Текст автореферата в электронной форме

На правах рукописи
ЧУДИНОВ Алексей Владимирович
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИЙ
ДЕЙТЕРОВОДОРОДНОГО ОБМЕНА ИОНОВ БИООРГАНИЧЕСКИХ
МОЛЕКУЛ С ДЕЙТЕРОАММИАКОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
РАДИОЧАСТОТНОГО СЕГМЕНТИРОВАННОГО КВАДРУПОЛЯ В
КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ИОННОГО РЕАКТОРА
01.04.17 – химическая физика,
в том числе физика горения и взрыва
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата физико-математических наук
Черноголовка 2007 г.
Работа выполнена в Филиале Института энергетических проблем химической
физики РАН в лаборатории «Масс-спектрометрия в энергетике и экологии»
Научный руководитель:
доктор физико-математических наук
Зеленов Владислав Валерьевич
Официальные оппоненты:
кандидат физико-математических наук
Сурин Алексей Константинович
доктор физико-математических наук
Морозов Игорь Иллиодорович
Ведущая организация:
Институт проблем химической физики РАН
Защита диссертации состоится «____»_______________2007 г. в ____ часов на
заседании
диссертационного
совета
Д
002.112.01
при
Институте
энергетических проблем химической физики РАН по адресу: 119334 Москва,
Ленинский проспект, 38, корпус 2, ИНЭПХФ РАН, актовый зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической
физики им. Н.Н. Семёнова РАН
Автореферат разослан «____»_______________2007 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д 002.112.01
кандидат химических наук
Николаева М.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность:
1.
Перспектива расширения аналитических возможностей метода масс-
спектрометрии, как инструмента для изучения особенностей газофазной
конформационной структуры биологических ионов.
2.
Информация об устойчивых конформационных состояниях биомолекул в
газовой фазе имеет как фундаментальную, так и практическую ценность.
Сюда можно включить:
• изучение
влияния
водной
среды
на
процесс
организации
и
функционирования биологических макромолекул,
• уточнение природы внутримолекулярных взаимодействий, ведущих к
формированию нековалентных структур в биологических системах.
3.
Потребность в определении мест селективного протонирования в
газофазных ионах белков и полипептидов для более глубокого понимания
механизмов перехода таких ионов в вакуум в современных источниках
ионизации: MALDI и ESI.
Целью настоящей работы является:
Исследование
возможности
использования
сегментированного
радиочастотного квадруполя, расположенного в атмосферном интерфейсе
времяпролетного масс-спектрометра с ортогональным вводом ионов, в
качестве ион-молекулярного реактора для изучения кинетики реакций H/Dобмена в биоорганических ионах.
Для достижения поставленной цели были сформулированы задачи:
• Разработка
методики
последовательности
численной
экспериментально
обработки
полученных
временной
масс-спектров
дейтерированных продуктов для вычисления кинетических параметров
реакций изотопного обмена.
• Реализация экспериментального метода исследования, включая:
3
a) Определение
величин
подвижности
ионов
аминокислот
и
полипептидов в продольном электрическом поле сегментированного
радиочастотного квадруполя.
b) Исследование кинетики H/D-обмена ряда биомолекулярных ионов с
дейтерированным
аммиаком
внутри
сегментированного
радио-
частотного квадруполя при задании времени контакта этих ионов с
газом-реагентом напряженностью продольного электрического поля и
последующим детектированием ионов-продуктов времяпролетным массспектрометром с ортогональным вводом ионов.
Основные защищаемые положения:
• Методика численной обработки масс-спектров молекулярных ионов
аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе протекания процесса H/Dобмена в этих ионах.
• Механизм
стабилизации
ион-молекулярных
комплексов
ионов
аминокислот с молекулами дейтероаммиака через диссипацию избыточной
энергии на внутренних степенях свободы этих комплексов.
• Эффективные
константы
скорости
реакции
H/D-обмена
в
ионах
аминокислот, усредненные по всем наблюдаемым процессам H/D-замещений
и
находящиеся
в
диапазоне
~10-11-10-10
см3с-1,
при
использовании
дейтерированного аммиака в качестве дейтерирующего агента.
• Разрешение групп активных атомов водорода, участвующих в реакциях
H/D-обмена с разными скоростями, в ионах грамицидина S и лейцинэнкефалина.
Научная новизна:
• Предложена оригинальная методика расчета кинетических параметров
H/D-обмена, которая использует связь наблюдаемых интенсивностей массспектральных линий с концентрацией активных центров исходного ионареагента. Разработанный подход применим для сложных биоорганических
молекул, для которых изотопное распределение является неразрешенным.
