Автореферат Хайруллина Р.Ф. - Институт биоорганической химии

Учреждение Российской академии наук
Институт биоорганической химии
им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
___________________________________________________________
На правах рукописи
ХАЙРУЛЛИН РАФИЛЬ ФИДАИЛЕВИЧ
НОВАЯ ПСИХРОФИЛЬНАЯ ПРОТЕИНАЗА
ИЗ SERRATIA PROTEAMACULANS
03.00.04 — Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва 2009
Работа выполнена в лаборатории химии протеолитических ферментов
Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии
им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
Научный руководитель:
кандидат химических наук
Михайлова Анна Григорьевна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук
Еремеев Николай Леонидович
кандидат химических наук
Зинченко Алексей Алексеевич
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН
Защита состоится « 25 » ноября 2009 года в 10-00 часов на заседании
специализированного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской
академии наук Институт биоорганической химии им. академиков
М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: ГСП-7, Москва В-437,
ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения
Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков
М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
Автореферат разослан «23» октября 2009 г.
Ученый секретарь
специализированного совета
доктор физико-математических наук
Олейников В.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В последнее время психрофилы и их ферменты привлекают к себе все
большее внимание исследователей вследствие своей специфической
способности функционировать в условиях низкой температуры окружающей
среды. Психрофильными называются организмы, способные выживать и
успешно развиваться в условиях пониженной температуры. Психрофилы
широко представлены в живом мире и включают представителей как про-, так
и эукариот. На сегодняшний день в эту группу включены многие бактерии,
грибы, растения и некоторые виды животных (насекомые и позвоночные).
Несмотря на чрезвычайно широкое распространение и разнообразие,
психрофилы сравнительно мало изучены. Благодаря повышенной
каталитической эффективности адаптированные к пониженным температурам
ферменты рассматриваются в качестве ценных инструментов для
биотехнологических целей, медицинской и пищевой промышленности.
Помимо практической значимости использования психрофильных
ферментов в практических целях следует отметить важность проведения
фундаментальных исследований, связанных с изучением структурных основ
повышенной каталитической эффективности ферментов организмов,
обитающих при пониженных температурах.
Молекулярные основы функционирования психрофильных ферментов к
настоящему моменту неизвестны. Сравнение первичных структур ферментовгомологов показывает, что аминокислотные остатки, формирующие их
активные центры и субстрат-связывающие районы, высоко консервативны.
Этот факт, в совокупности с данными о том, что ферменты психрофилов
характеризуются, как правило, заметно сниженной термостабильностью,
позволил выдвинуть и отчасти подтвердить гипотезу, объясняющую их
высокую удельную активность повышенной гибкостью молекулы. Однако
данная гипотеза является весьма общей, и, по-видимому, неприложима к ряду
конкретных случаев.
В этом смысле чрезвычайно большой интерес для исследователей
представляют адаптированные к пониженным температурам трипсины и
трипсиноподобные ферменты. Трипсины позвоночных – одни из наиболее
изученных представителей сериновых протеиназ, и поэтому сравнительный
анализ аминокислотных последовательностей, третичной структуры,
кинетических параметров, физико-химических свойств мезофильных и
психрофильных ферментов и их мутантных форм может пролить свет на
механизм адаптации к пониженным температурам.
В результате проведенного недавно широкомасштабного скрининга
психрофильных микроорганизмов был обнаружен и идентифицирован штамм
Serrratia proteomaculans, продуцирующий разнообразные протеиназы, в том
числе, активные при пониженной температуре (Костенко Ю.Г. и др. 2001.
Патент РФ № 2175350). Результаты проведенных медико-биологических
1
испытаний показали, что данный штамм не патогенен для теплокровных
животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным
микроорганизмам.
Объектом исследования настоящей работы является обнаруженная и
выделенная нами ранее неизвестная протеиназа из психрофильного
грамотрицательного микроорганизма Serratia proteamaculans.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является выделение, очистка и структурнофункциональная характеристика новой психрофильной протеиназы из
S. proteamaculans (PSP). Для выполнения работы были поставлены
следующие задачи:
1. Разработка методики выделения и очистки PSP.
2. Установление N-концевой последовательности фермента и
определение полной аминокислотной последовательности PSP.
3. Получение рекомбинантного фермента.
