МУ для семинарских занятий Биофизические методы
advertisement
1 МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» МЕТОДИЧЕСКОЕ УКАЗАНИЯ по проведению семинарских занятий по курсу Биофизические методы исследования в биотехнологии для аспирантов направления 06.06.01 Биологические науки направленность Биотехнология (в том числе бионанотехнология) Краснодар 2 ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 1 ИЗУЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА НА ИОНОСЕЛЕКТИВНОЙ МЕМБРАНЕ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучение пассивной диффузии ионов через полупроницаемую мембрану и образующейся при этом трансмембранной разности электрических потенциалов; выявление зависимости разности потенциалов от соотношения концентрации ионов по разные стороны мембраны. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: электрод с ионоселективной мембраной, высокоомный милливольтметр, химические стаканы емкостью 100 мл с растворами исследуемых веществ разных концентраций. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ Для поддержания жизненных процессов в клетке необходимо поступление в нее определенных веществ и одновременное выведение из нее продуктов метаболизма. В клетку, ограниченную от окружающей среды липидной мембраной, поступают вода, соли, неорганические ионы, сахара, аминокислоты и другие низкомолекулярные соединения. Биомембраны выполняют две прямо противоположные функции: барьерную, благодаря которой клетка защищается от чужеродных веществ, и транспортную, обеспечивающую поступление в неё веществ, необходимых для жизнедеятельности. Мембраны, способные избирательно пропускать определенные ионы, называются ионоселективными. Разделим сосуд ионоселективной мембраной и по обе её стороны поместим растворы одного и того же электролита разных концентраций (рис. 1). Пусть мембрана пропускает ионы одного знака и не [K C l] = 1 m o l [ K C l ] = 0 ,1 m o l пропускает ионы другого знака. Причиной этому может + быть сильное различие в эффективных диаметрах K гидратированных ионов, вследствие чего более крупные 1 ионы не проходят через поры мембраны. Возможно также и электрическое отталкивание ионов какого-либо знака 2 заряженными концами дипольных молекул, находящихся на поверхности мембраны. E = 1- 2 Допустим, что в обеих половинах сосуда находятся и о но селект и вна я м ем брана растворы хлорида калия [C] 1 и [C] 2, причём [C] 1 [C] 2 , а Рисунок 1. Схема образования мембрана пропускает К+. мембранного потенциала. Ионы калия будут диффундировать из левой части сосуда в правую, а ионы хлора, не проходящие через мембрану, будут оставаться в левой части сосуда. Поскольку ионы калия заряжены положительно, в правой части сосуда возникает избыточный положительный заряд, а жидкость в левой половине сосуда, потерявшая часть ионов калия, зарядится отрицательно. Возникающее при этом электрическое поле препятствует дальнейшей диффузии ионов калия, которая, в конце концов, прекратится. Работа, которую совершают силы электрического поля для того, чтобы прекратить диффузионный поток из левой части сосуда в правую, равна работе диффузионных сил, т.е. Аэ=Ад. Можно показать, что [C ]1 RT ln zF ( 1 2) , (1) [C ]2 где R=8,314 Дж/(Кмоль) – универсальная газовая постоянная, Т – абсолютная температура, z – валентность иона, диффундирующего через мембрану, F=9,698104 Кл/моль – число Фарадея, [C] 1 и [C] 2 – концентрации диффундирующего иона по разные стороны мембраны, 1 и 2 – электрические потенциалы по разные стороны мембраны. Отсюда легко найти разность потенциалов 1 - 2, образующуюся на мембране. Эту величину называют мембранной (трансмембранной) разностью потенциалов, или просто я 3 мембранным потенциалом. Обозначив (1-2) через Em, и перейдя от натурального логарифма к десятичному, получим: RT [C ]1 RT [C ]1 Em ln 2,3 lg (2) zF [C ]2 zF [C ]2 Таким образом, мембранный потенциал прямо пропорционален температуре, обратно пропорционален валентности диффундирующего иона и зависит от логарифма отношения концентраций ионов. Для температуры 20С (300К) и валентности диффундирующего иона +1 (Н+, К+) левая дробь в формуле (2), умноженная на 2,3, числено равна 0,059, поэтому (3) Em = 0,059 ( lg [C]1 - lg [C]2) Для отрицательных одновалентных ионов (например, NO3-) знак потенциала меняется. Мембранную разность потенциалов можно измерить с помощью пары неполяризующихся электродов. Такая пара Рисунок 2. электродов представляет собой сосуд, заполненный Установка для раствором хлористого калия, в который погружена измерения серебряная проволока, покрытая тонким слоем AgCl. мембранного Однако и в этом случае имеется электродный потенциала. потенциал, на который необходимо вводить поправку. Удобной моделью для изучения мембранного потенциала является электрод с ионоселективной искусственной мембраной. Электрод имеет пластмассовый цилиндрический корпус, нижний торец которого представляет собой полупроницаемую мембрану. Внутрь электрода заливают раствор необходимого электролита известной концентрации [C] 1 (приэлектродный раствор), в который погружают контактный полуэлемент. Если такой электрод опустить в раствор того же электролита концентрации [C] 2, содержащий диффундирующие через ионоселективную мембрану ионы, то очень скоро на мембране образуется мембранный потенциал, пропорциональный разнице концентраций электролита на противоположных сторонах мембраны. Его можно замерить с помощью высокоомного милливольтметра, подключив к нему контактный полуэлемент, находящийся в контакте с раствором [C] 1 хлорсеребряный электрод, погруженный в раствор [C] 2 (рис. 2). На практике электроды с ионоселективными мембранами используют для экспресс оценки содержания в воде, растворах, экстрактах, соках овощей и фруктов различных ионов: Hg2+, Pb2+, NO3-, NO2- и др. ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ЗАДАНИЕ 1 1. Включите измерительный прибор в сеть. 2. В табл. 1 запишите химическую формулу использованной соли, иона, для которого мембрана является проницаемой, и величину концентрации соли внутри электрода. 3. Опустите электрод с ионоселективной мембраной и хлорсеребряный электрод в раствор соли минимальной концентрации. Измерьте электрический потенциал на мембране с помощью высокоомного милливольтметра. Результат запишите в табл. 1. Проделайте те же самые измерения для других растворов последовательно в сторону увеличения концентрации [C]1. 4. Используя полученные результаты, постройте с помощью компьютера график зависимости электрического потенциала на мембране от концентрации соли. 4 ОТЧЕТ Измеренная разность мембранного потенциала, компьютерная распечатка экспериментального и теоретического графиков зависимости мембранного потенциала от концентрации соли в стакане. Вывод сделайте, проанализировав распечатанные графики. Постройте теоретический график для иона, заданного преподавателем. Таблица 1 Использован раствор соли KCl К+ 0,01 М мВ Мембрана проницаема для иона Концентрация соли внутри электрода |C|1 Поправка на электродный потенциал |C|2, М Em, mV ВЫВОДЫ (сделайте по результату компьютерной распечатки) ЗАДАНИЕ 2 Постройте теоретический график зависимости Em = f ( [C] 1, [C] 2 ) для иона при температуре К и [C]1 = М Ем, мВ 0 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 lg [C2], M Рисунок 3. Теоретический мембранный потенциал Контрольные вопросы: 1. Какая мембрана называется ионоселективной? 2. Объясните механизм образования на ионоселективной мембране мембранного потенциала. 3. При каких условиях потенциал на ионоселективной мембране равен нулю? 4. Глюкоза, сахароза, глицерин не диссоциируют на ионы в водных растворах. Будут ли образовываться потенциалы на мембранах, селективно пропускающих эти вещества и почему? 5. Для чего на практике используют ионоселективные электроды? 6. Как определить содержание нитратов (NO3-) в овощах и ионов тяжелых металлов (Cu2+) в бассейнах рек и лиманов? 7. РАБОТА ПРОВЕРЕНА__________________________________(________________) РАБОТА СДАНА_______________________________________(________________) ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №2 5 ПРОНИЦАЕМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН ДЛЯ ИОНОВ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить влияние проницаемости биологической мембраны на скорость выхода содержимого клетки методом измерения электропроводности омывающего биологическую ткань раствора. ОБОРУДОВАНИЕ: кондуктометр, химическая посуда, куриная печень, инфракрасный облучатель. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ Под проницаемостью понимают способность клеток и тканей пропускать воду и растворенные в ней вещества. Проницаемость имеет большое значение в фармакологии и токсикологии, так как лекарственные вещества должны хорошо проникать в клетки и ткани. Это справедливо и для ядов, применяемых в сельскохозяйственной энтомологии, для защиты растений и т.д. Среди методов исследования проницаемости следует отметить объемный метод, основанный на изменении объема клеток после помещения в раствор определенного состава. Этим методом можно определять проницаемость относительно крупных объектов: клеток водорослей, эритроцитов. Использование изотопов значительно повысило возможности изучения проницаемости и позволило проводить исследования для проницаемости определенных ионов, глюкозы, аминокислот и др. В основе проникновения веществ лежит процесс диффузии. Согласно закону Фика скорость диффузии прямо пропорциональна градиенту концентрации и площади поверхности, через которую происходит диффузия: dm dc Ds , dt dx где m – масса прошедшего вещества, t – время, D – константа диффузии, s – площади поверхности, dc/dx – градиент концентрации. Градиентом концентрации называют величину, равную отношению разницы в концентрациях между двумя точками к расстоянию между этими точками: grad c = (с1-с2)/(х1-х2) = Δc/Δx Исследования проницаемости клеток привели исследователей к построению липоидной теории клеточной мембраны. По современным представлениям биологическая мембрана представляет собой липидный бислой, в который погружены белковые молекулы (рис. 1). Полярной головкой липиды обращены в сторону водных растворов, нерастворимые в воде углеводные хвосты располагаются по направлению друг к другу. Так как липиды являются диэлектриками, то мембрана представляет собой электроизолятор, и поэтому заряженные молекулы и ионы через нее не проходят. Некоторые белковые молекулы частично погружены в мембрану или находятся на поверхности, другие белки пронизывают ее насквозь. Среди последних выделяют ионные каналы, специфически пропускающие определенные ионы из области высокой концентрации в область низкой концентрации, и насосы, которые, используя энергию АТФ, переносят ионы из области низкой концентрации в область высокой (например, Na+–K+-насос, протонная помпа). Вода достаточно легко проходит через дефекты в липидном бислое, которые называют кинками. Кинки образуются «кривыми» хвостами липидов, имеющих ненасыщенные связи. Поверхностны е белки Интегральн ые белки Полярная головка липида Липидны й бислой 6-10 