4
• Продемонстрированы возможности сегментированного радиочастотного
квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора для исследования H/Dобмена в биомолекулярных ионах.
Научная и практическая ценность:
• Разработанный метод определения кинетических параметров процесса
H/D-обмена в сложных биоорганических ионах является универсальным. Он
применим для широкого круга ионов биомолекул и газов-реагентов.
• Сегментированный радиочастотный квадруполь, предлагаемый в качестве
молекулярно-ионного
реактора
для
изучения
H/D-обмена,
может
применяться как атмосферный интерфейс во времяпролетных массспектрометрах с целью расширения их аналитических возможностей.
Личный вклад автора:
Автором разработана численная методика для исследования кинетики
реакций изотопного обмена при масс-спектрометрическом детектировании
продуктов реакции. Автор непосредственно участвовал в обосновании,
постановке и проведении всех экспериментов, их интерпретации и
обобщении полученных результатов.
Апробация работы:
Результаты работы докладывались и обсуждались на конференциях:
Международная конференция “Desorption-2004”, Санкт-Петербург, Россия,
2004;
2-я
химической
Международная
физике,
семинар-школа
биофизике
и
«Масс-спектрометрия
экологии»,
Звенигород
,
в
2004,
(докладываемой работе присуждено призовое место на конкурсе молодых
ученых);
Международная
конференция
американского
масс-
спектрометрического общества, Conference on Mass Spectrometry and Allied
Topics,
San
Antonio,
международным
USA,
участием
2005;
I
Всероссийская
«Масс-спектрометрия
и
конференция
ее
с
прикладные
проблемы», Москва, 2005; Конференция «Научные школы Черноголовки 5
молодежи», Черноголовка, 2006; 3-я Международная конференция–школа
«Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии»,
Звенигород, 2007, (докладываемой работе присуждено призовое место на
конкурсе молодых ученых).
Объем и структура диссертации:
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка
цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 110 страниц,
включая 42 рисунка и 7 таблиц. Список литературы содержит 101
наименование.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение. Обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной
работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная
новизна и практическая значимость.
Глава
1.
Литературный
экспериментов,
обзор.
Сделан
подтверждающих
обзор
по
возможность
результатам
существования
устойчивых конформационных состояний у биомолекулярных ионов в газовой
фазе.
Дано
краткое
описание
методов
исследования
газофазных
конформационных структур белковых молекул с использованием массспектрометрии.
Сделан
детальный
обзор
по
исследованию
конформационных состояний молекулярных ионов белков и полипептидов в
газовой фазе с использованием реакций газофазного H/D-обмена с
последующим масс-спектрометрическим детектированием образующихся
продуктов. Описаны преимущества и особенности методики, используемой
в диссертационной работе.
Глава 2. Методика проведения экспериментов. Описана экспериментальная установка. Приведен
список
используемых реактивов.
Описана
процедура проведения экспериментов и подходы, используемые при изучении
6
кинетики
химических
процессов
методом
времяпролетной
масс-
спектрометрии.
Экспериментальная установка представляет собой времяпролетный
масс-спектрометр с ортогональным вводом ионов (о-ВПМС). Ионы
аминокислот
и
полипептидов
электрораспылением.
В
получают
качестве
в
источнике
ионизации
молекулярно-ионного
реактора
используется сегментированный радиочастотный квадруполь (RFQ) (рис. 1),
находящийся во второй ступени дифференциальной откачки атмосферного
интерфейса о-ВПМС. Ионы попадают внутрь реактора из первой ступени
дифференциальной откачки атмосферного интерфейса о-ВПМС (рис. 1(1)).
Под действием эффективного потенциала радиочастотного поля (рис. 1(7)) и
соударений с молекулами газа ионы стягиваются к оси RFQ. Под действием
постоянного продольного электрического поля (рис. 1(6)) ионы двигаются с
постоянной дрейфовой скоростью в атмосфере буферного газа ко входу во
времяпролетный масс-анализатор. Основной составляющей буферного газа
является N2 газовой завесы источника ESI. Время нахождения ионов внутри
RFQ определяется формулой:
t = l κE ,
где
l=17
см
(1)
длина
квадруполя,
E
–
напряженность
продольного
электрического поля, κ – подвижность исследуемых ионов в электрическом
поле.