4. Исследование физико-химических и энзиматических свойств PSP.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые выделена и очищена до гомогенного состояния ранее не
описанная сериновая протеиназа с трипсиновой специфичностью из
грамотрицательного психротолерантного микроорганизма S. proteamaculans.
Установлена первичная структура фермента, определено, что новая
протеиназа относится к семейству олигопептидаз В (клан SC, семейство S9A
по номенклатуре MEROPS).
Показано, что PSP является первой описанной психрофильной
олигопептидазой В. Получен рекомбинантный фермент, проведен
субстратно-ингибиторный анализ, исследованы физико-химические свойства
PSP. Выявлено, что по своим субстратно-ингибиторным свойствам PSP
заметно отличается от ранее описанных олигопептидаз.
Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности
PSP с последовательностями олигопептидаз B патогенов человека и
животных – Yersinia pestis, Salmonella enterica, Trypanosoma cruzi, Klebsiella
pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных – Aeromonas
hydrophila, растений – Erwinia carotovora. В настоящее время большинство
бактериальных олигопептидаз В известны лишь по нуклеотидным
последовательностям. Высокая гомология PSP с олигопептидазами из других
источников позволяет использовать PSP в качестве модели для поиска
лекарственных препаратов против бактериальных и протозойных патогенов.
Апробация работы и публикации
Основные материалы диссертации были представлены на VIII чтениях,
посвященных памяти академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2006),
XIV, XV, XVI международной конференции и дискуссионном научном клубе
2
«Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и
экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2006, 2007, 2009), Итоговой конференции
по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного
направления «Живые системы», ФЦП «Исследования и разработки по
приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса
России 2007-2012 годы» (Москва, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и
пептиды» (Казань, 2009). Международной научной конференции по
биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной
75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова
(Москва-Пущино, 2009).
По теме диссертации опубликовано 3 работы в журналах,
рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы
Диссертация
состоит
из
введения,
обзора
литературы,
экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка
цитируемой литературы, включающего 172 наименований. Работа изложена
на 109 страницах, содержит 35 рисунков и 17 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Выделение
и
очистка
трипсиноподобной
протеиназы
из
психротолерантного
грамотрицательного
микроорганизма
S. proteamaculans
Культивирование психротолерантного штамма S. proteamaculans 94
(любезно предоставленным С.В. Костровым, ИМГ РАН) производилось при
4 °С при непрерывном перемешивании в течение 5 суток (до достижения А600
= 1,2). После наработки биомассы клетки осаждали центрифугированием и
подвергали обработке лизоцимом и ультразвуковой деградации. Гомогенат
клеток центрифугировали, наносили на колонку с Q-сефарозой в 0,1 М ТрисНСl, 50 мM CaCl2, 1мM MgCl2; pH 8,0. Элюирование проводили в градиенте
NaCl 0-0,2 М в том же буфере (рис. 1).
Рис. 1. Ионообменная хроматография
суммарного белкового препарата из
S. proteamaculans на Q-сефарозе.
Объем фракции 5 мл
1 – активный фермент;
2 – A280;
3 – градиент NaCl;
[S] = 0,2 мМ
3
В процессе очистки активность PSP определяли с помощью
стандартного трипсинового субстрата п-нитроанилида Nα-бензоил-DLаргинина (BAPNА). Так как BAPNA является субстратом не только
сериновых трипсиноподобных, но также метало- и цистеиновых протеиназ,
для определения типовой принадлежности PSP на частично очищенном
препарате фермента был проведен ингибиторный анализ (табл. 1).
Необратимые группоспецифические ингибиторы сериновых протеиназ
ДФФ и TLCK полностью инактивировали фермент. Другой специфический
ингибитор сериновых протеиназ – PMSF также значительно ингибировал
PSP. Как видно из табл. 1, BPTI является эффективным ингибитором
трипсиноподобного фермента из S. рroteamaculans, что позволило проводить
очистку PSP методом аффинной хроматографии на BPTI-сефарозе.