нм Кинк Гидрофобны й хвост липида Рисунок 1. Молекулярная структура биологической мембраны 6 Таким образом, биологические мембраны ответственны за транспорт молекул внутрь клетки и наружу, а их целостность и функциональная активность определяют жизнеспособность клеток. При хранении семена находятся в состоянии относительного покоя, однако жизненные процессы в них не прекращаются, а условия хранения (температура, влажность и др.) оказывают определенное влияние на эти процессы. При разрушении мембран клетки теряют жизнеспособность, а семена — всхожесть. Одним из критериев состояния семян, связанных с целостностью их мембранных структур, является скорость выхода электролитов в омывающий семена раствор: чем выше скорость, тем большее число мембран разрушено. Скорость выхода электролитов можно определять, измеряя сопротивление воды, в которую погружены семена. Аналогично ведут себя внутренние органы животных. При помещении нативной печени в воду сопротивление воды со временем остается постоянным. Однако при нагревании мембраны разрушаются, и электролиты клеток выходят в омывающий раствор, что приводит к увеличению электропроводности омывающей биологичекую ткань жидкости. Схема устройства для измерения электропроводности (λ) электролитов приведена на рис. 2. Для измерения электропроводности растворов электролитов используют кондуктометр, имеющий электрод и измерительный прибор. Электрод опускают в водный раствор. Удельной электропроводностью называется электропроводность электрического проводника площадью сечения 1 кв. метр и длиной 1 метр. Единицей измерения является Сименс на метр (См/м). Это большая величина, поэтому реально измеряют электропроводность в микросименсах (μS). ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ: 1. Изучите правила измерения электропроводности. 2. В два химических стакана емкостью 100 мл налейте одинаковые объемы дистиллированной воды. Один из них поставьте на инфракрасный облучатель, включенный на минимальную мощность. Кондуктометром измерьте электропроводности воды в стаканах. 3. Положите в стаканы одинаковые навески куриной печени. Определите электропроводность воды в обоих стаканах в начальный момент и через промежутки времени, указанные в таблице 1. 4. Используя полученные результаты, постройте график. Масштаб оси ординат проведите в соответствии с диапазоном полученных значений R. График подпишите. Стакан с исследуемым объектом в воде μS 236 Кондуктометр Стакан с исследуемым объектом в воде Рисунок 2. Схема установки для определения электропроводности дистиллированной воды, в которую помещена куриная печень Инфракрасны й облучатель ОТЧЕТ: заполненная таблица, график. Таблица 1. Экспериментальные данные по измерению сопротивления воды, в которую помещена куриная печень. 7 t, мин. 0 5 10 15 20 Нативная печень λ, μS t, мин. 0 5 10 15 20 Прогретая печень λ, μS Электропроводность дистиллированной воды μS Рисунок 3.___________________________________________________________ _____________________________________________________________________ ВЫВОДЫ: Контрольные вопросы: 1. Расскажите о молекулярной структуре биологической мембраны. 2. Какую функцию выполняют белки, пронизывающие мембрану? 3. Почему мембрана обладает высоким электрическим сопротивлением? 4. Для чего в мембране имеются каналы и насосы и в чем их различия? 5. Что такое градиент концентрации? 7. Почему скорость выхода электролитов из семян может служить критерием их всхожести? 8. Почему после прогрева семян в водяной бане сопротивление омывающего семена водного раствора оказывается минимальным? 9. По аналогии с определение градиента концентрации сформулируйте определение градиента температуры. РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________) РАБОТА СДАНА______________________________________(________________) ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 3 ИЗУЧЕНИЕ ДИСПЕРСИИ СОПРОТИВЛЕНИЯ И ЕМКОСТИ КУРИНОЙ ПЕЧЕНИ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить работу измерителя иммитанса, с его помощью построить дисперсионные кривые для биологической ткани. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: измеритель иммитанса, электроды, стакан, инфракрасный облучатель, куриная печень. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ Величина электрического сопротивления R и электрической емкости биологическая ткань С живых клеток и тканей меняются в См электрод зависимости от частоты тока, на которой См Rц ведется измерение. Объяснить это можно следующим образом. клетка На рис. 1 изображена эквивалентная Rмж электрическая схема биологической ткани. Биологическая ткань имеет клеточную структуру. Каждая клеткамембрана окружена липидной мембраной, которая является к измерителю иммитанса Рисунок 1. Эквивалентная электрическая схема биологической ткани 8 диэлектриком, омываемым с внутренней стороны цитоплазмой, с внешней – межклеточной жидкостью. И цитоплазма, и межклеточная жидкость – электролиты, т.