Измерение подвижности в электрическом поле ионов девяти
аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys), а также двух- и
однозарядных
энкефалина
ионов
и
грамицидина
двухзарядных
S,
ионов
однозарядных
полипептида
ионов
HR2
лейцин-
проводилось
непосредственно в процессе выполнения работы по методике, разработанной
ранее. В диссертации приводится описание этой методики и таблица с
полученными значениями ионных подвижностей.
7
Рис. 1. Схема молекулярноионного реактора: 1 –
протонированные ионы
полипептидов; 2 - баллон с
дейтерирующей смесью; 3 игольчатый вентиль для
подачи дейтерирующей смеси
в реактор; 4 - датчик
давления газа в реакторе; 5 –
радиочастотный квадруполь
(RFQ);
6 – принципиальная электрическая схема подачи постоянного электрического
поля на RFQ; 7 – принципиальная электрическая схема подачи радиочастотного
электрического поля на RFQ; 8 – орто-время-пролетный масс-спектрометр.
Для проведения реакций H/D-обмена внутрь RFQ через игольчатый
вентиль рис. 1(3) подавалась дейтерирующая смесь, представляющая собой
ND3, разбавленный в N2. Концентрация дейтерирующего агента в реакторе
рассчитывалась по формуле:
[ ND 3 ] = ϕ( p − p0 )n L ,
(2)
где ϕ - содержание ND3 в дейтерирующей смеси в долях; p- давление в
реакторе, бар; p0 - остаточное давление воздуха в реакторе в отсутствие
подачи дейтерирующей смеси, бар; nL- число Лошмидта ( n L = 2.44 × 1019 см-3
бар-1).
Все расчеты кинетики реакций в работе производили, пренебрегая
переносом ионов вдоль оси RFQ за счет продольной диффузии на основании
малости его вклада, что следует из выполнения неравенства:
4kD /(κE ) 2 < 0.1
(3)
где D – коэффициент диффузии, а k – эффективная константа реакции.
Неравенство (3) остаётся справедливым практически во всех случаях.
Глава 3. Модельное описание кинетики H/D-обмена в протонированных
ионах аминокислот и полипептидов. Выведено уравнение, связывающее
8
наблюдаемую
зависимость
интенсивностей
в
изотопного
масс-спектральных
распределения
линиях
относительных
исследуемого
иона
с
изменением содержания атомов дейтерия (D) в независимых реакционных
центрах. Предложена кинетическая модель обратимого протекания
реакций H/D-обмена и на её основе предложен метод расчета кинетических
параметров H/D-обмена. Оценена чувствительность этого метода.
Величина сдвига изотопного распределения в результате реакции
H/D-обмена может быть выражена через относительные интенсивности массспектральных пиков изотопного распределения иона в виде:
η (t ) = ∑ j ⋅ I j (t ) ,
(4)
j
где Ij – относительная интенсивность j-го пика. Иону, содержащему только
самые легкие изотопы в уравнении (4), присваивается порядковый номер j=0.
Здесь
и
далее
мы
будем
предполагать
равенство
относительных
интенсивностей пиков в масс-спектре их относительным концентрациям в
долях от суммарной концентрации наблюдаемых ионов-продуктов:
∑ I j (t ) = 1 .
j
Процесс H/D-обмена представляет собой сумму химических реакций,
приводящих к накоплению атомов D в независимых реакционных центрах
ионов биомолекул:
η(t ) = ∑ niH ni (t ) + δ ,
(5)
i
где niH - количество активных атомов в i-том независимом центре, ni(t) –
относительная концентрация атомов D в i-том центре в момент времени t,
параметр δ введен для учета природных изотопов, присутствующих в
исходных ионах (δ=η(0)). Каждая функция ni(t) является решением системы
дифференциальных
кинетических
уравнений,
описывающих
кинетику
изменения относительной концентрации атомов D в i-том центре по всем
возможным продуктам.
9
Для больших молекул белков в высоких зарядовых состояниях пики
отдельных ионов в изотопном распределении могут быть неразрешимы. В
этом случае предлагается метод вычисления величины сдвига изотопного
распределения с использованием следующего выражения:
M max / z
η (t ) =
∫ M ⋅ I (t , M / z )d (M / z )
M min / z
M max / z
∫ I (t , M / z )d (M / z )
− M min ,
(6)
M min / z
где I(M/z) – интенсивность масс-спектра в точке с абсциссой M/z, величина
Mmin соответствует молекулярной массе иона, содержащего только самые
легкие изотопы, а Mmax – самые тяжелые. В диссертационной работе
приводится доказательство справедливости уравнения (6).
