АВТОРЕФЕРАТ Исследование процесса получения продуктов белковой и углеводной природы из белого лепестка сои

На правах рукописи
ХОАНГ ТХИ МИНЬ НГУЕТ
Исследование процесса получения
продуктов белковой и углеводной
природы из белого лепестка сои
Специальность 03.00.23 – биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Москва
2009 г
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического
университета им. Д.И. Менделеева.
Научный руководитель:
кандидат химических наук, доцент
Красноштанова Алла Альбертовна
Официальные оппоненты:
доктор технических наук,
Винаров Александр Юрьевич
кандидат технических наук,
Соболева Наталья Павловна
Ведущая организация:
Институт биохимической физики
им. Н.М. Эмануэля РАН
Защита состоится «22» декабря 2009 г. в 1430 часов на заседании объединенного
Диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом
университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9 в
аудитории 443 (конференц-зал).
С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ
им. Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан «___»__________ 2009г.
Учёный секретарь
Диссертационного совета
ДМ 212.204.13
Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время одной из наиболее актуальных
проблем является продовольственная. Важнейшим из компонентов питания,
составляющих основу процессов жизнедеятельности человека, является белок.
Увеличение спроса на белки для питания человека происходит в соответствии с
общей концепцией повышения уровня жизни. По данным ВОЗ более 60%
человечества питается неудовлетворительно, не получая, в частности, достаточного
количества белка.
Недостаток
белков в питании нарушает динамическое равновесие
метаболических процессов с участием белков, сдвигая его в сторону преобладания
распада собственных белков клетки, что приводит к истощению организма. В связи с
этим особую значимость приобретают вопросы обеспечения населения белковыми
компонентами питания, а также приоритет исследований в этом направлении,
подтверждаемый разработкой и осуществлением специальных программ в
промышленно-развитых странах мира [Чичева – Филатова, 2004].
Одним из путей решения проблемы дефицита белка является разработка новых
технологий получения пищевого белка из возобновляемого сырья, мало
используемого в процессе получения продуктов питания: жмыхи и шроты масличных
и бобовых культур, зеленая масса растений, перья птиц, шерсть, внутренности рыб [Киреева, 1994].
Одним из перспективных источников белка является растительное сырьё,
прежде всего злаковые, масличные, бобовые культуры, биомасса зеленых растений, а
также соевые бобы, аминокислотный состав белка которых наиболее близок к
животному белку. Благодаря уникальному составу (около 40% протеинов и 20%
жира), оптимальному соотношению аминокислот, содержанию витаминов, микро- и
макроэлементов, полиненасыщенных жирных кислот и отсутствию холестерина
продукты на основе сои являются лечебно- профилактическими [Бегеулов, 2006].
Для их получения чаще всего используется белый лепесток – полупродукт,
получаемый после отжима соевого масла. Известные из литературы технологии
переработки сои предполагают получение главным образом белковых концентратов и
изолятов.
Однако в первом случае получаемый продукт содержит низкомолекулярные
пептиды, что ухудшает его качество, а во – втором образуется значительное
количество отходов, которые не могут быть непосредственно утилизированы на
__________________________________________________________________________
Список сокращений
БЛ – белый лепесток, ИЭТ – изоэлектрическая точка, СВ – сухое вещество, ВМФ –
высокомолекулярная фракция, НМФ – низкомолекулярная фракция, УВ – углеводы, ФП –
ферментный препарат, ТСХ – тонкослойная хроматография
1 традиционных очистных сооружениях.
Анализ мировой практики использования соевых бобов показывает, что
имеется несколько крупных секторов их потребления: производство растительного
масла, кормов, белковых продуктов питания. Кроме того, соевые белковые
концентраты и изоляты могут использоваться в качестве ингредиентов в
производстве традиционных белковых продуктов питания [Бутова с соавт., 2003].
Помимо белковых веществ, соевые бобы содержат углеводы, такие как глюкоза
– 0,01%, фруктоза (моно-) – 0,55%, сахароза (ди-) – 5,1%, раффиноза (три-) – 1,58%,
стахиоза (тетра-) – 3,0%, а также полисахариды (крахмал и др.) и нерастворимые
структурные полисахариды (гемицеллюлозы, пектиновые вещества) – 14,1%
[Скурихин с соавт., 1987]. Среди перечисленных углеводов раффиноза и стахиоза
представляют наибольший практический интерес, поскольку используются в
спортивном питании, а также в качестве заменителей сахара в диабетическом питании
[Бегеулов, 2006].
Целью настоящей работы явилась разработка основ технологии получения
веществ белковой и углеводной природы из белого лепестка сои.
В задачи работы входило:
1) изучить количественные закономерности процессов экстракции белковых веществ
из белого лепестка сои; ультраконцентрирования полученных экстрактов; осаждения
ВМФ белка в изоэлектрической точке;
2) установить оптимальные условия обработки белого лепестка различными
экстрагентами, что обеспечило бы максимальный выход ВМФ белка; подобрать
оптимальные условия выделения и очистки белкового изолята методами осаждения
из водных и водно-спиртовых растворов, а также диафильтрации, что обеспечило бы
получение препарата пищевого назначения;
3) разработать основы технологии получения белкового продукта кормового
назначения из белоксодержащих отходов производства изолята;
4) разработать основы технологии получения раффинозы и стахиозы из
депротеинизированного белого лепестка;
5) провести ориентировочные технико-экономические расчеты для разработанной
технологии.
Научная новизна. Показана возможность применения для описания процесса
экстракции белка из БЛ сои ранее разработанных кинетических моделей
аналогичных процессов для микробного и животного сырья. Подобраны оптимальные
условия, обеспечивающие максимальный выход ВМФ белка.