е. проводят электрический ток. Два проводника электрического тока, разделенные диэлектриком, являются конденсатором. Если на электроды подать напряжение, то мембрана поляризуется в результате разделения зарядов внутри клетки и в межклеточной жидкости под действием электрического поля. Это эквивалентно заряду конденсаторов. См (емкость мембраны), обкладками которого является с внутренней стороны мембраны цитоплазма, с внешней – межклеточная жидкость. Так как цитоплазма и межклеточная жидкость электропроводны, то они обладают электрическими сопротивлениями. На рисунке этими эквивалентами являются Rц и Rмж. При увеличении частоты тока и емкость, и сопротивление биоткани уменьшаются. Это связано с механизмом ее поляризации. Для проведения измерений электрической емкости и сопротивления в биофизике используется измеритель иммитанса – радиоизмерительный прибор, предназначенный для определения параметров полного сопротивления или полной проводимости электрической цепи: R – сопротивления, С – емкости. Сумма активного (R) и емкостного (С) сопротивлений называется – обобщающее измеритель понятие для полного (комплексного) иммитанса сопротивления – называется импедансом (Z). электрод Ср 34,1 pF Принцип измерения основан на анализе ы прохождения тестового сигнала (обычно биоткан синусоидального) с заданной частотой через ь измеряемую цепь, обладающую комплексным сопротивлением. Напряжение рабочей частоты с внутреннего генератора подается на измеряемый объект. На выделенном участке цепи измеряется электродная напряжение, ток и фазовый сдвиг между ними. камера Измеренные величины используются для расчёта Рисунок 2. Схема установки для параметров цепей. измерения сопротивления и емкости Графики зависимости сопротивления и биологической ткани емкости биоткани от частоты переменного тока называются дисперсионными кривыми. У нативной ткани мембраны не повреждены. При повреждении мембран поляризационные эффекты уменьшаются, что приводит к уменьшению как электрической емкости, так и электрического сопротивления ткани. Поэтому для нативной и разрушенной биологической ткани будут отличаться и дисперсионные кривые. Измерение импеданса и построение дисперсионной кривой позволяет контролировать состояние органов при трансплантации в медицине, оценивать физиологическое состояние человека и животных. В селекции растений отбирать устойчивые к низким температурам экземпляры, так как у неустойчивых особей при низких температурах мембраны разрушаются кристаллами льда цитоплазмы и фазовыми переходами мембраны. Более быстрым и достаточно информативным является расчет коэффициента поляризации Кп: Кп = R4/ R6, (1) где R4 – сопротивление ткани на частоте 104 Гц, R6 – сопротивление ткани на частоте 106 Гц. При расчете Кп достаточно провести измерение только на двух частотах. Нативные ткани обладают высоким значением коэффициента поляризации. При разрушении 9 мембран значение Кп уменьшается и приближается к единице. Так, после замораживания курицы при температуре -20 оС коэффициент поляризации печени падает от 11,6 до 3,1, при повторном замораживании он равен 1,4. Таким образом, Кп может быть использован для оценки качества продукции, т.е. определения было ли мясо замороженным и сколько раз. ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ 1. Изучите используемые в работе приборы. Включите измеритель иммитанса и инфракрасный облучатель. 2. В стакан с водой положите печень и поставьте на облучатель. Прогрейте печень примерно до 60 оС. Воткните игольчатые электроды в нативную печень. 3. Измерьте сопротивление, емкость и импеданс в диапазоне частот 100 Гц – 100000 Гц. Результаты запишите в табл. 1. 4. Повторите те же измерения для прогретой печени. 5. По результатам измерений постройте дисперсионные кривые в полулогарифмических координатах в диапазоне частот 100 Гц – 100000 Гц или используйте для этой цели компьютер. 6. Рассчитайте значения коэффициентов поляризации по формуле (1). 7. Сравните дисперсионную кривую Z нативной печение с дисперсионными кривыми лабораторной работы №5. Определите, какая эквивалентная схема в большей степени соответствует печени. Таблица 1 Зависимость сопротивления и емкости куриной печени от частоты переменного тока R, Ом C, нФ Z, Ом 0,1 0,5 1 5 10 50 100 500 1000 Нативная печень f, кГц C, нФ Прогретая печень R, Ом Z, Ом Значение коэффициента поляризации для нативной печени: КпН = ачение коэффициента поляризации для разрушенной печени: КпР = Рисунок 3.__________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ВЫВОДЫ: Контрольные вопросы: 1. Нарисуйте эквивалентную электрическую схему биологической ткани. 10 2. 3. 4. 5. 6. Почему биологические ткани обладают электрической емкостью? Что такое импеданс? Что такое дисперсионная кривая? Чему равен коэффициент поляризации биологической ткани? Что характеризует коэффициент поляризации? РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________) РАБОТА СДАНА______________________________________(________________) ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 4 ПОЛУЧЕНИЕ СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ ВОДНОГО РАСТВОРА ВИТАМИНА В2 ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить законы поглощение света и получить спектр поглощения водного раствора витамина В2. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: спектрофотометр с принадлежностями, ФЭК, водный раствор витамина В2. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ При прохождении света через вещество часть фотонов захватывается его атомами и световой поток ослабевает. Захват фотона приводит к переходу электрона атома на более высокие энергетические уровни. Чем больше атомов и молекул встретится на пути светового потока, тем больше вероятность захвата фотона и тем сильнее уменьшается интенсивность светового потока. Направим на плоскую поверхность прозрачной кюветы с раствором окрашенного вещества параллельный пучок света интенсивностью I0 (рис. 1). На расстоянии x от поверхности выделим бесконечно тонкий слой вещества dx. l Интенсивность света dI, поглощенного этим слоем, пропорциональна интенсивности падающего на него света I и количеству атомов, находящихся в слое dx,: dI=-k I dx (1) I I Знак минус означает, что интенсивность света в направлении оси ОХ уменьшается, k – константа пропорциональности, она характеризует поглощение света в слое единичной толщины. x dx x+dx 0 X Разделим переменные в равенстве (1) и проинтегрируем его от одной поверхности кюветы с раствором до другой, т. е. Рисунок 1. К выводу закона левую часть от I0 до I, а правую — от 0 до l, где l — толщина поглощения света кюветы: I l dI I 0 I 0 k d x (2) . Считая показатель поглощения k не зависящим от расстояния и от интенсивности света, после интегрирования получим: ln I – ln I0 = - kl. (3) Из уравнения (3) найдем значение интенсивности света, прошедшего через кювету: I = I0 е-kl. (4) 11 Показатель поглощения света k зависит от молярной концентрации окрашенных молекул С. Введем коэффициент пропорциональности тогда k=С и запишем уравнение (4) в виде: (5) I/I0 = e -Сl или I = I0 е -Сl. Это закон поглощения света Бугера-Ламберта-Бера. После логарифмирования выражения (5) и преобразования натурального логарифма в десятичный получим: -lg(I/I0) = lg(I0/I) = Сl. (6) где называется молярным коэффициентом гашения (экстинции) вещества ( =/2,3). Его значение определяют при толщине кюветы 1 см и концентрации окрашивающего вещества в 1 М, и он зависит только от длины волны света, проходящего через кювету. Отношение интенсивности света, прошедшего через кювету (I), к интенсивности падающего света (I0) называют коэффициентом пропускания (Т) и выражают в процентах: Т(%)=( I/ I0)∙100% (7) Сравнивая уравнения 6 и 7, можно записать: lg(I0/I) = cl=lg(1/T) (8) Десятичный логарифм отношения интенсивности падающего на вещество света к интенсивности света, прошедшего через это вещество, называется оптической плотностью вещества: D=lg(I0/I). Выразим в последнем уравнении значение концентрации вещества через оптическую плотность: c = D /l или D = c l (9) Из уравнения (9) следует, что оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации вещества и толщине кюветы (длине пути). В биологии величина оптической плотности используется для определения концентраций окрашенных веществ. В физике наиболее популярен коэффициент пропускания, так как он выражает долю света, прошедшего через раствор. Так как показатель поглощения зависит от длины волны проходящего света, то от длины D,oe T,% 1,25 100,0 волны также зависят оптическая плотность и D, ое T, % коэффициент пропускания. Зависимость 1 75,0 оптической плотности вещества от длины волны Рисунок 2. 0,75 Спектры называется спектром поглощения, а зависимость 50,0 поглощения и 0,5 коэффициента пропускания — спектром пропускания 0,25 25,0 пропускания. Примеры спектров поглощения и спиртового экстракта пропускания приведены на рис. 2. Как следует из 0 0,0 хлорофилла рисунка, спектры зеркально симметричны друг 320 400 480 560 640 720 длина волны, нм другу. Для измерения величин D и Т существует широкая группа приборов, называемых спектральными. Наиболее простым из них является фотоэлектроколоритметр (ФЭК), служащий для измерений концентраций 12 окрашенных веществ в видимой области спектра. Определенные длины волн оптического спектра выделяются из света лампы накаливания стеклянными светофильтрами. Спектры поглощения и пропускания возможно получить только с использованием спектрофотометра. В этом оптическом приборе свет, излучаемый лампой накаливания (видимый свет) или газоразрядной дейтериевой лампой (УФ область) разлагается в спектр дифракционной решеткой. Это позволяет устанавливать длину волны с точностью до 1 нм. Спектры поглощения используют для идентификации веществ, так как они строго индивидуальны, а так же для измерения концентраций. В последнем случае пользуются той длиной волны, при которой оптическая плотность максимальна. ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ ЗАДАНИЕ 1 1. Включите ФЭК и спектрофотометр. Прогрейте их в течение 10 мин. 2. Откройте кюветное отделение ФЭК. По ходу луча установите белый экран и, переключая сменные фильтры, определите цвет, соответствующий каждой длине световой волны, пропускаемой светофильтром. Заполните таблицу 1. ЗАДАНИЕ 2 1. Ознакомьтесь с порядком работы на спектрофотометре. 2. Включите спектрофотометр и дайте ему прогреться не менее 15 мин. 3. В кюветное отделение спектрофотометра установите в дальнюю ячейку кювету с растворителем, в ближнюю ― кювету с водным раствором витамина В2. Измерьте оптическую плотность D с шагом 20 нм для диапазона длин волн 320-720 нм. Результаты занесите в таблицу компьютера. 4. Распечатайте полученный спектр поглощения и вклейте в протокол. ОТЧЕТ Таблица 1 Зависимость окраски светового луча от длины волны , нм 315 364 400 440 490 540 590 670 750 870 Цвет луча Рисунок 3. __________________________________________________________ _______________________________________________________________________ ВЫВОДЫ: Контрольные вопросы: 1. Что такое коэффициент поглощения, коэффициент экстинции, оптическая плотность? 2. Дайте определение спектра поглощения. 2. Сформулируйте закон Бугера-Ламберта-Бера. 3. Для каких целей можно использовать ФЭК? 4. Для каких целей можно использовать спектрофотометр? 5. Пользуясь спектром поглощения, изображенном на рис. 2 объясните, почему хлорофилл зеленого цвета. 13 5. Как выбрать оптимальный светофильтр у ФЭКа или длину волны у спектрофотометра для количественной оценки содержания красящего вещества в цветном растворе? 