Различия в форбол-зависимом фосфорилировании
advertisement
1 Различия в форбол-зависимом фосфорилировании регуляторных белков и сокращении фазных и тонических гладких мышц А.В.Воротников1, М.А.Крымский, М.В.Чибалина, Д.С.Кудряшов, В.П.Ширинский 1 Институт Экспериментальной Кардиологии РКНПК МЗ РФ, Москва, Электронный адресс: A.Vorotnikov@cardio.ru Гладкие мышцы разделяются на медленные тонические и быстро сокращающиеся фазные. В обоих случаях Са2+ является ключевым медиатором сократительного ответа. Однако, наличие тонической компоненты при сокращении сфинктеров и артериальных сосудов и ее отсутствие в фазной мускулатуре висцеральных органов является параметром, определяющим их различие. Мы обнаружили, что форбол 12,13-дибутират (PDBu) вызывает тоническое напряжение мышцы сонной артерии курицы, но не вызывает сокращения фазной мышцы мускульного желудка курицы. Целью данной работы был поиск тканеспецифичных различий в PDBu-зависимом фосфорилировании ключевых белков-регуляторов сокращения: кальдесмона, киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) и родственного ей белка телокина (KRP). Было выявлено два коррелятивных отличия. (1) PDBu повышал уровень фосфорилирования КЛЦМ в тонической ткани, но не влиял на фосфорилирование КЛЦМ в фазной. Результаты картирования фосфопептидов предполагают участие митоген-активируемой протеинкиназы (MAP-киназы) в фосфорилировании КЛЦМ in situ. (2) PDBu индуцирует фосфорилирование калдесмона по участкам MAP-киназы в обоих типах гладких мышц, однако, это фосфорилирование не оказывало существенного влияния на функциональную активность кальдесмона in vitro. Впервые обнаружено, что в фазной ткани PDBu стимулирует также транзиторное фосфорилирование кальдесмона пока неустановленной киназой, отличной от протеинкиназы С, Са2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы и казеинкиназы СК2. (3) Не было обнаружено существенных различий в кинетике PDBu-зависимого фосфорилирования KRP в тонической и фазной мускулатуре. В то же время, KRP является основным фосфобелком in vivo, фосфорилируемым по нескольким остаткам в пределах N-концевой области белка. Выявлены протеинкиназы, способные фосфорилировать эти остатки in vitro. Предполагается, что PDBu стимулирует фосфорилирование KRP MAP-киназой по участку, который гомологичен фосфорилируемому в КЛЦМ. (4) р44erk2 и р38 MAP-киназы обнаружены в фазной и тонической мускулатуре. Установлена их активация при действии PDBu на культивируемые гладкомышечные клетки аорты и исследовано их участие в фосфорилировании КЛЦМ и низкомолекулярной изоформы кальдесмона in vivo. Ключевые слова. Гладкая мускулатура, фосфорилирование, протеинкиназы, MAP-киназа, кальдесмон, киназа легких цепей миозина, KRP. Принятые сокращения: 2D-ФПК - двумерные фосфопептидные карты; ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография; ДСН-ПААГ - электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия; КЛЦМ- киназа легких цепей миозина; MAP-киназа, митогенактивируемая протеинкиназа; РЛЦ - регуляторные легкие цепи миозина; ФСБ – фосфатно-солевой буферный раствор; ЭГТА - этиленгликоль тетрауксусная кислота; ЭДТА - этилендиамин тетрауксусная кислота; [Са2+]in – концентрация свободного внутриклеточного кальция; СК2 казеинкиназа 2 типа; GSK3 - киназа гликогенсинтазы 3; KRP - белок, родственный киназе легких цепей миозина (kinase-related protein); PDBu - 4- -форбол 12,13-дибутират. 2 2+ Ионы Са играют ключевую роль в инициации сокращения как поперечнополосатых, так и гладких мышц (Somlyo, Somlyo, 1968). Для гладких мышц, однако, зависимость сократительного ответа от [Са2+]in не является однозначной и варьирует в зависимости от природы мышцы. Первоначальное возрастание [Са2+]in, связанное с кратковременной деполяризацией или агонист-зависимой стимуляцией, вызывает быстрое развитие натяжения (Rembold, Murphy, 1988). Однако последующая активация механизмов вывода Са2+ в ретикулум и наружу клетки приводят к снижению [Са2+]in и возникновению существенных различий силового ответа в разных типах мышц. Традиционное разделение гладких мышц по типу такого ответа на фазные и тонические (Somlyo, Somlyo, 1968) отражает, по сути, различную чувствительность сократительного аппарата к пониженной, но персистирующей [Са2+]in на стадии поддержания первичного сократительного ответа. Так, быстрое и полное расслабление фазной мускулатуры после первой стадии сокращения обусловлено недостаточной чувствительностью к остаточному Са2+ и, возможно, функционированием механизмов дальнейшего ее уменьшения (Rembold, 1992, Stull et al., 1993). Напротив, в тонических мышцах первая фаза активного развития натяжения сменяется периодом поддержания сокращенного состояния, причем его изометрическая составляющая может быть сопоставима с первичным силовым ответом (Rasmussen et al., 1987, Murphy, 1989). В англоязычной литературе этот феномен получил название ‘latch’ (Dillon et al., 1981, Murphy, 1989), что соответствует тоническому напряжению или тонусу. Предполагается, что в развитии тонуса важную роль играет увеличение Са2+-чувствительности сократительного аппарата (Somlyo, Somlyo, 1994). Примечательно, что тоническое напряжение может поддерживаться на протяжении достаточно длительного времени при минимальном расходе энергии (Paul, 1990) и значениях [Са2+]in, достигающих уровня покоя (Menice et al., 1997). В условиях in situ оказывается возможным разделить Са2+-зависимый и Са2+-чувствительный (тонический) сократительные ответы путем стимуляции мышцы определенными агонистами или химическими соединениями. Так, форболовые эфиры вызывают ярко выраженное тоническое напряжение интактной ткани при относительно низкой (Barany et al., 1992, Miura et al., 1997) или базальной (Ozaki et al., 1990) [Са2+]in. В гладкой мускулатуре наличие двух основных регуляторых систем обеспечивает проведение кальциевого сигнала к сократительному аппарату и непосредственную активацию актомиозина. При этом Са2+ связывается с кальмодулином, который далее взаимодействует с КЛЦМ и кальдесмоном, регуляторными белками, расположенными на актиновых филаментах (Walsh, 1994). Активированная таким образом КЛЦМ быстро (в течение нескольких секунд) фосфорилирует РЛЦ миозина и тем самым активирует гладкомышечный миозин (Walsh, 1994). Однако для дальнейшего продуктивного взаимодействия миозина с актином, т.е. взаимодействия, приводящего к перемещению этих белков относительно друг друга и генерации сокращения (Murphy, 1989), необходимо освобождение соответствующих участков связывания на поверхности актина. В покоящейся мышце эти участки экранированы лежащим вдоль актинового тяжа комплексом тропомиозина с кальдесмоном. Поэтому вторым необходимым условием активации актомиозина является связывание Са2+-кальмодулина с кальдесмоном и такое изменение конформации последнего, которое вызывает изменение положения тропомиозина и экспонирование миозин-связывающих участков на актине (Marston, 1995). Таким образом, развитие Са2+-зависимого сокращения гладкой мускулатуры требует одновременной активации как миозина через его прямое фосфорилирование, так и актина путем устранения ингибирующего влияния кальдесмона. После снижения [Са2+]in диссоциация комплексов кальмодулин-КЛЦМ и кальмодулин-кальдесмон приводит к инактивации киназы миозина и восстановлению ингибирующей активности кальдесмона. Последующее дефосфорилирование РЛЦ специфичной фосфатазой и переход тонких филаментов в неактивное состояние определяет расслабление гладкой мускулатуры (Rembold, 1992, Stull et al., 1993). Очевидно, что как активность, так и относительное содержание регуляторных белков в данном типе мышц должны определять чувствительность сократительного ответа к Са2+. Для фазных мышц характерно более высокое содержание кальдесмона (Haeberle et al., 1992) и повышенная активность фосфатазы РЛЦ (Gong et al., 1992). Кроме того, в этом типе мышц обнаружено большое количество белка, идентичного С-концевому домену КЛЦМ и содержащего участок посадки этого фермента на субстрат миозин. 