Таблица 1. Изучение влияния ингибиторов и некоторых других реагентов на
активность фермента. [PSP] = 0,3 нМ; [BAPNA] = 0,2 мМ, 0,1 М Трис, рН 8,0;
2% ДМСО, 25 °С
Реагент
Концентрация
реагента, М
Остаточная
активность, %
ДТДП
2,0·10-4
100
Йодацетамид
1,0·10-³
100
Меркаптоэтанол
1,6·10-2
50
ДФФ
1,3·10-4
0
ФМСФ
2,3·10-3
19,4
ТЛХК
3,0·10-3
0
ЭДТA
5,0·10-3
61,5
о-Фенантролин
5,0·10-3
0
Zn(AcO)2
1,0·10-3
0
CdCl2, CuCl2
1,0·10-3
0
MgCl2
1,0·10-3
1,0·10-2
100
87
BPTI
1,8·10-7
50
ДТДП – 4,4'-дитиодипиридин;
BPTI – основной
панкреатический
ингибитор трипсина быка; ТЛХК – хлорметилкетон Nα-п-тозил-L-лизина;
ФМСФ – фенилметилсульфонилфторид; ДФФ – диизопропилфторфосфат,
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
4
Активные фракции после Q-сефарозы обессоливали, переводили в 10 мM
Hepes, 1мM MgCl2, pH 7,5 и наносили на колонку с BPTI-сефарозой. Элюцию
проводили 0,1 М Na-ацетатным буфером pH 5, содержащим 0,1 М NaCl и
1 мМ MgCl2. Так как PSP инактивировался при низких значениях pH, фракции
собирали в пробирки, содержащие 1 М Трис-НСl pH 8,0 (рис. 2).
Рис. 2. Аффинная хроматография PSP на BPTI-сефарозе
Объем фракции 2 мл
1 – активный фермент;
2 – A280
Использование ионообменной и аффинной хроматографии позволили
получить практически гомогенный по данным ПААГ белковый препарат с
молекулярной массой 60 кДа (рис. 3).
Рис. 3. Фракции PSP после аффинной
хроматографии на BPTI-сефарозе
(Ds-Na-электрофорез в 10% ПААГ)
1 – фракция после BPTI-сефарозы;
2 – маркеры молекулярной массы
Однако N-концевая последовательность этого белка оказалась
практически идентичной соответствующей последовательности 60-кДа
субъединицы шаперонина GroEl, состоящего из 14 идентичных субъединиц
(рис. 4).
5
(K)
(E)
AAKDVEFGNDAEVYV- (белковая полоса 60 кДа)
MAAKDVKFGNDARVKM- (GroEl)
Рис. 4. N-концевые последовательности основной белковой полосы после
ионообменной и аффинной хроматографии и шаперонина GroEl
Таким образом, GroEl являлся основным компонентом полученного нами
препарата PSP; в денатурирующем ПААГ-электрофорезе самой протеиназе
соответствует минорная белковая полоса 78 кДа (рис. 3).
Присутствие в препаратах PSP после аффинной хроматографии
шаперонина навело нас на мысль об образовании прочного комплекса
PSP-GroEl, который не разрушается даже при взаимодействии фермента с
аффинным лигандом. При этом комплекс обладает ферментативной
активностью – гидролизует
специфический
субстрат
(BAPNA)
и
взаимодействует с ингибиторами.
По литературным данным, для разрушения комплекса GroEL c белкамилигандами применяется обработка метанолом [Weissman et al., 1995]. Для
разрушения комплекса PSP с шаперонином мы ввели стадию инкубирования
частично очищенного препарата после Q-сефарозы в 20%-ном метаноле. При
этом происходит частичная денатурация GroEL, а также, по-видимому, и
других примесных белков с образованием осадка; активность PSP
практически не изменяется. Осадок отделяли центрифугированием и
супернатант подвергали ультрафильтрации через мембрану с пределом
исключения 100 кДа. При этом в фильтрате оказывается не менее 50-60%
активности PSP, а концентрат содержит высокомолекулярный шаперонин
GroEL, распадающийся при электрофорезе на 60-кДа субъединицы (рис. 5).
Рис. 5. Отделение PSP от комплекса GroEl
ультрафильтрацией после обработки метанолом (Ds-Na-электрофорез в 10% ПААГ)
1 – фильтрат,
2 – концентрат;
3 – маркеры молекулярной массы
6
Активный фильтрат наносили на колонку с BPTI-сефарозой и
проводили аффинную хроматографию по методике, описанной выше. Таким
образом, применение метанола для разрушения комплекса с шаперонином в
сочетании с аффинной хроматографией на BPTI-сефарозе позволило нам
разработать методику получения PSP в гомогенном состоянии. Профиль
белков на различных стадиях очистки представлен на рис. 6.
