Диссертация Аблаева А.Р. размещено 14.10.2014 г., 1.60 МБ
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ На правах рукописи АБЛАЕВ АЛЕКСЕЙ РАВИЛЬЕВИЧ Процессы гидролиза лигноцеллюлозосодержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель: д.т.н., проф. В.М. Емельянов Казань – 2014 Содержание Введение ............................................................................................................. 4 1. Лигноцеллюлозосодержащее сырье и методы его конверсии .................. 7 1.1 Ресурсы лигноцеллюлозосодержащей биомассы и характеристика её химического состава ............................................................................................... 7 1.2 Предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья ...... 11 1.2.1 Механическая предобработка лигноцеллюлозосодержащего сырья .............................................................................................................................. 13 1.2.2 Химическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья ............................................................................................ 15 1.2.3 Биологическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья ............................................................... 18 1.2.4 Физико-химическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья ............................................................... 19 1.3 Микробиологическая конверсия продуктов гидролиза лигноцеллюлозсодержащего сырья в анаэробных условиях ........................... 22 1.3.1 Продуценты масляной кислоты ......................................................... 22 1.3.2 Метаболический путь синтеза масляной кислоты кислоты бактериями рода Clostridium............................................................................. 25 1.3.3 Биосинтез масляной кислоты с применением питательных сред, содержащих гидролизаты растительного сырья ............................................ 26 1.3.4 Оптимизация процессов биосинтеза масляной кислоты ................. 28 1.3.5 Влияние рН среды на биосинтез масляной кислоты ....................... 29 1.3.6 Удаление продуктов брожения из реакционной среды ................... 30 1.3.7 Применение различных способов культивирования ....................... 31 1.3.8 Пути создания и оптимизации высокоэффективных штаммовпродуцентов масляной кислоты ....................................................................... 32 1.4 Математическое моделирование кинетики предварительной обработки лигноцеллюлозосодержащего сырья минеральными кислотами .................... 34 2. Материалы и методы ................................................................................... 37 2 2.1 Характеристика объектов исследования ................................................. 37 2.2 Проведение предварительной обработки объектов исследования ....... 37 2.3 Проведение ферментативного гидролиза................................................ 40 2.4 Применяемые штаммы .............................................................................. 40 2.5 Восстановление коллекционных культур из лиофилизированного материала ............................................................................................................... 42 2.6 Условия культивирования ........................................................................ 43 2.7 Общие методы анализа ............................................................................. 44 2.7.1 Определение содержания редуцирующих веществ ......................... 44 2.7.2 Газохроматографический анализ ....................................................... 45 2.7.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография............................... 45 2.7.4 Методы определения активности ферментного комплекса ............ 46 3. Исследование процессов гидролиза лигноцеллюлоз-содержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях ........... 51 3.1 Предварительная обработка березового опила разбавленной сернистой кислотой ................................................................................................................. 51 3.2 Исследование процессов ферментативного гидролиза березового опила ....................................................................................................................... 61 3.3 Изучение кинетики предобработки свекловичного жома раствором сернистой кислоты в диапазоне температур 200-230 °С .................................. 72 3.4 Математическое моделирование кинетики выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома сернистой кислотой............... 80 3.5 Микробиологическая конверсия гидролизатов растительного сырья в анаэробных условиях ............................................................................................ 90 3.6 Технологическая линия гидролиза лигноцеллюлозсодержащего сырья и микробиологической конверсии продуктов в анаэробных условиях ........ 101 Заключение ..................................................................................................... 103 Список использованной литературы ........................................................... 105 3 Введение Переработка возобновляемого растительного сырья в промышленно важные химические вещества, в частности органические кислоты, представляет большой практический интерес. Масляная кислота широко применяется в различных отраслях промышленности: для производства пластмасс, пластификаторов, лаков, духов, фармацевтических препаратов и дезинфицирующих средств. Химический синтез масляной кислоты из нефтепродуктов себестоимости применяется производства Микробиологический главным и синтез образом доступности масляной из-за приемлемой исходных материалов. кислоты с использованием маслянокислых бактерий рода Clostridium в настоящее время привлекает все больше внимания из-за растущих цен на нефть, истощения ее природных запасов и необходимости защиты окружающей среды от загрязнения продуктами химического синтеза. Экономически целесообразно получать масляную кислоту методом сбраживания углеводов, содержащихся в дешевом и широко распространенном растительном сырье, в частности в отходах сельского хозяйства, лесной и лесоперерабатывающей промышленности. Основными ресурсными источниками растительной биомассы являются: древесина, отходы от ее заготовки и переработки, сельскохозяйственные, а также бытовые отходы. Многотоннажной лигноцеллюлозосодержащего сырья в ресурсной России базой являются отходы лесозаготовок, которые составляют 40-60 % перерабатываемой древесины, используемые пока только на 20 %. Для России лигноцеллюлозосодержащего сырья большой интерес в качестве представляют лиственные породы древесины, в первую очередь береза, так как существует развитая инфраструктура сбора и переработки данного вида сырья на 4 целлюлозно-бумажных комбинатах и фанерных заводах, а также серьезная проблема утилизации отходов этих производств. Перспективным вторичным ресурсом перерабатывающей промышленности является свекловичный жом. Более 40 % посевов сахарной свеклы в мире приходится на Россию. Общий объём производства сырого свекловичного жома в 2013 году составил 31 млн. 855 тыс. тонн. Свекловичный жом может включаться в комбикорма как один из компонентов, однако, высокая стоимость транспортировки, а также низкие сроки хранения не позволяют использовать свежий жом в полном объеме. Микроорганизмы не способны эффективно утилизировать полисахариды растительной биомассы без предварительного расщепления последних до моно- и олигосахаридов. Гидролиз слабыми кислотами и ферментами является одним из возможных путей получения углеводов из растительной биомассы. Перспективность применения сернистой кислоты в качестве гидролизующего агента для предобработки растительного сырья была продемонстрирована сотрудниками лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» ФГБОУ ВПО «КНИТУ» на примере пшеничной соломы, отрубей и свекловичного жома. Показана более высокая эффективность сернистой кислоты при гидролизе пшеничной соломы по сравнению с серной и возможность её регенерации за счет тепла, запасенного в гидролизате. Таким образом, разработка технологии переработки березового опила и свекловичного жома с применением сернистой кислоты и целлюлолитического ферментного комплекса, а также оценка возможности микробиологической конверсии полученных гидролизатов в анаэробных условиях является актуальной задачей. Целью настоящей работы являлось исследование и оптимизация процессов гидролиза березового опила и свекловичного жома, а также 5 конверсия продуктов гидролиза в анаэробных условиях бактериями Clostridium butyricum и Сlostridium tyrobutyricum. В соответствии с целью поставлены следующие задачи: 1. Определить оптимальные условия обработки березового опила разбавленной сернистой кислотой при температурах выше 190оС и охарактеризовать моносахаридный состав полученных гидролизатов. 2. Определить оптимальные условия ферментативного гидролиза березового опила, предварительно обработанного разбавленной сернистой кислотой. 3. Исследовать гидролиз свекловичного жома при температурах свыше 190°С и охарактеризовать моносахаридный состав полученных гидролизатов. 4. Разработать математическую модель выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой. 5. Оценить эффективность биосинтеза масляной, молочной кислот и бутанола Clostridium butyricum ВКПМ В-9617, В-9619 и Clostridium tyrobutyricum использовании в ферментативных ВКПМ качестве В-10406, субстратов гидролизатов березового В-9615 кислотных опила при и и свекловичного жома. Автор выражает благодарность к.т.н., ассистенту кафедры химической кибернетики ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» Хариной Марии Владимировне за помощь в выполнении экспериментальных исследований. 6 1. Лигноцеллюлозосодержащее сырье и методы его конверсии 1.1 Ресурсы лигноцеллюлозосодержащей биомассы и характеристика её химического состава Благодаря обилию, низкой стоимости и высокому содержанию углеводов (60-70% от абсолютно сухого вещества сырья), близкому к содержанию углеводов в зерновых культурах, лигноцеллюлозная биомасса является привлекательным сырьем для деполимеризации и биоконверсии с получением топлива и ценных химических продуктов. Производство ценных продуктов из лигноцеллюлозосодержащей биомассы стало одним из основных направлений интенсивных исследований и разработок в последние десятилетия [1-7]. Биомасса состоит в основном из целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина, зольных веществ и белков (таблица 1). Таблица 1 - Состав клеточной стенки возобновляемого растительного сырья (% от абсолютно сухого вещества (АСВ)) [1-6] Биомасса Лигнин, % Пшеничная солома Стебли кукурузы Рисовая солома Жом сахарного тростника Листья сахарного тростника Бамбук Мискантус Береза Свекловичный жом Береза 8,3 13,6 25,0 Гемицел- Целлюлоза, люлоза, % % 28,2 43,7 26,3 43,3 25,0 38,0 Другое, % 19,8 16,7 12,0 21,1 27,0 45,5 6,8 18,0 25,0 45,0 12,0 28,1 7,6-11,5 24,6 23,5-33,8 46,7 41,2-52,9 0,6 27,7 3,0 72,9 24,0 0,1 12,1- 19,10 21,7-28,7 47,0 4,0 Состав различных видов лигноцеллюлозы может значительно варьировать в зависимости от типа клеточной стенки и условий 7 произрастания биомассы. Например, содержание глюкана, лигнина или ксилана в кукурузных стеблях разного урожая или разной территории может отличаться на 10 % в абсолютных значениях из-за таких факторов, как год урожая и условия окружающей среды [2]. Основными являются ресурсными древесина, отходы источниками от ее растительной заготовки и биомассы переработки, сельскохозяйственные отходы растениеводства, а также бытовые отходы. Отходы лесозаготовок составляют 40-60 % от заготавливаемой древесины в России (рисунок 1). Рисунок 1 – Располагаемые (1), действительные (2) и экономически доступные (3) ресурсы древесной биомассы в России [7] До 20 % ресурсов древесной биомассы в России составляют отходы, образующиеся при лесопереработке, используемые пока только на 20 %. На 1 м3 вывезенной из леса древесины приходится до 500 кг отходов биомассы в виде пней, ветвей, древесной зелени, некондиционной древесины [7, 8]. По приближенным оценкам, суммарное годовое количество отходов лесопромышленного комплекса составляет свыше 200 млн м3. Отходы сельскохозяйственного производства составляют 200-250 млн м3 в год. Далее 8 древесное сырье теряется при лесопилении, деревообработке и химической переработке. Образующиеся отходы лесозаготовок в России используются не в полной мере, лишь частично в основном в целлюлозно-бумажной и лесной промышленности. В России могут использоваться отходы переработки лиственных пород древесины, в первую очередь березовый опил, так как существует развитая инфраструктура сбора и переработки данного вида сырья на ЦБК и фанерных заводах, а также серьезная проблема утилизации отходов этих производств. В работе [9] был оценен объём генерации соломы и свекловичного жома в РФ. Российский агропромышленный комплекс ежегодно производит 773 млн. т отходов (260 млн. т по сухому веществу). Из них 220 млн. т (150 млн. т по сухому веществу) приходится на растениеводство и 30 млн. т (14 млн. т по сухому веществу) – на отходы перерабатывающей промышленности. Отходы сельского хозяйства составляют 100-150 % объемов урожаев полевых культур, таких как сахарная свекла, помидоры, картофель, соя, пшеница, рис и другие зерновые. При сборе урожая зерновых культур биологический выход его нетоварной части (соломы и половы) определяется произведением количества собранного зерна на множитель, который зависит от вида зерновой культуры: для озимой ржи –1,6-2,0; яровой пшеницы и овса – 1,3-1,5, ячменя – 1,2; кукурузы – 2,5; подсолнечника – 2,8). Так при сборе в 2012 году в Республике Татарстан 3,2 млн. т зерна на полях сельскохозяйственных предприятий образовалось в среднем 5,0 млн. т соломы. Сахарная свекла – важнейшая техническая культура, сырье для сахарной промышленности. Основной объем сахарной свеклы, выращиваемой в России, перерабатывается на российских сахарных заводах. Более 40% посевов сахарной свеклы в мире приходится на Россию [10]. Общий объём производства сырого свекловичного жома в 2013 году 9 составил 31 млн. 855 тыс. тонн. Из них 17 млн. 741 тыс. тонн производят в Центральном федеральном округе, что составляет 55,7 % от всего производства в стране, а также в Южном федеральном округе 8 млн. 103 тыс. тонн (25,4 % всего производства) и Приволжском федеральном округе 4 млн. 820 тыс. тонн (15,1 % всего производства) [11]. Таким образом, предприятия, перерабатывающие сахарную свеклу, в основном сосредоточены в трёх федеральных округах. Средний выход сахара при переработке сахарной свеклы составляет 10-12 %, при этом образуется 80-84 % сырого свекловичного жома, богатого полисахаридами [12]. Свекловичный жом обладает высокой кормовой ценностью. Его скармливают сельскохозяйственным животным в свежем и консервированном виде. Однако в свежем виде может скармливаться не более 30-40 % выработанного жома. Несмотря на высокое содержание углеводов, жом не удовлетворяет даже минимальных потребностей животных в азотистых веществах и витаминах ввиду низкого содержания сырого протеина (до неудовлетворительного 3 % от соотношения содержания кальция и сухих веществ) фосфора [3, и 12]. Свекловичный жом может включаться в комбикорма как один из компонентов, однако, высокая стоимость транспортировки, а также низкие сроки хранения не позволяют использовать свежий жом в полном объеме. Продукты конверсии полисахаридов свекловичного жома могут применяться для производства биоэтанола, кормовых дрожжей, лизина и др. В России свекловичный жом является одним из наиболее перспективных вторичных ресурсов сельскохозяйственного производства. Анализ литературных источников показал, что крупнотоннажными и перспективными видами лигноцеллюлозосодержащего сырья в России являются отходы деревообработки, в частности березовый опил, а также жом сахарной свеклы. 10 1.2 Предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья Лигноцеллюлозное сырье требует предварительной обработки, для высвобождения моносахаридов, содержащихся в целлюлозных волокнах, встроенных в гетероматрицы растительной клеточной стенки. Предварительная лигноцеллюлозную обработка биомассу из - процесс, нативной преобразующий формы, любую устойчивой к ферментному гидролизу, в форму, эффективную для ферментативного гидролиза [13]. Предварительная обработка является одной из наиболее важных стадий переработки лигноцеллюлозы с биомассы, увеличением при этом площади изменяется доступной структура поверхности, происходит декристаллизация, частичная деполимеризация целлюлозы, растворение гемицеллюлоз и/или лигнина, изменение структуры лигнина [10]. Ключевым фактором в определении оптимального пути предобработки для каждого типа лигноцеллюлозной биомассы является относительное содержание целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Стойкость биомассы при переработке напрямую связана со свойствами конкретного сырья. Факторы, которые способствуют устойчивости биомассы включают [14]: кристалличность и степень полимеризации целлюлозы; площадь доступной поверхности (или пористость); степень экранирования целлюлозы лигнином; степень оборачивания целлюлозы гемицеллюлозами; прочность волокна. Чем больше удалено лигнина из биомассы, тем более эффективен последующий ферментативный гидролиз биомассы. Высококристаллическая целлюлоза является менее доступной для ферментолиза, чем аморфная [15]. Доступность целлюлозы для ферментов является одним из наиболее важных 11 ограничивающих факторов ферментативного гидролиза после минимизации влияния лигнина [16-18]. Идеальным результатом предобработки биомассы является получение субстрата, который легко подвергается гидролизу без образования продуктов разложения сахаров и ингибиторов ферментации. Оценка процессов предобработки биомассы определяется «фактором жесткости процесса», который учитывает совокупное влияние температуры, pH и длительности предобработки. «Фактор жесткости» используется в качестве сравнительной характеристики в работах по анализу результатов предобработки биомассы, но не дает точной информации о «жесткости» условий процесса. Другими словами, он применяется для приблизительной оценки [19]. Оценка процесса предобработки биомассы должна включать в себя следующие этапы [18-29]: анализ содержания сахаров в жидкой фазе, и содержания углеводов в нерастворимой твердой фазе после предобработки; ферментативный гидролиз подвергшихся вымыванию и оставшихся в осадке частиц твердой фазы; оценка возможности использования ферментолизатов и жидкой фазы, образующейся в процессе предобработки, в качестве компонента питательных сред для культивирования микроорганизмов. В настоящее время используются различные методы предобработки лигноцеллюлозной биомассы при подготовке ее к дальнейшему ферментативному гидролизу. Эти методы подразделяются на физические, химические, биологические или их комбинацию [30-33]. 12 1.2.1 Механическая предобработка лигноцеллюлозосодержащего сырья Грубое измельчение, расщепление, резка, дробление и размалывание представляют собой различные методы уменьшения размера частиц лигноцеллюлозной биомассы [34]. В результате увеличивается удельная поверхность, снижаются степень полимеризации и кристалличность целлюлозы [35]. В ходе сбора и подготовки лигноцеллюлозной биомассы древесные стволы перерабатываются до фрагментов грубого измельчения с размером 10-50 мм. На стадии расщепления размер частиц биомассы уменьшается до 10-30 мм, после дробления и размалывания – до 0,2-2 мм. Установлено, что дальнейшее измельчение биомассы до частиц размером менее 0,4 мм не оказывает значительного влияния на скорость и эффективность гидролиза [36]. Целью расщепления сырья является снижение барьеров тепло- и массопередачи. Дробление и размалывание более эффективно уменьшают размер частиц и степень кристалличности целлюлозы, что может быть обусловлено сдвиговыми усилиями, которые создаются в ходе данных процессов [34]. Способ и продолжительность размалывания в сочетании с типом биомассы определяют степень увеличения удельной поверхности, конечную степень полимеризации и кристалличность целлюлозы. В работе [35] показано, что вибрационная шаровая мельница более эффективна, чем обычная мельница для снижения степени кристалличности целлюлозы в щепе осины или древесины хвойных пород. Дисковое размалывание до волокон более эффективно для интенсификации гидролиза целлюлозы, чем измельчение в молотковой дробилке, несмотря на получение в последней более мелких частиц [37]. Энергозатраты на механическое измельчение лигноцеллюлозной биомассы зависят от ее характеристик и требуемого конечного размера частиц. Для древесины требуются большие энергозатраты, чем для отходов сельского хозяйства [38]. Операция измельчения используется в 13 большинстве исследовательских работ по гидролизу, но мало сведений дается о характеристиках сырья и энергозатратности данного процесса [39, 40]. Принимая во внимание высокие энергозатраты на осуществление измельчения сырья в промышленном масштабе [41] и рост спроса на энергию, маловероятно, что данная операция экономически обоснована (таблица 2). Таблица 2 - Затраты электроэнергии на механическую обработку сельскохозяйственных лигноцеллюлозных материалов до различной степени измельчения [42, 43] Лигноцеллюлозный материал Конечный размер, мм Энергозатраты, кВтч/т Измельчение Измельчение резкой дроблением 130 130 80 120 50 115 25 95 Твердая древесина 1,60 2,54 3,2 6,35 Солома 1,60 2,54 7,5 6,4 42 29 Кормовая кукуруза 1,60 3,20 6,35 9,5 Нет данных 20 15 3,2 14 9,6 Нет данных Нет данных Однако, поскольку измельчение сырья может проводиться как до химической предобработки, так и после нее, было показано, что измельчение после выполнения данной операции значительно снижает энергозатраты на измельчение, уменьшает стоимость разделения твердой и жидкой фаз, поскольку легко отделить щепу, прошедшую предобработку, позволяет исключить из процесса энергозатратное смешение предобработанной 14 биомассы, снижает соотношение жидкой фазы к твердой, не приводит к образованию ингибиторов [44, 45]. Среди других форм физической предобработки следует отметить использование гамма-излучения [46], приводящего к увеличению удельной поверхности частиц биомассы и снижению степени кристалличности. Данный метод, несомненно, крайне дорог в промышленном масштабе и представляет огромный риск с позиции производственной безопасности и охраны окружающей среды. 