Для численной обработки экспериментальных данных по кинетике
H/D-обмена в работе использовано аналитическое выражение, следующее из
рассмотрения реакции замещения каждого отдельного атома H на атом D, как
независимого процесса. Уравнение (5) с точки зрения предлагаемой модели
будет иметь вид:
αkiD [ ND3 ]
(1 − exp(− K iЭффt )) + δ ,
η(t ) = ∑
Эфф
Ki
i
(7)
K iЭфф = αkiD [ ND3 ] + (1 − α)kiH [ ND3 ] + kiФ [H] .
(8)
где
В уравнениях (7) и (8): α – относительное содержание D в ND3 (0<α<1); k iD ,
k iH
– константы скорости прямой и обратной реакций H/D-обмена,
происходящих
в
результате
взаимодействия
исследуемых
ионов
с
молекулами аммиака, для каждого i-того атома H. Для учета возможной
обратной реакции H/D-обмена, происходящей в результате взаимодействия с
водородсодержащими примесями в реакторе, в уравнении (8) присутствует
член kiФ [H] .
10
На основании уравнения (7) при анализе полученных в работе
зависимостей ηэксп(t), пример которых представлен на рис. 2, использовалось
выражение:
η мод (t ) = ∑ ai (1 − exp(− bi t )) + δ ,
(9),
i
ai =
где
α ⋅ k iD ⋅ [ ND 3 ]
Pi ,
K iЭфф
bi = K iЭфф
При этом величина Pi соответствует числу атомов H, обменивающихся с iтым набором одинаковых, с точки зрения достигаемой точности измерения,
констант скорости. Количество наборов кинетических параметров (ai,bi) в
модельном
выражении
экспериментальных
(9)
определялось
данных
выбранной
из
адекватности
зависимостью
в
описания
пределах
экспериментальных ошибок. Критерием такой адекватности является
соответствие величины минимального значения функционала при заданном
числе наборов (ai, bi):
⎛ ηnэксп − η мод (t n ) ⎞
⎟⎟ ,
F (ai , bi ) = ∑ ⎜⎜
σn
n =1 ⎝
⎠
2
N
(10)
числу точек на экспериментальной зависимости – N. В уравнении (10) σn
соответствует
измеренному
опытным
путем
среднеквадратичному
отклонению экспериментальных результатов от среднего значения величины
ηэксп(t) при заданном постоянном t.
1.8
1.2
η
p, мкбар
36.6
29.2
24.8
21.9
20.1
19.1
0.6
0.0
0
2
4
6
8
t, мс
11
Рис. 2. Зависимости η(t) для
протонированных ионов
гистидина, полученные при
разных давлениях
дейтерирующей смеси в
реакторе.
Оценка чувствительности выбранной методики при разрешении
скоростей
протекания
H/D-обмена
на разных
реакционных центрах
показывает, что порог такого разрешения при величинах σn, достигаемых в
нашей работе, соответствует константам скорости химической реакции,
которые различаются примерно в четыре раза.
Глава 4. Экспериментальные результаты и их обсуждение. Приведены
экспериментальные
данные
по
исследованию
кинетики
химических
процессов, протекающих при взаимодействии ионов девяти аминокислот
(Ala, Asp, Arg, Glu, His, Ile, Lys, Pro, Tyr) и трех полипептидов (лейцинэнкефалин, грамицидин S, пептид HR2) с молекулами ND3. Предложена
схема образования стабильных ион-молекулярных комплексов ионов семи
аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr, Pro, His) с молекулами дейтероаммиака,
наблюдаемых в полученных масс-спектрах. На основании предложенной
схемы
выведены
выражения
для
аппроксимации
экспериментальных
зависимостей относительной интенсивности масс-спектральных пиков
комплексов от времени контакта. С использованием полученных выражений
определены константы скорости реакций комплексообразования для пяти
аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr). Приведены результаты обработки
масс-спектральных линий с помощью методики, описанной выше, с целью
получения величин констант скорости H/D-обмена, специфичных для
индивидуальных активных атомов.
4.1 Кинетика образования нековалентносвязанных комплексов ионов
аминокислот с ND3
Помимо продуктов H/D-обмена протонированных ионов аминокислот
и полипептидов в экспериментально полученных масс-спектрах наблюдались
пики, соответствующие по M/z устойчивым ион-молекулярным комплексам
протонированных аминокислот с ND3 (рис. 3).
12
3.0
8
8
Количество ионов, тыс.
