ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ С МЕМБРАННО

РЫБНОЕ ХОЗЯЙСТВО
УДК 597-143.4:571.118
А. Н. Неваленный, Д. А. Бедняков
Астраханский государственный технический университет
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ
С МЕМБРАННО-СВЯЗАННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ
СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ КИШЕЧНИКА РЫБ
СЕМ. ACIPENSERIDAE И CYPRINIDAE
В последние годы особый интерес у исследователей вызывает влияние микроэлементов на различные функции метаболизма у гидробионтов
[1–4]. Однако данные по воздействию ионов металлов на процессы пищеварения в кишечнике рыб отрывочны [5–9]. В то же время известно, что
кинетические характеристики многих пищеварительных ферментов существенно изменяются под влиянием ионов металлов [7, 8, 10, 11], которые
относятся к группе веществ-модификаторов [12, 13].
Целью данной работы являлось изучение in vitro влияния ионов
шести металлов четвертого периода периодической системы химических
элементов Д. И. Менделеева (Mn, Fe(II), Co, Ni, Cu и Zn) в концентрации
10 мг/л на уровень активности суммарной протеиназы, мальтазы и щелочной
фосфатазы слизистой оболочки кишечника севрюги, карпа и карася.
Материал и методика
Работа выполнена в течение 2003–2005 гг. в лабораторных условиях.
В работе были исследованы половозрелые особи севрюги (Acipenser stellatus Pallas), карпа (Cyprinys carpio L.) и карася (Carassius carassius L.).
Определение уровня активности мальтазы производили глюкозооксидазным методом [14], уровня активности нейтральной протеиназы – модифицированным методом Лоури [15], уровня активности щелочной фосфатазы – по степени гидролиза n-нитрофенилфосфата Na.
В качестве источников ионов металлов использовали соответствующие сернокислые соли (MnSO4, FeSO4, CoSO4, NiSO4, CuSO4, ZnSO4).
Растворы этих солей добавляли в ферментативно активный препарат
и субстрат в количестве, необходимом для создания в этих средах концентрации соответствующего иона в 10 мг/л.
Результаты обрабатывали методами вариационной статистики
[16, 17]. Достоверность различий определяли с помощью критериев Стьюдента. Основная часть статистической обработки выполнена с использованием пакета статистической обработки информации STATGRAPHICS.
Результаты и обсуждение
Данные, полученные при исследовании влияния ионов металлов
в концентрации 10 мг/л на уровень активности щелочной фосфатазы,
мальтазы и суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб,
представлены в таблице.
93
ISSN 1812-9498. ВЕСТНИК АГТУ. 2005. № 3 (26)
Влияние ионов металлов на уровень активности
пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб
Ион металла
Контроль
Mn
Fe(II)
Co
Ni
Cu
Zn
Фермент
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Щелочная фосфатаза
Мальтаза
Суммарная протеиназа
Уровень активности ферментов, мкмоль/(г.мин)
Севрюга
Карп
Карась
0,28 ± 0,01
0,18 ± 0,01
0,27 ± 0,01
5,00 ± 0,15
4,34 ± 0,13
3,48 ± 0,21
0,26 ± 0,03
0,42 ± 0,03
0,74 ± 0,05
0,59 ± 0,02
0,39 ± 0,02
0,48± 0,02
6,34 ± 0,28
5,41 ± 0,18
5,01 ± 0,37
0,44 ± 0,05
0,68 ± 0,02
1,03 ± 0,06
0,49 ± 0,01
0,33 ±0,02
0,44 ± 0,02
5,28 ± 0,24
5,07 ± 0,11
4,91 ± 0,25
0,43 ± 0,02
0,54 ± 0,03
0,97 ± 0,07
0,40 ± 0,01
0,23 ± 0,01
0,36± 0,02
5,61 ± 0,40
4,98 ± 0,17
4,27 ± 0,19
0,34 ± 0,01
0,51 ± 0,02
0,83 ± 0,04
0,40 ± 0,01
0,23 ± 0,01
0,30 ± 0,01
5,13 ± 0,25
4,41 ± 0,07
3,71 ± 0,24
0,27 ± 0,04
0,45 ± 0,03
0,79 ± 0,03
0,15 ± 0,01
0,10 ± 0,01
0,10 ± 0,01
3,79 ± 0,10
3,21 ± 0,15
2,18 ± 0,11
0,19 ± 0,01
0,32 ± 0,02
0,59 ± 0,03
0,25 ± 0,01
0,12 ± 0,01
0,19 ± 0,01
3,18 ± 0,05
3,72 ± 0,11
2,96 ± 0,17
0,29 ± 0,02
0,35 ± 0,03
0,65 ± 0,02
Как видно из таблицы, ионы металлов оказывают разнонаправленное влияние на уровень активности исследованных ферментов слизистой
оболочки кишечника рыб. При этом уровень активности ферментов слизистой оболочки кишечника зависит не только от того, какой металл находится в инкубационной среде, но и от систематического положения исследуемых рыб. Так, например, Mn2+ повышает уровень активности щелочной фосфатазы от 80 до 115 %, Fe2+ и Co2+ активируют фермент от 25 до
80 %, Cu2+ и Zn2+, напротив, вызывают ингибирование уровня активности
щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб от 10 до 60 %
в зависимости от вида рыб.
