11 6 4 6 8 -/ о Bacillus intermedius 3-19.

о
11
6 4 6 8 -/
На правах рукописи
ШАКИРОВ ЕВГЕНИЙ ВИТАЛЬЕВИЧ
ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗА
Bacillus intermedius 3-19.
БИОСИНТЕЗ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА,
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ
03.00.07 -
микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
КАЗАНЬ
- 2000
Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного
университета
им .
Химического
факультета
В .И.Ульянова-Ленина
Московского
и
в
лаборатории
государственного
Химии
белка
университета
им.
М . В.Ломоносова
Научные руководители:
доктор химических наук ,
профессор Г . Н.Руденская
НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА
(МГУ, Москва)
КФУ
111\Ш '11
0000947699
доктор биологических наук,
академик АН Татарстана,
1111111111 11111
профессор И .Б. Лещинская
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
ведущий научный сотрудник
Г .И.Эль-Регистан
(Институт микробиологии РАН, Москва)
доктор биологических наук,
профессор В.И .Чикав
Научно-исследовательский
Ведущая организация:
ветеринарный
институт (НИВИ), г. Казань
Защита диссертации состоится___З
__l_~
--'-'--"ал_-"-'=--------2000 г.
в / lt 'r. 30..и часов на заседании диссертационного совета К 053.29.19 при
Казанском государственном университете им.В.И. Ульянова-Ленина,
г.Казань, ул.Кремлевская,
С
диссертацией
420008,
18
можно
ознакомиться
в
библиотеке
Казанского
го сударст в е нного университета
Автореферат разослан
j_J?~2oooг.
Ученый секретарь
диссертационного совета ,
кандидат биологических наук
А.Н. Аскарова
0·7 1 6 4 6 8 -/
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Белки
осуществляющие
множество
-
основные «рабочие» единицы клетки,
различных реакций
и
процессов
и
являющиеся
неотъемлемой частью структуры самой клетки. Синтез и само существование
белков, как и любых других составляющих клеток, подвергается строжайшему
контролю и реrуляIЩи со стороны факторов, ответственных за развитие клетки.
Старые,
поврежденные
или
избыточные
белковые
молекулы
должны
быть
разрушены для того, чтобы клетка смогла развиваться дальше . Этот процесс
-
быстрое и селективное расщепление химически устойчивой пептидной связи в
белках
- решается с помощью протеолитических ферментов - протеиназ -
уникальных биологических катализаторов, в миллиарды раз ускоряющих реакцию
гидролиза белков. Энергия, необходимая для расщепления пептидной связи в
белках в нейтральной водной среде при комнатной температуре, настолько велика,
что спонтанный гидролиз во многих случаях не происходит даже при инкубации в
течение нескольких месяцев. Однако, при температуре
молекула протеиназы
способна
вызвать
37 ° и
протеолиз
100
нейтральном рН одна
пептидных
связей
в
секунду.
Протеолитические ферменты выполняют в клетке ряд жизненно важных
функций.
Кроме
протеолитические
участия
ферменты
в
деструктивных
фунКIЩонируют
катаболических
на
этапе
процессах
посттрансляционного
процессинrа белков, участвуют в клеточной дифференцировке
,
в том числе у
прокариот, в таком важном с общебиологических позИIЩЙ процессе, как переход
вегетативных клеток к спорообразованию, то есть в анабиотическое состояние .
Они осуществляют селективный протеолиз белков, связанный с изменением
метаболизма.
Протеолитические ферменты широко используются в молекулярной биологии
в качестве инструментов для изучения первичной структуры белков и пептидов; с
другой стороны, сами протеазы являются удобными объектами для изучения
механизмов функционирования белков (Вreddam К.
et а!., 1992).
Протеолитические ферменты применяются в производстве моющих средств,
кожевенной и пищевой промышленности. Они также нашли широкое применение
во многих областях меДИIЩНЫ, их используют для лечения опасных ожоговых
поражений, для ускорения заживления ран, восстановления повреждений после
переломов и травм (Сахаров И.Ю. и др.,
инфекций и роста раковых клеток
1993),
при защите организма от вирусных
(Odake S et al., 1991).
4
Род
Bacil/us -
это
непатогенные
микроорганизмы,
являющиеся
легко
культивируемыми продуцентами многих внеклеточных ферментов и поэтому
представляющие собой один из наиболее удобных
объектов для получения
протеолитических ферментов и изучения их свойств (Харвуд К.,
Нами было установлено, что бактерии
гидролазами (ферменты,
расщепляющие
1992).
наряду с другими
Bacillus intermedius
связи в биологических молекулах
-
рибонуклеаза, фосфатаза) секретируют несколько сериновых протеиназ, одна из
которых по предварительным данным относится к группе глутамилэндопептидаз
ферментов,
расщепляющих
пептидные
связи,
образованные
-
карбоксильными
группами глутаминовой и аспарагиновой кислот. Представлялось интересным
выделить
и
охарактеризовать
представления
о
рассматривающиеся
этот
фермент,
глутамилэндопептидазах
как
отдельная
который
класса
расширяет
сериновых
эволюционная
ветвь
с
наши
протеиназ,
кардинальным
изменением специфичности действия.
Пели
и
задачи
исследования.
характеристики нового фермента
intermedius 3-19,
и
получения
-
Данная
работа
проведена
с
внеклеточной глутамилэндопептидазы
целью
Bacillus
включая изучение физико-химических и энзиматических свойств
кристаллов
протеиназы
для
проведения
рентгеноструктурного
анализа молекулы белка, а также определения условий, оптимальных для синтеза
этого фермента.
В
соответствии
с
поставленной
целью
бh!ЛИ
определены
следующие
экспериментальные задачи:
1.
Оптимизация
состава
питательной
среды
для
получения
максимальной продукции глутамилэндопептидазы.
2.
Выделение
жидкости
3.
и
очистка
B.intermedius;
глутамилэндопептидазы
из
культуральной
получение гомогенного препарата фермента.
