МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ
ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
Л.Д. ВАРБАНЕЦ, Г.М. ЗДОРОВЕНКО,
Ю.А. КНИРЕЛЬ
МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
ЭНДОТОКСИНОВ
ПРОЕКТ
“НАУКОВА ДУМКА”
КИЕВ
НАУКОВА ДУМКА
2006
УДК 576. 8.098
В монографии изложены современные методы выделения и
очистки
эндотоксинов
(липополисахаридов)
грамотрицательных
бактерий, получения отдельных структурных компонентов молекулы
(О-специфического полисахарида, олигосахарида кора, липида А),
описаны
подходы
к
изучению
их
состава
и
структуры
с
использованием химических методов, масс-спектрометрии и ЯМРспектроскопии, включая разработанные в последние годы различные
модификации этих методов. Отдельные главы посвящены методам
иммунологического
анализа
и
изучению
некоторых
видов
биологической активности эндотоксинов.
Для микробиологов, биохимиков, химиков, преподавателей,
аспирантов и студентов, занимающихся изучением липополисахаридов
грамотрицательных бактерий.
Ответственный редактор
академик НАН Украины, профессор В.С. ПОДГОРСКИЙ
Рецензенты:
д-р биол. наук, проф. Р.И. Гвоздяк
д-р биол. наук, проф. А.М. Зайченко
Рекомендовано к печати ученым советом Института микробиологии
и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины
Научно-издательский отдел медико-биологической, химической и
геологической литературы
Редактор Ж.В. Загоруйко
ISBN 966-00-0458-3
ПРЕДИСЛОВИЕ
___________________________________________________________________________
Известно, что эндотоксины – термостабильные биополимеры, которые
вырабатываются грамотрицательными бактериями, обладают широким
спектром
биологической
активности
и
способны
оказывать
токсическое действие на организм животных и человека. В
настоящее
время
септический
шок,
вызванный
эндотоксинами
грамотрицательных бактерий, продолжает оставаться одной из
актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной
тенденции к росту числа больных и стабильно высокой летальности.
Это происходит в результате увеличения доли инфекций, вызываемых
условно-патогенными,
а
также
неферментирующими
бактериями,
такими,
как
Pseudomonas
aeruginosa,
Acinetobacter
sp.,
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloaceae и др. Неоправданное
использование комбинированной антибиотикотерапии и ряда новых
препаратов ультраширокого спектра действия обусловили появление
в качестве возбудителей прежде крайне редко встречающихся при
сепсисе микроорганизмов – Enterococcus faecium, Stenotrophomonas
maltophilia, Flabobacterium sp.
Вместе с тем эндотоксины способны оказывать и благотворное
влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к
бактериальным и вирусным инфекциям. По данным [27], эндотоксины
важны для нормального развития и функционирования иммунной
системы организма.
Для того чтобы выяснить, каким образом эндотоксины
осуществляют столь разнообразные функции, необходимо знать их
химический состав, структуру, конформацию, топологию в клетке.
В 1935 г. A. Boivin и J. Mesrobeanu [55, 56], используя
метод экстракции клеток трихлоруксусной кислотой, показали, что
эндотоксин представляет собой макромолекулярный комплекс из
белка, липида и полисахарида.
Спустя 20 лет O. Westphal и O. Luderitz [212] разработали
водно-фенольный
метод
изолирования
эндотоксина
из
грамотрицательных бактерий и провели классические исследования
по биохимии эндотоксинов. Полученный ими полимер по своей
биологической
активности
был
подобен
эндотоксину,
экстрагируемому трихлоруксусной кислотой, однако в отличие от
последнего состоял в основном из углеводов и жирных кислот.
Таким образом, эндотоксины с химической точки зрения
представляют собой липополисахариды (ЛПС) – основные компоненты
внешней мембраны грамотрицательных бактерий, локализованные
исключительно на наружной поверхности. Ее внутренняя поверхность
содержит другой тип липидов – глицерофосфолипиды [166, 168]. В
то время как монослой глицерофосфолипида текуч при нормальной
температуре и в значительной степени напоминает термальное
поведение глицерофосфолипидного бислоя в цитоплазматической
мембране,
монослой
ЛПС
имеет
высокоупорядоченную
квазикристаллическую структуру с очень низкой текучестью [167];
в нем молекулы ЛПС связаны посредством ионных мостиков из
дивалентных катионов Mg2+, Ca2+. Такая структура слоя ЛПС во
внешней мембране ограничивает поступление веществ, таких, как
соли
дивалентных
катионов,
литические
ферменты,
некоторые
антибиотики.
В
то
время
как
пориновые
каналы
позволяют
диффундировать
через
внешнюю
мембрану
низкомолекулярным
веществам (до 600 Да), например моно- и дисахариды, вещества с
большей
молекулярной
массой и все гидрофобные соединения
эффективно удерживаются внешней мембраной многих бактерий
–
представителей Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и др.
[166].
Поэтому
грамотрицательные
бактерии
гораздо
менее
чувствительны к гидрофобным антибиотикам, чем грамположительные.
