Ознакомиться с диссертацией
advertisement
ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК На правах рукописи НОДЕЛЬМАН ЕКАТЕРИНА КОНСТАНТИНОВНА Применение гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы для защиты хлоропластов растений томата и табака от окислительного стресса Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор П.Н. Харченко Москва – 2013 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................. 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .............................................................................. 9 1.1 Негативное влияние абиотических стрессовых факторов на культурные растения ..................................................................................................................... 9 1.1.1 Неблагоприятное действие засоления и солевого стресса.......................... 9 1.1.2 Неблагоприятное действие окислительного стресса и активных форм кислорода.............................................................................................................. 12 1.2 Получение растений устойчивых к неблагоприятным абиотическим факторам среды ....................................................................................................... 15 1.2.1 Применение генов, кодирующих ферменты синтеза осмопротекторов .. 16 1.2.2 Применение генов, кодирующие LEA белки и пептиды (late embryogenesis abundant protein genes), синтезирующиеся на поздних стадиях эмбриогенеза ........................................................................................................ 20 1.2.3 Применение генов, кодирующих сигнальные и регуляторные молекулы (белки, пептиды, РНК) ......................................................................................... 21 1.2.4 Применение генов, кодирующих ферменты, влияющие на количество, транспорт и восприятие рецепторами растительных гормонов ........................ 22 1.2.5 Применение генов участвующих в нейтрализации окислительного стресса .................................................................................................................. 23 1.2.6 Применение генов, кодирующих, симпортеры, антипортеры, протонные помпы и транспортеры ионов.............................................................................. 25 1.2.7 Применение генов, кодирующих молекулярные шапероны .................... 26 1.3 Роль супероксиддисмутазы в регуляции активных форм кислорода............. 27 1.3.1 Структура, локализация и функции супероксиддисмутазы..................... 27 1.3.2 Активность супероксиддисмутазы в условиях действия неблагоприятных факторов. .............................................................................................................. 28 1.4 Технология получение трансгенных растений семейства Solanaceae (табака и томата) ..................................................................................................................... 29 3 1.4.1 Использование метода биолистической трансформации.......................... 30 1.4.2 Использование метода электропорации..................................................... 31 1.4.3 Использование метода микроинъекции ДНК ............................................ 32 1.4.4 Использование метода агробактериальной трансформации..................... 33 1.5 Стратегии повышения устойчивости томата к воздействию абиотических стрессов ................................................................................................................... 37 1.6. Заключение по обзору литературы ................................................................. 41 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................... 42 2.1 Растительный материал .................................................................................... 42 2.2 Введение томата и табака в культуру in vitro .................................................. 42 2.3 Конструкция для агробактериальной трансформации растений .................... 43 2.4 Агробактериальная трансформация ................................................................. 45 2.5 Анализ наследования селективного гена NPT II в первом трансгенном поколении табака и томата ..................................................................................... 47 2.6 Молекулярно – генетический анализ трансформантов ................................... 47 2.6.1 Экстракция бактериальной и плазмидной ДНК ........................................ 47 2.6.2 Экстракция тотальной геномной ДНК растений ....................................... 48 2.6.3 Полимеразная цепная реакция.................................................................... 48 2.6.4 Выделение РНК и обратная транскрипция ................................................ 49 2.6.5 Электрофорез продуктов амплификации ................................................... 50 2.7 Измерение активности антиокислительных ферментов ................................. 50 2.7.1 Получение грубых гомогенатов и ферментативных экстрактов .............. 50 2.7.2 Определение активности ферментов.......................................................... 51 2.7.3 Анализ кислородного газообмена и переменной флуоресценции .......... 52 2.8 Электронная микроскопия ................................................................................ 52 2.9 Цитофотометрический анализ .......................................................................... 54 4 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................... 56 3.1 Агробактериальная трансформация и отбор генетически модифицированных растений ................................................................................................................... 56 3.1.1 Изучение регенерационного потенциала томата сортов Белый ............... 56 налив 241 и Взрыв ................................................................................................ 56 3.1.2 Первичная оценка трансформантов ........................................................... 59 3.1.3 Молекулярно-генетический анализ канамицин – устойчивых побегов томата и табака ..................................................................................................... 61 3.1.4 Оценка эффективности агробактериальной трансформации.................... 63 3.1.5 Анализ экспрессии целевого гена Fe-SOD1 методом ОТ-ПЦР ................ 66 3.1.6 Адаптация и выращивание в условиях защищенного грунта трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген Fe-SOD1. Анализ семенного поколения ............................................................................................................. 67 3.1.7 Анализ экспрессии гена Fe-SOD1 в первом семенном поколении T1 .... 71 3.2 Влияние экспрессии гена Fe-SOD на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений табака и томата .................................. 73 3.2.1 Анализ активности ферментов трансгенных растений ............................. 74 3.2.2 Оценка митотической активности клеток трансгенных растений ........... 76 3.2.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях. ............................................................. 79 3.3 Влияние экспрессии гена Fe-SOD1 на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений томата в условиях стресса ................ 86 3.3.1 Исследование активности фотосинтетического аппарата ........................ 86 3.3.2 Оценка цитофотометрических показателей трансгенных растений при солевом стрессе .................................................................................................... 87 3.3.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях при воздействии солей ....................... 91 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .......................................................................................................... 99 ВЫВОДЫ ................................................................................................................. 103 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ...................................................................................... 104 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................... 105 6 ВВЕДЕНИЕ В естественных условиях произрастания растения часто оказываются под действием стрессов вызываемых засухой, засолением, избыточной освещенностью, высокими или низкими температурами и другими абиотическими факторами. Все абиотические воздействия сопровождаются образованием активных форм кислорода (АФК), токсичных для растительных клеток. Для нейтрализации АФК растения выработали целый ряд защитных механизмов. К ним относятся возрастание активности ферментов таких, как супероксиддисмутаза (EC 1.15.1.1, СОД), аскорбатпероксидаза (EC 1.11.1.11, АсП), глутатионредуктаза (EC 1.6.4.2, ГР) и другие, а также синтез низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбат, глутатион, каротиноиды и антоцианины) [114]. Внедрение генов, кодирующих синтез антиокислительных ферментов, - перспективный способ получения растений, обладающих толерантностью ко многим стрессам [99, 114]. В различных исследованиях было продемонстрировано, что повышенной устойчивостью к окислительному стрессу обладают растения-трансформанты супероксиддисмутазы, с суперэкспрессией аскорбатпероксидазы, единичных генов глутатион-S-трансферазы, глутатионредуктазы и др. В то же время, остается мало изученным действие окислительного стресса на основные структурно-функциональных системы индивидуальных клеток. Настоящая работа направлена на решение одной из актуальных проблем современной биотехнологии – изучение клеточных механизмов, обеспечивающих защиту растений от действия оксидативного стресса. Первичный ответ на действие АФК к клетке является синтез супероксиддисмутаз (СОД) (Fe-СОД, Mn-СОД и Cu/Zn-СОД), основная функция которых заключается в ферментативном превращении супероксида (О2-) и воды перекись водорода (H2O2), нейтрализуемый затем другими ферментами, в частности, аскарбатпероксидазой. Хлоропласты наиболее подвержены риску токсических повреждений, вызываемых АФК, так как молекулярный кислород в 7 процессе фотовосстановления, происходящего в фотосистеме I, получает дополнительный электрон и превращается в супероксид (О2-). В геноме арабидопсиса содержится 7 генов, кодирующих различные виды и изоформы СОД. Установлено, что FeSOD2 и FeSOD3 локализуются в хлоропластах. Показано, что они формируют гетеромерный белковый комплекс с нуклеоидом хлоропластов. Локализация FeSOD1, установленная путем трансляционного слияния с GFP белком, свидетельствует о его наличии в цитоплазме и ядре, причем установлено, что экспрессия FeSOD1 в антисенс-ориентации не приводит к нарушению структуры пластид, в отличие от аналогичных экспериментов с FeSOD2 и FeSOD3 [167]. В настоящее время остаются малоизученными многие аспекты, связанные с особенностями влияния локализации продуктов экспрессии введенных генов, а также с влиянием внедренных генов на структурную организацию клеточных компартментов. Исходя из роли супероксиддисмутаз в антиокислительной защите структурной организации пластид, принципиальное значение имеет вопрос - может ли экспрессия цитоплазматической FeSOD приводить к изменениям структуры компартментов клетки при перенаправлении ее в хлоропласт. Цель работы - изучить влияние экспрессии гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы с сигнальной последовательностью Rbsc на структурную организацию хлоропластов трансгенных растений табака и томата при действии окислительного стресса. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1. Получить трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген Fe- SOD1, кодирующий цитоплазматическую Fe-зависимую супероксиддисмутазу из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с сигнальной последовательстью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.) для локализации продукта в хлоропластах; 2. Измерить активность супероксиддисмутазы у трансгенных растений томата и табака, с экспрессией гена Fe-SOD1; 8 3. Изучить влияние экспрессии гена Fe-SOD1 у трансгенных растений томата и табака на пролиферативную активность клеток меристемы корня; 4. Изучить влияние экспрессии гена Fe-SOD1 у трансгенных растений томата и табака при таргетинге продукта в пластиды на структурно-функциональную организацию клеток фотосинтезирующих тканей; 5. Изучить влияние экспрессии гена Fe-SOD1 на физиологические и структурные характеристики трансгенных растений томата при воздействии абиотических факторов (засоление, УФ-радиация), генерирующих образование в клетке АФК. 9 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Негативное влияние абиотических стрессовых факторов на культурные растения Растения часто подвергаются влиянию неблагоприятных факторов окружающей среды - стрессоров. Стрессоры делятся на абиотические и биотические. К биотическим стрессорам относят воздействие патогенов – бактерий, вирусов, растительноядных насекомых. Абиотическими стрессорами являются засоление почв, водный дефицит, экстремальные температуры, ультрафиолетовая радиация, гипоксия и ряд других [1]. В первую очередь стрессоры угнетают развитие и рост растения, снижают продуктивность. Было выявлено, что урожайность культурных растений обычно составляет всего 20% от максимально возможного уровня [43]. Предполагаемые потери урожая от абиотических стрессов сотавляют: 17 % из-за засухи, 20% за счет засоления почв, 40% из-за повышенных температур, 15% из-за низких температур и 8% за счет других неблагоприятных факторов среды [28,199]. Засоление, затопление, воздействие экстремальных температур, засуха, токсические концентрации тяжелых металлов, высокая кислотность или щелочность почв снижают продуктивность сельскохозяйственных растений в два раза и более [43, 45], а при высокой интенсивности и достаточно долгой продолжительности стресса приводят к их гибели. В соответствии с данными FAO (ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства) около 22% пахотных земель являются засоленными [78]. 1.1.1 Неблагоприятное действие засоления и солевого стресса Причиной ингибирования роста большинства видов культурных растений и ограничения их урожайности является избыток солей в почвенном растворе [43, 108]. Засоление почвы связано с избыточным количеством натрия, кальция, магния, хлоридов, сульфатов и карбонатов. Если содержание солей более чем 0,20,25%, почва считается засоленной. Прогнозируют, что в связи с засолением через 10 25 лет 30 % земель станут непригодными для использования в сельском хозяйстве. Существует несколько причин почвенного засоления. Ранее наиболее распростаненной причиной засоления являлось наличие естественного высокого уровня минеральных солей в почве, реже причиной засоления являлись периодические затопления ряда районов морской или соленой водой. В последние годы основной причиной увеличения количества непригодных или слабо пригодных для сельского хозяйства засоленных земель все чаще становится деятельность человека. Это происходит по причине неконтролируемого использования водных ресурсов, неправильной мелиорации, что вызывает так называемое вторичное засоление [27, 81]. Кроме того, в последнее время ряд авторов утверждает, что дополнительно на эти процессы влияет изменение климата, в результате действия человека, что приводит не только к засолению, но и к опустыниванию огромных районов некогда плодородных территорий [45]. Засоление почвы характерно для большинства регионов, где испарение превышает количество выпадающих осадков. Многие умеренно или сильно солеустойчивые растения могут нормально существовать на соленых почвах. Подобные виды используют различные способы нейтрализации или избежания ионной токсичности и могут поддерживать поглощение воды, поддержание тургора и транспирацию в присутствии высоких концентраций солей [34]. Некоторым видам удается использовать локализацию ионов в специальных компартментах или клетках (специфические вакуоли и солевые железки), препятствовать поглощению токсичных ионов с помощью белковых комплексах на мембранах блокирующих их проникновение, ряду растений также удается избежать других негативных воздействий, вызванных засолением, используя формирование АФК. Чувствительность растений к засолению меняется в зависимости от вида, генотипа и стадии роста [92]. Обычно, засоление почвы связывают с накоплением различных солей натрия. Таким образом, засоление часто именуют хлоридным, сульфатным, содовым или смешанным в зависимости от преимущественного вида солей натрия 11 в почвенном растворе [103]. В ряде случаев в реальных условиях в разных горизонтах почвы на одном участке могут присутствовать существенно отличающиеся по составу комбинации ионов. При засолении почв это проявляется как токсическое влияние высоких концентраций солей и вызывает изменения в водном балансе растения, существенно влияя на транспирацию, тургор и транспорт воды. Наиболее изученной является реакция на хлоридное засоление. При засолении - ионы Na+ и Cl– оказывают влияние не только на водные оболочки взаимодействиям молекул, между но также аминокислотами препятствуют белков. нековалентным Это приводит к конформационным изменениям и потере функций белков. Высокая концентрация натрия в засоленой почве препятствует накоплению других катионов. Условия засоления могут также вызвать дефицит калия [40]. Засоление оказывает влияние на рост растений, вызывая нарушения, приводящие к дефициту минеральных веществ и токсичность ионнов, может приводить к нарушению физиологических и биохимических процессов метаболизма [164]. В условиях засоления у большинства гликофитов понижается содержание хлорофиллов [86]. Одним из объяснений понижения количества хлорофилла в клетке в условиях засоления может быть активация протеолитических ферментов, ответственных за деградацию хлорофилла [213] Солевой стресс оказывает влияние на содержание каротиноидов, а также на эффективность фиксации углерода, за счет активности рибулозо 1,5- бифосфат карбоксилазы/оксигеназы [68]. Высокие концентрации солей вызывают повреждение мембранных структур и целостность ряда компартментов. Повреждения проявляются в росте проницаемости мембран и утрате способности к избирательному накоплению отдельных ионов и молекул, с током воды, необходимым для поддержания тургора посредством транспирации в клетки поступают ионы соли, что может приводить к сильному повреждению и даже гибели клеток. Не менее чувствительны к высоким концентрациям солей процессы фосфорилирования и карбоксилирования. В результате присутствие в почве повышенных 12 концентраций ионов Na+ и (или) Сl- ингибирует процесс фотосинтез [268]. Нарушается структурная организация пластид, а в результате нарушения процессов дыхания и митохондрий [74]. Таким образом, формирование устойчивости к засолению обуславливает необходимость адаптации сразу к трем независимым факторам: увеличению осмотического давления, токсическому действию ионов и окислительному стрессу [3]. Ионная токсичность, осмотический стресс, и дефицит поступления питательных веществ при действии солей может вызывать окислительный стресс [275]. В результате осмотического стресса меняется транспорт ионов в клетке растения и, как следствие, нарушается гомеостаз [183]. Различные виды абиотических стрессов, таких как засоление, засуха, экстимальные температуры часто сопровождаются окислительным стрессом, в ходе которого образуются АФК, способные повреждать различные биополимеры клетки [36]. Соответственно различные виды стрессов могут формировать сходные сигнальные пути [276]. Что позволяет клеткам растений даже при отсутствии специфического восприятия сигнала использовать одинаковые клеточные ответы на воздействие нехарактерных для данного вида стрессоров. 1.1.2 Неблагоприятное действие окислительного стресса и активных форм кислорода Одной из важнейших причин повреждений от различных видов стресса является образование АФК [234]. АФК обычно образуются при нормальных метаболических процессах в растении. К АФК относят перекись водорода (H2O2), анион-радикал (O2•– ), гидроксильный радикал (HO•), гидроперекисный радикал (HO2•), синглетный кислород (O2) и озон(O3) [1]. Хлоропласты, митохондрии и пероксисомы – наиболее важные внутриклеточные генераторы АФК, таких, как супероксидный радикал (O2•– ) и перекись водорода (H2O2). Окислительный стресс является результатом дисбаланса между производством и удалением АФК. В стрессовых условиях, таких как засоление, засуха, экстремальные температуры, растения производят и накапливают АФК [114, 174]. 13 АФК представляют собой серьезную угрозу для организмов, живущих в аэробной среде, в связи с поломками ДНК [44], перекисным окислением липидов мембраны [154], инактивацией ферментов [85], и ингибированием клеточного цикла [200]. Фотосинтетическая электрон - транспортная система является основным источником АФК в растительных тканях [25]. АФК образуются в реакциях восстановления кислорода в результате окисления различных субстратов, а так же в фотоиндуцируемых реакциях [115]. В хлоропластах O2•– и H2O2 в основном производятся акцептором электронов фотосистемы I, в то время как синглетный кислород образуется путем передачи электрона от возбужденной молекулы хлорофилла до молекулярного кислорода [107]. АФК также выявлены в митохондриальной электрон-транспортной цепи [105] и при воздействии солевого стресса (NaCl) было показано, что АФК могут привести к повреждению митохондриального транспорта электронов в Zea mays [100]. Митохондрии очень чувствительны к окислительному стрессу, о чем свидетельствует перекисное окисление липидов, белков и мутации митохондриальной ДНК [140]. Результаты Prasad с соавторами демонстрируют митохондрии в условиях окислительного стресса во время охлаждения в проростках кукурузы. Показано, что охлаждение ухудшает дыхательную активность, цитохромный путь транспорта электронов и АТФ-азную активность [195]. В соответствии с установленным механизмом образования АФК окислительный стресс был обнаружен в нескольких видах растений после воздействия NaCl. Важная роль свободных радикалов O2•– и H2O2 в повреждениях растения хлоридом натрия была обнаружена в растениях Vigna catjand, Vigna unguiculata и Oryza sativa [232, 106]. АФК обладают высокой реакционной способностью, и, в отсутствие защитного механизма растений, могут вызвать серьезные повреждения различных клеточных структур и их функций. Супероксидный радикал, например, формирует гидроксильные радикалы в реакции Фентона. Гидроксильный радикал – это высокотоксичный свободный 14 радикал, способный инициировать окисление липидов, разрушение ДНК, белков [24]. Последние данные свидетельствуют, что АФК являются необходимыми сигналами в посредничестве закрытия устьиц через регулирующее действие абсцизовой кислоты (АБК). Растения накапливают АБК в ответ на действие водного стресса, вызывая сигнальный каскад в замыкающих клетках, что приводит к закрытию устьиц. Этот процесс является очень важным в стрессовых условиях, поскольку поры устьиц локализованы в растительном эпидермисе и контролируют поступление CO2 для фотосинтеза и потери воды через транспирацию [135]. АФК служат ключевым звеном сигнального каскада по активации кальциевых каналов в плазматической мембране. Таким образом, наиболее вероятной последовательностью событий в условиях солевого стресса будет следующая: физиологический дефицит воды – закрытие устьиц листа, регулируемое абсцизовой кислотой – ограничение доступности CO2 – ослабление электрон-транспортной цепи и образование АФК. Это условие, называемое фотоокислительным стрессом, является основой реакций растения на прочие виды стресса – засуху, высокие и низкие температуры и чрезмерную освещенность [239, 119]. В связи с этим растения защищены антиокислительными механизмами, связывающими компонентов: свободные радикалы. ферментативного и Эти механизмы неферментативного. состоят из двух Неферментативный компонент включает в себя защиту с помощью антиоксидантов, таких, как токоферол, каротиноиды, аскорбат и глутатион, которые удаляют молекулы свободных радикалов [217]. Ферментативный компонент состоит из энзимов, таких, как супероксиддисмутаза, каталаза, аскорбат пероксидаза, моногидроаскорбат редуктаза, дегидроаскорбат редуктаза и глутатион редуктаза [217]. Наряду с этим, железосодержащий белок, ферритин, также вовлечен в процесс удаления АФК [156]. Большое количество обзоров было сосредоточено на зависимости между солевым стрессом и антиокислительными механизмами защиты растений [24, 39]. 