3 Исследование структуры гена, кодирующего этот белок, первоначально названный телокином (Ito et al., 1989), показало что он является частью гена КЛЦМ, но наличие собственного промотора внутри одного из экзонов гена КЛЦМ определяет независимую от КЛЦМ экспрессию телокина in vivo (Collinge et al., 1992). Вследствие генетического родства с киназой, телокин получил новое название - KRP (от англ. kinase related protein). Установлено, что KRP связывается с миозином и препятствует его АТФ-зависимой деполимеризации (Shirinsky et al., 1993) и, вероятно, участвуя тем самым в поддержании структуры филаментов миозина в покоящейся мышце. Кроме структурной, KRP может иметь и регуляторную функцию. In vitro, KRP конкурирует с КЛЦМ за связывание с миозином и тем самым препятствует его фосфорилированию (Shirinsky et al., 1993, Silver et al., 1997) и активации сократительного ответа in situ (Sobieszek et al., 1998). Недавно появились данные о том, что KRP способен прямо активировать фосфатазу РЛЦ и тем самым ускорять расслабление гладких мышц (Wu et al., 1998). Таким образом, можно рассматривать KRP как один из регуляторных компонентов сократительного аппарата гладких мышц, влияющего на баланс активностей фосфатазы и киназы миозина (Vorotnikov, 1997). Повышенное содержание KRP и кальдесмона в сочетании с повышенной активностью фосфатазы РЛЦ в фазных гладких мышцах по сравнению с тоническими могут вносить существенный вклад в расслабление этих мышц при снижении [Са2+]in. Несмотря на вероятное смещение баланса активностей фосфатазы и киназы РЛЦ в пользу фосфорилирования миозина, сочетанное с низким содержанием кальдесмона и KRP в тонической мускулатуре, представляется маловероятным, что этого достаточно для обеспечения поддержания тонического напряжения при пониженной [Са2+]in. В настоящее время предполагается, что существуют другие механизмы, опосредующие Са2+-чувствительность гладкомышечного сокращения. Так, чувствительность к Са2+ может возрастать после прямого КЛЦМ-независимого фосфорилирования РЛЦ (Komatsu, Hosoya, 1996, Kureishi et al., 1997) или ингибирования фосфатазы РЛЦ при ее фосфорилирования Rho-киназой (Kimura et al., 1996), а также за счет активации КЛЦМ фосфорилированием р42/р44 митоген-активируемыми протеин (MAP) киназами (Klemke et al., 1997). Было отмечено, однако, что Са2+-сенситизация не всегда коррелирует с повышением уровня фосфорилирования РЛЦ и тогда появилась гипотеза об участии фосфорилирования кальдесмона (Van Eyk et al., 1998) или KRP (Wu et al., 1998) в модуляции сократительного ответа. В настоящей работе было исследовано сокращение фазной мышцы мускульного желудка и тонической мышцы сонной артерии курицы, вызываемое форбол 12,13-дибутиратом (PDBu), и PDBu-индуцируемое изменение фосфорилирования регуляторных белков КЛЦМ, KRP и кальдесмона в ненагруженных полосках этих мыщц. Обнаружено, что в присутствии внеклеточного Са2+ PDBu вызывает тоническое сокращение сосудистых мышц и стимулирует фосфорилирование всех вышеназванных белков. В тех же условиях PDBu не вызывает сокращения фазной мускулатуры и не влияет на уровень фосфорилирования КЛЦМ, хотя стимулирует фосфорилирование кальдесмона и KRP. Полученные результаты позволяют предположить, что специфическое фосфорилирование регуляторных белков может участвовать в генерации тонуса гладких мышц. Материал и Методика Материалы. [_-32P]АТФ и [32P]РО4 были получены из Института энергетической физики (Обнинск, Россия). Использованы следующие коммерческие реагенты: PDBu, среда 199, HEPES, MOPS, дитиотреитол, ЭГТА, ЭДТА, среда 199, раствор Хэнкса, Тритон-Х100, о-ванадат (“Sigma”, США), среды МЕМ и DMEM (“Gibco BRL”, США), окадаевая кислота (“LC Laboratories”, США), протеин G-агароза и ингибиторы MAP-киназ (“Calbiochem”, США), амфолины (“Pharmacia Biotech.”, Швеция), ТРСК-трипсин (“Worthington Biochem. Corp.”, США). Во всех экспериментах в среду 199 добавляли HEPES (рН 7,4) до 20 мМ. Антитела против р42/р44erk1,2 и р38 MAP-киназ и Са2+-кальмодулин-зависимая протеинкиназа II были приобретены у “New England Biolabs” (США), антитела к киназам-1,2 МАР-киназ – у “Transduction Laboratories” (США). Каталитическая субъединица протеинкиназы А и смесь _____-изоформ протеинкиназы С были предоставлены дром Дж. Селлерсом (Dr. J.Sellers, NHLBI, NIH, USA). кДНК p44erk1 MAP-киназы, 4 субклонированная в pGEX-3X вектор, была предоставлена д-ром Т.А.Войно-Ясенецкой (UIC, Chicago, USA). Измерение сократительной активности мышц. Опыты проводили на курицах возраста 4-6 мес и крысах весом 250-300 г. После декапитации сегменты сонной артерии или аорты вырезали, промывали ФСБ (pH 7,4), освобождали от эндотелия и помещали в среду 199 при постоянном протоке карбогена. Конечные препараты получали поперечным разрезанием сосудов на кольца длиной 2-3 мм. Мускульный желудок охлаждали на льду в течение 10 мин, затем препарировали на полоски толщиной 0,6 мм поперек основной оси желудка, т.е. так, чтобы мышечные волокна располагались вдоль среза. После отделения от внутренней выстилки желудка, мышечные полоски помещали в среду 199 и разрезали на прямоугольные сегменты размером 6 х 3 мм. При этом препарат не содержал областей пейсмейкерной активности, следствием чего являлось отсутствие спонтанных фазных сокращений (Ozaki et al., 1991). Кольца артерии и полоски мышцы мускульного желудка закрепляли в изометрическом тензодатчике и уравновешивали в среде 199 в течение 40-60 мин до получения стационарного базального натяжения при растяжении тканей в 1,5 и 1,3 раза, соответственно. После получения контрольного сократительного ответа на добавление 30-60 мМ KCl, ткань релаксировали и стимулировали добавлением PDBu до 1 мкМ. Нагрузка ткани [ 3 2 P]РО 4 и фосфорилирование in situ. Каждый сегмент сосуда или мышцы мускульного желудка помещали в отдельную ячейку камеры объемом 12 мл, заполненную бесфосфатной средой МЕМ и сконструированную таким образом, что она вмещала до 10 полосок и позволяла круговую конвекцию среды, обусловленную постоянным протоком карбогена. После инкубации в течение 1,5 ч со сменами среды через каждые 30 мин, среду МЕМ заменяли на раствор Хэнкса, содержащий 5-10 МБк/мл [32P]Na3РО4 и инкубацию продолжали еще 4 ч. После этого отбирали контрольные полоски ткани, а к оставшимся добавляли PDBu до 2 мкМ или окадаевую кислоту до 0,5 мкМ. Через определенные интервалы времени индивидуальные полоски вынимали, быстро промывали ледяным ФСБ (в течение 2-3 с) и замораживали в жидком азоте. К замороженным образцам добавляли 0,6 мл буферного раствора экстракции (20 мМ MOPS, рН 7,0, 1 % тритона-Х100, 0,35 M NaCl, 25 мМ MgCl2, 2 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотреитола, 1 мМ ованадата, смесь ингибиторов протеаз) и растирали в ступке, находящейся в жидком азоте. Получившийся порошок размораживали и инкубировали 30 мин на льду при периодическом встряхивании. Экстракты центрифугировали в течение 30 мин при 12000 g и 4 оС, осадок удаляли, а в супернатант добавляли 15-25 мкг аффинно очищенных кроличьих антител против кальдесмона (Shirinsky et al., 1989) или аффино очищенных козьих антител против KRP, выделенного из мускульного желудка курицы. Иммунные комплексы, образованные в течение ночи при 4 оС, связывали с протеин G-агарозой в течение 1.5 ч и осаждали при той же температуре. Агарозу промывали при 4 оС 3 раза раствором экстракции и 2 раза раствором 20 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,65 М NaCl. Белки элюировали кипячением в буферном растворе нанесения для ДСН-ПААГ и разделяли электрофорезом в тонком слое 7 или 10 % ПААГ. Каждый образец подвергали анализу как минимум дважды и снимали по две авторадиограммы с каждого геля. После количественного сканирования относительную степень фосфорилирования белков выражали через соотношение интенсивностей их полос на авторадиограммах и окрашенных Кумасси R-250 гелей. Фосфорилирование в культуре гладкомышечных клеток. Клетки из аорты курицы выделяли путем энзиматической диссоциации (Campbell et al., 1974) и культивировали без добавления HEPES в среде 199, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (“HyClone”, США). В работе использовали клетки 2-3 пассажей. За 24 ч до эксперимента клетки переводили на бессывороточную среду. Далее клетки инкубировали в присутствии 20 мМ HEPES, рН 7,4 2 ч в бесфосфатной среде МЕМ и 2,5 ч в МЕМ, содержащей 0,1 мМ [32Р]Na-фосфат с активноcтью 2 МВк/мл. Клетки стимулировали в той же среде добавлением PDBu до 2 мкМ. При использовании ингибиторов MAP-киназ их добавляли за 1,5 ч до начала стимуляции. Клетки лизировали буферным раствором экстракции (см. выше) после промывки холодным ФСБ. Иммунопреципитацию и анализ фосфорилирования белков проводили как описано выше. 5 Выделение и экспрессия белков. Кальдесмон (Vorotnikov et al., 1988) и KRP (Shirinsky et al., 1993) выделяли из мускульного желудка