. 147. Kohl A1, Binz HK, Forrer P, Stumpp MT, Plückthun A, Grütter MG. Designed to be stable: crystal structure of a consensus ankyrin repeat protein // Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 148. Münch, R.C.,1 Mühlebach, M. D., Schaser, T., Kneissl, S, Jost, C, Plückthun,A., Cichutek, K., Buchholz, C.J. DARPins: an efficient targeting domain for lentiviral vectors // Mol Ther. 2011. - Vol.19(4), 686–693. 149. Henderson B.W. Fluence rate as a modulator of PDT mechanisms / B. W. Henderson, T. M. Busch, J. W. Snyder // Lasers Surg. Med. – 2006. – Т. 38 – № 5 – 489–493с. 150. Brancaleon L. Laser and non-laser light sources for photodynamic therapy. / L. Brancaleon, H. Moseley // Lasers Med. Sci. – 2002. – Т. 17 – № 3 – 173–186с. 151. Agostinis P. Photodynamic therapy of cancer: An update / P. Agostinis, K. Berg, K. A. Cengel, T. H. Foster, A. W. Girotti, S. O. Gollnick, S. M. Hahn, M. R. Hamblin, A. Juzeniene, D. Kessel, M. Korbelik, J. Moan, P. Mroz, D. Nowis, J. Piette, B. C. Wilson, J. Golab // CA. Cancer J. Clin. – 2011. – Т. 61 – № 4 – 250–281с. 152. Juzeniene A. Effectiveness of different light sources for 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy. / A. Juzeniene, P. Juzenas, L.-W. Ma, V. Iani, J. Moan // Lasers Med. Sci. – 2004. – Т. 19 – № 3 – 139–149с. 153. Beyer W. Systems for light application and dosimetry in photodynamic therapy. / W. Beyer // J. Photochem. Photobiol. B. – 1996. – Т. 36 – № 2 – Р. 153–156. 154. Plaetzer K. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: fundamental aspects. / K. Plaetzer, B. Krammer, J. Berlanda, F. Berr, T. Kiesslich // Lasers Med. Sci. – 2009. – Т. 24 – № 2 – 259–268с. 109 155. Chatterjee D.K. Small upconverting fluorescent nanoparticles for biomedical applications. / D. K. Chatterjee, M. K. Gnanasammandhan, Y. Zhang // Small – 2010. – Т. 6 – № 24 – 2781– 2795с. 156. Boyer J.-C. Synthesis of colloidal upconverting NaYF4 nanocrystals doped with Er3+, Yb3+ and Tm3+, Yb3+ via thermal decomposition of lanthanide trifluoroacetate precursors. / J.-C. Boyer, F. Vetrone, L. A. Cuccia, J. A. Capobianco // J. Am. Chem. Soc. – 2006. – Т. 128 – № 23 – 7444–7445с. 157. Chen J. Upconversion Nanoparticles: Design, Nanochemistry, and Applications in Theranostics / G. Chen, H. Qiu, P. N. Prasad, and X. Chen // Chem Rev. – 2014. – №114 (10) – Р. 51615214 158. N. Bloembergen No Title // Phys. Rev. Lett. – 1959. – Т. 2 – 84–85с. 159. В.Л. В.Фотоника биологических структур / В. В.Л. – , 1988.– 164 с.c 160. Xia L. An upconversion nanoparticle--Zinc phthalocyanine based nanophotosensitizer for photodynamic therapy. / L. Xia, X. Kong, X. Liu, L. Tu, Y. Zhang, Y. Chang, K. Liu, D. Shen, H. Zhao, H. Zhang // Biomaterials – 2014. – Т. 35 – № 13 – 4146–4156с. 161. Ungun B. Nanofabricated upconversion nanoparticles for photodynamic therapy. / B. Ungun, R. K. Prud’homme, S. J. Budijon, J. Shan, S. F. Lim, Y. Ju, R. Austin // Opt. Express – 2009. – Т. 17 – № 1 – 80–86с. 162. Zhou A. Pyropheophorbide A and c(RGDyK) comodified chitosan-wrapped upconversion nanoparticle for targeted near-infrared photodynamic therapy. / A. Zhou, Y. Wei, B. Wu, Q. Chen, D. Xing // Mol. Pharm. – 2012. – Т. 9 – № 6 – 1580–1589с 163. Qian H.S. Mesoporous-silica-coated up-conversion fluorescent nanoparticles for photodynamic therapy. / H. S. Qian, H. C. Guo, P. C.