пектина смолевки обыкновенной Silene Vulgaris

II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ,
Казань, 24–27 июня 2002 г
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА СИЛЕНАНА - ПЕКТИНА СМОЛЕВКИ
ОБЫКНОВЕННОЙ SILENE VULGARIS (MOENCH) GARKE
О.А.Бушнева∗, Р.Г.Оводова
Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, bushneva@physiol.komisc.ru
Проведено исследование общих закономерностей построения углеводных цепей и элементов тонкой
химической структуры пектинового полисахарида силенана SV, мол. масса MsD = 22 кДа, [α]D20 +148.6° (c
0.1; H2O), выделенного из нетрадиционного растительного источника - смолевки обыкновенной Silene
vulgaris (Moench) Garke [1]. Ранее было установлено проявление силенаном иммуномодулирующей
активности [2].
Для исследования силенана, являющегося нерегулярным полисахаридом, использованы современные
методы и подходы структурной химии углеводов. Строение силенана изучено с помощью спектроскопии
ЯМР 13С и 1Н фрагментов расщепления по Смиту исходного силенана и остатка его ферментативного
гидролиза с помощью пектиназы, а также с использованием метилирования фрагмента литий-деградации
силенана. При установлении частичной структуры разветвленной области силенана впервые применена
двумерная спектроскопия COSY, TOCSY, ROESY, HSQC.
Аналогично многим известным пектиновым полисахаридам [3], силенан SV имеет блочный характер
построения углеводной цепи. В основе его макромолекулы находится линейная цепь, состоящая из
фрагментов галактуронана и рамногалактуронана. Результаты частичного кислотного гидролиза силенана и
данные спектроскопии ЯМР точно указывают на то, что α-1,4-D-галактопиранозилуронан является кором
неразветвленной области, занимающей главную часть макромолекулы данного пектина [1]. Образование
значительных количеств D-галактуроновой кислоты при ферментативном гидролизе силенана с помощью
пектиназы также подтверждает, что в данном пектиновом полисахариде присутствуют участки α-1,4-Dгалактопиранозилуронана, не имеющие боковых связей. При этом часть остатков галактуроновой кислоты
линейной области имеет сложноэфирные метильные группы [1]. Кроме того, анализ с помощью спектроскопии ЯМР продукта предварительного омыления и ферментативного гидролиза (фрагмент SVPP) подтверждает наличие в силенане также области линейного рамногалактуронана, главная цепь которого образована
отдельными участками галактуронана, связанными между собой остатками 2-О-гликозированной рамнопиранозы.
На основании результатов ферментативного гидролиза, распада по Смиту и литий-деградации в
сочетании с данными спектроскопии ЯМР показано, что в силенане присутствуют блоки разветвленной
области, представленные рамногалактуронаном I. Кор разветвленных областей силенана состоит из остатков
α-1,4-D-галактопиранозилуроновой кислоты и α-рамнопиранозы, 2-О-гликозилированной остатками α-Dгалактопиранозилуроновой кислоты. Установлено, что некоторые остатки рамнопиранозы, имея замещение
по 4-положению, соответственно являются точками разветвления главной углеводной цепи силенана.
При ферментативном гидролизе силенана SV пектиназой получен гомогенный полисахаридный
фрагмент SVP, [α]D20 +54.5° (с 0.1; вода), 44 % остатков D-галактуроновой кислоты, 3.1 % метоксильных
групп. В результате дополнительного ферментативного гидролиза фрагмента SVP с помощью пектиназы
после предварительного омыления с помощью 0.5 М NaOH получен гомогенный полисахаридный фрагмент
SVPP, [α]D20 +49.2° (с 0.1; вода), 37 % остатков D-галактуроновой кислоты, не содержащий метоксильных
групп. Фрагмент SVPP характеризуется значительно более высоким содержанием нейтральных моносахаридных остатков по сравнению с фрагментом SVP и содержит особенно большое число остатков рамнозы
(до 16 %), галактозы (22-26 %) и арабинозы (12 %). Анализ моносахаридного состава позволяет предположить, что устойчивые к действию пектиназы фрагменты SVP и SVРР углеводной цепи силенана SV
представляют собой участки разветвленной области RG-I.