Fe2+ и Co2+ вызывают статистически достоверные изменения в уровне
активности суммарной протеиназы карповых видов рыб, в то время как
у осетровых (севрюга) данные металлы не взывают статистически значимых изменений. Это может быть объяснено, скорее всего, существенными
различиями в строении полипептидных цепочек ферментов у представителей семейств Acipenseridae и Cyprinidae.
Ранее А. М. Уголевым [18] было высказано предположение о существовании не одного, а нескольких регуляторных центров в молекулах
пищеварительных ферментов, специализированных для различных групп
эффекторов. По мнению ряда исследователей [19, 20], быстрые конформационные переходы одной формы молекулы фермента в другую, приводящие к изменению уровня их активности, могут происходить в результате
действия модификаторов как органической, так и неорганической природы.
Еще один возможный механизм взаимодействия металла с молекулой фермента, вероятно, заключается в связывании иона металла со специальной контактной площадкой (регуляторный, или аллостерический центр),
94
РЫБНОЕ ХОЗЯЙСТВО
пространственно отделенной от активного центра [21–23], с замещением металлокомпонента некоторых энзимов (пептидазы, щелочная фосфатаза) на
металл, близкий по атомному строению. Так, ионы ряда металлов, например
марганца, кобальта, цинка, способны активно подменять ионы других металлов, в частности магний, в ряде энзиматических систем [24].
Скорее всего, первый способ взаимодействия ионов металлов с ферментом лежит в основе изменения гидролитической активности такой исследуемой группы ферментов, как суммарная протеиназа и мальтаза,
а взаимодействия второго типа характерны для щелочной фосфатазы. Однако не исключено, что в ряде случаев мы имеем дело с эффектом положительной кооперативности, оказываемым ионами металлов, когда в результате взаимодействия олигомерной глобулы фермента с ионом металла
увеличивается сродство фермента к субстрату. Следствием этого становится возросшая эффективность образования продукта реакции [12, 13].
Приведенные выше данные, свидетельствующие о наличии межвидовых отличий в уровне ответной реакции пищеварительных ферментов
на присутствие ионов металлов в инкубационной среде у представителей
сем. Acipenseridae и Cyprinidae, позволяют предположить, что каталитические и регуляторные центры ферментов у осетровых и карповых рыб
имеют существенные отличия. По предположению В. В. Кузьминой [5],
в процессе эволюции каталитические центры ферментов изменяются
в меньшей степени, чем регуляторные.
Еще А. В. Войнаром [10] была отмечена зависимость ответной реакции ферментов на действие ионов металлов в соответствии с их положением в периодической таблице химических элементов Д. И. Менделеева.
В наших экспериментах была продемонстрирована зависимость ответной
реакции щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб от положения металла, находящегося в инкубационном растворе, в таблице химических элементов Д. И. Менделеева. В частности, установлено, что
в ряду металлов IV периода вспомогательных групп Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+,
Cu2+ и Zn2+ максимальное влияние оказывают металлы, находящиеся в начале и конце ряда. При этом перечисленные металлы, находящиеся в начале периода, оказывают стимулирующее действие на уровень активности
щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб, а в конце – угнетающее. Данная зависимость для мальтазы и суммарной протеиназы
прослеживается в меньшей степени.
Заключение
Приведенные результаты демонстрируют регуляторную функцию
ионов металлов, выступающих в качестве модификаторов гидролитических систем как осетровых, так и карповых видов рыб. Из приведенных
фактов следует, что, варьируя концентрацию микроэлементов, входящих
в составе премиксов в искусственные корма, возможно стимулировать
процесс усвоения углеводных или белковых компонентов пищи у выращиваемых видов рыб.
Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ
(грант № 05-04-96503)
95
ISSN 1812-9498. ВЕСТНИК АГТУ. 2005. № 3 (26)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
96
Влияние смеси хлорорганических пестицидов и тяжелых металлов на функционально-структурные характеристики ранней молоди осетра Азовского
бассейна / Э. В. Макаров, Э. Г. Спивак, Е. И. Аксенова и др. // Состояние
и перспективы науч.-практ. разработок в области марикультуры России: Материалы совещ. (Ростов-на-Дону, авг., 1996). – М.: Изд-во ВНИИПРХ, 1996. –
С. 193–196.