1.2.2 Химическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья По литературным данным, химические соединения, такие как кислоты, щелочи, органические растворители и ионные жидкости, оказывают значительное воздействие на исходную структуру лигноцеллюлозной биомассы [47, 48]. Предобработка такими основаниями как NaOH, KOH, Ca(OH)2, гидразин и безводный аммиак, приводит к набуханию биомассы, увеличению ее внутренней поверхности и снижению степени полимеризации и кристалличности целлюлозы. Щелочная предобработка приводит к разрушению структуры лигнина и разрыву связей между лигнином и другими углеводными фракциями лигноцеллюлозной биомассы, увеличивая, таким образом, доступность углеводов в матрице биомассы. Реакционная способность остаточных полисахаридов повышается с извлечением лигнина. В ходе щелочной предобработки также удаляются ацетил и другие заместители уроновой кислоты, снижающие доступность поверхности целлюлозы для ферментов [49, 50]. Большая часть щелочи, однако, расходуется в процессе предобработки. Щелочная предобработка наиболее эффективна для биомассы с малым содержанием лигнина, такой как отходы 15 сельского хозяйства, с ростом содержания лигнина в биомассе ее эффективность снижается [47-50]. Предварительная обработка слабыми кислотами облегчает доступность целлюлазных ферментов для максимизации выхода сахаров Слабокислотный гидролиз является простым и быстрым [5]. способом получения гемицеллюлозных гидролизатов. Эти гидролизаты содержат, главным образом, ксилозу (80% от содержания сахара в гемицеллюлозной фракции), арабинозу, глюкозу, галактозу и маннозу в сочетании с побочными продуктами – ингибиторами, получающимися из клеточной стенки, такими как фураны, фенолы, слабые кислоты и др. [8], [9], [10]. Кислоты используются для гидролиза биомассы уже более 100 лет. Использование двухстадийного гидролиза серной кислотой для анализа лигнина датируется началом 20-го века, хотя использование концентрированной кислоты для получения сахаров было изобретено ещё в начале 19 века. Первым, кто использовал серную кислоту для гидролиза древесины и выделения лигнина, был Класон в 1906 году [21]. Кроме того, слабыми кислотами можно растворить гемицеллюлозу. Преимуществами данного вида предварительной обработки являются повышение ферментативной доступности целлюлозы и значительно увеличенная добавленная стоимость конечной продукции [23]. Серная и соляная кислоты широко используются для слабокислотного гидролиза. В работе [24] была исследована предобработка кукурузной кочерыжки слабой серной кислотой H2SO4. Оптимальными условиями предобработки являлись: концентрация серной кислоты 0,5 % масс, температура 122 °С, продолжительность обработки 20 мин. При этих условиях структурная целостность кукурузной кочерыжки изменилась, микрофибриллы целлюлозы стали более доступными для ферментов. Выход сахаров составил 80 % масс, при низкой дозировке фермента (0,024 г фермента на 1 г предварительно обработанных кукурузных початков). 16 Также находит применение фосфорная кислота, которая менее токсична, чем другие кислоты [25]. Кроме того, после нейтрализации гидролизата, соли фосфорной кислоты можно использовать в качестве сырья для ферментации микроорганизмов [26]. Авторы работы [27] изучали предобработку кукурузной кочерыжки минеральными кислотами: H2SO4, HNO3 и H3PO4. После предобработки качество гидролизата сравнивалось путем ферментации С. beijerinckii TISTR 1461 продуцирующих биобутанол. Было установлено, что гидролизат после предобработки фосфорной кислотой может быть использован в качестве субстрата без какого-либо удаления ингибитора. Тем не менее, при обработке сырья фосфорной кислотой наблюдался самый низкий выход общих сахаров. При оптимизации ферментативного гидролиза предварительно обработанной кукурузной кочерыжки снизилась дозировка ферментов и время гидролиза до 7,68 FPU/г биомассы и 63,88 часов, соответственно с выходом 51,82 г/л редуцирующих сахаров. В работе [28] пшеничную солому подвергали предобработке 0,5%, 1% и 2% серной кислотой при температуре 140 и 160°С. Время предобработки составляло 10, 20, 30, 45 и 60 мин. Предобработанную пшеничную солому промывали шестью объёмами воды и гидролизовали ферментными комплексами целлюлаз в течение 24-48 часов. Оптимальные условия для предварительной обработки соломы пшеницы были определены как: температура 140 °C, концентрация серной кислоты 1 %, продолжительность обработки 30 мин. В этих условиях выход глюкозы из пшеничной соломы достиг 89,0 % от теоретического максимума, в то время как концентрация муравьиной кислоты, фурфурола, уксусной кислоты и 5- оксиметилфурфурола составила 32,37 ± 4,91, 12,08 ± 1,69, 7,98 ± 1,02 и 1,14 ± 0,22 г/кг соответственно. Увеличение степени предварительной обработки привело к увеличению выработки ингибиторов, а также снижению выхода моносахаридов на 27 %. 17 Конструкция реакторов для предобработки биомассы кислотами является важным фактором для максимальной деполимеризации гемицеллюлозы [18, 29, 30]. Для слабокислотного применение реакторов гидролиза биомассы вытеснения, перспективно противотоковых реакторов, перколяционных и противотоковых реакторов с изменяемым рабочим объёмом [18, 31, 32]. В ряде исследований [16-21] отмечается, что среди всех вышеперечисленных, противотоковые реакторы позволяют осуществлять наиболее полный продолжительности гидролиз гемицеллюлоз, обработки сырья, и способствуют минимизируют снижению образование ингибиторов [33]. 1.2.3 Биологическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья Биологическая предобработка обычно ассоциируется с воздействием микроорганизмов, продуцирующих ферменты, способные разлагать лигнин, гемицеллюлозу и полифенолы. Для деполимеризации лигнина используются культуры Phanerochaetechrysosporium, Phlebiaradiata, Dichmitussqualens, Rigidosporuslignosus и Junguaseparabilima [51, 52]. Данная предобработка характеризуется высокой селективностью и эффективностью. При анализе вклада обработки грибами белой гнили в комбинированную предобработку древесины бука биологическими методами и органическими растворителями, показали, что биологическая предобработка экономит 15% электроэнергии, требуемой для этанолиза древесины бука после предобработки по данной технологии [53]. Скорость биологической предобработки слишком мала для промышленных масштабов. Требуемое время выдержки в 10-14 дней [51-53], тщательное соблюдение условий роста грибов, значительные площади, требуемые для размещения оборудования биологической предобработки, 18 являются недостатками, обуславливающими низкую привлекательность этого метода возможность углеводов. в промышленных поглощения Биологическую масштабах. Другой микроорганизмами предобработку недостаток части можно – образующихся применять как индивидуально, так и в сочетании с другими методами как первый этап стандартной предобработки биомассы с низким содержанием лигнина. 1.2.4 Физико-химическая предварительная обработка лигноцеллюлозосодержащего сырья К данной группе относится большинство используемых технологий предобработки, таких как предобработка паром, горячей водой, окисление в атмосфере паров воды, обработка жидким аммиаком и органическими растворителями [54, 55]. Данные методы предобработки основаны на совместном варьировании параметров процесса и использовании химических соединений для воздействия одновременно на физические и химические свойства биомассы. Предобработка паром – наиболее интенсивно изучаемый и используемый физико-химический метод предобработки биомассы. Термин «автогидролиз» является синонимом предобработки паром и отражает изменения, происходящие с биомассой в ходе данного процесса [56-58]. В процессе предобработки паром биомасса обрабатывается насыщенным паром высокого давления при температуре 160-240 °C и давлении 0,7 – 4,8 МПа [54-58]. Время выдержки под давлением с целью интенсификации гидролиза гемицеллюлозы составляет от нескольких секунд до нескольких минут. В результате данного вида предварительной обработки повышается доступность целлюлозы, что обусловлено гидролиом гемицеллюлоз. 19 Считается, что гидролиз гемицеллюлозы в ходе предобработки паром сопровождается образованием уксусной кислоты из связанных с гемицеллюлозой ацетильных групп, а также других кислот. Данные соединения могут далее катализировать гидролиз гемицеллюлозы с образованием мономеров глюкозы и ксилозы. Поэтому данный процесс также называют автогидролизом [59]. В жестких условиях паровой предобработки (270 °C, 1 мин) гидролиз гемицеллюлозы достигает оптимальных значений. В то же время, более низкие температуры и меньшая выдержка (190 °C, 10 мин) более предпочтительны, так как позволяют избежать образования продуктов разложения сахаров, которые подавляют последующую микробиологическую конверсию продуктов предобработки сырья [60]. Эффективность паровой предобработки можно значительно повысить введением H2SO4, CO2 или SO2 в качестве катализаторов. Введение кислотных катализаторов значительно повышает выход гемицеллюлозных сахаров [20-23]. Преимущества паровой предобработки заключается в малом количестве применяемых реагентов, малых энергозатратах, отсутствии необходимости регенерации и нейтрализации реагентов. К недостаткам предобработки паром можно отнести неполное удаление лигнина, возможность конденсации и осаждения растворимых компонентов лигнина, частичное разложение ксилана и гемицеллюлозы с возможным образованием фурфурола и гидроксиметилфурфурола в условиях повышенной температуры. Предобработка горячей водой (сольволиз, гидротермолиз, водное фракционирование) сходна с паровой предобработкой, но в ней используется жидкая вода при повышенных температурах, а не пар. Предобработка горячей водой приводит к гидролизу гемицеллюлозы и частичному удалению лигнина, увеличивает доступность целлюлозы и не 20 сопровождается образованием продуктов деструкции сахаров, протекающим при более высоких температурах [61]. Для предобработки горячей водой используются реакторы трех основных конфигураций, различающиеся направлением потоков воды и биомассе в реакторе: реактор параллельного тока, реактор противотока и проточный реактор. Контакт воды и биомассы осуществляется в течение 15 минут при температурах 160-230 °C. Под действием горячей воды происходит разрыв гемиацетальных связей, что приводит к образованию кислот в ходе гидролиза и, соответственно, способствует разрыву прочих химических связей в биомассе [61]. Авторы работы [62] установили, что образование моносахаридов и последующих продуктов разложения, которые являются катализаторами гидролиза целлюлозы в ходе предобработки горячей водой, можно свести к минимуму путем поддержания pH на уровне 4-7. Существует несколько ключевых критериев эффективной предобработки. Процесс предобработки должен иметь низкие капитальные и эксплуатационные затраты. Он должен быть эффективным в широком диапазоне параметров и должен компонентов сырья в виде привести к выделению большинства отдельных фракций. Должна быть минимизирована необходимость подготовки сырья, например уменьшение размера частиц. Предобработка не должна вести к получению продуктов распада сахаров и лигнина, которые ингибируют действие гидролитических ферментов и рост микроорганизмов, а также процесс не должен требовать много энергии или затраченная энергия должна использоваться далее в процессе [17-22]. Стоимость применяемого катализатора и возможность его регенерации, возможность производства продуктов с более высокой стоимостью, получения гемицеллюлозных сахаров в жидкой форме для снижения использования ферментов гемицеллюлаз в последующем ферментативном гидролизе также составляет основу сравнения различных 21 вариантов предварительной обработки [18]. Процесс предобработки того или иного сырья должен выбираться с учетом указанных особенностей, с расчетом их влияния на последующие стадии обработки в соответствии с капитальными и эксплуатационными затратами и стоимостью биомассы. 1.3 Микробиологическая конверсия продуктов гидролиза лигноцеллюлозосодержащего сырья в анаэробных условиях 1.3.1 Продуценты масляной кислоты Правильный выбор микроорганизмов является основой успешного процесса биосинтеза. Для получения масляной кислоты подходят многочисленные бактериальные штаммы, которые в основном выделены из сточных вод, ила, почвы, загрязненной молочной и пищевой продукции, мяса, и пищеварительной системы животных. В общей сложности известно более десяти бактериальных штаммов, производящих масляную кислоту, принадлежащих к родам: Clostridium, Butyrvibrio, Butyribacterium, Eubacterium, Fusobacterium Megasphera и Sarcina [63]. Наиболее изученными являются штаммы рода Clostridium, благодаря их высокой продуктивности и относительно высокой стабильности. Также часто исследуются бактерии родов Butyrivibrio и Butyribacterium. Бактерии рода Clostridium - это грамположительные подвижные или неподвижные палочковидные бактерии с закругленными концами. Подвижные клетки обычно перитрихиальные. Большинство видов образуют овальные или сферические эндоспоры. Обычно являются хемоорганотрофами, некоторые виды хемоавтотрофы или хемолитотрофы. Обычно продуцируют смеси органических кислот и спиртов из углеводородов или пептонов. Некоторые виды способны фиксировать атмосферный азот. Большинство видов облигатно анаэробные, хотя толерантность к кислороду колеблется в широких пределах; некоторые виды 22 могут расти в присутствии воздуха при атмосферном давлении, но без образования спор. Большинство видов растет при рН 6,5-7, температуре 30 37 ° С. Типичные виды: ATCC 19398, CCUG 4217, CIP 103309, DSM 10702, HAMBI 482, IAM 14194, NBRC 13949, JCM 1391, KCTC 1786, KCTC 1871, LMG 1217, NCCB 89156, NCIMB 7423, NCTC 7423, VKM B-1773. В настоящее опубликованы данные о 168 видах рода Clostridium [64]. Наиболее продуктивными считаются штаммы С. butyricum, С. beijerinckii, С. acetobutylicum, С. tyobutyricum, С. populeti и С. thermobutyricum. Для культур C. butyricum, C. tyrobutyricum и С. populeti оптимальная температура роста колеблется от 30 до 37 °С. Наиболее благоприятной температурой роста для C. thermobutyrium считается 55 °C. В таблице 3 приведены наиболее популярные штаммы, используемые в исследованиях биосинтеза масляной кислоты, и достигнутые результаты при разных условиях. Таблица 3 - Биосинтез масляной кислоты бактериями рода Clostridium [65] Источник Метод углерода в Темпера- Выход Штамм ферментации питательной тура, °C , г/л среде Периодическая 12,25 С. butyricum ZJUCB С подпиткой 16,74 Периодическая 7,30 C. butyricum S21 С подпиткой 37 20,00 С подпиткой 41,65 C. tyrobutyricum Непрерывная 50,11 C. tyrobutyricum Глюкоза Периодическая 45,00 CIP 1-776 Периодическая 10,04 C. thermobutyricum 55 Непрерывная 19,38 C. tyrobutyricum Периодическая 13,76 JM1 37 C. tyrobutyricum Непрерывная 24,88 ATCC25755 C. populeti Периодическая 6,30 23 Для биосинтеза масляной кислоты бактерии рода Clostridium могут использовать различные типы сахаров в том числе гексозы, некоторые виды пентоз, олиго- и полисахариды. Субстратная специфичность C. butyricum и C. tyrobutyricum приведена в таблице 4. С. butyricum способен продуцировать масляную кислоту на средах, содержащих в качестве источников углерода глицерин, пентозы, гексозы, патоку, лигноцеллюлозу и картофельный крахмал [64]. Таблица 4 - Углеводные субстраты, утилизируемые бактериями C. C. tyrobutyricum + - - - + - - - - - с - - - Трегалоза Крахмал - + + + + - - Ксилоза Рибоза Рафиноза Мелибиоза Мелициоза Манноза Сахароза Мальтоза Лактоза Инулин Галактоза Фруктоза Амигдалин Целлобиоза + ± + ± + + ± + + + + ± + + Рамноза C. butyricum Арабиноза Вид Глюкоза butyricum и C. tyrobutyricum [64] ± - + утилизируют более 90 % штаммов; - более 90 % штаммов не утилизируют; с - плохо утилизируют; ± некоторые штаммы утилизируют С. tyrobutyricum может синтезировать масляную кислоту только на средах, содержащих глюкозу, ксилозу и фруктозу [66]. В работе [67] сообщают, что C. tyrobutyricum способен продуцировать масляную кислоту на средах, содержащих пентозы и гексозы. Однако скорость потребления ксилозы ниже, чем глюкозы. С. thermobutyricum, который выделен из конского навоза, в основном использует моносахариды (глюкозу, фруктозу, мальтозу, ксилозу, рибозу, но не утилизирует арабинозу, галактозу и маннозу), дисахариды (целлобиоза), олигосахариды и полисахариды. 24 - 1.3.2 Метаболический путь синтеза масляной кислоты кислоты бактериями рода Clostridium Метаболический путь синтеза масляной кислоты бактериями рода Clostridium был исследован в многочисленных работах [65, 68, 69]. Ниже представлены стехиометрические уравнения биосинтеза масляной кислоты бактериями С. butyricum (1) и С. tyrobutyricum (2) [69]: Glucose→0.8 Butyrate + 0.4 Acetate + 2.4 H2 + 2 CO2 (1) Glucose→0.85 Butyrate + 0.1 Acetate + 0.2 Lactate+ 1.9 H2 + 1.8 CO2 (2) Превращение моносахаридов в бутират бактериями рода Clostridium осуществляется по пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса [70]. Метаболизм маслянокислого брожения состоит из двух основных ответвлений. Функцией первого является снабжение клетки энергией путем образования молекул АТФ, второго – регенерация молекул НАД+. В процессе метаболизма маслянокислых бактерий, из различных источников углерода, включая глюкозу и ксилозу, образуются масляная и уксусная кислоты, водород и углекислый газ, а также небольшое количество других продуктов, в том числе, в зависимости от штамма и условий культивирования, бутанол, лактат и ацетон [71-75]. Ключевыми ферментами, участвующими в образовании масляной кислоты клостридиями являются фосфотрансбутирилаза (2.3.1.19), бутираткиназа (2.7.2.7) и КоА-трансфераза (2.8.3.8), присутствующие в ферментных системах C. butyricum и C tyrobutyricum [71,73, 76-79]. Масляная кислота производится из глюкозы на стадии ацетогенеза, тогда как на стадии сольвентогенеза бутират преобразуется в бутанол [71]. Ряд авторов сообщает, что для предотвращения процессов сольвентогенеза в клетках должны быть сохранены высокая концентрация АТФ и минимальное соотношение НАДН:НАД [69]. Метаболический путь микроорганизма при анаэробной ферментации зависит от нескольких факторов. При синтезе 25 масляной кислоты бактериями рода Clostridium на скорость роста, конечную концентрацию и распределение продуктов влияет концентрация глюкозы, рН, парциальное давление водорода, наличие ацетата и бутирата в среде [80, 81]. Поэтому важно разработать такие параметры процесса биосинтеза масляной кислоты, которые будут способствовать низкой продукции уксусной кислоты (большей селективности), высокому выходу масляной кислоты. 1.3.3 Биосинтез масляной кислоты с применением питательных сред, содержащих гидролизаты растительного сырья В настоящее время микробиологический синтез масляной кислоты привлекает все больше внимания из-за растущих цен на нефть, истощения ее природных запасов и необходимости защиты окружающей среды от загрязнения продуктами химического синтеза. Тем не менее, процесс биосинтеза является масляной конкурентоспособным, исследований кислоты потому проводились с пока что не большинство использованием экономически опубликованных стандартной дорогой питательной среды. В качестве источника углерода в питательных средах для производства масляной кислоты перспективно использование гидролизатов лигноцеллюлозной биомассы. Использование в качестве субстрата тростниковой патоки при рН 6,0 позволило получить 26,2 г/л бутирата, в то время как культивирование с подпиткой дало 34,6 г/л [82]. В качестве потенциального сырья с низкой стоимостью для производства масляной кислоты был исследован топинамбур [83]. Выход масляной кислоты при культивировании штамма С. tyrobutyricum ZJU 8235 на гидролизате топинамбура в биореакторе с полыми волокнами составил 0,44 г/г с производительностью 2.75 г/л/ч. Вэй и соавторы [84] сообщили о производительности масляной кислоты 0,51 г/л/ч, 26 и конверсии 0,45 г/г сахара, в биореакторе с полыми волокнами на средах, содержащих 15-20% гидролизата багассы. Необходимы дополнительные исследования по ферментации масляной кислоты на гидролизатах лигноцеллюлозного сырья для достижения рентабельного производства в промышленных масштабах. В работе [85] был использован новый штамм Clostridium tyrobutyricum RPT-4213, который производит бутират в анаэробных условиях. Этот штамм продуцирует 9,47 г/л масляной кислоты на среде MRS, конверсия глюкозы при этом 48%. Данный штамм был также использован для сбраживания предобработаных разбавленной серной кислотой гидролизатов пшеничной соломы, стеблей кукурузы, рисовой шелухи и прутьевидного проса (Panicum virgatum). Результаты показали, что использование пиательной среды, содержащей, 50 % об. гидролизата пшеничной соломы дало выход масляной кислоты 8.06 г/л (конверсия глюкозы 46%), 50 % об. гидролизата прутьевидного проса - 6.01 г/л (конверсия глюкозы 44%). Однако, 50% об. гидролизат стеблей кукурузы ингибировал рост микроорганизмов. Штамм Clostridium tyrobutyricum RPT4213 был также использован для ферментации с использованием питательной среды MRS с добавлением 60 % об. гидролизатов пшеничной соломы и прутьевидного проса. В результате использования гидролизатов пшеничной соломы получен титр масляной кислоты 9.87 г/л (конверсия глюкозы 44%) и 7.05 г/л масляной кислоты при культивировании на гидролизатах прутьевидного проса (конверсия глюкозы 42%). В работе [86] была проведена ферментация масляной кислоты на гидролизатах пшеничной соломы. Среди моносахаридов в гидролизатах преобладали глюкоза и ксилоза (71,6 ± 0,2 г / л и 55,4 ± 0,2 г/л соответственно) с содержанием сухих веществ 20,87 %. Максимальный выход масляной кислоты (0,47 г/г сахара, 96% от теоретического выхода) был получен при рН между 6 и 7 с высокой селективностью (> 90%). Тем не менее, скорость потребления ксилозы была гораздо ниже, чем глюкозы. 