SWorld – 18-27 December 2012

SWorld – 18-27 December 2012
http://www.sworld.com.ua/index.php/ru/conference/the-content-of-conferences/archives-of-individual-conferences/december-2012
MODERN PROBLEMS AND WAYS OF THEIR SOLUTION IN SCIENCE, TRANSPORT, PRODUCTION AND EDUCATION‘ 2012
УДК 577.15:663.12
Черно Н.К., Коваленко А.В., Шапкина К.И.
ПОЛУЧЕНИЕ И ЧАСТИЧНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕТА-ГЛЮКАНА
КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCESS CEREVISIE
Одесская национальная академия пищевых технологий, Украина, г.Одесса,
ул.Канатная 112, 65039
UDC 577.15:663.12
Cherno N.K., Kovalenko A.V., Shapkina K.I.
ISOLATION AND PARTIAL HYDROLYSIS OF THE BETA-GLUCAN OF
THE YEAST CELL WALLS SACCHAROMYCESS CEREVISIE
Odessa National Academy of Food Technologies, Ukraine, Odessa,
st. Kanatnaya 112, 65039
Разработан упрощенный метод получения β-глюкана клеточных стенок
дрожжей
Saccharomyces
водорастворимой
cerevisiae.
формы
Показана
глюкана
возможность
посредствам
получения
ограниченного
ферментативного гидролиза.
The simple method for isolating β-glucan from the cell walls of Saccharomyces
cerevisiae is developed. A water-soluble glucan was obtained by the limited
enzymatic hydrolysis of the water-insoluble glucan.
Ключевые
слова:
β-глюкан,
дрожжи,
ферментативный
гидролиз,
водорастворимый дрожжевой β-глюкан.
Key words: β-glucan, yeast, enzymatic hydrolysis, water-soluble yeast glucan.
Бета-глюканы – полисахариды, присутствующие в клеточных стенках
различных зерновых культур (овес, ячмень), водорослей, микроорганизмов и
грибов. В последние годы они привлекают к себе пристальное внимание как
иммуномодуляторы, вещества, обладающие онко- и радиопротекторными
свойствами.
Бета-глюканы различных источников имеют некоторые отличия в своей
структуре. Так например, зерновые β-глюканы имеют линейное строение
макромолекул, в состав которых входит блоки из остатков β-(1→4)- связанных
D-глюкопираноз,
разделенные
β-(1→3)-
связями.
Блочные
фрагменты
представляют собой три- либо тетрамеры, соотношение которых варьирует.
Бета-глюканы дрожжей и грибов, в отличие от зерновых глюканов, имеют
разветвленное строение. Основная цепь их макромолекул состоит из остатков
β-D-глюкопираноз, соединенных (1→3) гликозидными связями. К ней в
положениях О-6 подсоединяются боковые ответвления, частота и размер
которых вариабельны [1].
Считается,
что
наиболее
важным
физиологическим
эффектом
β-глюканов является их способность влиять на иммунную систему. Механизм
действия β-глюканов заключатся в активации иммунной системы человека.
Особенностью
иммуномодулирующего
действия
является
адекватное
повышение активности иммунной системы без ее чрезмерной стимуляции, что
нередко служит причиной возникновения аутоиммунных заболеваний [2].
Биологическая действие β-глюканов определяется многими факторами:
типом
и
конфигурацией
разветвленностью
и
связей
конформацией
между
остатками
макромолекулы,
моносахаридов,
степенью
ее
полимеризации; растворимостью в воде и др. [3]. Установлено, что
растворимые β-глюканы обладают большей физиологической активностью, чем
нерастворимые. Показано, что, в сравнении с другими глюканами, β-(1→3),
(1→6)-D-глюкан дрожжей Saccharomyces cerevisiae проявляет наибольшую
физиологическую активность [4].
В клеточных оболочках дрожжей β-глюкан находится во внутреннем слое
клеточной стенки [5], где он соединен с белком, мананом и хитином. Эти
компоненты связаны ковалентными связями, что усложняет технологию
получению глюкана клеточной стенки.
Существуют различные подходы к выделению β-глюкана из клеточной
стенки хлебопекарных дрожжей. Они, преимущественно, основаны на
разрушении клеточной оболочки путем физического воздействия (обработка
ультразвуком, разрушение клеток дрожжей с помощью бус Балотини и др.) с
последующей
обработкой
щелочью
или
ферментами
для
удаления
сопутствующих веществ. Имеются данные о получении глюкана клеточной
стенки путем непосредственной обработки биомассы дрожжей ферментными
препаратами [6], которые способствуют декструкции сопутствующих ему
соединений.
