РОЛЬ ДИСУЛЬФИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РЕГУЛЯЦИИ

Международный Научный Институт "Educatio" III (10), 2015
119
Таким образом, на основании полученных результатов установили, что удельная активность пероксидаз
хвои сосны, собранных на Мухинке выше, чем в образцах
полученных с территории космодрома «Восточный», выявлено пять множественных форм пероксидаз хвои сосны.
В образцах хвои сосны, собранных у стартового комплекса число множественных форм пероксидаз выше, а
удельная активность фермента ниже, чем у дороги на
подъезде к космодрому. Пероксидазный тест можно использовать для мониторинга окружающей среды.
Список литературы
1. Андреева, В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений / В.А. Андреева. – М.:
Наука, 1988. – 302 с.
2. Ермак, Е.В. Изменение изоферментных спектров
оксидоредуктаз сеянцев под влиянием хрома / Е.В.
Ермак, С.Ф. Негруцкий // Лесной журнал, № 6. –
1987. – С. 84-90.
3. Иваченко, Л.Е. Активность и множественные
формы ферментов в семенах сои, полученных в раз-
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ных агроклиматических условиях Амурской области. / Л.Е. Иваченко, В.И. Шаройко, Г.П. Ефимова
// сб. научн. тр. «Проблемы экологии верхнего Приамурья». – Благовещенск: Изд-во БГПУ, 1997. – выпуск 3. – С. 104 - 108.
4. Мелихова, О.П. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирования / О.П.
Мелихова [и др.]. – М.: Издательский центр «Академия», 2007. – 288с.
5. Ушакова, В.Г. Основные тенденции развития демографической ситуации в горном Алтае / В.Г. Ушакова // Сборник материалов международной
научно-практической конференции, 26-29 ноября
2012 г. – М.: Изд-во МГОУ, 2012. – С. 82-84.
6. Ушакова, В.Г. К вопросу о химических превращениях техногенных токсичных загрязнителей в окружающей среде / В.Г. Ушакова // Сборник материалов международной научно-практической конференции, 26-29 ноября 2012 г. – М.: Изд-во МГОУ,
2012. – С. 84-86.
РОЛЬ ДИСУЛЬФИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ
ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗЫ ЭРИТРОЦИТОВ
Агафонова Ольга Алексеевна
старший преподаватель Северо-Западного медицинского университета им. И.И.Мечникова, Санкт-Петербург
Голованова Наталья Эриковна
канд. биол. наук, доцент Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург
ROLE OF DISULFIDES IN THE REGULATION OF THE ACTIVITY OF GLUTATHIONE S-TRANSFERASE IN
ERYTHROCYTES
Agafonova Olga, Assistant professor, North-Western State Medical University named after I.I.Mechnikov, Saint-Petersburg
Golovanova Natalia, Candidate of Science, associate professor, Saint-Petersburg State University, Saint-Petersburg
АННОТАЦИЯ
Цель работы - исследование влияния α-липоевой кислоты, дигексилдисульфида, фармакопейного препарата этилендиаминовой соли α-липоевой кислоты на активность глутатионтрансферазы (ГТ) эритроцитов крыс и донорской крови в экспериментах in vitro. Показано дозозависимое снижение активности фермента при действии всех исследованных дисульфидов. Наиболее выраженное снижение активности наблюдалось при действии дигексилдисульфида. Умеренно выраженное снижение активности ГТ при действии α-липоевой кислоты и ее фармакопейного препарата может быть выгодно клетке для сохранения высокого уровня, восстановленного глутатиона, необходимого для
работы антиоксидантной системы.
ABSTRACT
This article presents the results of the effect of α-lipoic acid, dihexyl disulfide and a pharmaceutical drug –
ethylenediamine salt of α-lipoic acid on the glutathione-S-transferase activity of rat erythrocytes and blood-donors in vitro. The
enzyme activity is reduced by the action of the studied disulfides. Dihexyl disulfide most significantly reduces the activity of the
enzyme. It's an exogenous toxin. α-Lipoic acid and its pharmaceutical drug moderately decrease the activity of glutathione-Stransferase. Such a reduction in red blood cells may be useful to maintain a high level of reduced glutathione, which is required
for the antioxidant system.