-L. Ho, R. Mahendran, Y. Zhang // Small – 2009. – Т. 5 – № 20 – 2285–2290с. 164. Guo H. Singlet oxygen-induced apoptosis of cancer cells using upconversion fluorescent nanoparticles as a carrier of photosensitizer. / H. Guo, H. Qian, N. M. Idris, Y. Zhang // Nanomedicine – 2010. – Т. 6 – № 3 – 486–495с. 165. Chatterjee D.K. Upconverting nanoparticles as nanotransducers for photodynamic therapy in cancer cells. / D. K. Chatterjee, Z. Yong // Nanomedicine (Lond). – 2008. – Т. 3 – № 1 – 73– 82с. 166. Liu K. Covalently assembled NIR nanoplatform for simultaneous fluorescence imaging and photodynamic therapy of cancer cells. / K. Liu, X. Liu, Q. Zeng, Y. Zhang, L. Tu, T. Liu, X. Kong, Y. Wang, F. Cao, S. A. G. Lambrechts, M. C. G. Aalders, H. Zhang // ACS Nano – 2012. – Т. 6 – № 5 – 4054–4062с 110 167. Shan J. Pegylated Composite Nanoparticles Containing Upconverting Phosphors and mesoTetraphenyl porphine (TPP) for Photodynamic Therapy / J. Shan, S. J. Budijono, G. Hu, N. Yao, Y. Kang, Y. Ju, R. K. Prud’homme // Adv. Funct. Mater. – 2011. – Т. 21 – № 13 – 2488– 2495с 168. Qiao X.-F. Triple-functional core-shell structured upconversion luminescent nanoparticles covalently grafted with photosensitizer for luminescent, magnetic resonance imaging and photodynamic therapy in vitro. / X.-F. Qiao, J.-C. Zhou, J.-W. Xiao, Y.-F. Wang, L.-D. Sun, C.-H. Yan // Nanoscale – 2012. – Т. 4 – № 15 – 4611–4623с. 169. Zhao Z. Multifunctional core-shell upconverting nanoparticles for imaging and photodynamic therapy of liver cancer cells. / Z. Zhao, Y. Han, C. Lin, D. Hu, F. Wang, X. Chen, Z. Chen, N. Zheng // Chem. Asian J. – 2012. – Т. 7 – № 4 – 830–837с 170. Wang C. Near-infrared light induced in vivo photodynamic therapy of cancer based on upconversion nanoparticles. / C. Wang, H. Tao, L. Cheng, Z. Liu // Biomaterials – 2011. – Т. 32 – № 26 – 6145–6154с 171. Chen F. A uniform sub-50 nm-sized magnetic/upconversion fluorescent bimodal imaging agent capable of generating singlet oxygen by using a 980 nm laser. / F. Chen, S. Zhang, W. Bu, Y. Chen, Q. Xiao, J. Liu, H. Xing, L. Zhou, W. Peng, J. Shi // Chemistry – 2012. – Т. 18 – № 23 – 7082–7090с. 172. Cui S. Amphiphilic chitosan modified upconversion nanoparticles for in vivo photodynamic therapy induced by near-infrared light / S. Cui, H. Chen, H. Zhu, J. Tian, X. Chi, Z. Qian, S. Achilefu, Y. Gu // J. Mater. Chem. – 2012. – Т. 22 – № 11 – 4861–4873с. 173. Park Y. Il Theranostic probe based on lanthanide-doped nanoparticles for simultaneous in vivo dual-modal imaging and photodynamic therapy. / Y. Il Park, H. M. Kim, J. H. Kim, K. C. Moon, B. Yoo, K. T. Lee, N. Lee, Y. Choi, W. Park, D. Ling, K. Na, W. K. Moon, S. H. Choi, H. S. Park, S.-Y. Yoon, Y. D. Suh, S. H. Lee, T. Hyeon // Adv. Mater. – 2012. – Т. 24 – № 42 – 5755–5761с 174. Idris N.M. In vivo photodynamic therapy using upconversion nanoparticles as remotecontrolled nanotransducers. / N. M. Idris, M. K. Gnanasammandhan, J. Zhang, P. C. Ho, R. Mahendran, Y. Zhang // Nat. Med. – 2012. – Т. 18 – № 10 – 1580–1585с. 175. Hermanson G.T. Chapter 1 - Introduction to Bioconjugation / под ред. G.T.B.T.