Описан
последовательную
метод
обработку
получения
β-глюкана,
дрожжей
растворами
предусматривающий
гидроксида
натрия,
уксусной кислоты и ацетата натрия с последующим автоклавированием для
удаления белка, гликогена и маннана [7]. Однако эти способы трудоемки и
энергозатратны.
Вышеизложенное определяет актуальность данной работы, посвященной
разработке упрощенного способа получения дрожжевого β-глюкана и его
наиболее физиологически активной – водорастворимой формы.
Сущность разработанного метода заключается в использовании для
разрушения клеточных оболочек обработки дрожжей пероксидом водорода и
последующего удаления сопутствующих глюкану соединений посредствам их
ступенчатой экстракции из дезинтегрированной дрожжевой биомассы. В
экспериментах по дезинтеграции клеточных оболочек использовали 3 %, 15 %
и 24 % растворы H2O2, варьируя продолжительность обработки и массовое
соотношение дрожжи–раствор пероксида водорода. Дезинтегрированную
дрожжевую массу промывали дистиллированной водой и центрифугировали.
Для удаления белка и маннана твердый остаток обрабатывали 3%-ным
раствором NaOH в течение 30 минут при температуре 18 – 22 °С, а затем 6%ным раствором NaOH в течение 60 минут при температуре 50 – 60 °С. Смесь
центрифугировали, твердую фазу суспендировали в дистиллированной воде
добавляли 0,1 н раствор НСl до рН среды 5,0. Надосадочную жидкость
отделяли центрифугированием, остаток суспендировали в 0,5 н растворе
уксусной кислоты и нагревали до температуры 75 °С для удаления гликогена,
затем промывали несколько раз дистиллированной водой и высушивали.
Содержание
углеводной
составляющей
в
получаемых
продуктах
варьировало в диапазоне 82,6 – 97,3 %, белка 0 – 14,5 %, гликоген отсутствовал.
Выход продуктов составлял 8,1 – 19,7 %.
Установлено, что условиями обработки дрожжей пероксидом водорода,
обеспечивающими высокий выход продукта в сочетании с низким содержанием
в нем белка, являются следующие: концентрация H2O2 в растворе 3 %,
соотношение дрожжи – раствор пероксида водорода 1:2, продолжительность
обработки 180 минут. При этих условиях выход целевого продукта – 14,7 %,
содержание в нем β-глюкана – 89,7 %, белка – 8,3 %.
Получить глюкан, не содержащий сопутствующие соединения, возможно
обработкой сырья 24 % раствором H2O2 при массовом соотношении дрожжи –
раствор пероксида водорода 1:2 и продолжительности обработки 300 минут.
Выход – 8,1 %, содержание глюкана 97,3 %, белок отсутствует.
Для
получения
водорастворимой
формы
глюкана
использовали
ферментный препарат, обладающий эндо-1,3-β-глюканазной активностью.
Ферментативный гидролиз проводили при Т = 50 °С и рН 4,5, варьируя
концентрацию фермента в растворе, продолжительность ферментолиза и
соотношение фермент: субстрат (E:S). По окончании процесса смесь кипятили
в
течение
15
минут
для
инактивации
фермента,
охлаждали
и
центрифугировали. Накопление водорастворимых углеводов – продуктов
частичного гидролиза глюкана, определяли антроновим методом. Степень
перехода в раствор твердой фазы в условиях эксперимента колебалась в
диапазоне 45 – 91% (табл.1).
Таблица 1
Выход водорастворимых продуктов, % от массы исходного
полисахарида
№
Концентрация Продолжительность
образ-
фермента,
ца
мг/см3
1
0,25
ферментолиза, ч
Соотноше-
Выход
ние E:S
водорастворимых
углеводов, %
24
1:15
45,3
2
3
48
4
5
72
6
7
0,50
24
8
9
48
10
11
72
12
1:30
52,1
1:15
63,2
1:30
67,3
1:15
91,5
1:30
87,0
1:15
45,1
1:30
45,8
1:15
61,5
1:30
71,3
1:15
80,7
1:30
81,5
Установлено, что варьируя условия ферментативного гидролиза, можно
получить фрагментированный водорастворимый глюкан, молекулярная масса,
которая находится в интервале от 0,5 120 кДа и выше. Так например,
ферментативный гидролиз исходного глюкана при концентрации фермента в
растворе
0,25
мг/см3,
соотношение
E:S=1:15
и
продолжительности
ферментолиза 72 часа позволяет получить водорастворимые фрагменты, в
которые содержание фракции с молекулярной массой 1 – 30 кДа, считающейся
наиболее физиологически активной [8], составляет 67,9 % от сухой массы
глюкана клеточных стенок.