D2
6
2
0
D3
D4
1.5
0.0
156.0
D4
D1
4
6
D3
D5
D0
D2
3
157.0
D1
2
134 136 138 140
156.5
1
D0
+
4
AspH
0
152
156
160
2
+
[AspH•ND3]
0
130
135
140
145
M/z
150
155
160
Рис. 3. Интенсивности дейтерированных ионов (Asp+H+) и стабилизированных
нековалентносвязанных комплексов этих ионов с молекулами ND3 (пики
продуктов со степенью дейтерирования i и соответствующие им комплексы
обозначены на рисунке символами Di). Масс-спектр, представленный в качестве
примера, получен при проведении исследования H/D-обмена в ионах (Asp+H+),
концентрация ND3 [ ND3 ] = 2.2 × 1012 см-3, время реакции t = 8.3 мс.
Была предложена схема процессов, приводящих к появлению массспектральных линий комплексных ионов аминокислот с дейтероаммиаком:
k+
A + + NH3 ⎯⎯
⎯→ A ⋅ NH3+*
k−
A ⋅ NH3+* ⎯⎯
⎯→ A + + NH3
kS
A ⋅ NH3+* + M ⎯⎯→
⎯ A ⋅ NH3+ + M *
kΓ
A ⋅ NH3+ + M * ⎯⎯→
⎯ A ⋅ NH3+* + M
(11)
В представленной схеме A+ - это ион аминокислоты, A·NH3+ - комплексный
ион. В качестве M, как предполагалось первоначально, выступают степени
свободы молекул буферного газа, с которыми происходят процессы обмена
энергией, приводящие к стабилизации или возбуждению комплексных ионов.
Из решения системы дифференциальных уравнений, соответствующих
механизму
химических
реакций
(схема
13
(11))
получено
выражение,
описывающее динамику изменения относительных интенсивностей массспектральных
линий
стабильных
комплексов,
исходя
из
условия
квазиравновесности для концентрации возбужденных комплексов:
I A⋅NH (t ) =
3
+
⎛ k k [ NH 3 ] + k − kΓ
⎞⎞
k S k + [ NH 3 ] ⎛
⎜1 − exp⎜⎜ − S +
⎟⎟ ⎟⎟ .
[
M
]
t
k S k + [ NH 3 ] + k − kΓ ⎜⎝
k
k
[
M
]
+
−
S
⎝
⎠⎠
0.8
IA⋅ΝΗ
3
0.6
0.4
p, мкбар
38.5
32.6
25.3
0.2
0.0
0
2
4
t, мс
6
8
(12)
Рис. 4. Зависимости
относительной интенсивности
нековалентносвязанных
комплексов протонированных
ионов Asp с ND3 ( I A⋅NH ) от
3
времени реакции, полученные
при разных давлениях.
Из аппроксимации наблюдаемых временных зависимостей относительной
интенсивности масс-спектральных линий комплексов (рис. 4) выражением
(12) найдены значения параметра
K eff =
k S k + [ M ][ NH 3 ]
k− + kS [M ]
(13)
для ионов пяти аминокислот: Ala, Asp, Glu, Ile и Tyr при нескольких
давлениях. Зависимости Keff для Asp, Glu и Ile оказались линейными по
давлению (рис. 5). Для остальных ионов аминокислот соответствующие
комплексы получались в очень малых количествах, и данных, на основании
которых можно было бы сделать определенные утверждения о характере
таких зависимостей, недостаточно. Исходя из наблюдающихся зависимостей
Keff от p, имеющих линейный характер, предложен механизм комплексообразования, при котором в качестве третьего тела - M (схема(11)) участвуют
внутренние степени свободы самих комплексов. Предположение о механизме
внутренней
диссипации
избыточной
энергии
в
ион-молекулярных
комплексах сделано на основании того, что в противном случае зависимости
Keff должны быть квадратичны по давлению.
14
Все полученные экспериментальные зависимости Keff от давления
были аппроксимированы выражениями линейной регрессии, и с учетом
уравнения
(2)
были
рассчитаны
величины
эффективных
констант
комплексообразования для ионов аминокислот Asp, Ala, Glu, Ile и Tyr – KC.
Полученные величины сведены в табл. 1.
300
eff
K ,с
-1
Asp
Glu
Ile
200
Рис. 5. Зависимости Keff от
давления в реакторе,
полученные для ионов
аминокислот Asp, Ile и Glu.
100
0
18
24
30
p, мкбар
36
42
Таблица 1. Эффективные константы
протонированных аминокислот с ND3.