27 В работе [87] для ферментации масляной кислоты на гидролизатах кукурузной кочерыжки использовался штамм Clostridia butyricum ВКПМ В9619. Исследователи выяснили, что при ферментации штамма на гидролизате кукурузной кочерыжки с добавками мелассы в количестве 1,35 % РВИ (1% сахарозы) выход масляной кислоты составил не менее 43 % от потребленных редуцирующих веществ. Показано, что помимо гексоз (глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза) штамм сбраживает и пентозы (ксилозу и арабинозу) и в последнюю очередь сахарозу. Основной задачей увеличения выхода масляной кислоты является повышение толерантности штаммов Clostridia к продуктам ферментации и снижение стоимости сырья. Лигноцеллюлозные материалы могут быть экономически эффективным источником сырья для различных химических веществ и топлива. Главным препятствием является высокая стоимость гидролиза целлюлозы в простые сахара. Также необходимы дополнительные исследования биосинтеза масляной кислоты на гидролизатах лигноцеллюлозного сырья для достижения рентабельного производства в промышленных масштабах. Таким образом, анализ литературных данных показал, что в качестве субстрата для биосинтеза масляной кислоты перспективно использовать ежегодно возобновляемое растительное сырье, содержащее до 70 % углеводов от абсолютно сухого вещества. 1.3.4 Оптимизация процессов биосинтеза масляной кислоты Существующая в настоящее время технология биосинтеза масляной кислоты все ещё неконкурентоспособной является нерентабельной в с связи низкой и экономически концентрацией, низкой производительностью и низким выходом масляной кислоты. Образование побочных продуктов биосинтеза, таких как уксусная, молочная кислота и этанол приводит к снижению концентрации масляной кислоты и 28 увеличивает затраты на очистку конечного продукта. В целях улучшения экономических показателей процесса производства масляной кислоты необходимо принять ряд мер по его оптимизации. 1.3.5 Влияние рН среды на биосинтез масляной кислоты Значительное влияние на активность ферментов фосфотрансацетилиза, ацетаткиназа, фосфотрансбутирилаза, бутираткиназа, и лактатдегидрогеназа и, следовательно, на соотношение продуктов биосинтеза, оказывает рН среды. Относительно высокий рН (более 6,0) является благоприятным для роста клеток и биосинтеза масляной кислоты, особенно для культуры C. butyricum [88]. В работе [89] при исследовании модифицированного штамма С. acetobutyricum было обнаружено, что рН ниже 4,6 приводит к снижению биосинтеза бутирата. Кроме того, рН питательной среды также влияет на скорость роста культур и синтеза бутирата. Ряд авторов отмечает, что C. tyrobutyricum при рН 6,3 синтезирует большее количество масляной кислоты, чем при рН 6,0 и 6,7 [90]. Показано [91] что чем ниже рН питательной среды, тем меньшее количество бутирата продуцирует культура. При рН 5,0 основными продуктами брожения клостридий являются ацетат и лактат. Метаболический сдвиг от формирования бутирата при рН 6,3 к образованию лактата и ацетата при рН 5,0 связывают со снижением активности фосфотрансбутирилазы и увеличением активности фосфотрансацетилазы и лактатдегидрогеназы [90]. Авторами [90] показано, что изменение рН от 5,0 до 7,0 незначительно влияет на активность ферментов ацетаткиназа и бутираткиназа. Следует отметить, что различные значения рН могут влиять не только на обмен и продукцию органических кислот, но и на проводимость клеточных мембран и лизис клеток [69]. 29 1.3.6 Удаление продуктов брожения из реакционной среды Удаление продуктов ферментации с помощью различных методов, в том числе диализа, перегонки, адсорбции и экстракции для изоляции карбоновых кислот и других нейтральных продуктов могут быть применены при биосинтезе масляной кислоты [82]. Удаление целевого продукта может улучшить процесс брожения и повысить производительность за счет снижения концентрации данного продукта в культуральной жидкости и снижения его токсического действия на клетки. При электродиализе биомасса отделяется от культуральной жидкости методом микро- или ультрафильтрации. Этот метод успешно применяется при биосинтезе пропионовой, молочной и уксусной кислот [92-94]. Первапорация (испарение жидкостей через полупроницаемую мембрану для их разделения) также часто используются для отделения летучих продуктов при культивировании. Данный метод успешно используется для удаления продуктов ферментации при культивировании C. acetobutylicum [95]. Адсорбция также является довольно распространенным методом отделения таких продуктов ферментации как бутанол с применением различных материалов в качестве адсорбентов [96, 97]. Метод экстракции эффективно используется для удаления из культуральной жидкости ацетата, пропионата и лактата. В работе [98] при биосинтезе бутирата в качестве экстрагентов были применены различные растворители, включая третичные амины, спирты, алканы и растительные масла. Было показано, что третичные амины лучше экстрагируют масляную кислоту. 30 1.3.7 Применение различных способов культивирования Биосинтез масляной кислоты был изучен при использовании периодических и непрерывных процессов, с циркуляцией и без циркуляции бактериальных клеток. По сравнению периодическими и полунепрерывными процессами, непрерывные процессы способствуют достижению более высокого выхода бутирата, но концентрация целевого продукта при этом ниже. Для достижения большего выхода масляной кислоты могут быть применены новые конструкции реакторов с иммобилизацией бактериальных клеток, позволяющие снизить скорость роста, и, как следствие, повысить выход бутирата и селективность процесса [99-101]. Однако, следует отметить, что биореакторы с иммобилизованными клетками, как правило, теряют свою производительность с течением времени в связи с накоплением старых неактивных клеток [65]. В биореакторах с клетками, иммобилизованными на волокнистом материале жизнеспособность клеток выше, по сравнению с другими типами биореакторов. Такие аппараты могут обеспечивать высокий выход масляной кислоты в течение более длительного периода [102]. Это связано с большим объемом пустот, образованных волокнами, и их высокой проницаемостью, что повышает регенеративную способность клеток и способствует интенсификации массообмена [103]. Данный тип реакторов успешно используются различными исследовательскими группами для получения масляной кислоты [103-106]. Культивыирование волокнистом в ректоре материале, с клетками, показало иммобилизованными повышение толерантности на С. acetobutylicum к масляной кислоте (86,9 г/л) [103, 107, 108]. Помимо оптимизации технологии культивирования, создаются новые улучшенные штаммы бактерий, производящих масляную кислоту. 31 1.3.8 Пути создания и оптимизации высокоэффективных штаммовпродуцентов масляной кислоты Процессы биосинтеза масляной кислоты природными продуцентами все еще экономически неконкурентоспособны в связи с низкой конечной концентрацией бутирата в культуральной жидкости и низким выходом. Для повышения экономических показателей биосинтеза масляной кислоты необходимо увеличить выход и титр бутирата при одновременном снижении образования ацетата [65]. Авторы [104] сообщили, что полное прекращение синтеза уксусной кислоты приводит к увеличению образования масляной кислоты иммобилизованными клетками (1 моль/моль глюкозы и 0,83 моль/моль ксилозы). Таким образом, выключение метаболического пути образования уксусной кислоты может увеличить количество масляной кислоты, продуцируемой штаммом. В работе [109] для увеличения синтеза бутирата культурой C. tyrobutyricum АТСС 25755 были применены методы генной инженерии с целью удаления путей образования ацетата. Были получены штаммы C. tyrobutyricum с инактивированными генами pta (фосфотрансацетилаза) или ak (ацетат киназа). Это позволило увеличить выход и титр масляной кислоты по сравнению с диким штаммом. Более того, полученный штамм обладал большей устойчивостью к ингибирующему воздействию масляной кислоты. Штамм C. tyrobutyricum с инактивированным геном ak также продуцировал большее количество водорода. Тем не менее, несмотря на то, что полученные штаммы имели гораздо более низкую активность ферментов фосфотрансацетилазы и ацетат киназы, инактивация генов не оказала существенного влияния на титр уксусной кислоты в культуральной жидкости. Однако, в связи со значительным снижением активности ферментов, отвечающих за синтез ацетата, который ведет к образованию 32 большего количества АТФ по сравнению с процессом биосинтеза бутирата, наблюдалось снижение скорости роста биомассы. В работе [110] с помощью методов метаболической инженерии на базе штамма C. acetobutylicum M5, в котором была исключена плазмида pSOL1, содержащая гены aad и биосинтеза ацетона. В данном исследовании авторы пытались объединить гиперэкспрессированный thl (тиолаза) гиперэкспрессированный aad (алкоголь/ альдегиддегидрогеназа) гены и с целью увеличения выхода бутанола. Благодаря данному подходу удалось снизить количество продуцируемой уксусной кислоты и этанола, титр бутанола не был улучшен. Тем не менее, авторы обнаружили, что с гиперэкспрессия thl привела к значительному увеличению выхода масляной кислоты. Другой подход заключается в повышении толерантности бактерий к бутирату путем применения методов мутагенеза, а также генетической инженерии для гиперэкспрессии некоторых генов. Например, гиперэкспрессия генов spo0A или groESL у бутанол-продуцирующих штаммов способствовала повышению устойчивости бактерий к бутанолу [111-113]. Сочетание перечисленных подходов и методов позволит разработать основы эффективной технологии производства масляной кислоты из возобновляемого сырья с использованием высокоактивных, конкурентоспособных по сравнению с существующими отечественными и зарубежными аналогами в части конверсии субстрата в целевой продукт и уровня накопления продукта в среде культивирования микробных продуцентов, повысить эффективность использования возобновляемого сырья, снизить влияние вредного воздействия на окружающую среду и теплоэнергозатрат за счёт увеличения выхода конечных продуктов и высокой эффективности используемых штаммов. 33 1.4 Математическое моделирование кинетики предварительной обработки лигноцеллюлозосодержащего сырья минеральными кислотами От условий гидролиза (расхода кислоты, значений температуры, скорости подачи варочной смеси, длительности режима гидролиза) зависит степень гидролиза полисахаридов, распада моносахаридов и, в целом, степень деструкции гидролизуемого материала, что сказывается на составе гидролизата. В состав гидролизата входят продукты гидролиза полисахаридов (Pn) : моносахариды (С), декстрины, олигосахариды (Dn) и побочные продукты (R), – которые можно подразделить в зависимости от их происхождения [114, 115]. Ряд авторов [114, 115] исследовали состав моносахаридов, образующихся при гидролизе различного растительного сырья. Установлено, что гидролизаты растительного сырья представлены следующим составом моносахаридов: пентозы (рамноза, арабиноза, ксилоза) и гексозы (манноза, глюкоза, галактоза, фруктоза) [116-119]. Механизм деструкции полисахарида с участием кислотного катализатора включает ряд элементарных стадий и протекает через образование промежуточных продуктов реакции [114, 115, 120]. k2 k3 k1 Pn Dn C R Математическая модель процесса гидролиза связующих гликанов до моносахаридов описывает скорости изменения концентраций веществ и представляет собой систему дифференциальных уравнений кинетики [116]: d [ Pni ] w1 , dt d [ Dni ] dt d[Ci ] dt w2 , w3 34 Здесь wj (j=1,2,3) – скорость соответствующей стадии реакции гидролиза: w1 = – k1i·[Pni] w2 = k1i·[Pni] – k2i·[Dni] w3 = k2i·[Dni] – k3i[Ci] где k1i (i =1,2,3) – константы скорости гидролиза полисахарида Pn; k2i константы скорости гидролиза промежуточных продуктов Dni (декстринов, олигосахаридов); k3i –константы скорости превращений (распада); [Сi] – текущие концентрации моносахаридов (ксилозы, глюкозы и арабинозы); При полном гидролизе полисахаридов выход моносахаридов составляет: [Сi0] = μi ·[Рni0] , где μi – стехиометрический коэффициент пересчета полисахаридов в моносахариды; [Сi0] – исходное количество моносахаридов, определенное в процессе полного гидролиза полисахаридов пшеничной соломы; t – продолжительность процесса гидролиза; Константу скорости гидролиза следует понимать как некоторую усредненную по времени эффективную константу, характеризующую многоступенчатый гидролиз большого количества полисахаридов, входящих в состав растительного сырья. Идентификация констант скоростей реакции можно проводить путем решения задачи многомерной оптимизации: k n (С j 1i 1 э С р (к )) 2 ij i i min где [Сэi], [Срi] (i=1,2,3) – соответственно экспериментальные и расчетные значения концентраций моносахаридов [115]. К сожалению, лишь немногие исследователи выполнили детальные кинетические исследования, в которых определяются параметры кинетикивыхода углеводов, и их разложения в процессе кислотного гидролиза (таблица 5). 35 Таблица 5 – Параметры кинетики выхода углеводов в процессе предобработки растительного сырья растворами кислот [114-122] Константы Энергия скорости реакций, актива– Сырье Условия гидролиза –1 мин ции, кДж/моль k1 k2 Пшеничная 0,5 % масс. H2SO4; – – 50,0в; солома 95-160ºС 105,0г Кукурузная 0,6-1,2 % масс. H2SO4 – – 130,0в; солома 160-189ºС 168,0г Кукурузная 0.47-1.95 % масс. – – 148,0в; кочерыжка H2SO4 199,0г 140-170ºС Стебли 0.5–6 % масс. HCl; – – 101,2 подсолнеч110–140ºС ника Рисовая 0.093 моль/л H2SO4; 0,09 0,006е – д солома 121ºС 4 Солома 2% H2SO4; 122 ºС 0.06 0.000 – д е сорго 235 844 Солома 2% H2SO4; 122 ºС 0.04 0.000 – и к сорго 6558 285 R2 – – – – 0,993 0.9911 0.9997 а – арабиноза; б – галактоза; в – «быстрая» фракция ксилана; г – «медленная» фракция ксилана; д – гидролиз ксилана до ксилозы; е – деструкция ксилозы; и – гидролиз глюкана; к – деструкция глюкозы Как видно из данных, представленных в таблице 5, в опубликованных ранее работах существует большой разброс в значениях констант скоростей, что обусловлено различиями в применяемом виде сырья, гидролизующего агента, условиях предварительной обработки, используемых реакторах и моделях. 36 2. Материалы и методы 2.1 Характеристика объектов исследования Для получения кислотных и ферментативных гидролизатов использовали прессованный жом сахарной свеклы (ОOО «Буинский сахарный завод») и березовый опил (ОАО «Зеленодольский лесозавод»). Свекловичный жом, который представлял собой мелкую обессахаренную стружку длиной 15-20 мм, толщиной 2-3 мм. Свекловичный жом измельчению и высушиванию не подвергался. Березовый опил предварительно высушивали при 102 ºС в течение 2 ч для доведения до равновесной влажности. 2.2 Проведение предварительной обработки объектов исследования Предварительную обработку растительного сырья осуществляли разбавленной сернистой кислотой в диапазоне температур 160-250 °C на следующих установках: гидролизер капсульного типа с масляным термостатом; гидролизер капсульного типа с металлическим тепловым аккумулятором с периодической загрузкой сырья, разработанных на кафедре химической кибернетики ФГБОУ ВПО «КНИТУ» (рисунок 2) [123-125]. Лабораторная установка с масляным термостатом [125] для исследования кинетики высокотемпературного гидролиза растительного сырья позволяет проводить процессы химического гидролиза в рабочем диапазоне температур от 100 °C до 200 °C при избыточном давлении 0-1,2 МПа. В качестве теплоносителя в гидролизере капсульного типа с масляным термостатом использовали силиконовое масло ПМС-300. Лабораторная установка с тепловым аккумулятором предназначена для работы в диапазоне температур от 100 °C до 250 °C при избыточном давлении 0-1,2 МПа. 37 Обрабатываемое сырье загружали в капсулы, выполненные из нержавеющей стали 12Х18Н10Т объемом 30 мл, вставляемые в ячейки теплового аккумулятора. Давление в гидролизере измеряли манометром ДМ90 (0-2,5 МПа). Регулирование температуры осуществляли измерителемрегулятором ТРМ 210. Объект исследования (березовый опил, свекловичный жом) взвешивали на аналитических весах. Навески сырья помещали в просушенные капсулы, куда под тягой доливали расчетные количества воды и раствора сернистой кислоты. Общая масса загрузки каждой капсулы составляла 15 – 30 г. а б Рисунок 2 – Общий вид установок для исследования кинетики процессов гидролиза: а – гидролизер капсульного типа с масляным термостатом; б – гидролизер капсульного типа с металлическим тепловым аккумулятором 38 Экспериментально было установлено, что опорный цилиндр должен быть нагрет на 15 ˚С выше, чем рабочая температура гидролиза. После завершения предварительного нагрева, уставка терморегулятора перенастраивается на рабочую температуру гидролиза и гидролизер опускается в опорный нагревательный цилиндр. Процесс гидролиза продолжается в течение заданного промежутка времени, после чего капсула извлекается из опорного цилиндра с помощью специального захвата и немедленно погружают в емкость с холодной водой. Содержимое капсулы разделяли центрифугированием на лабораторной автоматической центрифуге с охлаждением Rotina 380R (Германия) при скорости вращения ротора 2000 об/мин в течение 15 минут. В полученной жидкой фракции, содержащей углеводы, определяли содержание редуцирующих веществ, моносахаридный состав и использовали в качестве источника углеводов в питательных средах при культивировании. Основные характеристики экспериментальных установок представлены в таблице 6. Таблица 6 - Основные характеристики экспериментальных установок Тип Высота Диаметр Толщина Материал аккумулятора капсул капсул стенки капсул масляный 10.5 19.7 2.45 Пищевая Диапазон рабочих температур 1000 С–2000 С нержавеметаллический 15.8 18.9 2.35 ющая 190–2500 С сталь 39 Твердую фракцию, содержащую целлюлозу, промывали дистиллированной водой для удаления кислоты, которая в дальнейшем может снижать эффективность ферментативного гидролиза. 2.3 Проведение ферментативного гидролиза После предварительной обработки сырье подвергали ферментативному гидролизу. Ферментативный гидролиз проводили в натрий-цитратном буфере рН 5,0 в колбах Эрленмейера объемом 250 мл и объемом реакционной среды 50 мл при постоянном перемешивании на качалке с частотой вращения 150 об/мин. В качестве биокатализатора при ферментативном гидролизе в работе использовали ферментный препарат «CellicCTec2» компании «Novozymes». Основные компоненты ферментного комплекса: целлюлаза CAS 9012-54-8, ксиланаза CAS 37278-89-0. Плотность препарата 1,15 г/мл. 2.4 Применяемые штаммы Для сбраживания гидролизатов использовали штаммы маслянокислых бактерий из коллекции ВКПМ: Clostridium butyricum ВКПМ В-10406, В9617, В-9619 и Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406, В-9615. Характеристика данных штаммов представлена в таблице 7. Clostridium butyricum - грамположительные прямые палочки с закругленными концами, подвижные и перитрихиальные, 0,5-1,7 × 2,4-7,6 мкм. Встречаются поодиночке, парами или в виде коротких цепочек, а иногда и как длинные нити. Споры овальные. Оптимальный температурный диапазон для роста 30-37 ° С. Многие штаммы хорошо растут при 25 ° С. Рост подавляется 6,5% NaCl. Штаммы Clostridium butyricum растут в 40 глюкозо-минеральных средах с биотином. Все штаммы хорошо ферментируют пектин. Фиксируют атмосферный азот. Пируват утилизируют в ацетат, бутират, а иногда и в формиат. Не потребляют лактат и треонин. Пектин ферментируют в метанол, уксусную кислоту, H2, CO2, а также небольшое количество бутирата и этанола. Все штаммы чувствительны к клиндамицину, хлорамфениколу, эритромицину, тетрациклину, 9 из 37 штаммов устойчивы к пенициллину. Три клинических изолята Clostridium butyricum устойчивы к пенициллину, производят β-лактамазу. Два клинических изолята протестированы на восприимчивость к цефокситину (4 мкг / мл), клиндамицину (1 мкг / мл), и метронидазолу (1 мкг / мл). Таблица 7 - Характеристика штаммов маслянокислых бактерий [126] Номер штамма 9617 9619 Автор(ы) вида или подвида 10406 Clostridium Род штамма Вид штамма 9615 butyricum tyrobutyricum Prazmowski Prazmowski 1880 1880 DSM 10702, ATCC 19398, Имена-синонимы штамма (номера в IAM 14194, IFO 13949, других JCM 1391, коллекциях) NCIB 7423, NCTC 7423 NRRL B1024, ATCC 859 van Beynum and Pette 1935 van Beynum and Pette 1935 DSM 2637, ATCC 25755, NCIB 10635 ATCC 25755, DSM 2637, NCIB 10635 Среда для переноса штамма (номер) 286 Оптимальная температура роста, °С 37 Применение штамма Типовой штамм 41 Типичные штаммы Clostridium butyricum: ATCC 19398, CCUG 4217, CIP 103309, DSM 10702, HAMBI 482, IAM 14194, NBRC 13949, JCM 1391, KCTC 1786, KCTC 1871, LMG 1217, NCCB 89156, NCIMB 7423, NCTC 7423, VKM B-1773. Clostridium tyrobutyricum - грамположительные, подвижные и перитрихиальные палочки. Обычно размером 1.1-1.6 × 1.9-13.3 мкм. Встречаются поодиночке или в парах. Споры овальные. Оптимальная температура для роста 30-37 °C. Умеренно растут при 25 °С. Рост подавляется 6,5% NaCl или 20 % раствором желчи. Пируват утилизируют в бутират и ацетат. В присутствии ацетата, Clostridium tyrobutyricum преобразует лактат в бутират, CO2, и H2. Чувствительны к хлорамфениколу, клиндамицину, эритромицину, пенициллину G, и тетрациклину. Типичные штаммы: ATCC 25755, CCUG 48315, CIP 105092, DSM 2637, JCM 11008, LMG 1285, NCIB 10635) [64]. 