курицы. Казеинкиназы 1 и СК2 выделяли из печени кролика (Vorotnikov et al., 1988). MAP-киназу экспрессировали в BL21 DE3 линии E.coli как белок, содержащий глутатион-трансферазный домен и очищали с помощью коммерческой глутатион-сефарозы (Pharmacia Biotech) по протоколу производителя. Концентрации белков определяли спектрофотометрически как описано ранее (Vorotnikov et al., 1988, Shirinsky et al., 1993) или по методу Брэдфорд, используя коммерческие реагенты и протокол фирмы Bio-Rad (США). Фосфорилирование in vitro. Активацию рекомбинантной MAP-киназы осуществляли следующим способом. Клетки линии COS-7 культивировали в среде DMEM до субконфлюента и депривировали от сыворотки в течение 36-40 ч. Далее клетки стимулировали 50 нМ эпидермальным фактором роста в течение 10 мин и лизировали 30 мин на льду в буферным раствором следующего состава: 50 мМ трис-HCl, pH 7,5, 0,5 % тритона-Х100, 0,1 M NaCl, 5 мМ ЭДТА, 40 мМ Na-пирофосфата, 0,2 мМ о-ванадата, 1 мМ дитиотреитола и смеси ингибиторов протеаз. Лизат центрифугировали и в супернатант добавляли антитела к киназам-1,2 MAP-киназы, преадсорбированные на протеин G-агарозе. После перемешивания суспензии в течение 2 ч на льду, агарозу промывали дважды буферным раствором лизиса и дважды раствором, содержащим 40 мМ HEPES, рН 8, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ дитиотреитола, 0,2 мМ о-ванадата. Реакцию фосфорилирования проводили в последнем растворе, содержащем 0,4 мМ АТФ в течение ночи при 30 оС и перемешивании. Активированную фосфорилированием GST-MAP-киназу хранили при –20 о С в 50 % глицерине. Фосфорилирование белков проводили как описано ранее (Vorotnikov et al., 1988). Степень фосфорилирования определяли по включению радиоактивности используя [ 32 P]АТФ в качестве субстрата (Vorotnikov et al., 1988), или (в случае KRP) изоэлектрическим фокусированием аликвот реакционной смеси в тонком слое 7,5 % ПААГ и 2 % амфолинов диапазона 3,5-5 (Pharmacia Biotech., Швеция) в горизонтальном аппарате Multiphor II. Картирование и анализ фосфопептидов. После ДСН-ПААГ из геля вырезали куски, содержащие радиоактивные кальдесмон, КЛЦМ или KRP, и измельчали их в 1 мл 0,1 М NH4HCO3, pH 8. Трипсинолиз проводили при 37 оС и непрерывном встряхивании, добавляя 50 мкг TPCKтрипсина на 14 ч и еще два раза по 25 мкг в течение последующих 6 ч. Раствор отделяли от остатков геля и лиофилизовали. Осадок растворяли в буферной смеси уксусной кислоты, муравьиной кислоты и H2O при соотношении 15:5:80, рН 2. Пептиды разделяли элетрофоретически в тонком слое в той же смеси на пластинах 20 x 20 см SilicaGel 60 (“Merck”, Германия) при 10 оС и напряжении 1000 V в течение 75 мин. Последующее разделение в перпендикулярном направлении проводили тонкослойной восходящей хроматографией в смеси н-бутанола, пиридина, уксусной кислоы и H2O (15:15:4:16). Фосфопептиды детектировали авторадиографией на пленке Kodak Biomax. Очистку пептидов проводили с помощью BЭЖХ на обращенно-фазных колонках Vydac С18 (300 А) и Aquapore OD-300 в градиенте ацетонитрила с трифторуксусной и гептафтормаслянной кислотами, соответственно. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Форбол-зависимое сокращение тонической и фазной гладкой мускулатуры. Изометрическое сокращение колец тонических мышц сонной артерии курицы и аорты крысы (рис.1, а) и полосок фазной мышцы мускульного желудка курицы (рис.1, б) измеряли в среде, содержащей 1,8 мМ СаCl2. Оба типа мышц развивали типичное Са2+-зависимое контрольное сокращение при стимуляции 60-90 мМ KCl, которое сменялось расслаблением при удалении деполяризующего агента. Последующая стимуляция мышц сосудов с помощью 1 мкM PDBu приводила к развитию сокращения, сила которого была сопоставима с KCl-зависимым ответом (рис.1, а). При этом максимальное напряжение сохранялось в течение долгого времени (до 20-30 мин) и лишь незначительно снижалось при последовательных отмывках. Подобный эффект PDBu, связанный с трудностями отмывания препарата, был описан ранее (Barany et al., 1992). Полное расслабление было достигнуто с помощью форсколина, что свидетельствует о сохранении интактности мышцы (рис.1, а) (Itoh et al., 1993). 6 Рис.1. Сравнение характерных сократительных реакций тонических и фазных гладких мышц. После получения контрольного ответа на KCl, кольцевые препараты аорты крысы (а), сонной артерии курицы (б), а также полоски мускульного желудка курицы (в) отмывали исходной средой (двойная стрелка) и последовательно обрабатывали 1 мкМ форбол 12,13-дибутиратом (PDBu), форсколином (Ф) или KCl. Силу сократительного ответа нормализовали к величине первичного ответа на KCl, который обычно составлял 0.2-0.4 г. Противоположный результат был получен на фазной мышце мускульного желудка курицы. 1 мкM PDBu не вызывал сокращения несмотря на сохранение последующего сократительного ответа на KCl (рис.1, б). Таким образом, фазная и тоническая мускулатура проявляют различную сократительную реакцию при стимуляции тонического напряжения форболовым эфиром. Аналогичные результаты были получены на фазной мышце ободочной кишки, где PDBu не вызывал сокращения (Sato et al., 1994), и тонических мышцах сонной артерии свиньи (Singer, 1990), аорты кролика (Singer et al., 1989, Miura et al., 1997) или крысы (Ozaki et al., 1990, Itoh et al., 1993), где PDBu вызывал длительное сокращение. Однако четкая корреляция между изометрической силой и степенью фосфорилирования Ser19 РЛЦ - участка, узнаваемого КЛЦМ, - обнаруживалась только иногда (Singer et al., 1989, Itoh et al., 1993). В других случаях (Ozaki et al., 1990, Miura et al., 1997) сила сократительного ответа была непропорционально высока по отношению к степени фосфорилирования РЛЦ по остатку Ser19. В мышце трахеи, однако, PDBu сам по себе не только не вызывал сокращения, но и приводил к релаксации после сокращения, вызванного карбахолом (Kamm et al., 1989). Отличительной особенностью этой ткани является то, что активируемая PDBu протеинкиназа С прямо фосфорилирует остатки Ser1 и Ser2 РЛЦ и тем самым ингибирует АТФазу актомиозина в мышце трахеи (Kamm et al., 1989). Таким образом, сравнение именно сосудистых тонических мышц с фазными представляется наиболее адекватным при анализе PDBu-зависимых механизмов Са2+-чувствительности сократительного ответа. PDBu-зависимое фосфорилирование кальдесмона. В ряде работ показано, что фосфорилирование кальдесмона в сосудистой ткани in situ возрастает в процессе сокращения, вызываемого такими агонистами как эндотелин, гистамин, серотонин (см. обзор: Shirinsky et al., 1999), а также форболовыми эфирами (Rasmussen et al., 1987, Adam et al., 1989, Barany et al., 1992). Несмотря на то, что обнаружен целый ряд протеинкиназ, способных фосфорилировать кальдесмон in vitro (см. обзоры: Gusev, Vorotnikov, 1993; Shirinsky et al., 1999), было установлено, что в артериальной ткани PDBu-зависимое фосфорилирование кальдесмона опосредуется, в основном, MAP-киназой (Adam et al., 1992, 1993). Участки фосфорилирования были локализованы в функционально важной области кальдесмона вблизи области взаимодействия с кальмодулином и актином, отвечающей также за ингибирование актин-активируемой АТФазы миозина (Adam et al., 1992). Хотя прямой эффект фосфорилирования кальдесмона MAP-киназой не был детально исследован, было принято, что это фосфорилирование приводит к подавлению ингибиторной активности кальдесмона (Redwood et al., 1993) и, таким образом, вносит вклад в поддержание тонического напряжения мышц сосудов (Katoch, Moreland, 1995, Gerthoffer et al., 1997). 