Рис. 6. Препараты PSP на разных стадиях очистки из S. proteamaculans (Ds-Naэлектрофорез в 10% ПААГ). 1 – Суммарный белковый препарат после разрушения клеток;
2 – ионообменная хроматография на Q-сефарозе; 3 – инкубация с 20%-ным МеОН и
ультрафильтрация (Ultracel 100k), концентрат; 4 – инкубация с 20%-ным МеОН и
ультрафильтрация, фильтрат; 5 – аффинная хроматография на BPTI-сефарозе фильтрата
после Ultracel 100k; 6 – маркеры молекулярной массы
Как видно из таблицы 2, в результате очистки удельная активность
возросла в 3300 раз, выход составил 25%. Из 100 г исходной биомассы
S. proteamaculans 94 получают 0,26 мг PSP.
После получения гомогенного по данным Ds-Na-электрофореза
препарата
PSP
была
определена
N-концевая
аминокислотная
последовательность 1-10 этого фермента: MMTPPKAEKR-. Проведен массспектральный анализ (MALDI-TOF, Ultraflex-TOF/TOF, «Bruker», Германия)
пептидов трипсинолиза препарата PSP с использованием белковой базы
данных NCBInr и поисковой программы MASCOT (www.matrixscience.com).
Эти данные позволили идентифицировать PSP как ранее неизвестную
олигопептидазу В.
Для определения первичной структуры PSP соответствующий ген
олигопептидазы В (OpdB) S. proteamaculans 94 был секвенирован с
использованием праймеров на основании последовательности гена OpdB из
геномной библиотеки S. рroteаmaculans 568 в Институте молекулярной
генетике РАН (С.В.Костров, И.В.Демидюк).
7
Таблица 2. Очистка PSP из S. рroteamaculans 94
Стадия очистки
Активный
фермент,
нмоль PSP
Белок, Содержание Степень
мг
PSP,
очистки
нмоль/мг
белка
Выход,
%
Бесклеточный
экстракт
3,46
920,3
0,0038
1
100
Ионообменная
хроматография на
Q-сефарозе
1,93
5,25
0,37
97,4
55,8
Ультрафильтрация
в 20%-ном МеОН;
фильтрат
1,21
1,48
0,82
215,8
35,0
Аффинная
хроматография на
BPTI-сефарозе
0,88
0,07
12,57
3307,9
25,4
Первичная
структура
PSP.
Сравнение
аминокислотных
последовательностей OpdB из различных источников
Аминокислотная последовательность PSP (рис. 7) имеет одиннадцать
замен (Thr34, Ala52, Thr113, Gln220, Thr260, Glu299, Asp396, Ser439, Ala441,
Glu547, Gln585) по сравнению с OpdB из S. рroteаmaculans 568 (Ala34, Val52,
Ile113, Lys220, Lys260, Asp299, Gly396, Lys439, Thr441, Arg547, Glu585).
Аминокислотная последовательность OpdB из S. proteamaculans (PSP)
имеет высокую степень гомологии с последовательностями OpdB из E. coli и
S. enterica (68%; для C-концевого каталитического домена – 85%). PSP имеет
характерную для OpdB из других источников каталитическую триаду (Ser532,
His652 и Asp617) и первичный субстрат-связывающий центр (Glu576 и
Asp578). В числе интересных особенностей первичной структуры OpdB из
S. proteamaculans является отсутствие одного из пары остатков Asp/Glu,
контролирующих Р2-специфичность фермента – остаток Asp462 заменен на
Ala. В случае трипаносомных и некоторых бактериальных олигопептидаз В
пара Asp/Glu в положениях 460 и 462 является обязательной. Однако в
соответствующих ферментах из L. major и L. amazonensis второй из этих
остатков также заменен на незаряженный [Guedes et. al., 2007]; данные о
специфичности ферментов из лейшманий отсутствуют. Наиболее близки
аминокислотные последовательности PSP и (определенной по гену) OpdB
Y. pestis (возбудителя чумы), где также отсутствует отрицательно заряженный
остаток в положении 462. В этом случае степень идентичности достигает
87%; для более консервативного C-концевого каталитического домена – 90%.
8
Одна из трипаносомных OpdВ, а именно из T. brucei, является
одновременно сериновой и SH-зависимой: ее активность контролируется
остатком Cys256 N-концевого домена, а также остаками Cys559 и Cys597,
близких к Ser активного центра [Morty et. al., 2005]. В случае PSP
ингибиторный анализ показал, что фермент не является SH-зависимым;
определенная по гену аминокислотная последовательность OpdВ из S.