2.5 Восстановление коллекционных культур из лиофилизированного материала Штаммы бактерий хранят в виде лиофильно высушенных культур в стеклянных запаянных ампулах. Ампулу вскрывали, добавляли около 500 мкл стерильной дистиллированной воды, оставляли для набухания, после этого 100 мкл переносили в чашки Петри на плотную питательную среду MSS с агаром для клостридий. Остаток суспензии переносили с помощью шприца (на 2 мл) в герметичный флакон для анаэробного культивирования с жидкой синтетической средой). Чашки Петри помещали в анаэростат и выращивали в термостате при температуре 37 °С в течение 48 часов. Флакон со средой, засеянный суспензией культуры, помещали в термостат на 37 °С и 42 выращивали в течение 24 часа. Наличие в среде ацетона, бутанола и этанола подтверждали путем газовой хроматографии. Для проверки чистоты культуры объект испытаний высевали на плотную среду, инкубировали в анаэростате при температуре 37 °С в течение 48 часов. На чашках тестировали чистоту культуры, однородность колоний; микроскопированием препарата («раздавленная» капля или фиксированный окрашенный мазок) проверяли характерную морфологию клеток и отсутствие контаминации. Для определения жизнеспособности клеток анализируемые образцы клеточной популяции высевали на плотную среду MSS; долю жизнеспособных клеток определяли, подсчитывая число колоний на поверхности агара после высева на него известного числа клеток и инкубации в анаэростате при температуре 37 °С в течение 48 часов [71]. 2.6 Условия культивирования Бактерии выращивали во флаконах для анаэробной ферментации [127] общим объемом 120 мл и объемом питательной среды 50 мл. Для создания анаэробных условий флаконы с питательной средой продували N2. В качестве базовой использовали среду MSS, содержащую (г/л): KH2PO4 – 1,0; K2HPO4 – 0,8; MgSO4·7H2O – 1,0; FeSO4·7H2O – 0,05; ацетат аммония – 3,0; дрожжевой экстракт – 5,0; цистеин – 0,5 [127, 128]. Среду MSS не содержащую сахаров стерилизовали при 121 °С в течение 30 мин, после чего в каждый флакон добавляли необходимое количество глюкозы или гидролизатов свекловичного жома и березового опила. Культивирование проводили при температуре 30 °С, рН 6,0 в течение 72 ч. Перед сбраживанием кислотные гидролизаты нейтрализовали с помощью CaCO3 до рН 7,0. Нейтрализованные гидролизаты фильтровали через бумажные фильтры и стерилизовали с помощью фильтра Sarstedt 43 (Гармания) с диаметром пор 0,20 мкм [76]. В питательную среду добавляли 25-50 об. % кислотного гидролизата свекловичного жома или березового опила или 25-50 об. % ферментолизата (до конечной концентрации углеводов ~ 10-30 г/л). 2.7 Общие методы анализа 2.7.1 Определение содержания редуцирующих веществ Определение содержания редуцирующих веществ осуществляли методом Макэна–Шоорля [129]. Объемный метод Макэна–Шоорля для определения содержания РВ является модификацией метода Бертрана. При объемном определении используется раствор Фелинга с точным содержанием меди. Количество меди, восстановленной сахарами при кипячении пробы, вычисляется по остатку неизрасходованной меди (II), определяемой йодометрически. Ход определения [130]: в коническую колбу из термостойкого стекла вносят 1,0 мл гидролизата и добавляют 1,0 мл 2 Н соляной кислоты. Колбу нагревают на водяной бане при 80 0С в течение 10 мин (с целью гидролиза ди– и олигосахаридов, содержащихся в гидролизате). Затем добавляют 8 мл дистиллированной воды, 10 мл раствора Фелинга I и 10 мл раствора Фелинга II. Полученную смесь кипятят на электроплитке в течение 2 мин и быстро охлаждают холодной водой до 25 °С, добавляют 2 г йодистого калия и 15 мл 20 % серной кислоты. Выделившийся йод при непрерывном перемешивании титруют 0,1 Н раствором тиосульфата натрия до исчезновения синего окрашивания при добавлении 1 % раствора крахмала. При тех же условиях, но без добавления гидролизата проводится холостой опыт. По разности расходов раствора тиосульфата натрия в холостом и рабочем опытах (мл), с помощью эмпирической таблицы [129, 130] находят количество редуцирующих веществ в пробе гидролизата, взятой на анализ. 44 2.7.2 Газохроматографический анализ Содержание бутанола, ацетона, этанола, масляной и молочной кислот в культуральной жидкости определяли до и после ферментации методом газохроматографического анализа (ГХ). Использовали хроматограф «Shimadzu» GC-17A (Япония), оснащенный автосэмплером AOC-20i, пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой Agilent (длина 30 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина плёнки 0,25 мкм) («Supelco», США). В качестве газа-носителя использовали азот при температуре 260 °С. Сбор и обработку данных проводили с помощью пакета программ «Мультихром» на основе персонального компьютера. Измерения проводили в трех повторностях. Погрешность определения в диапазоне концентраций 0,5-10,0 г/л не превышала 10 % относительных. 2.7.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография Содержание моносахаридов определяли методом ВЭЖХ на хроматографе системы «Alliance» фирмы WATERS c рефрактометрическим детектором Waters 2414, оснащенном колонкой Reprosil-Pur NH2 (длина 250 мм, внутренний диаметр 4,0 мм, толщина пленки 5 мкм), («Dr. Maisch GmbH», Германия). Температура колонки 50 ºС; скорость элюирования 1 мл/мин; состав подвижной фазы: ацетонитрил:вода:этилацетат (76:20:4). Приём и обработку данных производили с использованием компьютерной системы «Empower Pro». Для измерения концентраций органических кислот использовали колонку ReproSil-Pur C18-AQ («Dr. Maisch», Германия). Измерения проводили как минимум в трех повторностях. Погрешность определения в диапазоне концентраций 0,5-50,0 г/л не превышала 10,0 % относительных. Также моносахаридный анализ гидролизатов проводили с помощью метода ВЭЖХ на колонке «CarboPacPA-1» (4 x 250 мм, «Dionex», США), 45 используя импульсный амперометрический детектор PAD («Dionex»). Скорость элюирования 1 мл/мин. Температура колонки 30 ºС. Буферы: А – 100 мM NaOH в 1 M AcNa, В – 15 мM NaOH. Градиентное элюирование проводили следующим образом: 0-20 мин. В - 100 %; 20-21 мин. В - 90 %, А – 10 %; 22-41 мин. В - 50 %, А – 50 %; 42-55 мин. А - 100 %; 56-85 мин. В – 100 %. Определение маннозы в данном методе затруднено в связи с невозможностью разделения пиков ксилозы и маннозы. 2.7.4 Методы определения активности ферментного комплекса 2.7.4.1 Определение авицелазной активности Авицелазную активность определяли, проводя реакцию гидролиза МКЦ в течение 60 мин в термостатируемой при 40 0С пробирке при рН 5,0 в условиях перемешивания. Для этого из запасной суспензии МКЦ (1%), перемешиваемой на магнитной мешалке, кончиком наконечника отбирали 0,25 мл суспензии, помещают в пробирку, добавляли туда 0,15 мл 0,1 М Naацетатного буфера, рН 5,0, и перемешивали на магнитной мешалке при 40 0С в течение 10 минут. В пробирку (фиксируя начало времени реакции по секундомеру) вносили 0,1 мл раствора анализируемого ферментного препарата, предварительно разбавленного должным образом Na-ацетатным буфером, рН 5,0, и прогретого в течение 10 минут при 40 0С. Реакционную смесь помещали в термостатируемую при 40 0 С водяную баню, находящуюся на магнитной мешалке, и перемешивали в течение 60 минут. После истечения 60 минут пробирку центрифугировали 2 минуты при 12000 об./мин, затем отбирали 0,2 мл супернананта и вносили его в пробирку, содержащую 0,2 мл реактива Шомоди. Пробирку плотно закрывали крышкой и помещали в кипящую водяную баню на 40 минут. После этого пробирку охлаждали холодной водой, добавляли 0,2 мл реактива Нельсона, встряхивали, выдерживали 10 минут при комнатной температуре, добавляли 0,4 мл ацетона и 1 мл дистиллированной воды. Пробирку центрифугировали 46 2 минуты при 12000 об./мин, раствор переносили из пробирки в кювету спектрофотометра и измеряли оптическую плотность раствора при 610 нм против кюветы с раствором «фона буфера». Полученную оптическую плотность обозначали как Афр (оптическая плотность ферментативной реакции). Концентрацию восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте) в пробе вычисляли относительно данных калибровочного графика [131]. 2.7.4.2 Определение концентрации белка методом Лоури При определении белка методом Лоури использовали следующие реагенты: раствор «A» - 2% Na2CO3, 0,02% Na,K-тартрат в 0,1 М растворе NaOH; раствор «B» - 0.5% водный раствор CuSO45H2O; раствор «C» - 50 мл «А» + 1мл «B»; Раствор «D» - коммерческий реагент Фолина, разбавленный (1:1) водой. К 0.1 мл раствора белка добавляли 1 мл раствора «C» и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут; далее добавляли 0,1 мл раствора «D», перемешивали и, после 40 минут инкубации при комнатной температуре, измеряли А750. В качестве контроля ставили аналогичный эксперимент, в котором вместо фермента добавляли воду, в которой был растворен белок. Содержание белка определяли по калибровочной кривой [131]. 2.7.4.3 Определение β-глюканазной активности Метод основан на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (методом Нельсона-Шомоди) при гидролизе βглюканазами β -глюкана ячменя. За единицу β-глюканазной активности принимают начальную скорость гидролиза β-глюкана, равную 1 микромолю восстанавливающих 47 сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 мин при 50 oC и pH 5,0 (0,05M Na-ацетатный буфер). β-глюканазную активность определяют, проводя реакцию гидролиза β -глюкана в течение 10 минут в термостатируемой (при 50 о С) градуированной пробирке (1,5 см x 15 см) при рН 5,0. Для этого 0,25 мл запасного раствора 1% β -глюкана помещают в градуированную пробирку, добавляют туда 0,15 мл 0,05M Na-ацетатного буфера, рН 5,0, прогревают эту смесь при 50 oC в течение 5 минут. Вносят в пробирку (фиксируя при этом начало времени реакции по секундомеру) 0,1 мл раствора анализируемого ферментного препарата, предварительно разбавленного должным образом ацетатным буфером и прогретого в течение 5 минут при 50 oC. Реакционную смесь быстро перемешивают и инкубируют 10 мин при 50 oC (в течение этих 10 минут осуществляется реакция гидролиза β-глюкана β-глюканазой). После 10 минут реакции (по секундомеру) в пробирку добавляют 0,5 мл реактива Шомоди, перемешивают и помещают пробирку в кипящую баню на 40 минут. После этого пробирку охлаждают холодной водой (или во льду), добавляют 0,5 мл реактива Нельсона, перемешивают и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Доводят объем раствора в пробирке дистиллированной водой до 5 мл. Переносят раствор из пробирки в кювету спектрофотометра и измеряют оптическую плотность раствора при 610 нм против кюветы со стандартным раствором [131]. 2.7.4.4 Метод определения β-глюкозидазной активности β-глюкозидазную активность определяют по гидролизу п-нитрофенилβ-D-глюкопираноида (пНФГ) концентрацией 1 мМ (Sigma, N-8016) при 40ºС и рН 5,0. Запасной раствор пНФГ (10 мМ) готовят, растворяя 6 мг пНФГ в 2 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0 [132]. Для осуществления реакции гидролиза 0,1 мл запасного раствора пНФГ смешивают с 0,8 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0 (нагретого предварительно до 40 ºС), вносят в 48 реакционную смесь 0,1 мл предварительно разбавленного ферментного препарата β-глюкозидазы, инкубируют реакционную смесь при 40 ºС в течение 10 мин, после чего останавливают реакцию гидролиза пНФГ добавлением в реакционную смесь стоп-реагента (0,5 мл 1 М раствора Na2CO3) и определяют оптическую плотность раствора при 400 нм (Аф). Разбавление ферментного препарата выбирают таким образом, чтобы оптическая плотность находилась в диапазоне 0,05-0,35 ед. Раствор сравнения готовят, смешивая 0,1 мл запасного раствора пНФГ с 0,9 мл 0,1 М ацетатного буфера и 0,5 мл 1 М Na2CO3 (измеряемая в этом растворе при 400 нм оптическая плотность обозначается как Ас). Стоп-реагент (1 М раствора Na2CO3) готовят, растворяя 10,6 г безводного Na2CO3 в 80 мл дистиллированной воды и доводят далее объем раствора до 100 мл. За единицу фермента, β-глюкозидазной которое активности освобождает принимают за 1 мин такое 1 количество микромоль п- нитрофенилгюкозида при рН 5,0 и 40ºС. 2.7.4.5 Определение карбоксиметилцеллюлазной активности За единицу КМЦ-азной активности принимают начальную скорость гидролиза КМЦ, равную 1 микромолю восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 минуту при 50 oC и pH 5,0 (0,05M Na-ацетатный буфер). КМЦ-азную активность определяют, проводя реакцию гидролиза КМЦ в течение 5 минут в термостатируемой (при 50 оС) градуированной пробирке (1,5 см х 1 см) при рН 5,0. Для этого 0,25 мл запасного раствора 1% КМЦ помещают в градуированную пробирку, предварительно прогревают при 50oC в течение 5 мин. Вносят в пробирку (фиксируя при этом начало времени реакции по секундомеру) 0,25 мл раствора анализируемого ферментного препарата, предварительно разбавленного должным образом ацетатным буфером и прогретого в течение 5 минут при 50 оС. Ракционную смесь быстро перемешивают и инкубируют 49 5 минут при 50 oC (в течение этих 5 минут осуществляется реакция гидролиза КМЦ целлюлазами). После 5 мин реакции (по секундомеру) в пробирку добавляют 0,5 мл реактива Шомоди, перемешивают и помещают пробирку в кипящую баню на 40 минут. После этого пробирку охлаждают холодной водой (или во льду), добавляют 0,5 мл реактива Нельсона, перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Далее в пробирку добавляют 1 мл ацетона для растворения осадка КМЦ, образовавшегося при кипячении, и доводят объем раствора в пробирке дистиллированной водой до 5 мл. Переносят раствор из пробирки в кювету спктрофотометра и измеряют оптическую плотность раствора при 610 нм против кюветы со стандартным раствором [131]. 2.7.4.6 Определение ксиланазной активности За единицу ксиланазной активности принимают начальную скорость гидролиза березового ксилана, равную 1 микромолю восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 минут при 50 oC и pH 5,0 (0,05M Na-ацетатный буфер). Ксиланазную активность определяют, проводя реакцию гидролиза ксилана в течение 10 минут в термостатируемой (при 50 оС) градуированной пробирке (1,5 см х 1,5 см) при рН 5,0. Для этого 0,25 мл запасного раствора 1 % ксилана помещают в градуированную пробирку, добавляют туда 0,15 мл 0,05М Na-ацетатного буфера, рН 5,0, прогревают эту смесь при 50 оС в течение 5 минут. Вносят туда (фиксируя при этом начало времени реакции по секундомеру) 0,1 мл раствора анализируемого ферментного препарата, предварительного разбавленного должным образом ацетатным буфером и прогретого в течение 5 минут при 50 оС. Реакционную смесь быстро перемешивают и инкубируют 10 минут при 50 oC (в течение этих 10 минут осуществляется реакция гидролиза ксилана ксиланазой). После 10 минут реакции (по секундомеру) в пробирку добавляют 0,5 мл реактива Шомоди, перемешивают и помещают пробирку в 50 кипящую баню на 40 минут. После этого пробирку охлаждают холодной водой (или во льду), добавляют 0,5 мл реактива Нельсона, перемешивают и инкубируют 10 минут при комнатной температуре. Доводят объем раствора в пробирке дистиллированной водой до 5 мл. Переносят раствор из пробирки в кювету спектрофотометра и измеряют оптическую плотность раствора при 610 нм против кюветы со стандартным раствором [133]. 3. Исследование процессов гидролиза лигноцеллюлозо-содержащего сырья и микробиологическая конверсия продуктов в анаэробных условиях 3.1 Предварительная обработка березового опила разбавленной сернистой кислотой Во время предобработки растительной биомассы слабыми кислотами такие параметры, как температура, время, концентрация кислоты и гидромодуль играют решающую роль в получении оптимального количества восстановленных сахаров и минимального количества ингибиторов [75]. Процесс предобработки сырья должен быть недорогим для обеспечения конкурентоспособности технологии и эффективного использования лигноцеллюлозного сырья. В большинстве кинетических исследований [75, 134, 135, 139] показано, что энергия активации для реакции гидролиза растительного сырья больше, чем реакции разложения моносахаридов. Высокая температура реакции, таким образом, способствует гидролизу больше, чем разложению. Выход моносахаридов, следовательно, будет увеличиваться вместе с температурой реакции. Это означает, что на практике должны быть применены максимально возможные температуры. Верхний предел температуры ограничен только практическими факторами такими, как давление в реакторе и возможность контролировать короткое время реакции. С целью определения оптимальных условий обработки березового опила гидролиз проводили в диапазоне температур 190-250 °С при 51 варьировании концентрации сернистой кислоты от 0,6 до 2,5 % масс и гидромодуле 1:3,5 (рисунки 3-5) [136-138]. Как видно из представленных графиков, низкие концентрации кислоты компенсируется высокой температурой в соответствии со временем реакции. Рисунок 3 - Изменение концентрации редуцирующих веществ в процессе предобработки березового опила в диапазоне температур 190-250 °С (гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 0,6 % масс.) При обработке березового опила сернистой кислотой концентрацией 0,6 % масс при температуре 190 °С максимальное содержание редуцирующих веществ в гидролизате детектировали через 20 минут. 52 Рисунок 4 - Изменение концентрации редуцирующих веществ в процессе предобработки березового опила в диапазоне температур 190-250 °С (гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты от 1,18 % масс.) Повышение концентрации сернистой кислоты до 1,8 и 2,5 % масс способствовало сокращению продолжительности обработки, необходимой для достижения максимального выхода редуцирующих веществ и составило 10 минут (рис. 4, 5). Такая же закономерность была характерна и для температуры 200 °С. Как видно из графиков (рисунки 3-5), характер кинетических зависимостей определяется концентрацией сернистой кислоты тем значительнее, чем меньше температура гидролиза. Рисунок 5 - Изменение концентрации редуцирующих веществ в процессе предобработки березового опила в диапазоне температур 190-250 °С (гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты от 2,5 % масс.) Повышение температуры в большей степени, по сравнению с повышением концентрации гидролизующего агента, способствовало сокращению продолжительности обработки, необходимой для достижения максимального выхода редуцирующих веществ. 53 Наибольшая скорость предобработки березового опила сернистой кислотой (накопления продуктов реакции) была достигнута при температуре 250 °С. Продолжительность предобработки, необходимой для достижения максимальной концентрации редуцирующих веществ в гидролизате составила 4 минуты. Как видно из графиков с повышением концентрации сернистой кислоты также наблюдается увеличение скорости распада сахаров. С целью определения оптимальной дозировки сернистой кислоты, обеспечивающей максимальную концентрацию редуцирующих веществ в гидролизате проведены исследования кинетики гидролиза березового опила 1,77 и 2,0 % масс сернистой кислотой в диапазоне температур 240-250 °С при гидромодуле 1:3,5 (таблица 8). Показано, что с повышением концентрации сернистой кислоты наблюдается увеличение скорости распада сахаров. Максимальная концентрация редуцирующих веществ в гидролизатах при применении сернистой кислоты 1,18-2,0 % масс. в диапазоне температур 240-250 °С составляла 5 и 4 минуты соответственно. Увеличение концентрации сернистой кислоты до 2,0 % масс. приводит к незначительному повышению концентрации редуцирующих веществ в гидролизате по сравнению с применением 1,77 % масс. Наиболее целесообразным и достаточным является применение сернистой кислоты концентрацией 1,77 % масс. Важным при гидролизе является снижение гидромодуля с целью повышения концентрации редуцирующих веществ и уменьшения объема сточных вод. Имеющиеся в литературе сведения о влиянии гидромодуля на эффективность и скорость гидролиза неоднозначны. Отмечается, что уменьшение величины гидромодуля приводит к снижению константы скорости гидролиза. Это связывают с влиянием зольных элементов и концентрации углеводов внутри частиц сырья на каталитическую активность кислот [75]. Однако исследование гидролиза целлолигнина 0.5% серной 54 кислотой при 200 °С показало, что снижение гидромодуля до 2 не влияет на выход редуцирующих веществ и скорость гидролиза [134]. Приведенные данные подтверждают необходимость исследования влияния гидромодуля на скорость гидролиза и выход редуцирующих веществ при обработке березового опила сернистой кислотой. 55 Таблица 8 - Исследование кинетики предобработки березового опила в диапазоне температур 240-250 °С при гидромодуле 1:3,5 и варьировании концентрации сернистой кислоты Продолжительность Температура предобработки, °С 240 240 предобработки, мин 240 240 250 250 250 250 250 1,77 2,00 Концентрация сернистой кислоты в реакционной среде, % масс 0,60 1,18 1,77 2,50 0,60 1,18 1,50 Концентрация редуцирующих веществ в гидролизате, % 2 3 4 5 6 … … … 5,72±0,15 6,73±0,21 6,68±0,15 … … … 6,95±0,10 7,38±0,25 7,68±0,24 … … … … … 7,12±0,21 6,08±0,11 … … 6,84±0,11 7,05±0,16 … … 3,08±0,15 2,91±0,22 2,56±0,15 2,83±0,14 6,95±0,11 6,88±0,15 6,46±0,23 7,14±0,11 7,42±0,10 7,35±0,18 7,70±0,07 7,89±0,21 6,48±0,12 7,10±0,27 5,90±0,29 6,73±0,27 4,00±0,15 3,32±0,08 … 2,18±0,19 10 4,48±0,19 1,93±0,13 2,61±0,10 0,63±0,15 1,94±0,20 … … 0,63±0,17 … 20 1,12±0,15 0,63±0,15 0,79±0,05 0,37±0,24 … … … … … 30 0,53±0,10 0,57±0,22 0,29±0,11 0,29±0,14 … … … … … … - в данных точках измерения не проводились 56 С целью определения оптимальных условий проведен гидролиз березового опила 1,77 % масс сернистой кислотой при температуре 250 °С Концентрация редуцирующих веществ, % при варьировании гидромодуля от 1:3 до 1:5 (рисунок 6). 