ВЛИЯНИЕ ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩИХ ГОРМОНОВ

УДК 577.115
Усовершенствование
способа
этерификации
жирных
кислот
для
идентификации их с помощью газовой хроматографии
Л.Н. Чижова, к. б. н.
И.Н. Локтева, с.н.с.
В.Ю. Бороденко, асп.
В последние годы изучению жирных кислот уделяется все большее
внимание. В результате проводимых исследований все полнее вырисовывается
разносторонняя функциональная роль этих важнейших соединений.
От жирнокислотного состава липидов зависит целый ряд процессов,
например, транспортные процессы, гормоно-рецепторное взаимодействие,
функция
фосфолипидообменивающих
белков,
синаптическя
передача,
некоторые иммунологические реакции и т.д. Жирные кислоты являются
важнейшими компонентами липидов, определяющими их физико-химические
свойства и функциональные особенности. В животном организме обнаружено
большое разнообразие жирных кислот. В липидах различных органов найдены
жирные кислоты с длиной цепи от 12 до 24 углеродных атомов, содержащие
четное и нечетное число атомов углерода, с нормальной и разветвленной
цепью, насыщенные и ненасыщенные, с различным количеством двойных
связей.
Как и полярные «головки» фосфолипидов, жирные кислоты принимают
участие в интеграции биологических мембран, обусловливая их структурные и
функциональные
особенности.
Углеводородные
цепи
жирных
кислот
участвуют в молекулярной организации биомембран, взаимодействуя при
помощи
Ван-дер-Ваальсовых
сил
с
другими
липидами
(например
с
холестерином) и с гидрофобными областями мембранных белков. Различные
биомембраны отличаются друг от друга не только по составу и расположению
липидов и белков, но и по составу и организации углеводородных цепей
жирных кислот.
Благодаря чрезвычайному разнообразию жирных кислот, возможно
существование множества липидов с широким спектром физико-химических
свойств, которые определяют их биологическую роль, метаболизм, участие в
биохимических реакциях. Состав жирных кислот – это своеобразная
характеристика отдельных липидных классов и индивидуальных липидов.
Разнообразием
отличаются
жирные
кислоты
мышц
сельскохозяйственных животных. Уровень содержания отдельных из них
связан как с продуктивностью животных (живая масса, прирост и др.), так и с
качеством мяса, следовательно, они могут служить тестом его биологической и
пищевой ценности.
Целью
настоящей
работы
являлась
разработка
новых
и
усовершенствование существующих методов выделения и этерификации
жирных кислот из мяса сельскохозяйственных животных.
Жирные кислоты являются группой гомологичных соединений, различия
в свойствах двух соседних членов этой группы порой выражены настолько
слабо, что при помощи большинства хроматографических методов, за
исключением газовой хроматографии, разделить их практически невозможно.
Многие соединения в биологических материалах являются по природе
нелетучими, и поэтому для их определения с помощью газовой хроматографии
должны быть приготовлены их летучие производные. Производные для
количественного анализа соединений должны приготавливаться просто и
быстро. Они должны быть устойчивы в течение нескольких дней и
образовываться при низких температурах, чтобы не произошло разложение
чувствительных молекул. Выбор летучих производных и типа колонки для
анализа зависит от сложности соединений в исследуемой пробе.
Для газохроматографического анализа обычно используют не свободные
жирные кислоты (ЖК), а их метиловые эфиры, так как температура кипения
эфиров значительно ниже, чем температура кипения жирных кислот, и потому
возможно проводить анализ при более низких температурах.
Существует масса приемов получения метиловых эфиров жирных кислот
как по характеру используемых реагентов, так и аппаратурному оформлению.
Нет метода, обладающего только положительными качествами. Все они имеют
и положительные и отрицательные стороны, в зависимости от предъявляемых
требований.
По методу В. Штоффеля (1959), например, для получения метиловых
эфиров
используют
смесь
безводного
метанола
и
соляной
кислоты,
длительность этерификации 2 часа.
По методу К. Пейскера (1964) применяют смесь метанола, хлороформа и
серной кислоты, длительность этерификации 2-3 часа.
По методу В. Моррисона и Л. Смита (1964) метилирование проводят с
помощью раствора фтористого бора в метаноле, длительность метилирования
90 минут.