Таким образом, разработан простой в применении способ получения βглюкана клеточных стенок хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae с
высоким выходом. Установлены условия преобразования β-глюкана в
водорастворимую форму с применением ограниченного ферментативного
гидролиза.
Литература:
1. Syed, H. A. The world of β‐glucans – a review of biological roles,
applications and potential areas of research / H. A. Syed // Thesis for the requirement
of master of Science – Medical Biology. – 2009. – P. 13-18.
2. Chen, Jiezhong. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans /
Jiezhong Chen, Robert Seviour // Mycological research. – 2007. – P. 635–652.
3. Беседнова, Н. Н. Иммунотропные свойства (1→3), (1→6)-β-D-глюканов /
Н. Н. Беседнова, Л. А. Иванушко, Т. Н. Звягинцева Л. А. Елякова //
Антибиотики и химиотерапия. – 2000. – № 5. – С. 37– 44.
4. Petravic-tominac, Vlatka Biological effects of yeast β-glucans / Vlatka
Petravic-tominac, Vesna Zechner-krapan, Slobodan Grba, Siniša Srecec and all //
Agriculturae Conspectus Scientificus – 2010. – Vol. 75. – 149–158.
5. Catalli, A. «Chitin and β-glucan polysaccharides as immunomodulators of
airway inflammation and atopic disease» / A. Catalli, M. Kulka // Metabolic &
Immune Drug Discovery. – 2010. – Vol. 4. – P. 175-189.
6. Пат. 2216595 МКП C12P19/04, C08B37/00, C12N1/16 A61K31/716.
Способ получения бета-глюкана клеточной стенки дрожжей / Тонева-Давидова
Е.Г.; заявитель и патентообладатель закрытое акционерное общество "Торговозакупочная фирма ВАИГ"№ 2002130728/13: Заяв. 18.11.2002; опубл. 20.11.2003,
7. Методы химии углеводов / под ред. Н. К. Кочеткова. – М.: Мир, 1967. –
125 с.
8. Patent 6143883, Water-soluble low molecular weight beta-glucans for
modulating immunological responses in mammalian system / Lehmann, Joachim
(Scottsdale, AZ), Kunze, Rudolf (Berlin, DE). – №09/224145; Filing Date
12.31.1998; Publication Date 11.07.2000. – 8с.
References:
1. Syed, H. A. The world of β‐glucans – a review of biological roles,
applications and potential areas of research / H. A. Syed // Thesis for the requirement
of master of Science – Medical Biology. – 2009. – P. 13-18.
2. Chen, Jiezhong. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans /
Jiezhong Chen, Robert Seviour // Mycological research. – 2007. – P. 635–652.
3. Besednova N. N., Immynotropnue svoistva (1→3), (1→6)-β-D-glucan / N.
N. Besednova, L. A. Ivanyshko, T. N. Zvaigiceva, L. A. Elaikova //Antibiotiki I
himioterapiai. – 2000. – № 5. – S. 37– 44.
4. Petravic-tominac, Vlatka Biological effects of yeast β-glucans / Vlatka
Petravic-tominac, Vesna Zechner-krapan, Slobodan Grba, Siniša Srecec and all //
Agriculturae Conspectus Scientificus – 2010. – Vol. 75. – 149–158.
5. Catalli, A. «Chitin and β-glucan polysaccharides as immunomodulators of
airway inflammation and atopic disease» / A. Catalli, M. Kulka // Metabolic &
Immune Drug Discovery. – 2010. – Vol. 4. – P. 175-189.
6. Pat. 2216595 MKP C12P19/04, C08B37/00, C12N1/16 A61K31/716. Sposob
polycheniai
beta-glucana
kletochoi
stenki
Toneva-Davidova
E.G./
№
2002130728/13: Zaaiv. 18.11.2002; opybl. 20.11.2003.
7. Metod himai yglevodov / pod red. N. K. Kochetkov. M.: Mir, 1967. – 125 s.
8. Patent 6143883, Water-soluble low molecular weight beta-glucans for
modulating immunological responses in mammalian system / Lehmann, Joachim
(Scottsdale, AZ), Kunze, Rudolf (Berlin, DE). – №09/224145; Filing Date
12.31.1998; Publication Date 11.07.2000. – 8с.