7 Необходимость биохимических доказательств этой гипотезы, а также выявления возможных отличий в фосфорилировании этого белка в фазных мышцах, где PDBu не вызывает тонического напряжения (рис.1, б), побудило нас к экспериментальному решению этих вопросов. Рис.2 показывает, что кинетика PDBu-зависимого фосфорилирования кальдесмона в мышце мускульного желудка курицы является двухфазной. При этом транзиторное фосфорилирование с максимумом около 10-15 мин сменялось частичным дефосфорилированием и новым увеличением включения фосфата при стимуляции более 30 мин (рис.2, а). Кальдесмон был иммунопреципитирован из ткани, гидролизован трипсином и подвергнут фосфопептидному картированию. Полученные 2D-ФПК были сопоставлены с 2D-ФПК кальдесмона после его фосфорилирования различными протеинкиназами in vitro. Оказалось, что как в покое, так и после длительной обработки ткани PDBu основная радиоактивность была ассоциирована с пептидами, содержащими участки фосфорилирования MAP-киназой (рис.2, б-д). Однако транзиторное фосфорилирование этого белка в первой фазе было связано преимущественно с включением фосфата в пептиды Х1-Х3 (рис.2, г), которые не образовывались при фосфорилировании кальдесмона in vitro под действием MAP-киназы, протеинкиназы С, Са2+-кальмодулин-зависимой протеинкиназы II или казеинкиназы СК2 (Krymsky et al., 1999). Только фосфопептид 4 (рис.2, г) содержал остаток, фосфорилируемый протеинкиназой С in vitro (результат не показан), однако его вклад в фосфорилирование кальдесмона in situ относительно невысок. Таким образом, в фазной ткани PDBu активирует некую кальдесмон-киназу, отличную от подробно описанных ранее (Shirinsky et al., 1999). Возможно, что этим ферментом является Са2+-независимая изоформа протеинкиназы С или р21-активируемая киназа. Последняя присутствует в гладкой мышце мускульного желудка и способна фосфорилировать кальдесмон в скинированной ткани (Van Eyk et al., 1998), однако, связь внутриклеточных механизмов ее активации с PDBu-зависимой сигнализацией остается неясной. Остается неясным, связано ли отсутствие транзиторного фосфорилирования кальдесмона в тонической ткани (Adam et al., 1989) с проявлением тонической сократительной реакции на PDBu. Х Рис.2. Фосфорилирование кальдесмона в фазной мышце мускульного желудка курицы in situ. а - Разделение иммунопреципитатов кальдесмона, из экстрактов 32Р-меченных мышечных полосок, инкубированных в течение разного времени с 2 мкМ PDBu, с помощью ДСН-ПААГ. АРГ – авторадиограмма, КД – кальдесмон, ТЦИ и ЛЦИ – тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, соответственно. Радиоактивная полоса на уровне ЛЦИ представляет собой протеолитический фрагмент кальдесмона. б-д, Авторадиограммы двумерных фосфопептидных карт кальдесмона, фосфорилированного in vitro рекомбинантной р44erk1 MAP-киназой (б), или иммунопреципитированного из 32Рмеченных полосок мускульного желудка курицы до (в) и после обработки 2 мкМ PDBu в течение 15 (г) и 60 мин (д). Совпадение подвижности фосфопептидов с одинаковыми номерами было установлено совместным картированием смесей образцов (результаты не показаны). Фосфорилирование кальдесмона по участкам, узнаваемым MAP-киназой, по-видимому, не играет ключевой роли для генерации тонического сократительного ответа гладких мышц как это предполагалось ранее (Adam et al., 1989, Katoch, Moreland, 1995, Gerthoffer et al., 1997). Этот вывод следует из анализа результатов как физиологических, так и биохимических экспериментов. 1) PDBu сходным образом стимулирует монотонное, приблизительно 2-кратное, увеличение уровня фосфорилирования кальдесмона в тонической (артериальной) и фазной (мускульный желудок) мускулатуре, тогда как тоническое напряжение наблюдается только в артериальной ткани и развивается быстрее, чем фосфорилирование кальдесмона MAP-киназой. 2) Фосфорилирование MAP-киназой кальдесмона или его С-концевого рекомбинантного фрагмента Н1, полностью сохраняющего функциональную активность исходного белка (Huber et al., 1993), существенно не влияло на их ингибиторную активность по отношению к актин/тропомиозин-активируемой АТФазе миозина и подвижности актиновых филаментов вдоль иммобилизованного активного фрагмента миозина (Krymsky et al., 1999). PDBu-зависимое фосфорилирование KRP. Анализ общего белкового фосфорилирования в экстрактах фазных и тонических гладких мышц курицы, метаболически 8 32 меченных [ Р]PO4, выявил наличие двух основных фосфобелков (рис.3). Белок с кажущейся массой 26 kDa специфически реагировал с антителами к KRP и его фосфорилирование монотонно возрастало в присутствии 2 мкМ PDBu (рис.3). После иммунопреципитации из мышцы мускульного желудка 32Р-меченный KRP был подвергнут фосфопептидному картированию. Было обнаружено значительное количество триптических фосфопептидов, причем их число и расположение было одинаково для KRP из контрольной и стимулированной ткани (рис.4, а,б), несмотря на возрастание степени фосфорилирования KRP в присутствии PDBu (рис.4, г). Более того, 2D-ФПК этого белка из ткани, обработанной окадаевой кислотой, также были качественно не отличимы (рис.4, в). В то же время, являясь мощным ингибитором большинства фосфатаз и свободно проникая сквозь плазматическую мембрану (Cohen et al., 1990), окадаевая кислота приводила к увеличению уровня фосфорилирования KRP в этой ткани в 2,5 раза (рис.4, г). Наиболее вероятным объяснением наблюдаемых 2D-ФПК может быть то, что 1) KRP содержит нескольких остатков, фосфорилируемых in vivo, и 2) в покоящейся ткани KRP частично фосфорилирован по этим остаткам, тогда как PDBu и окадаевая кислота лишь увеличивают степень их фосфорилирования. Для проверки этих гипотез мы исследовали фосфорилирование KRP in vitro и картировали образующиеся фосфопептиды. Рис.3. Анализ общего фосфорилирования белков в 32Р-меченных препаратах фазных и тонических гладких мышц. 25 мкг белка из экстракта мускульного желудка (а) и 10 мкг белка аорты курицы (б) наносили на каждую дорожку и разделяли с помощью ДСН-ПААГ. 1 – окраска одной дорожки геля Куммасси R-250. 2-5 - авторадиограммы тех же гелей после разделения экстрактов тканей до (2) и после стимуляции 2 мкМ PDBu в течение 15, 30 и 60 мин, соответственно. Двойной стрелкой обозначен белок с Мr 97 kDa, одинарной стрелкой – KRP. На рис.5 представлена аминокислотная последовательность KRP из тканей курицы, показывающая наличие консенсусных участков фосфорилирования MAP-киназой (Ser18) и протеинкиназой А (Ser12). Действительно, каждый из этих ферментов включал in vitro 0.7-0.8 моля фосфата на 1 моль KRP по одному из остатков белка, что следует из результатов изоэлектрического фокусирования (рис.6, а, Vorotnikov et al., 1996). При этом на 2D-ФПК выявляются фосфопептиды 1 и 1’ или только 1, соответственно (рис.7, а,б). Единичный фосфопептид 1, образованный при фосфорилировании протеинкиназой А, был очищен с помощью ВЭЖХ. Частичное сиквенирование показало наличие Lys10-Ala-РSer12-Gly-Ser… N-концевой последовательности, тогда как массспектроскопический анализ дал мол. массу 4370.4. Таким образом, фосфопептид 1 содержит остатки Lys10-Lys48 KRP и Ser12 является единственным участком фосфорилирования протеинкиназой А (рис.5). Фосфопептид 1’ также содержит единственный остаток фосфата и представляет собой Ala11Lys48, продукт альтернативного трипсинолиза соседних пептидных связей Arg9-Lys-Ala11 как описано ранее (Boyle et al., 1991). Образование этого пептида невозможно при фосфорилировании Ser12 и внесении отрицательного заряда через остаток к С-концу от гидролизуемой связи (Boyle et al., 1991). Таким образом, отсутствие фосфопептида 1’ на рис.7, б характерно для KRP, полностью фосфорилированного по участку протеинкиназы А. 9 Рис.4. Фосфорилирование KRP в фазной мышце мускульного желудка in situ. а-в: авторадиограммы двумерных фосфопептидных карт KRP, иммунопреципитированного из необработанной ткани (а) и мышцы, стимулированной 2 мкМ PDBu (б) или 0,5 мкМ окадаевой кислотой (ОА) (в) в течение 30 и 45 мин, соответственно. (г) - уровень фосфорилирования KRP относительно (контроля (К)), использованного в данном эксперименте. Приведены средние величины (X ± Sx) по результатам сканирования четырех гелей и соответствующих авторадиограмм. Направления элктрофореза и хроматорафии как на рис. 2. Х Рис.5. Первичная структура KRP (Collinge et al., 1992), представленная в однобуквенном коде. Предполагаемые участки фосфорилирования (Ser12, Ser14, Ser18) выделены полужирным курсивом. Триптический фосфопептид 1 (Lys10Lys48) подчеркнут. Пояснения см. в тексте. X Рис.6. Фосфорилирование KRP in vitro. а - кинетика фосфорилирования протеинкиназой А (1) и рекомбинантной р44erk1 MAP-киназой (2). I-II - изоэлектрическое фракционирование KRP на разных стадиях фосфорилирования. KRP имеет два изоэлектрических варианта, которые смещаются к аноду в результате фосфорилирования (P-KRP). Отсутствие дополнительных фосфоформ KRP, доказанное авторадиографией (результаты не приведены), свидетельствует о фосфорилировании одного участка каждой протеинкиназой. б - последовательное фосфорилирование KRP MAP-киназой (МАР) и киназой гликогенсинтазы (GSK3). АРГ – авторадиограмма. Фосфорилирование MAPкиназой проводили в присутствии нерадиоактивного АТФ, после чего добавляли [ -32P]АТФ и продолжали фосфорилирование в присутствии или отсутствие GSK3. Фосфорилирование под действием GSK3 проводили используя только [ -32P]АТФ. Рис.7. Картирование фосфопептидов KRP после его фосфорилирования in vitro различными протеинкиназами. KRP был фосфорилирован в присутствии [ -32P]АТФ МАР-киназой до 0,7 моль Фн/моль (а), протеинкиназой А до 0,8 моль Рi/моль (б), последовательно протеинкиназой А (0,8 моля Фн/моль) и МАР-киназой (0,7 моль Фн/моль) (в), последовательно МАР-киназой, GSK3 и протеинкиназой А (г). В последнем случае низкая степень фосфорилирования под действием GSK3 приводит к преимущественному накоплению продуктов дифосфорилирования 2 и 2’ и меньшей доли продуктов трифосфорилирования 3 и 3’. 