Изучение основных физико-химических и энзиматических свойств
протеиназы.
4.
Выращивание
и
предварительный
анализ
кристаллов
для
рентгеноструктурного изучения белка.
Научная
работы.
новизна
глутамилэндопептидаза
Впервые
B.intermedius.
обнаружена
Определены
оптимальные
внеклеточная
условия
для
продукции протеиназы. Разработан эффективный лабораторный метод получения
гомогенного
препарата
глутамилэндопептидазы,
основанный
на
высокоэффективной,. w.оiГхр<j~~~~Ф~:~~еделены Физико-химические
1. . .
1
'
"1
i! i.:~.:~ · =·. : .. 1·
.... . .
~ ~ ."
·-• .:J
. ._ , ... . . . . ··.· · о
: · · -· '
·~...-." , w . •"'~
~ --
:: .
~· э
--
li
!
5
характеристики и энзиматические свойства фермента. Впервые в отечественной
науке получены кристаллы глутамилэндопептидазы В. intermedius, позволяющие
проводить
рентгеновские
резулы:аты
дают
исследования
возможность
структуры
пополнить
этого
новым,
белка.
ранее
Полученные
неизученным
бациллярным ферментом группу глутамилэндопептидаз, входящих в семейство
химотрипсина класса сериновых протеиназ.
Практическая
ценность
глутамилэндопептидазы.
работы.
Разработан
которого можно получить
2-3
Оптимизированы
метод
очистки
условия
фермента,
мг гомогенного белка из
l
биосинтеза
с
помощью
л культуральной
жидкости.
Нами показано, что выделенная и охарактеризованная протеиназа относится к
группе
глутамилэндопептидаз,
специфичность
действия
которых
целиком
определяется присутствием в субстрате отрицательно заряженных боковых цепей
глутаминовой и аспарагиновой кислот. Уникальные свойства этого фермента
делают
возможным
его
использование
в
качестве
инструмента
для
изучения
первичной структуры белков и удобной модели для конструирования протеиназ с
модифицированными свойствами .
Полученные
впервые
в
России
кристаллы
глутамилэндопептидазы
В. intermedius позволили провести рентгеновские исследования структуры этого
белка с целью выяснения уникального механизма субстратной специфичности
фермента.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы бьши
доложены на VIП Европейском конгрессе по биотехнологии (Будапешт, Венгрия,
1997), VI
Симпозиуме <<Химия протеолитических ферментов» (Москва,
Конференции
Испания,
по
промышленному
1997),
VП
1997),
(Барселона,
П съезде Биохимического общества РАН
Международной
конференции
биологических макромолекул (Гранада, Испания,
(Бостон, США,
ферментов
Международном конгрессе по биохимии и молекулярной
1997), 17
биологии (Сан-Франциско, США,
(Москва,
использованию
1997), VII
1998), 13
по
кристалли:зации
Симпозиуме по белкам
1999).
Публикации. Опубликовано
17 работ по материалам диссертации.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на
136
страницах
машинописного текста; состоит из обзора литературы, описания материалов и
методов исследований, раздела экспериментальных исследований, обсуждения
6
результатов, выводов и
списка литературы.
рисунка. Список литературы включает
Работа содержит
1О
таблиц,
22
145 источников .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали стрептомицинустойчивый
штамм
(В-3833, Всесоюзная коллекция промышленных
Bacillus intermedius 3-19
микроорганизмов),
выделенный
из
дикого
штамма
Bacil/us intermedius
7Р
(коллекция кафедры микробиологии Казанского государственного университета)
путем естественного рассева на среде со стрептомицином в концентрации
мкг/мл .
Штамм
B.intermedius
антибиотикоустойчивых
был
3-19
шrаммов
отобран
В. intermedius
по
среди
признаку
500
других
максимальной
протеолитической активности.
Для культивирования клеток
B.intermedius
в качестве исходной использовали
среду без глюкозы следующего состава (г/л): пептон
MgS04 х
7Н2 0-
МnS0 4 -
0,3; NaCI - 3,0;
0,1; рН- 8,5
х2Н 2 0
- 20; CaCI 2
(Лещинская И.Б. и др.,
- 0,1;
1981).
Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при длине волны
590
нм.
ПIJОдуктивность
определяли
как
культуры
отношение
(П)
величины
в
отношении
синтеза
протеолитической
протеиназы
активности
в
культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах
или процентах относительно контроля. Белок определяли спе.ктрофотометрически,
считая, что концентрация белка
единице
(оп.ед.)
в
кювете
1
мг/мл соответствует А 280
толщиной
определяли по казеину (Каверзнева Е .Д.,
субстрату (Мосолова О.В., и др.,
Для
выделения
ионообменную
и
1
см.
1971) и
=
1
оптической
Протеолитическую
активность
по синтетическому хромоrенному
1987).
очистки
хроматографию
на
глутамилэндопептидазы
КМ-целлюлозе
и
использовали
высокоэффективную
жидкостную хроматографию (ВЭЖХ).
Степень чистоты препарата и молекулярную массу фермента определяли
электрофорезом в
Лаэммли
(Laemmli
12,5%-ном ПААГ в присутствии
Н.К.,
Изоэлектрическую
(Sluyteпnaп
0,1% DS-Na
по
методу
1970).
точку
L. et al., 1978)
фермента
на Увикорде
определяли
(«ISCO»),
хроматофокусированием
используя колонку с гелем РВЕ-
94 («Pharmacia», Швеция) .
При
изучении
влияния
специфических
глутамилэндопептидазы использовали
ингибиторов
DFP, PMSF, TLCK,
на
ЭДТА,
активность
Hg(CH3COO}i,
7
бензамидин
«Sigma>>
(Германия) в соотношении фермент:ингибитор
Белковые ингибиторы использовали в молярном соотношении
Субстратную
специфичность
синтетические субстраты
фермента
изучали
H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH
и
1:100.
1: 1О.