15 1.2 Получение растений устойчивых к неблагоприятным абиотическим факторам среды Показано, что основной проблемой селекционной работы по повышению устойчивости к абиотическим стрессам является наличие большого комплекса генов, контролирующих реакцию растений на абиотические стрессы, характеризуются сложной регуляцией [103, 242, 229]. Например, при действии солевого стресса у растений изменяется экспрессия около1500 генов [146]. Следовательно, для существенного увеличения толерантности к стрессовым факторам необходим отбор по многим генам. Изучение регуляторной системы и механизмов устойчивости растений к абиотическим стрессам на молекулярном уровне дает возможность использовать генно-инженерный подход для получения стрессоустойчивых растений. В последние годы биотехнологи изучают связь изменений физиологических и фенотипических признаков при стрессе с регуляцией транскрипции, синтезом белков и их комплексов с устойчивостью с использованием мутагенеза и генно-инженерных манипуляций. Гены, потенциально способные оказывать влияние на изменение (увеличение либо уменьшение) устойчивости растений к абиотическим стрессам: 1) гены, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе осмопротекторов; 2) гены, кодирующие LEA белки и пептиды (late embryogenesis abundant protein genes), синтезирующиеся на поздних стадиях эмбриогенеза; 3) гены, кодирующие сигнальные и регуляторные молекулы (белки, пептиды, РНК), 4) контролирующие регуляцию стрессового ответа; 5) гены, контролирующие количество, транспорт и восприятие рецепторами растительных гормонов; 6) гены, кодирующие ферменты, участвующие в нейтрализации окислительного стресса; 7) гены, кодирующие белки регуляции транспорта ионов (антипортеры, симпортеры и транспортеры, локализованные в плазмалемме и мембранах различных клеточных компартментов - вакуолей и органоидов); 8) гены молекулярных шаперонов и другие. 16 1.2.1 Применение генов, кодирующих ферменты синтеза осмопротекторов Одной из наиболее распространенных реакций на воздействие стрессовых факторов у органических растений растворов является [223]. синтез различных Осмолиты – типов совместимых это соединения с низким молекулярным весом, не токсичные при высоких концентрациях в клетке. Осмолиты делятся на аминокислоты (пролин, аланин), четвертичные амины (бетаин, глицинбетаин), сахароспирты (маннитол, трегалоза). Они учавствуют в защите растения от стрессовых воздействий с помощью различных механизмов, посредством снижения водного потенциала клеток, обеспечивают целостность структурных белков, защищают ферменты от инактивации, осуществляют детоксификацию АФК [56, 97]. Однако далеко не всегда повышение синтеза осмопротекторов приводит к повышению урожая [245]. Неспецифическая экспрессия генов, контролирующих синтез осмолитов, часто сопровождается плейотропным воздействием, таким как некроз и снижение роста, в связи с нарушениями метаболизма. Для снижения повреждающего эффекта синтез осмолитов должен быть только при воздействии стрессовых факторов и строго тканеспецифичен [89]. Аминокислота пролин, как известно, широко распространена в высших растениях и обычно накапливается в больших количествах в ответ на воздействие абиотических стрессов [181]. В дополнение к своей роли в качестве осмолита для регуляции осмотического потенциала, пролин способствует стабилизации субклеточных структур (мембраны и белки), удаляет АФК в условиях стресса. Пролин усиливает фотохимическую активность фотосистемы ІІ в мембранах тилакоидов, снижает перекисное окисление липидов, регулирует кислотность цитозоля и поддерживает соотношение НАД+/НАДH. Повышение неспецифической устойчивости растений к абиотическим стрессам достигается с помощью дополнительного синтеза пролина, который защищает мембраны, макромолекулы и структурные элементы клетки [127,94]. В ответ на засуху и засоление в растениях происходит накопление пролина в цитозоле [126]. Например, в клетках растения Distichlis spicata, обработанного 200 мМ NaCl, 17 концентрация пролина в цитозоле составила около 230 мМ [126]. Известно, что пролин индуцирует экспрессию генов, отвечающих на воздействие солевого стресса [55]. Концентрация пролина меняется в разные периоды роста растений, поэтому связь между содержанием пролина и устойчивостью к абиотическим стрессам довольно противоречива. Для некоторых культур была экспериментально подтверждена зависимость между уровнем сверхэкспрессии пролина и устойчивостью к воздействию низких температур, засолению, засухе [94, 266]. Синтез пролина в клетке осуществляется из глутамина или орнитина. В условиях стресса доминирует синтез пролина из глутамина. Ключевым ферментом биосинтеза пролина является пирролин-5-карбоксилатсинтетаза (P5CS) [263]. В геноме арабидопсиса имеются два гена, контролирующих синтез ирролин-5-карбоксилатсинтетазы: ген AtP5CS2 содержит DRE (dehydration responsive element) элементы кодирующей последовательности, второй ген AtP5CS1 не имеет этих элементов, оба гена активируются низкой температурой, засухой, наличием повышенных концентраций соли, осмотическим стрессом [77, 237]. Показано, что трансгенные растения табака, обладающие сверхэкспрессией P5CS, имеют повышенное содержание пролина и устойчивы к засухе и засолению [127]. Были получены трансгенные эмбриогенные агрегаты клеток лиственницы Larix leptoeuropaea с геном P5CS, которые обладали повышением содержания пролина в 30 раз по сравнению с контролем и характеризовались способностью к росту в условиях засоления и пониженных температур [94]. Еще одним ферментом синтеза пролина является орнитинаминотрансфераза (ОАТ) [54]. Были получены трансгенные растения Nicotiana plumbaginifolia, экспрессирующие ген ОАТ арабидопсиса, трансформанты отличались повышенной активностью ОАТ и уровнем свободного пролина по сравнению с контролем, а также при воздействии осмотического стресса имели большую биомассу и более высокую всхожесть семян [208]. Вклад данного гена в контроль солеустойчивости до конца не изучен, поскольку его тип экспрессии отличается от типичных стресс-специфических вариантов. Одним из способов получения 18 растений с повышенным содержанием пролина ингибирование ферментов деградации пролина. Например, полученные Nanjo с соавторами трансгенные растения арабидопсиса с геном пролиндегидрогеназы в антисмысловой ориентации были более устойчивы к заморозкам и засолению, чем контрольные нетрансгенные растения [170]. Среди многих четвертичных аммониевых соединений, известных в растениях, глицинбетаин наиболее обильно образуется в ответ на обезвоживание. Большое количество глицинбетаина содержится в хлоропластах, где он играет важную роль в защите тилакоидной мембраны, тем самым поддерживая эффективность фотосинтеза [90]. Установлено, что глицинбетаин защищает некоторые ферменты растений от высокотемпературной инактивации [182]. Известно, что фотосистема II чувствительна к воздействию высоких температур, выявлено, что введение генов, экспрессия которых увеличивала содержание в растениях бетаинов, обеспечивало защиту белков фотосистемы [271]. Показано, что глицинбетаин защищает растение путем стабилизации высоко упорядоченных структур белков и мембран [216]. Накопление глицинбетаина повышает толерантность к различным бактериального гена betА абиотическим в растения стрессам табака, Введение [202]. привело к накоплению глицинбетаина и повышению солеустойчивости трансгенных растений [142]. Рис преобразует бетаинальдегид солеустойчивым видом. При в глицинбетаин дополнительной и является экспрессии сравнительно гена betА в хлоропластах риса наблюдалось эффективное накопление глицинбетаина и повышение солеустойчивости [238]. Введение гена codА холиноксидазы в геном растений арабидопсиса и риса привело к увеличению уровня бетаина в хлоропластах трансгенных растений и более высокой устойчивости при солевом, низко- и высокотемпературном стрессах, повышенном уровнe освещения [166, 215]. Полиамины – низкомолекулярные поликатионы, присутствующие во всех живых организмах. Полиамины могут выступать в качестве низкомолекулярных осмолитов, повышающих устойчивость растений [97]. Полиамины растений 19 вовлечены во множество биологических процессов, в том числе рост, развитие и ответные реакции на абиотические стрессы [79, 87]. Основные формы путресцин, спермидин и спермин. В последние годы наблюдается растущий интерес к изучению участия полиаминов в защитной реакции растения против различных неблагоприятных факторов, таких как окислительный стресс [144], осмотический стресс [29], УФ-облучение [130], засоление [269]. Введение в геном растений табака генов S-аденозилметиониндекарбоксилазы или аргининдекарбоксилазы – ключевых ферментов биосинтеза полиаминов – привело к усилению засухо- и солеустойчивости [258]. При биохимическом анализе было показано четырехкратное увеличение уровня полиамина путресцина по сравнению с контролем. Однако у некоторых растений модификация метаболизма полиаминов коррелировала с замедлением роста и дефектами развития растений. Сахара и сахароспирты также выполняют функцию осморегуляции в клетках растений. Фруктаны – полисахариды, накапливающиеся во многих растениях и бактериях. Показано, что фруктаны могут стабилизировать структуру мембраны в условиях стресса [70]. Фруктаны являются растворимыми веществами и в связи с этим могут учавствовать в регуляции осмотического давления. Для создания трансгенных растений табака, накапливающих фруктаны, был использован ген SacB из Bacillus subtilis. Было выявлено, что скорость роста трансгенных растений была существенно выше (на 55%) по сравнению с нетрансгенным контролем в условиях засухи [193]. Содержание фруктанов и их метаболизм тесно связан с устойчивостью растений к низким температурам и засухе [243, 71]. Недавние эксперименты показали, что трансформация геном 1SST растений табака [141] приводит к накоплению фруктанов и повышает толерантность к охлаждению. Показана повышенная устойчивость растений риса со сверхэкспрессией гена биосинтеза трегалозы к условиям засухи и засоления [89]. Важную роль в адаптации растений к стрессовым условиям может играть маннитол. Маннитол накапливается у некоторых видов растений и понижает 20 осмотический потенциал клеток. Был отмечен антиокислительный эффект маннитола в стрессовых условиях [225]. Маннитол обеспечивает защиту растению даже при низких концентрациях в связи с особой ролью в удалении гидроксильных радикалов, которые образуются в реакции Фентона [104]. Маннитол выступает как осмопротектор в условиях засоления [273] и засухи [192]. Djilianov с соавторами получили трансгенные растения табака с использованием стратегии введения различных генов. В экспериментальной работе были использованы: ген SacB, кодирующий синтез левансахаразы Bacillus subtilis, ген соdА, ген синтеза пролина – ген P5CS арабидопсиса или Vigna [72]. Таким образом, были получены растения, обладающие повышенным содержанием фруктана, глицинбетаина и пролина. Трансгенные растения характеризовались устойчивостью к воздействию отрицательных температур без повреждения, в то время как контрольные растения после такой обработки теряли тургор и погибали [187]. Маннитол выполняет важную функцию при адаптации растений к неблагоприятным условиям. Маннитол оказывает антиокислительное воздействие [225], учавствует в защите растения при засолении [273] и засухе [192] как осмопротектор. 1.2.2 Применение генов, кодирующие LEA белки и пептиды (late embryogenesis abundant protein genes), синтезирующиеся на поздних стадиях эмбриогенеза LEA белки - группа гидрофильных белков, накапливающихся в семени на поздних стадиях эмбриогенеза, впервые были описаны для растений хлопка [73]. LEA белки влияют на толерантность растений к различным типам абиотических стрессов [171]. В растениях ячменя ген hva1 кодирует белок группы LEA и индуцируется дефицитом влаги. Растения шелковицы трансгенные по гену HVA1 характеризовались повышением скорости фотосинтеза, большей стабильностью клеточных мембран и меньшим повреждением при фотоокислительном стрессе. При воздействии солевого стресса в трансгенных растениях многократно 21 повысился уровень содержания пролина [136]. Трансгенные растения пшеницы, содержащие ген HVA1, характеризовались улучшенным ростом в условиях дефицита воды по сравнению с контролем [233]. Xu с соавторами были получены растения риса, экспрессирующие ген HVA1. Трансгенные растения обладали повышенной толерантностью к водному дефициту, солевому стрессу [264]. 1.2.3 Применение генов, кодирующих сигнальные и регуляторные молекулы (белки, пептиды, РНК) Растительный геном содержит большое количество генов, кодирующих транскрипционные регуляторы. Ответная реакция растения на воздействие стрессоров регулируется множеством сигналов, активирующих транскрипцию и последующий синтез соответствующих белков. Генно-инженерные манипуляции с регуляторами транскрипции могут привести к изменению экспрессии одновременно многих генов, участвующих в ответной реакции растения на стресс [55]. В геноме Arabidopsis около 1500 транскрипционных факторов [203], которые индуцируются стрессовыми воздействиями и классифицируются на АБК – зависимые и АБК - независимые пути регуляции [228]. В растительном геноме выделяют несколько крупных семейств транскрипционных факторов: WRKY, bZIP, NAC, MYB, AP2/ERF, MYC [132]. Moons с соавторами описывает усиление активности ряда генов rab, относящихся к семейству LEA, при воздействии высоких концентраций солей [160]. Известно семейство генов CBF, контролирующих экспрессию генов холодоустойчивости cor [116]. Трансгенные растения Arabidopsis конституитивно суперэкспрессирующие индуцируемый холодом транскрипционный фактор (CBF1; CRT/DRE - связывающий белок) продемонстрировали толерантность к замораживанию без негативного влияния на развитие и характеристики роста [116]. При введении CBF1 под контролем CaMV35S промотора в геном томата (Lycopersicon Esculentum), у растения повысилась толерантность к засухе и солевому стрессу. Однако растения характеризовались карликовым фенотипом и 22 снижением в образовании плодов и количества семян [109]. При экспрессии в геноме томата гена CAPIF1, выделенного из генома перца, была продемонстрирована повышенную устойчивость к холодовому стрессу, уровень устойчивости коррелировал с уровнем экспрессии гена CAPIF1 [222]. Конститутивная экспрессия ABF3 или ABF4 свидетельствует о повышении засухоустойчивости у растений Arabidopsis, с измененной экспрессией АБК – индуцибельных генов, таких как rd29B , rab18 , ABI1 и ABI2 [121]. Транскрипционный фактор в растениях риса Myb4, синтез которого кодирует ген Osmyb4, индуцируется воздействием холода. Трансгенные растения арабидопсиса продемонстрировали устойчивость к холодовому стрессу [252]. При изучении гена OsWRKY89 риса было показано, что значительное влияние на экспрессию оказывают метилжасмонат и УФ излучение. Растения с суперэкспрессией гена OsWRKY89 обладали устойчивостью к УФ облучению и характеризовались задержкой роста на ранних стадиях развития, образованием воска на листьях [261]. Экспрессия гена DREB1A у растений арабидопсиса и томата приводит к конститутивной экспрессии стресс-индуцируемых генов, и повышенной устойчивости растений к холоду и засолению [143, 169]. Cуперэкспрессия DREB1A повысила устойчивость трансгенных растений табака к засухе и низким температурам [125]. Группа факторов транскрипции известных как NAK, являющихся одним из самых крупных семейств, было показано участие данного семейства в толерантности растения к воздействию солевого стресса [179]. 1.2.4 Применение генов, кодирующих ферменты, влияющие на количество, транспорт и восприятие рецепторами растительных гормонов В растительных клетках присутствует множество сигнальных молекул, которые индуцируют ответную реакцию на воздействие стрессоров. Абсцизовая кислота (АБК) играет ключевую роль в индукции синтеза целого ряда стрессовых белков [47]. Различные стрессовые воздействия вызывают накопление АБК в 23 тканях растений: засуха [137], засоление [161], осмотический стресс [160], высокие и низкие температуры [111]. Продемонстрирована устойчивость клеток Bromus inermis к высокой температуре, связанная с синтезом большого количества низкомолекулярных белков теплового шока при индукции АБК [205]. Было выявлено, что АБК многократно индуцирует экспрессию ряда генов, регулируемых водным дефицитом [60]. Показано участие факторов транскрипции bZIP и MYB в сигнальной трансдукции АБК и активации генов синтеза АБК. Показана устойчивость к воздействиям засухи и холода у трансгенных растений Lactuca sativa с геном ABF3 арабидопсиса, кодирующим транскрипционный фактор для экспрессии АБК-чувствительных генов [250]. Суперэкспрессия этилен-чувствительного гена Sub1A у сорта риса, неустойчивого к этому виду стресса, привела к повышенной устойчивости к затоплению. Sub1A относится к транскрипционному фактору ERF (ethylene response factors), который действует при повышенном уровне этилена. Повышенная экспрессия любого из генов этой группы приводит также к возрастанию устойчивости к другим абиотическим воздействиям [265]. 1.2.5 Применение генов участвующих в нейтрализации окислительного стресса При абиотических стрессовых условиях растения претерпевают окислительный стресс, связанный с усиленным образованием активных форм кислорода, повреждающих мембраны и макромолекулы [155]. Главную роль в защите клеток антиоксидантам от окислительного относятся стресса играют супероксиддисмутаза, антиоксиданты. К аскорбатпероксидаза, глутатионредуктаза и каталаза [14]. Bowler с соавторами впервые продемонстрировали, что трансгенные растения с повышенным уровнем СОД, являются более устойчивыми к окислительному стрессу. Были получены трансгенные растения табака, которые 24 экспрессировали химерный MnSOD, состоящий из MnSOD полипептида Nicotiana plumbaginifolia, в котором митохондриальный транзитный пептид был заменен хлоропластспецифичексим транзитным пептидом, приводя к эффективному импорту активной MnSOD в хлоропласты [42]. Также была показана повышенная устойчивость растений к воздействию озона [247]. Трансформанты табака, экспрессирующие кДНК гена СОД люцерны, были устойчивы к тяжелым металлам, перекиси водорода, хлориду натрия, УФоблучению [176]. После воздействия низкой положительной температурой при высокой интенсивности освещения трансгенные растения табака с геном Mn-SOD были способны поддерживать фотосинтетическую активность на уровне 90% нормы. У контрольных растений в аналогичных условиях отмечалось снижение уровня фотосинтеза [98]. Исследования Perl с соавторами показали, что избыточная экспрессия хлоропластной повышенную Cu/ZnSOD защиту от в трансгенных растениях окислительного может повреждения [190]. обеспечить Растения трансгенного картофеля, экспрессирующие хлоропластную Cu/ZnSOD из томата сократили уровни повреждения по сравнению с контрольными растениями после обработки метилвиологеном. Исследования трансгенных растений виргинской сосны с повышенной активностью антиоксидантных ферментов (аскорбатпероксидазы, глутатионредуктазы и СОД) показали, что эти растения обладают повышенной устойчивостью к различным стрессам [240]. Были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие АcП с транспортом в хлоропласт. У данных растений была повышена активность фермента в 16 раз. Анализ повреждений мембран в листьях растений после воздействия метилвиологеном показал, что повышенная экспрессия АcП в хлоропластах способна обеспечить повышенную защиту по сравнению с нетрансгенными контрольными растениями [22]. 25 Получены трансгенные растения табака с суперэкспрессией к-ДНК фермента, обладающего активностью глутатион-S-трансферазы и глутатионпероксидазы. При воздействии низких температу и солевого стресса интенсивность развития проростков трансгенных растений была существенно выше, чем у контрольных нетрансгенных растений [209]. Поскольку СОД обеспечивают защиту от АФК, то считается, что в трансгенных растениях имеет смысл экспрессировать гены СОД, защищающие различные компартменты [21]. 1.2.6 Применение генов, кодирующих, симпортеры, антипортеры, протонные помпы и транспортеры ионов Одним из важнейших моментов в обеспечении устойчивости растений к повышенному содержанию минеральных солей является сохранение ионного гомеостаза клеток. При условии транспорта избытка токсичных ионов в вакуоли растительной клетки при сохранении низкого уровня NaCl в цитоплазме можно добиться повышения устойчивости к солевому стрессу. Растения арабидопсиса с суперэкспрессией гена, контролирующего работу ионного насоса Na+/H+, проявляли повышенную устойчивость к высоким концентрациям солей [226]. Суперэкспрессия гена AtNHX1, кодирующего вакуолярный транспортный белок арабидопсиса, приводила к повышению солеустойчивости у трансгенных растений сахарной свеклы [267]. Повышенная экспрессия вакуолярного Na+/H+ - антипортера AtNHX1 в растениях A.thaliana давала возможность роста растения на субстрате с содержанием NaCl в концентрации 200мМ [23]. Была отмечена устойчивость к солевому стрессу у трансгенных растений томата с геном дрожжей Hal1, регулирующим клеточный цикл. Они также характеризовались способностью поддерживать высокое содержание К+ в присутствии повышенных концентраций Na+ в листьях и клетках каллуса, что предполагает нейтрализацию повышенного содержания ионов Na+ путем накопления ионов К+ [37]. 26 1.2.7 Применение генов, кодирующих молекулярные шапероны К шаперонам синтезирующихся или относят белки, способствующие рефолдингу денатурированных фолдингу вследствие вновь стресса полипептидных цепей, а также их последующей сборке в биологически активные олигомерные структуры [57]. Молекулярные шапероны преимущественно являются белками теплового шока. Одним из ответов организмов на повышенную температуру является синтез белков теплового шока (Hsp). Одной из важнейших функций белков теплового шока является создание условий для правильной конформационной укладки белковых молекул. В результате воздействия стрессоров белки в клетке частично денатурируют, что активирует систему стрессорного ответа. При различных неблагоприятных воздействиях у разных видов растений синтезируются идентичные “ранние” стрессовые белки, в частности Hsp70 [257]. Синтез “поздних” белков характеризуется специфичностью и их вероятным участием в восстановительных реакциях [5]. Семейство белков Hsp 100 было выявлено в ряде видов растений. Регуляция экспрессии белков Hsp 100 является стресс индуцированной [20]. Установлено, что Athsp101 из семейства Hsp 100 A.thaliana имеет большое значение для термотолерантности [196]. Гены Hsp90 были выделены у нескольких видов растений [131]. Показано на растениях A.thaliana с редукцией функций sp90, что данное семейство генов контролирует рост и развитие растения [197]. В условиях стресса белки Hsp90 вовлекаются в клеточный цикл, мейоз и цитокинез [150]. Hsp70 у многих видов растений является консервативным и синтез данного семейства индуцируется при повышенной температуре [173]. В проростках трансгенных растений A.thaliana конститутивный синтез белков теплового шока усиливал устойчивость к высокой температуре [139]. Были получены трансгенные растения томата, содержащие ген белка теплового шока арабидопсиса hsf, слитый с геном GUS, при этом плоды трансгенных растений были более устойчивыми к воздействию высоких и низких температур, чем контрольные нетрансгенные растения [145]. 27 1.3 Роль супероксиддисмутазы в регуляции активных форм кислорода Супероксиддисмутаза (СОД) один из важнейших компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительной деструкции. McCord и Fridovich было обнаружено, что СОД катализирует реакцию дисмутации супероксидных радикалов (O2•–) [151]. СОД присутствует в клетках живых организмов разного уровня организации: бактерий, микроорганизмов — грибов [198], растений [31], животных [151] и человека [175]. В основе классификации СОД кофактор металла, который присутствует в активном центре: Cu/Zn, Fe и Mn, которые также могут быть идентифицированы по чувствительности к KCN и H2O2 [219]. В отличие от большинства других организмов, которые имеют только один из типов СОД, растения содержат несколько изозимов СОД. Например, в клетках листьев кукурузы обнаружено 9 изозимов СОД: 4 CuZnSOD в цитоплазме, 1 CuZnSOD в хлоропластах и 4 MnSOD в митохондриях [274]. Количество изозимов колеблется от одного вида растений к другому [219, 138]. Последовательности множества генов, кодирующих СОД, были описаны для табака, томатов, риса [189, 41, 122]. СОД играет центральную роль в защите растения от окислительного стресса. Является ключевым ферментом, который катализирует реакцию дисмутации супероксидных радикалов в перекись водорода и молекулярный кислород, которые в итоге удаляются из клетки каталазой и пероксидазой [220]. 1.3.1 Структура, локализация и функции супероксиддисмутазы СОД является первой линией защиты от окислительных повреждений, предотвращая окисление клеточных макромолекул. СОД является катализатором дисмутации супероксидных анион-радикалов в молекулярный кислород и перекись водорода [151]: 28 Механизм функционирования СОД заключается в последовательном восстановлении и окислении супероксидными анион-радикалами металла (Me) активного центра фермента [26]: , . Различия между изоформами СОД заключаются в молекулярной массе, чувствительности к ингибиторам и локализацией в клетках растений. СОД присутствуют во всех компартментах клетки, а также в апопласте. Сравнение данных о локализации разных форм СОД показывает, что наиболее изобильной в клетках растений является CuZnSOD, она обнаружена во всех внутриклеточных компартментах — в цитозоле, хлоропластах, митохондриях, пероксисомах, в апопласте. MnSOD обнаружена в митохондриях и пероксисомах. FeSOD локализована в хлоропластах и цитоплазме клубеньков некоторых бобовых [2]. CuZnSOD локализована в мембранах тилакоидов и строме хлоропластов [177], цитозольная форма CuZnSOD обнаружена в ядре [178]. Также CuZnSOD обнаружена в матриксе пероксисом [61]. MnSOD присутствует в матриксе митохондрий и пероксисом [69]. FeSOD локализована в строме и на мембранах тилакоидов хлоропластов [96]. Также фермент был обнаружен в цитозоле клубеньков некоторых растений из семейства бобовых [162] и в пероксисомах томата [157]. 