Динамика активности антиоксидантных ферментов в органах

Известия Тульского государственного университета
Естественные науки. 2012. Вып. 2. С. 285–291
Биология
УДК 581.17: 581.19: 581.52
Динамика активности антиоксидантных
ферментов в органах ×Triticosecale
на фоне NaCl-засоления
Н. Н. Жуков, А. Р. Гарифзянов, В. В. Иванищев
Аннотация. Исследована динамика активности аскорбатпероксидазы, гваяколовой пероксидазы и каталазы в органах тритикале
в присутствии хлорида натрия в среде в течение 12–96 часов
эксперимента. Установлено, что главную роль в ликвидации
возрастающего количества пероксида водорода в проростках
тритикале играет каталаза.
Ключевые слова: тритикале озимое, хлоридное засоление,
пероксидаза, каталаза, аскорбатпероксидаза, окислительный стресс.
Введение
Изучение механизмов защитных реакций растений при засолении
является актуальной проблемой современной физиологии растений,
поскольку количество засоленных почв увеличивается с каждым годом
вследствие искусственного орошения полей. В этом аспекте выявление
растений с повышенной устойчивостью к данному фактору представляет
собой одну из важных задач практики сельского хозяйства [11].
Негативное влияние засоления на рост и развитие растений имеет две
основные составляющие: дефицит влаги в результате осмотического стресса
и токсическое действие избытка ионов солей, особенно ионов Na+ , вследствие
нарушения ионного гомеостаза [4]. Высокие концентрации солей в почве
ингибируют ростовые процессы молодых растений, снижают активность
многих важных физиологических реакций, что в конечном итоге приводит
к преждевременному старению и гибели взрослых растений [3].
Постоянное образование АФК в клетках в ходе реализации
физиологических процессов даже при нормальных условиях развития
растений, вызывает необходимость функционирования систем антиоксидантной защиты, осуществляющих контроль уровня свободных радикалов [1].
Повышенная концентрация NaCl вызывает явление окислительного стресса,
сопряженного с избыточной генерацией активных форм кислорода (АФК), и
является одной из ранних ответных реакций растения на действие засоления,
286
Н. Н. Жуков, А. Р. Гарифзянов, В. В. Иванищев
так же как и на действие других повреждающих факторов [2]. У высших
растений важную роль в процессах снижения негативного влияния АФК
играет ферментативная антиоксидантная система. К ферментам растений,
нейтрализующих АФК, относят каталазу (КАТ), супероксиддисмутазу
(СОД), аскорбатпероксидазу (АПО) и другие пероксидазы (ПО). Во многих
исследованиях была обнаружена корреляция между устойчивостью к
стрессам и уровнем активности антиокислительных систем [1].
Однако до сих пор очень мало исследований, в которых была бы
проведена сравнительная оценка активности сразу нескольких ферментов,
обеспечивающих защиту растения от наиболее долгоживущей активной
формы кислорода — перекиси водорода. В связи с этим целью данной
работы являлось исследование динамики активности некоторых ферментов
антиоксидантной системы тритикале озимого, участвующих в детоксикации
пероксида водорода, в условиях повышенной концентрации хлорида натрия
в среде.
Методика
Растительный материал и условия выращивания. Объектами
исследования являлись побеги и корни тритикале озимого (×Triticosecale
Wittm. & Camus) сорта Дон. Семена стерилизовали в 2,5%-ном растворе
KMnO4 , промывали водой и проращивали на фильтровальной бумаге
в присутствии 1/10 среды Кнопа с микроэлементами по Хогланду.
Десятидневные проростки пересаживали в вегетационные сосуды и
выращивали в аэрируемой водной культуре на полной питательной среде.
Растения выращивали при 12-часовом световом периоде, температуре
воздуха 23 ± 1/15 ± 1◦ С (день/ночь), относительной влажности воздуха —
55/75% (день/ночь) и освещенности 35 Вт/м2 . При достижении проростками
фазы кущения, их пересаживали на питательный раствор, содержавший 120
мМ NaCl. Побеги и корни после 12, 24, 48, 72 и 96 ч экспозиции на растворе
NaCl использовали для приготовления экстрактов [9].
Активность гваяколовой пероксидазы и каталазы определяли
в Na/K-фосфатно-буферных экстрактах (pH 6,7-6,8): гваяколовой
пероксидазы (ПО) — спектрофотометрическим методом при 430 нм
на спектрофотометре СФ-26 (Россия) по количеству образующегося
пурпурогаллина (ε = 2, 47/(мМ*см)); каталазы (КАТ) — манометрическим
методом с использованием модифицированного аппарата Варбурга по
количеству выделившегося кислорода [6]. Активность аскорбатпероксидазы
(АПО) определяли в цитратно/фосфатно-буферном экстракте (pH 6,0) по
количеству окисленной аскорбиновой кислоты [7].