Леус Ю. В., Грубишко В. В. Активность антиоксидантной системы карпа при
действии ионов тяжелых металлов // Гидробиологический журнал. – 1998. –
34, № 2. – С. 59–63.
Jiayin Dai, Zheng Weiyun, Wang Shuhong. Influence of copper and zinc ions on
activity of enzymes in tissues young Pagrosomus major // Chin. J. Environ. Sci. –
1998. – 19, N 5. – P. 60–62.
Barnhoorn I., van Vuren J. H. J., du Preez H. H. Die effek van subletale dosisse
mangaan op die getal witbloedseltipes van die bloukurper Oreochromis mossambicus // SA Tydskrif Natuurwetenskap Tegnol. – 1999. – 18, N 1. – P. 5–9.
Кузьмина В. В. Оценка полифакторных воздействий на активность протеиназ
слизистой кишечника рыб // Биология внутренних вод. – 1997. – № 2. – С. 50–57.
Кузьмина В. В., Голованова И. Л. Влияние антропогенных факторов на активность пищеварительных ферментов рыб // Биология внутренних вод. – 1997. –
№ 3. – С. 72–77.
Туктаров А. В. Влияние ионов металлов на пищеварительно-транспортную
функцию кишечника осетровых рыб: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – Астрахань: Астрахан. гос. техн. ун-т, 2002. – 21 с.
Неваленный А. Н., Туктаров А. В., Бедняков Д. А. Функциональная организация и адаптивная регуляция процессов пищеварения у рыб. – Астрахань:
Изд-во АГТУ, 2003.
Неваленный А. Н., Бедняков Д. А. Влияние ионов кадмия в среде на уровень
активности ферментов, обеспечивающих процессы мембранного пищеварения у карпа // Экология. – 2004. – № 2. – С. 152–155.
Войнар А. И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных
и человека. – М.: Высш. шк., 1960.
Бедняков Д. А. Модификационное регулирование уровня активности некоторых пищеварительных ферментов у рыб: Автореф. дис. … канд. биол. наук. –
Астрахань: Астрахан. гос. техн. ун-т, 2004. – 24 с.
Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: Пер. с англ. – М.: Мир, 1982. – Т. 1–3.
Плакунов В. К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2001.
Балаховский И. С. В кн.: Лабораторные методы исследования в клинике / Под
ред. В. В. Меньшикова. – М.: Медицина, 1987. – С. 230–234.
Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Биохимия. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. – М.: Высш. шк., 1988.
Закс Л. Статистическое оценивание. – М.: Статистика, 1976.
Лакин Г. Ф. Биометрия. – М.: Высш. шк., 1990.
Уголев А. М., Иезуитова Н. Н., Цветкова В. А. Эволюционная физиология
пищеварения // Руководство по физиологии. Эволюционная физиология / Под
ред. Е. М. Крепса. – Л.: Наука, 1983.
Уголев А. М., Кузьмина В. В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. –
С.-Пб.: Гидрометеоиздат, 1993.
Кузьмина В. В. Физиологические адаптации (на примере процесса экзотрофии
у рыб) // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. – 2001. – 37, № 3. – С. 113–121.
РЫБНОЕ ХОЗЯЙСТВО
21. Monod J., Changeux J. P., Jocob F. Allosteric proteins and cellular control systems //
J. Mol. Biol. – 1963. – Vol. 6. – P. 306–329.
22. Monod J., Wyman J., Changeux J. P. On the nature of allosteric transition // J. Mol.
Biol. – 1965. – Vol. 12. – P. 85–118.
23. Уголев А. М. Мембранное пищеварение и процессы усвоения пищи в мире
животных // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. – 1972. – Т. 8, № 3. –
С. 269–278.
24. Калоус В., Павличек З. Биофизическая химия / Пер. с чешск. – М.: Мир, 1985.
Получено 1.04.05
INTERACTION OF METAL IONS WITH MEMBRANE-BOUND ENZYMES
OF INTESTINE MUSCOUS MEMBRANE
OF FAM. FISH ACIPENSERIDAE AND CYPRINIDAE
A. N. Nevalyonny, D. A. Bednyakov
Ion influence of Mn, Fe(II), Co, Ni, Cu and Zn on the level
of activity of phosphataze, maltase and total proteinaze of intestine
muscous membrane of stellate sturgeon, carp and crucian is considered here. Existence of interspecies features on the level of response reaction of digestive enzymes at the presence of metal ions
in incubation medium is exhibited by the representatives of fam.
Acipenseridae and Cyprinidae. There is supposition that catalytic
and regulator enzyme centres of sturgeon and carp have essential
differences. Dependence of response reaction of alkaline phosphataze of intestine muscous membrane of fish or metal position in
incubation solution, in the D. I. Mendeleyev table of chemical elements is shown here.
97