Впервые показана принципиальная возможность получения кормового
продукта на основе белоксодержащих отходов производства изолята белка путем
сорбции белковых веществ на малорастворимых солях кальция.
2 Впервые показана принципиальная возможность получения олигосахаридов:
стахиозы и раффинозы из депротеинизированного белого лепестка.
Практическая значимость. Разработана принципиальная схема комплексной
переработки белого лепестка сои с получением продуктов белковой и углеводной
природы: белкового изолята сои, белкового продукта кормового назначения,
раффинозы и стахиозы. В результате выход изолята белка, содержащего не менее
90% основного вещества, составляет 95% от содержания сырого протеина в БЛ,
кормового белкового продукта, содержащего 30% белка, с выходом 10% от
содержания сырого протеина в БЛ, стахиозы и раффинозы, содержащих не менее
90% основного вещества, с выходом соответственно 63% и 51% от их содержания в
БЛ.
Показано, что предложенный способ утилизации жидких стоков в кормовой
белковый продукт позволил снизить их ХПК в 25 раз.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на IV и V
международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективны развития»
(Москва, март 2008 г.; Москва, март 2009 г.), Международных конференциях «Успехи
в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, ноябрь
2007 г.; Москва, ноябрь 2008 г.; Москва, ноябрь 2009 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов
докладов в материалах научных конференций, в том числе 1 статья из списка
журналов, рекомендованных ВАК.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методик проведения экспериментов и
анализов, 3-х глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их
обсуждение, выводов, списка литературы, приложений. Работа изложена на 150 стр. и
содержит 36 рисунков, 48 таблиц. Библиография включает 111 наименований работ,
из них 33 иностранных источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Обзор литературы
В обзоре литературы приводится характеристика источников получения
растительных белков; описаны области применения сои в народном хозяйстве,
характеристика и биологические свойства сои; описание и анализ основных
технологических приемов получения белковых препаратов и углеводов на основе сои;
описание методов, применяемых для очистки сточных вод пищевой промышленности
и современных способов извлечения белковых веществ из сточных вод.
2. Материалы и методы
Объектом исследования являлась биомасса соевого белого лепестка
производства США, содержащего 43±2% сырого протеина с влажностью 9±2%.
3 В работе использовали химические реактивы квалификации не ниже «чда».
Содержание сырого протеина определяли микрометодом Къельдаля [Асатиани, 1964];
растворённые белковые вещества – по модифицированному методу Лоури [Lowry,
1951]. Общее содержание углеводов определяли методом Дюбуа (в фенол-серной
реакции) [Жданов, 1963]. Влажность сухой биомассы определяли по методике
[Шакир с соавт., 2008] , жироудерживающую способность (ЖУС),
жироэмульгирующую способность (ЖЭС) и доли растворимого белка в белковых
препаратах (NSI) – по методике [Шакир с соавт., 2008], ХПК – по методике [Лобачев,
2006].
Исследование количественных закономерностей процесса экстракции белковых
веществ из биомассы БЛ сои проводили в стеклянном аппарате ёмкостью до 1 л с
мешалкой и рубашкой для подвода теплоносителя, штуцерами для установки
термометра и пробоотборника.
Для изучения процесса ультраконцентрирования использовали лабораторную
ячейку с рабочим давлением 0,2 МПа с мембранными фильтрами УПМ- 20, 50, 100
фирмы «Владипор» (Россия).
Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки
«Specord M-40» (Германия).
Осаждение белковых веществ проводили с использованием мерных стеклянных
или пластиковых сосудов с крышками. Для обеспечения полноты осаждения
растворы охлаждали до температуры 4÷60С, необходимое значение рН устанавливали
растворами соляной кислоты и гидроксида натрия.
Молекулярно-массовое распределение белков в препаратах проводили
методом молекулярно-ситовой хроматографии (гель-фильтрации). При проведении
процесса гель-фильтрации использовали колонку диаметром 1 см и высотой 40 см с
молекулярном ситом «Сефадекс» G-100.
Токсичность продуктов определили с применением тест-культуры инфузорий
Tetrahymena pyriformis.
Очистку углеводсодержащих экстрактов от белковых примесей проводили
методом ионного обмена в статических и динамических условиях.
Содержание стахиозы и раффинозы определили методом тонкослойной
хроматографией на силикагеле G с использованием элюента: бутанол – этилацетат –
пропанол- 2 – уксусная кислота – вода (35:100:60:35:30 об.).
3. Экспериментальная часть
3.1 Исследование количественных закономерностей процесса экстракции
белковых веществ
Согласно литературным данным, для извлечения белка из соевого белого
лепестка (БЛ) возможно применение двух методов экстракции – кислотной и
4 щелочной. Каждый из этих способов имеет свои достоинства и недостатки. К
недостатку щелочной экстракции относится образование токсичных D-форм
аминокислот, а также высокое содержание в экстракте окрашенных соединений,
образующихся в ходе реакции Майера за счет конденсации белков с углеводами.
Преимуществом щелочной экстракции является меньшее содержание в экстракте
минеральных примесей. К достоинствам же кислотной экстракции следует отнести
меньшую степень деструкции аминокислот и образования токсичных энантиомеров, а
также возможность получения менее окрашенных гидролизатов [Гауровиц, 1965].
Таким образом, применение и кислотной, и щелочной обработки БЛ позволяет
получать на его основе белковые концентраты и изоляты. Однако окончательный
выбор метода экстракции белка должен определяться качеством получаемых
изолятов. Качество белковых продуктов должно служить основным критерием при
оптимизации режимов технологических стадий. На первом этапе исследований выбор
оптимального способа экстракции осуществлялся исходя из максимального выхода
ВМФ белка, поскольку именно на основе ВМФ получают белковый изолят.
