p53 protein DNA binding domain
advertisement
Компьютерный анализ структуры и эволюции функциональных сайтов белка p53 Пинтус С.С. Руководитель — доцент, к.б.н. В.А. Иванисенко Цель исследования Выявление закономерностей структурно-функциональной организации белка p53 на основе конформационного анализа пространственных структур мутантных форм белка и определения режимов его эволюции. Задачи Разработка метода поиска функциональных сайтов в пространственных структурах белков Разработка базы данных пространственных структур функциональных сайтов белков и их пространственного окружения Конформационный анализ мутантных форм белка p53, выявление участков белка, подверженных конформационным изменениям в результате мутаций Анализ влияния мутаций на структурную организацию функциональных сайтов белка p53, предсказание вновь возникающих сайтов в мутантных структурах белка Исследование предрасположенности позиций с различным режимом эволюции к накоплению мутаций с достоверно различным фенотипическим проявлением Изучение влияния естественного отбора на эволюционную историю и структуру белка p53 Повреждение ДНК Функции p53 +1 апоптоз Fas, DR5, PERP +1 p53 Деполяризация мембран митохондрий +1 Waf1, rprm, sfn gadd45 p53 Цитохром C APAF-1 p21 остановка клеточного цикла +1 антиангиогенез tsp1, bai1, Maspin +1 XPC, DDB2 эксцизионная репарация нуклеотидов P53 и его паралоги p53 TAD апоптоз DBD OD остановка клеточного цикла p63 TAD апоптоз DBD OD SAM эмбриональное развитие (т.ч. развитие кожи) p73 TAD апоптоз DBD OD SAM гомеостаз, нейрогенез Белки p63 и p73 способны вызывать остановку клеточного цикла и апоптоз, но имеют большее значение в эмбриогенезе, чем p53. P53 и MDM2 Взаимодействия между белком mdm2 (SWIB) и белком p53 (TAD) образуют отрицательную обратную связь Связывания ДНК белком p53 (DBD) необходимо для трансактивации его геновмишеней mdm2 p53 SWIB TAD апоптоз Zn DBD остановка клеточного цикла OD Пространственная структура мономера ДНК-связывающего домена белка p53 Связывание цинка необходимо белку p53 для связывания ДНК Мотив связывания ДНК петля-лист-спираль Область связывания иона цинка Метод предсказания функциональных сайтов в пространственных структурах белков Структурное выравнивание шаблона с фрагментом белка шаблон функционального сайта Потенциальные функциональные сайты (RMSD < 1.8 Å) База PDBSite База PDB 1 RMSD= N ∑ N i 2 2 x i −x'i y i − y'i z i −z' i 2 Классификация функциональных сайтов в базе PDBSite Группы функциональных сайтов Число специфических функций в группе Число сайтов в группе Каталитические 222 1467 Пострансляционной модификации 8 55 Связывания ионов металлов 17 3309 Связывания ионов неметаллов 9 1716 Связывания 133 органических лигандов 6747 Белок-белковых взаимодействий 15353 955 Взаимодействий белок- 1324 ДНК 1329 Взаимодействий белок- 752 РНК 755 Связывания фармацевтических препаратов 28 Разные 14 – 4481 Алгоритм предсказания новых сайтов в мутантных формах белка p53 Анализ молекулярной динамики >ID P53_HUMAN SWISS-MODEL Предсказание 3D структур мутантов PSBSiteScan Предсказание функциональных сайтов, начального положения лиганда Предсказанный возникший сайт связывания цинка в мутантной форме G245C белка p53 Cys 245 Cys 176 Cys 242 Cys 238 His 179 Предсказанный возникший сайт связывания цинка в мутантной форме G245D белка p53 Asp 245 Cys 176 His 179 Cys 242 Cys 238 Конформационный анализ мутантных форм белка p53 на основе статистического анализа траекторий молекулярной динамики 12 траекторий м.д 30 последних пикосекунд, Cα атомы Влияние мутаций на конформационную подвижность белка p53, свободного от иона цинка Замены G245C и G245D по-разному влияют на конформацию сайта связывания ДНК в белке p53, но одинаково влияют на ядро белка LSH, связывание большой бороздки ДНК L3, связывание малой бороздки ДНК 10 8 6 4 g245c g245d 2 0 -2 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Влияние мутаций на конформационную подвижность комплекса белка p53 с ионом цинка Связывание иона цинка частично компенсирует влияние замен G245C и G245D на сайт связывания ДНК Z̃ 20 15 10 5 0 -5 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 Различия между долями генеративных и соматических замен с различным фенотипическим проявлением, приходящихся на консервативные кодоны 90 80 70 60 50 генеративные соматические 40 30 20 10 0 потери приобретения доминантно-негативный Стабилизирующий отбор выраженно действовал против мутантных форм белка p53 с фенотипическим эффектом приобретения функции χ2 = 6.17 (p < 0.1, df = 3) Филогенетическое древо белков p53/p63/p73 p53 p73 p63 Подтвержаются данные, что семейство p53 произошло от общего для группы семейств предка раньше, чем семейство p73 произошло от предка, общего для семеиств