6. На распечатанном спектре поглощения витамина В2 примерно нарисуйте его спектр пропускания. РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________) РАБОТА СДАНА______________________________________(________________) ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 5 ПОЛУЧЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДНОГО РАСТВОРА ВИТАМИНА В2 ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: построить калибровочную кривую зависимости интенсивности люминесценции от концентрации раствора витамина В2 , определить значение неизвестной концентрции раствора витамина В 2. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: флуориметр, водные растворы витамина В2 известной и неизвестной концентраций, пробирки. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ К фотобиологическим процессам относят группу явлений, связанных с поглощением света и приводящих к разнообразным биохимическим, физиологическим и общебиологическим процессам. К этим явлениям относится фотосинтез — единственный биологический процесс, в котором происходит увеличение свободной энергии системы, все остальные биологические процессы осуществляются за счет потенциальной энергии, накапливаемой фотосинтезирующими организмами. Природа света. Видимый свет представляет собой E S2* электромагнитные волны длиною от 350 до 760 нм. Свет с 4 4′ * длиной волны менее 350 нм называется ультрафиолетовым, S1 5 T* более 760 нм — инфракрасным. Двойственность природы света заключается в том, что, имея волновую природу, он 1 2 поглощается и излучается порциями — квантами. Поглощение 3 S0 света сопровождается переходом одного из электронов в молекуле с более низкого (основного) энергетического уровня (S0) на более высокие (S*2, S*3) (рис. 1, переходы 1 и 2). Расстояние между уровнями по шкале энергии соответствует энергии ΔЕ поглощенного кванта. Атомы или молекулы, поглотившие квант энергии, находятся в возбужденном состоянии. Такое состояние термодинамически неравновесно, поэтому электрон стремится вернуться на более низкий уровень. Это возможно двумя путями и сопровождается уменьшением энергии возбужденного электрона. В первом случае электрон, тратя поглощенную энергию на излучение кванта света, возвращается на основной уровень (переходы 2 – 3, резонансная люминесценция). Во втором случае после перехода 1 с уровня S2* осуществляется безизлучательный переход 4 на нижележащий уровень S1*. Потерянная часть энергии при этом трансформируется в кинетическую (тепловую) энергию возбужденной молекулы. С уровня S 2* возможно высвечивание кванта света (переход 3, люминесценция), либо переход 4′ на триплетный уровень Т*, связанный с изменением спина электрона. На триплетном уровне электрон будет находиться до того момента, пока не произойдет в результате малого дополнительного поглощения энергии повторное Рисунок 1. электронных молекулы Схема уровней 14 изменение спина. Только в этом случае становится возможным обратный переход 5 на уровень S2*. В этом случае время между начальным переходом 1 и переходом 3 увеличивается. Люминесценция в этом случае носит название фосфоресценции или замедленной люминесценции. Все нагретые тела в природе излучают электромагнитные волны. Положение максимума интенсивности свечения в спектре излучения определяется законом Вина и зависит от температуры тела: с повышением температуры максимум сдвигается в коротковолновую область спектра. Так солнце, температура поверхности которого около 6000 К, имеет максимум в зеленой области спектра, а лампа накаливания с температурой нити в два раза ниже излучает преимущественно желтый свет. Такое свечение называется равновесным. Однако некоторые вещества при комнатной температуре способны в определенных условиях излучать свечение в области спектра, далекой от температурного максимума. Такое излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре, называется люминесценцией. К люминофорам, т.е. люминесцирующим веществам, относятся газы в разрядных трубках, пары серы, йода, ароматические соединения (нафталин), красители, кристаллы неорганических соединений с примесями ионов тяжелых металлов (рубин) и др. При температуре незначительно превышающей окружающую, они способны излучать как тела, нагретые до более высокой температуры. Так, у солнца и у лампы дневного света температуры разные, но спектры излучения одинаковые. Если после подъема на возбужденный уровень электрон безизлучательно переходит на низкий возбужденный уровень, а затем, излучив квант, вернется на основной уровень, то вследствие потери части энергии длина волны люминесценции будет больше длины волны возбуждающего света. Поэтому максимум спектра люминесценции сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн (правило Стокса). Многие важные молекулы, поглощая свет, люминесцируют. Среди них хлорофилл, β-каротин и др. 2 Возбуждение может осуществляться ультрафиолетовым 3 4 излучением либо синим светом. Люминесценция хлорофилла происходит в красной области спектра. Наблюдать люминесценцию можно непосредственно, но для ее количественной оценки используют приборы, называемые флуориметрами. Так как интенсивность люминесценции пропорциональна содержанию 132,5 5 люминесцирующих молекул в растворе, то флуориметр может быть использована для измерения концентрации Рисунок 2. Схема флуориметра. веществ. Работа флуориметра состоит в следующем (рис. 2). Возбуждающий свет от источника 1 (синий светодиод) попадает на пробирку с раствором витамина В2 (2), вызывая его флуоресценцию. Между пробиркой и фотодиодом 4 расположен светофильтр 3, прозрачный для зеленого света люминесценции витамина