В качестве параметров процесса экстракции были выбраны температура
процесса в интервале 20 – 500С, рН среды (1 – 3, 9 – 11) и время обработки БЛ.
Изучение влияния начальной концентрации БЛ на выход белковых веществ показало,
что степень извлечения отдельных белковых фракций не зависит от начальной
концентрации БЛ в суспензии. Поэтому все эксперименты проводили при начальной
концентрации БЛ 10% по массе, что является оптимальным с точки зрения
обеспечения эффективного перемешивания суспензии и позволяет получать
достаточно концентрированные растворы белка, что упрощает его дальнейшее
выделение.
Отсутствие S- образного характера кривых извлечения белка позволило
представить процесс извлечения белковых веществ в виде схемы превращений:
Р в клетке
k1
k2
Р в р-ре
k3
РР1 в р-ре (1)
РР2 в р-ре
Этой схеме превращений отвечают следующие дифференциальные уравнения:
dХ КЛ.
= −(k1 + k 3 ) ∗ Х КЛ (2)
dr
dХ Р
= k 1 Х КЛ − k 2 Х РР1
(3)
dr
dХ РР1
dr
=k 2 Х Р
(4)
5 dХ РР2
= k 3 Х КЛ
dr
(5),
где ХКЛ - содержание белка в клетке; ХРР1 и ХРР2 - содержание НМФ белка в растворе;
ХР - содержание ВМФ белка в растворе.
Дифференциальную обработку экспериментальных данных проводили по
начальным скоростям. Для раздельного нахождения значений эффективных констант
'
k1 и k3 была введена суммарная кинетическая константа k =k1 + k3.
Построив график зависимости в координатах ln(1- Х СУММ )= f(t), получили
линейные зависимости, по тангенсу угла наклона которых к оси абcциcс были
'
найдены значения tg α= k . Примеры обработки экспериментальных данных
иллюстрирует рис.1.
Для раздельного нахождения эффективных констант k1 и k3 были построены
зависимости прироста ВМФ белка от прироста НМФ, для начальных моментов
времени оказавшиеся линейными. Примеры полученных зависимостей приведены на
рис. 2.
'
Рис.2. Зависимость ХР= ƒ (ХРР)
при
0
условии экстракции: температура - 20 С, ●–
рН 1,0; ■– рН 2,0 ; ∆– рН 3,0; ○– рН 9,0; ▲–
рН 10,0; – рН 11,0).
Рис.1. Зависимость ln(1- Х СУММ )= k · t,
Условия экстракции: температура - 200С, ♦ рН 1,0; ■- рН 2,0; ▲- рН 3,0; ×- рН 9,0 ; жрН 10,0 ; ●- рН 11,0.
В результате такой обработки данных эксперимента были найдены численные
значения констант k1 и k3. Значение константы k2 было найдено в ходе интегральной
обработки экспериментальных данных.
На следующем этапе исследовали влияние температуры на экстракцию белков
из БЛ. Для установления связи эффективных констант с температурой использовали
уравнение Аррениуса. Результаты обработки экспериментальных данных приведены
в табл. 1.
6 Для установления связи эффективных констант с рН среды использовали
уравнение специфического кислотно-основного катализа:
k=
k
1+ K a .a
(6),
H+
где k - константа скорости, независимая от рН среды; K a - константа равновесия
образования комплекса белков с ионами H + ; а(Н+) = [H+] - концентрация ионов
водорода, моль/л.
Таблица 1
Значения параметров уравнения Аррениуса процесса экстракции белковых веществ из БЛ
при различных условиях
Условия
экстракции
рН=1
рН=2
рН=3
Путь
кинетической
схемы
k1
k2
k3
k1
k2
k3
k1
k2
k3
Е, кДж/
моль
Условия
Путь
экстракции кинетической
схемы
k1
рН=9
k2
k3
k1
рН=10
k2
k3
k1
рН=11
k2
k3
22±3
26±4
37±2
57±3
58±3
25±1
39±4
73±1
32±3
Е, кДж/
моль
56±4
33±4
45±4
40±2
74±3
23±4
20±3
21±4
54±5
В результате обработки экспериментальных данных и оптимизации параметров
кинетических схем было достигнуто адекватное описание всего массива
экспериментальных данных. Таким образом, была разработана кинетическая схема
процесса экстракции белков из БЛ. В табл. 2 приведены рассчитанные с ее помощью
и проверенные экспериментально данные по соотношению ВМФ и НМФ при
различных условиях экстракции и общему выходу белковых веществ.
Таблица 2
Соотношение высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций белка при различных
условиях
рН
1
2
3
9
10
11
ХР/ХРР
Условия
экстракции
Температура,0
С
20
9,29
20
12,89
20
13,22
20
4,17
20
4,07
20
1,82
Х СУМ
70,13
91,12
46,21
74,71
82,28
79,73
Условия экстракции
рН
Температура,0С
2
2
2
10
10
10
30
40
50
30
40
50
7 ХР/ХРР
Х СУМ
13,10
12,29
13,37
3,48
4,47
1,76
85,19
76,00
70,00
47,43
51,73
71,72
Из табл. 2 следует, что оптимальными условиями процесса экстракции с точки
зрения максимального выхода ВМФ являются: рН 2; температура 200С, время
экстракции – 1 ч, обеспечивающие выход ВМФ на уровне 91%. В щелочной среде
при рН 10,0 выход белковых веществ составляет около 82,3%, однако соотношение
ВМФ к НМФ примерно в 3 раза меньше.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что экстракцию белка из
белого лепестка следует проводить в кислой среде. Однако делать однозначный
вывод об оптимальном режиме экстракции на данном этапе преждевременно, т.к.