по
действию
на
H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH
и по расщеплению А и В цепей окисленного инсулина и глюкагона.
Для определения аминокислотного состава фермент гидролизовали
при
105°
в вакуумированных ампулах в течение
на аминокислотном анализаторе Нitachi
48
5,7
н
HCI
ч и гидролизат анализировали
(Япония). Остатки полуцистина и
835
метионина определяли после их окисления надмуравьиной кислотой, триптофан
после гидролиза белка метансульфоновой кислотой в присутствии
-
0,2%-ного
триптамина. N-концевую последовательность глутамилэндопептидазы определяли
по
методу
Эдмана
в
образцах,
полученных
хроматографией на колонке (4,6х100 мм)
градиенте
концентрации
кислотой в течение
мембранах
40
lmmoЬilon
(15-60%)
после
дополнительной
очистки
Aquapore («Applied Biosystems», USA)
ацетонитрила
с
О, 1%
в
трифлуороацетовой
мин с помощью НРLС. Белок затем иммобилизовали на
Р
и
секвенировали
на
приборе
Кnauer-816
(«Applied
проводили
методом
диффузии
Biosystem>> 120 А РIН, Analyzer One Line, USA).
Кристаллизацию
глутамилэндопептидазы
паров растворителя в «висячей капле» при комнатной температуре. Объем капли
белкового раствора равнялся
15
2,5-10 мкл.
Концентрация белка в капле составляла
мг/мл, фосфата калия-0,4-0,8 М, 2-метилпентандиола-2,4
вырастали небольшие тонкие пластины
раствором фосфата калия, рН
раствор для разращивания
(1,2
7 ,О
(0,05-0,1
- 3%.
Через
5-7
мм). Их промывали
6-
дней
1,15
М
для активации поверхности и помещали в
М фосфат калия, рН
содержащий
7,0,
0,6%
белка).
При выдерживании в этом растворе кристаллы достигали максимального размера
за три-четыре дня. Набор дифракционных данных был собран до разрешения
на автоматическом синхротроне (ЕМВL
1,7 А
Hamburg Station).
Для анализа цифрового материала экспериментов исследования проводили
математическую обработку результатов (Плохинский Н.А.,
1978).
Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении CJ ~
10%.
В
качестве
критерия
Стьюдента, принимая Р ~
Наряду
использовали
эксперимента
с
достоверности
0,05
традиционным
многофакторные
проводилась
разности
использовали
критерий
за достаточный уровень значимости.
с
изучением
влияния
эксперименты.
помощью
комплекса
факторов
отдельных
Обработка
результатов
компьютерных
программ
8
«BIOPT»,
вкточающего
программы
экспериментов {Краснов С . И. и др.,
обработки
результатов
многофакторных
1992).
РЕЗУЛЬ ТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1.
Отбор активных штаммов и исследование состава питательной среды
для обеспечения высокой продукции глутамилэндопептидазы
B.intermedius 3-19
Среди 16 антибиотикоустойчивых штаммов Bacillus intermedius бьш отобран
стрептомицинустойчивый
штамм
Bacil/us intermedius 3-19 по принципу
максимальной активности по хромогенному субстрату
Z-Glu-pNA,
который и
использовали в дальнейшей работе.
Динамика
роста
культуры
и
биосинтеза
фермента
на
исходной
среде
(Лещинская И . Б.,1981) представлена на рис . l. Согласно модели Колемана, синтез
катаболических ферментов микроорганизмов представляет собой двухфазный
процесс , при котором максимальный синтез ряда ферментов наступает в период
замедления или полного прекращения роста культуры
(Coleman G. et al., 1975).
Глутамилэндопептидаза В. intermedius появляется в культуральной жидкости в
стадии замедления роста культуры, активность фермента достигает максимума в
стационарной фазе на 18-й час роста.
Таким образом,
глутамилэндопептидаза
В. intermedius оnюсится к ферментам второй фазы, синтез которых осуществляется
в фазе замедления роста.
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
часы
Рис.1 Динамика роста и биосинтеза глутамилэндопептидазы В. intermedius
1 - биомасса,
опт. ед. ,
2 - активность, мкМ/мл
9
Согласно
данным
литературы
глюкозой.
подавляется
Исследование
легкометаболизируемых
показало,
что
концентрации глюкозы или мальтозы
на
50%
значительному
галактозы,
(рис.2).
снижению
лактозы
и
также
протеиназ
и
в
других
биосинтез
на
углерода
среде
минимальной
вызывало снижение продуктивности
концентрации
продуктивности
сахарозы
микробных
глюкозы
присутствие
(0,5%)
Увеличение
ряда
влияния
источников
глутамилэндопептидазы
бактерий
биосинтез
глюкозы
культуры .
приводило
приводило
Присутствие
к
снижению
в
к
среде
биосинтеза
протеиназы, но в меньшей степени . Аналогичные результаты бьши получены для
тиолзависимой сериновой протеиназы
1995)
и протеазы
B.intermedius 3-19
Streptomyces sp G-157 (Sampath
Р.
et
а!.,
(Ицкович Е.Л. и др.,
1998).
Таким образом,
подобно синтезу других протеиназ, синтез глутамилэндопептидазы
B.intermedius
подавляется легкометаболизируемыми источниками углерода, по-видимому, по
типу катаболитной репрессии.
120
П,%
1 2 3 4 5
о
2
0,5
Углеводы,%
Рис.2 Влияние углеводов на биосинтез глутамилэндопептидазы
B.intermedius
!-глюкоза, 2-галактоза, 3-лактоза, 4-мальтоза, 5-сахароза
Бьшо исследовано влияние различных типов пептона и их концентраций, а
также
неорганического
B.intermedius.