p63 и p73 (Saccone et al, 2002). Адаптивная эволюция белка p53 TAD DBD 6S 35L 38Q 47P 51E 52Q 59G 65R 73V 106S 129A 245G (ω = 0.098) ω = dN/dS Адаптивная эволюция белков p63 и p73 p73 p63 Большинство триплетов p63, подверженных движущему отбору, кодируют аминокислотные остатки, входящие в гибкие линкеры, которые соединяют более жесткие структурные элементы белка. Основные результаты Разработан метод анализа конформационных различий между мутантными и нормальной формой белка, основанный на методе молекулярной динамики и статистическом анализе траекторий молекулярной динамики с помощью Zстатистики. Метод позволяет оценивать влияние мутаций на конформацию отдаленных участков белков. Предположено возникновение нового потенциального сайта связывания катиона цинка в мутантной форме белка p53 человека, соответствующей аминокислотной замене G245С. Связывание иона цинка новым сайтом, обеспечивает уменьшение конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной форме белка p53 Получены свидетельства этапов движущего отбора в эволюционной истории семейства p53. Установлено выраженное действие стабилизирующего отбора против мутантных форм белка p53 с фенотипическим эффектом приобретения функции Выводы 1.Разработан метод поиска функциональных сайтов в третичных структурах белков на основе генетического алгоритма и структурного выравнивания сайтов из базы данных PDBSite, включающих в себя активные центры ферментов, сайты связывания ионов металлов, низкомолекулярных соединений, белков, РНК, ДНК, сайты посттрансляционной модификации с исследуемым белком. Разработан метод автоматической классификации функциональных сайтов, с использованием которого проведена классификация сайтов в базе данных PDBSite. 2.Разработан метод анализа конформационных различий между мутантными и нормальной формой белка, основанный на методе молекулярной динамики и статистическом анализе траекторий молекулярной динамики с помощью Zстатистики. Метод позволяет оценивать влияние мутаций на конформацию отдаленных участков белков. 3.С помощью разработанных методов предсказано возникновение нового сайта связывания иона цинка в результате мутаций, затрагивающих аминокислоту G245 (G245C, G245D) в белке p53, ассоциируемых с синдромом Ли-Фраумени и рядом других опухолевых заболеваний. Новый сайт располагается в непосредственной близости от нормального цинк-связывающего сайта и, предположительно, может конкурировать с ним за связывание иона цинка — аллостерического регулятора связывания ДНК белком p53. Выводы (продолжение) 4.Показано, что наибольшему влиянию замен G245C и G245D подвержена конформация удаленных участков белка, располагающихся в ядре домена связывания ДНК и таким образом, существенных для конформационных свойств этого домена в целом. Также показано, что связывание иона цинка новым сайтом, обеспечивает уменьшение конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной форме белка p53, что служит дополнительным свидетельством функциональности нового сайта. 5.Обнаружены события движущего отбора в эволюционной истории родственных семейств белков p53, p63 и p73, на стадии дивергенции происхождения тетрапод, амниот, синапсид и высших млекопитающих. Впервые обнаружено, что в белке p53 движущему отбору подвергались кодоны, соответствующие аминокислотным остаткам S106 и A129, важным для функциональных перестроек конформации при взаимодействии белка p53 c ДНК. 6.В результате сравнительного анализа частот различных аминокислотных замен, приходящихся на кодоны с различными режимами отбора, установлено, что наиболее жесткий стабилизирующий отбор направлен против мутаций с так называемым доминантнонегативным эффектом. Публикации по теме диссертации 5 статей в рецензируемых журналах, 4 из них в журналах ВАК, 2 публикации в монографиях Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSiteScan: a program for search of the active, binding and posttranslational modification sites in the 3D structures of proteins // Nucleic Acids Research. 2004. V.32. P.W549-W554. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSite: a database of the 3D structure of protein functional sites // Nucleic Acids Research. 2005. V.33. P.D1-D5. Пинтус С.С., Фомин Э.С., Иванисенко В.А., Колчанов Н.А. Филогенетический анализ семейства p53 // Биофизика. 2006. Т.51. С.640-649. Pintus SS, Fomin ES, Oshurkov I, Ivanisenko VA. Phylogenetic analysis of the p53 and p63/p73 gene families. In Silico Biology. 2007 7(3):319-332 Пинтус С.С. Коэволюция доменов ключевых белков апоптоза p53 и mdm2 // Информационный вестник ВОГиС. 2009. Т.13. №1 C.128-136. По результатам работы были сделаны устные доклады на 3-х конференциях: BGRS (Новосибирск) Третий съезд биофизиков России (Воронеж) MCCMB (Москва)