необходимо подобрать оптимальные условия выделения изолятов из кислого и
щелочного экстрактов и сравнить их качество.
Поскольку в ходе исследования процесса экстракции была показана
возможность получения изолята белка, как в ходе кислотной, так и в ходе щелочной
экстракции, то в дальнейшем все исследования проводили для обоих экстрактов.
3.2. Исследование процесса ультраконцентрирования белкового экстракта
При получении изолята белка на основе белкового экстракта необходимо
решить две проблемы. Во-первых, полученный после отделения отработанного БЛ
экстракт белка содержит 15 г/л ВМФ, что не обеспечивает высокого выхода
белкового изолята при осаждении в ИЭТ. Во-вторых, в состав изолята пищевого
назначения должны преимущественно входить белки с молекулярными массами не
менее 50 кДа. В табл. 3 приведен молекулярно-массовый состав белков в составе
кислого и щелочного экстрактов.
Таблица 3
Молекулярно-массовый состав белковых экстрактов, полученных при разных условиях
экстракции
Условия экстракции
Кислотная экстракция, рН 2
Щелочная экстракция, рН 10
Молекулярно-массовый состав белков в экстракте,
кДа
10-25
25- 50
50-65
39 %
21 %
40 %
46 %
39 %
15 %
Из приведенных данных видно, что белковые экстракты содержат набор белков
и пептидов различных молекулярных масс (10 – 65 кДа). Для решения
вышеуказанных проблем была исследована возможность применения метода
ультрафильтрации с использованием мембран УПМ–20, УПМ–50, УПМ–100 с
отсекаемыми молекулярными массами 10 – 100 кДa.
При исследовании процесса ультраконцентрирования были определены
параметры ультрафильтрационной установки:
- удельная производительность: G=Vнач/S·t л/м²·ч, по которой находили
концентрацию гелеобразования, где S=0,0113 м2 - площадь мембраны; t- время, час.
8 Сперм(конеч)
Сисх
Сперм
- дифференциальная селективность: = 1 −
Сконц
- интегральная селективность:
=1−
Наличие в белковом изоляте примесей углеводов существенно снижает его
качество. Поэтому в ходе ультрафильтрации также оценивали степень очистки ВМФ
белка от углеводных примесей.
Результаты исследования процесса ультрафильтрации обобщены в табл. 4.
Таблица 4
Сравнительная
характеристика
эффективности
ультрафильтрационных
мембран,
используемых для концентрирования экстракта белковых веществ белого лепестка
Тип
мембраны
УПМ-20
УПМ-50
УПМ-100
УПМ-20
УПМ-50
УПМ-100
Удельная Интегральная Интеграль- Максимальпроизводи селективность ная селекная степень
тельность, по
ВМФ тивность по концентри2
л/м ч
белка
углеводам
рования
Концентрирование кислотного экстракта
Соотношение белка к углеводам в экстракте: 2,05:1
4,1
0,69
0,45
2,4
6,6
0,73
0,48
2,7
7,8
0,80
0,52
3,1
Концентрирование щелочного экстракта
Соотношение белка к углеводам в экстракте: 1,49:1
1,4
0,78
0,26
2,6
2,7
0,81
0,33
2,8
3,2
0,82
0,38
3,0
Соотношение
белка
к
углеводам в
концентрате
2,47:1
3,15:1
3,84:1
1,82:1
2,21:1
2,79:1
Из представленных данных видно, что для проведения процесса
ультраконцентрирования экстрактов белка БЛ целесообразно использовать мембрану
маркой УПМ-100, которая позволяет сконцентрировать экстракт в три раза при
интегральной селективности по ВМФ белка 0,80. При этом соотношение ВМФ белка
к углеводам возрастает по сравнению с исходным экстрактом в 2 раза. Соотношение
белка к углеводам в случае кислотной экстракции больше, чем в случае щелочной
экстракции, т.е. использование кислотной экстракции предпочтительнее. Однако
ультрафильтрация не обеспечила полной очистки ВМФ белка от углеводных
примесей.
Выше было сказано о том, что белковые изоляты пищевого назначения должны
содержать белки с молекулярными массами не менее 50 кДа. Поэтому на
заключительном этапе данной части работы был исследован молекулярно-массовый
состав полученных ретантов и влияние на него степени концентрирования
экстрактов. Было установлено, что концентрат, полученный при кислотной обработке
БЛ, содержит белковые вещества следующих молекулярных масс: 61 кДа (14%), 49,5
9 кДа (15%), 41 кДа (28%), 38 кДа (23%), 21,5 кДа (20%). Что касается щелочного
концентрата, то он содержит белки в трех молекулярных масс: 61 кДа (56%), 41 кДа
(28%), 31,5 кДа (16%). Таким образом, исходя из проведенных исследований,
большая доля высокомолекулярных веществ присутствует в щелочном экстракте,
следовательно, использование щелочной экстракции предпочтительнее.
Поскольку в обоих концентратах присутствуют и ВМФ, и НМФ белка, была
исследована возможность применения для этой цели ультраконцентрирования
разбавленного раствора, что приводит к снижению концентрационной поляризации.
Было установлено, что при кратности разбавления исходного экстракта в 10 раз
селективного разделения ВМФ и НМФ не происходит, поэтому на следующем этапе
исследований была изучена возможность применения метода осаждения для этой
цели.
3.3. Исследование процесса осаждения белкового изолята в ИЭТ
На данном этапе был исследован процесс осаждения ВМФ белка сои из
полученных ретантов в ИЭТ, которая, как показали ранее проведенные исследования,
составляет 4,5 – 5,0. Было изучено влияние исходной концентрации белка на степень
осаждения. Соответствующие зависимости приведены на рис. 3 – 4.