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Продолжительность, мин 1: 3 1 : 3,5 1: 5 1 : 5,8 Рисунок 6 - Изменение концентрации редуцирующих веществ при гидролизе березового опила раствором сернистой кислоты концентрацией 1,77 % масс при температуре 250 °С и разном гидромодуле Как видно из графиков, повышение гидромодуля до 1:5 и 1: 5,8 привело к снижению скорости гидролиза березового опила, по сравнению с гидромодулем 1:3 и 1:3,5. Обработка березового опила 1,77 % масс. сернистой кислотой при температуре 250 ºС, гидромодуле 1:3 в течение 4 минут позволяет получать гидролизаты с концентрацией редуцирующих веществ до 8,9 %. Оставшуюся после гидролиза твердую фракцию отделяли центрифугированием на лабораторной автоматической центрифуге с охлаждением при скорости вращения ротора 2000 об/мин в течение 15 минут. Полученный после центрифугирования осадок, содержащий лигноцеллюлозу, дополнительно промывали четырехкратным объемом 57 дистиллированной воды, нагретой до 90 °С в течение 10 минут с целью извлечения оставшихся в сырье сахаров. Данная обработка позволила дополнительно увеличить выход редуцирующих веществ. Выход редуцирующих веществ при гидролизе березового опила раствором сернистой кислоты концентрацией 1,77 % масс при температуре 250 °С и варьировании гидромодуля приведен на рисунке 7. Выход редуцирующих веществ, % от АСВ березового опила 35 30 25 20 15 10 5 0 1:3 1:3.5 1:5 Гидромодуль в процессе гидролиза общий выход 1:5.8 при обработке водой Рисунок 7 - Выход редуцирующих веществ при гидролизе березового опила раствором сернистой кислоты концентрацией 1,77 % масс при температуре 250 °С и варьировании гидромодуля Наибольший выход редуцирующих веществ достигнут при гидромодуле 1:3,5, 1:5 и 1:5,8 и составил 26,8 %, 27,0 % и 29,2 % соответственно. Для характеристики углеводов, извлекаемых при предобработке березового опила разбавленной сернистой кислотой был определен их моносахаридный состав (таблица 9). 58 рамноза арабиноза галактоза глюкоза ксилоза галактуро- глюкуро- Суммарное новая новая содержание кислота кислота моносаха- моль %** мг/мл моль %** мг/мл моль %** мг/мл моль %** мг/мл моль %** 200 0,6 10 2,7 4,8 1,1 2,1 3,6 5,7 18,8 29,8 29,8 55,9 0,4 0,6 0,1 0,2 56,50 210 1,18 5 2,0 4,1 0,9 2,1 2,9 5,4 14,3 26,4 26,9 59,4 1,3 2,2 0,2 0,4 48,70 230 0,6 5 2,3 4,1 1,1 2,1 3,4 5,4 18,5 29,7 29,6 56,8 1,1 1,6 0,2 0,3 56,13 240 0,6 5 1,6 3,9 0,8 2,0 2,4 5,2 11,0 23,8 24,8 64,1 0,4 0,7 0,2 0,3 41,16 240 1,18 5 2,3 3,7 0,9 1,6 3,1 4,6 29,8 43,6 26,2 46,0 0,3 0,4 0,2 0,2 62,78 250 1,18 4 1,7 3,1 0,7 1,5 2,5 4,1 25,5 42,1 24,1 47,8 0,7 1,0 0,2 0,3 55,37 250 1,77 4 1,3 2,4 0,6 1,2 1,9 3,4 27,0 46,8 21,4 44,6 0,9 1,5 0,2 0,2 53,21 мг/мл мг/мл моль %** моль %** ридов в мг/мл обработки, мин % масс Продолжительность Концентрация H2SO3, Температура, ºС Таблица 9 - Моносахаридный состав гидролизатов березового опила при варьировании концентрации сернистой кислоты от 0,6 до 1,77 % масс при гидромодуле 1:3,5 в диапазоне температур от 200 до 250 °С* Содержание моносахаридов гидролизатах, мг/мл * погрешность реализации экспериментов при хроматографировании не превышала 10 % относительных ** % по отношению к другим моносахаридам в гидролизате, моль % 59 Наибольшее содержание моносахаридов наблюдалось при гидролизе березового опила 1,18 % масс сернистой кислотой при гидромодуле 1:3,5 в течение 5 минут при температуре 240 °С. Во всех гидролизатах преобладали глюкоза и ксилоза, содержание которых варьировало от 23,8 до 57,7 моль % и от 14,2 до 29,8 моль % от суммы моносахаридов соответственно (рисунок 8). глюкуроновая кислота следы рамноза 2,4 моль % арабиноза галактоза 1,2 моль % 3,4 моль % галактуроновая кислота 1,5 моль % ксилоза 45 моль % глюкоза 46,8 моль % Рисунок 8 - Моносахаридный состав гидролизата березового опила (концентрация сернистой кислоты1,77 % масс, 250 °С, гидромодуль 1:3,5 продолжительность обработки 4 мин) Таким образом, обработка березового опила 1,77 % масс. сернистой кислотой при температуре 250 ºС, гидромодуле 1:3 в течение 4 мин позволяет получать гидролизаты с концентрацией редуцирующих веществ до 8,9 %, что будет способствовать снижению энергетических и приведенных затрат при их дальнейшем использовании в микробиологической промышленности. При применении гидромодуля 1:3,5 максимальная концентрация редуцирующих веществ в гидролизате достигнута при температуре 250 ºС, концентрации сернистой кислоты 1,77 % 60 масс. Выход редуцирующих веществ составил 23.5 % от абсолютно сухого вещества березового опила. В качестве процесса предобработки березового опила также целесообразен гидролиз березового опила 0,6 % масс сернистой кислотой при 200 °С в течение 20 минут позволяющий удалить 23,2 % редуцирующих веществ от массы абсолютно сухого вещества березы. 3.2 Исследование процессов ферментативного гидролиза березового опила Полученный лигноцеллюлозу, после центрифугирования промывали осадок, дистиллированной водой содержащий и подвергали гидролизу ферментнымми комплексами «CellicCTec2» и «CellicНTec2». Предварительно была определена активность компонентов ферментных комплексов (таблицы 10-14). 220±6,6 3430±68,2 3700±93,0 130±3,1 70±3,5 880±28,1 2490±99,1 1210±42,1 β -ксилозидаза, единиц/мл комплекса β-глюкозидаза, единиц/мл ферментного ксиланаза, единиц/мл целлобиаза, единиц/мл компонентов авицелаза, единиц/мл Активность FPA*, единиц/мл - β-глюканаза, единиц/мл карбокси-метилцеллюлаза, единиц/мл Белок, мг/мл Таблица 10 «CellicCTec2» <1 * Filter Paper Activity - единиц фильтровальной бумаги/мл ферментного препарата 61 Полученные показателями, данные по представленными содержанию в паспорте белка согласуются ферментного с комплекса «CellicCTec2» (белок 200 мг/мл). Наибольшую активность в комплексе «CellicCTec2» проявляли βглюканаза, карбоксиметилцеллюлаза, ксиланаза и целлобиаза. Согласно паспортным данным, комплекс «CellicCTec2» в своем составе содержит целлюлазу и ксиланазу. Проведенные исследования позволили выявить широкий спектр ферментов в составе данного комплекса. 15,6±0,32 16,8±0,26 0,6±0,02 0,3±0,01 4,0±0,09 11,3±0,13 5,5±0,11 β -ксилозидаза, единиц/мл β-глюкозидаза, единиц/мл ксиланаза, единиц/мл целлобиаза, единиц/мл авицелаза, единиц/мл FPA*, единиц/мл β-глюканаза, единиц/мл карбокси-метилцеллюлаза, единиц/мл Таблица 11 – Специфическая активность компонентов ферментного комплекса «CellicCTec 2» <0,1 Полученные данные по содержанию белка были выше по сравнению с представленными в паспорте ферментного комплекса «CellicНTec2» (белок 100-200 мг/мл). 62 Таблица 12 - Активность компонентов ферментного комплекса «CellicНTec 0 β-глюкозидаза, единиц/мл 0 ксиланаза, единиц/мл целлобиаза, единиц/мл 42±0,34 3,2±0,06 4,7±0,10 авицелаза, единиц/мл β-глюканаза, единиц/мл карбокси-метилцеллюлаза, единиц/мл Белок, мг/мл 2» 2319±82 0,3±0,02 Таблица 13 - Специфическая активность компонентов ферментного Согласно 0 0 β-глюкозидаза, единиц/мл авицелаза, единиц/мл 55,2±0,16 ксиланаза, единиц/мл 0,11±0,02 целлобиаза, единиц/мл 0,08±0,001 β-глюканаза, единиц/мл карбокси-метилцеллюлаза, единиц/мл комплекса «CellicНTec2» 0,01±0,0022 паспортным данным, комплекс «CellicНTec2» в своем составе содержит лишь ксиланазу. Проведенные исследования позволили выявить также карбокси-метилцеллюлазу и β-глюканазу в составе данного комплекса. 63 Проведено исследование влияния рН и температуры на активность компонентов ферментных комплексов «CellicCTec2» и «CellicНTec2» (рисунки 9-12). Рисунок 9 – Исследование влияния рН на активность компонентов ферментного комплекса «CellicCTec2» Из графиков, представленных на рисунке 9, следует, что оптимум активности компонентов ферментного комплекса «CellicCTec2» лежит в пределах рН 4,5-5,5, что коррелирует с данными, заявленными производителем (в диапазоне температур от 45-50 °С оптимум рН 5,0-5,5). 64 Рисунок 10 – Исследование влияния рН на активность ксиланазы ферментного комплекса «CellicНTec2» Оптимум активности ксиланазы ферментного комплекса «CellicНTec2» достигается при рН 5,5. Согласно паспортным данным максимальная активность ферментного комплекса «CellicНTec2» в диапазоне температур 45-50 °С наблюдается при рН 5,0. Исследование влияния температуры на активность компонентов ферментного комплекса «CellicCTec2» показало, что для авицелазы, βглюкозидазы и ксиланазы максимальная активность достигается при температуре 60 °С, а для карбокси-метилцеллюлазы – при 70°С, что несколько выше температурного диапазона, рекомендуемого производителем ферментного комплекса (45-50 °С). 65 Рисунок 10 – Исследование влияния температуры компонентов ферментного комплекса «CellicCTec2» на активность Рисунок 11 – Исследование влияния температуры на активность ксиланазы ферментного комплекса «CellicНTec2» 66 Исследование влияния температуры на активность ксиланазы ферментного комплекса «CellicНTec2» показало, что ксиланаза достаточно термостабильна и достигает максимальной активности при 80 °С, что также выше температурного диапазона, рекомендуемого производителем ферментного комплекса (45-50 °С). Согласно предварительно проведенной оценке влияния температуры и рН на активность ферментных комплексов, а также в целях снижения энергозатрат ферментативный гидролиз исследуемого сырья при рН 5,0 и температуре 50 °С. Дозировка ферментного комплекса варьировала от 4 до 6 % от абсолютно сухого вещества (АСВ) березового опила, гидромодуль 1:1530 (рисунки 12-14). Рисунок 12 - Изменение концентрации редуцирующих веществ при ферментолизе березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой, при варьировании дозировки ферментного комплекса «CellicCTec2» (гидромодуль 1:30) 67 Рисунок 13 - Изменение концентрации редуцирующих веществ при ферментолизе березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой, при варьировании дозировки ферментного комплекса «CellicCTec2» (гидромодуль 1:20) Из данных, представленных на рисунках 12-15, оптимальной является концентрация ферментного комплекса «CellicCTec2» 5 % от АСВ, так как увеличение его дозировки до 6 % от АСВ березы не приводило к существенному увеличению выхода редуцирующих веществ при гидролизе. 68 Рисунок 14 - Изменение концентрации редуцирующих веществ при ферментолизе березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой, при варьировании дозировки ферментного комплекса «CellicCTec2» (гидромодуль 1:20) Рисунок 15 - Выход редуцирующих веществ при ферментолизе березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой, при варьировании гидромодуля (дозировка ферментного комплекса «CellicCTec2» 5 % от АСВ березового опила, продолжительность гидролиза 76 ч.) 69 В связи с тем, что твердая фракция, отделенная после предобработки березового опила, помимо целлюлозы, может также содержать и ксиланы, нами применен ферментный комплекс «CellicНTec2» в сочетании с препаратом «CellicСTec2», согласно дозировке, рекомендуемой производителем (таблица 14). Таблица 14 - Изменение концентрации редуцирующих веществ при ферментолизе березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой (дозировка «CellicНTec2» и «CellicСTec2» - 2 % и 3 % от АСВ березового опила соответственно, гидромодуль 1:30) Продолжительность гидролиза, ч Концентрация Выход редуцирующих редуцирующих веществ, % веществ, % от АСВ березового опила 8 0,70±0,09 20,9 24 1,05±0,15 31,5 48 1,08±0,32 32,4 72 1,11±0,18 33,3 120 1,13±0,11 33,8 Применение ферментного комплекса «CellicНTec2» в сочетании с препаратом «CellicСTec2» не привело к увеличению выхода редуцирующих веществ по сравнению с использованием «CellicСTec2» при прочих равных условиях проведения ферментативного гидролиза березового опила. Это может свидетельствовать о низком содержании ксиланов в твердой фракции, оставшейся свидетельствуют после данные предобработки моносахаридного сырья, состава о чем также ферментолизатов березового опила (рисунок 16), согласно которым доля ксилозы в ферментолизате не превышало 2,5 % по отношению к другим моносахаридам. 70 Рисунок 16 – Моносахаридный состав ферментативного гидролизата березового опила (гидромодуль 1:30, дозировка ферментного комплекса «CellicCTec2» 5% от АСВ березы, рН 5,0, температура 50 °С.) Следует также отметить, что предобработка березового опила сернистой кислотой позволила значительно увеличить выход редуцирующих веществ (в 26,7 раз) по сравнению с березой, не подвергавшейся предварительной обработке. Изучение влияния гидромодуля при ферментативном гидролизе на выход редуцирующих веществ показало, что его снижение от 1:30 до 1:15 приводит к увеличению концентрации редуцирующих веществ в гидролизате от 2,8 до 3,6 %, однако выход редуцирующих веществ при этом снижается от 55,2 до 39,04 % соответственно. Это может быть связано с процессами ингибирования ферментов конечными продуктами гидролиза. Суммарный выход редуцирующих веществ при двухстадийной обработке березового опила составил 82,0 % от АСВ березового опила. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза березового опила являлись: гидромодуль 1:30, дозировка ферментного комплекса «CellicCTec2» 5% от АСВ березы, рН 5,0, температура 50 °С. 71 3.3 Изучение кинетики предобработки свекловичного жома раствором сернистой кислоты в диапазоне температур 200-230 °С Ранее в лаборатории «Инженерные проблемы биотехнологии» ФГБОУ ВПО «КНИТУ» проводились исследования предобработки свекловичного жома в гидролизере капсульного типа с масляным термостатом в диапазоне температур 160 0С-190 0С и варьировании концентраций сернистой кислоты при различных гидромодулях [114, 139-141]. Был определен качественный и количественный состав легко- и трудногидролизуемых полисахаридов свекловичном жома, а также полученных гидролизатов. Однако конструктивные особенности используемой установки не позволили авторам исследовать кинетику предобработки свекловичного жома при температурах свыше 190 0С. Авторы [114, 139-141] отмечают, что повышение температуры обработки может способствовать более эффективному гидролизу гемицеллюлоз, а, следовательно, и более эффективной предобработке свекловичного жома. В связи с вышеперечисленным, в данной работе проведено изучение кинетики предобработки свекловичного жома раствором сернистой кислоты в диапазоне температур 200-230 °С на гидролизере с тепловым аккумулятором. Помимо диапазона рабочих температур и способа нагрева, установки, применяемые в исследованиях, отличались конструктивными особенностями капсул (таблица 6). Для сопоставления экспериментальных данных нами был повторно проведен гидролиз свекловичного жома при температуре 190 °С, а также изучена кинетика гидролиза данного вида сырья при 200 ° С на гидролизере капсульного типа с масляным термостатом (рисунок 17) при концентрации сернистой кислоты (1 % масс.) и гидромодуле (1:3), определенных в качестве оптимальных в предыдущих исследованиях [114, 139-141]. 72 Концентрация редуцирующих веществ, % 10 8 6 4 2 0 0 10 20 30 40 Продолжительность, мин 190 °С 50 200 °С Рисунок 17 - Изменение концентрации редуцирующих веществ в процессе гидролиза свекловичного жома при температуре 190 и 200 °С (гидромодуль 1:3, концентрация сернистой кислоты 1 % масс.) на гидролизере капсульного типа с масляным термостатом Как следует из графиков, представленных на рисунке 17, при обработке свекловичного жома на гидролизере капсульного типа с масляным термостатом повышение температуры на 10 °С способствует росту концентрации редуцирующих веществ в гидролизате. Максимальная концентрация редуцирующих веществ в процессе гидролиза свекловичного жома при температуре 190 и 200 °С составила 8,54 % и 8,76 % соответственно, что согласуется с данными полученными ранее в работах [114, 139-141]. При исследовании кинетики гидролиза на гидролизере капсульного типа с масляным термостатом для быстрого выхода температуры на заданный режим все капсулы одновременно погружали в предварительно перегретую на 10 °С ёмкость с силиконовым маслом. В момент погружения капсул на терморегуляторе устанавливали изучаемую температуру. Перегрев теплоносителя, необходимый для быстрого выхода уставки на заданный режим, был подобран экспериментально. Однако диапазон рабочих температур (таблица 73 6) не позволил предварительно нагреть термостат до 210 °С. Этим объясняется увеличение продолжительности гидролиза необходимого для достижения максимальной концентрации редуцирующих веществ при 200 °С. В связи с этим дальнейшее исследование процесса гидролиза свекловичного жома при более высоких температурах проводились на гидролизере с металлическим тепловым аккумулятором. Исследовано влияние температуры на концентрацию редуцирующих веществ в диапазоне температур 190-230 ºС при гидромодуле 1:3 и концентрации сернистой кислоты 1 % масс (таблица 15). Из таблицы 15 следует, что при температурах 190 ºС и 200 ºС концентрация редуцирующих веществ в гидролизатах, полученных на гидролизере с металлическим тепловым аккумулятором ниже, чем в гидролизатах, полученных при тех же режимах на гидролизере с масляным термостатом. Таблица 15 – Концентрация редуцирующих веществ в гидролизатах, полученных на гидролизере капсульного типа с металлическим тепловым аккумулятором Температура, °С Продолжительность гидролиза, мин 190 200 220 230 3 … … … 5,58 5 5,07 6,53 7,50 5,83 10 6,71 5,67 3,80 2,93 15 … 5,15 2,21 1,63 20 … 4,98 1,77 1,54 … - в данных точках измерения не проводились Это может быть связано с конструктивными особенностями капсул, применяемых в гидролизерах, и принципом обогрева капсул (рисунок 18). 74 а) б) Рисунок 18 - Общий вид капсул для исследования кинетики процессов гидролиза: (а) гидролизер капсульного типа с масляным термостатом; (б) гидролизер капсульного типа с металлическим тепловым аккумулятором В целом, проведенные исследования высокотемпературного гидролиза свекловичного жома позволяют сделать вывод, что при подъеме температуры выше 200 ºС возрастает скорость выхода и распада сахаров и детектирование максимальной концентрации редуцирующих веществ за столь короткие промежутки времени является затруднительным в связи с конструктивными особенностями гидролизера. В проведенных ранее исследованиях [114] был определен лишь моносахаридный состав гидролизатов, полученных при предобработке свекловичного жома 1 % масс сернистой кислотой при гидромодуле 1:3 в диапазоне температур от 170 ºС до 190 ºС. С целью прогнозирования влияния температурной зависимости и концентраций сернистой кислоты на выход моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой нами было проведено дополнительное экспериментальное определение кинетики выхода моносахаридов в диапазоне температур 170 ºС -200 ºС и концентрации сернистой кислоты 0,59-1,66 % масс (таблица 16). 75 мг/мл мг/мл мг/мл 20 20 20 15 5 10 15 20 30 15 10 5 20 30 40 10 10 20 мг/мл Время, мин 0,59 1,0 1,66 0,59 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,66 0,59 1,0 1,0 1,0 1,0 1,66 1,0 1,0 мг/мл Концентраци я H2SO3, % масс 170 170 170 180 180 180 180 180 180 180 190 190 190 190 190 190 200 200 Содержание моносахаридов мг/мл Температура, ºС Таблица 16 - Моносахаридный состав гидролизатов, полученных* при предобработке свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой (гидромодуль 1:3)** Суммарное содержание моносахаридов в гидролизатах, мг/мл 0 0,6 1,1 0,04 0 0 0 2,0 0 1,5 0,3 0 0 0 1,4 0 1,4 0,6 6,2 6,0 7,5 5,99 3,0 5,8 6,4 5,4 3,8 6,4 4,5 2,4 6,0 4,5 3,2 7,4 5,0 2,9 2,7 2,1 3,6 2,55 0,6 2,2 3,4 3,5 7,0 3,7 0,8 1,8 3,4 3,2 2,9 3,6 3,1 0,7 6,1 5,3 6,7 6,39 5,0 6,5 6,1 6,0 3,9 6,1 4,6 4,7 5,4 4,6 4,2 6,5 5,0 4,8 1,7 0,6 1,6 1,67 1,2 1,1 2,1 2,0 1,2 2,0 0,3 0,2 1,6 1,6 1,0 2,2 1,7 0,6 1,1 0,9 1,8 1,1 0,2 0,8 1,4 1,0 0,3 2,0 0,4 0,2 1,2 0,4 0,1 2,3 0,1 0,2 17,8 15,5 22,4 17,84 9,9 16,5 19,4 20,0 16,1 21,6 10,9 9,3 17,6 14,4 12,8 21,9 15,5 9,8 рамноза арабиноза галактоза глюкоза ксилоза галактуроновая кислота * приведенный в настоящей таблице моносахаридный состав гидролизатов свекловичного жома получен в данной работе ** погрешность реализации экспериментов при хроматографировании не превышала 10 % относительных 76 Из данных, представленных на рисунках 19-21 можно сделать вывод, что с увеличением концентрации сернистой кислоты выход моносахаридов возрастает. Рисунок 19 – Концентрация сернистой кислоты (190 моносахаридов варьировании концентрации °С, гидромодуль 1:3, продолжительность предобработки 10 минут) Рисунок 20 – Концентрация сернистой кислоты (180 моносахаридов варьировании концентрации °С, гидромодуль 1:3, продолжительность предобработки 15 минут) 77 Высокое содержание галактозы может быть объяснено тем, что структурные составляющие пектинов могут включать (1→4) связанные β– галактаны с низкой степенью полисеризации и разветвленные (1→3,6) связанные галактаны, которые относительно легче других полисахаридов подвергаются гидролизу и выходят в гидролизат в виде моносахаридов [117]. Рисунок 21 – Концентрация сернистой кислоты (170 моносахаридов варьировании концентрации °С, гидромодуль 1:3, продолжительность предобработки 20 минут) Для условий оптимального режима (гидромодуль 1:3, концентрация сернистой кислоты 1,0 % масс) была исследована кинетика выхода моносахаридов в процессе гидролиза свекловичного жома при температурах 180 °С и 190 °С (рисунки 22, 23). Наибольшая концентрация моносахаридов наблюдалась при температуре 190 °С. Моносахаридный состав гидролизатов свекловичного жома, в диапазоне температур 170-190 °С, гидромодуле 1:3 и варьировании концентрации 78 сернистой кислоты от 0,59 до 1,66 % масс хорошо согласуется с данными, детектированными ранее в работах [114, 139-141]. Рисунок 22 – Изменение концентрации моносахаридов в гидролизате в процессе предобработки свекловичного жома 1,0 % масс H2SO3 при гидромодуле 1:3, температуре 180 °С Рисунок 23 – Изменение концентрации моносахаридов в гидролизате в процессе предобработки свекловичного жома 1,0 % масс H2SO3 при гидромодуле 1:3, температуре 190 °С Наибольший выход моносахаридов наблюдается при температуре 190 °С на 10 минуте. 79 3.4 Математическое моделирование кинетики выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома сернистой кислотой Для описания механизма гидролиза полисахаридов используют различные упрощенные формально-кинетические модели. Поскольку при низкокислотном гидролизе деполимеризация целлюлозы незначительна, были рассмотрены особенности моделирования реакции для гемицеллюлоз. Практически все известные модели гидролиза гемицеллюлоз представлены одной из четырех основных схем [142-151]. 