Метод метилирования с использованием BF3 позволяет быстро получать
чистые метиловые эфиры жирных кислот. Однако его недостатком является
довольно сложная процедура получения метилирующего реактива, при которой
приходится работать с ядовитым газом, реактив BF3 в метаноле нельзя хранить
более двух месяцев.
В отечественной литературе наиболее часто встречается в качестве
метилирующего агента хлористый ацетил в метаноле (Верещагин А.Г., 1964;
Byorntorp Р., 1960).
Мы в своей работе ориентировались на доступность реактивов, их
экологическую безопасность и сокращение временного фактора. Для этого
использовались
приспособления
для
метилирования
жирных
кислот
диазометаном (включает воронку с притертым краном, колбу на 250 мл с
боковым ответвлением и сосуд-приемник объемом на 100 мл). Соединение всех
частей осуществляется с помощью хорошо притертых шлифов.
Предварительно
в
колбу
помещали
гидроокись
калия
и
смесь
гидразингидрата и изопропилового спирта. Приемник заполняли этоксиэтаном,
через воронку подавали очищенный хлороформ. В результате реакции с
содержимым колбы происходит образование диазометана.
3 KOH + NH2-NH2 + CHCl3 = CH3N2 + 3 KCl + 3 H2O
Диазометан через боковой отросток поступает в сосуд с эфиром, и там
происходит насыщение эфира диазометаном. Смесь приливают к пробе жирных
кислот, метилирование проходило в течение 10-15 минут с изменением цвета
смеси и выделением газа.
R-COOH + CH3N2 = R-COOCH3 + N2
По окончании метилирования эфир выпаривали на водяной бане.
Анализ полученных метиловых эфиров кислот проводили в хроматографе
«Хром-5» на колонке из нержавеющей стали 2,40±0,6 мм (внутренний
диаметр),
заполненной
15%-ным
полидиэтиленгликольсукцинатом
на
хромосорбе, силанизированном гексаметилдисилазаном. Величина зерен 60-80
меш. Температура колонки 1850, дозатор 300, газ-носитель гелий, скорость
прохождения через колонку 35 мл/мин, детектор пламенно-ионизационный.
Скорость воздуха и водорода (для поддержания пламени) соответственно 950 и
55 мл/мин. Чувствительность самописца
10 мВ. Пробу объемом 1-3 мкл
вводили шприцем Гамильтона. Анализ проводили в течение 25 минут.
Усовершенствованный нами способ этерификации жирных кислот для их
идентификации на хроматографе «Хром-5» экономичен, менее длителен,
экологичеки безвреден и более точен по сравнению с другими методами.
Литература
1. Ленинджер, А. Основы биохимии /А. Ленинджер - М.: Мир, 1985.-Т 1-3.
2. Общая органическая химия - М.: Химия, 1986. -Т 11. Липиды, углеводы,
макромолекулы, биосинтез /Ред. проф. Н.К. Кочеткова, В.Е. Васьковский в
соавт.- М., 2001.
3. Верещагин, А.Г. Биохимия /А.Г. Верещагин, С.В. Скворцов, И.И. Исхаков. 1963.
4. Грин, Н. Биология /Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор //В 3 т. Под ред. Сопера Р.
-М.: Мир, 1990.
5. Методические
указания
по
исследованию
липидного
обмена
у
сельскохозяйственных животных, выпуск 3 /Под ред. Н.А. Шманенкова. Боровск, 1973. -С. 92-95.
6. Синяк, К.М. Лабораторное дело /К.М. Синяк, М.Я. Оргель, В.И. Крук. –
1976. -№1. -С. 37-41.
7. Bjorntorp, P. Polynsaturated Fatty Acids in Man Aslo, 1960.
8. Лабораторное дело. -М.: Медицина. – 1971. -№2.
9. Митрук, Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и
медицине /Б.М. Митрук. -М.: Медицина. -1978 г.
10. Stoffel, W. /W. Stoffel, F. Chu, E.N. Ahrens. –Anal. Chtm 159. –vol. 31. –
p.307-318.
11. Peisker, K.V.-J. Amer. Oilchem Soc., 1964. - vol 41. -p 87-88.
12. Morrison, W.R. /W.R. Morrison, L.M. Smith. -J. Lipid Res., 1964. -vol.5. p.600-608.