10 Расположение двух фосфорилируемых остатков в одном триптическом пептиде KRP (см. рис.5) объясняет наличие только одного мажорного дифосфопептида 2 на карте KRP, фосфорилированном протеинкиназой А и MAP-киназой (рис.7, в). В подтверждение, после фосфорилирования MAP-киназой in vitro, очищенный ВЭЖХ фосфопептид 1 (Lys10-Lys48) также мигрировал на 2D-ФПК как дифосфопептид 2 (результат не показан). Далее была исследована возможность фосфорилирования KRP под действием так называемых ацидотропных киназ, которые используют для консенсусного узнавания субстрата отрицательные аминокислотные остатки и фосфатные группы, перенесенные другими киназами (Roach, 1991). KRP являлся плохим субстратом для казеинкиназ I и СК2 и его фосфорилирование либо не изменялось, либо незначительно увеличивалось после предварительного фосфорилирования KRP другими киназами (результаты не показаны). Напротив, фосфорилирование KRP киназой гликогенсинтазы 3 (GSK3) в сильной степени зависело от предварительного фосфорилирования Ser18 MAP-киназой (рис.6, б). Наиболее вероятно, что согласно своей субстратной специфичности (Roach, 1991), GSK3 фосфорилирует Ser14 KRP, используя для его узнавания отрицательный заряд фосфорильной группы, переносимой на Ser18 KRP MAP-киназой (см. рис.5). Результатом последовательного фосфорилирования KRP MAPкиназой и GSK3 было образование мажорных дифосфопептидов 2 и 2’, представляющих собой продукты альтернативного трипсинолиза Lys10-Lys48 и Ala11-Lys48 (результаты не приведены). Наконец, фосфорилирование KRP протеинкиназой А, MAP-киназой и GSK3 in vitro приводило к образованию всех фосфоформ KRP. Хотя при этом белок находился преимущественно в дифосфорилированной форме, наличие дополнительных фосфопептидов 3 и 3’ четко выявлялось с помощью 2D-ФПК (рис.7, г). Остается пока неясным, с чем связано образование двух трифосфопептидов в данном случае, поскольку альтернативный протеолиз маловероятен в случае полного фосфорилирования Ser12 протеинкиназой А. Однако фосфопептиды 3 и 3’ характерны для KRP, изолированного из 32Р-меченной ткани (см. рис.4). Идентификация фосфопептидов KRP in vitro позволяет детально проанализировать его фосфорилирование в мышце мускульного желудка. В нестимулированной ткани KRP преимущественно монофосфорилирован (фосфопептиды 1 и 1’ являются основными), однако, ди- и трифосфо-KRP также представлены (рис.4, а). Вероятно, фосфат распределен между Ser12 (участок протеинкиназы А) и другим остатком, так как выявляется фосфопептид 1’. PDBu активирует эндогенную MAP-киназу, которая фосфорилирует Ser18 с образованием как моно- так и дифосфоKRP. Доля дифосфопептида 2 существенное возрастает, тогда как относительная интенсивность фосфопептидов 1/1’ и трифосфопептидов 3/3’ почти не изменяется (рис.4, б). Неспецифическое увеличение общего уровня фосфорилирования KRP при воздействии окадаевой кислоты сопровождается как ди-, так и существенным трифосфорилированием KRP при значительном (в 4-5 раз) уменьшении доли монофосфо-KRP (рис.4, в). Преобладание фосфопептида 2’ над 2 говорит о значительной доле KRP, преимущественно дифосфорилированном по остаткам, не затрагивающим Ser12 и косвенно указывает на вклад последовательного фосфорилирования KRP под действием MAP-киназы и GSK3. Следует отметить, что фосфопептиды 5 и 5’ часто, но не воспроизводимо, образуются также при гидролизе KRP, фосфорилированном in vitro. Скорее всего, они представляют собой продукты неспецифического протеолиза KRP. Таким образом, KRP является одним из основных фосфобелков гладкой мускулатуры и его фосфорилирование возрастает при стимуляции ткани. Вместе с тем, роль этого фосфорилирования остается в большой степени неясной. Ранее мы показали, что моно- и дифосфорилирование KRP не влияет на его взаимодействие с миозином и ингибирование скорости его фосфорилирования КЛЦМ (Vorotnikov et al., 1996). Остается установить, какое влияние на эти активности KRP может оказывать его одновременное фосфорилирование KRP несколькими протеинкиназами, однако, наличие такого эффекта представляется маловероятным. Добавление KRP к скинированным гладким мышцам кишечника и бедренной артерии приводило к снижению уровня фосфорилирования РЛЦ и расслаблению, но не влияло на скорость тиофосфорилирования РЛЦ. Это позволило предположить прямую активацию фосфатазы миозина под действием KRP (Wu et al., 1998). Стимуляция эндогенных протеинкиназ, зависимых от циклических нуклеотидов, сопровождалась увеличением фосфорилирования KRP и ускорением релаксации (Wu et al., 1998). Возможно, что фосфорилирование усиливает активирующее действие 11 KRP на фосфатазу РЛЦ, и ответ на этот вопрос требует дальнейших исследований. Однако отсутствие различий в кинетике PDBu-зависимого фосфорилирования KRP в фазной и тонической ткани свидетельствует против участия фосфорилирования KRP в генерации тонического ответа. Для окончательного решения этого вопроса необходим подробный анализ участков фосфорилирования KRP в тонической ткани. PDBu-зависимое фосфорилирование MLCK. В интактной тонической мышце развитие PDBu-зависимого тонического ответа сопровождалось фосфорилированием КЛЦМ, чего не было обнаружено в фазной мускулатуре. На рис.8 показана зависимость фосфорилирования КЛЦМ в сонной артерии (кривая 1) и аорте курицы (кривая 2) от времени обработки PDBu, из которой следует, что максимальный уровень фосфорилирования достигается за 15-30 мин и сохраняется постоянным в течение продолжающейся стимуляции и сохранении тонуса (см. рис.1, а). Напротив, в мышце мускульного желудка PDBu не стимулировал фосфорилирования КЛЦМ (рис.8, кривая 3) и развития тонического ответа (см. рис.1, б). Возможно, что отсутствие фосфорилирования КЛЦМ было связано с отсутствием начальной механической нагрузки в экспериментах с 32Р-меченной фазной мышцей. Тем не менее, можно предположить, что фосфорилирование КЛЦМ в сосудистой ткани может повышать ее активность и вносить вклад в развитие тонической реакции. X Рис.8. Кинетика фосфорилирования КЛЦМ в аорте курицы in situ. После стимуляции колец сонной артерии (1), аорты (2) или полосок мускульного желудка (3) курицы 2 мкМ PDBu в течение указанного времени КЛЦМ экстрагировали, иммунопреципитировали и анализировали с помощью ДСН-ПААГ (см.: «Материал и методика»). Относительное фосфорилирование определяли по результатам количественного сканирования и выражали как соотношение интенсивностей полос на авторадиограммах и соответствующих гелях, окрашенных Куммасси R-250. Приведены характерные кривые. Ряд исследований, посвященных регуляции активности КЛЦМ, выявил возможность ингибирования этого фермента путем его фосфорилирования (Stull et al., 1993). При этом фосфорилированию подвергается регуляторный домен КЛЦМ, что снижает сродство фермента к Са2+-кальмодулину, вызывает инактивацию КЛЦМ и приводит к потере Са2+-чувствительности сократительного ответа некоторых гладких мышц. Существование механизмов повышения активности КЛЦМ было лишь недавно предложено на основании биохимических и клеточнобиологических экспериментов. Показано (Morrison et al., 1996), что фосфорилирование КЛЦМ MAP-киназой и родственной ей Сdc2-киназой стимулирует ее активность in vitro, тогда как другие авторы (Klemke et al., 1997) наблюдали повышенную миграцию клеток, связанную с увеличением эндогенной активности КЛЦМ и фосфорилирования РЛЦ при гиперэкспрессии киназы, активирующей эндогенную MAP-киназу. Поскольку PDBu вызывает увеличение фосфорилирования кальдесмона и KRP по участкам, узнаваемым MAP-киназой, в интактных полосках гладких мышц (см. выше), представлялось важным узнать, стимулирует ли PDBu фосфорилирование соответствующих участков КЛЦМ in situ. Для этого КЛЦМ иммунопреципитировали из 32Р-меченных полосок мускульного желудка и изолированных клеток аорты курицы до и после их стимуляции