фосфата
на
биосинтез
планирования эксперимента по плану В2 (Максимов В.Н.,
двух факторов
глутамилэндопептидазы
Исследование проводили с применением метода математического
-
пептона
(Xl)
1980),
и неорганического фосфата (Х2)
-
где концентрации
варьировались на
10
трех уровнях (табл.1) . С помощью программы "ВIОРТ'' получены уравнения
регрессии, по которым были рассчитаны оптимальные концентрации пептона и
неорганического
фосфора
использовались
для
исследуемых
- 20
г/л
достижения
пептонов
был
и
г/л
0,2
соответственно ,
максимального
отобран
пептон
выхода
растительного
которые
фермента.
и
Из
происхождения
производства Тбилисского завода, так как активность протеиназы на среде с ним
была в
2 раза вьШiе,
чем на средах с другими .
Одним из путей регуляции биосинтеза внеклеточных ферментов является
регуляция
конечным
продуктом,
которым
для
глутамилэндопептидазы
могут
служить аминокислоты. Присутствие в среде индивидуальных аминокислот, как
правило,
ингибирует
синтез
протеиназ.
Мы
исследовали
влияние
ряда
индивидуальных аминокислот, а также комплекса аминокислот (казаминовые
кислоты)
на
биосинтез
глутамилэндопептидазы
B.intermedius.
Добавление
в
питательную среду, содержащую пептон , индивидуальных аминокислот в той или
иной
степени
подавляет
биосинтез
глутамилэндопептидазы
В. intermedius.
Внесение казаминовых кислот в среду культивирования подавляет рост бактерий в
2 раза, активность же
снижается незначительно.
Таблица
1
Оптимизация состава питательной среды по плану В2 для биосинтеза
протеиназы В. intermedius
Уровни факторов
Биомасса,
Фн
Пептон
3-19 на пептоне
опт.ед.
растительного происхождения
Активность,
мкМ/мл
Продуктивность ,
усл.ед
Xl
г/л
Х2
г/л
+
30
0,3
14,0
10,7
0,76
-
10
+
+
0,3
5,5
9,0
1,64
+
30
12,5
11,5
0,92
-
-
0,1
10
0,1
5,9
14,6
2,47
+
30
о
0,2
13,9
12,0
0,86
-
10
о
0,2
5,3
12,8
2,42
о
20
+
0,3
12,0
23,8
1,98
о
20
-
0,1
10,9
22,2
2,04
11
Полученные данные
синтеза внеклеточной
позволяют предположить
наличие
чувствительности
глутамилэндопептидазы к азотметаболитной репрессии .
Похожий эффект был получен для других внеклеточных протеиназ (Колев Д.А. ,
1986, Ицкович
Е.Л. и др.,
1995).
Казаминовые кислоты при культивировании микроорганизмов могут служить
источником
одновременно
и углерода и азота.
При
исследовании
влияния
казаминовых кислот в качестве единственного источника углерода и азота на рост
бактерий и синтез фермента было показано, что урожай клеток понижается в
раза по сравнению с контрольной средой, а активность снижается на
3,5
15-20%
в
зависимости от концентрации казаминовых кислот. Похожий эффект был получен
для тиолзависимой сериновой протеиназы
1995),
для кислой протеиназы
протеиназ
B.intermedius 3-19
(Ицкович Е .Л . и др . ,
a!Ьicans (Вanerjee А.
Candida
et
B.megaterium (Morovcova J. et а1., 1984). При добавлении
а! . ,
для
1991 ),
в питательную
среду дрожжевого экстракта увеличивался урожай клеток и активность фермента,
однако продуктивность культуры не увеличивалась. Ионы аммония, внесенные в
среду в виде соли ~CI стимулируют синтез фермента на
15%
по сравнению с
контролем.
Для
каталитической
активности
протеиназ
важную
двухвалентных металлов. Известно, что ионы Са
роль
играют
ионы
стабилизируют молекулу
2
+
глутамилэндопептидазы, при этом повышается активность фермента (Руденская
Г.Н. ,
1998,
Мосолова О.И. и др.,
1987).
Мы провели изучение влияния ионов ряда
двухвалентных металлов на накопление глутамилэндопептидазы в культуральной
жидкости B.intermedius (рис.3). Из рисунка видно, что наличие в среде ионов Mg2+
в концентрации 2 мМ и ионов Са2+ в концентрации 5 мМ является оптимальным
для биосинтеза глутамилэндопептидазы. Присутствие в среде ионов Со
концентрации
наблюдалось
(оптическая
3
мМ увеличивало продуктивность в
сильное
ингибирующее
плотность
уменьшалась
действие
в
4
2,5
на
раза),
2
+
в
раза. Однако , при этом
рост
микроорганизмов
активность
же
фермента
увеличивалась незначительно, в связи с чем ионы кобальта не вводились в среду
культивирования.
При
исследовании
локализации
клетках и культуральной жидкости В. intermedius
глутамилэндопептидазы
в
было показано, что фермент
обнаруживается на мембране и что соли кобальта, вероятно, влияют на процесс
диссоциации фермента с мембраны, способствуя выходу мембраносвязанного
белка в среду с образованием внеклеточного фермента (Шарипова М.Р. и др . ,
2000).
12
300 '
250
'<f?.
!З" 200
!8-!00"' j~~
1
50
J'-------'------'-----L__L____~
о
2
4
10
Ионы металлов, мМ
Рис.З.
Влияние
ионов
двухвалентных
глутамилэндопептидазы В.
1-
ионы кобальта;
магния;
5-
2-
ионы меди;
металлов
биосинтез
intermedius
ионы кальция; З
6-
на
ионы железа;
-
ионы марганца;
7-
4-
ионы
ионы цинха.
За 100% принята продуктивность культуры без Ионов металлов
а~
10%
Таким образом, проведенные исследования позволяют отметить, что регуляция
биосинтеза
регуляции
глутамилэндопептидазы
синтеза
других
В. intermedius
протеиназ,
осуществляется
а
именно,
аналогично
подавляется
легкометаболизируемыми источниками углерода по типу катаболитной репрессии
и
комплексом аминокислот по типу репрессии
продуктом,
однако
имеются
некоторые
синтеза фермента конечным
особенности,
например,
увеличение
продукции глутамилэндопептидазы в присутствии ионов кобальта в среде.