Аминокислота
Asp
Ala
Glu
Ile
Tyr
скорости
комплексообразования
KC×1011, см3с-1
14.5±0.2
2.0±0.3
4.1±0.2
8.6±0.2
9.1±0.8
4.2 Кинетика H/D-обмена в ионах аминокислот
Полученные
протонированных
зависимости
ионов
η(t)
аминокислот
для
в
всех
пределах
исследованных
погрешностей
экспериментальных измерений удовлетворительно описываются уравнением:
η мод (t ) = a(1 − exp(− bt )) + δ .
(14)
Правильность такого описания подтверждается соответствием величины
минимального значения функционала (10) числу экспериментальных точек
для всех исследованных аминокислот.
Кривые η(t) для всех аминокислот были аппроксимированы модельной зависимостью (14). Исходя из величин параметров a и b (уравнение (14)),
15
полученных при разных давлениях дейтерирующей смеси, и с учетом
величины максимально наблюдаемой степени H/D-обмена – P, для всех
аминокислот были рассчитаны величины констант KD (уравнение (9)):
K D = αk D ,
где kD – константа скорости H/D-обмена в ионе аминокислоты, усредненная
по всем активным атомам водорода, принимающим участие в наблюдаемом
процессе. Рассчитанные значения KD представлены в табл. 2. Полученные
величины близки к величинам центроспецифичных констант скорости H/Dобмена, которые приводятся другими авторами.
Таблица 2. Эффективные константы скорости H/D-обмена и энергии сродства к
протону исследованных аминокислот.
KD×1010,
PA,
Аминокислота
P
см3 с-1
ккал моль-1
4
215.5
2.35±0.05
Ala
5
217.2
3.0±0.5
Asp
5
218.2
1.6±0.2
Glu
4
219.3
4.0±0.1
Ile
3
220.0
1.7±0.3
Pro
4
221.3
3.0±0.3
Tyr
4
236.1
2.9±0.2
His
5
238.0
0.8±0.1
Lys
2
251.2
0.7±0.1
Arg
В некоторых работах указывается на возможность корреляции скорости H/D-обмена с разностью в энергиях сродства к протону между Дейтерирующим агентом и ионом аминокислоты. В связи с этим значения констант скорости KD (табл. 2) были отложены от соответствующих величин разностей в энергиях сродства к протону, ΔPA, между аммиаком ( PAND =204
3
ккал моль-1) и ионом аминокислоты (табл. 2). Результат представлен на рис.
6.
16
Ala
Asp
Glu
Ile
Pro
Tyr
His
Lys
Arg
3
K ×10 , см с
-1
4.5
D
10
3.0
1.5
0.0
10
20
30
Рис. 6. Значения KD, отложенные от соответствующих
значений ΔPA для протонированных аминокислот.
40
-1
ΔPA, ккал моль
Как видно из рис. 6, аминокислоты Lys и Arg, обладающие самыми
большими
величинами
ΔPA,
имеют
наименьшие
значения
KD.
В
аминокислоте His скорость H/D-обмена сильно превышает величину,
ожидаемую на основании величины ее энергии сродства к протону. Повидимому, высокая скорость реакции H/D-обмена в ионе His объясняется
тем, что реакция протекает через мостиковый водородносвязанный комплекс,
образованный молекулой ND3 между атомами азота амино- и имидазольной
функциональных групп (рис. 7).
D
H2
N
O
CH C OH
CH2
D2N
D
H2
N
CH2
D2N
H
H N
O
CH C OH
N
Рис. 7. Реакция H/D-обмена в
мостиковом комплексе,
образованном ионом His с
молекулой ND3.
NH
NH
4.3 Кинетика H/D-обмена в ионах полипептидов
При
численной
обработке
экспериментальных
результатов
исследования кинетики H/D-обмена в ионах полипептидов возникают
неопределённости в установлении максимальной степени дейтерирования,
характерной для данного иона полипептида вследствие более сложного
характера изотопных распределений этих ионов, чем у протонированных
аминокислот. Поэтому точные числа активных атомов H (обозначение Pi в
уравнении (9)), участвующих в реакции H/D-обмена в ионах полипептидов,
17
не определялись. Таким образом, полученные для протонированных
полипептидов константы скорости реакции имеют физический смысл
суммарной
скорости
H/D-обмена
активных
атомов
i-той
группы,
обменивающихся с неразличимым с точки зрения погрешности измерений
скоростями, при единичной концентрации ND3.