В 2 и непрозрачный для синего возбуждающего света. В результате в фотодиоде возникает фототок, пропорциональный интенсивности люминесценции. Измерительный прибор 5, шкала которого прокалибрована в относительных единицах, преобразует сигнал фотоэлемента в числовую величину. Линейная часть зависимости интенсивности люминесценции от концентрации люминесцирующего вещества будет наблюдаться только в определенном диапазоне от нуля до некоторой величины концентрации. При низких концентрациях свет люминесценции свободно выходит за пределы раствора, не поглощаясь им. По мере роста концентрации часть света люминесценции начинает поглощаться самим раствором, и зависимость приобретает нелинейный характер. Поэтому для определения концентрации строят калибровочную кривую, по которой затем можно определять концентрацию. Для этого делают точные растворы люминесцирующего вещества и измеряют интенсивности 15 их люминесценции. По полученным данным строят график зависимости люминесценции от концентрации люминесцирующего вещества. Этот график и называется калибровочной кривой. ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ 1. Включите флуориметр. 2. В кюветное отделение поместите пробирку с водой. Закрыв колпачком пробирку, установите «нулевое» показание прибора нажатием на соответствующую кнопку. 3. Замените пробирку с водой на растворы витамина В2 известных концентраций. Проведите измерения интенсивности люминесценции пигмента и запишите в таблицу полученные значения. 4. Поместите в прибор раствор с самым высоким уровнем люминесценции. Определите визуально цвет возбуждающего света и люминесценции. 5. Постройте график зависимости интенсивности люминесценции от концентрации раствора (калибровочную кривую). 6. Используя калибровочную кривую, определите неизвестную концентрацию витамина В2. Таблица 1 Интенсивность люминесценции водного раствора витамина В2 Концентрация, Интенсивность люм., отн. ед. Цвет возбуждающего света ________________, цвет люминесценции_____________ Определение неизвестной концентрации экстракта. Интенсивность люминесценции ______________ отн. ед. Концентрация________________________ Рисунок 3 _________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ ВЫВОДЫ: Контрольные вопросы: 1. Сформулируйте закон Вина. 2. В чем заключается двойственность природы света? 3. Что такое люминесценция? 4. Что такое возбужденное состояние молекулы или атома? 5. По схеме, приведенной на рис. 1, объясните, почему выполняется правило Стокса. 6. Чем вы объясните то, что люминесценция хлорофилла возбуждается синим светом, а цвет люминесценции красный? 7. Что такое калибровочная кривая? 16 РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________) РАБОТА СДАНА______________________________________(________________) ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 6 ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭЛЕКТРОАКТИВИРОВАННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: изучить современные методы получения электроактивированных водных растворов и их применение в ветеринарии и зоотехнии. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: стенд УМС-3, 10% раствор хлористого натрия, лабораторная посуда. КРАТКАЯ ТЕОРИЯ В настоящее время существуют многочисленные нормы, правила и подходы к определению качества воды питьевой и водных растворов (моющих, дезинфицирующих и стерилизующих). Основой качества питьевой воды считается ее чистота и минеральный состав. Основой качества моющих, дезинфицирующих и стерилизующих водных растворов является противоречивость их свойств: высокая эффективность к простейшим и безвредность к сложным, высокоорганизованным биологическим системам − растениям, животным и человеку. Многочисленные исследования доказали, что существующие стандарты оценки качества и исследования свойств воды и водных растворов являются несовершенными и не учитывают множество параметров, которые характеризуют ее биологическую полезность и активность. На физиологические свойства воды влияют не только химический состав и степень очистки, но и целый ряд других комплексных физических параметров, которые характеризуют воду как сложную структурированную систему, находящуюся в неравновесном термодинамическом состоянии с собственной микрокластерной структурой Одним из важнейших параметров питьевой воды, с точки зрения современной медицины, является ее "заряд" – окислительно-восстановительный потенциал (ОВП). Классическое понятие "электрический потенциал" означает работу переноса единичного положительного заряда из одной точки электрического поля в другую. Перенос электрона равносилен удалению от него соответствующего положительного заряженного электронного акцептора. Потенциал ионизации атома водорода (Н) означает, что для перенесения его единственного электрона в бесконечность (относительно протона) должна быть затрачена энергия, эквивалентная 21,6010-19 Дж или 13,5 эВ. Соответственно при возвращении электрона на свою орбиту или при попадании его на орбиту другого акцептора выделяется эквивалентное количество энергии, характеризующей "электронное сродство" акцептора. При проведении окислительно-восстановительных реакций между парами веществ, одни из которых являются донорами электронов или восстановителями, а другие их акцепторами или окислителями, совершается перенос определенного числа электронов и затрачивается энергия. ОВП соответствует работе по переносу электронов от окисляемого элемента или соединения к восстанавливаемому, или от восстановителя к окислителю. В тканевых жидкостях существует ОВП, который отражает соотношение суммарных концентраций окисленных и восстановленных форм и "служит мерой тенденции системы становиться окисленной или восстановленной". Иными словами ОВП отражает донорные или акцепторные свойства тестируемой живой системы. Физиологическая значимость ОВП определяется способностью этого показателя регулировать общий биохимический и биофизический статус среды. ОВП питьевой воды должен быть отрицательным, а рН нейтральным, т.