1.3.2 Активность супероксиддисмутазы в условиях действия неблагоприятных факторов. Результаты многочисленных исследований показали, что окислительный стресс снижает или усиливает активность СОД [42]. Отмечено повышение активности СОД при воздействии различных стрессовых факторов [124, 138, 123]. Повышение активности СОД является ответной реакцией на увеличение образования супероксидных радикалов в условиях стрессовых факторов. Таким 29 образом, фермент осуществляет защиту клеток растения от окислительных повреждений. В экспериментальной работе Mittova с соавторами на разных сортах томата показано, что устойчивый к воздействию солевого стресса сорт характеризуется повышенной активностью СОД и менее выраженными окислительными повреждениями по сравнению с чувствительным сортом. Функционирование стрессоустойчивых растений при воздействии неблагоприятных факторов среды осуществляется за счет более эффективной работы антиоксислительных ферментов. На ряде трансгенных растений было показано повышение устойчивости к окислительному стрессу при повышенном уровне экспрессии генов СОД [42, 190, 153, 30, 88, 260]. Ген Fe-SOD, изолированный из арабидопсиса и направленный в хлоропласты табака (сорт Petit Havana SR1), в итоге повысил защиту от O2, образующихся как в плазмалемме, так и в фотосистеме II [248]. McKersie описал трансгенные растения люцерны (medicago sativa l.), экспрессирующие Mn-SOD, Fe-SOD и Cu/Zn-SOD, обладающие повышенной выживаемостью и устойчивостью к холоду, засухе [153]. При достаточно длительном и интенсивном воздействии стрессовых факторов происходит снижение активности СОД, что было отмечено при солевом стрессе [218], при дефиците влаги [84], при засухе [270] и других неблагоприятных условиях. 1.4 Технология получение трансгенных растений семейства Solanaceae (табака и томата) Получение трансгенных растений, в настоящее время, осуществляется с помощью различных методов, наиболее часто используемыми являются: биобаллистическая трансформация, агробактериальная микроинъекция ДНК, электропорация, трансформация липосом. трансформация, 30 Генетическая трансформация растений впервые в мире была описана для растений табака [67, 188]. 1.4.1 Использование метода биолистической трансформации. Метод биолистической трансформации заключается в преципитации ДНК на поверхность частиц инертного металла (вольфрама, золота, платины) [128]. Осаждение экзогенной ДНК осуществляется с использованием ПЭГ и спермидина. Частицы с иммобилизованной ДНК наносятся на целлофановую подложку, которая помещается внутрь так называемой баллистической пушки. Затем частицы с осажденной ДНК разгоняются в установке под действием давления гелия или электрического заряда (существуют также пневматические и пороховые) и направляются в растительные ткани. Этим методом трансформированы клетки таких однодольных растений как пшеница [32], рис [58], ячмень [148] и другие. Эффективность биолистической трансформации различна в зависимости от вида растения, ткани, физиологического состояния, размера частиц. С помощью обстрела микрочастицами была достигнута эффективная трансформация табака, которая составила 1,2% [112]. Такие данные сопоставимы с экспериментами Klein с соавторами. При использовании метода обстрела микрочастицами интактных клеток листьев табака эффективность трансформации составила 2-5% [129]. Iida с соавторами, при обстреле микрочастицами суспензионной культуры клеток табака, выявили связь эффективности трансформации и этапа клеточного цикла. При использовании суспензионной клеточной культуры табака в биолистической трансформации было выявлено, что клетки, находящиеся в М и G2 фазах клеточного цикла дают в 4-6 раз большую эффективность трансформации, чем клетки в фазах S и G1 [113]. Путем изменения биологических и физических параметров Russel с соавторами оптимизировали методику обстрела микрочастицами трансформации составила 10% [212]. таким образом, что эффективность 31 Получение трансформантов томата с помощью метода обстрела микрочастицами было описано несколькими авторами [249, 211]. Объектом биолистической трансформации могут быть отдельные структуры клетки, например, хлоропласты [210, 64], так же в качестве объекта могут быть использованы клеточные суспензии [129, 249, 212], эмбриогенный каллус, незрелые зародыши, примордии листьев [65]. Метод биолистической трансформации является альтернативным, когда нет возможности использовать агробактериальную трансформацию. Например, в случае, когда растение устойчиво к агробактериальной инфекции. Благодаря методу биолистической трансформации существует возможность одновременного введения нескольких генов в одно растение. Lili Chen с соавторами проведен эксперимент одновременного введения 9, 10 и даже 13 генов в рис [51]. Однако метод биолистической трансформации имеет ряд недостатков: невозможность контролировать количество копий вводимого гена в одну клетку, слишком большое число копий трансгена ведет к подавлению его активности; размер экзогенной ДНК ограничен (не более 10 КБ), поскольку слишком большие плазмиды имеют низкий уровень осажденияна частицах и повреждаются в процессе обстрела [241]. 1.4.2 Использование метода электропорации Метод электропорации основан на обработке клеток или тканей растения электрическими импульсами высокого напряжения(200-1500В/см) в присутствии ДНК. Импульсы высокого напряжения обратимо усиливают проницаемость биомембран, благодаря этому экзогенная ДНК проникает внутрь клетки. Первым трансгенным растением, полученным с помощью метода электропорации, был табак [83, 204]. Bellini с соавторами был проведен эксперимент с электропорацией протопластов томата, при этом эффективность трансформации составила 0,2 2,5% [33]. 32 Метод электропорации подходит для различных типов эксплантов: протопласты, меристематические ткани, незрелые зародыши, пыльцевые зерна. Abdul-Baki с соавторами продемонстрировали возможность получения трансформантов с помощью электропорации из прорастающих пыльцевых зерен табака [19]. Rodenburg с соавторами, при проведении экспериментов на протопластах табака, обнаружили, что более высокую частоту стабильных канамицин-устойчивых трансформантов дает использование одноцепочечных молекул ДНК, чем двухцепочечных [206]. Недостатками метода являются низкая эффективность трансформации и разрушение генетических конструкций под воздействием электрических импульсов с высоким напряжением. 1.4.3 Использование метода микроинъекции ДНК Метод микроинъекции ДНК обычно используется для клеток животных и является методом, основанным на передаче ДНК к неповрежденным растениям или протопластам механическим путем [63]. Применение этого метода для растительной клетки ограничено наличием клеточной стенки из лигнина и целлюлозы. По этой причине, основным объектом для микроинъекции ДНК, являются протопласты [221]. Микроинъенкция ДНК осуществляется с помощью микрокапилляров и микроскопических устройств, позволяющих передать конкретное количество генов в цитоплазму или непосредственно в ядро клеток [172]. В качестве объектов для микроинъекции ДНК могут быть использованы изолированные протопласты, интактные одиночные клетки с клеточной стенкой, единичные клетки суспензионной культуры, многоклеточные структуры [172]. Toyoda с соавторами провели успешную трансформацию с помощью микроинъекции ДНК в клетки каллуса томата [244]. Метод микроинъекции ДНК является довольно трудоемким, имеет высокую стоимость, низкую эффективность и плохо воспроизводим. Ограничением в применении метода микроинъекции для томата является трудность регенерации морфологически нормального диплоидного растения от трансформированного 33 протопласта. Однако в данном направлении отмечен значительный прогресс [224]. 1.4.4 Использование метода агробактериальной трансформации В настоящее время почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens является самым часто используемым инструментом генетической трансформации для большинства двудольных растений. Наиболее эффективной системой переноса чужеродной ДНК в растения томата является агробактериальная трансформация, впервые описанная McCormick [152]. Агробактериальная трансформация имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами. Во-первых, методика трансформации с помощью агробактерий является достаточно простой и дешевой манипуляцией. Во-вторых, данный метод позволяет переносить в клетки растения-реципиента большие участки чужеродной ДНК и при этом они встраиваются в геном в небольшом количестве копий. В-третьих, тотипотентность растительных клеток позволяет трансформировать клетки разных типов. Хотя ткани разных видов растений по-разному регенерируют и реагируют на трансформацию. Поэтому оптимальные условия культивирования и способы регенерации должны быть установлены для каждой ткани и вида растения [259]. С помощью метода агробактериальной трансформации были получены фенотипически нормальные и фертильные растения, несущие целевой ген, который передавался следующему поколению в соответствии с менделевским наследованием [67]. Наследование гена устойчивости к канамицину в трансформированных протопластах табака было установлено для 6 поколений без влияния процедуры селекции на протяжении двух лет [227, 194]. После скрещивания с диким типом устойчивость к канамицину наследовалась как доминантный признак в соответствие с трансформантов. законами Менделя в 90% случаях из 150 основных 34 С использованием A.tumefaciens были трансформированы клетки суспензионной культуры табака, показано присутствие нопалина (аминокислоты, кодируемой в ДНК плазмиды) [231, 149]. С использованием хлоропластов табака продемонстрировано, что агробактериальная трансформация может применяться для переноса чужеродных генов в хлоропласты высших растений с помощью сайт-специфической рекомбинации [256]. Kumar с соавторами был проведен ряд экспериментов по изучению влияния физических и химических факторов на эффективность агробактериальной трансформации листьев табака. В итоге было обнаружено, что воздействие ультразвука повышает эффективность трансформации в 2,2 раза, а при совмещении с обработкой ацетосирингоном повышается в 4,1 раза [134]. Рядом исследователей было показано, что для выполнения процедуры агробактериальной трансформации томата имеет значение выбор оптимального типа экспланта, подбор регуляторов роста для эффективной регенерации, концентрация агробактерии, присутствие индукторов генов вирулентности, штамм агробактерии. В качестве эксплантов для агробактериальной трансформации томата используют различные части растения. Выбор типа экспланта для каждого вида и сорта индивидуален, поскольку способность к регенерации зависит от генотипа растения. В экспериментах по агробактериальной трансформации томатабольшинство исследователей использовало в качестве эксплантов семядоли [79, 50, 46]. McCormick с соавторами получили трансгенные растения с использованием листьев [152]. В экспериментах Sigareva с соавторами успешно использовали различные типы эксплантов - сегменты гипокотилей, листья и семядоли, был отмечен эффективный процесс органогенеза [230]. Chyi and Phillips в качестве эксплантов применяли сегменты стебля [59]. Особую роль для повышения эффективности трансформации играет подбор оптимальной среды для регенерации трансформированных эксплантов. Для успешного органогенеза в питательной среде для регенерации необходимо присутствие регуляторов роста. В большинстве протоколов агробактериальной 35 трансформации использовался зеатин [79, 207] или сочетание зеатина с ИУК [101, 253, 118, 186, 255]. Cortina и Culanez-Maciaт показали, что при использовании в качестве регулятора роста рибозида зеатина с ИУК частота регенерации составляет 23%, а при использовании зеатина с ИУК всего 6% [62]. Moghaieb с соавторами при агробактериальной трансформации сегментов гипокотиля томата добавляли в питательную среду 2,4 Д и кинетин, при этом частота регенерации составила 25-65% в зависимости от сорта [158]. Эффективность агробактериальной трансформации томата в зависимости от генотипа может изменяться в широком диапазоне. Например, у McCormick с соавторами эффективность трансформации составила - 70% растений, устойчивых к селективному агенту [152]. В исследовании Shahin эффективность составила 4050% [224], в экспериментах Chyi – 75% устойчивых растений. В более поздних работах эффективность трансформации оценивалась путем подсчета соотношения количества исходно кокультивированных с агробактерией эксплантов к количеству трансгенных регенерантов. Таким способом эффективность трансформации была подсчитана в экспериментальной работе Park с соавторами и составила 20% [186], а также в работах Sun - 28-48% [236] и Hu - 25% [110]. Особое значение имеет концентрация агробактерий в суспензии для совместного кокультивирования с эксплантами. Влияние плотности бактериальной суспензии на эффективность трансформации было изучено в экспериментах Fillati с соавторами. Было показано, что когда концентрация бактерии увеличена или снижена относительно 5x108 бактериальных клеток на мл, эффективность трансформации снижается как минимум на 20% [79]. Одним из способов повышения эффективности агробактериальной трансформации является использование фенольных соединений. Фенольные соединения индуцируют экспрессию генов, ответственных за перенос Т-ДНК в клетку растения [38]. Davis с соавторами в экспериментальной работе показал влияние ацетосирингона на эффективность трансформации [66]. Альтернативным вариантом является использование фидерных клеток различных растений (табака, 36 петунии, томата) как источник фенольных соединений [79]. В экспериментальной работе Hamza было показано, что при агробактериальной трансформации томата эффективность трансформации составила 10% с использованием фидерных клеток и 6% без использования на среде с ИУК и зеатином [101]. Продолжительность варьирует в различных сокультивирования протоколах эксплантов трансформации. с Agrobacterium Некоторые авторы используют смачивание краев экспланта в течение нескольких минут [152, 66], тогда как другие предлагают проводить процедуру сокультивирования не менее 30 минут [79, 101]. Эффективность агробактериальной трансформации также зависит от выбора штамма Agrobacterium. Рядом авторов было показано, как изменяется выход трансгенных растений в зависимости от использованного штамма [253,82]. Большинство исследователей использует в качестве маркерного гена nptII, который обеспечивает устойчивость трансгенного растения к антибиотикам, относящимся к группе аминогликозидов. Обычно в экспериментальной работе для отбора используют добавление антибиотика канамицина в различных концентрациях [152, 207, 110]. Briza с соавторами проводили эксперименты по выбору оптимальной селективной среды для отбора трансформантов томата. Была использована конструкция, содержащая ген фосфоманнозаизомеразы (pmi), благодаря которму трансгенные клетки могут расти на среде с маннозой. PMI катализирует обратимую изомеризацию манноза-6-фосфата в фруктозо-6-фосфат, которая является промежуточным продуктом гликолиза и положительно влияет на рост трансформированных клеток. В отсутствие PMI манноза-6-фосфат накапливается и клетки перестают расти. С помощью агробактериальной трансформации семядольных эксплантов томата с использованием среды с маннозой была достигнута эффективность трансформации 4,2%. Но наивысшая эффективность трансформации составила 9% при использовании канамицина в качестве селективного агента [46]. Довольно часто отбор трансформантов осуществляют с помощью репортерных генов gfp [51] и gus [211]. 37 1.5 Стратегии повышения устойчивости томата к воздействию абиотических стрессов Последние картирование с количественных значительный достижения методов помощью признаков вклад в молекулярной молекулярных и маркеров, генетическую понимание биологии, анализ трансформацию, генетических, включая локусов внесли физиологических и биохимических основ устойчивости растений к абиотическим стрессам и способствовали получению растений с повышенной толерантностью. В условиях in vitro культура томата успешно используется для выбора устойчивых клеточных линий для изучения абиотических стрессов в лабораторных условиях. Данный метод требует сравнительно меньше усилий и ресурсов, чем отбор генотипов томата в полевых условиях. Например, Cano с соавторами провели скрининг на устойчивость к засолению культурных и диких видов томата в условиях in vitro с использованием апексов побегов [48]. Были отмечены существенные отличия между культурным и дикими видами по способности к укоренению позволив провести оценку и скрининг видов томата и сегрегирующей популяции. Осуществлен скрининг in vitro на устойчивость к засухе индийских разновидностей томата с примением полиэтиленгликоля [133]. Ряд ученых продемонстрировал отбор клеточных линий, толерантных к воздействию солей и засухе [102, 235]. Снижение воздействия засоления также достигается путем использования солеустойчивых подвоев. Например, прививка побегов «Jaquar» на солеустойчивые корневые подвои Radja, Pera и гибрид «Volgogradskij» X Pera увеличивала урожай плодов томата на 80% по сравнению с растениями Jaquar на их собственном подвое [76]. Растения в условиях in vivo используют различные физиологические и биохимические механизмы для ответа и адаптации к стрессу через продукцию сигнальных молекул, таких как АБК, Ca2+, жасмоновая кислота, этилен и салициловая кислота. Сигнальные молекулы запускают защитные ответы растения на воздействие стрессовых факторов. Защитная реакция растения 38 проявляется путем активации генов, кодирующих осмопротекторы и другие функциональные белки. Обработка листа растения томата во время вегетативной стадии глицинбетаином повышало проводимость устьиц и содержание белка и хлорофилла, в то же время, уменьшая фотодыхание, при солевом стрессе [147]. Park с соавторами глицинбетаином продемонстрировали, повышала устойчивость что экзогенная растения томата к обработка замерзанию благодаря непосредственной защите макромолекул и мембран и индукции антиоксидантов посредством влияния перекиси водорода [185]. Показано, что сигнальный пептид системин, индуцируемый повреждением растения, учавствует в солетолерантности растений томата [49]. Системин совместно с жасмоновой кислотой увеличивал толерантность к солевому стрессу. Одновременно Ca2+-зависимая протеинкиназа LeCDPK-1 осуществляла индукцию сигналинга, приводя к устойчивости от солевого стресса и стресса, вызыванного поранением. Результаты данной работы свидетельствуют о возможности участия жасмоновой кислоты и Ca2+ в устойчивости к воздействию солевого Получение растений с помощью трансгеноза с повышенной толерантностью к различным абиотическим стрессам посредством суперэкспрессии генов, вовлеченных в различные физиологические механизмы, толерантностью, использовалось целым рядом ученых (таблица 1). связанные с 39 Таблица 1. Достижения генетической инженерии томата устойчивого к абиотическим стрессам Ген, продукт гена и его функция katE каталаза Распад H2O2 на воду и кислород SAMDC S-аденозилметиониндекарбоксилаза Биосинтез полиаминов codA Холиноксидаза Аккумуляция глицинбетаина Rice Osmyb4 gene Транскрипция стресс-индуцибельных генов Вакуолярный Na+/H+ антипортер Повышение накопления Na+ в листьях Просистемин Биосинтез системина NtAQP1 Аквапорин Водный баланс растения HAL1 из дрожжей Альтернативный гомеостаз Na+ и K+ Фенотип (устойчивость) Источник Толерантность к фотоокислительному Mohamed et al., 2003 [159] стрессу, вызванному засухой и охлаждением Устойчивость к высоким температурам Cheng et al., 2009 [52] Устойчивость к охлаждению Park et al., 2004 [184] Устойчивость к засухе Vannini et al., 2007 [251] Устойчивость к солевому стрессу Устойчивость к солевому стрессу Zhang and Blumwald, 2001 [272] Orsini et al., 2010 [180] Устойчивость к солевому стрессу Sade et al., 2010 [214] Устойчивость к солевому стрессу Gisbert et al., 2000 [93] 40 Ген, продукт гена и его функция CaKR1 Анкириновый повтор домена цинковых пальцев Влияет на систему антиоксидантов Осмотин Аккумуляция осмотина Фенотип (устойчивость) Источник Устойчивость к солевому и окислительному Seong et al., 2007 [222] стрессам Устойчивость к засухе и солевому стрессу Goel et al., 2010 [95] 41 1.6. Заключение по обзору литературы Технологические подходы, применяемые в генетической инженерии для получения томатов, толерантных к абиотическим стрессам рассматриваются как привлекательная альтернатива обычной селекции. Достижения трансформации молекулярной генетической растений природы инженерии способствовали защитных в технике прогрессу механизмов и в генетической установлении идентификации генов, ферментов или соединений, осуществляющих вклад в толерантность растений к различным абиотическим стрессам. Таким образом, становится возможным обеспечить разработку новых стратегий устойчивости растений к воздействию стрессовых факторов. В связи с тем, что воздействие абиотических стрессов сопровождается образованием АФК, широкую перспективу открывает применение различных ферментов и окислительного соединений, нейтрализующих стресса. литературным По повреждающее данным показано действие успешное применение суперэкспрессии антиокислительных ферментов [240, 22, 209]. Весьма эффективно использование таких соединений для защиты отдельных клеточных структур и компартментов от деструктивного влияния окислительного стресса. В ряде случаев весьма эффективным для защиты растения от абиотических стрессоров оказалось использование генов, кодирующих СОД [42, 190, 153, 30, 88, 260]. Поскольку АФК нарушают структуру и функции фотосинтезирующих мембран в первую очередь в защите нуждаются мембранные органоиды клетки. Поэтому особый интерес вызывает суперэкспрессия и перенаправление СОД в пластиды и митохондрии. Логично предположить, что сдвиг равновесия в системе АФК/СОД в сторону СОД может привести к “выключению” деструктивной функции АФК, что, в свою очередь, должно сказаться на макромолекулярной организации фотосинтезирующих систем хлоропластов. 42 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Растительный материал В экспериментальной работе были использованы асептические проростки томата (Solanum lycopersicum L.) сортов Белый налив 241 и Взрыв, полученные из семян, а также стерильные растения табака обыкновенного (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Сорт Самсун - растение цилиндрической формы. Высота в среднем 100-150 см. Листья черешковые, пластинка у них широкоовальная или овальная, сердцевидная у основания. Лист эластичный, смолистый, темно-зеленый. Цветы яркие, от розового до красного цвета. Сорт Белый налив 241 выведен на Овощной станции имени В.И.Эдельштейна РГАУ МСХА им.К.А.Тимирязева путем скрещивания сортов Гибрид № 14-22 (Пушкинский х Виктор) х Маяк 12/20-4 (авторы А.В.Крючков, Г.И.Тараканов, М.Д.Панова). Сорт раннеспелый, плоды округлые, красные, массой 80-132 грамм, среднеустойчив к фитопатогенам (вирусным и грибным заболеваниям), холодостойкий, предназначен для открытого грунта и пленочных теплиц. Сорт Взрыв - раннеспелый (93-100 дней) высокоурожайный, для открытого грунта. Куст детерминантный, высотой 40-45 см. Плоды округлые массой 120-150 грамм. Томат взрыв является улучшенным вариантом продуктивного сорта Белый налив. Данный сорт помидоров отличается от других не только своей раннеспелостью, но и повышенной холодостойкостью. Особая ценность этого сорта заключается в повышенной устойчивости растения к различным заболеваниям томатов, в частности, к фитофторозу. 2.2 Введение томата и табака в культуру in vitro Семена томата и табака стерилизовались диацидом (состав: 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида на 1 л воды, добавляют 43 несколько капель детергента твин - 80) на протяжении 7 минут, затем трижды промывались стерильной дистиллированной водой. В качестве эксплантов для индукции регенерации побегов томата сортов Белый налив 241 и Взрыв были использованы семядоли, сегменты гипокотиля и стебля, а также фрагменты настоящих листьев. Культивирование эксплантов осуществляли на модифицированной агаризованной среде МS [165] с различным содержанием регуляторов роста (таблица 2) [13]. Донорные растения и экспланты культивировали в климокамере Fitotron H-600 при температуре 25°С с 16-часовым световым режимом. Питательные среды стерилизовались автоклавированием при давлении 1 атм. в течение 25 минут. Фитогормоны стерилизовались фильтрованием (Millipore, 0,22 мкм). Таблица 2. Состав фитогормонов в питательных средах для регенерации растений томата на основе MS Вариант Тип регулятора роста Концентрация, мг/л питательной среды 6 БАП 5,0 1 ИУК 0,2 Зеатин рибозид 1 2 ИУК 0,1 6 БАП рибозид 2,5 3 НУК 0,1 6 БАП рибозид 5 4 ИУК 0,2 Оценка эффективности регенерации была проведена путем подсчета соотношения количества эксплантов с побегами к общему количеству эксплантов. 