Из уравнения (9) следует связь между определяемым из эксперимента
произведением ai bi и кинетическими параметрами реакции H/D-обмена:
ai bi = αkiD [ ND3 ]Pi .
(15)
Выражение, стоящее справа от знака равенства, имеет смысл скорости
обмена i-той группы атомов H при заданной постоянной концентрации
молекул ND3. Исходя из линейной зависимости этого выражения от
концентрации ND3, было найдено значение константы скорости реакции
H/D-обмена i-той группы активных атомов H: K i = αkiD Pi
Далее
величину
Ki
использовали
в
качестве
сравнительной
характеристики реакционной активности независимых центров протекания
H/D-обмена в ионах полипептидов. Значения Ki, полученные в работе для
всех исследованных форм ионов полипептидов, сведены в табл. 3.
Таблица 3. Константы скорости H/D-обмена в реакционных центрах ионов
полипептидов
Заряд иона в
элементарных
K2×1011, см3с-1
Полипептид
K1×1010, см3с-1
единицах
+2
1.7±0.1
1.6±0.2
Грамицидин S
+1
--0.016±0.001
Лейцин+1
1.5±0.1
~0.01
Энкефалин
Пептид HR2
+2
--1.4±0.1
В двухзарядном ионе грамицидина S ([GS+2H]+2) обнаружено два
вида активных атомов H, различающихся по скорости протекания для них
реакции H/D-обмена. Из сравнения масштаба H/D-обмена в каждой из двух
групп кинетически эквивалентных атомов H в [GS+2H]+2 видно, что
18
концентрация атомов, участвующих в реакции с меньшей скоростью, выше
(рис. 8).
Y(t)=a2(1-exp(-b2t))
a)
1.2
Y
Y(t)=a1(1-exp(-b1t))
0.6
0.0
0
4
t, мс
8
b)
Рис. 8. Оценка
относительного содержания
атомов H, H/D-обмен
которых описывается
кинетическими параметрами:
a) (a1,b1) и b) (a2,b2) в ионах
[GS+2H]+2
12
В однозарядном ионе грамицидина S ([GS+H]+) наблюдается более
медленная скорость реакции H/D-обмена по сравнению с [GS+2H]+2 (табл. 3).
По-видимому, это свидетельствует о том, что в результате кулоновских сил,
возникающих между двумя положительными зарядами, иону [GS+2H]+2
соответствует более развёрнутая форма, что приводит к увеличению
интенсивности H/D-обмена. В [GS+H]+ такое взаимодействие отсутствует.
Заряд иона при этом сильнее стабилизирован за счет формирования
водородных связей, вследствие чего доступ молекул ND3 к подвижным
атомам H затруднен.
Рис. 9. Зависимости η(t)
полученные для [LeuEnk+H]+ при
максимальных давлениях
дейтерирующей смеси
2.4
η
p, мкбар
35.0
39.7
2.1
1.8
1
t, мс
10
В ионе лейцин-энкефалина ([Leu-Enk+H]+) также обнаружено две
группы атомов H, участвующих в реакции H/D-обмена с разными
скоростями. Так как константы скорости реакции в этих группах
19
различаются на три порядка величины, то на зависимости η(t), построенной
от lnt (рис. 9), отчётливо возникают дополнительные точки перегиба.
В ионе полипептида HR2 групп активных атомов H, участвующих в
реакции H/D-обмена с разными скоростями, выделено не было (табл. 3).
Выводы
1. Разработана методика численной обработки масс-спектров протонированных
аминокислот и полипептидов, получаемых в ходе их взаимодействия с
дейтерирующим агентом. Методика применена для получения информации о
кинетике
реакций
H/D-обмена
в
независимых
реакционных
центрах
молекулярных ионов девяти аминокислот и трех полипептидов. Учтено
естественное изотопное распределение и реакция обратного обмена.
2. Определены ионные подвижности в электрическом поле ионов девяти
аминокислот (Asp, Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys), а также одно- и
двухзарядных ионов грамицидина S, однозарядного иона лейцин-энкефалина и
двухзарядного иона полипептида HR2.
3. С
использованием
радиочастотного
квадруполя
с
продольным
электрическим полем в качестве химического реактора и орто-ВПМС в качестве
детектора исследованы процессы комплексообразования протонированных
аминокислот с молекулами ND3, протекающие параллельно процессам H/Dобмена. Для семи ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr, Pro, His)
установлено образование ион-молекулярных комплексов с молекулами ND3.