-B.T. (Third edition) Hermanson. Boston: Academic Press, 2013. – 1–125с. 176. Kotov N. Luminescence of Nanoparticle-Labeled Antibodies and Antigens CRC Press, 2004 177. Santes K. De Radiolabeled antibody targeting of the HER-2/neu oncoprotein. / K. De Santes, D. Slamon, S. K. Anderson, M. Shepard, B. Fendly, D. Maneval, O. Press // Cancer Res. – 1992. – Т. 52 – № 7 – 1916–1923с. 111 178. Edelweiss E. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells. / E. Edelweiss, T. G. Balandin, J. L. Ivanova, G. V Lutsenko, O. G. Leonova, V. I. Popenko, A. M. Sapozhnikov, S. M. Deyev // PLoS One – 2008. – Т. 3 – № 6 – e2434с. 179. Ivanova J.L. Application of fusion protein 4D5 scFv-dibarnase:barstar-gold complex for studying P185HER2 receptor distribution in human cancer cells. / J. L. Ivanova, E. F. Edelweiss, O. G. Leonova, T. G. Balandin, V. I. Popenko, S. M. Deyev // Biochimie – 2012. – Т. 94 – № 8 – 1833–1836с 180. Ren X.-R. Polyclonal HER2-specific antibodies induced by vaccination mediate receptor internalization and degradation in tumor cells. / X.-R. Ren, J. Wei, G. Lei, J. Wang, J. Lu, W. Xia, N. Spector, L. S. Barak, T. M. Clay, T. Osada, E. Hamilton, K. Blackwell, A. C. Hobeika, M. A. Morse, H. K. Lyerly, W. Chen // Breast Cancer Res. – 2012. – Т. 14 – № 3 – R89с 181. Murakami L.S. Photocytotoxicity of a cyanine dye with two chromophores toward melanoma and normal cells. / L. S. Murakami, L. P. Ferreira, J. S. Santos, R. S. da Silva, A. Nomizo, V. A. Kuz’min, I. E. Borissevitch // Biochim. Biophys. Acta – 2015. – Т. 1850 – № 6 – 1150– 1157с. 182. Morgan J. Mitochondria-based photodynamic anti-cancer therapy. / J. Morgan, A. R. Oseroff // Adv. Drug Deliv. Rev. – 2001. – Т. 49 – № 1-2 – 71–86с 183. Zinchuk V. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. / V. Zinchuk, O. Grossenbacher-Zinchuk // Prog. Histochem. Cytochem. – 2009. – Т. 44 – № 3 – 125–172с 184. Nagy P. Activation-dependent clustering of the erbB2 receptor tyrosine kinase detected by scanning near-field optical microscopy. / P. Nagy, A. Jenei, A. K. Kirsch, J. Szollosi, S. Damjanovich, T. M. Jovin // J. Cell Sci. – 1999. – Т. 112 ( Pt 1 – 1733–1741с. 185. Nagy P. Lipid rafts and the local density of ErbB proteins influence the biological role of homo- and heteroassociations of ErbB2. / P. Nagy, G. Vereb, Z. Sebestyen, G. Horvath, S. J. Lockett, S. Damjanovich, J. W. Park, T. M. Jovin, J. Szollosi // J. Cell Sci. – 2002. – Т. 115 – № Pt 22 – 4251–4262с. 186. Sakharov D. V Prolonged lipid oxidation after photodynamic treatment. Study with oxidationsensitive probe C11-BODIPY581/591. / D. V Sakharov, E. D. R. Elstak, B. Chernyak, K. W. A. Wirtz // FEBS Lett. – 2005. – Т. 579 – № 5 – 1255–1260с 187. Girotti A.W. Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathways, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms. / A. W. Girotti // J. Photochem. Photobiol. B. – 2001. – Т. 63 – № 1-3 – 103–113с. 112 188. Bhatti M. Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments. / M. Bhatti, G. Yahioglu, L. R. Milgrom, M. Garcia-Maya, K. A. Chester, M. P. Deonarain // Int. J. Cancer – 2008. – Т. 122 – № 5 – 1155–1163с 189. Manfredi J.J. Taxol binds to cellular microtubules. / J. J. Manfredi, J. Parness, S. B. Horwitz // J. Cell Biol. – 1982. – Т. 94 – № 3 – 688–696с 190. Schiff P.B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. / P. B. Schiff, J. Fant, S. B. Horwitz // Nature – 1979. – Т. 277 – № 5698 – 665–667с. 191. Savellano M.D. Photochemical targeting of epidermal growth factor receptor: a mechanistic study. / M. D. Savellano, T. Hasan // Clin. Cancer Res. – 2005. – Т. 11 – № 4 – 1658–1668с. 192. Zhivotovsky B. Determination of apoptosis and necrosis. / B. Zhivotovsky, A. Samali, S. Orrenius // Curr. Protoc. Toxicol. – 2001. – Т. Chapter 2 – Unit 2.2с 193. Fabris C. Photosensitization with zinc (II) phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis. / C. Fabris, G. Valduga, G. Miotto, L. Borsetto, G. Jori, S. Garbisa, E. Reddi // Cancer Res. – 2001. – Т. 61 – № 20 – 7495–7500с 194. Castano A.P. Photodynamic therapy and anti-tumour immunity. / A. P. Castano, P. Mroz, M. R. Hamblin // Nat. Rev. Cancer – 2006. – Т. 6 – № 7 – 535–545с 195. Berg K. Photochemical internalization (PCI): a technology for drug delivery. / K. Berg, A. Weyergang, L. Prasmickaite, A. Bonsted, A. Hogset, M.-T. R. Strand, E. Wagner, P. K. Selbo // Methods Mol. Biol. – 2010. – Т. 635 – 133–145с. 196. Yang Y. Thienopyrrole-expanded BODIPY as a potential NIR photosensitizer for photodynamic therapy. / Y. Yang, Q. Guo, H. Chen, Z. Zhou, Z. Guo, Z. Shen // Chem. Commun. (Camb). – 2013. – Т. 49 – № 38 – 3940–3942с. 197. Yuan A. Application of near-infrared dyes for tumor imaging, photothermal, and photodynamic therapies. / A. Yuan, J. Wu, X. Tang, L. Zhao, F. Xu, Y. Hu // J. Pharm. Sci. – 2013. – Т. 102 – № 1 – 6–28с 198. Zhang P. Versatile Photosensitizers for Photodynamic Therapy at Infrared Excitation / P. Zhang, W. Steelant, M. Kumar, M. Scholfield // J. Am. Chem. Soc. – 2007. – Т. 129 – № 15 – 4526–4527с 199. Hao S. Sensing using rare-earth-doped upconversion nanoparticles. / S. Hao, G. Chen, C. Yang // Theranostics – 2013. – Т. 3 – № 5 – 331–345с 200. Förster T. Intermolecular Energy Migration and Fluorescence / T. Förster // Ann. Phys – 1948. – Т. 2 – 55–75с 201. Generalova A.N. Submicron polyacrolein particles in situ embedded with upconversion nanoparticles for bioassay. / A. N. Generalova, I. K. Kochneva, E. V Khaydukov, V. A. 113 Semchishen, A. E. Guller, A. V Nechaev, A. B. Shekhter, V. P. Zubov, A. V Zvyagin, S. M. Deyev // Nanoscale – 2015. – Т. 7 – № 5 – 1709–1717с. 202. N. Miyoshia, M. Uedaa, K. Fukeb, Y. Tanimotoa, M. Itoha and G.T. Lifetime of Singlet Oxygen and Quenching by NaN3 in Mixed Solvents / and G. T. N. Miyoshia, M. Uedaa, K. Fukeb, Y. Tanimotoa, M. Itoha // Z. Naturforsch – 1981. – Т. 37 – 649–652с 203. Harvey P. Ratiometric detection of enzyme turnover and flavin reduction using rare-earth upconverting phosphors. / P. Harvey, C. Oakland, M. D. Driscoll, S. Hay, L. S. Natrajan // Dalton Trans. – 2014. – Т. 43 – № 14 – 5265–5268с 204. Morris H.P. EFFECTS ON THE GENESIS AND GROWTH OF TUMORS ASSOCIATED WITH VITAMIN INTAKE / H. P. Morris // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1947. – Т. 49 – № 1 – 119–140с 205. http://www.expasy.org/ 206. Steiner D. Efficient selection of DARPins with sub-nanomolar affinities using SRP phage display. / D. Steiner, P. Forrer, A. Pluckthun // J. Mol. Biol. – 2008. – Т. 382 – № 5 – 1211– 1227с. 207. Shaner N.C. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. // Nat. Biotechnol. – 2004. – Т. 22. – № 12. – 1567– 1572с 208. Chudakov D.M. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. / D. M. Chudakov, M. V Matz, S. Lukyanov, K. A. Lukyanov // Physiol. Rev. – 2010. – Т. 90 – № 3 – 1103–1163с 209. Jost C. Structural basis for eliciting a cytotoxic effect in HER2-overexpressing cancer cells via binding to the extracellular domain of HER2. / C. Jost, J. Schilling, R. Tamaskovic, M. Schwill, A. Honegger, A. Pluckthun // Structure – 2013. – Т. 21 – № 11 – 1979–1991с. 210. Steiner D. Efficient selection of DARPins with sub-nanomolar affinities using SRP phage display. / D. Steiner, P. Forrer, A. Pluckthun // J. Mol. Biol. – 2008. – Т. 382 – № 5 – 1211– 1227с 211. Dong B. Multifunctional NaYF4 : Yb3+,Er3+@Ag core/shell nanocomposites: integration of upconversion imaging and photothermal therapy / B. Dong, S. Xu, J. Sun, S. Bi, D. Li, X. Bai, Y. Wang, L. Wang, H. Song // J. Mater. Chem. – 2011. – Т. 21 – № 17 – 6193с. 212. Cheng L. Facile preparation of multifunctional upconversion nanoprobes for multimodal imaging and dual-targeted photothermal therapy. / L. Cheng, K. Yang, Y. Li, J. Chen, C. Wang, M. Shao, S.-T. Lee, Z. Liu // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2011. – Т. 50 – № 32 – 7385– 7390с. 114 213. Dai Y. Doxorubicin conjugated NaYF4: Yb3+/Tm3+ Nanoparticles for therapy and sensing of drug delivery by luminescence resonance energy transfer / Y. Dai, D. Yang, P. Ma, X. Kang, X. Zhang, C. Li, Z. Hou, Z. Cheng, J. Lin // Biomaterials – 2012. – Т. 33 – № 33 – 8704–8713с. 214. Kerr A.C. Ultraviolet A1 phototherapy: a British Photodermatology Group workshop report / A. C. Kerr, J. Ferguson, S. K. Attili, P. E. Beattie, A. J. Coleman, R. S. Dawe, B. Eberlein, V. Goulden, S. H. Ibbotson, H. du P. Menage, H. Moseley, L. Novakovic, S. L. Walker, J. A. Woods, A. R. Young, R. P. E. Sarkany // Clin. Exp. Dermatol. – 2012. – Т. 37 – № 3 – 219– 226с. 215. Morris H.P. Effectson the genesis and growth of tumors associated with vitamin intake. / H. P. Morris // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 1947. – Т. 49 – № 1 – 119–140с. 216. Rao P.N. Elevation of serum riboflavin carrier protein in breast cancer. / P. N. Rao, E. Levine, M. O. Myers, V. Prakash, J. Watson, A. Stolier, J. J. Kopicko, P. Kissinger, S. G. Raj, M. H. Raj // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 1999. – Т. 8 – № 11 – 985–990с 217. Vaidya S.M. Molybdenum, xanthine oxidase and riboflavin levels in tamoxifen treated postmenopausal women with breast cancer. / S. M. Vaidya, P. L. Kamlakar, S. M. Kamble // Indian J. Med. Sci. – 1998. – Т. 52 – № 6 – 244–247с 218. Karande A.A. Riboflavin carrier protein: a serum and tissue marker for breast carcinoma. / A. A. Karande, L. Sridhar, K. S. Gopinath, P. R. Adiga // Int. J. Cancer – 2001. – Т. 95 – № 5 – 277–281с. 219. Phelps M.A. A novel rhodamine-riboflavin conjugate probe exhibits distinct fluorescence resonance energy transfer that enables riboflavin trafficking and subcellular localization studies. / M. A. Phelps, A. B. Foraker, W. Gao, J. T. Dalton, P. W. Swaan // Mol. Pharm. – 2004. – Т. 1 – № 4 – 257–266с 220. York N.R. UVA1 phototherapy: A review of mechanism and therapeutic application / N. R. York, H. T. Jacobe // Int. J. Dermatol. – 2010. – Т. 49 – № 6 – 623–630с 115 Приложение 1. Конфокальные изображения клеток CHO после инкубации с 4D5scFv-miniSOG при 4C. A изображение клеток в проходящем свете, Б – флуоресцентное изображение в зеленом канале. Приложение 2. Цитотоксичность таксола® на клетках SKBR-3. Ось абсцисс – концентрация таксола® в логарифмической шкале, ось ординат – относительная жизнеспособность клеток (±стандартное отклонение). 116 Приложение 3. Результат измерения дзета-потенциала НАФ, покрытых полимерной оболочкой ПМАО Приложение 4. Детекция связывания нанокомплекса НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry с клетками. Представлены изображения HER2/neu-положительных клеток SK-BR-3 (а, б) и HER2/neuотрицательных клеток СНО (в, г), обработанных нанокомплексом, полученные на эпилюминесцентном инвертированном микроскопе (ИПЛИТ РАН). Изображения а,в, сделанные в проходящем свете, соответствуют изображениям б,г, полученным в канале люминесценции нанофосфоров. 117 Приложение 5. Морфологические изменения клеток SK-BR-3, инкубированных с НАФ(Tm3+)РМАО:DARPin-mCherry и облученных ИК-лазером в течение 10 мин. Снимки клеток сделаны в трех каналах: проходящий свет (А), красный флуоресцентный канал (Б), канал люминесценции НАФ (В). А) Б) В) 118 Благодарности Автор выражает огромную благодарность всему коллективу лаборатории молекулярной иммунологии, в особенности научному руководителю Сергею Михайловичу Дееву. Особую благодарность автор выражает Галине Михайловне Прошкиной за живое обсуждение работы и за помощь в ее реализации на этапах от постановки экспериментов и до написания статей. Огромную благодарность за помощь в работе над изложением диссертации автор выражает Екатерине Николаевне Лебеденко. Автор очень признателен Татьяне Здобновой, Олегу Стремовскому, Виктории Шипуновой, Екатерине Ивукиной, Юрию Ходаровичу за ценные методические советы. Автор выражает благодарность Анастасии Рябовой (лаборатория лазерной биоспектроскопии, ИОФ РАН) за высококвалифицированную помощь в получении конфокальных изображений клеток, Андрею Нечаеву (кафедра химии и технологии биологически МИТХТ) активных соединений им.Н.А.Преображенского, за синтез нанофосфоров, Алле Генераловой (лаборатория «Полимеры для биологии», ИБХ РАН) за покрытие НАФ полимерными оболочками, Марине Шевченко и Александру Прохорову (лаборатория клеточных взаимодействий, ИБХ РАН) за отзывчивость и помощь в работе с оборудованием . Отдельную благодарность автор выражает Евгению Хайдукову и Владимиру Анатольевичу Семчишену (Лаборатории нелинейной оптики поверхности и лазерноплазменных процессов, ИПЛИТ РАН) за интерес к работе и за неоценимую помощь в реализации ее физической части.