1ая двухстадийная схема Саймана и соавторов, включающая псевдогомогенные необратимые реакции первого порядка: К 1 С К Р 2 продукты деструкции 2ая схема, включаящая в себя водорастворимый олигомер (О): К 1 О К Р 2 С К 3 продукты деструкции Эта модель основана на том, что кислотный катализатор разбивает длинные цепи гемицеллюлоз и формирует короткие олигомеры, которые продолжают распадаться до мономерных сахаров. Олигомеры, полученные в ходе процесса гидролиза, имеют различную степень полимеризации (2<СП <10). Концентрация олигомеров с различными значениями СП, как правило, гораздо меньше, чем концентрация мономеров. По этим причинам, многие кинетические исследования исключают олигомеры из моделей. Однако, ряд исследователей считает, что олигомеры углеводов играют ключевую роль в объяснении протекания процессов гидролиза. 3-я схема, которая включает быстрогидролизуемые (РБГ) и медленногидролизуемые (РМГ) фракции легкогидролизуемых полисахаридов [125]: РБГ К1 С К 3 продукты деструкции РМГ К2 80 Соотношение «быстрых» и «медленных» фракций связующих гликанов обычно сотавляет соответственно 65% и 35 % для большинства видов сырья. 4ая схема, включаящая в себя фракции ЛГП и водорастворимые олигомеры (О): РБГ К1 О К 3 С К 4 продукты деструкции РМГ где Pn, Оn, С – соответственно полисахариды, промежуточные продукты (олигосахариды, декстрины) и моносахариды. Рассмотренные механизмы не учитывают деструкцию простых сахаров с участием продуктов их разложения (фурфурол, 5-гидроксиметилфурфурол и др.). В данной работе математическое моделирование конверсии легкогидролизуемых полисахаридов свекловичного жома в моно- и олигосахариды было проведено с использованием схем 1 и 2. В общем виде последовательность превращений углеводов при кислотно-каталитическом воздействии для этих моделей можно представить как: mH O , K K2 продукты Pn 2 1 nС (nm)H O, K mH O, K 1(m 1)О Pn 2 n /(m 1) деструкции K 2 олиго 2 продукты деструкции nС где n, n/(m+1) – степень полимеризации полисахаридов и олигосахаридов; m, n-m – число молекул воды, вступивших в реакцию; k1 скорости гидролиза соответствующего полисахарида; – константа kолиго – константа скорости гидролиза промежуточного продукта Оn ; k2 – константа скорости деструкции соответствующего моносахарида. 81 Математическая модель процесса гидролиза связующих гликанов до моносахаридов описывает скорости изменения концентраций веществ и представляет собой систему дифференциальных уравнений кинетики: 1ая схема d [ Pn ] w1 , dt d [C ] w2 dt Здесь wj ( j =1,2) – скорость соответствующей стадии реакции гидролиза: w1 = - k1·[Pn], w2= k1·[Pn] – k2·[C] Выход моносахаридов с учетом их распада определяется по уравнению: [С] [ Рn0 ] k1 k1 t k 2 t e e (k 2 k1) где [Pno] – исходное количество полисахаридов, определенное в процессе полного гидролиза; t – продолжительность процесса гидролиза; μ – стехиометрический коэффициент пересчета соответствующего полисахарида в моносахарид, величина которого в зависимости от типа полисахарида находится в пределах 1,1 – 1,14. 2ая схема d [ Pn ] w1 , dt d [Оn ] dt wолиго . , d[C ] w2 dt Здесь wj – скорость соответствующей стадии реакции гидролиза: w1 = - k1·[Pn], wолиго = k1·[Pn] - kолиго·[On], w2 = kолиго ·[On] – k2· [C] Выход моносахаридов с учетом их распада: k t k t k t [Рn0 ] k1 k 2 e 1 e 3 e 2 e k 3 t , [С] (k 2 k1) k3 k1 k3 k 2 82 Константы скорости реакций рассчитывались по модифицированному уравнению Аррениуса, в котором предэкспоненциальный множитель зависит от концентрации кислотного катализатора [143, 150]: К0 А[Ckt ] , K А exp(Eа /(R T))[Ckt ] где K0 - предэкспоненциальный множитель для индивидуального моносахарида; Eа – энергия активации; Т – температура (К); С kt концентрация кислотного α– катализатора; показатель степени по концентрации катализатора. Задача идентификации многопараметрической решалась оптимизации стандартными функционала методами квадратичного отклонения между экспериментальными данными и кинетической моделью при различных начальных значениях параметров. Степень достоверности аппроксимации кинетических данных для каждого вида моносахаридов оценивалась с помощью критерия детерминации: n R2 1 [C Э k k 1 n [C 2 ] [C kТ ] Э k ] [С ] 2 k 1 Параметры гидролиза свекловичного жома, рассчитанные по схемам 1 и 2, имеют незначительные различия. Константы скорости превращения олигомера в мономер намного выше, чем константы образования олигомера (колиго >10·к1). О неустойчивости интермедиатов говорит и низкое содержание исследуемых олигосахаридов [114] в гидролизатах (≤ 2,8% от содержания соответствующего моносахарида). Поэтому в соответствии с методом стационарных состояний можно принять промежуточных продуктов неизменной во времени: d[Оn ] dt 0. концентрацию Это позволяет формально использовать более простую двухстадийную модель гидролиза без ущерба качества аппроксимации данных. 83 В таблице 17 представлены результаты моделирования образования и деструкции моносахаридов свекловичного жома по схеме 1. Расхождения в значениях параметров кинетики с данными [114], [150] можно объяснить различиями в применяемом виде сырья, типе и концентрации гидролизующего агента, условиях предварительной обработки, температуре проведения гидролиза, а также используемых реакторах и моделях. Таблица 17 - Кинетические параметры предобработки свекловичного жома (СH2S03=0,59-1,66% масс; Т=1800С-1900С) Моносахарид глюкоза галактоза арабиноза А1, Е1, α1 А2, Е2, а2 R2 мин-1 КДж/моль мин-1 КДж/моль 2,06 0,73 E+05 53,4 0,83 2,99E+03 30,3 0,81 4,64E+08 81,5 1,41 3,34E+08 75,4 1,13 0,83 4,07E+11 107,2 1,09 2,67E+07 64,5 0,90 0,82 В таблице 18 приведены константы скоростей образования и деструкции моносахаридов свекловичного жома. Таблица 18 - Константы скорости гидролиза свекловичного жома Моносахарид Катализатор глюкоза галактоза арабиноза H2S03 Условия реакции К1·102 К2·102 мин-1 мин-1 Т=1700С 1,80 14,86 гидромодуль 1:3 0, 58 3,96 Сkаt =1% масс 0, 95 9,97 Достаточно высокие значения критерия детерминации (таблица 17) позволяют сделать вывод, что модель Саймана качественно описывает выход моносахаридов в гидролизатах свекловичного жома во всем интервале изменений технологических параметров. Рисунки 24-26 демонстрируют 84 хорошую согласованность результатов моделирования и экспериментальных данных. Рисунок 24 - Изменение концентрации моносахаридов в гидролизате в процессе предобработки свекловичного жома 1,0 % масс H2SO3 при гидромодуле 1:3, температуре 190 °С: ♦ - глюкоза; ▲ - арабиноза; ■ - галактоза; ▬ - модель Для свекловичного жома расчет дает более низкие энергии активации и высокие значения констант скоростей по сравнению с другими видами сырья [142-161, 163]. Для время гидролиза обусловлено него также характерно меньшее оптимальное по сравнению, например, с пшеничной соломой. Это сравнительно небольшой степенью кристалличности целлюлозы и невысоким содержанием лигнина в жоме по сравнению с другими целлюлозосодержащими отходами. 85 Рисунок 25 - Изменение концентрации глюкозы в гидролизате в процессе предобработки свекловичного жома 0,59 % масс H2SO3 при гидромодуле 1:3, температуре 190 °С : ▬ - модель; ● - экспериментальные данные Рисунок 26 - Изменение концентрации арабинозы в гидролизате в процессе предобработки свекловичного жома 0,59 % масс H2SO3 при гидромодуле 1:3, температуре 190 °С : ▬ - модель; ● - экспериментальные данные Скорость всего процесса в целом и его кинетические закономерности определяются скоростью лимитирующей стадии. В кинетической области скорость диффузии значительно выше скорости химической реакции и, как следствие, скорость массопередачи не оказывает заметного влияния на 86 динамику превращения, поэтому скорость процесса определяется химической стадией. Кинетическая область протекания гетерогенных процессов обычно характеризуется сильной зависимостью скорости реакции от температуры (изменение в 2-4 на каждые 10 0С), сравнительно высокой энергией активации (Еа > 40 кДж/моль) и малой эффективностью перемешивания. На основании значений энергии активации реакции гидролиза (таблица 17) и температурных коэффициентов Вант-Гоффа (таблица 19) можно сделать вывод о протекании процесса в кинетической области. Таблица 19 - Температурные коэффициенты Вант-Гоффа Температура, 0С Свекловичный жом, Скаt=1% глюкоза галактоза арабиноза 170-180 1,38 1,63 1,90 180-190 1,36 1,60 1,85 Сравнительно низкие значения температурного коэффициента для глюкозы и галактозы свекловичного жома позволяют предположить, что явления диффузии могут оказывать заметное влияние на динамику выхода этих моносахаридов. Однако дополнительные исследования показали, что скорость гидролиза полисахаридов свекловичного жома практически не зависит от гидродинамических параметров. Известно также, что для реакций в жидкостях с ростом температуры понижается вязкость, степень ассоциации, гидратации, что приводит к росту коэффициентов диффузии и соответственно переходу из диффузионной в кинетическую область. С помощью модели исследовано влияние температуры процесса и концентрации кислоты на эффективность гидролиза полисахаридов различной природы. Температурная зависимость выхода моносахаридов определяется соотношением констант скоростей их образования (к1) и распада (к2). С ростом температуры кинетическая модель предсказывает 87 уменьшение оптимального времени протекания процесса гидролиза, а также увеличение максимальной концентрации для всех моносахаридов (рис. 27-32). Рисунок 27 - Влияние температуры процесса на скорость гидролиза глюканов свекловичного жома раствором 1 % масс сернистой кислоты: ♦ - 1700С; ● - 1800С; ▲- 1900С; ■ - 2000С; ▬ - модель Рисунок 28 - Влияние температуры процесса на скорость гидролиза глюканов свекловичного жома раствором 1,66 % масс сернистой кислоты: ● - 1800С; ▲ - 1900С; ▬ - модель 88 Кинетическая модель дает возможность не только рассчитать концентрации продуктов реакции, но и определить условия, позволяющие увеличить конверсию полисахаридов растительного сырья. При коротком времени проведения гидролиза она предсказывает существенный относительный рост выхода моносахаридов при увеличении температуры (таблица 20). Таблица 20 - Оценка эффективности процесса по результатам моделирования* Y Арабиноза Температура , 0С Ксилоза Температура , 0С Продолжительность гидролиза, мин Температура , 0С Глюкоза Y 1 230 63% 230 77% 230 3 220 45% 230 67% 230 5 220 36% 230 53% 220 10 210 12% 220 21% 200 0 *относительно выхода моносахарида при Т=190 С, Сkаt=1%. Y 83% 63% 40% 10% Таким образом, в результате проведенного исследования были установлены кинетические параметры лекгогидролизуемых полисахаридов процесса деполимеризации свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой. Показано, что процесс протекает в кинетической области и весь массив измерений выхода моносахаридов удовлетворительно описывается схемой с минимальным числом элементарных стадий. Проведен вычислительный эксперимент, на основе которого определены оптимальные области параметров процесса. Установлено существенное влияние температуры реакции на содержание моносахаридов в гидролизатах растительного сырья и продолжительность процесса. Разработанная математическая модель процесса предобработки свекловичного жома может 89 быть применима при моделировании и описании закономерностей предобработки березового опила сернистой кислотой. 3.5 Микробиологическая конверсия гидролизатов растительного сырья в анаэробных условиях Штаммы-продуценты масляной кислоты: Clostridium butyricum ВКПМ В-9617, В-9619 и Clostridium tyrobutyricum ВКПМ В-10406, В-9615 были восстановлены из лиофилизированного материала, полученного в коллекции ВКПМ, согласно п. 2.5. Выживаемость и микробиологическую чистоту клеток проверяли по методу, представленному в п. 2.5. Было показано, что восстановленные культуры имеют высокий уровень выживаемости клеток после длительного хранения в лиофилизированном состоянии (свыше 90%), являются однородными, не содержат контаминации и по совокупности морфологических признаков принадлежат к видам Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum. В составе питательных сред для культивирования бактерий применяли гидролизаты, полученные при режимах обработки свекловичного жома и березового опила, представленных в таблице 21. Высокотемпературная обработка сырья сернистой кислотой в течение 10 минут позволяет получить гидролизаты с более высокой концентрацией редуцирующих веществ по сравнению с ферментативными гидролизатами. Преимуществом применения ферментативных гидролизатов в качестве питательных сред является отсутствие ингибиторов роста микроорганизмов. Кроме того, ферментативный гидролиз обладает большей селективностью в деградации биомассы до целевого продукта по сравнению с химическими методами гидролиза [10, 20, 23]. Углеводный состав кислотных и ферментативных гидролизатов растительного сырья, использованных в качестве субстратов в данном исследовании, представлен в таблице 22. 90 Высокое содержание арабинозы, галактозы и низкое содержание ксилозы в кислотных гидролизатах свекловичного жома обусловлено преобладанием в сырье арабинанов и арабиногалактанов. Таблица 21 – Режимы получения кислотных и ферментативных гидролизатов свекловичного жома и березового опила ФерментативКислотный Кислотный Ферментативный Условия гидролизат гидролизат ный гидролизат гидролизат гидролиза свеклович- березового свекловичного березового ного жома опила жома опила Гидромодуль 1:3 1:3,5 1:30 1:30 Концентрация 1,0 0,6 H2SO3, % масс Температура, °С 190 200 50,0±2 50,0±2 Продолжитель10,0 мин 10,0 мин 76 ч 76 ч ность обработки рН 5,0 5,0 Дозировка ферментного 0,05 0,05 препарата, г/г субстрата Концентрация редуцирующих 8,1 6,5 1,4 2,8 веществ, % масс Таблица 22 – Углеводный состав гидролизатов растительного сырья Содержание, г/л Рамноза Арабиноза Галактоза Глюкоза Ксилоза Галактуроновая кислота Глюкуроновая кислота Сахароза Кислотный гидролизат свекловичного жома 0,39 9,40 1,70 7,30 0,54 Кислотны Ферментатив- Ферментай ный тивный гидролизат гидролизат гидролизат березового свекловичного березового опила жома опила 2,73 следы 1,12 0,21 3,63 0,05 18,60 6,00 28,25 26,61 1,00 0,74 0,72 0,40 0,01 - 0,13 0,08 0,01 - - - 0,51 0,55 91 Моносахаридный состав кислотных гидролизатов березового опила преимущественно представлен ксилозой и глюкозой. В ферментативных гидролизатах обоих видов сырья преобладала глюкоза, образующаяся при деполимеризации трудногидролизуемых полисахаридов. Согласно литературным данным [64], не все углеводы, входящие в состав полученных растительных гидролизатов, утилизируются бактериями C. butyricum и C. tyrobutyricum. C. tyrobutyricum из углеводов, содержащихся в исследуемых растительных гидролизатах, способны утилизировать лишь глюкозу и ксилозу. C. butyricum могут утилизировать также галактозу и сахарозу, а некоторые и арабинозу, содержание которой преобладает в кислотных гидролизатах свекловичного жома. Соответствие углеводного состава гидролизатов свекловичного жома и березового опила субстратной специфичности бактерий C. butyricum и C. tyrobutyricum представлено в таблице 23. Таблица 23 – Соответствие углеводного состава гидролизатов свекловичного жома и березового опила субстратной специфичности бактерий C. butyricum и C. tyrobutyricum % углеводов в составе гидролизатов свекловичного жома и березового опила, утилизируемых данным видом бактерий Ферментатив- ФерментативКислотный Кислотный Вид бактерий ный ный гидролизат гидролизат гидролизат гидролизат свекловичного березового свекловичного березового жома опила жома опила C. butyricum 95,8 99,1 99,7 100,0 C. tyrobutyricum 38,9 85,0 89,9 98,1 На основании данных, представленных в таблице 23, можно сделать вывод, что бактерии C. butyricum и C. tyrobutyricum будут лучше утилизировать кислотные и ферментативные гидролизаты березового опила. Причем бактерии C. butyricum способны утилизировать свыше 95,8 % углеводов, содержащихся в исследуемых гидролизатах. 92 Кривые роста штаммов C. butyricum и C. tyrobutyricum, выращенных на средах, содержащих различные типы растительных гидролизатов, а также на глюкозосодержащей среде MSS, представлены на рисунке 33. Скорость роста бактерий и уровень накопления биомассы при выращивании на средах, содержащих 50 об. % кислотных гидролизатов, существенно ниже, чем на среде MSS и на ферментативных гидролизатах. Это объясняется ингибирующим действием побочных продуктов кислотного гидролиза, таких как фурфурол, оксиметилфурфурол, карбоновые кислоты, фураны и фенольные соединения [23]. По экспериментальным данным, содержание фенольных соединений в кислотных гидролизатах свекловичного жома составило 0,69 %. 2,5 2,5 2 2 1,5 001,5 6 0 0 6 D 1 О D О 1 0,5 0,5 0 0 0 10 20 30 40 Время, ч а 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 Время, ч 60 70 80 б Рисунок 33 – Кривые роста штаммов C. butyricum и C. tyrobutyricum на различных видах субстратов: а) C. butyricum ВКПМ B-9619: ◆ - среда MSS; ■ - ферментативный гидролизат березового опила 25 об. %; *ферментативный гидролизат свекловичного жома 25 об. %; ● – кислотный гидролизат березового опила 50 об. %; ▲ – кислотный гидролизат свекловичного жома 50 об. %. б) среда MSS: ° - C. butyricum ВКПМ B-9619, ◊ - C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615; △ - C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406; кислотный гидролизат березового опила 50 об. %: ● - C. butyricum ВКПМ B9619, ◆ - C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615, ▲ - C. tyrobutyricum ВКПМ B10406. На графике представлены усредненные значения трех экспериментов. Погрешность измерений 5 %. Ферментативные гидролизаты растительного сырья более пригодны для культивирования клостридий, по сравнению с кислотными. Кривые 93 роста культуры В-9619 на ферментативных гидролизатах и на глюкозосодержащей среде MSS, в первые 18 часов культивирования практически совпадают. Прекращение роста бактерий после 18-20 часов культивирования на ферментативных гидролизатах объясняется более низким по сравнению со средой MSS содержанием в них сахаров (таблица 24). При выращивании C. butyricum и C tyrobutyricum содержащих растительные гидролизаты, основными на средах, продуктами ферментации были: масляная, уксусная и молочная кислоты, бутанол и этанол. Состав продуктов метаболизма исследуемых штаммов клостридий на ферментативных гидролизатах растительного сырья приведен в таблице 24. При конверсии глюкозы, три из четырех исследуемых штаммов бактерий синтезировали бутират (таблица 24), при этом максимальная концентрация бутирата в среде (4,39 г/л) и выход близкий к теоретическому максимуму (47,8 % от утилизованных сахаров) был зафиксирован для штамма C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615. Однако, степень утилизации глюкозы этим штаммом составила всего 21,34 %, что может свидетельствовать о низкой скорости метаболизма. Наибольшие содержание и выход бутанола были зарегистрированы для штамма C. butyricum ВКПМ B-9619 (7,68 г/л и 20,7 % от утилизованных сахаров соответственно); степень утилизации глюкозы этим штаммом составила 89,17 %. Бутират, лактат и этанол данная культура производит в гораздо меньших количествах (таблица 5). При выращивании штамма ВКПМ B-9619 на кислотном гидролизате березового опила выход бутанола достигает 48,5 % от утилизируемых культурой углеводов. Соотношение бутанол/бутират в составе продуктов брожения, полученных штаммом ВКПМ B-9619 на растительных гидролизатах, составляет 0,8-3,0, а на среде MSS оно составляет 8,9. 94 Таблица 24 – Анализ процессов микробиологической конверсии гидролизатов растительного сырья Углеводы Утилизировано Источник углеводов 1 Среда MSS Кислотный гидролизат березовых опилок 50 об. % Кислотный гидролизат свекловичного жома 50 об. % Штамм 2 C. butyricum ВКПМ B-9617 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 C. butyricum ВКПМ B-9617 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 Исходное количество, г/л Состав продуктов брожения Бутират Лактат Бутанол, г/л г/л % г/л Выход, %* г/л Этанол, г/л Ацетат**, г/л г/л Выход, %* 10 11 12 13 3 4 5 6 7 8 Выход, %* 9 36,89 12,21 33,09 0 0 0 0 0 -1,99 2,25 18,24 41,60 37,10 89,17 0,86 2,3 7,68 20,7 0,14 -1,40 0,33 0,9 43,02 9,18 21,34 4,39 47,8 0,02 0,2 0,05 -1,93 0,13 1,4 42,93 24,73 57,60 3,06 12,37 0,02 0,08 0,04 -1,60 0,1 0,4 28,61 0,97 3,39 0,55 56,7 0 0 0 -0,3 0,42 43,3 24,00 1,65 6,87 0,12 7,3 0,8 48,5 0 0,5 0 0 30,99 1,92 6,18 0,55 28,6 0 0 0,01 -1,3 0 0 13,31 0,20 1,50 0 0 0 0 0 -1,5 1,73 100 9,66 0 0 0 0 0 0 0 -0,3 0,45 0 11,21 1,17 10,45 0,05 4,3 0 0 0,01 0,3 0 0 14,57 2,04 14,01 0,15 7,4 0 0 0,01 1,5 0 0 95 1 Ферментативный гидролизат березы 50 об. % Ферментативный гидролизат березы 25 об. % Ферментативный гидролизат свекловичного жома 50 об. % 2 C. butyricum ВКПМ B-9617 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 Ферментативный гидролизат свекловичного жома 25 об. % C. butyricum ВКПМ B-9619 Смесь кислотного и ферментативного гидролизатов березы 50 об. % C. butyricum ВКПМ B-9617 C. butyricum ВКПМ B-9619 C. tyrobutyricum ВКПМ B-9615 C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 Продолжение таблицы 3 11 12 13 3 4 5 6 7 8 9 10 20,39 0,45 2,2 0 0 0 0 0,14 0,01 0 0 17,39 14,06 80,9 1,02 7,3 3,11 22,1 0,16 -0,86 0 0 22,96 4,5 19,6 0 0 0 0 1,08 0,12 0 0 19,25 0,67 3,5 0 0 0 0 0,18 0,03 0 0 12,69 0,03 0,2 0 0 0 0 0 0,02 0,29 0 12,97 1,92 14,8 0,11 5,7 0 0 0,01 0 0,08 4,2 10,48 5,54 52,9 0,90 16,2 1,44 26,0 0,20 -0,40 0 0 10,59 3,15 29,8 0,01 0,3 0 0 0,3 0,1 2,85 87,7 9,12 4,18 45,8 1,12 26,8 0,9 21,5 0,21 -0,37 0 0 23,01 0,16 0,7 0 0 0 0 0,134 0,23 0 0 22,33 2,25 10,1 0 0 0 0 0,1 0,225 0 0 22,5 1,4 6,2 0 0 0 0 0,02 0,08 0 0 26,17 3,23 12,34 0 0 0 0 0,03 0,15 0 0 * - от утилизируемых сахаров; ** «+» количество ацетата произведенного культурой; «-»утилизировано из исходного содержания ацетата в среде (3 г/л) 96 Штамм C. butyricum ВКПМ B-9617 не синтезировал масляную кислоту при культивировании на средах, содержащих кислотные и ферментативные гидролизаты свекловичного жома и березового опила. При выращивании данной культуры на кислотных гидролизатах свекловичного жома 100 % утилизируемых углеводов конвертируется в лактат (1,7 г/л). При выращивании на среде MSS с глюкозой данный штамм также не производит масляную кислоту, образуя лишь молочную кислоту. Это может быть обусловлено высокой активностью у штамма ВКПМ B-9617 фермента лактатдегидрогеназы, а также тем, что образование лактата в бактериальной клетке является кратчайшим путем регенерации и возвращения в клеточный метаболизм НАД+, затраченного при образовании пирувата (рисунок 34). Преимущественное образование лактата также наблюдается у штамма C. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 при использовании в качестве источника углерода ферментативного гидролизата свекловичного жома. При использовании в качестве субстратов ферментативных гидролизатов свекловичного жома и березового опила, бутират в количестве, превышающем 1 г/л, синтезировал только штамм C. butyricum ВКПМ B9619. Необходимо отметить, что при этом синтез масляной кислоты был сопряжен с утилизацией ацетата из питательной среды (таблица 24). Штамм С. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 синтезировал масляную кислоту (0,55 г/л). только при культивировании на кислотном гидролизате березового опила. Выход масляной кислоты при этом составил 28,6 % от конвертируемых углеводов. Синтез масляной кислоты в данном случае также был сопряжен с утилизацией ацетата из питательной среды. Многие бактерии рода Clostridium клостридий синтезируют бутират, ферментируя глюкозу, ксилозу, лактозу, крахмал и глицерин. Продуктами метаболизма маслянокислых бактерий, помимо бутирата, являются ацетат, этанол, бутанол, лактат, водород и CO2. Для промышленного производства масляной кислоты наибольший интерес представляют виды Clostridium 97 tyrobutyricum и Clostridium butyricum. Они производят бутират с наиболее высокой продуктивностью и выходом. Глюкоза … … Ксилоза Глицеральдегид-3-фосфат AДФ НAД+ ATФ НAДH+H + 11 2H 2 Пируват Лактат 14 CO2 Ацетилфосфат Ацета т 17 2 4 4H + КoA 2 Ацетил-КoA 3 НAД+ 2ФдH 2 Pi КoA ATФ AДФ 1 15 НAДH+H + НAД+ НAДH+H + 2Фд КoA Ацетальдегид 18 Эта нол + + НAДH+H + НAД+ НAДH+H НAД КoA Ацетоацетил-КoA НAДH+H + 16 НAД+ 7 3-Гидроксибутирил-КoA 9 H2O Кротонил-КoA 10 ATФ AДФ Pi КoA Бутирил-КoA Бутирилфосфат Бутират 6 2 НAДH+H + 2 НAД+ 5 НAДH+H + НAД+ Бутиральдегид 12 Бута нол 13 Рисунок 34 - Схема метаболизма маслянокислых бактерий [8, 20-25]: 1) гидрогеназа; 2) фосфотрансацетилаза; 3) ацетаткиназа; 4) тиолаза; 5) фосфотрансбутирилаза; 6) бутираткиназа; 7) КоА-трансфераза; 8) β-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа; 9) кротоназа; 10) бутирил-КоАдегидрогеназа; 11) глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа; 12) бутиральдегиддегидрогеназа; 13) бутанолдегидрогеназа; 14) лактатдегидрогеназа; 15) пируват:ферредоксин-оксидоредуктаза; 16) L(+)-β-оксибутирил-КоА-дегидрогеназа; 17) ацет-альдегиддегидрогеназа; 18) алкогольдегидрогеназа 98 Маслянокислые бактерии превращают глюкозу в пируват по пути Эмбдена–Мейергофа–Парнаса [72]. Пируват декарбоксилируется до ацетилКоА и СО2 под действием пируват:ферредоксин оксидоредуктазы (рисунок 34). Продуктом этой реакции является также восстановленный ферредоксин, который реокисляется под действием гидрогеназы; при этом образуется Н2. Часть пирувата при определенных условиях может быть конвертирована в лактат с помощью лактат дегидрогеназы. Ацетил-КоА превращается в ацетат (при участии фосфотрансацетилазы и ацетиткиназы) либо в бутирил-КоА. Бутирил-КоА может быть преобразован в бутират двумя путями: 1) под действием фосфотрансбутирилазы и бутират киназы; при этом на стадии бутираткиназы образуется АТФ; 2) с помощью фермента бутирилКоА:ацетат-КоА трансферазы, который переносит КоА от бутирил-КоА на ацетат, формируя бутират и ацетил-КоА [72, 108-112] (рисунок 34). В процессе синтеза бутирата из глюкозы генерируется три молекулы АТФ, тогда как при конверсии молекулы глюкозы в ацетат образуется четыре молекулы АТФ и две молекулы НАДН. 1 Глюкоза → 2 Ацетат + 4 H2 +2 CO2 + 4ATФ (1) 1 Глюкоза → 1 Бутират + 2H2 +2 CO2 + 3ATФ (2) Однако, для поддержания гликолиза необходима регенерация НАДН. У C. tyrobutyricum в процесс регенерации НАДН вовлечены реакции восстановления пирувата в лактат и образования бутирил-КоA из ацетоацетил-КоА. Поэтому, хотя синтез бутирата сопровождается меньшим выходом АТФ, он необходим клеткам, поскольку позволяет поддерживать нейтральный окислительно-восстановительный баланс. Формирование ацетата сопровождается активным ростом клеток, чему способствует образование АТФ. При истощении субстрата образование ацетата и рост клеток замедляются. В связи с необходимостью регенерации НАДН в стационарной фазе главным продуктом ферментации является бутират, 99 который может синтезироваться в том числе и за счет реутилизации ацетата из среды с помощью бутирил-КоА:ацетат-КоА трансферазы. Поскольку аннотация геномов ряда штаммов C. tyrobutyricum и C. butyricum не закончена, гены, ответственные за синтез ферментов фосфотрансбутирилазы, бутираткиназы и бутирил-КоА:ацетат-КоА трансферазы, еще не идентифицированы. Предполагается, что полный набор генов двух путей метаболизма бутирата присутствует не у всех видов маслянокислых бактерий. Неизвестно, могут ли два альтернативных метаболических пути синтеза бутирата функционировать одновременно; условия функционирования каждого из метаболических путей также недостаточно исследованы. Полученные нами экспериментальные данные позволяет предположить, что при ферментации сложных субстратов штаммы C. butyricum ВКПМ B-9619 и С. tyrobutyricum ВКПМ B-10406 используют ацетат в качестве субстрата для синтеза масляной кислоты, проходящего по метаболическому пути, катализируемому ферментом КоА-трансферазой (рис. 2) [72, 108-112, 162]. Согласно приведенным данным можно заключить, что C. butyricum лучше сбраживает растительные гидролизаты, со сложным моносахаридным составом, по сравнению с C. tyrobutyricum, который из углеводов, входящих в состав исследуемых субстратов, утилизирует лишь ксилозу и глюкозу. Количество углеводов, потребленных C. butyricum из ферментативных гидролизатов, варьирует от 45,8 до 80,9 %. Тогда как степень утилизации углеводов для C. tyrobutyricum не превышает 29,8 %. Штамм C. butyricum ВКПМ B-9619 наиболее перспективно использовать для получения масляной кислоты на гидролизатах свекловичного жома и березового опила. 100 3.6 Технологическая линия гидролиза лигноцеллюлозо-содержащего сырья и микробиологической конверсии продуктов в анаэробных условиях Схема технологической линии по переработке березового опила представлена на рисунке 35. Рисунок 35 - схема технологической линии по переработке березового опила. Сернистый газ для предобработки лигноцеллюлозосодержащего сырья получается сжиганием серы. Сера, предварительно раздробленная до кусков размером 40-50 мм, л подается в бункер-плавилку (1). Расплавленная сера (поток 1) насосом (4) подается в фильтр и направляется в печь (6), куда также подается воздух. Сжигание серы осуществляется при температуре 1200-1400°С. Горячий сернистый газ охлаждается и очищается в сухом электрофильтре (7) и скруббере (8). Очищенный и охлажденный сернистый газ (поток 2) подается в гидролизер (13), обогреваемый паром. Технический пар производится в паровом котле (5), используя теплоту сжигания серы. 101 Березовый опил (поток 5) затем обрабатывается аммиаком (поток 4) в делигнификаторе для отделения лигнина (поток 7). Газообразный аммиак направляется в конденсатор (9) после чего снова подается в делигнификатор (10). Из делигнификатора сырье (поток 6) подается в гидролизер (13), где в противотоке обрабатывается сернистым газом (поток 2) при температуре 250 ºС, в течение 5 мин при концентрации гидролизующего агента 1,77 % масс. Гидролизат (поток 11), содержащий преимущественно пентозаны (до 70 %) отделяется от твердой фракции на фильтр-прессе (15) и используется для производства фурфурола (поток 10). Непрогидролизованный остаток сырья (11) направляется на ферментативный гидролиз в ферментолизер (16) при 55ºС и рН 5. Ферментолизат (поток 14) отделяется от твердой фракции (поток 13) и направляется в биореактор (19), в котором происходит брожение штамма C. tyrobutyricum – продуцента маслянной кислоты. Условия культавации 35–37°C, pH 4.5–7.0 в атмосфере CO2 или N2. После 48 часов брожения полученная культуральная жидкость направляется на прессфильтр, микрофильтрацию или центрифугу (18) для отделения клеточной биомассы (поток 16). Далее из фильтрата (15) выделяется маслянная кислота. 102 Заключение 1. Определены оптимальные режимы предобработки березового опила (температура 250 °С, гидромодуль 1:3,5, концентрация сернистой кислоты 1,77 % масс, продолжительность 5 мин, позволившие в 26,7 раз повысить выход редуцирующих веществ при последующем ферментативном гидролизе. Общий выход редуцирующих веществ при предобработке сернистой кислотой и последующем ферментативном гидролизе березового опила составил 82,0 % от АСВ березового опила. 2. Установлены оптимальные режимы ферментативного гидролиза березового опила, предварительно обработанного сернистой кислотой (гидромодуль 1:30, дозировка ферментного комплекса 5% от АСВ березы, рН 5,0, температура 50 °С). Показано, что в составе ферментолизатов березового опила, получаемых при обработке препаратом «CellicCТec2» преобладала глюкоза, содержание которой составило 28,25 г/л. 3. Охарактеризован моносахаридный состав гидролизатов свекловичного жома при температурах свыше 190°С. 4. Разработана математическую модель выхода моносахаридов в процессе предобработки свекловичного жома разбавленной сернистой кислотой. 5. Проведена оценка эффективности биосинтеза масляной, молочной кислот и бутанола штамми Clostridium butyricum и Clostridium tyrobutyricum при использовании в качестве субстратов кислотных и ферментативных гидролизатов березового опила и свекловичного жома. Максимальные концентрация масляной кислоты (1,12 г/л), 103 выход (26,8 % от утилизованных сахаров) и степень утилизации сахаров (45,8 %) были достигнуты при сочетании ферментативного гидролизата свекловичного жома, исходно содержащего 9,12 г/л углеводов (с преобладанием глюкозы, ксилозы, сахарозы и арабинозы), и штамма Clostriduim butyricum В-9619. При этом соотношение бутират/бутанол в составе продуктов брожения составило 1,24, что более чем в 10 раз превышает таковое при ферментации сред, содержащих только глюкозу (0,11). 6. Штамм C. butyricum ВКПМ B-9617 при выращивании на кислотных гидролизатах свекловичного жома 100 % утилизируемых углеводов конвертировал в лактат (1,7 г/л). 7. C. butyricum лучше сбраживает растительные гидролизаты, со сложным моносахаридным tyrobutyricum, который составом, из углеводов, по сравнению входящих в с C. состав исследуемых субстратов, утилизирует лишь ксилозу и глюкозу. Количество углеводов, потребленных C. butyricum из ферментативных гидролизатов, варьирует от 45,8 до 80,9 %. Тогда как степень утилизации углеводов для C. tyrobutyricum не превышает 29,8 %. Штамм C. butyricum ВКПМ B-9619 наиболее перспективно использовать для получения масляной кислоты на гидролизатах свекловичного жома и березового опила. 104 Список использованной литературы 1. Lynd L.R., Wyman C.E., Gerngross T.U. Biocommodity Engineering // Biotechnol Prog, 15, 777-793, 1999. 2. Chandel A. K., Chandrasekhar G., Silva M.B., da Silva S. The realm of cellulases in biorefinery development // Сrit Rev Biotechnol, 1, 187-202, 2012 3. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Ч.II. М.: СПб.: АНО НПО «Профессионал», 2007. 1142 с. 4. Евилевич А. З., Ахмина Е. И., Раскин М. Н., Безотходное производство в гидролизной промышленности. М.: Лесная промышленность, 1982. 184 с. 5. Холькин Ю. И. Технология гидролизных производств. М.: Лесная промышленность, 1989. 490 с. 6. Мустафина Э. Ф., Аблаев А. Р., Тарасова Е. В., Харина М.В. Перспективы использования биотехнологий в аграрной сфере Единого Экономического Пространства. М.: ООО «Угрешская типография», 2014. – 136 с. 7. Шаймурадов Р. Р. Оптимизация производства сухих кормовых дрожжей спиртовых заводов / Р. Р. Шаймурадов, И. В. Логинова, Р. Т. Валеева, М. В. Харина, Мухачев С. Г. // Аннотации сообщений «Научной сессии КГТУ» Казань, 2011. - С. 90 8. Кузнецов Б. Н., Кузнецова С. А., Тарабанько В. Е. Новые методы получения химических продуктов из биомассы деревьев сибирских пород // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева), XL VIII, 3, 67-70, (2004) 9. Харина М. В., Емельянов В. М. Исследование кинетики высокотемпературного гидролиза свекловичного жома сернистой кислотой. // Вестник Казанского технологического университета, 18, 191-193 (2013) 105 10. Харина М. В., Емельянов В. М., Аблаев А. Р., Мокшина Н. Е., Ибрагимова Н. Н., Горшкова Т. А. Динамика выхода углеводов при высокотемпературном гидролизе пшеничной соломы сернистой кислотой // Химия растительного сырья. 2014. №1. С. 53-59. 11. Спичак В.В., Дудкин В.М., Ананьева П.А., Пузанова Л.Н., Остроумов В.Б. Эффективное использование вторичных сырьевых ресурсов сахарного производства // Хранение и переработка сельхозсырья, 7, 73-76. 2007 12. Аблаев А.Р. Топливо и химия из возобновляемого сырья: перспективы развития в России // Вестник Химической Промышленности, журнал. 2012. № 2. – С. 37-39 13. Lynd R.L., Weimer J.P., Zyl H.W., Pretorius S.I., Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology. //Microbiol Mol Biol Rev, 66, 506509, 2002 14. Mosier N.S., Hendrickson R., Brewer M., Ho N., Sedlak M., Dreshel R., Welch G., Dien B.S., Aden A., Ladisch M.R. Industrial scale-up of pH-controlled liquid hot water pretreatment of corn fiber for fuel ethanol production. // Appl Biochem Biotechnol, 125, 77-97, 2005 15. Аблаев А.Р. Промышленные биотехнологии и биотоплива – запуск инновационного будущего регионов // Вестник Объединенных спиртовых заводов, журнал. 2013. №2. – С. 17-19 16. Jeoh T., Ishizawa C.I, Davis M.F., Himmel M.E., Adney W.S., Johnson D.K. Cellulase digestibility of pretreated biomass is limited by cellulose accessibility. // Biotechnol Bioeng. 98, 112-122 (2007) 17. Silverstein R. A. Сomparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks / R. A. Silverstein , Y. Chen , R. R. SharmaShivappa, M. D. Boyette , J. Osborne//Bioresource Technology. – 2007. – №98. – p. 3000–3011. 106 18. Mosier N., Wyman C., Dale B., Elander R., Lee Y.Y., Holtzapple M., Ladisch M., Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. // Bioresour Technol, 96, 673-686 (2005) 19. Galbe M., Zacchi G., Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production. // Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;108:41-65. 20. Zheng Y., Pan Z.L., Zhang R.H., Overview of biomass pretreatment for cellulosic ethanol production. // International Journal of Agricultural and Biological Engineering, 2, 51-68 (2009) 21. Аблаев А.Р. Топливо и химия из возобновляемого сырья: перспективы развития в России // Вестник Химической Промышленности, журнал. 2012. №2(65). – С. 37-39 22. Аблаев А.Р. Большая нефть и биотопливо // Биотехнология журнал, издании ГосНИИГенетика. 2011. №3. – С. 8-14 23. Browning B. L. Methods of Wood Chemistry, 2, 785-823. 1967. 24. Hendriks. A.T., Zeeman G., Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass // Bioresource Technology, 100(1), 10-18, 2009. 25. Kahar Е., Taku K., Tanaka S., Enzymatic digestion of corncobs pretreated with low strength of sulfuric acid for bioethanol production // Journal of Bioscience and Bioengineering, 110, 4, 453–458, 2010. 26. Sirikarn S., Luengnaruemitchai A., Wongkasemjit S., Effect of Temperature and Time on Dilute Acid Pretreatment of Corn Cobs // World Academy of Science, Engineering and Technology, 6, 1-16, 2012. 27. Gamez S.R., González-Cabrialesa J.J., Ramíreza J.A., Garroteb G., Vázquezc M. Study of the hydrolysis of sugar cane bagasse using phosphoric acid // Journal of Food Engineering, 74, 78-88, 2006. 28. Boonsombuti А., Luengnaruemitchaia A., Wongkasemjita S. Effect of Phosphoric Acid Pretreatment of Corncobs on the Fermentability of Clostridium beijerinckii TISTR 1461 for Biobutanol Production // Preparative Biochemistry & Biotechnology, 5, 65-75 (2014) 107 29. Kalavathy R., Carrier J.D. Effect of dilute acid pretreatment conditions and washing on the production of inhibitors and on recovery of sugars during wheat straw enzymatic hydrolysis. // Biomass and Bioenergy, 45-49 (2014) 30. Taherzadeh M.J., Karimi1., Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review. // Int J Mol Sci, 9, 1621-1651 (2008) 31. P. Lenihan, Orozco A., O’Neill E., Ahmad M.N.M., Rooney D.W., Mangwandi C., Walker G.M. Kinetic Modelling of Dilute Acid Hydrolysis of Lignocellulosic Biomass // Biofuel production-recent developments and prospects, 8, 72-77, 2011. 32. Mussatto S.I., Teixeira J. A., Lignocellulose as raw material in fermentation processes // Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology, 2, 64-69, 2010. 33. Chandel A.K., Singh O.V., Chandrasekhar G., Rao L.V., Narasu M.L., Key drivers influencing the commercialization of ethanol-based biorefineries // J Comm Biotechnol, 16, 239-257, 2010. 34. Lee Y.Y., Iyer P., Torget R.W., Dilute-Acid Hydrolysis of Lignocellulosic Biomass // Adv Biochem Eng Biotechnol, 65, 93-115, 1999. 35. Palmowski L, Muller J. Influence of the size reduction of organic waste on their anaerobic digestion. // In II International Symposium on anaerobic digestion of solid waste. Barcelona 15-17 June. 1999:137-44. 36. Sun Y, Cheng J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. // Bioresour Technol 2002;83:1-11. 37. Chang V.S., Burr B., Holtzapple M.T., Lime pretreatment of switchgrass. // Appl Biochem Biotechnol 1997;63-65:3-19. 38. Zhua J.Y., Wang G.S., Pan X.J., Gleisner R.. Specific surface to evaluate the efficiencies of milling and pretreatment of wood for enzymatic saccharification. // Chem Eng Sci 2009;64:474-85. 108 39. Cadoche L., Lopez G.D., Assesment of size reduction as a preliminary step in the production of ethanol from lignocellulosic wastes. // Biotechnol Wastes 1989;30: 153-7. 40. Nguyen Q.A., Tucker M.P., Keller F.A., Eddy F.P., Two-stage dilute-acid pretreatment of softwoods. // Appl Biochem Biotechnol 2000;84-86:561-75. 41. Zhu Y.M., Lee Y.Y., Elander R.T., Optimization of dilute-acid pretreatment of corn stover using high-solids percolation reactor. // Appl Biochem Biotechnol 2005;121:325-7. 42. Hendricks A.T., Zeeman G. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass. // Bioresour Technol 2009;100:10-8. 43. Cadoche L., Lopez G.D. Assesment of size reduction as a preliminary step in the production of ethanol from lignocellulosic wastes // Biotechnol Wastes 1989;30: 153-7. 44. Sun Y., Cheng J, Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review // Bioresource Technology, 83, 2002, 1-11. 45. Takacs E., Foldvary C.M., Wojnarovits L., Effect of high-energy radiation and alkali treatment on the properties of cellulose // Radiat Phys Chem, 2003;57:505508. 46. Fengel D., Wegener G. // Wood Chemistry, Ultrastructure, Reactions. Berlin New York; 1984 47. Swatloski R.P., Spear S.K., Holbrey J.D., Rogers R.D. Ionic liquids: new solvents for non- derivitized cellulose dissolution // Abstr Pap Am Chem Soc 2002;224:U622 48. Chandra R.P., Bura R., Mabee W.E., Berlin A., Pan X., Saddler J.N. Substrate pretreatment: the key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? // Adv Biochem Eng Biotechnol 2007;108:67-93. 49. Chang V.S., Holtzapple M.T. Fundamental factors affecting biomass enzymatic reactivity //Appl Biochem Biotechnol 2000;84-86:5-37. 109 50. Galbe M., Zacchi G. Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production // Biofuels 2007;108:41 -65. 51. Mosier N., Wyman C.E., Dale B.E., Elander R., Lee Y.Y., Holtzapple M.T. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass // Bioresour Technol 2005b;96:673-86. 52. Hatakka A.I. Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role from in lignin degradation // FEMS Microbiol Rev 1994;13:125-35. 53. Hatakka A.I., Varesa T., Lunn T.K. Production of multiple lignin peroxidases by the white- rot fungus Phlebia ochraceofulva // Enzyme Microb Technol 1993;15:664-9. 54. Itoh H., Wada M., Honda Y., Kuwahara M. Bioorganosolve pretreatments for simultaneous saccharification and fermentation of beech wood by ethanolysis and white-rot fungi // J Biotechnol 2003;103:273-80 55. Zhu S.D., Wu Y.X., Chen Q.M., Yu N., Wang C.W., Jin S.W. Dissolution of cellulose with ionic liquids and its application: a mini-review // Green Chem 2006;8:325-7. 56. Zhu Z.G., Sathitsuksanoh N., Vinzant T., Shell D.J., McMillan J.D., Zhang Y.P. Comparitive study of corn stover preteated by dilute acid and cellulose solvent-based lignocellulose fractionation: enzymatic hydrolysis, supramolecular structure, and substrate accessibility // Biotechnol Bioeng 2009;103:715-24 57. Chandra R.P., Bura R., Mabee W.E., Berlin A., Pan X., Saddler J.N. Substrate pretreatment: the key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? // Adv Biochem Eng Biotechnol 2007;108:67-93. 58. McMillan J.D. Pretreatment of lignocellulosic Biomass // Enzymatic Conversion Biomass Fuels Prod 1994;566:292-324. 59. Saddler J.N., Ramos L.P., Breuil C. Steam pretreatment of lignocellulosic residues. // In: Saddler J.N., editor. Bioconversion of forest and agricultural plant residues. M.: Oxford, UK: CAB International; 1993. p. 73-92. 