Каждый опыт проводили в трех биологических по три аналитические
повторности. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью
пакета прикладных компьютерных программ MS Excel 2003 и SigmaStat 3.1.
Динамика активности антиоксидантных ферментов
287
Результаты и обсуждение
Проведенное исследование показало, что величины активности
аскорбатпероксидазы в побегах и корнях в начале эксперимента были
близкими (рис.1).
Рис. 1. Динамика активности аскорбатпероксидазы в органах тритикале
В течение первых 12 часов экспозиции на NaCl-содержащей среде
активность фермента в побегах повышалась в 1,4 раза. Далее она снижалась
в 2,5 раза от достигнутого максимума, составляя величину в 57% от
исходного значения, и оставалась на данном уровне до 48 часов. После
этого активность АПО увеличивалась, достигая к концу эксперимента
максимальной величины.
В корнях наблюдали гораздо меньшую вариацию исследуемого
показателя. В первые 12 часов увеличение активности фермента
составляло только в 1,4 раза. Далее к 24 часам происходило снижение до
первоначального уровня с постепенным увеличением активности фермента
к 96 часам эксперимента до максимального значения, равного 0,405
мкмоль/мин·г.
Конститутивный уровень пероксидазы в корнях был в 2,4 раза выше, чем
в побегах (рис.2).
В течение первых 2-х суток в побегах (до 48 часов) наблюдали более
чем двукратное снижение активности фермента, после чего активность
несколько возрастала, однако, не достигая при этом первоначальной
величины.
В корневой системе происходило резкое (примерно шестикратное)
снижение активности гваяколовой пероксидазы в первые 12 часов
эксперимента с последующим плавным снижением до 72 часов и увеличением
к 96 часам проведения опыта до уровня 1, 54 ± 0, 25 мкмоль/мин·г сырой
массы.
288
Н. Н. Жуков, А. Р. Гарифзянов, В. В. Иванищев
Рис. 2. Динамика активности гваяколовой пероксидазы в органах
тритикале
Исходная активность каталазы в побегах тритикале была значительно
выше, чем в корнях, и различилась в 5,4 раза (рис.3).
Рис. 3. Динамика активности каталазы в органах тритикале
Такую картину наблюдали на протяжении всего эксперимента. Анализ
динамики активности показал, что в течение 24 часов засоления происходило
3-х кратное повышение активности фермента в побегах с его последующим
снижением вплоть до 72 часов эксперимента до величины, равной 69, 6 ± 1, 7
мкмоль O2 /мин·г. После этого наблюдали увеличение показателя до уровня,
соответствующего 48 часам эксперимента.
В корнях наблюдали 7-кратное увеличение активности каталазы к 12
ч эксперимента. Далее к 48 часам происходило резкое падение активности
(до 11, 2 ± 3, 0 мкмоль O2 /мин·г), чуть превышая значения контроля, с еще
большим снижением к 72 и 96 часам до уровня в 7, 2 ± 1, 0 мкмоль O2 /мин·г.
Анализ показателей активности ферментов в начале эксперимента
показывает, что аскорбатпероксидаза действует на примерно одинаковым
уровне в тканях корневой системы и проростка. Это предполагает
возможность активного переноса по организму растения аскорбата,
образующегося из продуктов фотосинтеза. При этом увеличение
активности фермента в первые 12 ч эксперимента можно объяснить
Динамика активности антиоксидантных ферментов
289
возрастанием содержания пероксида водорода [2]. Дальнейшее накопление
пероксида к 24 ч сопровождалось наблюдавшимся снижением активности
аскорбатпероксидазы (рис.1). Это говорит об истощении конститутивного
пула фермента, процесс восстановления которого занимает достаточно
долгое время (более двух суток). Активация этого процесса, возможно,
обусловлена отчасти поддержанием высоких концентраций пероксида
водорода [2], для которого известна сигнальная функция. В то же время в
корнях изменения в активности были невелики, возможно, из-за присутствия
там более стабильного изофермента аскорбатпероксидазы.
В связи с этим, кажется, вопреки точке зрения о ключевой роли
АПО в ликвидации пероксида водорода [10], в данном случае такая
роль отведена каталазе, кривая динамики активности которой (рис.3)
практически повторяет таковую для содержания пероксида водорода [2].
Да и величина активности этого фермента на два порядка превышает
активность АПО. Существенное падение активности каталазы в корневой
системе свидетельствует об истощении пула фермента и невозможности
его синтеза там в наблюдаемый период эксперимента, в результате чего
содержание пероксида водорода в корнях не снижается.