PDBu, подвергали триптическому гидролизу и двумерному картированию фосфопептидов. X Рис.9. Двумерное картирование фосфопептидов КЛЦМ, фосфорилированной in situ. а-б - фосфорилирование КЛЦМ в фазной мышце мускульного желудка до (а) и после (б) стимуляции 2 мкМ PDBu в течение 30 мин; в-г - фосфорилирование КЛЦМ в изолированных гладкомышечных клетках аорты курицы до (в) и после (г) стимуляции 2 мкМ PDBu в течение 30 мин. Цифрами обозначены фосфопептиды, происходящие из KRP-домена КЛЦМ, что определено совместным картированием фосфо-КЛЦМ и фосфо-KRP (результаты не приведены). М1 и М2 обозначают фосфопептиды, уникальные для КЛЦМ. 12 В отсутствие PDBu основная доля радиоактивного фосфора была связана с пептидами 1 и 1’, происходящими из С-концевого домена КЛЦМ и имеющего структуру, идентичную KRP (ср. рис.9, а,в и рис.4). Это означает, что в покое KRP-домен КЛЦМ фосфорилирован по единственному остатку, причем присутствие фосфопептида 1’ свидетельствует о том, что этот остаток отличен от фосфорилируемого протеинкиназой А (см. предыдущий раздел). Исчезающее количество фосфопептида 2 означает крайне низкую степень фосфорилирования KRP-домена одновременно по двум остаткам. Дополнительные фосфопептиды М1 и М2 характерны только для КЛЦМ, но не KRP. Возможно, они содержат фосфорилируемые пролин-направленными киназами остатки Thr40/43 или Thr283 N-концевого домена КЛЦМ как было показано in vitro (Morrison et al., 1996). Обработка фазной мышцы PDBu не приводила к стимуляции фосфорилирования КЛЦМ и изменению 2D-ФПК этого белка (рис.9, б), что также свидетельствует против перераспределения фосфата между разными остатками при сохранении общего уровня фосфорилирования. В изолированных клетках аорты, однако, PDBu вызывал дифосфорилирование КЛЦМ по ее KRPдомену, что характеризуется образованием фосфопептида 2’ (рис.9, г). Кроме этого, происходило перераспределение радиоактивности между фосфопептидами М1 и М2. Принимая во внимание расположение этих фосфопептидов, можно предположить, что М2 является продуктом последующего фосфорилирования М1. Анализ N-концевой последовательности КЛЦМ показывает такую возможность в последовательности …-Gly-Thr40-Pro-Lys-Thr43-Pro-…, которая содержит два потенциальных участка для пролин-направленных киназ (Morrison et al., 1996). Сравнение 2D-ФПК полученных для КЛЦМ (рис.9, г) и KRP (рис.4, б) из стимулированных клеток и ткани, соответственно, выявляет их большое сходство, что может свидетельствовать об участии одинаковых киназ в фосфорилировании гомологичных остатков. Роль MAP-киназ в фосфорилировании регуляторных белков. Поскольку предположение о PDBu-зависимой активации эндогенных MAP-киназ основывается лишь на данных, полученных для других мыщц, а 2D-ФПК позволяют только локализовать фосфорилируемые остатки, представлялось логичным показать наличие MAP-киназ в исследуемых тканях, возможность их активации форболовым эфиром и участие в фосфорилировании КЛЦМ и кальдесмона. Семейство MAP-киназ объединяет группу родственных пролин-направленных киназ, имеющих сходные пути и механизмы внутриклеточной активации и фосфорилирующих остатки Ser или Thr, расположенные непосредственно перед остатком Pro (Alvarez et al., 1991). MAP-киназы являются конечными эффекторами в каскадах последовательных киназных реакций, сопряженных с мембранными рецепторами, облпдающими Tyr-киназной активностью (Porter, Vaillancourt, 1998). Конечная активация MAP-киназ осуществляется посредством специфического двойного фосфорилирования остатков Thr и Tyr, расположенных в каталитическом домене этих ферментов (Sugden, Clerk, 1998). Незначительные различия последовательности, окружающей эти остатки в структуре разных MAP-киназ, определяют специфичность фосфорилирующих их MAP-киназ-киназ и, в конечном счете, путей внутриклеточной сигнализации. По этим параметрам MAP-киназы разделяют на три основные подгруппы: внеклеточно-активируемые киназы ERК, стрессактивируемые киназы SAPK, и группу p38 родственных киназ (Sugden, Clerk, 1998). Считается, что SAPK участвуют, в основном, в апоптической сигнализации, тогда как p38 и ERK опосредуют клеточные ответы в рамках физиологической нормы реакции. Таким образом, наиболее вероятно, что именно р38 и/или ERK, а не SAPK, вовлечены в фосфорилирование белков цитоскелета и сократительного аппарата клеток гладких мышц. Анализ тканей мускульного желудка и аорты курицы с помощью специфических антител выявил наличие р38 и ERK киназ в этих тканях (рис.10). Отличительной особенностью тканей курицы является экспрессия только р42erk2 изоформы MAP-киназы, тогда как р44erk1 изоформа не обнаруживалась ни в мышечных, ни в немышечных (результаты не представлены) тканях. В изолированных гладкомышечных клетках аорты курицы содержание р38 MAP-киназы относительно р42erk2 было выше по сравнению с исходной тканью, что может быть следствием культивирования клеток (рис.10). В гладкомышечных клетках аорты курицы PDBu стимулировал фосфорилирование КЛЦМ и низкомолекулярной изоформы кальдесмона (77 kDa) (рис.11), а также активность эндогенной 13 erk2 р42 MAP-киназы (результаты не представлены). Преинкубация клеток с PD098059, ингибирующим активацию р42/р44erk1,2 киназ (Alessi et al., 1995), приводила к пропорциональному снижению как базального, так и PDBu-стимулированного фосфорилирования КЛЦМ и кальдесмона (рис.11). С другой стороны, 10 мкМ SB202190, специфический ингибитор р38 MAP-киназ (Jiang et al., 1996), полностью ингибировал PDBu-зависимое, но не базальное фосфорилирование КЛЦМ (рис.11). В этой концентрации SB202190 не блокировал активацию р42erk2 MAP-киназы, однако, сочетание 25 мкМ SB202190 с 50 мкМ PD098059 полностью подавляло активность MAP-киназ (результаты не показаны) и фосфорилирование КЛЦМ (рис.11). Это означает, что базальное и PDBu-зависимое фосфорилирование КЛЦМ в культивируемых гладкомышечных клетках полностью опосредуется р42erk2 и р38 MAP-киназами, соответственно. X Рис.10. Экспрессия различных МАР-киназ в гладкомышечных тканях и изолированных клетках. Экстракты мышцы мускульного желудка (1), аорты (2) и культивируемых гладкомышечных клеток аорты (3) курицы, а также аорты крысы (4) анализировали на содержание р38 (нижняя левая панель) и р42/р44erk1,2 (правая нижняя панель) МАР-киназ с помощью специфических анти-р38 и анти-р42/р44 антител, соответственно. Сравнимое количество белка, нанесенного на каждую дорожку, продемонстрировано окрашиванием актина (верхние панели). X Рис.11. Ингибиторный анализ фосфорилирования КЛЦМ и легкой изоформы кальдесмона в 32Р-меченных гладкомышечных клетках аорты курицы. Клетки 2 пассажа преинкубировали с 50 мкМ ингибитора р42/р44erk1,2 PD098059 (PD), с 25 или 10 мкМ ингибитора р38 МАР-киназ SB202190 (SB) в течение 2 ч и стимулировали 2 мкМ PDBu в течение 15 мин. КЛЦМ и кальдесмон иммунопреципитировали из клеточных лизатов и анализировали с помощью ДСНПААГ (левые панели) и авторадиографии (правые панели). Напротив, PDBu-зависимое фосфорилирование кальдесмона не ингибировалось при совместном использовании PD098059 и SB202190 (рис.11). По-видимому, фосфорилирование этого белка в изолированных клетках аорты имеет сложный характер и MAP-киназы участвуют лишь в его базальном фосфорилировании. Предварительные данные фосфопептидного картирования кальдесмона изолированного из PDBu-стимулированных клеток предполагают значительный вклад протеинкиназы С и пока неустановленной транзиторной кальдесмон-киназной активности, описанной выше, в фосфорилирование этого белка. Таким образом, в отличие от КЛЦМ, фосфорилирование кальдесмона в культивируемых клетках и интактной гладкомышечной ткани может существенно различаться. Заключение и перспективы дальнейших исследований. Принято считать, что чувствительность сократительного аппарата к Ca2+ играет основную роль в PDBu-зависимом сокращении, а фосфорилирование ключевых регуляторных белков может опосредовать этот эффект PDBu (Rasmussen et al., 1987). Сложность установления механизмов, определяющих Ca2+чувствительность, связана, в большой степени, с отсутствием объекта, который можно было бы рассматривать в качестве ‘отрицательного контроля’. Действительно, анализ процессов, сопровождающих развитие и модуляцию тонического напряжения в данном типе мускулатуры, позволяет выявить лишь набор корреляций между ними. Количество таких корреляций прогрессивно возрастает с установлением новых путей внутриклеточной сигнализации и их взаимозависимости, тогда как выявление истинных механизмов тонуса требует строгого доказательства причинно-следственных взаимоотношений. Одним из подходов для отбора ‘существенных’ корреляций может быть сравнительный анализ фосфорилирования ключевых белков-регуляторов сокращения в тканях, проявляющих тоническую реакцию и не развивающих ее. В этом случае PDBu является одним из оптимальных модельных стимуляторов, который вызывает сильный тонический ответ сосудистой ткани, но не стимулирует сокращения фазной мускулатуры (рис.1). Подобная ситуация обуславливает поиск таких тканеспецифичных различий в фосфорилировании регуляторных белков, которые, в совокупности с результатами биохимического анализа последствий фосфорилирования, позволят 14 предположить их роль в развитии тонуса гладкой мускулатуры. Фосфорилирование трех таких белков-регуляторов сокращения in situ было исследовано в настоящей работе. Учитывая данные, полученные in vitro, можно сделать следующие выводы. 