Рис.3. Зависимость степени осаждения белковых веществ из кислотного ретанта от начальной концентрации белка. Начальная
концентрация ВМФ в растворе: ♦- 30 г/л; ■15 г/л; ●- 6 г/л; ▲- 3,8 г/л.
Рис.4.
Зависимость степени осаждения
белковых веществ из щелочного ретанта от
начальной концентрации белка. Начальная
концентрация ВМФ в растворе: ♦- 30 г/л; ■15 г/л; ●- 6 г/л; ▲- 3,8 г/л.
Из полученных данных следует, что и для кислотного, и для щелочного
ретанта максимальная степень осаждения белка достигается при его исходной
концентрации 81 г/л, что соответствует ранее установленной максимальной степени
концентрирования в 3 раза.
Из литературных данных известно, что степень осаждения зависит от
начальной концентрации белковых веществ. При этом, чем меньше начальная
10 концентрация белковых веществ, тем выше вероятность осаждения только
высокомолекулярных белков. Поэтому было проведено осаждение белковых изолятов
из растворов с различной концентрацией. Полученные данные по степени осаждения
ВМФ приведены в табл.5, а в табл. 6 - молекулярно- массовый состав получаемых
изолятов.
Таблица 5
Степени
осаждения
белковых
веществ
из
растворов с различной
концентрацией
Начальная
концентрация белка,
г/л
81,0
40,5
16,2
Степень
осаждения
0,86
0,52
0,21
Таблица 6
Молекулярно-массовый состав белковых изолятов при
осаждении из растворов с различной начальной
концентрацией белка
Щелочная
Кислотная
экстракция, %
Молекулярная экстракция, %
масса, кДа
начальная концентрация, г/л
81,0 40,5 16,2 81,0 40,5 16,2
63-49
47-23
23-13
15
39
46
31
46
23
43
41
16
40
21
39
8
86
6
69
31
-
Из представленных данных следует, что осаждение ВМФ белка с молекулярной
массой более 50кДа следует проводить из ретантов с исходной концентрацией белка
16,2г/л, при этом ее выход составляет 21% от общего содержания белка в ретанте.
Таким образом, возможны два варианта организации процесса получения белкового
изолята из БЛ в зависимости от области его применения:
1) получение изолята технического назначения осаждением всей ВМФ белка в
ИЭТ из концентрированных растворов;
2) получение изолята пищевого назначения осаждением фракции с молекулярной
массой более 50кДа, а оставшегося ВМФ затем концентрировать и получать
осаждением в ИЭТ изолят технического назначения.
Полученный осадок изолята белка отделяли центрифугированием,
обрабатывали этиловым спиртом и ацетоном, высушивали в вакуум-сушильном
шкафу при температуре 60оС и проанализировали их состав. Было установлено, что
полученный изолят содержит 65 - 70% белка, поэтому необходимо разработать
стадии его очистки.
3.4. Выбор оптимальной схемы очистки белкового изолята
Полученный в данной технологии белковый изолят загрязнен в основном
минеральными примесями. Для очистки от них было предложено использовать
следующие методы:
11 1) переосаждение (процесс проводили в изоэлектрической точке, предварительно
растворив белок в подкисленной воде при рН 1,5-2,0);
2) диафильтрация (ретант, полученный на стадии ультрафильтрации, разбавляли
в 2 раза водой и сконцентрировали до прежнего объема; затем белковый изолят
осаждали в ИЭТ).
Сравнение эффективности этих методов приведено в табл. 7.
В табл. 8 приведены данные по соотношению белков и углеводов в ретантах,
полученных при различной кратности диафильтрации.
Сравнение качества
диафильтрации
белковых
Способ очистки
Переосаждение изолята
Диафильтрация ретанта№1
Диафильтрация ретанта№2
Диафильтрация ретанта№3
изолятов,
получаемых
рН=2
Содержание Содержание
белка до
белка после
очистки,
очистки,
% к СВ
% к СВ
75 %
69 %
81 %
87 %
91 %
методом
Таблица 7
переосаждения и
рН=10
Содержание Содержание
белка до
белка после
очистки,
очистки,
% к СВ
% к СВ
74 %
67 %
76 %
82 %
86 %
Таблица 8
Соотношение ВМФ белка к углеводам при различной кратности диафильтрации
Значение рН
Ретант 1
Ретант 2
Ретант 3
Ретант до
исходного
диафильтрации
экстракта
Белки
/
2
3,84/1
6,1/1
7,7/1
7,9/1
Углеводы
10
2,05/1
6,8/1
8,0/1
8,3/1
Из представленных данных видно, что трехкратная диафильтрация
обеспечивает очистку от углеводных примесей, как для кислотной, так и для
щелочной экстракции. В сравнении с методом переосаждения, диафильтрация
позволяет достичь более высокого содержания белка в изоляте и, следовательно,
является более эффективным способом очистки.
3.5. Анализ полученных белковых изолятов на острую токсичность, NSI, ЖУС и
ЖЭС
Из литературных данных известно, что белковые изоляты пищевого назначения
оцениваются по целому ряду показателей, а именно: острая токсичность;
жироудерживающая способность (ЖУС); жироэмульгирующая способность (ЖЭС);
индекс растворимого белка (NSI). Результаты исследований приведены в табл. 10.
Для сравнения в той же таблице приведены данные по значениям вышеуказанных
12 показателей для некоторых наиболее распространенных соевых продуктов.
Анализируя данные табл. 9, можно сделать вывод о том, что полученные в работе
белковые изоляты являются нетоксичными и характеризуются показателями качества,
близкими к известным соевым продуктам, что позволяет использовать их для
пищевых целей.