2.3 Конструкция для агробактериальной трансформации растений Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, содержащий плазмиду pBI-FeSOD. тДНК плазмиды (рис. 1) содержит ген Fe- 44 SOD1, кодирующий цитоплазматическую Fe-содержащую супероксиддисмутазу из Arabidopsis thaliana L. с сигнальной последовательностью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.), обеспечивающую накопление продукта в пластидах. Ген FeSOD1 находится под контролем сильного конститутивного промотора CaMV 35S и терминатора NOS. Кроме того, тДНК содержит селективный ген nptII, обуславливающий устойчивость к канамицину, под контролем NOS промотора и терминатора. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, содержащий плазмиду pBI-FeSod на основе стандартного экспрессионного вектора pBI (Van Camp W., Bowler C. Et al.1990) с целевым геном Fe-содержащей супероксиддисмутазы из Arabidopsis thaliana, придающий устойчивость к повреждающему действию окислительного стресса. Клетки бактерий культивировали на стандартной агаризованной среде LB при температуре 280С. В среду добавляли антибиотики рифампицин (50 мг/л) для избирательного роста агробактерий и канамицин (50 мг/л) как селективный маркер. В экспрессионной конструкции (рисунок 1) ген Fe-SOD находится под контролем конститутивного промотора CaMV 35 S и терминатора NOS. В Тобласти вектора также встроен ген неомицинфосфотрансферазы II (NPTII) для селективного отбора эксплантов. Рисунок 1. Схема области Т-ДНК векторной конструкции pBI-FeSOD. Обозначения: Fe-SOD1 – целевой ген, кодирующий Fe-зависимую супероксиддисмутазу; Signal – сигнальная последовательность гена rbsc гороха, направляющая супероксиддисмутазу в хлоропласт; 35S promoter – промотор 35S 45 РНК вируса мозаики цветной капусты; NOS promoter и NOS terminator – промотер и терминатор гена нопалинсинтазы; nptII – ген неомицинфосфотрансферазы II E. coli; RB и LB –левая и правая последовательности, ограничивающие Т-область. 2.4 Агробактериальная трансформация Процедура агробактериальной трансформации табака проведена путем сокультивирования листовых дисков с Agrobacterium tumefaciens по стандартной методике [9]. Для последующей регенерации растений табака листовые экспланты помещали на питательную среду MS с добавлением соответствующих растительных гормонов (НУК 0,1 мг/л, 6-БАП 1 мг/л) и селекционного агента. Для проведения экспериментов трансформанты размножали с помощью микроклонирования. Агробактериальную трансформацию томата осуществляли, как было предложено McCormick с соавторами с внесением некоторых модификаций [152]. Прекультивирование эксплантов осуществляли на агаризованной среде MS с добавлением 5 мг/л БАП рибозида и 0,2 мг/л ИУК в темноте в течение 2 суток, после чего лезвием скальпеля на экспланты наносили насечки. Экспланты переносили в колбу с ночной культурой клеток Agrobacterium tumefaciens, разбавленной в соотношении 1:20 жидкой средой MS, с добавлением экссудат табака [12]. Для определения оптимальной концентрации агробактерий в ночной культуре проводили титрование и дальнейшее измерение оптической плотности при длине волны 550 Нм [79]. Далее колбу помещали на шейкер и в течение 2 ч осуществляли cокультивирование. Впоследствии экспланты подсушивали на стерильной фильтровальной бумаге и переносили на чашки Петри с агаризованной средой MS. Последующее сокультивирование проводили в темноте при комнатной температуре в течение 2 сут до появления бактериального ореола. После сокультивирования с агробактерией экспланты отмывали в стерильной дистиллированной воде и помещали на агаризованную среду MS с 46 добавлением 5,0 мг/л 6-БАП рибозида, 0,2 мг/л ИУК и 200 мг/л тиментина с целью подавления роста и размножения агробактерии [53]. При последующем субкультивировании в питательную среду добавляли селективный антибиотик (30 мг/л канамицина во втором пассаже, 50 мг/л – в последующих пассажах). Регенеранты пересаживали индивидуально в пробирки с агаризованной средой MS, содержащей 1/2 макро- и микроэлементов, а также 0,1 мг/л ИМК и 100 мг/л канамицина для инициации корнеобразования. Укоренившиеся на селективной среде побеги клонально размножали методом черенкования. Растения адаптировали к почвенном условиям и выращивали в условиях защищенного грунта. На рисунке 2 представлена схема манипуляций, проводимых при агробактериальной трансформации растений томата. Рисунок 2. Схема манипуляций, проводимых при агробактериальной трансформации растений томата. Этапы агробактериальной трансформации: 1.Стерилизация семян. 2.Получение асептических проростков на агаризованной среде MS, содержащей 1/2 концентрацию макро- и микроэлементов. 3-4. Прекультивация эксплантов (фрагментов листа и гипокотилей) на среде MS, с добавлением рибозид 6-БАП и ИУК в концентрациях 5 мг/л и 0,2 мг/л соответственно. 47 5. Инокуляция и сокультивирование с агробактерией, содержащей векторную конструкцию с геном Fe-SOD1. 6. Элиминация агробактерии на неагаризованной среде с антибиотиком тиментином (300 мг/л). 7-9. Регенерация и отбор устойчивых к канамицину побегов томата и табака (Кm 30 – 50 мг/л). 10-11. Укоренение регенерантов на среде для ризогенеза (Кm 50 мг/л). 12. Адаптация регенерантов к почвенным условиям. 2.5 Анализ наследования селективного гена NPT II в первом трансгенном поколении табака и томата Семена табака и томата, полученные в результате самоопыления, вводили в культуру in vitro на селективную питательную среду MS, содержащую канамицин в концентрации 100 мг/л. Оценку устойчивости осуществляли через 4 недели селекции. Анализ наследования гена неомицинфосфотрансферазы II осуществлялся путем подсчета канамицин устойцивых и канамицин чувствительных проростков. Достоверность расщепления рассчитывалась путем статистической обработки, применяя критерий Пирсона (хи-квадрат) [8]. 2.6 Молекулярно – генетический анализ трансформантов 2.6.1 Экстракция бактериальной и плазмидной ДНК Тотальная геномная ДНК Agrobacterium tumefaciens экстрагировалась с использованием метода, описанного Arlene A. Wise [262]. Плазмидная ДНК выделялась с использованием метода щелочного лизиса [35]. 48 2.6.2 Экстракция тотальной геномной ДНК растений Выделение ДНК осуществлялось набором реагентов «Проба ЦТАБ» производства «ДНК-технологии» по инструкции производителя (ООО «ДНКТехнология», Москва). В качестве проб использовали кусочки молодых листьев массой 100-200мг. 2.6.3 Полимеразная цепная реакция Присутствие привнесенных целевого и селективного генов осуществлялось с помощью ПЦР. Амплификационная смесь содержала: 100 нг ДНК, 3 mМ MgCl2, 250 μМ dNTPs, 0,25 μМ прямого и обратного праймеров, 1x буфер для ПЦР и 1 ед. Taq-полимеразы. Реактивы для ПЦР были любезно предоставлены лабораторией молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ РАСХН. Синтез олигонуклеотидов был осуществлен ЗАО Синтол (Россия). Для амплификации последовательности гена Fe-SOD1 было подобрано два специфических праймера: FeS1 (5’_ACCTCCATTCGCACTGGATGCTTT_3’) и FeS2 (5’_TTCGGTGATGCAGAACTCACTGT_3’). Размер ампликона составляет 645 п.о. Для проведения ПЦР была использована следующая программа амплификации: 1) 94°С – 3 мин.; 2) 40 циклов: 94°С – 45 сек.; 60°С – 45 сек.; 72°С – 1 мин. 30 сек.; 3) 72°С – 10 мин. Отсутствие бактериальной контаминации полученных трансформантов проверяли с использованием праймеров на нуклеотидную последовательность гена virD2, входящего в состав (5'_GAACCAAGACCCTTCAGCA_3') резидентной Ti-плазмиды: и virD2F virD2R (5'_ATCCAGGACTATGCCGTGAC_3'). Размер ампликона составляет 491 п.о. ПЦР проводили в условиях, приведенных выше, при температуре отжига, равной 55°С. Присутствие селективного гена npt II подтверждали с помощью праймеров 5'_AACCAGACCAGACCACGGACCCCGACCTGTCCGGTGCCC_3' и 49 5'_AACCAGACCAGACCACGGACCCCGCCACACCAGCCGGCC_3'. Размер амплифицируемого фрагмента составляет 550 п.о. ПЦР проводили при температуре отжига праймеров, равной 60°С. Экспрессию гена Fe-SOD1 подтверждали с помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли с использованием набора реагентов «ПРОБА-НК-ПЛЮС» (ДНК-Технология, Россия) согласно инструкции производителя. кДНК синтезировали с олигоdT праймерами, обратную транскрипциию проводили в буфере, содержащем ингибитор РНКаз, смесь dNTP и обратную транскриптазу M-MLV. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР с праймерами, комплементарными последовательности гена Fe-SOD1. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. Длину амплифицированных участков определяли с помощью маркера GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas, Литва). 2.6.4 Выделение РНК и обратная транскрипция Экспрессию гена Fe-SOD1 подтверждали с помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли с использованием набора реагентов «ПРОБА-НК-ПЛЮС» (ДНК-Технология, Россия) согласно инструкции производителя. кДНК синтезировали с олигоdT праймерами, обратную транскрипциию проводили в буфере, содержащем ингибитор РНКаз, смесь dNTP и обратную транскриптазу M-MLV. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР с праймерами, комплементарными последовательности гена Fe-SOD1. 50 2.6.5 Электрофорез продуктов амплификации Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. Элетрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза Sub Cell GT System производства Bio-Rad. В лунки вносили 5 мкл образца, смешанного с буфером для нанесения (6X DNA Loading Dye -10mM Tris-HCl (pH7.6), 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60mM EDTA). Длину амплифицированных участков определяли с помощью маркера молекулярных длин GeneRuler 100 bp DNA Ladder производства Fermentas (Литва). Просмотр окрашенных гелей после электрофореза осуществлялся в УФ – свете трансиллюминатора. 2.7 Измерение активности антиокислительных ферментов Клонированные трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген FeSOD1, снабженные сигнальной последовательностью, направляющей фермент в хлоропласт, в течение 2-х недель выращивали в контролируемых условиях при средней интенсивности света 50 Вт/м2, температуре 25±2оС и влажности воздуха – 60-70%. Затем растения извлекали из пробирок и измеряли активность супероксиддисмутазы и аскорбатпероксидазы. В следующей серии экспериментов листья клонированных трансгенных растений, облучали 40 минут ультрафиолетом (УФ-А), после чего измеряли активность фотосинтетического аппарата путем полярографического определения скорости фотосинтеза по О2 газообмену и методом замедленной флуоресценции. 2.7.1 Получение грубых гомогенатов и ферментативных экстрактов Исследования интенсивности перекисных процессов и активности антиоксидантных ферментов проводили в гомогенатах и ферментных экстрактах из листьев контрольных и опытных растений. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли в листьях контрольных и опытных растений. Для этого 0.5 г 51 материала растирали в ступке с 4.5 мл охлажденного 30 мМ К/Na_фосфатного буфера (рН 7.4), содержащего 0.1 мМ EDTA и 2% поливинилпирролидон (мол.масса 25000 а.е.м ). Гомогенат фильтровали через капроновую ткань и центрифугировали при 11000 g в течение 20 мин. Супернатант, разбавленный в 20 раз, использовали в качестве ферментативного экстракта для определения активности СОД. 2.7.2 Определение активности ферментов Активность супероксиддисмутазы определяли методом Giannopolitis и Ries [91] по фотовосстановлению п-нитротетразолиевого синего (NBT) (мол. масса 817.68) в присутствии рибофлавина и метионина, генерирующих супероксидные анион_радикалы NBT восстанавливается до синего формазана с максимумом поглощения при 560 нм. Реакционная смесь (3 мл) содержала 1.3 мкМ рибофлавин, 13 мМ метионин, 63 мкМ NBT в 0.05 М K/Na_фосфатный буфер с 0.10 мМ EDTA, рН 7.4 и 0.1 мл ферментативного экстракта. Образцы освещали в течение 6 мин. Измерения проводилина спектрофотометре “Hitachi 557”. За единицу активности SOD принимали объем ферментативного экстракта, который вызывал 50% ингибирование фотовосстановления NBT. Активность аскорбатпероксидазы оценивали методом Nakano and Asada [168] по снижению поглощения при 290 нм при окислении аскорбата (коэффициент экстинции 2,8 мМ.см-1). Реакционная смесь для определения АсП активности содержала 25 мМ К/Na- фосфатный буфер (рН-7,4), 0,5 мМаскорбат, 0,1 мМ ЭДТА и ферментативный экстракт. Реакцию начинали введением 0,1 мл 0,1 мМ перекиси водорода. Полученные результаты по активности ферментов рассчитывали на грамм сырой биомассы листьев. Аналитическая повторность в эксперименте была 4 -5 кратная. Биологическая повторность 2 -3 кратная. В расчеты брали данные одного биологического эксперимента. Статистическую обработку проводили с помощью программы «Статистика». 52 2.7.3 Анализ кислородного газообмена и переменной флуоресценции Фотосинтетическое выделение O2 образцов, из листьев томатов проводили в 5-мл термостатированной ячейке со стандартным платиновым электродом Кларка при интенсивности света 1200 мкмоль фотонов ∙ м-2 ∙ с-1 и температуре 25°C. В исследованиях использовали 50 мМК-фосфатный буфер (рН 7,5). Перед началом измерений в раствор добавляли избыточное количество бикарбоната натрия, достаточное для снабжения фотосинтетической реакции источником углерода (0,1 мл 0,5 М NaHCO3). Измерение скорости фотосинтеза проводили с помощью полярографа LP-7E (CzechRepublic). Активность фотосистемы 2 измеряли с помощью метода переменной флуоресценции. Переменная флуоресценция- интенсивностями флуоресценциихлорофилла это при разница закрытых между и открытых реакционных центрах; является характеристикой активности начальных стадий фотосинтеза [16]. Флуоресценцию возбуждали светом с λм =480 нм. Интенсивность света на уровне поверхности листа была 30 В/м-2. Перед проведением измерений листья экспонировали в темноте в течение 15 минут. Для регистрации использовали интерференционный светофильтр (λм = 685, полуширина полосы 10 nm) и монохроматор (∆λ = 1nm) с фотоумножителем ФЭУ 119. Сигнал регистрировали с помощью запоминающего осциллографа (Tektronix, USA) или быстро регистрирующего самописца Endim 322-01M (VEBMS, FRG). Измеряли F0, Fv, и рассчитывали Fv/(F0+Fv) – флуоресцентное отношение (F0фоновая флуоресценция, Fv- переменная флуоресценция). 2.8 Электронная микроскопия Клонированные трансгенные растения томата, экспрессирующие цитоплазматическую FeSOD в течение 2-х недель выращивали в контролируемых условиях при средней интенсивности света 50 Вт/м2, температуре 25±2оС и влажности воздуха – 60-70%. Затем растения помещали на ½ среды MS c 53 добавлением солей, выровненных по осмотическому давлению до 400 кПа (NaCl и Na2SO4) на 7 суток. Концентрация была выбрана исходя из результатов предварительных экспериментов, как вызывающая сильное замедление прорастания [4]. После чего кусочки листа растений фиксировали для электронномикроскопического анализа. Фрагменты центральной части листа растений, выращенные в культуре in vitro, использовали в качестве образцов для фиксации. Бритвой вырезали кусочки 1 ммЗ при этом погружали фрагменты растения на охлажденный столик в 0,1М фосфатном буфере, затем фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида (Sigma) на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,3 с добавлением сахарозы 0,15 мг/мл в течение 4- 8 часов в холодильнике при +4°С. После данной процедуры образцы промывали 0,1М буфером Зоренсена и дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия (OsO4) в течение 2 часов при +4°С. Материал обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации при +4°С. Использовали следующую схему: 30% (30 ми-нут)=>50% (30минут)=>70% (30 минут)*=>96%(30 минут)**=>абсолютный этанол (30 минут), далее образцы помещали в окись пропилена( * -при необходимости можно хранить до нескольких месяцев при +4°С. **- далее растворы имеют комнатную температуру). Заключение образцов в смолу проводилось в несколько этапов. Использовалась смесь эпона с аралдитом и окись пропилена в следующих концентрациях: 1/5; 2/3; 1/1; 3/2; 5/1. В каждой смене образцы выдерживались по 40 минут. Затем материал переносили в плоские пластиковые заливочные формы и заливали смолой с катализатором. Полимеризацию проводили в 2 этапа: сутки 370С, сутки 560С. После полимеризации образцы вырезали и приклеивали на пирамидки из эпоксидной смолы при помощи смолы, сохраняя для резки ориентацию поперечных срезов. 54 Перед микротомированием образец затачивался под лупой в форме усеченной пирамиды с площадью среза 1-2 (2-3) мм2. Далее образец помещали в держатель микротома и ориентировали длинную сторону параллельно горизонту, ориентируясь по режущей кромке стеклянного ножа. Ультратонкие стрезы толщиной 400-450 (серый срез) получали на микротоме LKB-5(Швеция) при помощи алмазного ножа с углом 43,5. Далее срезы помещали на медные сеточки 200 меш с формваровой или порлодиевой подложкой. После чего срезы контрастировали 1% уранилацитатом (45 минут), далее промывали и контрастировали раствором цитрата свинца по Рейнольдс [201] (40 минут) и также тщательно промывали в свежеперегнанной дистилированной воде. После подсушивания препараты просматривали в электронном трансмиссионном микроскопе Hitachi H-500 при рабочем увеличении 10000. Полученные снимки оцифровывали (сканировали на EpsonPerfection 3170) разрешение 600 dpi. Для обработки изображений использовали программу MicrosoftPhotoEditor и CorelDRAW. 2.9 Цитофотометрический анализ Для проведения цитофотометрического анализа кончики корней (0,5 - 0,7 см) трансгенных и контрольных растений фиксировали в смеси этанола и уксусной кислоты (в соотношении 3:1) в течение 3 ч. Зону корневой меристемы (до 1-2 мм) отделяли и помещали на 2 ч при 37оС в мацерирующую смесь, содержащую 0,4 % целлюлазы ("Sigma", США) и 0,4% пектиназы ("Merk"), затем окрашивали по методу Фельгена (реактив Шиффа, "Мегк") в течение 2 ч (время гидролиза в 5N НСl при 22оС 40 мин) и готовили постоянные препараты. Для определения относительного содержания ДНК ядра меристематических клеток измеряли на цитофотометре SMP-20 (Opton) с объективом х16, окуляром х10 и зондом 0,16 мм. В качестве стандарта использовали ядра меристематических 55 клеток корня в стадиях телофазы (2C) или метафазы (4С). Выборка для каждой экспериментальной точки составляла не менее 300 ядер из клеток 10 корешков. На постоянных препаратах корневых меристем определяли встречаемость отдельных фаз митоза и митотический индекс по стандартной методике [7]. Данные анализировали в программе «Статистика 5,0», для визуализации использовали гистограммы, построенные в программе Excel. Значение митотического индекса вычисляли по формуле: , где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, анафазы и телофазы, а N — общее число проанализированных клеток [15]. 56 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Агробактериальная трансформация и отбор генетически модифицированных растений 3.1.1 Изучение регенерационного потенциала томата сортов Белый налив 241 и Взрыв Важным этапом перед процедурой агробактериальной трансформации растений является изучение регенерационного потенциала различных типов эксплантов растений и подбор питательной среды с наилучшими показателями регенерации. Была проведена серия экспериментов по изучению способности к образованию регенерантов различных типов эксплантов растений томата сортов Белый налив 241 и Взрыв. В качестве эксплантов были использованы: семядоли и сегменты гипокотиля, полученные от 14-суточных проростков, сегменты листовых дисков и фрагменты стебля от растений, культивируемых в условиях in vitro. Изучение регенерационной активности осуществлялось путем выращивания эксплантов на модифицированной среде МS с различным содержанием регуляторов роста [11]. Оценка проводилась путем подсчета количества образовавшихся регенерантов на разных составах сред и на разных типах эксплантов через 35 суток культивирования. Из представленных данных (таблица 3) можно оценить регенерационный потенциал различных типов эксплантов томата сорта Белый налив 241 на различных средах. Лучшими показателями обладал гипокотиль(90% эксплантов образовали побеги). Известно, что экспланты, полученные из тканей ювенильных растений, обладают наивысшим регенерационным потенциалом [18]. Стеблевые экспланты обладали достаточно высоким регенерационным потенциалом: 72% эксплантов давали побеги на среде, содержащей 6 БАП-Р (5 мг/л) и ИУК(0,2 мг/л). Из данных таблицы 3 очевидно, что замена 6-БАП на 6-БАП-рибозид в той же концентрации (5 мг/л) существенно повышает количество регенерантов у всех 57 типов эксплантов, кроме семядолей. На среде с зеатин – рибозидом отмечена высокая регенерация эксплантов. Таблица 3. Изучение регенерационной способности побегов томата сортов Белый налив 241 и Взрыв в культуре in vitro. Эксплант Регуляторы роста и концентрация (мг/л) лист гипокотиль 6-БАП (5,0) ИУК (0,2) семядоли стебель лист Зеатин гипокотиль рибозид (1,0) семядоли ИУК 0,1 стебель лист 6-БАП гипокотиль рибозид (2,5) семядоли НУК 0,1 стебель лист 6-БАП гипокотиль рибозид (5,0) семядоли ИУК (0,2) стебель Белый налив 241 Частота Количество регене- регенерантов рации на эксплант (%) (шт.) 52,6 3,16±1,43 35,0 2,41±0,98 57,1 3,34±1,47 61,2 3,11±1,24 50,5 3.29±1,53 90,5 3,71±1,65 50,0 3,60±1,78 58,8 3,45±1,56 75,0 2,71±1,27 18,2 3,67±1,79 46,7 1,94±0,98 66,4 2,75±0,87 62,5 3,42±1,34 63 3,11±1,77 50,3 3,28±0,98 72,31 3,55±1,74 Взрыв Частота Количество регене- регенерантов рации на эксплант (%) (шт.) 22,2 1,55±0,95 33,3 2,2±1,23 31,6 1,83±0,75 47,2 1,25±0,95 20,8 2,6±1,34 27,8 2,2±1,09 25 3,01±1,33 44,4 2,44±1,2 32,3 2,35±0,92 66,7 5,88±2,70 76,5 2,64±1,58 51,1 2,62±0,64 40,9 2,17±1,13 52,9 2,83±1,06 63,6 1,43±0,53 55,2 3,24±1,64 В таблице 3 представлены результаты по оценке регенерационного потенциала различных типов эксплантов сорта Взрыв. Гипокотили и семядоли показали довольно высокий потенциал регенерации. Из данных таблицы видно, что увеличение концентрации 6-БАП-Р от 2,5 до 5,0 мг/л приводит к снижению регенерации у всех типов эксплантов. Наибольший процент эксплантов, образующих регенеранты составил: для гипокотилей (66,7%) и семядолей(76,5 %) на среде с 6 БАП рибозидом -2, 5 мг/л, НУК – 0,1 мг/л (таблица 3). 58 Отмечено, что преобладание в составе среды цитокининов над ауксинами способствует более высокому выходу регенерантов. Наилучшими показателями регенерации обладает гипокотиль, однако наиболее удобными для нас эксплантами для агробактериальной трансформации являются фрагменты листа и стебля, поскольку их можно получить от растений, культивируемых в условиях in vitro. Необходимость в большом количестве эксплантов для трансформации связана с тем, что на этапе отбора регенеранты подвергаются негативному влиянию различных факторов: угнетение роста и снижение регенерации под действием агробактерии и селективных агентов. На рисунке 3 представлены различные типы эксплантов томата обоих сортов на среде с лучшими показателями регенерации (6 БАП рибозид -2, 5 мг/л, НУК – 0,1 мг/л). А Б В Д Е Ж Г З Рисунок 3. Регенерация побегов томата сортов Белый налив 241 (А, Б, В, Г) и Взрыв (Д, Е, Ж, З) из различных типов эксплантов при культивировании на среде MS с добавлением 6 БАП-Р 5,0 мг/л и ИУК 0,2 мг/л. А, Д - побеги, полученные из листовых эксплантов; Б, Е - из гипокотиля; В, Ж - из семядолей; Г, З - из фрагментов стебля. 59 Экспланты фрагментов стеблей показали наиболее высокую регенерационную способность на среде, содержащей 6 БАП- R 5,0 мг/л и ИУК 0,2 мг/л, которая в дальнейшем использовалась нами в процессе трансформации растений. Таким образом, нами был изучен регенерационный потенциал томатов сортов Белый налив 241 и Взрыв и подобрана среда с наивысшими показателями регенерации эксплантов (6 БАП- R 5,0 мг/л и ИУК 0,2 мг/л). 3.1.2 Первичная оценка трансформантов В работе было получено 520 готовых к трансформации эксплантов сорта Белый налив, 120 эксплантов сорта Взрыв и 150 эксплантов табака сорта Самсун. После процедуры сокультивирования эксплантов с Agrobacterium tumefaciens, их пересаживали на агаризованную среду МS для последующей регенерации побегов с добавлением тиментина (200мг/л) для элиминации A. tumefaciens. Со второго пассажа в питательную среду добавляли селективный антибиотик канамицин культивировании в концентрации концентрация 30 увеличивалась мг/л. до 50 При дальнейшем мг/л. Повышение концентрации селективного антибиотика проводили постепенно, это связано с тем, что высокие концентрации канамицина угнетают процесс регенерации. Образовавшиеся индивидуальные побеги были перенесены на среду для ризогенеза, дополненную разную канамицином и тиментином. Побеги проявляли степень устойчивости к антибиотику, чувствительные к канамицину проявляли признаки хлороза и постепенно отмирали (рисунок 4). 