110 60. Weil J.R., Sariyaka A., Rau S.L., Goetz J., Ladisch C.M., Brewer M., et al. Pretreatment of yellow poplar wood sawdust by pressure cooking in water // Appl Biochem Biotechnol 1997;68:21-40. 61. Wright J.D. Ethanol from biomass by enzymatic hydrolysis // Chem Eng Prog 1998;84: 62-74. 62. Yang B., Wyman C.E.. Effect of xylan and lignin removal by batch and flow through pretreatment on enzymatic digestibility of corn stover cellulose // Biotechnol Bioeng 2004;86:88-95. 63. Antal M.J. Water: A Traditional Solvent Pregnant with New Application. // In: Proceedings of the 12th international conference on the properties of water and steam. M.: New York: Begell House; 1996. p. 23-32. 64. Аблаев Перспективы А. Р., Харина М.В., Логинова И. В., Емельянов В.М. переработки возобновляемого растительного сырья с получением масляной кислоты // Вестник Казанского технологического университета. – 2014. - № 14. – С. 328-333 65. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Volume 3: The Firmicutes / Под ред. Paul De Vos, George M. Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer and William B. Whitman. Baltimore: The Williams & Wilkins Co. 2009. XXVI. С. 1450. 66. Zhang C., Yang H., Yang F., Ma Y. Current progress on butyric acid production by fermentation // Current Microbiology, 2009, V.59, №6, С. 656-663. 67. Matijasic B.B., Rajsp M.K., Perko В., Rogelj I. Inhibition of Clostridium tyrobutyricum in cheese by Lactobacillus gasseri // Int. Dairy J. 2007.V. 17. С.157-166 68. Baroi, N.B. Westermann P., Gavala H.N. Butyric acid fermentation from pretreated and hydrolyzed wheat straw by C. tyrobutyricum // Industrial biotechnology-meeting the challenges. 2013. International Conference, September 12–13, Lund, Sweden 111 69. Zigova J., Sturdk E., Vandak D., Schlosser A. Butyric acid production by Clostridium butyricum with integrated extraction and pertraction // Process Biochemistry. 1999. V. 34. P. 835-843. 70. Zigova J., SturdIk E. Advances in biotechnological production of butyric acid // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2000. V. 24. № 3. Р. 153-160. 71. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.: Мир, 1982. 310 с. 72. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология: Учебник. 2-е изд. M.: Изд-во Моск ун-та, 1985. 376 с. 73. Liu S., Bischoff K. M., Leathers T.D., Qureshi N., Rich J.O., Hughes S.R. Butyric acid from anaerobic fermentation of lignocellulosic biomass hydrolysates by Clostridium tyrobutyricum strain RPT-4213 // Bioresource Technology. – 2013. - №143. – Р. 322-329. 74. Horhammer H., Berezina O.V., Hiltunen E., Granstrom T., Van Heiningen A. Semi-bleached paper and fermentation products from a larch biorefinery // Tappi journal. 2012. V. 11. № 10. Р. 31-39 75. Berezina O. V., Brandt A., Yarotsky S.V., Schwarz W. H., Zverlov V.V. Isolation of a new butanol-producing Clostridium strain: High level of hemicellulosic activity and structure of solventogenesis genes of a new Clostridium saccharobutylicum isolate // Systematic and Applied Microbiology. 2009. V.32. №7. P. 449-459. 76. Tsao G. T. Recent progress in bioconversion of lignocellulosics. Berlin: M.: Springer, 1999. 280 p. 77. Матвеев М. В. Утилизация растительных отходов с получением дефицитных продуктов и энергии. M.: Экономика природопользования. – 1999. №4. С. 21-24 78. Lynd L. R. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology // Microbiol Mol Biol Rev. 2002. V. 66. P. 506-77. 112 79. Сушкова В. И., Воробьёва Г. И., Безотходная конверсия растительного сырья в биологически активные веществ. M.: Киров: ДеЛи принт, 2007. 204с. 80. Шарков В. И., Куйбина Н. И., Химия гемицеллюлоз. М.: Лесная промышленность, 1972. 440 с. 81. Kong Q., He G.Q., Chen F, Ruan H. Studies on a kinetic model for butyric acid bioproduction by Clostridium butyricum // Lett. Appl. Microbiol. 2006. V. 43. P. 71-77 82. Rodriguez J., Kleerebezem R., Lema J.M., van Loosdrecht M.C.M. Modeling product formation in anaerobic mixed culture fermentations // Biotechnol. Bioeng. 2006. V. 93. P. 592-606 83. Freeman A., Woodley J. M., Lilly M. D. In situ product removal as a tool for bioprocessing // BioTechnology. 1993. V. 11. № 9. P. 1007-1012 84. Boyaval P., Seta J., Gavach C. Concentrated propionic acid production by electrodialysis // Enzyme and Microbial Technology. 1993. V. 15. №8. Р. 683686. 85. Habova V., Melzoch K., Rychtera M., Sekavova B. Electrodialysis as a useful technique for lactic acid separation from a model solution and a fermentation broth // Desalination. 2004. V. 162. № 1-3. Р. 361-372. 86. Zhang S. T., Matsuoka H., Toda K. Production and recovery of propionic and acetic acids in electrodialysis culture of Propionibacterium shermanii // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1993. - V. 75 . № 4. Р. 276-282. 87. Mollah A. H., Stuckey D. C. Maximizing the production of acetone-butanol in an alginate bead fluidized bed reactor using Clostridium acetobutylicum // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 1993. V. 56. №1. Р. 83-89 88. Maddox I. S. Use of silicalite for the adsorption of n-butanol from fermentation liquors // Biotechnology Letters. 1982. V. 4. № 11. Р. 759-760 89. He G. Q., Kong Q., Chen Q. H., Ruan H. Batch and fed–batch production of butyric acid by Clostridium butyricum ZJUCB // J. Zhejiang Univ. Sci. 2005. V. 6. P. 1076 -1080. 113 90. Soni B.K., Jain M.K. Influence of pH on butyrate uptake and solvent fermentation by a mutant strain of Clostridium acetobutylicum // Bioprocess Eng. 1997. V. 17. P. 329-334 91. Zhu Y., Yang S.T. Adaptation of Clostridium tyrobutyricum for enhanced tolerance to butyric acid in a fibrous–bed bioreactor // Biotechnol. Prog. 2003. V. 19. P. 365-372 92. Kumar J.A., Li J., Yuan Y., Baral N., Ai B. Review on Bio-butyric Acid Production and its Optimization // International journal of agriculture & biology. 2014. V. 16. P. 1019-1024 93. Boyaval P., Seta J., Gavach C. Concentrated propionic acid production by electrodialysis // Enzyme and Microbial Technology. 1993. V. 15. №8. Р. 683686. 94. Habova V., Melzoch K., Rychtera M., Sekavova B. Electrodialysis as a useful technique for lactic acid separation from a model solution and a fermentation broth // Desalination. 2004. V. 162. № 1-3. Р. 361-372. 95. Zhang S. T., Matsuoka H., Toda K. Production and recovery of propionic and acetic acids in electrodialysis culture of Propionibacterium shermanii // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1993. V. 75 . № 4. Р. 276-282. 96. Mollah A. H. Maximizing the production of acetone-butanol in an alginate bead fluidized bed reactor using Clostridium acetobutylicum / A. H. Mollah, D. C. Stuckey // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. – 1993. - V. 56. №1. - Р. 83-89 97. Maddox I. S. Use of silicalite for the adsorption of n-butanol from fermentation liquors / I. S. Maddox // Biotechnology Letters. - 1982. - V. 4. - № 11. - Р. 759-760 98. Thompson A. B., Cope S. J., Swift T. D., Adsorption of n-butanol from dilute aqueous solution with grafted calixarenes // Langmuir. 2011.V. 27. № 19. Р. 990998 114 99. Zigova J., Vandak D., Schlosser S., Sturdik E. Extraction equilibria of butyric acid with organic solvents // Separation Science and Technology. 1996. V. 31. № 19. Р. 2671-2684. 100. Michel-Savin D., Marchal R., Vandecasteele J. P., Control of the selectivity of butyric acid production and improvement of fermentation performance with Clostridium tyrobutyricum // Applied Microbiology and Biotechnology. 1990. №32. Р. 387- 392. 101. Michel-Savin D., Marchal R., Vandecasteele J. P. Butyric fermentation: metabolic behaviour and production performance of Clostridium tyrobutyricum in a continuous culture with cell recycle // Applied Microbiology and Biotechnology. - 1990. - V. 34. - № 2. - Р. 172-177 102. Michel-Savin D., Marchal R., Vandecasteele J. P. Butyrate production in continuous culture of Clostridium tyrobutyricum: effect of end-product inhibition // Applied Microbiology and Biotechnology. - 1990. - V. 33. - № 2. - Р. 127-131 103. Huang Y. L., Wu Z., Zhang L., Cheung M.C., Yang S. T. Production of carboxylic acids from hydrolyzed corn meal by immobilized cell fermentation in a fibrous-bed bioreactor // Bioresource Technology. - 2002. - V. 82. - № 1. Р. - 5159 104. Jiang L., Wang J., Liang S., Wang X., Cen P., Xu Z. Production of butyric acid from glucose and xylose with immobilized cells of clostridium tyrobutyricum in a fibrous-bed bioreactor // Applied Biochemistry and Biotechnology. - 2010. V. 160. - № 2. - Р. 350-359 105. Jiang L. Enhanced butyric acid tolerance and bioproduction by Clostridium tyrobutyricum immobilized in a fibrous bed bioreactor // Biotechnology and Bioengineering. – 2011. - V. 108. - P. 31-40. 106. Li W., Han H. J., Zhang C. H., Continuous butyric acid production by corn stalk immobilized Clostridium thermobutyricum cells // African Journal of Microbiology Research. - 2011. - V. 5. - № 6. -Р. 661-666 115 107. Liu X., Yang S. T. Kinetics of butyric acid fermentation of glucose and xylose by Clostridium tyrobutyricum wild type and mutant // Process Biochemistry. 2006. - V. 41. - № 4. - Р. 801-808 108. Druaux D., Mangeot G., Endrizzi A., Belin J. M. Bacterial bioconversion of primary aliphatic and aromatic alcohols into acids: effects of molecular structure and physicochemical Conditions // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. - 1997. - V. 68. - № 2. – Р. 214-218 109. Wu Z., Yang S.T. Extractive fermentation for butyric acid production from glucose by Clostridium tyrobutyricum // Biotechnology and Bioengineering. – 2003. - V. 82. - Р. 93-102. 110. Liu X., Zhu Y., Yang S. T. Butyric acid and hydrogen production by Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 and mutants // Enzyme and Microbial Technology. - 2006. - V. 38. - № 3-4. – Р. 521-528 111. Sillers R., Chow A., Tracy B., Papoutsakis E. T. Metabolic engineering of the non-sporulating, non-solventogenic Clostridium acetobutylicum strain M5 to produce butanol without acetone demonstrate the robustness of the acid-formation pathways and the importance of the electron balance // Metabolic Engineering. 2008. - V. 10. - № 6. – Р. 321-332. 112. Durre P., Bohringer M., Nakotte S., Schaffer S., Thormann K., Zickner B. Transcriptional regulation of solventogenesis in Clostridium acetobutylicum // J Mol Microbiol Biotechnol. – 2002. - № 4. – Р. 295-300 113. Alsaker K. V., Spitzer T. R., Papoutsakis E.T. Transcriptional analysis of spo0A overexpression in Clostridium acetobutylicum and its effect on the cell’s response to butanol stress // J Bacteriol. – 2004. – V. 186. – P. 1959-1971 114. Tomas C. A., Beamish J., Papoutsakis E. T. Transcriptional analysis of butanol stress and tolerance in Clostridium acetobutylicum // J Bacteriol. – 2004. – V. 186. – P. 2006-2018 116 115. Харина М.В. Предобработка лигноцеллюлозосодержащих отходов и ферментативный сельского хозяйства: гидролиз дис…канд техн.,наук. M.: Казань, 2013.–232 с 116. Grohmann K., Torget R., Himmel M. Optimization of dilute acid pretreatment of biomass // Biotechnology and bioengineering symposium. – 1985. – №15. – Р. 59–80. 117. Шарков В. И. / В. И. Шарков, Н. И. Куйбина. Химия гемицеллюлоз– М.: Лесная промышленность, 1972. – 440 с. 118. Горшкова Т. А. Растительная клеточная стенка как динамичная система. М.: Наука, 2007.– 429 c. 119. Бровенко Г. Н. Химический состав гидролизатов древесины – субстрата для микробиологического синтеза белка (обзор литературы). Сообщение 1. Фурфурол и оксиметилфурфурол / Г. Н. Бровенко, Т. В. Гусельникова //Гидролизная и лесохимическая промышленность. – 1993. – №1. – C. 6–1 120. Дудкин М. С., Громов В. С. Гемицеллюлозы. M.: Рига: Зинатне, 1991. – 488 c. 121. Esteghlalian A., Hashimoto A.G., Fenske J.J., Penner M.H. Modeling and optimization of the dilute–sulfuric acid pretreatment of corn stover, poplar and switchgrass // Bioresource Technology. – 1997. – №59. – Р. 129–136 122. Chen R., Lee Y. Y., Torget R. Kinetic and modeling investigation on two– stage reverse–flow reactor as applied to dilute–acid pretreatment of agricultural residues // Applied Biochemistry and Biotechnology. – 1996. – №57. – Р.133– 147. 123. Tellez–Luis S.J., Ramirez J.A., Vazquez M. Mathematical modelling of hemicellulosic sugar production from sorghum straw // Journal of Food Engineering. – 2002. – №3. – Р.285–291 124. Шагивалеев И. В., Мухачев С. Г., Емельянов В. М., Харина М. В., Аблаев А. Р., Понкратов А. С. Универсальная установка для исследования 117 процессов гидролиза лигноцеллюлозного сырья // Вестник Казанского технологического университета. – 2014. - №3. - С. 182 – 183 125. Шагивалеев И.В., Валеева Р.Т., Мухачев С.Г. Лабораторная установка высокотемпературного гидролиза с тепловым аккумулятором // Вестник Казанского технологического университета. – 2014. - №11. - С. 190 – 193 126. Нуртдинов Р.М., Мухачев С.Г., Валеева Р.Т., Емельянов В.М. Высокотемпературный гидролиз сырья // Вестник Казан. технол. ун–та.– 2011.–№10.–С. 204 – 208 127. Электронный ресурс «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов http://www.genetika.ru/vkpm/ 128. Horhammer H., Berezina O.V., Hiltunen E., Granstrom T., Van Heiningen A. Semi-bleached paper and fermentation products from a larch biorefinery // Tappi journal. – 2012. – V. 11. – № 10. – Р. 31-39 129. Berezina O. V., Brandt A., Yarotsky S.V., Schwarz W. H., Zverlov V.V. Isolation of a new butanol-producing Clostridium strain: High level of hemicellulosic activity and structure of solventogenesis genes of a new Clostridium saccharobutylicum isolate // Systematic and Applied Microbiology. – 2009. – V.32. – №7. – P. 449-459. 130. Жданов Ю. А., Дорофеенко Г. Н., Корольченко Г. А., Богданова Г.В. Практикум по химии углеводов. М.: Высшая школа, 1973. – 204 с. 131. Оболенская А. В., Ельницкая З. П., Леонович А. А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. Учеб. пособие для вузов. М.: Экология, 1991. 320 с. 132. Полыгалина Г. В., Чередниченко В. С., Римарева Л.В., Определение активности ферментов. Cправочник. M.: ДеЛи принт, 2003г. 133. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: Изд-во МГУ, 1995.224 с. 118 134. Adney B., Baker J. Measurement of Cellulase Activities // Chemical Analysis and Testing Task Laboratory Analytical Procedure. Golden: NREL, 1997. 11 p. 135. Корольков И. И. Перколяционный гидролиз растительного сырья. ˗ М.: Лесная промышленность, 1990. ˗ 272 с. 136. Esteghlalian A., Hashimoto A. G., Fenske J. J., Penner M. H. Modeling and optimization of the dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover, poplar and switchgrass // Bioresource Technology. - 1997. - 59. - p. 129 137. Аблаев А.Р., Храмова И.А., Харина М. В., Емельянов В.М., Гайфуллина И.З. Определение оптимальных параметров предобработки березовых опилок сернистой кислотой // Международная научная конференция «Биотехнологии в химиколесном комплексе» (11-12 сентября 2014 г.) сб. тез. докладов. – Архангельск: ИД САФУ. – 2014. – С. 318-320. 138. Аблаев А.Р., Харина М.В., Храмова И.А., Емельянов В.М., Гайфуллина И.З. Определение оптимальных параметров гидролиза березовых опилок сернистой кислотой // XIII Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (15-17 апреля 2014 г.) сб. тез. докладов. - Казань: Изд-во «Отечество». – 2014. – С. 48. 139. Аблаев А.Р., Храмова И.А., Гайфуллина И.З., Харина М.В., Емельянов В.М. Высокотемпературный гидролиз березового опила сернистой кислотой // Вестник Казанского технологического университета. 2014. - №14. – С. 344347 140. Харина М.В., Емельянов В. М., Высокотемпературный гидролиз свекловичного жома сернистой кислотой // Башкирский химический журнал. – 2013. - №3 – С. 54–57. 141. Харина М.В., Емельянов В.М. Влияние предварительной обработки на изменение структуры целлюлозосодержащего сырья // Башкирский химический журнал. – 2013. - №3 – С. 119 119 142. Aguilar R. Kinetic study of the acid hydrolysis of sugar cane bagasse / R. Aguilar, J. A. Ramнrez, G. Garrote, M. Vбzquez // Journal of Food Engineering. 2002. - №55. – p. 309–318. 143. Ranganathan S. Kinetic studies of wheat straw hydrolysis using sulphuric acid / S. Ranganathan, D. S. MacDonald, N. N. Bakhshi //The Canadian Journal of Chemical Engineering. – 1985. - №63. – p. 840–844. 144. Lavarack B. P. The acid hydrolysis of sugarcane bagasse hemicelluloses / B. P.Lavarack, G. J. Griffin, D Rodman / Biomass and Bioenergy. – 2002. -№ 23.p. 367–380. 145. A. H. Conner Kinetic model for the dilute sulfuric acid saccharification of lignocelluloses / A. H. Conner, B. F. Wood, C. G. Hill, J. F. Harris // Journal of Wood Chemistry and Technology. – 1985. – №5. – p. 461–489. Maloney M. T. Dilute acid hydrolysis of paper birch: kinetic study of xylan and acetylgroup hydrolysis / M. T. Maloney, T. W. Chapman, A. J. Baker // Biotechnology and Bioengineering. – 1985. - №27. – p. 355–361. 122. Mcmillan J. D. Processes for pretreating of lignocellulosic biomass. Review / Mcmillan J. D. – Colorado: NREL, 1992. – 45 p. 123. Lee Y. Y. Hemicellulose hydrolysis and fermentation of resulting pentoses to ethanol / Y. Y. Lee, T. A. McCaskey // Technical Association of the Pulp and Paper Industry. - 1983. - №66.– p. 102–107. 124. Jimenez L. Acid hydrolysis of sunflower residue biomass / L. Jimenez, J.L. Bonilla // Process Biochemistry. – 1993. - №28.- p. 243–247. 125. Esteghlalian A. Modeling and optimization of the dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover, poplar and switchgrass / A. Esteghlalian, A.G. Hashimoto, J.J. Fenske, M.H. Penner // Bioresource Technology. – 1997. - №59. – p. 129–136. 146. González G. Dilute acid hydrolysis of wheat straw hemicellulose at moderate temperature: A simplified kinetic model / G. González, J. López- 120 Santín, G. Caminal, C. Solà // Biotechnology and Bioengineering. – 1986. - №2. – p. 288–293 147. Логинова И. В., Емельянов В. М., Валеева Р. Т., Мухачев С. Г. Моделирование кинетики процессов высокотемпературного гидролиза растительного сырья // Вестник Казанского технологического университета. – 2012. - №12. – С. 102–104. 148. Емельянов В. М., Логинова И.В., Валеева Р.Т., Мухачев С.Г. Решение задачи многомерной высокотемпературного оптимизации гидролиза для идентификации соломы // Вестник параметров Казанского технологического университета. – 2012. - № 12. – С. 105–106. 149. Carpita N, McCann M (2000) The cell wall. In: Buchanan B, Gruissem W, Jones R (eds) Biochemistry and molecular biology of plants. American Society of Plant Biologists, Rockville, p. 52–108 150. Esteghlalian A., Hashimoto A.G., Fenske J.J., Penner M.H. Modeling and optimization of the dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover, poplar and switchgrass // Bioresource Technology. – 1997. - №59. – p. 129–136. 151. Grohmann K., Torget R., Himmel M. Optimization of dilute acid pretreatment of biomass // Biotechnology and bioengineering symposium. - 1985. - №15. – p.59–80. 152. Chen R., Lee Y. Y., Torget R. Kinetic and modeling investigation on twostage reverse-flow reactor as applied to dilute-acid pretreatment of agricultural residues // Applied Biochemistry and Biotechnology. – 1996. - №57. – p. 133– 147. 153. Téllez-Luis S.J., Ramírez J.A., Vázquez M. Mathematical modelling of hemicellulosic sugar production from sorghum straw // Journal of Food Engineering. – 2002. - №3. – p. 285–291. 154. Jimenez L., Bonilla J.L. Acid hydrolysis of sunflower residue biomass // Process Biochemistry. – 1993. - №28.- p. 243–247. 121 155. Аблаев А.Р. Клещевников Л.И., Логинова И.В., Харина М.В., Емельянов В.М. Математическое моделирование выхода моносахаридов в процессе предобработки пшеничной соломы // Материалы международной научной конференции: «Рациональное использование природных биологических ресурсов», Рим, (12-19 апреля 2014 г.) часть 1. - М.: «Академия естествознания».- 2014. - С. 210-211. 156. Клещевников Л.И., Аблаев А.Р., Логинова И.В., Харина М.В., Емельянов В.М. Имитационное моделирование температурных режимов предобработки растительного сырья // Materiály X mezinárodní vědecko praktická konference «Moderní vymoženosti vědy – 2014». - Díl 31. Chemie a chemická technologie.Zeměpis a geologie.: Praha. Publishing House «Education and Science» s.r.o. - 2014. - С.64-67. 157. Kobayashi T., Sakai Y. Hydrolysis rate of pentosan of hardwood in dilute sulfuric acid // Bulletin of the Agricultural Chemical Society . - 1956. - №20. –p. 1–7. 158. Chamy R., Illanes I., Aroca G., Nunez L. Acid hydrolysis of sugar beet pulp as pretreatment for fermentation // Bioresource Technology. - 1994. - №50. – p. 149–152. 159. El-Tayeb T. S., Abdelhafez A. A., Ali S. H., Ramadan E. M. Effect of acid hydrolysis and fungal biotreatment on agro-industrial wastes for obtainment of free sugars for bioethanol production // Brazilian Journal of Microbiology. – 2012. – №4.-p.1523–1535. 160. Simion А. I., Dobrovici P. E., Rusu L., Gavrilă L., Ciobanu D. New possibilities for the valorization of sugar industry by-products // Revue Roumaine de Chimie. – 2012. - №6.- p. 577–586. 161. Ivetić T.D., Vasić V.M., Šćiban M.B., Antov M.G. Analysis of pretreatments of sugar beet shreds for bioethanol production in respect of cellulose hydrolysis and waste flows //Acta periodica technologica. – 2011. – №2 – p. 223– 229 122 162. Аблаев А. Р., Харина М. В., Березина О. В., Рыков С. В., Яроцкий С. В., Емельянов В. М. Оценка эффективности биосинтеза масляной кислоты при культивировании бактерий Сlostridium butyricum и Сlostridium tyrobutyricum на гидролизатах березового опила и свекловичного жома // Биотехнология. – 2014. - №4. – С. 31-37 163. Аблаев А. Р., Логинова И. В., Харина М.В., Емельянов В.М. Исследование кинетики гидролиза свекловичного жома сернистой кислотой при температурах свыше 200 °С // Вестник Казанского технологического университета. – 2014. - № 14. – С. 339-342 123