Таблица 9
Сравнение полученных изолятов белка сои с известными соевыми продуктами
Наименование продукта
ЖУС, г
масла/ г
белка
1,20
0,90
0,70
0,50
0,75
1,00
Соевое молоко
Текстурат «Лайн-про»
Текстурат «Эмульгофикс-50»
Соевый концентрат «Эмулекс»
Изолят
Экстракция рН2
белка сои Экстракция рН10
ЖЭС, водная
фаза/масляная
фаза
1/1,00
1/1,00
1/1,87
1/1,50
1/1,45
1/1,64
NSI,
%
Острая
токсичность
70
68
72
71
67,9
71,9
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
3.6. Разработка путей утилизации стоков производства белкового изолята БЛ
В предлагаемой технологической схеме получения белкового изолята
образуется значительное количество жидких отходов, содержащих белковые
вещества, а именно – пермеат и диафильтрат. На 1 кг белкового изолята образуется
суммарно 32 л жидких стоков, содержащих (3,6±0,3)% СВ, которые представлены в
основном соединениями белковой и углеводной природы в соотношении 27:6
(концентрация белка – 16,61 г/л, углеводов – 3,69 г/л) и характеризуются высокими
показателями ХПК (более 100000 мг О/л).
С целью снижения количества отходов, образующихся в данной
технологической схеме, была исследована возможность снижения их количества
путем организации рецикла по пермеату и диафильтрату и получения
малорастворимых и нетоксичных соединений в объеме сточных вод, связывающих
компоненты сточных вод с получаемым осадком.
Таблица 10
Характеристика белковых изолятов, получаемых при организации рецикла по пермеату
Показатель
рН2
89
83
81
рН10
86
79
83
№ рецикла
2-ой
3-ий
рН2 рН10 рН2 рН10
90
88
90
87
82
80
81
82
82
84
80
82
68,2
отсут
72,4
отсут
68,5
отсут
1-й
Условия экстракции
Степень экстракции
Степень осаждения
% белка в изоляте
по СВ
NSI, %
Острая токсичность
13 72,8
есть
68,8
отсут
72,9
есть
4-й
рН2 рН10
89
87
83
80
81
83
69,0
отсут
73,1
есть
Таким образом, организация рецикла по пермеату и диафильтрату позволяет
снизить количество образующихся сточных вод в три раза в случае щелочной
обработки БЛ и в четыре раза в случае кислотной. Однако количество сточных вод
остается достаточно большим, поэтому необходимо разработать пути их дальнейшей
утилизации.
В качестве такого способа было предложено получать кормовой белковый
продукт путем сорбции белковых соединений малорастворимыми солями: сульфат
кальция (гипс), карбонат кальция (мел) или ортофосфаты кальция.
На рис. 5 – 6 приведено влияние типа сорбента на процесс сорбции белков и
углеводов из кислых и щелочных сточных вод.
Рис.5. Зависимость степени сорбции
белковых веществ и углеводов из сточных
вод при получении белкового изолята
методом кислотной экстракции: ●,○монофосфат кальция; ▲, ∆ - мел; ■, □гипс. Черные значки относятся к сорбции
белковых
веществ,
прозрачные
–
углеводов.
Рис.6. Зависимость степени сорбции
белковых веществ и углеводов из сточных
вод при получении белкового изолята
методом щелочной экстракции: ●,○монофосфат кальция; ▲, ∆ - мел; ■, □гипс. Черные значки относятся к сорбции
белковых веществ, прозрачные – углеводов.
Необходимо отметить, что во всех случаях процесс сорбции заканчивается за
30 – 45 мин., однако, только в случае монофосфата кальция степень сорбции
белковых веществ достигает 90%. В табл. 11 приведены данные по максимально
достигаемой степени сорбции углеводов и белков для каждого из исследованных
сорбентов и содержании сырого протеина в получаемом осадке, что определяет его
кормовую ценность.
Из приведенных данных следует, что в случае монофосфата кальция
содержание сырого протеина достигает 30%, что позволяет использовать получаемый
осадок в качестве кормового продукта.
Исследование влияния концентрации монофосфата кальция на степень сорбции
белковых веществ и содержание сырого протеина в осадке показало, что при
концентрации монофосфата кальция 4% по массе белковые вещества как из кислых,
очных стоков сорбируются не менее чем на 96%, причем степень сорбции углеводов
14 не превышает 10%. Установлено, что полученный продукт содержит не менее 30%
сырого протеина, что позволяет рекомендовать его к использованию в качестве
кормовой добавки.
Таблица 11
Влияние типа сорбента на степень сорбции белковых веществ, углеводов и содержание
сырого протеина в конечном продукте
Тип сорбента в Содержание
Степень сорбции, %
Содержание
сточных водах
сырого
протеина в
сорбента в
белковых
Углеводов
после
сорбенте,%
сточных
веществ
экстракции
водах, %
Щелоч- Кислые Щелоч- Кислые Щелоч- Кислые
ные
стоки
ные
стоки
ные
стоки
стоки
стоки
стоки
Гипс
4
32
27
20
18
14
11
Мел
4
62
60
39
33
26
24
Монофосфат
4
98
96
30
24
33
31
кальция
Результаты исследований по влиянию температуры на процесс сорбции
белковых веществ на монофосфате кальция приведены на рис. 7 и 8.
Рис.7. Зависимость степени сорбции
белковых веществ из кислых сточных вод на
монофосфате кальция от температуры: ■- 10
о
С, ▲- 20 оС, ∆- 30 оС, □- 40 оС, ●- 50 оС.
Рис.8. Зависимость степени сорбции
белковых веществ из щелочных сточных
вод
на монофосфате кальция от
температуры: ■- 10 оС, ▲- 20 оС, ∆- 30 оС, □40 оС, ●- 50 оС.