60 А Б В Г Д Е Рисунок 4. Канамицин-устойчивые(А,Г) и канамицин-чувствительные (Б, В, Д, Е) побеги табака сорта Самсун (А, Б, В) и томата сортов Белый налив 241 (Г, Д) и Взрыв (E) на среде , дополненной канамицином (50 мг/л) и тиментином (200 мг/л). В процессе селекции на канамицине в течение одного месяца было отобрано: 51 канамицин-устойчивое растение томата сорта Белый Налив, 12 растений сорта Взрыв и 45 растений табака (таблица 4). Эффективность селективного отбора на канамицине была очень низкой и составила: для томата сорта Белый налив 241 – 16%, томата сорта Взрыв – 19% и табака сорта Самсун – 64%. 61 Таблица 4. Количество канамицин-устойчивых (Km R-) и канамицин-чувствительных (Km S-) регенерантов томата (Белый налив, Взрыв) и табака (Самсун). Растительный объект Томат Табак Cорт Количество Количество Соотношение RKm Km R- / Km S-, Km Sрегенерантов регенерантов % Белый налив 51 314 16 Взрыв 12 63 19 Самсун 45 70 64 Таким образом, в результате агробактериальной трансформации были получены канамицин-устойчивые растения табака и томата. Затем растения проходили молекулярно-генетический анализ с применением метода полимеразной цепной реакции. 3.1.3 Молекулярно-генетический анализ канамицин – устойчивых побегов томата и табака Отобранные канамицин-устойчивые растения проверяли на присутствие в геноме и экспрессию целевого гена Fe-SOD1 и присутствие маркерного гена NPT II при помощи ПЦР. По результатам анализа с помощью ПЦР была показана интеграция целевого гена Fe-SOD1 в геном 16 растений томата сорта Белый налив 241 (рисунок 5А), 4 растений сорта Взрыв (рисунок 5Г) и 20 растений табака сорта Самсун (рисунок 5Г). Для всех растений, содержащих в геноме целевой ген, было выявлено присутствие маркерного гена NPT II (рисунок 5Б, 5Д). Отсутствие контаминации A.tumefaciens было проверено при амплификации с 62 использованием специфических праймеров на ген vir D2, ни одного положительного растения обнаружено не было (рисунок 5В, 5Е). 645 bp А Г 645 bp 550 bp Б 550 bp Д 491 bp 491 bp В Е Рисунок 5. Молекулярно-генетический анализ: А – Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК растений томата, подтверждающая присутствие гена Fe-SOD1. Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-7 – ПЦР-положительные растения по гену Fe-SOD1 (645 bp); 8 – контрольное нетрансгенное растение; 9 – H2O (контроль чистоты реагентов); 10 – положительный контроль (плазмидная ДНК). Б – Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК растений томата, подтверждающая присутствие гена NPT II. Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-8 – трансгенные растения томата; 11 – контрольное нетрансгенное растение; 10 – H2O; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК). 63 В – Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК растений томата, подтверждающая присутствие гена vir D2.Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-8 – трансгенные растения томата; 10 – контрольное нетрансгенное растение; 11 – H2O; 9 – положительный контроль (ДНК агробактерии). Г – Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК табака и томата сорта Взрыв, подтверждающая присутствие гена Fe-SOD1. Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-9, 11-13, 17 – ПЦР-положительные растения по гену Fe-SOD1 (645 bp); 10 – контрольное нетрансгенное растение; 18 – H2O (контроль чистоты реагентов); 19 – положительный контроль (плазмидная ДНК); 14-16 – нетрансгенные растения. Д – Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК растений томата, подтверждающая присутствие гена NPT II. Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-8 – трансгенные растения томата; 11 – контрольное нетрансгенное растение; 10 – H2O; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК). Е – Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК растений томата, подтверждающая присутствие гена vir D2. Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-8 – трансгенные растения томата; 10 – контрольное нетрансгенное растение; 11 – H2O; 9 – положительный контроль (ДНК агробактерии). В результате проведенных исследований было отобрано 16 растений томата сорта Белый налив, 4 растений сорта Взрыв и 20 растений табака сорта Самсун. 3.1.4 Оценка эффективности агробактериальной трансформации Была проведена оценка эффективности трансформации растений путем подсчета эксплантов на разных этапах процесса. Итоговое значение было вычислено посредством выяснения соотношения количества эксплантов с подтвержденным трансгенным статусом (с экспрессией целевого гена) к исходному количеству эксплантов. В результате отбора на канамицине и проведенных молекулярногенетических анализов эффективность агробактериальной трансформации табака 64 сорта Самсун и томата сортов Белый налив 241 и Взрыв составила, соответственно, 4, 5 и 17% (таблица 5). Самая высокая эффективность трансформации была выявлена у растений табака. Известно, что табак является модельным растением для агробактериальной трансформации и обладает высоким регенерационным потенциалом. Несмотря на то, что процесс отбора на канамицине был неэффективным, процент эффективности трансформации для выбранных растительных объектов достаточно высок (таблица 5). 65 Таблица 5. Эффективность агробактериальной трансформации томата (сорта Белый налив, Взрыв) и табака (сорт Самсун) при использовании векторной конструкции pBI Fe-SOD. Кол-во эксплантов Объект Сорт общее шт. Томат Табак % с регенерацией Регенеранты без регенерации чувствительные KmS ПЦР устойчивые KmR шт. % шт. % шт. % шт. % шт. % Эффективность, % Белый налив 520 100 365 70 155 30 314 86 51 14 16 31 4 Взрыв 120 100 75 62,5 45 37,5 63 84 12 16 4 33 5 Самсун 150 100 115 77 35 23 70 61 45 39 20 44 17 66 3.1.5 Анализ экспрессии целевого гена Fe-SOD1 методом ОТ-ПЦР Трансгенные растения томата (сорта Белый налив 241 и Взрыв) и табака (сорт Самсун) проверялись на наличие экспрессии целевого гена с помощью обратной транскрипции и последующей ПЦР. В итоге проверки было отобрано 13 растений томата сорта Белый налив 241 (рисунок 6А), 2 растения томата сорта Взрыв и 6 растений табака сорта Самсун (рисунок 6Б). 645 bp 645 bp А Б Рисунок 6. Электрофореграмма продукта амплификации к-ДНК растений томата (сорта Белый налив 241 и Взрыв) и табака (сорт Самсун). Обозначения: А – ОТ-ПЦР-электрофореграмма продукта амплификации к-ДНК растений томата сорта Белый налив, подтверждающая присутствие гена Fe-SOD1.Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1 – контрольное нетрансгенное растение; 2-8 – трансгенные растения томата; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК). Б – ОТ-ПЦР-электрофореграмма продукта амплификации к-ДНК растений табака и томата сорта Взрыв, подтверждающая присутствие гена Fe-SOD1. Обозначения: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1, 3-5, 7-9 – трансгенные растения; 2 – контрольное нетрансгенное растение; 6 – нетрансгенное растение; 10 – положительный контроль (плазмидная ДНК). Таким образом, был осуществлен анализ с помощью обратной транскрипции и последующей ПЦР и отобраны растения, в которых присутствует экспрессия целевого гена Fe-SOD1 (таблица 6). 67 Таблица 6. Анализ экспрессии целевого гена в растениях томата и табака. Объект Томат Табак Кол-во ПЦР +, шт. Сорт ОТ-ПЦР + – Шт % Шт % Белый налив 16 13 81 3 19 Взрыв 4 2 50 2 50 Самсун 20 6 30 14 70 3.1.6 Адаптация и выращивание в условиях защищенного грунта трансгенных растений томата и табака, экспрессирующих ген Fe-SOD1. Анализ семенного поколения Для последующих экспериментов были отобраны четыре линии растений томата Белый налив 241 (линия 4, 8, 19, 6) и три линии табака (№10,1,8); растения были посажены в почву с целью получения первого поколения и изучения наследования целевого гена. Трансгенные растения томата и табака были успешно адаптированы к условиям закрытого грунта (рисунок 7). А Б 68 В Г Рисунок 7. Адаптация трансгенных растений табака и растений томата к условиям защищенного грунта: А – растение на среде для укоренения; Б – растение адаптированное к условиям in vivo; В – пробирочные растения томата с развитой корневой системой; Г – растения, адаптированные к условиям in vivo. Растения были выращены до стадии плодоношения (рисунок 8) и было получено первое семенное поколение. А Б 69 Г В Рисунок 8. Трансгенные растения табака (А, Б) и томата (В, Г) на стадии цветения (А, В) и плодоношения (Б, Г). В итоге растения табака сорта Самсун и томата сорта Белый налив 241 были адаптированы к выращиванию в условиях in vivo и было получено первое семенное поколение. Нами были получены жизнеспособные семена трёх трансгенных линий томата (№4, 8,19) и трех линий табака(№ 1, 10,8). Затем семена были высажены на среду MS с концентрацией канамицина 100 мг/л. Прорастание семян трансгенных линий было достаточно активным. Начало прорастания наблюдалось через 3-5 суток после посадки на питательную среду. На рисунке 9 представлены растения в сравнении – растения под номерами 1, 2, 3 выращены на среде с канамицином (100 мг/л), 4 и 5 – нетрансгенные растения на среде без селективного агента; очевидно угнетение роста и корнеобразования антибиотиком. вследствие выращивания на питательной среде с 70 Рисунок 9. Выращивание семян томата Т1 на среде с канамицином (растения 1, 2, 3) и семян нетрансгенных растений томата без селективного агента (4, 5). На рисунке 10 представлены проростки растения табака поколения Т1, выращиваемые на селективной среде с канамицином (100 мг/л). А Б Рисунок 10. Выращивание семян табака Т1 на среде с канамицином: А – проростки табака с хлорозом; Б – растения сохранившие зеленую окраску. На основании полученных данных был проведен анализ наследования гена NPT II с использованием критерия Пирсона (таблица 6). В результате генетического анализа показано, что соотношение канамицинустойчивых проростков к числу канамицин-чувствительных соответствует 3:1, поскольку фактическое значение χ2 меньше теоретического. Данное расщепление 71 соответствует менделевскому наследованию, свидетельствующему об однолокусной модели наследования гена NPT II. Таблица 6. Анализ наследования селективного гена NPT II в первом семенном поколении T1 с использованием критерия Пирсона (χ2 теор. = 3,84). Количество проростков Фактическое Ожидаемое ᵡ2 Объект KmR KmS соотношение соотношение (фактическое общее KmR/KmS KmR/KmS значение) шт. % шт. % Табак (линия 93 68 73 25 27 68:25 3:1 0,18 L) Томат (линия 73 53 73 20 27 53:20 3:1 0,22 8) В результате анализа фенотипического расщепления по признаку устойчивости к канамицину было отобрано 68 растений табака и 53 растения томата. 3.1.7 Анализ экспрессии гена Fe-SOD1 в первом семенном поколении T1 Канамицин-устойчивые растения табака и томата проверялись на наличие целевого гена Fe-SOD1 с помощью молекулярно-генетического анализа. Было подтверждено присутствие гена Fe-SOD1 в геноме 16 растений первого поколения томата Белый налив, прошедших селективный отбор на канамицине (рисунок 11А) и 9 растений табака сорта Самсун (рисунок 11Б). Затем растения проверялись с помощью ОТ-ПЦР и экспрессия целевого гена была выявлена в 7 растениях томата (рисунок 11В) и в 6 растениях табака (рисунок 11Г). 72 645 bp 645 bp А Б 645 bp В 645 bp Г Рисунок 11. Электрофореграммы продукта амплификации геномной ДНК и кДНК растений томата и табака, подтверждающая присутствие и экспрессию гена Fe-SOD1. Обозначения: А – М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-8, 11-18 – ПЦР-положительные растения по гену Fe-SOD1 (645 bp); 10 – контрольное нетрансгенное растение; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК); Б – М – маркер GeneRuler 100 bp; 8 – контрольное нетрансгенное растение; 1-3, 5, 11-13, 17, 18 – ПЦР –положительные растения по гену Fe-SOD1 (645 bp); 10 – контрольное нетрансгенное растение; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК); 73 В – ОТ-ПЦР: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-7 – ПЦР-положительные растения по гену Fe-SOD1 (645 bp); 8 – контрольное нетрансгенное растение; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК); Г – ОТ-ПЦР: М – маркер GeneRuler 100 bp; 1-7 – ПЦР-положительные растения по гену Fe-SOD1 (645 bp); 8 – контрольное нетрансгенное растение; 9 – положительный контроль (плазмидная ДНК). В нескольких растениях табака и томата, содержащих в геноме ген FeSOD1, экспрессия целевого гена отсутствовала. Это связано с эффектом замолкания генов. Замолкание генов в трансгенных растения довольно распространенное явление и связано зачастую с тем, что целевой ген возможно встроился в участок гетерохроматина и соответсвенно не экспрессируется. Либо высока вероятность того, что при встраивании в ядерный геном могли произойти различные перестройки, такие как делеции, дупликации и другие. Еще один из возможных механизмов, приводящих к инактивации экспрессии трансгенов, – защита против вирусных инфекций. Показано, что экспрессия вирусных генов (или их фрагментов) сообщает растениям иммунитет к соответствующему вирусу [75]. Одним из основных факторов при замолкании гена является число идентичных копий гена, встроенных в геном: чем больше таких копий и чем они протяженнее, тем больше вероятность замолкания генов [17]. В результате молекулярно-генетического анализа было отобрано 7 растений томата и 6 растений табака, проверенных с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. 3.2 Влияние экспрессии гена Fe-SOD на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений табака и томата Для первых этапов работы были изучены растения, выращенные на питательной среде MS в стандартных условиях in vitro. 74 Известно что, у мутантных растений арабидопсиса по генам fsd2 и fsd3 нарушена нормальная ультраструктура хлоропластов, в результате чего такие мутанты не способны приобретать зеленую окраску [167]. В то же время мутация по fsd1, кодирующему FeSOD1 не оказывает значительного влияния на зеленую окраску листа и ультраструктуру, что подтверждает особую роль этого фермента, локализующегося в цитоплазме и ядре [167]. В настоящем исследовании было изучено влияние на ультрастурктуру хлоропласта смены локализации FeSOD1, путем перенаправления его с помощью сигнальной последовательности в хлоропласт. 3.2.1 Анализ активности ферментов трансгенных растений Из группы трансгенных растений томата сорта Белый налив 241 нами было отобрано 2 линии (условно обозначенные как №6 и №8). Растения линии №6 характеризовались пониженной скоростью роста и измененными листьями. Растения томата линии №8 обладали нормальным ростом и типичными для контрольных растений листьями. Для обеих линий было показано значительное увеличение активности антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД). При этом у линии №8 увеличение активности СОД сопровождается повышением активности аскорбатпероксидазы, а у линии №6 такого эффекта не обнаружено. Активность фермента супероксиддисмутазы в листьях трансгенных растений томата превышала уровень активности этого фермента в контрольных растениях на 39, 98 и 185 % соответственно (рисунок 12А). В трансгенных растениях табака превышение активности фермента у линии №10 было на 106%, у линии №L на 49% (рисунок 13) относительно контрольных нетрансгенных растений. Активность аскорбатпероксидазы в листьях трансгенных растений табака и томата была близка к контролю. Однако, у растений томата линии №8, которые также характеризовались высоким уровнем активности супероксиддисмутазы, 75 активность аскорбатпероксидазы превышала контрольный уровень на 49% (рисунок 12Б). А Б 2,5 1400 1200 2 1000 1,5 800 600 1 400 0,5 200 0 0 контроль №4 №6 №8 контроль №4 №6 №8 Рисунок 12. Активность супероксиддисмутазы (1) и аскорбатпероксидазы (2) у трансгенных растений томата (ед/г сырой массы листьев) 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 контроль № 10 №L Рисунок 13. Активность супероксиддисмутазы у трансгенных растений табака ( ед/г сырой массы листьев) Таким образом, в трансгенных растениях с экспрессией целевого гена продукция фермента соответственно выше, чем у нетрансгенных растений. 76 3.2.2 Оценка митотической активности клеток трансгенных растений Понимание особенностей процесса пролиферации клеток, в частности клеток меристемы корня, тесно связано с изучением реакций растений на различные воздействия стрессовых факторов окружающей среды, а также изменения их метаболизма [10]. В связи с этим, одной из задач настоящего исследования являлось изучение влияния экспрессии гена Fe-SOD1 на значение митотического индекса (МИ) клеток корня трансгенных растений томата и табака. В качестве экспериментальной системы для изучения циклирующих клеток использовалась меристема корней. Характеристикой митотической активности клеток является митотический индекс. Для контрольных растений томата этот показатель составляет около 5,7% , для табака около 7,4% . Нами было показано, что митотическая активность клеток выше на 1,8% у контрольных растений томата, чем у трансгенных линий, митотический индекс которых был примерно одинаков (рисунок 14А). У трансгенной линии табака №8 митотическая активность была существенно выше, чем у нетрансгенных контрольных растений - на 2,2%; показатель линии №10 был ниже контрольного (рисунок 14Б). 7 6 МИ, % 5 4 3 2 1 0 А K №6 №8 77 12 10 МИ, % 8 6 4 2 0 Б K №10 №8 Рисунок 14. Митотический индекс трансгенных и контрольных растений томата (А) и табака (Б), выращенных на среде MS. Обозначения: К – контрольное нетрасгенное растение, №6 и №8 (на рисунке «А») – линии трансгенных растений томата; №10 и №8 (на рисунке «Б») – линии трансгенных растений табака. У трансгенных растений томата наблюдаются особенности по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями. Среди них увеличение количества клеток в пресинтетической фазе у трансгенного томата (линия №8) по сравнению с контролем, частичное блокирование G1/S у трансгенного томата линии №8 в отличие от обычного, а также снижение количества клеток в G2 фазе (рисунок 15А). Трансгенные растения табака так же отличаются по активности митозов по сравнению с контрольными растениями (рисунок15 Б). В клетках корневой меристемы у трансгенных растений табака (линия №10) увеличено количество клеток в синтетической фазе клеточного цикла. В тканях линии №8 преобладают клетки в пресинтетической фазе митоза. Таким образом, в тканях всех линий трансгенных растений томата и табака присутствуют отличия в митотической активности клеток на разных стадиях митотического цикла по сравнению с контрольными растениями. 78 K №6 №8 70 Количество ядер, % 60 50 40 30 20 10 0 А G1 S K №10 G2 №8 60 Количество ядер, % 50 40 30 20 10 0 Б G1 S G2 Рисунок 15. Распределение клеток корневой меристемы томата (А) и табака (Б) по фазам клеточного цикла. Обозначения: К - контрольное нетрансгенное растение; №6- трансгенное растение томата линия №6; №8 - трансгенное растение томата линия №8; №10 - трансгенное растение табака линия №10; №8трансгенное растение табака линия № 8. Фазы митотического цикла: G1пресинтетическая; S- синтетическая; G2- постсинтетическая. 79 3.2.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях. Ультраструктурную организацию хлоропластов изучали в листьях проростков трансгенных растений, выращенных на среде MS. В качестве контроля использовали нетрансгенные растения, выращенные в аналогичных условиях. Чтобы исключить возможное деструктивное влияние культивирования на структуру хлоропластов, сравнили хлоропласты из листьев контрольных растений, выращенных в условиях in vivo и в условиях in vitro. По данным электронной микроскопии в клетках мезофилла и устьиц растений, культивируемых in vitro на среде MS, хлоропласты сохраняют все характерные для них структурные компоненты. Они содержат граны (около 10–18 штук на площадь сечения хлоропласта), ламеллы гран имеют типичные спаренные мембраны, которые по электронной плотности резко отличаются от торцевых и маргинальных мембран тилакоидов гран и тилакоидов стромы. В строме содержатся пластоглобулы (от двух до восьми на площадь сечения хлоропласта) и одно-два крахмальных зерна в виде правильных эллипсоидов (рисунок 15А, Б; 16А, Б; 17А). Сравнение с ультраструктурой хлоропластов растений, выращенных в нормальных условиях (in vivo), показало, что в хлоропластах нетрансгенных растений, культивируемых на среде MS, увеличивается размер крахмальных зерен и снижается количество тилакоидов в гранах и строме. Этот феномен может быть связан с тем, что растения, выращенные in vitro, находились в условиях ограниченного пространства, в котором нарушается полноценное снабжение листьев кислородом. Возможно, что описанные изменения хлоропластов индуцируются опосредовано, в связи с недостаточной аэрацией корневой системы и недостаточным газообменом в условиях in vitro. Были выявлены различия в анатомо-морфологическом строении трансгенных растений линии №8 по сравнению с контролем. Пластиды в клетках различного типа из листьев растений линии № 8 имеют характерную овально- 80 линзовидную форму и обладают развитой ультраструктурой гран и ламелл (рисунок 15В, Г; 16В, Г). В строме пластид наблюдаются локальные разрыхления материала. Хлоропласты практически лишены крахмальных зерен. В редких случаях они имеют одно зерно. Размер пластоглобул в 2,5 раза меньше по сравнению с контролем. В то же время, в клетках сосудов ксилемы хлоропласты не содержат крахмальные зерна, в них резко уменьшается количество гран и стромальных тилакоидов, а также количество тилакоидов в гранах (рисунок 15Б, Г, Е; 16Б, Г, Е). В хлоропластах из клеток устьиц много крупных крахмальных зерен, полностью занимающих объем пластиды. В клетках этого типа граны резко уменьшаются в размерах за счет снижения количества тилакоидов, снижается количество тилакоидов стромы и их протяженность. Пластоглобулы единичные и очень мелкие (рисунок 15А, В, Д). У растений линии № 6 в клетках аналогичных типов тилакоиды гран имеют структуру, сходную со структурой в контрольных клетках. В клетках устьиц располагаются многочисленные (не менее четырех) крахмальные зерна и гетерогенные по диаметру пластоглобулы (рисунок 15Д). В тилакоидах наблюдаются вздутия маргинальных мембран и локальная дезорганизация мембран тилакоидов стромы (рисунок 17Б). В клетках сосудов ксилемы в хлоропластах выявляются крупные пластоглобулы, иногда сложной формы (рисунок 15Е; 16Е). Четко сформированные граны в хлоропластах не выявляются. Незначительно повышается количество крахмальных зерен (как правило, два–три на органеллу). Наиболее характерное отличие от контроля дезорганизация тилакоидов стромы, которая выражается в потере упорядоченной ориентации ламелл и их частичной фрагментации. Другое существенное отличие – наличие аномально крупных пластоглобул. 81 А Б В Г Д Е Рисунок 15. Ультраструктура пластид листа трансгенных томатов, экспрессирующих FeSOD1, с сигнальной последовательностью, направляющей фермент в хлоропласт. А, Б – Контрольные растения; В, Г – линия № 8; Д, Е – линия № 6. А, В, Д – Клетки устьиц; Б, Г, Е – клетки сосуда ксилемы. Обозначения: Хл – хлоропласт, К – крахмальное зерно, Гр – грана, Пг – пластоглобула. Масштабная линейка 1 мкм. 82 А Б В Г Д Е Рисунок 16. Ультраструктура пластид листьев контрольных и трансгенных томатов, экспрессирующих FeSOD1 с сигналом транспорта в хлоропласты. А, Б – Контрольные растения; В, Г – линия № 8; д, е – линия № 6; А, В, Д – клетки губчатой паренхимы, примыкающие к сосудистому пучку; Б, Г, Е – клетки сосуда ксилемы. Обозначения: Хл – хлоропласт, К – крахмальное зерно, Гр – грана, Пг – пластоглобула, Ла – ламелла, М – митохондрия, Кс – клеточная стенка. Масштабная линейка 1 мкм. 83 А Б Рисунок 17. Фрагменты клеток мезофилла контрольного растения (А) и растения линии № 6 (Б). А – В контроле тилакоиды гран и стромы имеют нормальное строение (стрелки). Б – В клетках линии № 6 тилакоиды гран сохраняют нормальное строение, стромальные тилакоиды упакованы не упорядоченно (стрелки). Представлены фрагменты рисунка 15А и 15Е, увеличенные в 3,5 раза. 84 Различия в ультраструктурной организации хлоропластов в клетках трансгенных и исходных растений табака и томата выражались в сильном увеличении объема единичных пластоглобул (в 2-4 раза), особенно очевидного в клетках паренхимы у трансгенных растений как томата (рисунок 15Г, Е), так и табака (рисунок 18Г, Е). В то же время в пластидах устичных клеток увеличивалось количество крахмальных зерен (рисунок 15А, 18А). У трансгенных растений хлоропласты паренхимы имели меньшее количество гран. Однако, у экспрессирующих FeSOD1, растений табака, пластиды паренхимных клеток содержали странные новообразования, которые наблюдали, как в центральной, так и в переферической зоне пластид. Эти ламелярные новообразования представляли собой изгибы, предположительно тилакоидов стромы (рис.18Г, Е). Подобные особенности тонкой структуры не установлены для трансгенных растений томата. Таким образом, были выявлены различия в ультраструктуре пластид трансгенных растений томата и табака по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями. 85 А Б В Г Д Е Рисунок 18. Ультраструктура пластид листа трансгенных растений табака, экспрессирующих FeSOD1, с сигнальной последовательностью, направляющей фермент в хлоропласт. А, В, Д – нетрансгенный контроль; Б, Г ,Е – трансгенная линия. А,Б – клетки устьиц; В, Г – клетки столбчатой паренхимы, Д, Е – клетки губчатой паренхимы. Обозначения: Хл – хлоропласт; К – крахмальное зерно, Гр – грана, Пг – пластоглобула, Ла – ламелла, Лф – ламеллярные формации, М – митохондрия, Кс – клеточная стенка, Яд – ядро, Вв – внутриядерное включение. 