Для пяти ионов аминокислот (Asp, Ala, Glu, Ile, Tyr) определены константы
скорости
комплексообразования.
комплексообразования
от
На
давления
основании
предложен
зависимости
механизм
кинетики
стабилизации
комплексов через диссипацию избыточной энергии на внутренние степени
свободы самого комплекса
4. Исследована кинетика реакций H/D-обмена ионов девяти аминокислот (Asp,
Ala, Arg, Glu, His, Ile, Pro, Tyr, Lys). Определены эффективные константы
скорости H/D-обмена, величины которых находятся в диапазоне от 7×10-11 (для
20
Arg) до 4×10-10 см3с-1 (для Ile). Проанализирована связь констант скорости H/Dобмена с разностями в энергиях сродства к протону реагентов.
5. Исследована
кинетика
реакций
H/D-обмена
в
газовой
фазе
ионов
полипептидов GS, Leu-Enk и HR2 и определены эффективные константы
скорости, соответствующие групповому обмену кинетически эквивалентных
активных атомов H. Установлено, что в [GS+2H]+2 присутствует два вида
активных атомов H, различающихся по реакционной способности на порядок.
Установлено, что в [Leu-Enk+H]+ присутствует также два вида активных атомов
H, различающихся по реакционной способности на три порядка. Для иона
[HR2+2H]+2 различающихся констант скорости не выявлено.
Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:
Статьи в реферируемых научных журналах:
1. Чудинов А.В., Сулименков И.В., Козловский В.И., Брусов В.С., Пихтелев
А.Р.,
Зеленов
В.В.,
«Исследование
кинетики
реакций
газофазного
дейтероводородного обмена протонированных молекул аминокислот с ND3 с
использованием радиочастотного газонаполненного квадруполя в качестве
молекулярно-ионного реактора», Масс-спектрометрия 4, 2007, 19-30.
2. Чудинов А.В., Зеленов В.В., Козловский В.И., Сулименков И.В.,
«Исследование мест протонирования в газофазных ионах полипептидов
методом H/D-обмена с использованием радиочастотного сегментированного
квадруполя в качестве молекулярно-ионного реактора», Масс-спектрометрия
4, 2007, 131-138.
Тезисы докладов:
1. Kozlovski V.I., Soulimenkov I.V., Brusov V.S., Pikhtelev A.R., Chudinov
A.V., Dodonov A.F., “Study of biomolecule ion/reagent gas molecule reactions in
the segmented RFQ interfaced to the O-TOF MS”, Scientific Program and
Abstracts of the 10th International Conference “Desorption-2004”, Saint-Petersburg
(Russia), 2004, P.125.
21
2. Чудинов А.В., Козловский В.И., Сулименков И.В., Брусов В.С., Додонов
А.Ф., “Реакции дейтероводородного обмена в ионах аминокислот при
взаимодействии
с
молекулами
дейтероаммиака”,
Материалы
2го
международного семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической
физике, биофизике и экологии», Звенигород (Россия), 2004, С.251-252.
3. Chudinov A.V., Soulimenkov I.V., Kozlovski V.I., Pikhtelev A.R., Brusov
V.S., Dodonov A.F., “Probing a Protonation Sites in Peptides and Amino Acids by
H/D Exchange Reaction in RFQ Ion Guide of O-TOF MS”, Proceedings of the 53rd
ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Antonio (USA),
2005.
4. Чудинов А.В., Козловский В.И., Сулименков И.В., “Исследование
газофазных ион-молекулярных реакций H/D обмена электроспрейных ионов
пептидов с ND3 с помощью O-TOF MS с сегментированным радиочастотным
квадруполем”, Материалы всероссийской конференции с международным
участием “Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы”, Москва
(Россия), 2005.
5. Чудинов А.В., Зеленов В.В., Козловский В.И., «Исследование газофазного
дейтероводородного обмена с участием ионов аминокислот и пептидов, как
метод анализа структуры биомолекул», Программа и сборник трудов
конференции «Научные школы Черноголовки - молодежи», Черноголовка
(Россия), 2006. С. 80-81.
6. Чудинов А.В., Сулименков И.В., Козловский В.И., Пихтелев А.Р., Зеленов
В.В.,
«Исследование
протонированных
кинетики
пептидов
с
реакций
молекулами
газофазного
ND3
с
H/D-обмена
использованием
радиочастотного газонаполненного квадруполя в качестве молекулярноионного реактора», Материалы 3-ей международной Конференции-школы
«Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии»,
Звенигород (Россия), 2007, С. 162-163.
22