2. Выделение
и очистка rлутамилэндопептидазы
B.intermedius
Для характеристики глутамилэндопептидазы В. intermedius необходимо иметь
фермент в гомогенном состоянии. Нами разработан метод выделения и очистки
глутамилэндопептидазы из культуралъной жидкости В. intermedius с помощью
13
ионообменной
хроматографии
на
КМ-целлюлозе
жидкостной хроматографии на колонке
хроматографии, включающие
при ионной силе
NaCI.
40
высокоэффективной
белковых пика: белки первого пика элюировались
3
NaCI,
мМ
и
На рис.4 представлены результаты
MonoS.
второго
-
при
55
мМ
NaCI,
третьего
-
при
70
мМ
С помощью набора хромогенных субстратов установлено, что второй
белковый
пик
представляет
субстрат
Z-Glu-pNA.
белка со
степенью
Из
собой
глутамилэндопептидазу,
л культуральной жидкости получено
2
очистки
770
и
выходом
12%
(табл.2) .
расщепляющую
5
мг гомогенного
Все
дал ьнейшие
исследования были проведены с этой протеиназой .
А280
NaCl, M
+
г
1,2
1 -
0,8
0,6
0,4
0,2
0,4
t
t 0,3
t
0,2
l
о
.10,1
--
о
"
з
6
9
12
Рис.4. Хроматография глутамилэндопептидазы
15
о
мл
Bacillus intermedius
на колонке
MonoS
1-
А 280 ; П
-
градиент
NaCI
(О-О , 5М) в
15
мМ Nа-ацетатном буфере, рН
6,3 , содержащем 0,5 мМ CaCI 2•
1-
протеиназа, активная на субстрате
Glp-Ala-A\a-Leu-pNA,
2 - протеиназа,
активная на субстрате
Z-Glu-pNA,
3 - протеиназа,
активная на субстрате
Z-Ala-Ala-Leu-pNA
3.
Чистоту
Характеристика глутамилэидооептидазы
полученного
препарата
B.intermedius
глутамилэндопептидазы
определяли
с
помощью электрофореза в ПААГ, который показал наличие одного пол ипептида с
молекулярной массой
29
кДа . Гомогенность препарата глутамилэндопептидазы
подтверждается также обнаружением единственной N-концевой ам и нокислотной
последовател ьности
при
с еквенировании
по
Эдману.
Изоэлектричес кая
точка
14
равна
(рис . 5) . Константа Михаэлиса глутамилэндопептидазы В. intermedius на
8,4
субстрате
В
Z-Glu-pNA Km=6
таблице
мМ.
представлены
3
некоторые
энзиматические
свойства
глутамилэндопептидазы В. intermedius в сравнении с другими протеиназами того
же семейства, выделенных из разных источников.
Таблица
2.
Выделение глутамилэндопептидазы из культуральной жидкости
Bacil/us intermedius
Объем,
Общий
Общая
Уд . акт.,
Выход,
мл
белок,
активность,
ед/мг
%
сп.ед.
мкМ
Стадии очистки
1.
Культуралъная
2000
32000
50
0.0016
100
71
71
17
0.24
34
9.5
32.3
8.5
0.26
17
7.6
4.8
5.92
1.23
11.8
жидкость
2.
Хроматография на
на КМ-целлюлозе
3.
Рехроматография
на КМ-целлюлозе
4. Хроматография
колонке
на
MonoS
Протеиназа В. intermedius имеет один рН-оптимум на субстрате
(рН
8,0)
и два рН-оптимума на белковом субстрате (рН
Actinomyces sp. , Str.thermovulgaris
Факт
наличия
двух
7,5
и
9,0),
Z-Glu-pNA
как и протеиназы
и стафилококковые глутамилэндопептидазы.
рН-оптимумов
пока
не
получил
в
литературе
удовлетворительного объяснения. Протеиназа относительно стабильна в широких
пределах рН от 6,5 до 10,0 в течение 3 час при 22
смеси 5 мМ Са
2
+
° (рис.6). Наличие в реакционной
повышает стабильность фермента, несколько увеличивая его
активность. Такую же рН-стабилъность показывают почти все известные на
настоящий момент глутамилэндопептидазы.
Температурный
оптимум,
2
определенный
отсутствие ионов Са +, равен 55
оптимум смещается к
65
°
°.
в
трис-НСI
буфере,
подтверждает стабилизирующую роль ионов Са + (рис. 7). При 70
50%
активности.
8,0,
в
В присутствии ионов Са + температурный
с возрастанием активности почти в
2
около
рН
2
2 раза, что
° фермент теряет
15
Таблица
3
Сравнительная характеристика глутамилэндопептидаз
микроорганизмов
рН-оптимум
Мол.
Протеиназа
масса,
акrивности
Пептид-
pl
кDа
ный
казеин
Интервал
Темпера-
стабиль-
'I)'рНЬIЙ
ностирН
оптимум,
0
к.,,',
мМ
субсч>ат
В. intermedius
7.5;
29
8.4
8.0
26
6.7
6.5
25
5.7
8.5
25
4.5
8.2
26.5
4.5
-
4.0;
B.licheniformis
23 .567
4.8
8.0
Str.griseus
18.336
8.4
8.8
-
Str.fradiae
18.702
8.2
8.2
-
4.5-9.0
B.subtilis
17-18
7.7
8.0
23
-
8.5
Str.thermovulgaris
Actinomyces
sp.
S. aureus 92
гн
S.aureus VB
Thermoactinomycessp.