Детальный анализ спектров ЯМР 13С [4], COSY, TOCSY, ROESY и HSQC фрагмента SVP позволил
обнаружить терминальные, β-1,3- и β-1,4- связанные остатки галактопиранозы. В спектре ROESY фрагмента
SVРР найдены корреляционные пики атомов β-Galp, указывающие на наличие дисахаридного фрагмента β1,3-связанных остатков галактопиранозы. Химические сдвиги сигналов атомов арабинофуранозы в спектрах
ЯМР 13С и 1Н/13С HSQC фрагмента SVP указывают на присутствие в силенане α-1,5-связанных остатков
арабинофуранозы. В спектрах ЯМР фрагментa SVPP в отличие от фрагмента SVP отсутствуют сигналы
остатков α-1,5-связанной арабинофуранозы и наблюдаются лишь слабые сигналы остатков β-1,4-связанной
галактопиранозы. Возможно, что блоки углеводных цепей, состоящих из остатков β-1,4-связанной галактопиранозы и α-1,5-связанной арабинофуранозы, являются более низкомолекулярными по сравнению с углеводными цепями, состоящими из остатков β-1,3-связанной галактопиранозы. Таким образом, ферментатив––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ. Устный доклад
94
II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ,
Казань, 24–27 июня 2002 г
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
ная деградация силенана свидетельствует о том, что в его в состав входят разветвленные области – макромолекулы, содержащие α-1,5-арабинофуранан, β-1,3- и β-1,4-галактопирананы. На терминальных концах этих
блоков, вероятно, находятся остатки α-арабинофуранозы. В результате деградации по Смиту фракций силенана SV и SVP происходит существенное изменение количественного и качественного моносахаридного
состава пектина и образуются соответствующие гомогенные фрагменты SVS, [α]D20 +29.5° (с 0.37; вода), и
SVPS, [α]D20 + 35.6° (с 0.62; вода). Основными компонентами их углеводной цепи являются остатки галактуроновой кислоты (24-28 %), галактозы (31-36 %), арабинозы (13-17 %) и рамнозы (5-6 %). В спектре ЯМР
1
Н/13С HSQC фрагмента SVPS обнаружены остатки терминальной β-галактопиранозы, 3-замещенной и 2,3замещенной β-галактопиранозы, 2-замещенной и терминальной α-арабинофуранозы. Из спектра ROESY
также следует, что часть терминальных остатков β-D-галактопиранозы гликозилирует по третьему положению незамещенные остатки β-галактопиранозы; терминальный остаток арабинофуранозы гликозирует 2,3замещенный остаток β-галактопиранозы во второе положение, в свою очередь, в 3-положение этот остаток
замещен остатком β-галактопиранозы. Возможно, что к терминальным остаткам α-арабинофуранозы и βгалактопиранозы продуктов распада силенана по Смиту присоединяются в исходной макромолекуле линейные углеводные цепи, которые подвергаются разрушению при периодатном окислении. В результате обработки фрагмента SVP литием в этилендиамине с последующим фракционированием с помощью гельфильтрации на биогеле Р-4 получен гомогенный фрагмент SVPL, [α]D20 + 25.3° (с 0.06; вода), 15 % D-галактуроновой кислоты. Остатки нейтральных моносахаридов остаются устойчивыми к литий-деградации (31 % арабинозы, 30 % галактозы). Следует отметить заметный рост содержания остатков рамнозы (22 %). Результаты
анализа фрагмента SVPL с помощью метода метилирования с последующей хромато-масс-спектрометрией
(ГЖХ-МС) гидролизата сполна метилированного SVPL в виде соответствующих ацетатов полиолов находятся в соответствии с ранее полученными данными о строении боковых цепей силенана и свидетельствуют
о том, что в состав углеводной цепи фрагмента SVPL входят остатки терминальной и 5-замещенной арабинофуранозы, терминальной и 4-замещенной галактопиранозы. Кроме того, найдены 3,5- и 2,5-замещенные
остатки арабинофуранозы.
Таким образом, полученные данные указывают на то, что боковые цепи разветвленных областей силенана представляют собой главным образом различные блоки, содержащие α-1,5-арабинофуранан, а также
β-1,3- и β-1,4-галактопирананы. Линейные цепи β-1,3-галактопиранозы связаны с остатками α-арабинофуранозы и β-галактопиранозы в точках разветвления, представленных остатками 2,3-замещенной β-галактопиранозы и, вероятно, 2,5-замещенной α-арабинофуранозы. На терминальных концах этих блоков, скорее
всего, находятся остатки α-арабинофуранозы. Результаты проведенного исследования позволяют сделать
заключение о том, что новый пектин - силенан из смолевки обыкновенной, имея с известными пектинами
общий характер построения главной углеводной цепи, в то же время существенно отличается своеобразием
структуры боковых цепей разветвленной области макромолекулы. Выясненные особенности строения макромолекулы силенана открывают широкие возможности дальнейшего изучения на молекулярном уровне
механизма физиологической активности пектинов и ее зависимости от химической структуры этих сложнейших биополимеров.
Работа поддержана грантами РФФИ (гранты №. 00-04-48063, 01-04-96437) и «Минпромнауки РФ»
(грант №. 02-4208). Авторы выражают благодарность д.х.н. А.С.Шашкову (ИОХ им. Н.Д.Зелинского, РАН)
за съемку и помощь в расшифровке ЯМР-спектров и А.О.Чижову (ИОХ им. Н.Д.Зелинского, РАН) за съемку
и помощь в расшифровке хромато-масс-спектров.
Список литературы
1. О.А.Бушнева, Р.Г.Оводова, А.С.Шашков, Ю.С.Оводов. Выделение и предварительное исследование
строения полисахаридов из смолевки обыкновенной Silene vulgaris. // Биоорг. Хим. 2000. Т. 26. №. 9. С.
686-692.
2. S.V.Popov, R.G.Ovodova, O.A.Bushneva, E.A.Micharina. Characterization of chemical composition and
phagocytic activity of Silene vulgaris bioglicans. // Intern. GlycoBio Technol. Symposium 98. Braunshweig.
1998. P. 43.
3. Ю.С.Оводов Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность. // Биоорг.
химия. 1998. Т. 24. №. 7. С. 483-501.
4. R.Pressey, D.S.Himmelsbach. 13C NMR spectrum of a galactose-rich polysaccharide from tomato fruit. // Carbohydr. Res. 1984. V. 127. P. 356-359.
II Всероссийская конференция Химия и технология растительных веществ. Устный доклад
95