Лекция 11. Инициация полипептидных цепей

Лекция 11. Инициация полипептидных цепей
Исследования механизмов проявления генов, участвующих в синтезе
ферментов обмена лактозы, привело Жакоба и Моно в 1961 г. к постулату о
координированной
транскрипции генов лактозного оперона. Эти работы
оказали огромное влияние на развитие молекулярной биологии. В
интересующей нас области они поставили проблему уровня на котором
находятся “знаки препинания”, обеспечивающие фенотипическую реализацию каждого из смежных генов в виде отдельной полипептидной цепи.
Вскоре последовало открытие информационных (матричных) РНК, а затем
генетические и биохимические исследования показали, что в большинстве
случаев каждая мРНК определяет несколько полипептидных цепей,
соответствующих структурным генам одного оперона.
В 1964 г. появились сообщения о двух очень важных фактах, которые и
привели к открытию роли одной из тРНК как инициатора полипептидных
цепей. Первый из этих фактов, установленный Маркером и Сенгером,
состоял в том, что у E.coli, наряду с обычной тРНКМет существует еще особая
тРНК – тРНКф. Метионин, этерифицированный этой тРНКф, становился в
присутствии специфического фермента акцептором формиль-ной группы,
переносимой с формилтетрагидрофолата (фТГФ). Второй факт, открытый
Валлером, выяснился при
анализе N -концевых участков белков E. coli.
Оказалось, что препарат суммарных белков содержит в этих участках 45%
метионина, 30% аланина, 15% серина и только 10% других амино-кислот.
Зная эти результаты, Адамс и Копеки исследовали роль формилметионил –
тРНКф как инициатора. Они использовали рибосомную систему E.coli, и
РНК бактериофага R17; в соответствующих условиях на этой РНК
синтезировался капсидный белок фага - белок, о котором уже имелось
много сведений. В частности, было известно, что это белок с небольшим
молекулярным весом, что он не содержит гистидина и имеет N-концевую
последовательность аминокислот Ала-Сер-Асп-Фен-Тре. Когда систему
инкубировали с 3Н-фТГФ – донором формильных групп, образующийся
белковый материал содержал формильную группу. При центрифугировании
инкубационной смеси в градиенте сахарозы были получены результаты, где
было показано, что часть радиоактивности, происходящей из формильной
группы, оказалась связанной с функционирующими 70S -рибосомами, а
другая значительная часть находилась в легкой фракции (4S и менее),
содержавшей
вещества.
3
Н-фМет-тРНК,
Третья
фракция
3
Н-фТГФ
и
другие
радиоактивного
низкомолекулярные
материала
обладала
коэффициентом седиментации 30S и плечом в зоне 20S. Этот 30S материал,
хотя он и совпадает по своему распределению с 30S -субчастицами рибосом,
на самом деле соответствует РНК фага R17, имеющей тот же коэффициент
седиментации. Было показано, что радиоактивность, находящаяся в области
30S, принадлежит белку фаговой оболочки, который ассоциирован с РНК.
Плечо 20S соответствовало материалу, содержавшему другой белок,
кодируемый фаговой РНК.
Эти результаты, а также наблюдения Валлера позволяли предполагать, что
синтез всех белков E.coli начинается с формилметионина, за которым всегда
следует аланин, а затем серин, и только с четвертой аминокислоты белки
начинают отличаться друг от друга. Тот факт, что обычно в N -концевом
положении находят 45% метионина, 30% аланина и 15% серина, мог бы
указывать на то, что после синтеза полипептидных цепей специфические
ферменты отщепляют с N -конца либо одну формильную группу, либо ее и
метионин.
В опытах in vitro было показано, что белковый синтез на РНК фага f 2
зависит от присутствия фМет-тРНК. В этих опытах, клетки E.coli лишили
фМет-тРНК
и донора формильных групп
фТГФ, блокировав синтез
предшественника- тетрагидрофолата – путем добавления триметоприма,
ингибитора
дигидрофолатредуктазы.
В
экстрактах
из
таких
клеток
включение аминокислот в полипептиды в присутствии РНК фага f 2
происходило только при добавлении фМет-тРНК или же фТГФ (который
делает возможным синтез фМет-тРНК). Другие эксперименты показали, что
in vivo ингибирование биосинтеза белков
E.coli триметопримом тоже
обусловлено тем, что это вещество препятствует инициации полипептидных
цепей. Гидроксиламин в концентрациях 10-4
- 10-5 М, также ингибирует
синтез белков in vivo. В опытах in vitro было показано, что его тормозящее
действие локализуется на уровне фТГФ. Реагируя с активированными
формильными группами, гидроксиламин создает нехватку донора этих групп
и подавляет таким образом формилирование Мет-тРНКф.
Присутствие в клетке двух типов РНК, способных этерифицировать
метионин, ставит проблему узнавания каждой из этих тРНК специфическими
кодонами. С помощью фильтрации на нитроцеллюлозных дисках было
доказано, что
фМет-тРНКф
в присутствии рибосом реагирует с двумя
кодонами АУГ и ГУГ, а Мет-тРНКм –только с одним кодоном АУГ. В опытах
с синтетическими матрицами, начинавшимися с 5/-конца триплетом АУГ, за
которым следовало более или менее длинное повторение одного и того же
нуклеотида, было показано, что в присутствии смеси фМет-тРНКф и МеттРНКм в N -концевом положении образующихся полипептидных цепей
находится только
можно
формилметионин. Из совокупности этих результатов
заключить,
что
кодон
АУГ,
расположенный
на
5/-конце,
соответствующем N -концу полипептидной цепи, всегда взаимодействует с
фМет-тРНК,
а тот же кодон, локализованный в другом участке мРНК всегда
реагирует с Мет-тРНКм –донором метионина для внутренних и С-концевых
аминокислот полипептидных цепей.
Мы не знаем, что означает взаимодействие триплета ГУГ с фМет-тРНКф
наблюдаемое in vitro. Этот триплет соответствует одной из изоакцепторных
тРНКВал и, видимо, не служит сигналом инициации in vivo. В бесклеточных
экстрактах, где при отсутствии экзогенной матрицы полипептидный синтез
происходит
на
эндогенных
матрицах,
формилметионина на 150 аминокислот.
включался
один
остаток
Только
фМет-тРНКф,
но не Мет-тРНКм узнает два синтетических
тринуклеотида АУГ и ГУГ, хотя обе эти тРНК имеют в антикодоне один и
тот же нуклеотид (У), соответствующий первому основанию А и Г в кодонах.
Это показывает, что вторичная структура двух тРНК в районе антикодона не
идентична. Вероятно, на нее влияют модифицированные основания, которые
находятся в антикодоновых петлях этих тРНК в разных положениях.
Примечательно также, что в случае инициирующего кодона существует
неоднозначность спаривания (“люфт”) в первой позиции кодона, тогда как в
случае всех других транслируемых кодонов этот люфт возможен только в
третьей позиции.