Ключевые слова: глутатионтрансфераза, дисульфиды, α-липоевая кислота, антиоксидантная система.
Key words: glutathione-S-transferase, disulfides, α-lipoic acid, antioxidant system.
Основным звеном клеточного метаболизма являются окислительно-восстановительные реакции. Большой
вклад в окислительно-восстановительное состояние клеток вносит тиол-дисульфидный обмен. Тиол-дисульфидная система принимает участие в механизмах клеточной
регуляции и адаптации клетки к внешним воздействиям
[2, 7]. Изменение тиол-дисульфидного статуса клетки может негативно отразиться на ее функциональном состоянии. Активное участие в поддержании тиол-дисульфидного равновесия в клетке принимает глутатион, и система
глутатионзависимых ферментов. Одним из таких ферментов является глутатионтрансфераза (ГТ), которая исполь-
зует глутатион в качестве второго субстрата. Поэтому дисульфидные соединения могут выступать в качестве регуляторов активности ГТ.
Среди дисульфидных соединений существует большая группа молекул, необходимых для нормального метаболизма клетки, таких как α-липоевая кислота (ЛК), цистин, окситоцин, тиоредоксин и т.д. ЛК участвует в энергетическом обмене клетки в качестве простетической
группы ферментов, в системе расщепления глицина, обладает антиоксидантными свойствами, активно используется в качестве лекарственного препарата.
Международный Научный Институт "Educatio" III (10), 2015
120
С другой стороны, дисульфидные соединения являются ксенобиотиками, оказывающими токсическое действие на организм, например, дифенилдисульфид, дигексилдисульфид (ДГДС). Различные промышленные процессы приводят к загрязнениям окружающей среды меркаптанами и их дисульфидами, что создает серьезную
опасность для здоровья человека.
Цель работы: исследовать влияние отдельных дисульфидов на активность ГТ эритроцитов в экспериментах in vitro. ГТ широко представлена в тканях организма
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
человека и животных разными изоформами [5]. В эритроцитах содержится анионная изоформа ГТ.
Материалы и методы.
В эксперименте in vitro было исследовано влияние
ЛК (дисульфидная форма) (Sigma, Германия), ДГДС, фармакопейного препарата ЛК в виде этилендиаминовой соли
(раствор для внутривенного введения, «Берлитион 300»,
«Янагексал Фарма ГмбХ», Германия) (табл.1).
Название препарата
Дигексилдисульфид
α-Липоевая кислота
Структурные формулы исследованных соединений
Химическая формула
CH3-(CH2)5-S-S-(CH2)5-CH3
CH- CH2- CH-(CH2)4-COOH
SS
Этилендиаминовая соль αлипоевой кислоты
CH- CH2- CH-(CH2)4-CO-NH-CH2-CH2-NH2
SS
Таблица 1
Исследование проводили на гемолизате эритроцитов крыс линии Wistar, весом 200-220 грамм. Влияние
фармакопейного препарата также исследовали на эритроцитах периферической крови доноров. Возраст доноров –
20 лет. Получение эритроцитов из гепаринизированной
крови и приготовление гемолизата проводили по методу
Beutler E.[8]. Исследуемые концентрации веществ: ЛК –
1мМ, 3мМ, 5мМ, 7мМ; ДГДС – 0,075 мМ, 0,1 мМ, 0,15
мМ; этилендиаминовая соль ЛК- 3,6 мМ и 7,2 мМ. Инкубацию гемолизата с дисульфидами проводили при температуре 37º С в течение 15 мин. Инкубацию гемолизата
эритроцитов донорской крови с этилендиаминовой солью
ЛК проводили в течение 30 мин. Отбирали аликвоты из
инкубационной среды и вносили в реакционную смесь.