* Для реакции гидролиза
6.5-10
9.0
6.5;
6.0
55
1.25
6.0-10
55
1.1
5.0-10
40-45
10.0
3.5-.9.5
45
28.4
4.0-10
51 (Са2)
1.8
5.0-8.0
-
-
55
-
55
-
6.0;
9.0
4.6;
8.0
8.5
(Са2)
6.0-10
8.0
7.8
55; 65
5.0-11.0
Z-Glu-pNA
Термостабильностъ фермента при рН 8,0 в
увеличивается только в диапазоне температур от
присутствии
5 мМ Са2+
37 до 50 °, а затем происходит
резкая потеря активности (рис.8). Похожие свойства отмечены для некоторых
дРуrих rлутамилэндопептидаз (Мосолова О.В. и дР"
1989).
1987,
Хайдарова Н . В. и дР.,
16
А
о
рН
·- 9
о
0 .25
в.о
7 .0
0 .15
6.0
5. 0
0 .05
10
5
Рис.5 .
Определение
15
20
25
30
изоэлектрической
40
35
точки
В.
методом
intermedius
хроматофокусирования на колонке РВЕ-94 в градиенте рН
1 - A2so, 2 -
А,
%
1
о о
<Э
9,4-7,7
градиент рН
о
о
о
о
о
Е3
Е3
Е1
о
-<":)
90
8
о
7
о
6
о
5
о
сэ-
з
2
40
3
о
2
о
1
о
рН
6
1
Рис. 6 . рН-стабильность глутамидэндопептидазы В.
о
intermedius при 22
°
1 - 3 часа инкубации, 2 - 24 часа инкубации в отсутствии ионов Са2 •
3 - 24
часа инкубации в присутствии ионов Са~+
17
А,
1.8
мкМ /мл
1.8
1.4
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
Рис.7. Зависимость активности протеиназы
B.intermedius
от температуры
2
1 - активность в отсутствии ионов Са +,
2 - активность в присутствии ионов Са2+
2
100
А,%
90
7
50
4
10
20
зо
40
50
60
Рис.8. Термостабильность rлутамилзндопептидазы
1 - активность в отсутствии ионов Сан
2 -'- активность· в присутствии ионов Са2+
о
т.
B.intermedius
18
Активность фермента полностью подавляется специфическим ингибитором
сериновых
протеиназ
сериновых протеиназ
диизопропилфторфосфатом .
химической и белковой природы
-
Другие
-
ингибиторы
не оказывают влияния
на активность фермента.
При
изучении
субстратной
специфичности
глутамилзндопептидазы
В. intermedius было показано, что фермент практически полностью расщепляет
синтетический субстрат
H-Arg-Lys-Glu-Val-Tyr-OH
В таких же условиях фермент гидролизует только
Val-Tyr-OH
по связи
предпочтение
к
Asp-Val .
связям,
по связи
5,6%
Таким образом,
образованным
Glu-Val
субстрата
за
30
минут.
H-Arg-Lys-Asp-
фермент проявляет большее
глутаминовой
кислотой ,
чем
аспарагиновой кислотой, что характерно для ферментов этой гру ппы .
Специфичность
фермента
на
природных
олигопептидных
субстратах
определяли по расщеплению А и В цепей окисленного инсулина, содержащих
по
два остатка глутаминовой кислоты, и глюкагона, имеющего в составе молекулы
три остатка аспарагиновой кислоты (рис.9) . За
полностью
гидролизовал
образованные
в
А
глутаминовой
и
В
цепи
кислотой
и
4
часа фермент практически
окисленного
некоторые
инсулина
связи
все
связи ,
образованные
цистеиновой кислотой, полученной в результате окисления цистеина. В молекуле
rлюкагона фермент расщеплял все
связи по остаткам
аспарагиновой кислоты.
Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными
(Svendsen
I. et al., 1992, Niidome Т. et al ., 1990, Yoshida N. et а! . , 1988).
А-цепь инсулина
sо,н
G1
sо,н
У Е ~ JС А S У J~ L У Q L Е ~У С N
В-цепь инсулин а
S0 3H
S03H
1
1
!
i !
FVNQHL~GSHLVEALYLVtGERGFFYTPKA
i
Глюкагон
Н S G G Т F Т S D!Y S К У L D!S R А Q D t У Q \V L М N Т
Ри с.9.
Гидролиз
природных
глутамил эндо n е птидазой
Bacillus
олигопептидных
субстратов
intermedius
Стрелками показаны rидролизуемые протеиназой пептидные связ и
19
Определены
аминокислотный
состав
и
N-концевая
глуrамилэндопептидазы В. intermedius. Сравнительный
последовательность
анализ аминокислотного
состава глуrамилэндопептидазы В. intermedius и других протеиназ этого семейства
ферментов
показывает,
протеиназы,
по
4
что
цистеин
отсутствует
только
у
стафилококковой
у остальных протеиназ независимо от источника выделения имеется
остатка полуцистина, и
содержит в своем составе до
2
20%
остатка
-
у протеиназы В. intermedius. Фермент
(от всего количества аминокислотных остатков)
дикарбоновых кислот, что значительно меньше, чем в молекуле протеиназы
St.aureus
V8
(33%).
Эта
разница
изоэлектрических точек ферментов:
находит
pl 8,4
и
4,5
свое
отражение
на
B.intermedius
45%
идентичных остатков при сравнении с
глуrамилэндопептидазой, выделенной из
B.licheniformis (Svendsen 1. et al., 1992,
30
аминокислот имеет
величине
соответственно .
N-концевая последовательность глуrамилэндопептидазы
протяжении
в
Kakudo S. et al., 1992).
Столь значительный процент совпадений позволяет
предположить, что глуrамилэндопептидазы этих двух видов бацилл гомологичны
и имеют однотипную укладку полипептидной цепи в пространстве.
уровень
наблюдается
совпадений
последовательностью на протяжении
B.subtilis (40%).
20
при
сравнении
с
Высокий
N-концевой
аминокислот для глутамилэндопептидазы
Гораздо меньше совпадений при сравнении с N-концевыми
последовательностями
ферментов
из
стрептомицетов,
остатков при сравнении с протеиназой
St.aureus V8
а
число
совпадающих
слишком мало для суждения
об их ГОМОЛОl'ИИ (рис.1 О).
