Идентификация белка в геле

Приложение 4.1 3
Хряпова Е.В.
Лабораторная работа для студентов РГМУ, специальность Биохимия
“Идентификация белка в геле методом масс-спектрометрических
пептидных карт”
Гидролиз проб
Необходимые материалы и оборудование:
Оборудование
Пробирка типа Эппендорф на 1.5 ml, 0.2 ml.
Автоматические пипетки на 20 mkl, 200 mkl, 1000 mkl.
Термостат-шейкер Eppendorf 37 0С и термостат на 60 0 С
Ламинарный шкаф
Масс-спектрометр Ultraflex c MALDI мишенью
Реактивы:
Буфер для отмывки:
50 мМ NH4 HCO3 в 50 % ацетонитриле
Буфер для гидролиза:
50 мМ бикарбонат аммония
Дегидратирующий буфер:
ацетонитрил
Трипсин:
свиной модифицированный трипсин 200 mkg/ml, 5 мкл
Трифторуксусная кислота (ТФУ)
2,5 - Дигидроксибензойной кислоты (DHB)
Триптический гидролиз белка в полиакриламидном геле
(рис 1)
Отрежьте носик наконечника автоматической пипетки так, чтобы внутренний диаметр
был приблизительно 2 мм (рис. 1). Вырежьте часть пятна-белка в геле с помощью
пипетки с укороченным наконечником (рис. 2). Вырезанный кусок геля помещается в
пробирку объемом 200 мкл. (рис. 3).
1
Приложение 4.1 3
(рис 2)
(рис 3)
Проведение специфического триптического гидролиза белка в геле
Отмывка:
Проведите отмывку используя отмывочный буфер: 2 раза по 15 мин в 150 mkl а
термостате-шейкере при t=370 C.
Дегидратация:
После отмывки удалите остатки отмывочного буфера. Проведите дегидратацию
добавляя в пробирку 150 mkl ацетонитрила. Удалите ацетонитрил через 15 мин. и
подсушите на воздухе.
Проведите гидролиз: добавьте в пробу с высушенным куском геля 5 mkl трипсина, так
чтобы раствор трипсина впитался в гель. Рабочий раствор трипсина: 30 mkg/ml в
50 мМ NH4 HCO3.
Оставьте на ночь в термостате при t=370 C. Приблизительно через 18 часов
остановите реакцию добавив в пробирку 7 mkl 0.7% раствора ТФУ. Проинкубируйте
2
Приложение 4.1 3
пробирку при комнатной температуре 2 часа. Надгелевый раствор используйте для
получения MALDI-масс-спектров.
Подготовка образцов для масс-спектрометрического исследования
Приготовьте раствор матрицы 10 mkg/ml 2,5 - дигидроксибензойной кислоты в 50%
ацетонитриле в 3% трифторуксусной кислотой. Нанесите на мишень 1 mkl раствора
DHB с помощью пипетки. Тщательно перемешайте раствор в пробирке с гелем и
добавьте 1 mkl надгелевого раствора к еще не высохшей капле DHB на мишени.
Дождитесь пока высохнет смесь матрицы (DHB) и образца, нанесенных на мишень.
Вставьте масс-спектрометрическую мишень в масс-спектрометр Ultraflex для этого:
Нажмите кнопку Load/Enject на корпусе масс-спектрометра (рис.4).
(рис 4)
Дождитесь пока лоток манипулятора шлюза выйдет наружу и займет горизонтальное
положение (рис.5).
(рис 5)
3
Приложение 4.1 3
Положите мишень на лоток и нажмите кнопку Load/Enject еще раз. Подождите пока
завершиться процесс перемещения мишени в ионный источник.
Запустите программу Flex Control управления масс-спектрометром на управляющем
компьютере (контролере) масс-спектрометра.
О готовности прибора к работе будут свидетельствовать зеленые прямоугольные
флажки Sample IN и Systm Ready в верхнем левом углу окна программы Bruker Flex
Control.
Внимание! Если в течение продолжительного времени прямоугольные флажки
остаются окрашенными в желтый или красный цвет обратитесь к руководителю
практической работы.
На закладке Sample Selection выберите ту позицию на мишени, на которой нанесен
образец (рис.6).
(рис 6)
Нажав кнопку Select Metod вызовите меню выбора метода (режима) работы прибора и
выберите метод Student PMF 2006.par (рис.7).
4
Приложение 4.1 3
(рис 7)
Выберите с помощью мышки конкретный участок образца, для регистрации спектра в
окне видеомонитора. Нажмите кнопку Start в главном окне Bruker_FlexControl.
Вы увидите накапливающий спектр (рис.8).
5
Приложение 4.1 3
Наилучшего результата соотношения интенсивности сигналов и разрешения можно
добиться, регулируя мышкой мощность лазера. Увеличить выбранный вами
пептидный пик можно с помощью инструмента Zoom на мышке компьютера (рис 9).
(рис 9)
Обработка спектров
Сохраните те спектры, которые считаете достаточно хороши в директории /Student/_
ваша фамилия. Воспользуйтесь кнопкой Save As.
Выберите инструмент разметки спектров. Произведите разметку основных сигналов в
спектре.
Осуществите калибровку спектра по сигналам пептидов автолиза трипсина
Воспользуйтесь для этого инстремантом “внутренняя калибровка” (Calibrate – Internal)
(рис 10).
6
Приложение 4.1 3
(рис 10)
Для обработки зарегистрированного спектра запустите программу Bruker FlexAnalysis.
Откройте в этой программе снятые вами спектры.
Сохраните те спектры, которые считаете достаточно хороши в директории Student_
ваша фамилия. Воспользуйтесь кнопкой Save As.
Сделайте разметку остальных пиков вручную. Внизу (рис.11) вы сможете увидеть
помеченные вами пептидных пиков.
7
Приложение 4.1 3
(рис 11)
Идентификация белка с использованием программы Mascot
Откройте окно запроса Mascot Peptide Mass Fingerprint на локальном или удаленном
сервере Mascot.
Скопируйте в программе Bruker Flex Analisis список пептидных масс и поместите его в
графу Query окна запроса Mascot (рис.12). Выберите необходимую базу данных,
укажите вид организма (или поиск во всех известных геномах). Используемый
фермент (трипсин) и точность, с которой было осуществлено измерение
молекулярных масс
Удалите из списка массы известные вам как контаминантные массы (трипсин и
кератин).
8
Приложение 4.1 3
(рис 12)
Нажмите кнопку “Start Search”. Через 1-2 мин. Вы увидите результаты поиска в базе
данных выполненные системой Mascot (рис 13).
9
Приложение 4.1 3
(рис 13)
Щелкнув на ссылку “Protein Summary Repot” вы сможете увидеть более подробные
результаты поиска
10
Приложение 4.1 3
(рис 14)
Через 1-2 мин. вы увидите результаты поиска в базах данных выполненные системой
Mascot.
Подготовлено в соответствии п. 4.7.
Государственного контракта от «10» февраля 2006 г. № 02.451.11.7058
в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям
развития науки и техники» на 2002-2006 годы»
11