Из представленных данных следует, что с увеличением температуры от 10 до
20 С происходит возрастание степени сорбции белков с 80 до 95%. Однако при
дальнейшем повышении температуры происходит ее снижение, что, вероятнее всего,
связано с обратимостью процесса и возрастанием скорости десорбции.
Таким образом, результаты исследований показали, что процесс сорбции
необходимо проводить при следующих оптимальных условиях: температура 20оС,
концентрация монофосфата кальция в среде – 4% по массе, время сорбции – 1ч.
В результате было получены белковые продукты, содержащие не менее 30%
сырого протеина и 70% монофосфата кальция, их исследование на острую
о
15 токсичность показало ее отсутствие. В табл. 12 приведены данные по составу
сточных вод до и после сорбции белковых веществ.
Таблица 12
Сравнение состава сточных вод, полученных после сорбции белковых веществ с исходными
Щелочные стоки
Кислые стоки
Показатель
до сорбции
после сорбции
до сорбции после сорбции
Содержание белков
30 г/л
1,2 г/л
28 г/л
1 г/л
Содержание углеводов
6,7 г/л
6 г/л
6,2 г/л
5 г/л
Соотношение белков
к углеводам
ХПК, мгО/мл
4,5 : 1
1:5
4,5 : 1
1:5
100000
4000
100000
4000
Из приведенных данных видно, что предложенный метод утилизации стоков
позволяет снизить соотношение углерод: азот до уровня 1:10 и направлять данные
стоки на станции биологической очистки сточных вод.
3.7. Исследование процесса ферментативного гидролиза депротеинизированного
белого лепестка
В процессе получения белковых изолятов из БЛ слабощелочными или
слабокислыми растворами образуется также большое количество твердых отходов в
виде отработанной биомассы депротеинизированного белого лепестка (10 кг влажной
биомассы на 1 кг изолята), который содержит до 70% углеводов. Поэтому
представляется актуальным исследовать возможность получения из него ценных
олигосахаридов, прежде всего, стахиозы и раффинозы.
Из литературных данных известно, что для извлечения углеводов из сои
используют 70%-ный раствор этилового спирта. Однако предварительные
исследования показали, что выход углеводов в раствор в этом случае не превышает
40%. Это связано с тем, что углеводы сои представлены, главным образом, в виде
клетчатки. Поэтому для обработки целлюлоозосодержащих субстратов было
предложено использовать комплексный ферментный препарат целловиридин Г3х,
который состоит из ферментов 3-х типов: эндо-1,4-β-D-глюканазы; экзо-1,4-βглюканазы и экзо-1,4-β-D-глюкозидазы. Было изучено влияние начальной
концентрации целловиридина на выход углеводов из БЛ, а также способ внесения ФП
(однократная или дробная загрузка). Полученные результаты приведены на рис.9 и
10.
16 Рис.9. Зависимость выхода УВ при
ферментативном
гидролизе
депротеинизированного БЛ от температуры
при однократной загрузке ФП. □- 10 оС, ▲
- 25 оС, ■- 40 оС, ∆-70 оС.
Рис.10. Зависимость выхода УВ при
ферментативном
гидролизе
депротеинизированного
БЛ
от
температуры при дробной загрузке ФП.
□- 10 оС, ▲ - 25 оС, ■- 40 оС, ∆- 70 оС.
Из полученных данных следует, что максимальный выход углеводов (70%),
наблюдается при концентрации при дробной загрузке целловиридина через каждые
2ч. гидролиза при температуре 40оС, общий расход ФП составляет 10% от массы
субстрата (1% по активному белку). Соотношение белок : углеводы в полученном
экстракте составляет 0,22:1, содержание стахиозы – 1,9 – 5,6 г/л, раффинозы – 0,8 –
2,4 г/л в зависимости от способа обработки БЛ (кислотная или щелочная экстракция
белка).
3.8. Исследование процесса осаждения стахиозы
Из литературы известно, что стахиоза плохо растворима в этиловом спирте,
поэтому для ее выделения из раствора целесообразно использовать метод осаждения
из водно-спиртового раствора. Однако концентрация стахиозы в полученном
экстракте составляет 1,9 – 5,6 г/л, что не обеспечивает полного осаждения
олигосахарида. В связи с этим в технологический процесс необходимо ввести стадию
вакуум-выпаривания экстракта, которая проводится в промышленных условиях при
температуре 70оС. Однако в результате выпаривания был получен раствор, имеющий
интенсивную коричневую окраску. Это объясняется тем, что исходный экстракт
содержал значительное количество пептидов, поэтому его обработка при
повышенной температуре привела к образованию окрашенных соединений по
реакции Майара. Дальнейшая очистка препаратов углеводов от окрашенных
соединений представляет собой сложную технологическую задачу. Поэтому
стадией вакуум-выпаривания ввести в
представлялось целесообразным перед
17 технологический процесс стадию очистки от азотистых соединений белковой
природы. В промышленности для выделения пептидов из растворов, как правило,
используют сорбцию на катионитах.
Результаты по выбору типа катионита представлены на рис. 11 и в табл. 13.
Рис.11. Кинетика сорбции пептидов из
кислого
экстракта
для
разных
катионитов: ♦- КУ2×8 , □- С-106, ▲ –
С-150, ■- SGH100×10H, ∆- С-145.
Из представленных данных следует, что все исследованные катиониты обеспечивают высокую, не ниже 80% степень сорбции белковых веществ при времени
сорбции 1 ч, причем минимальное соотношение белка к углеводам равное 0,02:1
наблюдается для катионита КУ2×8.
Таблица 13
Соотношение белков к углеводам в несорбированной фракции после сорбции пептидов на
катионитах.