Таким образом, по физико-химическим и энзиматическим свойствам, по
субстратной специфичности, по влиянию ингибиторов на активность протеиназа
В. intermedius относится к группе глуrамилэндопептидаз, специфичность действия
которых
целиком
заряженных
определяется
боковых
цепей
присутствием
глутаминовой
или
в
субстрате
аспарагиновой
отрицательно
кислот
(КФ
3.4.21 .19).
4. Выращивание
и предварительный анализ кристаллов
глутамилэндопептидазы
B.intermedius
В настоящее время неизвестен молекулярный механизм, обеспечивающий
высокую
специфичность
а.\Шнокислотным
остаткам
действия
с
глуrамилэндопептидаз
отрицательно
заряженными
по
отношению
боковыми
к
цепями,
20
поскольку
неизвестен
компенсатор
отрицательного
выяснения
заряда
субстрата.
Для
таких ферментов необходимы
20
15
10
A
IR
Bacillus intermedius
~';·
...
. т ~ ·," т
s s .т
Baci/lus licheniformis
Baci/lus subtilis
Staphylococcus aureus VB
Actinomyces species
1 TDT
т
NGHY
к
YGF
у
р
у
ADT
Streptorrryces thermovulgaris
Streptomyces griseus
Streptomyces fradiae
YG
G
G S RC
G
G
G S R
у
25
Bacillus inlermedius
х
Bacillus licheniformis
А
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus VB
А
х
Р
х
х
v
н
V
30
.T
I
С
F
G
s s s
YI
Т
QVEAP
А
Actinomyces species
Streptomyces thermovulgaris
G
Streptomyces griseus
VTKNGVRYFLT
Streptorrryces fradiae
V
D
Т
К
G
G
А
R
У
F
VT
Рис.1 О. N-концевые последовательности глутамилэндопептидаз
знания
пространственной
структуры
белка.
Одним
из
основных
способов
определения структуры
белка в настоящее время является кристаллография .
Получение
глутамилэндопептидаз
кристаллов
представляет
трудную
задачу.
Например, до сих пор не удалось получить подходящие для рентгеноструктурного
исследования кристаллы для давно
известной протеШ1азы
Был
St.aureus VB.
разработан метод получения кристаллов глутамилэндопептидазы
B.intermedius,
размеры и форма которых оказались пригодными для проведения рентгеновского
исследования, а также проведен рентгеновский анализ этих кристаллов, который
показал, что кристаллы принадлежат к пространственной группе С2 и имеют
следующие
о
13= 117,6 .
параметры
элементарной
ячейки:
о
а=61,62 А,
о
о
в=60,4 А ,с=60,40 А,
о
Набор дифракционных данных был собран до разрешения
настоящее
время
Кристаллографии
благодаря
РАН
глутамилэндопептидазы
полученным
проведен
B.intermedius
нами
полный
кристаллам
в
1,68 А .
рентгеноструктурный
(результаты обрабатываются).
В
институте
анализ
Можно с
21
большой
вероятностью
предположить,
пространственной структуры
что
с
помощью
установленной
фермента будет раскрыт уникальный механизм
действия глутамилэндопептидаз , позволяющий в значительной степени сдвигать
рКа имидазольного кольца гистидина. Реализация этого механизма, вероятно ,
осуществляется различными способами в ферментах различного происхождения ,
что может служить отражением степени филогенетического родства этих белков и
их продуцентов.
выводы
1. Подобран
уровень
состав
активности
питательной
среды,
обеспечивающий
глутамилэндопептидазы
в
максимальный
культуральной
жидкости
При этом установлено, что синтез глутамилэндопептидазы
B.intermedius 3-19.
ингибируется глюкозой и смесью аминокислот, активируется ионам и кальция ,
магния и аммония .
2. Разработан
метод
выделения
и
очистки
глутамилэндопептидазы
из
культуральной жидкости В. intermedius с помощью ионообменной хроматографии
на колонках КМЦ и
фермента с ВЫХОДОМ
3. Впервые
MonoS
в режиме ВЭЖХ и получен гомогенный препарат
12%.
охарактеризована глутамилэндопептидаза В. intermedius, которая
имеет молекулярную массу
29 kDa и
изоэлектрическую точку
8,4. Обнаружены два
рН-оптимума на природном субстрате
субстрате
: при рН 7,5 и рН 9,0, на синтетическом
- при рН 8,0. Температурный оптимум действия фермента 55 °С .
4. Установлено,
остатка
что макромолекула глутамилэндопептидазы содержит два
полуцистина;
показана
45%-ная
гомология
N-концевой
последовательности протеиназы с известными глутамилэндопептидазами бацилл .
5. Анализ
действия ингибиторов и субстратной специфичности показал, что
фермент атакует только связи, образованные дикарбоновыми кислотами, что
позволило отнести его к глутамилэндопептидазам семейства химотрипсина с
кардинальным изменением специфичности действия (КФ
6. Впервые
получены
3.4.21 .19).
в отечественной науке разработаны услоьия кристаллизации и
кристаллы
глутамилэндопептидазы
Предварительный рентгеновский анализ с разрешением
В. intermedius
о
1,68
А
3-19.
показал , что
кристаллы принадлежат к пространственной группе С2 и имеют следующие
о
о
о
параметры элементарной ячейки : а=61 ,62 А, в=55,84 А , с=60,4 А , Р
о
=117,6 .
22
Публикации по теме диссертации
1.Нехотяева И.В., Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Ицкович Е.Л., Шакиров Е.В.
Внеклеточные
ВИНИТИ,
гидролазы
Bacil/us intermedius.
N2642-B92, 26.09.95. -
Выделение и
свойства./Деп .
в
18с.
2.Шарипова М.Р., Балабан Н.П. , Нехотяева И.В., Ицкович Е.Л . , Ша1СИров Е.В.,
Лещинская
И.Б . ,
Руденская
стрептомицинустойчивых бактерий
Г.Н.