1) PDBu стимулирует фосфорилирование КЛЦМ только в тонической, но не фазной, гладкой мускулатуре в отсутствие механической нагрузки. Вероятнее всего, это фосфорилирование осуществляется MAP-киназой, ферментом, способным активировать КЛЦМ in vitro (Morrison et al., 1996), повышать уровень фосфорилирования РЛЦ миозина и активность сократительного аппарата (Klemke et al., 1997). Мы предполагаем, что фосфорилирование именно KRP-домена является важным для модуляции активности КЛЦМ. Выяснение молекулярных механизмов активации КЛЦМ путем фосфорилирования, а также их роли в обеспечении Ca2+- чувствительности тонической мускулатуры должно явиться предметом ближайших исследований. 2) В ткани фазной мускулатуры обнаружено транзиторное фосфорилирование кальдесмона, стимулируемое PDBu (рис.2). Наши предварительные результаты и данные других авторов указывают на его отсутствие в тонической мускулатуре (Adam et al., 1989). Дополнительные исследования необходимы для детального анализа тканеспецифичности этого явления. Идентификация транзиторной кальдесмон-киназы, соответствующих участков фосфорилирования белка и его функциональных последствий in vitro будут необходимы для понимания регуляторных аспектов этого фосфорилирования. Кроме того, наши данные не подтверждают существующей гипотезы о значительной роли MAP-киназы в регуляции функциональной активности кальдесмона in vitro (Krymsky et al., 1999). Таким образом, отсутствие эффекта фосфорилирования кальдесмона MAP-киназой на сокращение и Са2+- чувствительность, наблюдаемые в физиологических экспериментах (Nixon et al., 1995, Gorenne et al., 1998), получает биохимическое обоснование. 3) Различия PDBu-зависимого фосфорилирования KRP в фазных и тонических мышцах не повторяют различий в сократительном ответе этих тканей по принципу 'все или ничего’ (рис.3). Этот факт ставит под сомнение роль фосфорилирования KRP в изменении чувствительности сократительного ответа к Са2+. Однако, в силу общности модифицируемых участков, их детальная характеристика может оказаться важной для анализа фосфорилирования КЛЦМ. Вопрос о физиологической значимости фосфорилирования KRP остается в значительной степени неясным. KRP вызывает релаксацию пермеабилизованных гладких мышц (Sobieszek et al., 1998, Wu et al., 1998), а последующая стимуляция эндогенных цАМФ- и цГМФ-зависимых протеинкиназ ускоряет расслабление и коррелирует с увеличением уровня фосфорилирования KRP (Wu et al., 1998). Хотя фосфорилирование KRP представляется сходным в фазной и тонической мускулатуре, участие нескольких эффекторных протеинкиназ и отсутствие данных об их различной активности в этих типах мышц пока не позволяют исключить его роль в обеспечении более глубокой релаксации фазной мускулатуры. Возможно также, что фосфорилирование KRP необходимо для регуляции других, пока неизвестных, функций этого белка in vivo. В этой связи, многочисленные примеры белков, передающих сигналы внутрь клеточного ядра, указывают на существенную роль множественного, в том числе и последовательного, фосфорилирования в обеспечении их транслокации из цитозоля в ядро. Интересно, что последовательное фосфорилирование с участием именно MAP-киназы и GSK3 было обнаружено in vivo пока только для фактора теплового шока HSF-1 и связывается с регуляцией его транскрипционной активности (Chu et al., 1996). 4) Наконец, важным предметом дальнейших исследований является изучение роли фосфорилирования фосфатазы миозина и других специфичных для гладкой мускулатуры белков, таких как SM22 и кальпонин, в модуляции чувствительности сократительного ответа гладких мышц к Са2+. Авторы благодарны А.В.Лапшину за помощь в измерении изометрического сокращения, И.В.Назимову за сиквенирование пептида KRP и K.Forner за помощь в проведении массспектометрического анализа. Работа поддержана грантами РФФИ 99-04-49209, Wellcome Trust (АВВ) и HHMI 75195546901 (ВПШ). 15 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Adam L. P., Gapinski C. J., Hathaway D. R. 1992. Phosphorylation sequences in h-caldesmon from phorbol esterstimulated canine aortas. FEBS Lett. 302: 223-226. Adam L. P., Haeberle J. R., Hathaway D. R. 1989. Phosphorylation of caldesmon in arterial smooth muscle. J. Biol. Chem. 264: 7698-7703. Adam L. P., Hathaway D. R. 1993. Identification of mitogen-activated protein kinase phosphorylation sequences in mammalian h-caldesmon. FEBS Lett. 322: 56-60. Alessi D. R., Cuenda A., Cohen P., Dudley D. T., Saltiel A. R. 1995. PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen- activated protein kinase kinase in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 270: 27489-27494. Alvarez E., Northwood I. C., Gonzalez F. A., Latour D. A., Seth A., Abate C., Curran T., Davis R. J. 1991. Pro-LeuSer/Thr-Pro is a consensus primary sequence for substrate protein phosphorylation. Characterization of the phosphorylation of c-myc and c-jun proteins by an epidermal growth factor receptor threonine 669 protein kinase. J. Biol. Chem. 266: 15277-15285. Barany K., Polyak E., Barany M. 1992. Protein phosphorylation in arterial muscle contracted by high concentration of phorbol dibutyrate in the presence and absence of Ca2+. Biochim. Biophys. Acta 1134: 233-241. Boyle W. J., Van der Geer P., Hunter T. 1991. Phosphopeptide mapping and phosphoamino acid analysis by twodimensional separation on thin-layer cellulose plates. Methods Enzymol. 201: 110-149. Campbell G. R., Chamley J. H., Burnstock G. 1974. Development of smooth muscle cells in tissue culture. J. Anat. 117: 295-312. Chu B., Soncin F., Price B. D., Stevenson M. A., Calderwood S. K. 1996. Sequential phosphorylation by mitogenactivated protein kinase and glycogen synthase kinase 3 represses transcriptional activation by heat shock factor1. J. Biol. Chem. 271: 30847-30857. Cohen P., Holmes C. F. B., Tsukitani Y. 1990. Okadaic acid: a new probe for the study of cellular regulation. Trends Biochem. Sci. 15: 98-102. Collinge M. A., Matrisian P. E., Zimmer W. E., Shattuck R. L., Lukas T. J., Van-Eldik L. J., Watterson D. M. 1992. Structure and expression of a calcium-binding protein gene contained within a calmodulin-regulated protein kinase gene. Mol. Cell Biol. 12: 2359-2371. Dillon P. F., Aksoy M. O., Driska S. P., Murphy R. A. 1981. Myosin phosphorylation and the cross-bridge cycle in arterial smooth muscle. Science 211: 495-497. Gerthoffer W. T., Yamboliev I. A., Pohl J., Haynes R., Dang S., McHugh J. 1997. Activation of MAP kinases in airway smooth muscle. Am. J. Physiol. 272: L244-52. Gong M. C., Cohen P., Kitazawa T., Ikebe M., Masuo M., Somlyo A. P., Somlyo A. V. 1992. Myosin light chain phosphatase activities and the effects of phosphatase inhibitors in tonic and phasic smooth muscle. J. Biol. Chem. 267: 14662-14668. Gorenne I., Su X., Moreland R. S. 1998. Inhibition of p42 and p44 MAP kinase does not alter smooth muscle contraction in swine carotid artery. Am. J. Physiol. 275: H131-8. Gusev N. B., Vorotnikov A. V. 1993. Effect of phosphorylation and Ca2+-binding proteins on functioning of caldesmon, thin filament linked regulator of smooth muscle and non-muscle motility. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol. 11: 1-53. Haeberle J. R., Hathaway D. R., Smith C. L. 1992. Caldesmon content of mammalian smooth muscles. J. Muscle Res. Cell Motil. 13: 81-89. Huber P. A., Redwood C. S., Avent N. D., Tanner M. J., Marston S. B. 1993. Identification of functioning regulatory sites and a new myosin binding site in the C-terminal 288 amino acids of caldesmon expressed from a human clone. J. Muscle Res. Cell Motil. 