Гваяколовой пероксидазе отводится небольшая роль в нейтрализации
пероксида водорода в первые часы эксперимента, после чего в течение
наблюдаемого периода времени ее активность оставалась на минимальном
уровне (рис.2). Поэтому можно предполагать, что пероксид водорода в этих
условиях NaCl-засоления не играет сигнальной роли в стимуляции синтеза
этого фермента.
Таким образом, полученные результаты предполагают, что ведущая
роль в нейтрализации пероксида водорода в органах тритикале озимого
отведена каталазе в первые несколько дней воздействия хлорида натрия.
После 48 ч в систему защиты включаются новые порции (или изоферменты)
аскорбатпероксидазы. Однако относительная активность последнего
фермента даже после синтеза его новых порций остается существенно
более низкой, что может говорить только о существенности локального
функционирования аскорбатпероксидазы для нейтрализации пероксида
водорода в отдельном(ых) компартменте(ах).
Список литературы
1. Колупаев Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии
стрессоров: образование и возможные функции // Вестник Харьковского
национального аграрного университета. Сер. Биология. 2007. Вып.3(12). С.6–26.
2. Особенности NaCl-индуцированного окислительного стресса и динамики
активности антиоксидантных ферментов в органах тритикале озимого / А.Р.
Гарифзянов [и др.] // Докл. Российской академии сельскохозяйственных наук.
2012. №2. C.9–11.
3. Munns R., Tester M. Mechanisms of salinity tolerance // Ann. Rev. Plant Biology.
2008. V.59, №1. P.651–681.
290
Н. Н. Жуков, А. Р. Гарифзянов, В. В. Иванищев
4. Dajic Z. Salt Stress // Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in
Plants / Eds Madhava Rao K.V., Raghavendra A.S., Janardhan Reddy K. Dordrecht: Springer-Verlag, 2006. P.41–101.
5. Ху Ю.Ф., Лиу Ж.П. Ферменты антиоксидантной защиты и физиологические
характеристики двух сортов топинамбура при солевом стрессе // Физиология
растений. 2008. Т.55. С.863–868.
6. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по
физиологии растений. М.: Высшая школа, 1975. С.280–310.
7. Чупахина Г.Н. Физиологические и биохимические методы анализа растений.
Калининград: Изд-во Калинин. гос. универ., 2000. 59 с.
8. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and
Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum
tuberosum L.) Seed-Tubers // Plant Physiol. 1993. V.102. P.115–124.
9. Гарифзянов А.Р., Жуков Н.Н., Пантюхин Ю.О. NaCl-индуцированное
изменение активности антиоксидантных ферментов ×Triticosecale // Проблемы
современной биологии: матер. III Международной научно-практической
конференции (19.01.2012). М.: Спутник+, 2012. C.26–33.
10. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. М.: Изд-во
КДУ, 2007. 140 с.
11. Кошкин Е.И. Физиология устойчивости сельскохозяйственных культур. М.:
Дрофа, 2010. С. 328–335.
Жуков Николай Николаевич (z.nikolay87@mail.ru), аспирант, кафедра
ботаники и технологии растениеводства, Тульский государственный
педагогический университет им. Л. Н. Толстого.
Гарифзянов Андрей Рузильевич (Garifzyanov86@yandex.ru), к.б.н.,
старший преподаватель, кафедра органической и биологической химии,
Тульский государственный педагогический университет им. Л. Н. Толстого.
Иванищев Виктор Васильевич (avdey_VV@mail.ru), д.б.н., зав.
кафедрой, кафедра ботаники и технологии растениеводства, Тульский
государственный педагогический университет им. Л. Н. Толстого.
Anti-oxidative enzymes dynamics in ×Triticosecale organs at
NaСl-salinization
N. N. Zhukov, A. R. Garyfzyanov, V. V. Ivanishchev
Abstract. It has been studied the dynamics of ascorbic peroxidase, guayacol
peroxidase and katalase activities in triticale organs in the presence of sodium
chloride in a mixture during 12–96 hs of experiment. It was established that the
Динамика активности антиоксидантных ферментов
291
main utilization of higher quantity of hydrogen peroxide in triticale seedlings has
been caused with katalase.
Keywords: winter triticale, chloride salinity, peroxidase, katalase, ascorbic
peroxidase, oxidizing stress.
Zhukov Nikolay (z.nikolay87@mail.ru), postgraduate student, department of
botany and technology of crop production, Leo Tolstoy Tula State Pedagogical
University.
Garifzyanov Andrei (Garifzyanov86@yandex.ru), candidate of biological sciences, senior lecturer, department of organic and biological chemistry, Leo Tolstoy
Tula State Pedagogical University.
Ivanishchev Victor (avdey_VV@mail.ru), doctor of biological sciences, head
of department, department of botany and technology of crop production, Leo
Tolstoy Tula State Pedagogical University.
Поступила 15.06.2012