Секретируемые
гидролазы
//Биохимия.
Baci/lus intermedius
- 1996. -
T.61,Nl. - С.110-118.
3.Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanova
А.М.,
Sharipova M.R., Viryasov
М.В.,
Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. Glutamyl
endopeptidase of Baci/lus intermedius, strain 3-19 //FEBS Letters. - 1997. - V.404. Р.241-244.
4.Лещинская И.Б., ШаЮ1ров Е.В., Ицкович Е.Л., Балабан Н.П., Марданова
А.М., Шарипова М.Р., Благова Е.В., Левдиков В.М., Куранова И.П., Руденская
Г.Н. , Степанов В.М. Глутамилэндопептидаза
свойства, кристаллизация //Биохимия.
5.Shakirov E.V.,
Mardanova
Bacillus intermedius 3-19.
Выделение,
- 1997. -T.62,N8. - С.1052-1059.
А.М .
Glutamylendopeptidase
Baci//us
from
intermedius 18 th European Congress ofBiotechnology, 1997, Budapest, 17-21
augusф­
P.144.
6 . Лещинская И.В., Ша1СИров Е.В., Балабан Н.П. , ВирясовМ.Б . , Руденская Г.Н. ,
Степанов
В.М .
Глутамилэндопептидаза
<<Химия протеолитических фермекгов»,
Bacil/us intermedius /IV
1997, Москва, 21-23
апреля.
Симпозиум
- С.42.
7.Благова Е.В., Левдиков В.М. , Куранова И.П., Балабан Н.П., Шакиров Е.В .
Руденская Г.Н. Получение кристаллов глутамилэндопептидазы
Bacil/us intermedius
и их предварительное рентгеноструктурное исследование /IVСимпозиум «Химия
протеолитических ферментов»,
8.Shakirov E.V.,
1997, Москва, 21-23
Balaban N.P.,
апреля,
Sharipova M.R.,
- С.47 .
Gabdrakhmanova L.A.,
Leshchinskaya I.B., Rudenskaya G.N., Stepenov V.M. Characterization of glutamyl
endopeptidaze from Bacillus internedius /VII Meeting of industrial applications of
enzymes, 1997, Barce\ona, 25-26 november, - Р .170.
9.Sbakirov E.V., Leshchinskaya I.B., Balaban N.P., Rudenskaya G.N., Stepanov
V.M., Blagova Е.В., Levdikov V.M., Kuranova I.P. Glutamyl endopeptidase of Bacil/us
intermedius, straim 3-19. Purification, properties, cristallization /17 th International
Congress ofBiochemistry and Molecular Biology, 1997, San Francisco, California, 2429 august. - 3135 .
23
10.Руденская Г .Н., Шакиров Е.В . , Балабан Н.П., Лещинская И.Б., Благова Е.В . ,
Левдиков В.М., Куранова ИЛ., Степанов В.М. Глутамилэндопептидаза
Intermedius.
Bacillus
Выделение, свойства, кристаллизация /Второй съезд Биохимического
общества Российской Академии Наук,
1997, Москва, 19-23
мая.
- С.62.
11 .Kuranova l.P., Blagova E.V" Levdikov V.M., Rudenskaya G.N., Balaban N.P.,
Shakirov E.V. Crystal growth and preliminary X-ray study of glutamic acid specific
proteinase from Bacillus intermedius 17 th International Conference on the
Crystallization ofBiological Macromoleculs, 1998, Granada, SPAIN, 3-8 may.-P.37.
12.Шакиров
Хуззятова
Е.В .,
Р.К . ,
Габдрахманова
Гарусов
Глутамилэндопептидаза
А.В. ,
Bacillus
Л . А.,
Балабан
Лещинская
Н.П .,
И.Б. ,
Биосинтез
intermedius.
Всероссийская конференция «Ферменты микроорганизмов» ,
февраля.
Шарипова
М . Р.,
Руденская
и
Г.Н.
выделение/ХI
1998,
Казань,
2-4
- С . 70 - 79.
13.Gabdrakhn1anova L.A., Shakirov E.V" Balaban N.P., Sharipova M.R.,
Rudenskaya
G.N.,
Leshchinskaya
l.B.
Biosynthesis
glutamylendopeptidase from Bacillus intermedius strain 3-19
and
localization
//МicroЬios .
- 1999. -
V.100 . -Р . 97-108.
14.Kuranova l.P., Dlagova E.V., Levdikov V.M., Rudenskaya G.N" Balaban N.P.,
Shakirov E.V. Crystal growth and preliminary X-ray study of glutamic acid specific
serine protease grom Bacillus intermedius //J.Crystal Growth. - 1999. - V.196 .-
Р.313-
318.
15.Shakirov E.V., Gabdrakhmanova L.A., Balaban N.P. , Sharipova M.R.,
Leshchinskaya
1.В . ,
Rudenskaya G.N. Effects of culture components on the
of glutamylendopeptidase Bacillus intermedius
!Гhе
Ьiosynthesis
Protein Society Thirteenth
Symposium, 1999, Boston, Massachusetts, 24-28 july.
16.Sharipova M.R., Shakirov E.V., Balaban N.P., Gabdrakhmanova L.A.,
Rudenskaya G.N., Leshchinskaya I.B. Localization of glutamylendopeptidaze and thioldependent serine proteinases in Bacillus intermedius cells /The Protein Society
Thirteenth Symposium, 1999, Boston, Massachusetts, 24-28 july.
17 . Шакиров
Руденская
Г.Н. ,
Е.В . ,
Габдрахманова
Лещинская
И . Б.
Л.А.,
Биосинтез
Балабан
Н.П.,
Шарипова
глутамилэндопептидазы
intermedius //Микробиология. - 2000. -T.69,Nl . - С.29-33 .
М.Р. ,
Bacillus
Подписано в печать
Усл . печ. л .
28 .04.2000 г.
1,5. Тираж 80 экз .
Огпечатано в издательском комплексе
Управления международных св.язей КГУ