Определение активности ГТ эритроцитов проводили спектрофотометрическим методом [9]. Активность фермента
рассчитывали на концентрацию белка. Содержание белка
определяли стандартным спектрофотометрическим методом Лоури («Экосервис», РФ). Полученные данные обрабатывали с использованием пакета прикладных программ
Statistika 6.0. Статистически значимыми считались различия при р≤0,05.
Полученные результаты представлены в таблице 2.
В эксперименте на гемолизате крыс ЛК во всех исследованных концентрациях приводила к снижению активности ГТ. В концентрации 1мМ и 3мМ – достоверного
отличия не наблюдалось. Статистически достоверное снижение активности наблюдалось при концентрации 5 мМ и
7 мМ. ДГДС, который из-за своей токсичности использовался в низких дозах, также приводил к снижению активности ГТ. Степень снижения активности фермента зависела от дозы ДГДС. Фармакопейный препарат снижал активность фермента в равной степени при концентрации
3,6 мМ и 7,2 мМ. В эксперименте на гемолизате эритроцитов донорской крови было показано снижение активности
ГТ при концентрации 3,6мМ и 7,2мМ, более выраженное
- на концентрации 7,2мМ.
ДГДС обладает высокой гидрофобностью и наиболее трудно замещаемой гексилмеркаптогруппой, он демонстрирует наиболее выраженное подавляющее действие из изученных соединений. Снижение активности ГТ
в данном случае можно объяснить присоединением его в
область Н активного центра фермента, в которой происходит связывание гидрофобного субстрата. При этом может
происходить экранирование G области, присоединяющей
глутатион. ЛК способна быстро переходить в восстановленную форму, в том числе при участии глутатионредук-
Таблица 2
Активность ГТ эритроцитов при действии дисульфидных соединений, in vitro
Название препарата
Концентрация,
Активность ГТ, нмоль•мин/мг
мМ
Дигексилдисульфид,
контроль
4,5±0,18
n=10
0,075
3,5±0,15*
0,1
2,12±0,17*
0,15
2,02±0,2*
α-Липоевая кислота,
контроль
3,19±0,03
n=10
1,0
2,87±0,04
3,0
2,89±0,04
5,0
2,28±0,03*
7,0
2,39±0,04*
Этилендиаминовая соль
контроль
4,55±0,29
ЛК, n=6,
3,6
3,22±0,14*
эритроциты крыс
7,2
2,99±0,12*
Этилендиаминовая соль
контроль
3,6
ЛК, n=2,
3,6
0,98
эритроциты донорской
7,2
0,46
крови
* - достоверность различий средних при р≤0,05
Международный Научный Институт "Educatio" III (10), 2015
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
121
тазы [4]. Данный фермент активно работает в эритроцитах. Благодаря этому в структуре ЛК появляются две SHгруппы способные вступать в тиол-дисульфидные взаимодействия, в том числе с SH-группами цистеина активного
центра ГТ и глутатиона [1,6]. Таким образом, оба исследуемых вещества оказывают подавляющий эффект на активность фермента, но из-за разной способности к восстановлению различаются механизмами воздействия на ГТ, возможно поэтому у ЛК эффект проявляется в значительно
более высоких концентрациях, чем у ДГДС.
Воздействие фармакопейного препарата «Берлитион 300», представляющего собой этилендиаминовую
соль ЛК, коррелирует с результатами, полученными собственно для ЛК. Увеличение гидрофильности ЛК в данном препарате не повлияло на степень выраженности эффекта.
Как показано в клинических исследованиях [3,4],
повышение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы наиболее частый биохимический сдвиг, защищающий ткани от активных форм кислорода, усиливает функционирование системы глутатиона. Полученный нами умеренно выраженный эффект снижения активности ГТ in vitro при использовании ЛК и ее этилендиаминовой соли позволяет поддерживать уровень восстановленного глутатиона в эритроцитах, что необходимо для
полноценной работы глутатионпероксидазы [5], одного из
основных ферментов антиоксидантной системы, а не
эритроцитарной ГТ (π-класса), которая не обладает выраженной антиоксидантной активностью.