Тип катионитов
КУ2×8
С-106
С-150
SGH100×10H
С-145
Соотношение белка к углеводам
0,02:1
0,06:1
0,08:1
0,12:1
0,11:1
Изучение влияния кратности упаривания на степень осаждения углеводов
показало, что максимальная степень осаждения равная 86% достигается при
кратности упаривания полученного элюата в 15 раз, в результате концентрация
раффинозы составила 36 г/л и стахиозы – 84 г/л.
На следующем этапе исследований изучили влияние гидромодуля спирта на
степень осаждения стахиозы. Было установлено, что оптимальный гидромодуль,
обеспечивающий степень осаждения стахиозы не ниже 96%, равен 32.
Полученный препарат был проанализирован на содержание основного
вещества методом ТСХ. Полученный препарат являлся индивидуальным химическим
соединением и содержал не менее 90% основного вещества, что позволили его
считать препаратом технического назначения. Выход стахиозы составил 1,9 % от
массы исходного белого лепестка (63% от ее содержания в БЛ).
18 Полученная после осаждения стахиозы надосадочная жидкость была упарена
под вакуумом с отгонкой этилового спирта до исходного объема и высушена в
распылительной сушилке. В результате был получен препарат раффинозы, который
являлся хроматографически чистым индивидуальным веществом и содержал 90%
основного вещества, что позволило его также считать препаратом технического
назначения. Выход раффинозы составил 0,8 % от массы белого лепестка (51% от ее
содержания в БЛ).
Таким образом, на основе проведенных исследований была предложена
принципиальная схема малоотходной технологии переработки белого лепестка сои с
получением продуктов белковой и углеводной природы кормового, пищевого и
технического назначения.
ВЫВОДЫ
1. На основе изучения кинетики экстракции белковых веществ из БЛ установлены
оптимальные условия извлечения ВМФ белка с выходом 85% от содержания
сырого протеина в сырье.
2. Установлены оптимальные условия выделения белкового изолята методами
ультрафильтрации и осаждения в ИЭТ. Показана возможность получения
белкового изолята пищевого назначения, содержащего белка с молекулярными
массами более 50 кДа.
3. Подобраны условия выделения и очистки белкового изолята методами осаждения
из водных и водно-спиртовых растворов, а также диафильтрации.
4. Установлено, что тип экстрагента (кислотный или щелочной) не оказывает влияния
на выход ВМФ. Однако применение кислотного экстрагента позволяет в четыре
раза снизить количество образующихся жидких отходов за счет организации
рецикла по пермеату на стадии ультрафильтрации.
5. Предложены основы технологии получения белкового продукта кормового
назначения, содержащего не менее 30% сырого протеина и 70% монофосфата
кальция, из белоксодержащих жидких отходов производства изолята.
6. Разработаны основы технологии получения раффинозы и стахиозы из
депротеинизированного белого лепестка. Выход стахиозы составил 63%, а
раффинозы – 51% от их содержания в белом лепестке. Установлено, что
полученные препараты являются индивидуальными химическими соединениями и
содержат не менее 90 % основного вещества, что позволяет их считать
препаратами технического назначения.
7. Исследование физико-химических показателей полученных белковых изолятов на
соответствие требованиям ТУ показало, что белковый изолят по качеству
сопоставим с выпускаемыми отечественной и зарубежной промышленностью
19 соевыми продуктами, что позволяет рекомендовать их к использованию в
пищевой промышленности.
8. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка разработанной
технологической схемы. Показано, что в условиях комплексного производства
себестоимость получаемых препаратов составляет 13% от себестоимости
препаратов известных фирм. Предлагаемая технология переработки сои позволяет
снизить количество образующихся твердых отходов – в 2,4 раза, а жидких – в
четыре раза.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Список публикации по теме диссертации:
Хоанг Тхи Минь Нгует. Исследование процесса экстракции белковых веществ из
белого лепестка сои водными растворами минеральных кислот и щелочей [Текст] /
Хоанг Тхи Минь Нгует // Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр.–
М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2007. – Т. ХХI, №12. – с. 136; 20см. –160 экз. –
с.33-35.
Хоанг Т.М.Н. Исследование процесса получения изолята белка сои из белого
лепестка [Текст] / Хоанг Т.М.Н., Красноштанова А.А //Сборник трудов V
Международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективны
развития» - 2008 г. – с.92.
Хоанг Тхи Минь Нгует. Получение кормового белкового продукта на основе
сточных вод производства белкового изолята [Текст] / Хоанг Тхи Минь Нгует //
Успехи в химии и химической технологии: Сб. науч. тр.– М.: РХТУ им. Д.И.
Менделеева, 2008.-Т. ХХII, №13. – с. 136; 20см. –160 экз. – с.80-84.
Хоанг Т.М.Н. Выделение низкомолекулярной водорастворимой
фракции
углеводов из депротеинизированного белого лепестка сои [Текст] / Хоанг Т.М.Н.,
Красноштанова А.А //Сборник трудов VI Международного Конгресса
«Биотехнология: состояние и перспективны развития» – 2009 г.
Хоанг Тхи Минь Нгует. Выделение низкомолекулярной водорастворимой фракции
углеводов из биомассы сои после кислотной и щелочной экстракции белковых
веществ [Текст] / Хоанг Тхи Минь Нгует, Красноштанова А.А. //Сборник статей
«Высокие технологии 21-го века». – 2009. – с. 108; 20см. – с.103-104.
Хоанг Т.М.Н. Утилизация стоков производства изолята белка сои в кормовой
продукт [Текст] / Хоанг Т.М.Н., Красноштанова А.А // Журнал «Химическая
промышленность сегодня» ». – 2009, № 7. – с. 56 – 600 экз – с.18-23. ISSN 0023
110X.
20