86 3.3 Влияние экспрессии гена Fe-SOD1 на анатомо-физиологические и биохимические характеристики растений томата в условиях стресса 3.3.1 Исследование активности фотосинтетического аппарата Облучение листьев УФ приводила к значительному снижению скорости фотосинтеза – в контроле до 36% от начальной величины. Введение гена FeSOD1 способствовало повышению устойчивости фотосинтетического аппарата растений томата к действию окислительного стресса, вызываемого УФ облучением. Это проявлялось в замедленном снижении скорости фотосинтеза и соответственно, больших значениях по сравнению с контролем. Так, например, для растений вариантов 4 и 8, по параметрам флуоресценции, соответственно, 213 и 156% по сравнению с контролем (рисунок 19). 250 200 150 контроль №4 №8 % 100 50 0 % к контролю по скорости выделения кислорода % к контролю по парамертрам замедленной флуоресценции Рисунок 19. Активность фотосинтетического аппарата у трансгенных линий томата после воздействия УФ-радиации. 87 Таким образом, в итоге наших экспериментов было показано что растения, содержащие в геноме ген меньше FeSOD1 повреждались в условиях окислительного стресса по сравнению с контрольными. 3.3.2 Оценка цитофотометрических показателей трансгенных растений при солевом стрессе В ходе экспериментальной работы было показано что, выявление наиболее существенных изменений, вызванных сульфатом и хлоридом натрия, может использоваться для определения пороговых условий для включения адаптационных механизмов у растения. Растительные клетки, подвергнутые окислительному стрессу, показывают временную остановку клеточного цикла, замедленную репликацию ДНК и задержки при переходах от фазы G1 к S, и от G2 к М [200]. Такие задержки на специфических контрольных точках стадий G1/S и G2/M связаны с временным подавлением экспрессии (Jang,2005), что, ряда генов, в свою очередь, контролирующих клеточный предоставляет время для цикл репарации повреждений. Таким способом растения томата, адаптированные к стрессу, могут восстанавливать нормальный рост и при продолжительном стрессе. В качестве критериев пролонгированного действия сульфата и хлорида натрия на клеточном уровне определялась митотическая активность и распределение клеток по фазам митотического цикла у трансгенных и обычных растений томата и табака. Для изучения циклирующих клеток использовались клетки меристематической зоны корня. Было обнаружено, что в контрольных растениях томата значение митотического индекса составляет около 5,7%. После проращивания растений в условиях сульфатного засоления среды наблюдается снижение митотического индекса на 26% в клетках корневой меристемы, а у трансгенных линий томата на 18-22%(№8 и №6) (рисунок 20А). При хлоридном засолении МИ у 88 контрольных томатов снижается на 28%, у трансгенных – на 15-20% (рисунок 20Б). В контрольных растениях табака митотический индекс составляет около 7,4%. После проращивания нетрансгенных растений табака в условиях сульфатного засоления среды наблюдается уменьшение МИ на 51% в клетках корневой меристемы; у трансгенного табака-на 18-27% (№8 и №10) (рисунок 20В). Действие хлоридного засоления проявляется в снижении МИ на 45% у контрольных растений табака и на 23-28% у его трансгенных линий (рисунок K МИ, % А В МИ, % 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 №6 №8 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Б K 8 9 7 8 6 7 5 6 МИ, % МИ, % 20Г). 4 3 №6 №8 5 4 3 2 2 1 1 0 K №10 №8 Г 0 K №10 №8 Рисунок 20. Митотический индекс трансгенных и контрольных растений томата (А, Б) и табака (В, Г), выращенных на среде MS с добавлением сульфата (А, В) и хлорида (Б, Г) натрия. Обозначения: К – контрольное нетрасгенное растение, №6 и №8 (на рисунке «А, Б») – линии трансгенных растений томата; №10 и №8 (на рисунке «В, Г») – линии трансгенных растений табака. 89 При высоких концентрациях хлорида натрия у трансгенного томата №8 образуется блок в пресинтетической фазе клеточного цикла (рисунок 21А), свидетельствующий о возможной чувствительности растений к данным неблагоприятным условиям выращивания. У контрольной формы томата сорта «Белый налив» наблюдается блок в пресинтетической фазе клеточного цикла. Под действием хлорида и сульфата натрия в клетках меристемы корня трансгенных растений томата (линии №6 и №8) увеличивается продолжительность пресинтетической фазы клеточного цикла (рисунок 21А, Б), возможно это связано с неблагоприятными условиями культивирования. При хлоридном засолении (рисунок 21А) наблюдается увеличение количества клеток в G1 фазе: у контрольных растений томата в 2.2 раза, а у трансгенных (линии №6 и №8) – в 1.5-1.3 раза. В синтетической фазе митотического цикла (S) число клеток уменьшилось: у контрольных растений томатов в 2.6 раз, у линии №8 – в 3 раза. У линии №6 произошло небольшое увеличение клеток в синтетической фазе. Изучение клеточного цикла корневой меристемы табака показало, что сульфат и хлорид натрия по-разному влияют на распределение клеток по периодам интерфазы и митоза. Цитофотометрическим методом показано, что изменение митотической активности сопровождалось соответствующим изменением продолжительности фаз клеточного цикла. Под действием хлорида натрия в клетках меристемы корня трансгенных растений табака (№8 и №10) увеличивается продолжительность пресинтетической фазы клеточного цикла, причем, со снижением синтетической активности (рисунок 21В). Клетки меристемы корня нетрансгенного табака создают блок G1/S. При сульфатном засолении увеличивается количество клеток в G1 фазе, как у нетрансгенного растения табака, так и у трансгенных линий (рисунок 21Г). При воздействии сульфата натрия трансгенный табак (№10) создает блок G1/S и, как следствие, происходит ингибирование процесса репликации ДНК. Это означает, что засоление является цитостатическим фактором, частично блокирующим нормальное деление клеток. 90 А K 70 60 60 50 40 30 20 10 0 G1 S №10 G2 Б №8 40 30 20 10 0 G1 S K 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 №6 50 №8 №10 G2 №8 70 Количество ядер, % Количество ядер, % №8 70 K В №6 Количество ядер, % Количество ядер, % K G1 S G2 Г 60 50 40 30 20 10 0 G1 S G2 Рисунок 21. Распределение клеток корневой меристемы томата (А, Б) и табака (В, Г), выращенных на среде MS с добавлением хлорида (А, В) и сульфата (Б, Г) натрия, по фазам клеточного цикла. Обозначения: К - контрольное нетрансгенное растение; №6 и №8 (на рисунке «А, Б») – линии трансгенных растений томата; №10 и №8 (на рисунке «В, Г») – линии трансгенных растений табака. Фазы митотического цикла: G1-пресинтетическая; S-синтетическая; G2- постсинтетическая. Таким образом, действие сульфата натрия приводит к перераспределению интерфазных клеток по фазам клеточного цикла, как у обычного табака, так и у трансгенных линий. Однако у трансгенных растений наблюдаются свои особенности: появление блока G1/S у трансгенного табака (№10) в отличие от нетрансгенного, а также снижение количества клеток в G2 фазе (рисунок 21В, Г). 91 У трансгенных растений в меньшей степени сокращается продолжительность клеточного цикла, чем у контрольных. Такая способность клеток к пролиферации и задержка в фазе G1 свидетельствует о большей устойчивости трансгенных растений к неблагоприятным условиям засоления. Пролонгированное действие сульфата натрия показало, что по таким параметрам как МИ и распределение клеток по фазам клеточного цикла табак обладает большей устойчивостью к сульфатному, чем к хлоридному засолению. Очевидно, что трансгенные растения лучше переносят засоление сульфатом натрия по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями. Нарушения воздействий и клеточного являются цикла реакцией характерны для растительных обезвоживание и температурные стрессы, однако, многих клеток на стрессовых засоление, различные стрессовые воздействия имеют свои особенности. Изучение клеточного цикла корневой меристемы томата и табака показало, что хлорид и сульфат натрия по-разному влияют на распределение клеток по периодам интерфазы и митоза. 3.3.3 Сравнительный анализ структурной организации хлоропластов в контрольных и трансгенных растениях при воздействии солей Ультраструктурную организацию хлоропластов изучали в листьях проростков трансгенных растений томата, выращенных на среде MS с добавлением хлорида (рисунок 22) и сульфата натрия. В качестве контроля были использованы нетрансгенные растения, выращенные в аналогичных условиях (рисунок 22). Растения, выращенные в условиях in vitro, подвергаются многим специфическим воздействиям при использовании водной среды. Важную роль в данных условиях выращивания играет перманентный анаэробный стресс, вызываемый аноксией. Изменение структурной организации митохондрий при аналогичных условиях хорошо изучены на разных культурах [254, 6]. 92 1 А 2 Б Рисунок 22. Трансгенные (А, Б1) и контрольное (Б2) растения томата на среде с хлоридом натрия. При анализе ультраструктуры были выявлены изменения ультраструктуры паренхимных клеток у нетрансгенных растений томата характерные для действия солевого стресса, затрагивающие пластиды и митохондрии (рисунок 23 А, Г, Ж, 24 А, Б, В). Показано деструктивное влияние хлорида натрия на структурную организацию пластид. Изменения затронули форму пластид, это, вероятно, связано с нарушением осмоса; так же было отмечено появление увеличенных пластоглобул (рисунок 23Г). 93 Рисунок 23. Хлоропласты в клетках мезофилла листа трансгенных линий томата, экспрессирующих FeSOD1 под действием хлорида (Г-Е) и сульфата (Ж-И) натрия. 94 Нетрансгенная линия А, Г, Ж; трансгенная линия №6 – Б, Д, З; трансгенная линия №8 – В, Е, И; культуральная среда MS (контроль) – А-В. Условные обозначения: М- митохондрия, Хл – хлоропласт, К – крахмальное зерно, Пг – пластоглобула, В – вакуоль, Ц - цитоплазма, * - нуклеоид хлоропласта, белая* - кристаллическая структура. Масштабная линейка равна 1 мкм. Повреждающее действие солей на митохондрии выражалось в значительном уменьшении количества крист и их неравномерном расположении, изменении формы с округлой на сильно изогнутую, с инвагинациями (рисунок 24 Б). При воздействии сульфата натрия пластиды приобрели неправильную угловатую форму, строма становится более плотной, крахмальные зерна окружают неравномерные угловатые светлые участки, от отдельных пластид отшнуровываются фрагменты стромы, окруженные мембраной и содержащие ламеллярные структуры, количество пластоглобул не меняется (рисунок 23 Ж). Размер митохондрий в 1,5 раза меньше чем в контроле. Митохондрии сохраняли округлую форму и имели небольшое число более длинных, чем в норме изогнутых крист (рисунок 24 В). 95 Рисунок 24. Митохондрии в клетках мезофилла листа трансгенных линий томата, экспрессирующих FeSOD1 под действием хлорида (Г-Е) и сульфата (Ж-И) натрия. Нетрансгенная линия - А, Г, Ж; трансгенная линия №6 – Б, Д, З, К, Л, М; трансгенная линия №8 – В, Е, И; культуральная среда МС (контроль) – А-В, К-М. Условные обозначения: М- митохондрия, Хл – хлоропласт, Пк – пероксисома, * кристаллическая структура. Масштабная линейка равна 1 мкм. 96 Пластиды клеток паренхимы трансгенных линий №6 и №8 существенно отличались как от контроля, так и между собой (рисунок 23). Под действием хлорида натрия пластиды линии №6 теряли характерные крупные пластоглобулы (рисунок 23Д), на фоне чего изменялась форма пластиды и ее размер. В пластидах присутствовал нуклеоид, крахмальные зерна оставались в некоторых клетках (рисунок 24Д), количество гран оставалось также ниже, чем у исходной формы и линии №8 (рисунок 23Д). При хлоридном засолении митохондрии линии № 6 были более мелкими, хотя и содержали характерные для нормальных условий для этой линии кристаллические включения, кристы были четко выражены, имели ромбовидную и треугольную форму, плотный матрикс. Вероятно, повреждение митохондрий в данном случае, было обратимым (риcунок 24Д). Сульфатное засоление вызывало изменение пластид линии №6, проявляющееся в уменьшении размеров, сохранении значительного количества крахмальных зерен, появлении пластоглобул, меньшего чем в норме для этой линии, но соответствующего размеру пластоглобул у исходной формы и трансгенной линии №8 в нормальных условиях (рисунок 23А, В). Митохондрии линии №6 не имели значимых изменений структуры, более того во многих клетках имели более характерное для контрольных условий структурное состояние (рисунок 24Е), чем в норме у этой линии (рисунок 24Г). Очевидно, что на фоне типичных митохондрий при сульфатном засолении сохранялось некоторое количество митохондрий, имеющих кристаллические включения и полости. Ультраструктура хлоропластов линии №8 имела существенные отличия по сравнению как с исходной формой, так и с линией №6, выражавшиеся при действии NaCl в сохранении овально-линзовидной формы. Тилакоиды гран и стромы также имели нормальное строение, в строме наблюдали небольшое количество нуклеоидов свидетельствовало Митохондрии об клеток и некрупных отсутствии паренхимы пластоглобул повреждений линии №8 при (рисунок данного 23Е), что компартмента. хлоридном засолении 97 характеризовались округлой формой, имели развитую структуру крист, несколько большие размеры, чем в нормальных условиях у этой линии (рисунок 24В), но соответствующую структуре митохондрий у исходной формы без воздействия солей (рисунок 24А). При сульфатном засолении пластиды линии №8 были меньше, заметны были незначительные изменения формы, уменьшалось количество гранн и тилакоидов в гранах, пластоглобулы становились более мелкими. Под действием сульфата натрия митохондрии линии №8 приобретали овальную продолговатую форму, содержали относительно плотный матрикс и развитую систему крист (рисунок 24И), структура была аналогична структуре митохондрий у линии №6 в нормальных условиях (рисунок 24Г). Было показано, что различия в ультраструктурной организации хлоропластов в клетках трансгенных и исходных растений томата выражались в сильном увеличении объема единичных пластоглобул (в 2-4 раза), особенно очевидного в клетках паренхимы. В то же время в пластидах устьичных клеток увеличивалось количество крахмальных зерен, что свидетельствует об опосредованной связи метаболизма липидов и крахмала с активностью FeSOD1 в хлоропластах. Кроме того, у трансгенных растений пластиды паренхимы имели меньшее количество гран. Интересно, что у экспрессирующих FeSOD1 растений табака, пластиды паренхимных клеток содержали особые ламеллярные новообразования, представляющие собой изгибы, предположительно, тилакоидов стромы. Подобные особенности тонкой структуры не были установлены для трансгенных растений томата. Особый интерес представляет сравнение структуры митохондрий в контроле и при действии солей (рисунок 24). Так же как и при анализе пластид, видно, что действие хлоридного и сульфатного засоления принципиально отличаются по действию на ультраструктуру действительно как для нетрансгенных, так пластид и митохондрий, что и трансгенных растений. Отличительной особенностью реакции митохондрий на действия NaCl для исходной линии и линии№8 является уменьшение количества крист, увеличение 98 объема митохондрий (рисунок 24 Б,З). Для всех вариантов характерны и некоторые особенности действия Na2SO4: утолщение наружной мембраны, сохранение крист (рисунок 24 В,Е,И). При этом индивидуальные особенности линий при сравнении структурной организации митохондрий еще более очевидны. Таким образом, по состоянию ультраструктуры митохондрий линия №8 оказалась более устойчивой, как сульфатному, так и к хлоридному засолению. 99 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Имеющиеся многочисленные работы по изучению действия стрессовых факторов на фотосинтетический аппарат и целое растение свидетельствуют о прямой корреляции устойчивости с уровнем антиокислительной активности. Поэтому одним из путей повышения устойчивости растений может быть получение растений с повышенным содержанием и активностью ферментов детоксикаторов активных форм кислорода, в частности, супероксиддисмутазы. Несмотря на то, что биологическая роль Fe-зависимых супероксиддисмутаз в формировании структур хлоропластов остается до конца не понятой, установлено, что FeSOD2 и FeSOD3 играют важную роль в развитии пластид. Это подтверждается нарушением нормальной ультраструктуры хлоропластов в клетках растений арабидопсиса с нокаутом по генам FeSOD2 и FeSOD3, в результате чего такие мутанты не способны приобретать зеленую окраску [167]. В то же время мутация по гену FeSOD1, кодирующему FeSOD1 не оказывает значительного влияния на зеленую окраску листа и ультраструктуру, что подтверждает особую роль этого фермента, локализованного в цитоплазме и ядре [167]. Переадресация фермента FeSOD1 путем перенаправления с помощью сигнальной последовательности в хлоропласт продемонстрировала, что трансформация растений геном FeSOD1 вызывает изменения ультраструктурной организации пластид во всех клетках различных типов тканей листа у трансгенных линий как томата, так и табака. Вероятно, это связано с увеличением активности СОД у трансгенных растений, экспрессирующих FeСОД1. В наших исследованиях введение гена FeSOD1 в растения томата и табака способствовало значительному повышению устойчивости фотосинтетического аппарата к действию окислительного стресса, вызываемого УФ-А облучением. Это проявлялось в меньшем снижении скорости фотосинтетического выделения кислорода по сравнению с контролем, более высоких уровнях работы фотосистемы II, определяемых по параметрам замедленной флуоресценции. Это свидетельствует не только о сохранении и стабильной работе 100 фотосинтетического аппарата в стрессовых условиях, но также о возможности растений лучше противостоять другим абиотическим стрессам. Полученные данные убедительно демонстрируют ожидаемое увеличение активности СОД у трансгенных растений, а также сохранение стабильной работы другого важного антиокислительного фермента – аскорбат пероксидазы. Наличие одной линии трансгенного томата с увеличенной активностью не только СОД но и АсП может свидетельствовать о возможном включении заложенного механизма нейтрализации, либо о эпигенетических повреждениях связанных с трансформацией, вызванных изменением каких либо метаболических путей, что однако не препятствует, как показано на данном примере успешной защитной стратегии. Отмеченные изменения активности фотосинтетического аппарата, а также активности антиокислительных ферментов в листьях трансгенных растений томата, имели место при кратковременном воздействии УФ на листья растений. В настоящей работе подтвердилось, что структура пластид и митохондрий не имеет повреждений, которые наблюдаются у контрольных нетрансгенных растений при действии солей. При этом линия №8 имеет менее поврежденную структуру пластид и митохондрий по сравнению с контролем и линией №6. В случае ожидаемого более сильного действия Na2SO4 наблюдали сохранение внешних мембран, неповрежденного комплекса гран, нормальной структуры стромы. Это явно свидетельствует об отсутствии необратимых повреждений в отличие от нетрансгенных растений, у которых наблюдались существенные повреждения и дезорганизация мембранных структур. Изменения структуры хлоропластов в контрольных условиях свидетельствуют об эффективности защиты фотосинтетического аппарата, а также об опосредованном влиянии повышенной активности антиокислительных ферментов в хлоропластах листьев трансгенных растений томата на защиту дыхательного метаболизма, за который ответственны митохондрии. 101 Измененная структура митохондрий, выражающаяся в уменьшении количества крист и разбухании, была характерна для контрольных условий у нетрансгенных растений (рис. 23А) соответствует данным описанным при изучении динамики на начальных стадиях аноксии у кукурузы [6] и анаэробном стрессе у других культур [254]. Наличие прямых связей между экспрессией цитоплазматической СОД при таргетинге ее маловероятно. в пластиду Однако, и можно структурной предположить организацией два митохондрий возможных варианта объяснения наблюдаемого факта. Наиболее вероятно то, что конститутивно экспрессирующаяся СОД выполняет важную сигнальную функцию, повышая уровень Н2О2 внутри пластиды. Перекись водорода, выходя в цитозоль, каскадно запускает пути передачи сигнала в ядро, индуцируя различные гены антиокислительной защиты [163]. В данном случае защита митохондрий осуществляется опосредованно [191]. Либо, возможно, что экспрессия СОД осуществляется нормально, но произошло частичное нарушение таргетинга этого белка в пластиду, и тогда защита структурной организации как пластид, так и митохондрий является прямым, а не опосредованным следствием функционирования СОД, в том числе и через запуск сигналинга, как в первом случае. Используемый подход можно рассматривать как модельную систему при изучении действия окислительного стресса, вызванного различными неблагоприятными факторами внешней среды и ответной реакции трансгенных растений. Полученные результаты не позволяют сделать однозначного вывода о причинах столь значимых различий в ультраструктуре хлоропластов трансгенных растений табака и томата, но свидетельствуют о том, что функционирование интродуцированного гена FeSOD1 может оказывать существенный эффект на происходящие в пластидах биохимические процессы, которые прямо зависят от макромолекулярной организации этих субкомпартментов хлоропластов. 102 Полученные данные подтверждают перспективность использования трансгенных растений с геном FeSOD1 и его аналогов, свидетельствуют о важной роли антиоксидантных ферментов и о быстром включении их в механизм защиты от окислительной деструкции в условиях действия стрессовых факторов. 103 ВЫВОДЫ 1. Впервые получены трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген цитоплазматической Fe-зависимой супероксиддисмутазы (Fe-SOD1) из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., снабженный сигнальной последовательстью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.) для таргетинга фермента в пластиды. 2. Установлено, что экспрессия гена Fe-SOD1 приводит к увеличению активности супероксиддисмутазы в листьях трансгенных растениях томата и табака. 3. Показано, что экспрессия гена Fe-SOD1 изменяет митотическую активность клеток меристемы корня у трансгенных растений томата и табака. 4. Продемонстрировано, что экспрессия гена Fe-SOD1 при таргетинге продукта в хлоропласт вызывает изменения ультраструктурной организации пластид и митохондрий в клетках фотосинтезирующих тканей трансгенных растений томата и табака. 5. Экспрессия гена Fe-SOD1 приводит к повышению устойчивости трансгенных растений томата к солевому стрессу и ультрафиолетовому облучению. 104 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода СОД – супероксиддисмутаза Fe-СОД – Fe-зависимая супероксиддисмутаза Mn-СОД– Mn-зависимая супероксиддисмутаза Cu/Zn-СОД – Cu/Zn-зависимая супероксиддисмутаза АсП – аскорбатпероксидаза АБК – абсцизовая кислота ОАТ – орнитинаминотрансфераза ГР – глутатионредуктаза 6-БАП – 6-бензиламинопурин ИМК – 3-индолилмасляная кислота НУК – 1- нафтилуксусная кислота ИУК – 3-индолилуксусная кислота 2,4 Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота EDТА – этилендиаминтетрауксусная кислота MS – среда Мурасиге-Скуга ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота К-ДНК – комплементарная ДНК РНК – рибонуклеиновая кислота ПЦР – полимеразная цепная реакция ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции МИ – митотический индекс FAO – Food Agricultural Organization of United Nations Fe-SOD1 – ген железозависимой суперокисддисмутазы 1 nptII – ген неомицинфосфотрансферазы II gfp – ген зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescence protein) 105 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Балнокин Ю. В. Растения в условиях стресса // Физиология растений: Учебник для студ. вузов / под ред. И. П. Ермакова – М.: Издательсктй центр «Академия», 2005. – сс.510-584. 2. Бараненко В.В. Супероксиддисмутаза в клетках растений // Цитология. – 2006. – Т.48. – № 6. – С. 465-474. 3. Баранова Е.Н, Гулевич А.А. Проблемы и перспективы генно-инженерного подхода в решении вопросов устойчивости растений к засолению // Сельскохозяйственная биология. – 2006. – №1. – С. 39-55. 4. Баранова Е.Н., характеристика Гулевич А.А., устойчивости Лаврова мобилизации Н.В. Цитоплазматическая запасных веществ при прорастании семян томата в условиях засоления среды // Известия ТСХА. – 2009. – №3. – С. 61-64. 5. Войников В.К., Боровский Г.Б. Роль стрессовых белков в клетках при гипертермии // Успехи современной биологии. – 1994. – Т.114. – С.85-95. 6. Генерозова И.П., Снхчян А.Г., Вартапетян Б.Б. Динамика изменений ультраструктуры митохондрий проростков кукурузы в условиях аноксии // Физиология растений. – 1984. – Т.31. – №4. – С.683-691. 7. Гидова Э.М. Методические указания к лабораторным занятиям по цитогенетике / Гидова Э.М. – Нальчик: Каб.- Балк. Ун.-т. – 2003. – С. 26. 8. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта: (с основами статистической обработки результатов исследований) / Доспехов Б.