Минимальные концентрации многих гидрофобных ингибиторов для
“дикого типа” штаммов Escherichia coli, Salmonella typhimurium в
10–1000 раз выше, чем для их мутантов, дефектных по
структуре
внешней мембраны, или грамположительных бактерий [167, 168].
ЛПС играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной
клетки
с
окружающей
средой,
а
в
случае
патогенных
микроорганизмов – с организмом хозяина, по отношению к которому
он проявляет себя как эндотоксины и антигены. Поскольку ЛПС
представляют
собой
основные
термостабильные
поверхностные
антигены (их называют О-антигенами) бактериальной клетки, они
имеют
большое
значение в серотипировании некоторых видов
грамотрицательных бактерий.
В настоящее время в зависимости от специфических свойств
или функций, которые выполняют этим биополимеры, используют три
названия: эндотоксины, ЛПС, О-антигены. ЛПС – это семейство
структурно
родственных
амфифильных
макромолекул,
которые
характеризуются
общим
строением.
Полная
макромолекула
ЛПС
состоит из полисахаридной части – О-специфической цепи и
олигосахарида кора, ковалентно связанного с липидной частью,
названной липидом А, с помощью которого молекула “заякоривается”
в наружном слое внешней мембраны [215]. Липид А и олигосахарид
кора считаются относительно консервативными в филогенетическом
отношении структурами, в то время как О-специфические цепи
характеризуется чрезвычайной вариабельностью. Такая структура
ЛПС
–
S-форма
–
продуцируется
гладкими
бактериальными
фенотипами,
представителями
Enterobacteriaceae
и
Pseudomonodaceae.
Микроорганизмы,
являющиеся
искусственно
полученными или природными R-мутантами (шероховатые фенотипы
многих
видов
Acinetobacter,
Bordetella,
Campylobacter,
Bacteroides, Neisseriae, Haemophylus, Chlamydia), синтезируют
R-ЛПС, в молекуле которых отсутствует О-полисахаридный фрагмент.
Химический
анализ
R-мутантов
бактерий,
представителей
Enterobacteriaceae (E. coli, Salmonella enterica), дефектных по
биосинтезу
О-специфических
полисахаридных
цепей,
позволил
дифференцировать ряд хемотипов: Ra, Rb, Rc, Rd и Re [148]. Ra
описывает ЛПС, содержащий полную структуру олигосахарида кора, в
то время как Re представляет минимальную структуру ЛПС,
состоящую
только
из
липида
А
и
дисахарида
2-кето-3дезоксиоктоновой кислоты. Большинство же штаммов «дикого типа»
бактерий продуцирует S-, R-, а также переходные SR-формы ЛПС. В
зависимости от того, в S- или R-форме ЛПС присутствует в
клетках, применяют различные методы их выделения и очистки.
В
монографии,
состоящей
из
5
глав,
изложены
как
классические, так и современные методы анализа эндотоксинов
(ЛПС) грамотрицательных бактерий. Первая глава посвящена методам
выделения и очистки липополисахаридов, получению их структурных
компонентов (О-специфического полисахарида, олигосахарида кора и
липида
А),
а
также
химически
модифицированных
форм
(дефосфорилированных, дезацилированных).
Во
второй
главе
приведены
методы
изучения
состава
препаратов
ЛПС:
количественное
определение
общих
сахаров,
пентоз, гексоз, гептоз, аминосахаров, уроновых кислот, 4-амино4-дезокси-L-арабинозы,
кетодезоксиоктоновой
кислоты
(КДО),
глюкозы,
галактозы,
а
также
неуглеводных
компонентов
(пировиноградная кислота, ацетильные группы, фосфор) и примесей
(белок, нуклеиновые кислоты); описаны методы бумажной, газожидкостной
(ГЖХ),
жидкостной,
тонкослойной
хроматографии,
включая хроматографическое определение КДО и 4-амино-4-дезоксиL-арабинозы,
абсолютных
конфигураций
моносахаридов
и
неуглеводных компонентов.
В третьей главе рассмотрены методы структурного анализа
ЛПС, включая химические (метилирование, парциальный гидролиз и
сольволиз, дезаминирование, распад по Смиту) и физические
методы,
в
том
числе
масс-спектрометрия
с
ионизацией
бомбардировкой быстрыми атомами (FAB), лазерной десорбцией из
матрицы (MALDI) и электрораспылением (ESI), а также одно- и
двумерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Поскольку ЛПС – основные антигены бактериальной клетки, для
изучения
их
иммунохимической
специфичности
используют
традиционные методы (различные виды агглютинации, преципитации,
двойной иммунодиффузии в агаре), иммуноэлектрофорез (включая
ракетный), иммуноферментные методы анализа, а также электрофорез
с иммуноблоттингом. Все указанные методы приведены в четвертой
главе.
Как
известно,
ЛПС
характеризуются
широким
спектром
биологической активности, включающей летальную токсичность,
пирогенность, митогенную активность, способность индуцировать
образование цитокинов (фактор некроза опухоли, оксид азота,
гамма-интерферон, интерлейкины), оказывать протективное действие
и т.д. Методы, используемые для изучения различных видов
биологической активности, изложены в пятой, заключительной
главе.