к. клетки человека имеют ОВП ≈ -70 мВ. Болезни возникают, когда потенциал клеток отличается от нормы. Обычная питьевая (консервированная) вода с положительным ОВП, проникая в ткани человеческого организма, отнимает электроны от клеток и тканей, состоящие из воды на 80-90%. В результате этого 17 биологические структуры организма (клеточные мембраны, органоиды клеток, нуклеиновые кислоты и другие) подвергаются окислительному разрушению. Так организм изнашивается, стареет, жизненно важные органы теряют свою функцию, снижается иммунитет. Использование новых уникальных российских технологий, запатентованных устройств и способов позволило создать установки принципиально нового поколения как для приготовления питьевой воды высшего качества, так и для получения эффективных безвредных для человека дезинфицирующих растворов. На сегодняшний день эти установки не имеют аналогов в мире. Основой установки является модульный проточный элемент (ПЭМ), имеющий две проточные камеры, Рисунок 1. разделенные керамической полупроницаемой диафрагмой ПЭМ (рис. 1А). В схематическом варианте установка изображена на рис. 1Б. На ее основе рассмотрим принцип униполярной (уни – один) обработки воды. Водопроводная вода подается на два входа униполярных камер, разделенных диафрагмой. Каждая камера имеет электропроводящий элемент (анод или катод – в зависимости от знака подключенного электрического напряжении). Диафрагма проницаема для воды и мелких ионов. В результате через обе камеры протекает электрический ток, но жидкость между ними не перемешивается. В анодной камере элемента ПЭМ вода в течение долей секунды насыщается высокоактивными окислителями: HCIO, ClO2, А Б ClO2 , O3 , O2 , H2O2 , OH , HO2 . Их концентрация в зависимости от режима электрохимической обработки может изменяться от 1 до 10 мг/л. Процессы прямого электролитического окисления (на поверхности электрода) и электрокаталитического окисления (на каталитически активных центрах поверхности электрода и в объеме воды с участием катализаторов-переносчиков) обеспечивают разрушение органических примесей и уничтожение микроорганизмов. Основными процессами при униполярной электрохимической катодной обработке воды являются электролитическое восстановление в катодной камере электролизера воды и содержащихся в ней веществ. При катодной обработке в элементе ПЭМ вода также в течение долей секунды насыщается высокоактивными восстановителями: ОН-, Н2О2 , НО2, О2-, еaq. Это приводит к образованию нерастворимых гидроксидов тяжелых металлов (Меn- + nОН- Ме(ОН)n). Кроме того, в катодной камере происходит прямое электролитическое восстановление (на поверхности электрода), а также электрокаталитическое восстановление (в объеме воды с участием катализаторовпереносчиков и гидратированных электронов) многозарядных катионов тяжелых металлов: Меn+ + е- Ме0 . Указанные процессы снижают токсичность воды, обусловленную наличием ионов тяжелых металлов, за счет перевода их в естественную устойчивую биологически неактивную форму существования в природе. ПОЛУЧЕНИЕ АКТИВИРОВАННЫХ РАСТВОРОВ Включите стенд в сеть. Включите воду и установить суммарный проток воды из анодной и катодной камер электроативатора 50±2 л/ч. Протоки из шлангов выхода анолита и католита должны быть равны. Показание манометра контролируйте на протяжении всего опыта. Измерьте параметры исходной водопроводной воды (рН, ОВП, температура, минерализация) и полученные значения запишите в табл.1. Подайте электропитание на стенд и включите его в режим II. 18 Электроактивацию проводите при значении электрического тока 6 ампер. Величину тока установите изменением скорости подачи раствора хлористого натрия. Соберите анолит и католит в пластиковые стаканы по 500 мл. Измерьте рН, ОВП, t, минерализацию полученных растворов. Полученные значения запишите в табл. 2. Оцените запах анолита и католита. В табл.2 наличие запаха хлора отметьте знаком «+/-». Включите стенд в режим I. В этом режиме получают питьевые электроактивированные анолит и католит. Измерьте рН, ОВП, t, минерализация полученных растворов. Полученные значения запишите в табл. 2. Обобщите полученные результаты и сделать выводы. Таблица 1 Параметры исходной водопроводной воды рН ОВП, мВ Т,ОС Минерализация, ppm Таблица 2 Параметры электроактивированных водных растворов Анолит, Cl2 « » рН ОВП, Т,ОС мВ Минерали зация, ppm Анолит питьевой Католит Cl2 (+/-) рН ОВ П, мВ Т,ОС Минерализ ация, ppm Католит питьевой Выводы: Контрольные вопросы: 1. Что такое окислительно-восстановительный потенциал? 2. Какова величины ОВП в тканях человека? 3. Почему анолит пахнет хлором? 4. Исходя из параметры электроактивированных водных растворов ответьте почему анолит называют «мертвой водой», а католит – «живой»? 5. Зачем в электроактиваторе имеется диафрагма (неселективная полупроницаемая мембрана)? 6. Для каких целей вы будете использовать анолит? 7. Для каких целей вы будете использовать католит? РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________) РАБОТА СДАНА______________________________________(________________)