А. – Изд. 4-е, перераб. и доп. – М.: Колос. – 1979. – С. 416. 9. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство / пер. с англ. под редакцией Дж. Дрейпера, Р.Скотта, Ф.Армитиджа, Р.Уолдена – М.: Колос. – 1991. – С. 408. 10. Иванов В.Б. Пролиферация клеток в растениях. Итоги науки и техники / Сер. «Цитология». – М.:ВИНИТИ, 1987. – №5. – С.216. 106 11. Корнеева И.В., Парашина Е.В., Лебедев В.Г. и др. Получение трансформированных растений томата (Lycopersicon esculentum Mill.) / Методические рекомендации. – Москва. – 2008. – С. 13. 12. Норова Г. Е., Калиев А. Б. Трансформация растений томата (Lycopersicon esculentum L.) сорта Бахтемир // Биотехнология. – 1991. – №2. – С. 16-18. 13. Парашина Е.В. Создание и характеристика трансгенных форм томатов (Lycopersicon esculentum M.), экспрессирующих ген дефензина редьки RsAFP2. автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.23 / Парашина Елена Владимировна. – М. – 1999. – С.18. 14. Попов В.Н., Кипайкина Н.В., Астахова Н.В. и др. Особенности окислительного стресса растений табака, трансофрмированных геном desC 9-ацил-липидной десатуразы из Synechocjccus vulcanus при гипотермии // Физиология растений. – 2006. – Т. 53. – №4. – С. 525-529. 15. Прохорова И.М., Комарова М.И., Фомичева А.Н. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды / Методические указания. – Ярославль: Яросл. гос. ун-т. – 2003. – С. 32. 16. Рубин А.Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т.6. – №4. – С. 7-13. 17. Сингер М., Берг П. Гены и геномы / Сингер М., Берг П. - М: Мир, 1998. – Т.1. – С. 373. 18. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. и др. // Сельскохозяйственная биотехнология. – 1998. – М.: Высшая школа. – C. 154-212. 19. Abdul-Baki A.A., Saunders J.A., Matthews B.R. et al. DNA uptake during electroporation of germinating pollen grains // Plant Sci. – 1990. – Vol. 70. – P. 181-190. 20. Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Sahi C. et al. Arabidopsis thaliana Hsp100 proteins: kith and kin // Cell Stress Chaperones. – 2001. – №6. – P. 219-224. 107 21. Allen R.D. Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants // Plant Physiol. – 1995. – №107. – P. 1049-1054. 22. Allen R.D., Webb R.P., Schake S.A. Use of transgenic plants to study antioxidant defenses // Free Radic Biol Med. – 1997. – №23. – P. 473-479. 23. Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.S. et al. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis // Science. – 1999. – №285. – P. 1256-1258. 24. Arora A., Sairam R. K., Srivastava G. C. Oxidative stress and antioxidative systems in plants // Curr. Sci. – 2002. – №82. –P. 1227-1238. 25. Asada K. Mechanisms for scavenging reactive molecules generated in chloroplasts under light stress / in: Baker N.R., Bowyer J.R., eds. Photoinhibition of photosynthesis. From molecular mechanisms to the field. Oxford: Bios Scientific Publishers, 1994. – P. 129-142. 26. Asada K. Radical production and scavenging in the chloroplasts / in Photosynthesis and the Environment. ed. Baker NR (Kluwer Academic Publishers, The Netherlands), 1996. – P. 123-150. 27. Ashraf M. Breeding for salinity tolerance in plants // Crit. Rev. Plant Sci. – 1994. – №13. – P. 17-42. 28. Ashraf M., Athar H.R., Harris P.J.C. et al. Some prospective strategies for improving crop salt tolerance // Adv. Agron. – 2008. – №97. – P. 45-110. 29. Aziz A., Martyn-Tanguy J., Larher F. Plasticity of polyamine metabolism associated with high osmotic stress in rape leaf discs and with ethylene treatment // Pln. Grow. Regul. –1997. – №21. – P. 153-163. 30. Basu U., Good A. G., Taylor G. J. Transgenic Brassica napus plants overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide dismutase cDNA are resistant to aluminium // Plant Cell Envir. – 2001. – №24. – P. 1269-1278. 31. Beauchamp C. O., Fridovich I. Isozymes of superoxide dismutase from wheat germ. Biochim. biophys. acta. – 1973. – №317. – P. 50-64. 108 32. Becker D., Brettschneider R., Lorz H. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scuteller tissue // Plant J. – 1994. – Vol. 5. – P. 299-307. 33. Bellini C., Chupeau M.C., Guerche P. et al. Transformation of Lycopersicon peruvianumand, Lycopersicon esculentum mesophyll protoplasts by electroporation // Plant Sci. – 1989. – Vol. 65. – №1. – P. 63-76. 34. Benlloch-Gonzalez M., Fournier J.M., Ramos J. et al. Strategies underlying salt tolerance in halophytes are present in Cynara cardunculus // Plant Sci. – 2005. – №168. – P. 653-659. 35. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. – 1979. – Vol. 7. – P. 15131523. 36. Bohnert H.J, Sheveleva E. Plant stress adaptations – making metabolism move // Curr.Opin.Plant Biol. – 1998. – №1. – P. 267-274. 37. Bolarin M.C., Santa Cruz A., Caro M. Relationship between the salt responses of tomato transgenic plants and calluses derived from them // IX Intern. Congr.Plant Tissue Cell Culture: Abstr. (June 14–19, 1998). –Jerusalem, 1998. – P. 132. 38. Bolton G.W., Nestor E.W., Gordon M.P. Plant phenolic compounds induce expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence // Science. – 1986. – Vol. 232. – P. 983-985. 39. Borsani O., Valpuesta V. and Botella M. A. Developing salt tolerant plants in a new century: a molecular biology approach // Plant Cell Tissue Organ Cult. – 2003. – №73. – P. 101-115. 40. Botella M.A., Martinez V., Pardines J. et al. Salinity induced potassium deficiency in maize plants // J. Plant Physiol. – 1997. – №150. – P. 200-205. 41. Bowler C., Alliotte T., de Loose M. et al. The induction of Mn-superoxide dismutase in response to stress in N. plumbaginifolia // EMBO J. – 1989. – №8. – P. 31-38. 109 42. Bowler C., Slooten L., Vandenbranden S. et al. Manganese superoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicals in transgenic plants // EMBO J. – 1991. – №10. – P. 1723-1732. 43. Boyer J.S. Plant productivity and environment. Science. – 1982. – №218. – P. 443-448. 44. Brawn K., Fridovich I. DNA strand scission by enzymically generated oxygen radicals // Arch. Biochem. Biophys. – 1981. – №206. – P. 414-419. 45. Bray E.A., Bailey-Serres J., Weretilnyk E. Responses to abiotic stresses / in Gruissem W., Buchannan B., Jones R., eds. Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville, 2000. – P. 11581249. 46. Briza J., Pavingerova D., Prikrylova P. et al. Use of phosphomannose isomerase-based selection system for Agrobacterium-mediated transformation of tomato and potato // Biologia plantarum. – 2008. - Vol. 52. – №3. – P. 453-461. 47. Busk, K., Pages, M. Regulation of abscisic acid-induced transcription // Plant Mol. Biol. – 1998. – №37. – P. 425-435. 48. Cano E.A., Perez-Alfacea F., Moreno V. et al. Evalution of salt tolerance in cultivated and wild tomato species through in vitro shoot apex culture // Plant Cell Tissue Organ culture. –1998. – Vol.53. – №1. – P. 19-26. 49. Capiati D.A., Pais S.M., Tellez-Inon M.T. Wounding increases salt tolerance in tomato plants: evidence on the participation of calmodulin-like activities in crosstolerance signaling // J Exp Bot. – 2006. – №57. – P. 2391-2400. 50. Carolina C., Francisco A.C.M. Tomato transformation and transgenic plant production // Plant Cell, Tiss. and Org. Cult. – 2004. – Vol. 76. – P. 269-275. 51. Chen L., Marmey P., Taylor N.J. et al. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nat. Biotech. – 1998. – Vol. 16. – P. 1060-1064. 110 52. Cheng L., Zou Y., Ding S. et al. Polyamine accumulation in transgenic tomato enhances the tolerance to high temperature stress // J. Integr. Plant Biol. – 2009. – №51. – P. 489–499. 53. Cheng, Z.M., Schnurr J.A., Kapaun J.A. Timentin as an effective antibiotic for suppression of Agrobacterium tumefaciens in genetic transformation // Plant Cell Reports. – 1998. – Vol. 17. – P. 646-649. 54. Chiang H.H., Dandekar A.M. Regulation of proline accumulation in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh during development and in response to desiccation // Plant Cell Environ. – 1995. – №18. – P. 1280-1290. 55. Chinnusamy V., Jagendorf A., Zhu J.K. Understanding and improving salt tolerance in plants // Crop Sci. –2005. – №45. – P. 437-448. 56. Chinnusamy V., Zhu J.K. Plant salt tolerance / in : Hirt H., Shinozaki K., ed. Topics in Current Genetics. Vol. 4: Plant Responses to Abiotic Stress. SpringerVerlag, Berlin – Heidelberg, 2004. – P. 241-270. 57. Christis C., Lubsen N.H., Braakman I. Protein folding includes oligomerizationexamples from the endoplasmic reticulum and cytosol // FEBS J. – 2008. – №275. – P. 4700-4727. 58. Christou P., Ford T.L., Kofron M. Production of transgenic rice (Oryza sativa) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos // Biotechnology. – 1991. – Vol. 9. – P. 957-962. 59. Chyi Y.S., Phillips G.C. High efficiency Agrobacterium - mediated transformation of Lycopersicon esculentum based on conditions favorable for regeneration // Plant Cell Rep. – 1987. – Vol. 6. – P. 105-108. 60. Cohen A., Moses M.S., Plants A.L. et al. Multiple mechanisms control the expression of abscisic acid (ABA)-requiring genes in tomato plants exposed to soil water deficit // Plant, Cell and Environment. – 1999. – №22. – P. 989-998. 111 61. Corpas F. J., Sandalio L. M., Del Rio L. A. et al. Copper-zinc superoxide dismutase is a constituent enzyme of the matrix of peroxisomes in the cotyledons of oilseed plants // New Phytol. –1998. – №138. – P. 307-314. 62. Cortina C., Culianez-Macia F.А. Tomato transformation and transgenic plant production // Plant Cell Tiss. and Org. Cult. - 2004. - Vol. 76. - P. 269-275. 63. Crossway A., Oakes J.V., Irvine J.M. et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts // Mol. Gen. Genet. – 1986. – Vol. 202. – P. 179-185. 64. Daniell H., Lee S.B., Panchal T. et al. Expression of the Native Cholera Toxin B Subunit Gene and Assembly as Functional Oligomers in Transgenic Tobacco Chloroplasts // J. Mol. Biol. – 2001. – Vol. 311. – №5. – P. 1001-1009. 65. Danilova S.A. The Technologies for Genetic Transformation of Cereals // Rus. J. of Plant Physiol. – 2007. - Vol. 54. - P. 569–581. 66. Davis M.E., Miller A.R., Lineberger R.D. Temporal competence for transformation of Lycopersicon esculentum cotyledons by Agrobacterium tumefaciens: relation to wounding-healing and soluble plant factor // J. Exp. Bot. – 1991. – Vol. 42. – P. 359-364. 67. De Block M., Herrera-Estrella L., Van Montagu M. et al. Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny // EMBO J. – 1984. – Vol. 3. – P. 1681-1689. 68. Delfine S., Alvino A., Zacchini M. et al. Consequences of salt stress on diffusive conductances, Rubisco characteristics and anatomy of spinach leaves. Aust J Plant Physiol. – 1998. – №25. – P. 395-402. 69. Del Rio L. A., Sandalio L. M., Altomare D. et al. Mitochondria and peroxisomal manganese superoxide dismutase: different expression during leaf senescence // J. Exp. Bot. – 2003. – №54. – P. 923-933. 70. Demel R.A., Dorrepaal E., Ebskamp M.J.M. et al. Fructans interact strongly with model membranes // Biochim Biophys Acta. – 1998. – №1375ю – P. 36-42. 112 71. De Roover J., Vandenbranden K., Van Laere A. et al. Drought induces fructan synthesis and 1-SST (sucrose: sucrose fructosyltransferase) in roots and leaves of chicory seedlings (Cichorium intybus L.) // Planta. – 2000. – №210. – P. 808-814. 72. Djilianov D., Yordanov Y., Valkov V. et al. Establishing drought_tolerant tobacco – the gene transfer approach // Abstr. IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture (June 14–19). – Jerusalem, 1998. – P. 138. 73. Dure L., Greenway S.C., Galau G.A. Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination: changing messenger ribonucleic acid populations as shown by in vitro and in vivo protein synthesis // Biochemistry. – 1981. – №20. – P. 4162-4168. 74. El-Banna Y., Attia T. Root tip meristematic cell and leaf chloroplast structure in three barley (Hordeum vulgare L.) genotypes exposed to salinity stress // Cytologia. – 1999. – №64. – P. 69-76. 75. English J. J., Mueller E., Baulcombe D. E. Suppression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes // Plant Cell – 1996. – Vol.8. – P. 179-188. 76. Estan M.T., Martinez-Rodriguez M.M., Perez-Alfocea F. et al. Grafting raises the salt tolerance of tomato through limiting the transport of sodium and chloride to the shoot // J Exp Bot. – 2005. – Vol.56. –№412. – P. 703-712. 77. Fabro G., Kovacs I., Pavet V. et al. Proline accumulation and AtP5CS2 gene activation are induced by plant-pathogen incompatible interactions in Arabidopsis // Mol Plant Microbe Interact. – 2004. – №17. – P. 343–350. 78. FAO Production Yearbook 2002. Vol. 56. FAO Statistics Series No. 176 Rome, 2003. – P. 336. 79. Fillatti J.J., Kiser J., Rose R. et al. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector // Biotech. – 1987. – Vol. 5. – P. 726-730. 80. Flores H.E., Protacio C.M., Signs M.W. Primary and secondary metabolism of polyamines in plants / in: Poulton J.E., Romeo J.T., Conn E.E., eds. Plant 113 Nitrogen Metabolism, Rec. Adv. Phytochem, Vol 23, Plenum Press, New York, 1989. – P. 329-393. 81. Flowers T.J., Garcia A., Koyama M. Breeding for salt tolerance in crop plantsthe role of molecular biology // Acta Physiologiae Plantarum. – 1997. – №19. – P. 427-433. 82. Frary A., Hamilton C.M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato // Transgenic Res. – 2001. – Vol. 10. – P. 121-132. 83. Fromm M.E., Taylor L.P., Walbot V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1985. – Vol. 82. – P. 5824-5825. 84. Fu J., Huang B. Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress // Environ. Expt. Bot. – 2001. – №45. – P. 105-114. 85. Fucc L., Oliver C.N., Coon M.J. et al. Inactivation of metabolic enzymes by mixed-function oxidation reaction: possible implication in protein turnover and aging // Proc Nat Acad Sci USA. – 1983. – №80. – P. 1521-1525. 86. Gadallah M.A.A. Effect of waterlogging and kinetin on the stability of leaf membranes, leaf osmotic potential, soluble carbon and nitrogen compounds and chlorophyll content of Ricinus plants // Phyton. – 1995. – №35. – P. 199–208. 87. Galston A.W., Sawhney R.K. Polyamines in plant physiology // Plant Physiol. – 1990. – №94. – P. 406-410. 88. Gao X., Ren Z., Zhao Y. et al. Overexpression of SOD increases salt tolerance of Arabidopsis // Plant Physiol. – 2003. – №133. – P. 1873-1881. 89. Garg A.K., Kim J.K., Owens T.G. et al. Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to different abiotic stresses. Proc Natl Acad Sci USA. –2002. – №99. – P. 15898–15903. 114 90. Genard H., Le Saos J., Billard J.P. et al. Effect of salinity on lipid composition, glycine betaine content and photosynthetic activity in chloroplasts of Suaeda maritima // Plant Physiol. Biochem. – 1991. – №29. – P. 421-427. 91. Giannopolitis C.N., Ries S. K. Superoxide dismutases occurrence in higher plants // Plant Physiol. – 1979. – Vol. 59. – P. 309-314. 92. Gill K.S., Dutt S.K. Physiological aspects of salt tolerance in barley and wheat grown in pots and coastal conditions // Ind. J. Agric. Sci. – 1987. – №57. – P. 409-415. 93. Gisbert C., Rus A.M., Bolarin M.C. et al. The yeast HAL1 gene improves salt tolerance of transgenic tomato // Plant Physiol. – 2000. – №123. – P. 393-402. 94. Gleeson D., Lelu Walter M.A., Parkinson M. Overproduction of proline in transgenic hybrid larch (Larix leptoeuropaea (Dengler)) cultures renders them tolerant to cold, salt and frost // Mol. Breed. – 2005. – №15. – P. 21-29. 95. Goel D., Singh A.K., Yadav V. et al. Overexpression of osmotin gene confers tolerance to salt and drought stresses in transgenic tomato (Solanum lycopersicum L.) // Protoplasma. – 2010. – №245. – P. 133–141. 96. Gomez J., Jimenez A., Olmos E. et al. Location and effects of long-term NaCl stress on superoxide dismitase and ascorbate peroxidase isoenzymes of pea (Pisum sativum, cv. Puget) chloroplasts // J. Exp. Bot. – 2004. – №55. – P. 119130. 97. Groppa M.D., Benavides M.P. Polyamines and abiotic stress: recent advances // Amino Acids. – 2008. – №34. – P. 35-45. 98. Gupta A.S., Webb R.P., Holaday A.S. et al. Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress // Plant Physiology. – 1993. – №103. – P. 1067-1073. 99. Gusta L.V., Benning N.T., Wu G. Superoxide dismutase: an all-purpose gene for agri-biotechnology // Mol Breed. – 2009. – №24. – P. 103-115. 100. Hamilton E.W., Heckathorn S.A. Mitochondrial adaptation to NaCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins, whereas complex II is 115 protected by proline and betaine // Plant Physiol. – 2001. – №126. – P. 12661274. 101. Hamza S., Chupeau Y. Re evaluation of conditions for plant regeneration and Agrobacterium-mediated transformation form tomato (Lycopersicon esculentum) // J. Exp. Bot. - 1993. - Vol. 44. - P. 1837-1845. 102. Handa A. K., Bressan R.A., Handa S. et al. Clonal variation for tolerance to polyethylene glycol-induced water stress in cultured tomato cells. Plant Physiol. – 1983. – №72. – P. 645-653. 103. Hasegawa P.M., Bressan R.A., Zhu J.K. et al. Plant cellular and molecular responses to high salinity // Ann. Rev. of Plant Phys. and Plant Mol. Biol. – 2000. – №51. – P. 463-499. 104. Henle E.S., Linn S. Formation, prevention, and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide // J Biol Chem. – 1997. –№272. – P. 19095-19098. 105. Hernandez J. A., Corpas F.J., Gomez M. et al. Salt-induced oxidative stress mediated by activated oxygen species in pea leaf mitochondria // Phys. Plantarum. – 1993. – Vol.89. – №1. – P. 103-110. 106. Hernandez J.A., Del Rio L.A., Sevilla F. Salt stress-induced changes in superoxide dismutase isozymes in leaves and mesophyll protoplasts from Vigna unguiculata (L.) // Walp. New Phytol. – 1994. – №126. – P. 37-44. 107. Hernandez J.A., Olmos E., Corpas F.J. et al. Salt-induced oxidative stress in chloroplasts of pea plants // Plant Sci. – 1995. – №105. – P. 151-167. 108. Horie T., Schroeder J.I. Sodium transporters in plants: diverse genes and physiological functions // Plant Physiol. –2004. – №136. – P. 2457-2462. 109. Hsieh T.H., Lee J.T., Charng Y.Y. et al. Tomato plants ectopically expressing Arabidopsis CBF1 show enhanced resistance to water deficit stress // Plant Physiol. – 2002. – №130. – P. 618-626. 110. Hu W., Phillips G.C. A combination of overgrowth control antibiotics improves Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation efficiency for cultivated 116 tomato (Lycopersicon esculentum) // In vitro Cell Dev Bio-Plant. – 2001. – Vol.37. – P. 12-18. 111. Hughes M.A., Dunn M.A. The molecular biology of plant acclimation to low temperature // J Exp Bot. – 1996. – №47. – P. 291-305. 112. Iida A., Seki M., Kamada M. et al. Gene delivery into cultured plant cells by DNA-coated gold particles accelerated by a pneumatic gun // Theor. Appl. Genet. – 1990. – Vol. 80. – P. 813–816. 113. Iida A., Yamashita T., Yamada Y., Morikawa H. Efficiency of particle bombardment-mediated transformation is influenced by cell cycle stage in synchronized cultured cells of tobacco // Plant Physiol. – 1991. – Vol. 97. – P. 1585-1587. 114. Inze D., Van Montagu M. Oxidative stress in plants. Curr. Opin. Biotechnol. – 1995. – №6. – P. 153-158. 115. Ivanov S., Konstantinova T., Parvanova D. et al. Effect of high temperatures on the growth, free proline content and some antioxidants in tobacco plants // C.R. Acad. Bulg. Sci. – 2001. – Vol.54. – №7. – P. 71-74. 116. Jaglo-Ottesen J., Zarka D.G., Schabenberger O. et al. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance // Science. – 1998. – №280. – P. 104-106. 117. Jang S.J., Shin S.H., Yee S.T. et al. Effects of abiotic stresses on cell cycle progression in tobacco BY-2 cells // Molecules and Cells. - 2005. - Vol. 20. - P. 136-141. 118. Jia G.X., Zhu Z.Q., Chang F.Q. et al. Transformation of tomato with the BADH gene from Atriplex improves salt tolerance // Plant cell Rep. – 2002. – Vol.21. – P. 141-146. 119. Jiang M., Zhang J. Water stress-induced abscisic acid accumulation triggers the increased generation of reactive oxygen species and up-regulates the activities of antioxidant enzymes in maize leaves // J. Exp. Bot. – 2002. – №53. – P. 2401– 2410. 117 120. Joersbo M., Brunstedt J. Electroporation and Transgenic Plant Production / in: Lynch P.T., Davey M.R., eds. Electrical Manipulation of Cells NY: Chapman and Hall, 1996. – P. 201-222. 121. Kagaya Y., Hobo T., Murata M. et al. Abscisic acid-induced transcription is mediated by phosphorylation of an abscisic acid response element binding factor, TRAB1 // Plant Cell. – 2002. – №14. – P. 3177-3189. 122. Kaminaka H., Morita S., Yokoi H. et al. Molecular cloning and characterization of a cDNA for plastidic copper/zinc-superoxide dismutase in rice (Oryza sativa L.) // Plant Cell Physiol. –1997. – №38. – P. 65-69. 123. Kaminska-Roiek E., Pukacki P. Effect of water deficit on oxidative stress and degradation of cell membranes in needles of Norway spruce (Picea abies) // Acta physiol. plant. – 2004. – №26. – P. 431-442. 124. Kang H.M., Saltveit M.E. Activity of enzymatic antioxidant defense systems in chilled and heat shocked cucumber seedlings radicles // Physiol Plant. – 2001. – №113. – P. 548-556. 125. Kasuga M., Miura S., Shinozaki K. et al. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible RD29A promoter improved drought- and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer // Plant Cell Physiol. – 2004. – №45. – P. 346-350. 126. Ketchum R.E.B., Warren R.C., Klima L.J. et al. The mechanism and regulation of proline accumulation in suspension cultures of the halophytic grass Distichlis spicata L. // J. Plant Physiol. – 1991. – №137. – P. 368-374. 127. Kishor P.B.K., Hong Z., Miao G.H. et al. Overexpression of pyrroline-5carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants // Plant Physiol. – 1995. – №108. – P. 1387-1394. 128. Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. et al. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells // Nature. –1987. – Vol. 327. – P. 70-73. 118 129. Klein T.M., Harper E.C., Svab Z. et al. Stable genetic transformation of intact Nicotiana cells by the particle bombardment process // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. – 1988. – Vol. 85. – P. 8502-8505. 130. Kramer G.F., Wang C.Y., Conway W.S. Inhibition of softening by polyamine application in ‘Golden Delicious’ and ‘McIntosh’ apples // J. Amer. Soc. Hort. Sci. –1991. – №116. – P. 813-817. 131. Krishna P, Gloor G. The Hsp90 family of proteins in Arabidopsis thaliana // Cell Stress Chaperones. – 2001. – №6. – P. 238-246. 132. Krishna P. Plant responses to heat stress / in: Hirt H., Shinozaki K., eds. Topics in Current Genetics. Vol. 4: Plant Responses to Abiotic Stress. Springer-Verlag, Berlin – Heidelberg, 2004. – P. 73-101. 133. Kulkarni M., Deshpande U. In vitro screening of tomato genotype for drought resistance using polyethylene glycol // African Journal of Biotechnology. – 2007. – №6. – P. 69-696. 134. Kumar V., Sharma A., Prasad B.C.N. et al. Agrobacterium rhizogenes mediated genetic transformation resulting in hairy root formation is enhanced by ultrasonication and Biotechnology. – acetosyringone 2006. – treatment Vol. 9. // – Electronic №4. Journal Access of mode: http://www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/view/v9n44/322 135. Kwak J.M., Mori I.C., Pei Z.M. et al. NADPH oxidase AtrbohD and AtrbohF genes function in ROS-dependent ABA signaling in Arabidopsis // EMBO J. – 2003. – №22. – P. 2623-2633. 136. Lal S., Gulyani V., Khurana P. Overexpression of HVA1 gene from barley generates tolerance to salinity and water stress in transgenic mulberry (Morus indica) // Transgenic Res. – 2008. – №17. – P. 651-663. 137. Lang V., Mantyla E., Welin B. et al. Alterations in water status, endogenous abscisic acid content and expression of rabZ8 gene during the development of 119 freezing tolerance in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. – 1994. – №104. – P. 1341-1349. 138. Lee D.H., Kim Y.S., Lee C.B. The inductive responses of the antioxidant enzymes by salt stress in the rice (Oryza sativa L.) // J. Plant Physiol. – 2001. – №158. – P. 737-745. 139. Lee J.H., Hubel A., Schoffl F. Derepression of the activity of genetically engineered heat shock factor causes constitutive synthesis of heat shock proteins and increased thermotolerance in transgenic Arabidopsis // Plant J. – 1995. – №8. – P. 603-612. 140. Lenaz G. Role of mitochondria in oxidative stress and aging // Biochim. Biophys. Acta. – 1998. – №1366. – P. 53-67. 141. Li H.J., Yang A.F., Zhang X.C. et al. Improving freezing tolerance of transgenic tobacco expressing sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase gene from Lactuca sativa // Plant Cell Tissue Organ. Cult. – 2007. – №89. – P. 37-48. 142. Lilius G., Holmberg N., Bulow L. Enhanced NaCl stress tolerance in transgenic tobacco expressing bacterial choline dehydrogenase // Biotechnol. – 1996. – Vol. 14 – №2. – P. 177-180. 143. Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y. et al. Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis // Plant Cell. – 1998. – №10. – P. 13911406. 144. Lovaas E. Antioxidative and metal-chelating effects of polyamines // Adv. Pharmacol. – 1997. – №38. – P. 119-149. 145. Lurie S., Shatai S., Schoffl F. et al. Fruits of tomato plants expressing the chimeric HSF-GUS gene manifest increased tolerance to high and low temperature stresses // IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture: Abstr. (June 14–19, 1998). – Jerusalem, 1998. – P. 160. 120 146. Ma S., Gong Q., Bohnert H.J. Dissecting salt stress pathways // J. Exp. Bot. – 2006. – Vol. 57. – №5. – P. 1097-1107. 147. Makela P., Kontturi M., Pehu E. et al. Photosynthetic response of drought- and salt-stressed tomato and turnip rape plants to foliar-applied glycinebetaine // Physiol. Plant. – 1999. – №105. – P. 45-50. 148. Manoharan M., Dahleen L.S. Genetic transformation of the commercial barley (Hordeum vulgare L.) cultivar conlon by particle bombardment of callus // Plant Cell Rep. – 2002. – Vol. 21. – P. 76-80. 149. Marton L., Wullems G.J., Molendijk L. et al. In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium Tumefaciens // Nature (Lond). – 1979. – Vol. 277. – P. 129-131. 150. McClellan A.J., Xia Y., Deutschbauer A.M. et al. Diverse cellular functions of the Hsp90 molecular chaperone uncovered using systems approaches // Cell. – 2007. – №131. – P. 121-135. 151. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase, an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) // J. Biol. Chem. – 1969. – №244. – P. 6049-6055. 152. McCormick S., Niedermeyer J., Fry J. et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (Lycopersicon esculentum) using Agrobacterium tumefaciens // Plant Cell Rep. – 1986. – Vol. 5. – P. 81-84. 153. McKersie B.D., Murnaghan J., Jones K.S. et al. Iron-superoxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases winter survival without a detectable increase in photosynthetic oxidative stress tolerance // Plant Physiology. – 2000. – №122. – P. 1427-1438. 154. Mead J.F. Free radical mechanism of lipid damage andconsequences for cellular membranes / in: Pryor WA, ed. Freed radicals in biology, vol 1. Academic Press NY. – 1976. – P. 51-68. 155. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends in Plant Science. – 2002. – №9. – P. 405-410. 121 156. Mittler R., van der Auwerra S., Gollery M. et al. Reactive oxygen gene network of plants // Trends Plant Sci. – 2004. – №10. – P. 490-498. 157. Mittova V., Tal M., Volokita M. et al. Up-regulation of the leaf motochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt-induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii // Plant Cell Envir. – 2003. – №26. – P. 845-856. 158. Moghaieb R.E.A., Saneoka H., Fujita K. Shoot regeneration from GUStransformed tomato (Lycopersicon esculentum) haity root // Cell. and Mol. Biol. Lett. – 2004. – Vol. 9. – P. 439-449. 159. Mohamed E.A., Iwaki T., Munir I. et al. Overexpression of bacterial catalase in tomato leaf chloroplasts enhances photo-oxidative stress tolerance // Plant Cell Environ. – 2003. – №26. – P. 2037-2046. 160. Moons A., Bauw G., Prinsen E. et al. Molecular and physiological responses to abscisic acid and salts in roots of salt-sensitive and salt-tolerant Indica rice varieties // Plant Physiol. – 1995. – №107. – P. 177-186. 161. Moons A., Prinsen E., Bauw G. et al. Antagonistic effects of abscisic acid and jasmonates on salt stress inducible transcripts in rice roots // Plant Cell. – 1997. – №9. – P. 2243-2259. 162. Moran J. F., James E. K., Rubio M. C. et al. Functional characterization and expression of a cytosolic iron-superoxide dismutase from cowpea root nodules // Plant Physiol. – 2003. – №133. – P. 773-782. 163. Mullineaux P.M., Karpinski S., Baker N.R. Spatial dependence for hydrogenperoxide-directed signaling in light-stressed plants // Plant Physiol. – 2006. – Vol. 141. – P. 346-350. 164. Munns R., Tester M. Mechanisms of salinity tolerance // Annu. Rev. Plant Biol. – 2008. – №59. – P. 651-681. 165. Murasighe T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioasays in tobacco tissue culture // Physiologia Plantarum. – 1962. – Vol. 15. – P. 473-479. 122 166. Murata N. Enhancement of tolerance to multiple stresses by genetic engineering // Abstr. IX Intern. Congr. Plant Tissue Cell Culture (June 14–19, 1998). – Jerusalem, 1998. – P. 34. 167. Myouga F., Hosoda C., Umezawa T. et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis // The Plant Cell. – 2008. – №20. – P. 3148-3162. 168. Nakano Y., Asada K. Hydrogen Peroxide Is Scavenged by Ascorbate Specific Peroxidase in Spinach Chloroplasts // Plant Cell Physiol. – 1981. – Vol. 22. – P. 867-880. 169. Nakashima K. and Yamaguchi-Shinozaki K. Regulons involved in osmotic stress-responsive and cold stress-responsive gene expression in plants // Physiologia Plantarum. – 2006. – №126. – P. 62-71. 170. Nanjo T., Kobayashi M., Yoshiba Y. et al. Antisence suppression of proline degradation improves tolerance to freezing and salinity in Arabidopsis thaliana // FEBS Lett. – 1999. – №461. – P. 205-210. 171. NDong C., Danyluk J., Wilson K.E. et al. Cold-regulated cereal chloroplast late embryogenesis abundant-like proteins. Molecular characterization and functional analyses // Plant Physiology. – 2002. – №129. – P. 1368-1381. 172. Neuhaus G., Spangenberg G. Plant transformation by microinjcction techniques // Physiol. Plant. – 1990. – Vol. 79. – P. 213-217. 173. Neumann D., Nover L., Parthier B. et al. Heat shock and other stress response systems of plants // Biol. Zentralbl. – 1989. – №108. – P. 1-156. 174. Noctor G., Foyer C.H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1998. – №49. – P. 249279. 175. Nyman P.O. A modified method for the purification of erytrocuprein // Buochim. biophys. acta. – 1960. – №45. – P. 387-389. 123 176. Oberschall A., Deak M., Torok K. et al. A novel aldose/aldehyde reductase protects transgenic plants against lipid peroxidation under chemical and drought stresses // Plant Journal. – 2000. – №24. – P. 437-446. 177. Ogawa K., Kanematsu S., Takabe K. et al. Attachment of CuZn-superoxide dismutase to thylakoid membrane at the site of superoxide generation (PSI) in spinach chloroplast: detection by immunogold labeling after rapid freezing and substitution method // Plant Cell Physiol. – 1995. – №36. – P. 565-573. 178. Ogawa K., Kanematsu S., Asada K. Intra and extra-cellular localization of «cytosolic» CuZn-superoxide dismutase in spinach leaf and hypocotyls // Plant Cell Physiol. – 1996. – №37. – P. 790-799. 179. Olsen J.V., Blagoev B., Gnad F. et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. // Cell. – 2006. – Vol. 127. – №3. – P. 635-648. 180. Orsini F., Cascone P., Pascale S.D. et al. System independent salinity tolerance in tomato: Evidence of specific convergence of abiotic and biotic stress responses // Physiol. Plant. – 2010. – №138. – P. 10-21. 181. Ozturk L., Demir Y. In vivo and In vitro protective role of proline // Plant Growth Regul. – 2002. – №38. – P. 259-264. 182. Paleg L.G., Douglas T.J., van Daal A. Proline, betaine and other organic solutes protect enzymes against heat inactivation // Austr. J. Plant Physiol. – 1998. – Vol. 8. – №1. – P. 107-114. 183. Parida A.K., Das A.B. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review // Ecotoxicol. Environ. Saf. – 2005. – №60. – P. 324-349. 184. Park E.J., Jeknic Z., Sakamoto A. et al. Genetic engineering of glycine betaine synthesis in tomato protects seeds, plants, and flowers from chilling damage // Plant J. – 2004. – №40. – P. 474-487. 185. Park E.J., Jeknic Z., Chen T.H.H. Exogenous application of glycine betaine increases chilling tolerance in tomato plants // Plant Cell Physiol. – 2006. – №47. – P. 706-714. 124 186. Park S.H., Morris J.L., Park J.E. et al. Efficient and genotype independent Agrobacterium-mediated tomato transformation // Plant Physiol. – 2003. – Vol. 160. – P. 1253-1257. 187. Park E.J., Jeknic Z., Chen T.H.H. Exogenous application of glycine betaine increases chilling tolerance in tomato plants // Plant Cell Physiol. – 2006. – №47. – P. 706-714. 188. Parvanova D., Ivanov S., Konstantinova T. et al. Transgenic tobacco plants accumulating osmolytes show reduced oxidative damage under freezing stress // Plant. Physiol. Biochem. – 2004. - №42. – P. 57-63. 189. Paszkowski J., Shillito R.D., Saul M.W. et al. Direct gene transfer to plants // EMBO J. – 1984. – Vol. 3. – P. 2717-2722. 190. Perl-Treves R., Nacmias B., Aviv D. et al. Isolation of two cDNA clones from tomato containing two different superoxide dismutase sequences // Plant Mol. Biol. – 1988. – №11. – P. 609-624. 191. Perl A., Perl-Treves R., Galili S. et al. Enhanced oxidative stress defence in transgenic potato expressing tomato Cu,Zn superoxide dismutases // Theoretical and Applied Genetics. – 1993. – №85. – P. 568-576. 192. Pesaresi P., Schneider A., Kleine T. et al. Interorganellar communication // Curr. Opin. Plant Biol. – 2007. – Vol. 10. – P. 600-606. 193. Pharr D.M., Stoop J.M.H., Williamson J.D. et al. The dual role of mannitol as osmoprotectant and photoassimilate in celery // Hortscience. – 1995. – №30. – P. 1182-1188. 194. Pilon‐Smits E.A.H., Terry N., Sears T. et al. Enhanced drought resistance in fructan‐producing sugar beet // Plant Physiology and Biochemistry. – 1999. – №37. – P. 313-317. 195. Potrykus I., Shillito R.D., Saul M.W. et al. Direct gene transfer: State of the art and future potential // Plant Mol. Biol. Rep. – 1985. – Vol. 3. – P. 117-128. 125 196. Prasad T.K., Anderson M.D., Martin B.A. et al. Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide // Plant Cell. – 1994. – Vol. 6. – P. 65-74. 197. Queitsch C., Hong S.W., Vierling E. et al. Heat stress protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Arabidopsis // Plant Cell. – 2000. – №12. – P. 479-492. 198. Queitsch C., Sangster T.A., Lindquist S. Hsp90 as a capacitor of phenotypic variation // Nature. – 2002. – №417. – P. 618-624. 199. Rapp I., Adams W.C., Miller R.W. Purification of superoxide dismutase from fungi and characterization of the reaction of the enzyme with catechols by electron spin resonance spectroscopy // Can. J. Biochem. – 1973. – №51 – P. 158-171. 200. Rehman S., Harris P.J.C., Ashraf M. Stress environments and their impact on crop production / in: Ashraf M., Harris P.J.C., eds. Abiotic Stresses: Plant Resistance Through Breeding and Molecular Approaches. Haworth Press, New York, 2005. – P. 3-18. 201. Reichheld J.P., Vernoux Т., Lardon F. et al. Specific checkpoints regulate plant cell cycle progression in response to oxidative stress // Plant Journal. – 1999. – Vol. 17. – P. 647-656. 202. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. – 1963. – №17. – P. 208-212. 203. Rhodes D., Hanson A.D. Quaternary ammonium and tertiary sulfonium compounds in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1993. – №44. – P. 357-384. 204. Riechmann, J.L., Heard, J., Martin, G. et al. Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes // Science. – 2000. – №290. – P. 2105-2110. 205. Riggs C.D., Bates G.W. Stable transformation of tobacco by electroporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1986. – Vol. 83. – P. 5602-5606. 126 206. Robertson A.J., Ishikawa M., Gusta L.V. et al. Abscisic acid-induced heat tolerance in Bromus inermis Leyss cell-suspension cultures. Heat-stable, abscisic acid-responsive polypeptides in combination with sucrose confer enhanced thermostability // Plant Physiol. – 1994. – №105 – P. 181-190. 207. Rodenburg K.W., de Groot M.J.A, Schilperoort R.A. et al. Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plant protoplasts // Plant Mol. Biol. – 1989. – Vol. 13. – P. 711-719. 208. Romero J.P., Houlne G., Cana L. et al. Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explant for Agrobacterium -mediated transformation // Plant Cell Tissue and Org Cult. – 2001. – Vol. 67. – P. 173-180. 209. Roosens N.H., Bitar F.A., Loenders K. et al. Overexpression of ornithine-daminotransferase increases proline biosynthesis and confers osmotolerance in transgenic plants // Mol. Breed. – 2002. – №9. – P. 73-80. 210. Roxas V.P., Smith R.K., Allen E.R. et al. Overexpression of glutathione Stransferase/glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress // Nat. Biotechnol. – 1997. – №15. – P. 988-991. 211. Ruf S., Hermann M., Berger I.J. et al. Stable genetic transformation of tomato plastids and expression of a foreign protein in fruit // Nat. Biotech. – 2001. – Vol. 19. – P. 870-875. 212. Ruma D., Dhaliwal M.S., Kaur A. et al. Transformation of tomato using biolistic gun for transient expression of the β-glucuronidase gene // Indian Journal of Biotechnology. – 2009. – Vol. 8. – №4. – P. 363-369. 213. Russel J.A., Roy M.K., Sanfor J.C. Major improvement in biolistic transformation of suspension-cultured tobacco cells // In Vitro Cell. Dev. Biol. – 1992. – Vol. 28. – P. 97-105. 214. Sabater B., Rodriguez M.I. Control of chlorophyll degradation in detached leaves of barley and oat through effect of kinetine on chlorophyllase levels // Physiol Plant. – 1978. – №43. – P. 274-276. 127 215. Sade N., Gebretsadik M., Seligmann R. et al. The role of tobacco aquaporin1 in improving water use efficiency, hydraulic conductivity, and yield production under salt stress // Plant Physiol. – 2010. – №152. – P. 245-254. 216. Sakamoto A., Murata A., Murata N. Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold // Plant Mol. Biol. – 1998. – Vol. 38. – №6. – P. 1011-1019. 217. Sakamoto A., Murata N. Genetic engineering of glycinebetaine synthesis in plants: current status and implications for enhancement of stress tolerance // Journal of Experimental Botany. – 2000. – №51. – P. 81-88. 218. Salin M.L. Toxic oxygen species and protective systems of the chloroplast // Physiol. Plant. – 1988. – №72. – P. 681-689. 219. Santos C.L.V., Campos A., Azevedo H. et al. In situ and in vitro senescence induced by KCl stress: Nutritional imbalance, lipid peroxidation and antioxidant metabolism // J. Exp. Bot. – 2001 – №52, P. 351-360. 220. Scandalios J.G. Molecular genetics of superoxide dismutase in plants / in: Scandalios J.G., ed. Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press., 1997. – P. 527-568. 221. Scandalios J.G. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses // Braz. J. Med. Biol. Res. – 2005. – №38. – P. 995-1014. 222. Schnorf M., Neuhaus-Url G., Galli A.et al. An improved approach for transformation of plant cells by microinjection: molecular and genetic analysis // Transgenic Research. – 1991. – Vol. 1. – №1. – P. 23-30. 223. Seong E.S., Baek K.H., Oh S.K. et al. Induction of enhanced tolerance to cold stress and disease by over-expression of the pepper CAPIF1 gene in tomato // Physiol. Plant. – 2007. – №129. – P. 555-566. 224. Serraj R., Sinclair T.R. Osmolyte accumulation: can it really help increase crop yield under drought conditions? // Plant Cell Environ. – 2002. – Vol. 25. – №2. – P. 333-341. 128 225. Shahin E.A. Totipotency of tomato protoplasts // Theor. Appl. Genet. – 1985. – Vol. 69. – P. 235-241. 226. Shen B., Jensen R.G., Bohnert H.J. Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants by targeting mannitol biosynthesis to chloroplast // Plant Physiol. – 1997. – №113. – P. 1177-1183. 227. Shi H., Lee B.H., Wu S.J. et al. Overexpression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana // Nat. Biotechnol. – 2003. – №21. – P. 81-85. 228. Shillito R.D., Saui M.W., Paszkowski J. et al. Direct gene transfer to plants // Newsl. Int. Assoc. Phml. Tissue Culture. – 1986. – P. 5-15. 229. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways // Curr. Opin. Plant Biol. – 2000. – №3. – P. 217-223. 230. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. Gene networks involved in drought stress response and tolerance // J. Exp. Bot. – 2007. – Vol. 58. – №2. – P. 221227. 231. Sigareva M., Spivey R., Willits M.G. et al. An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants // Plant Cell Rep. – 2004. – Vol. 23. – P. 236-245. 232. Sigee D.C., Smith V.A., Hindley J. Passage of bacterial DNA into host cells during in vitro transformation of Nicotiana tabacum by Agrobacterium Tumefaciens // Microbios. – 1982. – Vol. 34. – №136. – P. 113-132. 233. Singha S., Choudhuri M.A. Effect of salinity (NaCl) stress on H2O2 metabolism in Vigna and Oryza seedlings // Biochem. Physiol. Pflanz. – 1990. – №186. – P. 69-74. 234. Sivamani E., Bahieldin A., Wraith J.M. et al. Improved biomass productivity and water use efficiency under water deficit conditions in transgenic wheat constitutively expressing the barley HVA1 gene // Plant Science. – 2000. – №155. – P. 1-9. 129 235. Smirnoff N. The role of active oxygen in the response of plants to water deficit and desiccation // New Phytologist. – 1993. – №125. – P. 27-58. 236. Srivastava K.M., Hallan V., Raizada R.K. et al. Molecular cloning of Indian tomato leaf curl virus genome following a simple method of concentrating the supercoiled replicative form of viral DNA // J. Virol. Methods. – 1995. – №51. – P. 297-304. 237. Sun H.J., Uchii S., Watanabe S. et al. A highly efficient transformation protocol for Micro-Tom, a model cultivar for tomato functional genomics // Plant Cell Physiol. – 2006. – Vol. 47. – P. 426-431. 238. Szekely G., Abraham E., Cseplo A. et al. Duplicated P5CS genes of Arabidopsis play distinct roles in stress regulation and developmental control of proline biosynthesis // Plant J. – 2008. – Vol. 53. – №1. – P. 11-28. 239. Takabe T., Hayashi Y., Nakamura T. et al. Genetic engineering of glycinebetaine accumulation and increased salinity tolerance in plants // Abstr. 5th Intern. Congr. Plant Mol. Biology (21–27 Sept. 1997). – Singapore, 1997. – P. 667. 240. Tanaka Y., Hibino T., Hayashi Y. et al. Salt tolerance of transgenic rice overexpressing yeast mitochondrial Mn-SOD in chloroplasts // Plant Sci. – 1999. – №148. – P. 131-138. 241. Tang J., Misson L., Gershenson A. et al. Continuous measurements of soil respiration with and without roots in a ponderosa pine plantation in the Sierra Nevada Mountains // Agric. For. Meteorol. – 2005. – №132. – P. 212-227. 242. Tang K., Wu A., Yao J. et al. Development Mediated Transformation and Genetic Analysis –Based Selection // Acta Biotech. – 2000. – Vol. 20. – P. 175183. 243. Thomashow M.F., Gilmour S.J., Stockinger E.J. et al. Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation // Physiologia Plantarum. – 2001. – Vol. 112. – №2. – P. 171-175. 130 244. Tognetti J.A., Salerno G.L., Crespi M.D. et al. Sucrose and fructan metabolism of different wheat cultivars at chilling temperatures // Physiol. Plant. – 1990. – №78. – P. 554-559. 245. Toyoda H., Matsuda Y., Utsumi R. et al. Intranuclear microinjection for transformation of tomato callus cultures // Plant Cell Rep. – 1988. – Vol. 7. – P. 293-296. 246. Turner N.C., Shahal A., Berger J.D. et al. Osmotic adjustment in chickpea (Cicer arietinum L.) results in no yield benefit under terminal drought // J. Exp. Bot. – 2007. – №58. – P. 187-194. 247. Van Camp W., Bowler C., Villarroel R.et al. Characterization of iron superoxide dismutase cDNAs from plants obtained by genetic complementation in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1990. – Vol. 88. – P. 99039907. 248. Van Camp W., Willekens H., Bowler C. et al. Elevated levels of superoxide dismutase protect transgenic plants against ozone damage // Biotechnology. – 1994. – №12. – P. 165-168. 249. Van Camp W., Capiau K., Van Montagu M. et al. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts // Plant Physiology. – 1996. – №112. – P. 1703-1714. 250. Van Eck J.M., Blowers A.D., Earle E.D. Stable transformation of tomato cell cultures after bombardment with plasmid and YAC DNA // Plant Cell Rep. – 1995. – Vol. 14. – P. 299-304. 251. Vanjildorj E., Bae T.W., Riu K.Z. et al. Overexpression of Arabidopsis ABF3 gene enhances tolerance to drought and cold in transgenic lettuce (Lactuca sativa) // Plant Cell Tiss. Org. Cult. – 2005. - №83. – P. 41-50. 252. Vannini C., Campa M., Iriti M. et al. Evaluation of transgenic tomato plants ectopically expressing the rice Osmyb4 gene // Plant Sci. – 2007. – №173. – P. 231-239. 131 253. Vannini C., Locatelli F., Bracale M. et al. Overexpression of the rice Osmyb4 gene increases chilling and freezing tolerance of Arabidopsis thaliana plants // Plant J. – 2004. – Vol. 37. – №1. – P. 115-127. 254. Van Roekel J.S.C., Damm B., Melchers L.S. et al. Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum) // Plant Cell Rep. – 1993. – Vol. 12. – P. 644-647. 255. Vartapetian B.B., Andreeva I.N., Generozova I.P. et al. Functional electron microscopy in studies of plant response and adaptation to anaerobic stress // Ann. Bot. – 2003. – Vol. 91. – №2. – P. 155-172. 256. Velcheva M., Faltin Z., Flaishman M. et al. A liquid culture system for Agrobacterium-mediated transformation of tomato (Lycopersicon esculentum) // Plant Sci. – 2005. – Vol. 168. – P. 121-130. 257. Venkateswarlu K., Nazar R.N. Evidence for T-DNA mediated gene targeting to tobacco chloroplasts // Biotechnology. – 1991. – Vol. 9. – P. 1103-1105. 258. Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1991. – №42. – P. 579-620. 259. Waie B., Rajam M.V. Effect of increased polyamine biosynthesis on stress responses in transgenic tobacco by introduction of human S-adenosylmethionine gene // Plant Sci. – 2003. – №164. – P. 727-734. 260. Walden R., Wingender R. Gene-transfer and plant-regeneration techniques // Trends Biotechnol. – 1995. – Vol. 13. – P. 324-331. 261. Wang B., Luttge U., Ratajczak R. Specific regulation of SOD isoforms by NaCl and osmotic stress in leaves of the C3 halophyte Suaeda salsa L // J. Plant Physiol. – 2004. – №161. – P. 285-293. 262. Wang H., Hao J., Chen X. et al. Overexpression of rice WRKY89 enhances ultraviolet B tolerance and disease resistance in rice plants // Plant Molecular Biology. – 2007. – №65. – P. 799-815. 132 263. Wise A.A., Liu Z., Binns A.N. Nucleic Acid Extraction from Agrobacterium Strains // Agrobacterium Protocols. Methods in Molecular Biology. – 2006. – Vol. 343. – P. 67-76. 264. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.K. Cell Signaling during Cold, Drought, and Salt Stress // The Plant Cell. – 2002. – Vol. 14. – P.165-183. 265. Xu D., Duan X., Wang B. et al. Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice // Plant Physiol. – 1996. – №110. – P. 249-257. 266. Xu Z.S., Xia L.Q., Chen M. et al. Isolation and molecular characterization of the Triticum aestivum L. ethylene-responsive factor 1 (TaERF1) that increases multiple stress tolerance // Plant Molecular Biology. – 2007. – №65. – P. 719732. 267. Yamada M., Morishita H., Urano K. et al. Effects of free proline accumulation in petunias under drought stress // J. Exp. Bot. – 2005. – №56. – P. 1975-1981. 268. Yang A.F., Duan A.G., Gu X.F. et al. Efficient transformation of beet (Beta vulgaris) and production of plants with improved salt-tolerance // Plant Cell Tissue Organ and Culture. – 2005. – №83. – P. 259-270. 269. Yeo A.R., Caporn S.J.M., Flowers T.J. The effect of salinity upon photosynthesis in rice (Oryza sativa L.): gas exchange by individual leaves in relation to their salt content // J. Exp. Bot. – 1985. – №36. – P. 1240-1248. 270. Zapata P.J., Serrano M., Pretel M.T. et al. Polyamines and ethylene changes during germination of different plant species under salinity // Plant Sci. – 2004. – №167. – P. 781-788. 271. Zhang J., Kirkham M.B. Drought-stress induced changes in activities of superoxide dismutase, catalase and peroxidases in wheat leaves // Plant Cell Physiol. – 1994. – №35. – P. 785-791. 272. Zhang J., Tan W., Yang X.H. et al. Plastid-expressed choline monooxygenase gene improves salt and drought tolerance through accumulation of glycine betaine in tobacco // Plant Cell Rep. – 2008. – Vol. 27. – №6. – P. 1113-1124. 133 273. Zhang H.X., Blumwald E. Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit // Nat. Biotechnol. – 2001. – №19. – P. 765-768. 274. Zhifang G., Loescher W.H. Expression of a celery mannose 6-phosphate reductase in Arabidopsis thaliana enhances salt tolerance and induces biosynthesis of both mannitol and a glucosyl-mannitol dimer // Plant, Cell and Environment. – 2003. – №26. – P. 275-283. 275. Zhu D., Scandalios J.G. Differential accumulation of manganese-superoxide dismutase transcripts in maze in response to abscisic acid and high osmoticum // Plant Physiol. – 1994. – №106 – P. 173-178. 276. Zhu J.K. Cell signaling under salt, water and cold stresses // Curr. Op. in Plant Biol. – 2001. – №4. – P. 401-406. 277. Zhu J.K. Salt and drought stress signal transduction in plants // Annu. Rev. Plant Biol. – 2002. – №53. – P. 247-273.