14: 385-391. Ito M., Dabrowska R., Guerriero V., Jr., Hartshorne D. J. 1989. Identification in turkey gizzard of an acidic protein related to the C-terminal portion of smooth muscle myosin light chain kinase. J. Biol. Chem. 264: 13971-13974. Itoh H., Shimomura A., Okubo S., Ichikawa K., Ito M., Konishi T., Nakano T. 1993. Inhibition of myosin light chain phosphatase during Ca2+-independent vasocontraction. Am. J. Physiol. 265: C1319-C1324. Jiang Y., Chen C., Li Z., Guo W., Gegner J. A., Lin S., Han J. 1996. Characterization of the structure and function of a new mitogen-activated protein kinase (p38 ). J. Biol. Chem. 271: 17920-17926. Kamm K. E., Hsu L., Kubota Y., Stull J. T. 1989. Phosphorylation of smooth muscle myosin heavy and light chains. Effects of phorbol dibutyrate and agonists. J. Biol. Chem. 264: 21223-21229. Katoch S. S., Moreland R. S. 1995. Agonist and membrane depolarization induced activation of MAP kinase in the swine carotid artery. Am. J. Physiol. 269: H222-H229. Kimura K., Ito M., Amano M., Chihara K., Fukata Y., Nakafuku M., Yamamori B., Feng J., Nakano T., Okawa K., Iwamatsu A., Kaibuchi K. 1996. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rhokinase). Science 273: 245-248. Klemke R. L., Cai S., Giannini A. L., Gallagher P. J., de Lanerolle P., Cheresh D. A., de-Lanerolle P. 1997. 16 Regulation of cell motility by mitogen-activated protein kinase. J. Cell Biol. 137: 481-492. Komatsu S., Hosoya H. 1996. Phosphorylation by MAPKAP kinase 2 activates Mg2+-ATPase activity of myosin II. Biochem. Biophys. Res. Commun. 223: 741-745. Krymsky M. A., Chibalina M. V., Shirinsky V. P., Marston S. B., Vorotnikov A. V. 1999. Evidence against the regulation of caldesmon inhibitory activity by p42/p44erk mitogen-activated protein kinase in vitro and demonstration of another caldesmon kinase in intact gizzard smooth muscle. FEBS Lett. 452: 254-258. Kureishi Y., Kobayashi S., Amano M., Kimura K., Kanaide H., Nakano T., Kaibuchi K., Ito M. 1997. Rho-associated kinase directly induces smooth muscle contraction through myosin light chain phosphorylation. J. Biol. Chem. 272: 12257-12260. Marston S. B. 1995. Ca2+-dependent protein switches in actomyosin based contractile systems. Int. J. Biochem. Cell Biol. 27: 97-108. Menice C. B., Hulvershorn J., Adam L. P., Wang C. A., Morgan K. G. 1997. Calponin and mitogen-activated protein kinase signaling in differentiated vascular smooth muscle. J. Biol. Chem. 272: 25157-25161. Miura M., Iwanaga T., Ito K. M., Seto M., Sasaki Y., Ito K. 1997. The role of myosin light chain kinase-dependent phosphorylation of myosin light chain in phorbol ester-induced contraction of rabbit aorta. Pflug. Arch. 434: 685693. Morrison D. L., Sanghera J. S., Stewart J., Sutherland C., Walsh M. P., Pelech S. L. 1996. Phosphorylation and activation of smooth muscle myosin light chain kinase by MAP kinase and cyclin-dependent kinase-1. Biochem. Cell Biol. 74: 549-557. Murphy R. A. 1989. Special topic: contraction in smooth muscle cells. Annu. Rev. Physiol. 51: 275-283. Nixon G. F., Iizuka K., Haystead C. M., Haystead T. A., Somlyo A. P., Somlyo A. V. 1995. Phosphorylation of caldesmon by mitogen-activated protein kinase with no effect on Ca2+ sensitivity in rabbit smooth muscle. J. Physiol. 487: 283-289. Ozaki H., Gerthoffer W. T., Publicover N. G., Fusetani N., Sanders K. M. 1991. Time-Dependent Changes in Ca2+ Sensitivity During Phasic Contraction of Canine Antral Smooth Muscle. J. Physiol. 440: 207-224. Ozaki H., Ohyama T., Sato K., Karaki H. 1990. Ca2+-dependent and independent mechanisms of sustained contraction in vascular smooth muscle of rat aorta. Jap. J. Pharmacol. 52: 509-512. Paul R. J. 1990. Smooth muscle energetics and theories of cross-bridge regulation. Am. J. Physiol. 258: C369-C375. Porter A. C., Vaillancourt R. R. 1998. Tyrosine kinase receptor-activated signal transduction pathways which lead to oncogenesis. Oncogene 17: 1343-1352. Rasmussen H., Takuwa Y., Park S. 1987. Protein kinase C in the regulation of smooth muscle contraction. FASEB J. 1: 177-185. Redwood C. S., Marston S. B., Gusev N. B. 1993. The functional effects of mutations Thr673->Asp and Ser702>Asp at the Pro-directed kinase phosphorylation sites in the C- terminus of chicken gizzard caldesmon. FEBS Lett. 327: 85-89. Rembold C. M. 1992. Regulation of contraction and relaxation in arterial smooth muscle. Hypertension 20: 129-137. Rembold C. M., Murphy R. A. 1986. Myoplasmic calcium, myosin phosphorylation, and regulation of the crossbridge cycle in swine arterial smooth muscle. Circ. Res. 58: 803-815. Roach P. J. 1991. Multisite and hierarchal protein phosphorylation. J. Biol. Chem. 266: 14139-14142. Sato K., Leposavic R., Publicover N. G., Sanders K. M., Gerthoffer W. T. 1994. Sensitization of the contractile system of canine colonic smooth muscle by agonists and phorbol ester. J. Physiol. 481: 677-688. Shirinsky V. P., Birukov K. G., Vorotnikov A. V., Gusev N. B. 1989. Caldesmon150, caldesmon77 and skeletal muscle troponin T share a common antigenic determinant. FEBS Lett. 251: 65-68. Shirinsky V. P., Vorotnikov A. V., Birukov K. G., Nanaev A. K., Collinge M. A., Lukas T. J., Sellers J. R., Watterson D. M., Collinge M. 1993. A kinase-related protein stabilizes unphosphorylated smooth muscle myosin minifilaments in the presence of ATP. J. Biol. Chem. 268: 16578-16583. Shirinsky V. P., Vorotnikov A. V., Gusev N. B. 1999. Caldesmon phosphorylation and smooth muscle contraction. In: Molecular Mechanisms and their Disorder in Smooth Muscle Contraction. Austin TX: Landes Biosciense, 59-79. Silver D. L., Vorotnikov A. V., Watterson D. M., Shirinsky V. P., Sellers J. R. 1997. Sites of Interaction between kinase related protein and smooth muscle myosin. J. Biol. Chem. 272: 25353-25359. Singer H. A. 1990. Phorbol ester-induced stress and myosin light chain phosphorylation in swine carotid medial smooth muscle. J. Pharmacol. Exp. Ther. 252: 1068-1074. Singer H. A., Oren J. W., Benscoter H. A. 1989. Myosin light chain phosphorylation in 32P-labeled rabbit aorta stimulated by phorbol 12,13-dibutyrate and phenylephrine. J. Biol. Chem. 264: 21215-21222. Sobieszek A., Liebetrau C., Andruchov O. Y., Ruegg J. C. 1998. Telokin modulates relaxation and contraction rates of smooth muscle skinned fibres. J. Muscle Res. Cell Motil. 19: 311a. Somlyo A. P., Somlyo A. V. 1968. Vascular smooth muscle. I. Normal structure, pathology, biochemistry, and biophysics. Pharmacol Rev 20: 197-272. Somlyo A. P., Somlyo A. V. 1994. Signal transduction and regulation in smooth muscle. Nature 372: 231-236. 17 Stull J. T., Tansey M. G., Tang D.-C., Word R. A., Kamm K. E., Tang D. C. 1993. Phosphorylation of myosin light chain kinase: a cellular mechanism for Ca2+ desensitization. Mol. Cell Biochem. 127/128: 229-237. Sugden P. H., Clerk A. 1998. 'Stress-responsive' mitogen-activated protein kinases (c-Jun N-terminal kinases and p38 mitogen-activated protein kinases) in the myocardium. Circ. Res. 83: 345-352. Van Eyk J. E., Arrell D. K., Foster D. B., Strauss J. D., Heinonen T. Y., Furmaniak-Kazmierczak E., Cote_G. P., Mak A. S. 1998. Different molecular mechanisms for Rho family GTPase-dependent, Ca2+-independent contraction of smooth muscle. J Biol Chem 273: 23433-23439. Vorotnikov A. V. 1997. Kinase-related protein: a smooth muscle myosin-binding protein. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29: 727-730. Vorotnikov A. V., Shirinsky V. P., Gusev N. B. 1988. Phosphorylation of smooth muscle caldesmon by three protein kinases: implication for domain mapping. FEBS Lett. 236: 321-324. Vorotnikov A. V., Silver D. L., Sellers J. R., Watterson D. M., Shirinsky V. P. 1996. Kinase-related protein is phosphorylated both in vitro and in smooth muscle by mitogen-activated and cyclic AMP-dependent protein kinases. J. Muscle Res. Cell Motil. 17: 153a. Walsh M. P. 1994. Calmodulin and the regulation of smooth muscle contraction. Mol. Cell Biochem. 135: 21-41. Wu X., Haystead T. A., Nakamoto R. K., Somlyo A. V., Somlyo A. P. 1998. Acceleration of myosin light chain dephosphorylation and relaxation of smooth muscle by telokin. Synergism with cyclic nucleotide-activated kinase. J. Biol. Chem. 273: 11362-11369.