Список литературы
1. Калинина Е. В., Чернов Н. Н., Новичкова М. Д. Роль
глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов //
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Успехи биологической химии. - т. 54. - 2014. - С.
299–348.
Калинина В.Е., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие
тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных
редокс-зависимых процессах // Успехи биологической химии. - т. 48.- 2008.- С. 319–358.
Колесниченко Л.С., Кулинский В.И., Шпрах В.В. и
др. Система глутатиона крови при цереброваскулярных заболеваниях и коррекция нарушений ее
функций липоевой кислотой // Журн.неврол. и психиатрии им. С.С.Корсакова. – 2008. - №9. – С.36-40.
Колесниченко Л.С., Лалетин В.С., Кулинский В.И.
Воздействие липоевой кислоты на систему глутатиона печени здоровых мышей и перевитых асцитной
карциномой Эрлиха // Биомедицинская химия. –
2011. –Т.57. –вып.2. –С.219-224.
Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Система глутатиона. Синтез, транспорт, глутатионтрансферазы, глутатионпероксидазы // Биомедицинская химия. – 2009.- Т.55. – вып.3. - С. 255-277.
Смертина М.Н., Голованова Н.Э., Дадали В.А. Влияние алифатических дисульфидов на активность
эритроцитарной глутатион-S-трансферазы // Вестник СПбГА им. И.И.Мечникова. – 2004. – С.119122.
Соколовский В.В. Тиол-дисульфидная система в
биохимическом механизме реакции организма на
экстремальные воздействия // Вестник СПбГА им.
И.И.Мечникова. – 2004. – С.97-100.
Beutler E. Red Cell Metabolism. A Manual of
Biochemical Methods. Sec.edition. – N. Y., S.Fr.,
London: Grune and Strattion, 1975. – 160 p.
Habig W., Jakoby W. GST (rats and human) //
Meth.Enzimol.-1981.-V.77-P.218-243.
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ МОЛОДЫХ СУБСЕМЕЙСТВ ALUY И МЕТИЛИРОВАНИЯ
ИХ ДНК В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА K562
Кабанов Игорь Николаевич
Санкт-Петербургский Государственный университет, Санкт-Петербург, биологический факультет,
кафедра биохимии, м. н.с.
Мавропуло-Столяренко Григорий Ростиславович
Старший преподаватель Санкт-Петербургского Государственного университета, Санкт-Петербург,
биологический факультет, кафедра биохимии
Тищенко Людмила Ивановна
канд. биол. наук, доцент Санкт-Петербургского Государственного университета, Санкт-Петербург,
биологический факультет, кафедра биохимии
CHANGES IN EXPRESSION AND DNA METHYLATION OF YOUNG ALUY SUBFAMILIES IN HUMAN TUMOR CELL
К562
Kabanov Igor, St. Petersburg State University, St. Petersburg, Faculty of Biology, Department of Biochemistry, Research
Associate
Gregory Mavropulo-Stolyarenko, Senior lecturer of St. Petersburg State University, St. Petersburg, Faculty of Biology,
Department of Biochemistry
Lyudmila Tishchenko, Ph.D., assistant professor of St. Petersburg State University, St. Petersburg, Faculty of Biology,
Department of Biochemistry
АННОТАЦИЯ
На культурах клеток человека К562 изучали экспрессию РНК и уровень метилирования ДНК генов AluY при
апоптозе. Применялись методы: ПЦР в реальном времени, плавление с высоким разрешением, секвенирование ДНК
после бисульфитной обработки. При апоптозе содержание Alu-РНК в клетках К562 возрастает в 8-10 раз. Увеличению экспрессии AluYb8-РНК сопровождается снижением метилирования CpG в А-боксе промотора гена AluYb8 и в
сайте связывания белка Р53 с AluYb8-ДНК. Снижение метилирования AluYb8-ДНК приводит к увеличению экспрессии
AluYb8-РНК при апоптозе клеток К562.