рroteamaculans (рис. 7) продемонстрировала, что, в отличие от
соответствующих ферментов других грамотрицательных бактерий, остатки
цистеина в этом белке вообще отсутствуют. Отсутствие дисульфидных связей
является характерным признаком психрофильных ферментов и может быть
ответственным за их низкий температурный оптимум.
1
MMTPPKAEKR
--MLPKAARI
--MLPKANRI
MMTPPKADKR
PYPITTHGDT
PHAMTLHGDT
PYAMTVHGDT
PYPMTRHGDT
RVDDYYWLRD
RIDNYYWLRD
RIDNYYWLRD
RVDDYYWLRD
DERTDPQVLD
DTRSQPEVLD
DTRSQPEVLD
DERTDADVLN
YLQAENAFTD
YLQQENSYGH
YLHQENEYGR
YLQAENAFTA
AALKPQQALR
RVMASQQALQ
KVMSSQQALQ
AVLKPQQQLR
SP94
EC
SE
YP
61
ETLYEEMVAR
DRILKEIIDR
DRILKEIIDR
ETLYQEMVGR
IPQQEHSVPY
IPQREVSAPY
IPPREVSAPY
IPPQEESVPY
VRHGYRYQTR
IKNGYRYRHI
VKNGYRYRYI
VRNGYRYQTR
FEPGNEYAIY
YEPGCEYAIY
YEPGCEYAIY
FEPGNEYAIY
VRQPQAESEH
QRQSAFSEEW
QRQSALSEEW
VRQPVSTDSD
--WDTLIDGN
DEWEILLDAN
NVWETLLDAN
--WETLLDGN
SP94
EC
SE
YP
119 QRAEQREFYT
KRAAHSEFYS
QRAAHSEFYT
QRAEGHEFYT
LGGLEVSPDN
MGGMAITPDN
LGGLAITPDN
LGGLDVSPDN
QKLAVAEDFL
TIMALAEDFL
TIMALAEDYL
QLLAVAEDYL
SRRQYDIRFK
SRRQYGIRFR
SRRQYGLRFR
SRRQYDIRIK
NLSDDSWTDE
NLETGNWYPE
NLESGNWYPE
NLSSGGWHDE
VLENTSGSFE
LLDNVEPSFV
LLDNVAPEFV
VISNTSGGFE
SP94
EC
SE
YP
179 WANDSATVYY
WANDSWTFYY
WANDSLTLYY
WANDSKTLYY
VRKHAKTLLP
VRKHPVTLLP
VRKHKKTLLP
VRKHEKTLLP
YQVYRHVVGT
YQVWRHAIGT
YQVWRHTIGT
YQVYRHVVGT
DPQLDELIYE
PASQDKLIYE
PSSQDELVYE
DPEQDKLIYQ
EQDDTFYVGL
EKDDTYYVSL
EKDDTFYVSL
ESDDTFYVSL
EKTTSDRFIL
HKTTSKHYVV
HKTTSQHYVV
EKTTSERFIL
SP94
EC
SE
YP
239 IHLSSTTTSE
IHLASATTSE
IHLASATTSE
IHLSSTTTSE
ILLLDADRAD
VRLLDAEMAD
VLLLDAELAD
ILLLDADLPE
STPQMFVPRR
AEPFVFLPRR
AEPFSFLPRR
PVPQVFAPRR
KDHEYGIDHY
KDHEYSLDHY
KDHEYSLDHY
KDHEYGVDHY
HQHFYIRSNK
QHRFYLRSNR
QHKFYLRSNR
KQHFYIRSNK
DGKNFGLYQS
NGKNFGLYRT
NGKNFGLYRT
EGKNFGLYKI
SP94
EC
SE
YP
299 EQ-------A
RMR------RVR------EDSQGCSDFA
DEAQWQTLIA
DEQQWEELIP
NENAWEELIP
DESQWALLIA
PRIEVMLEGF
PRENIMLEGF
PREHIMLEGF
PRTDVMLEGF
SLFRDWLVVE
TLFTDWLVVE
TLFTDWLVVE
SLFRDWLVVE
ERSEGLTQLR
ERQRGLTSLR
ERQRGLTSLR
ERSEGLTHLR
QIHWQSGEVK
QINRKTREVI
QINRKTREVI
QIHWSTGEEK
SP94
EC
SE
YP
352 RIAFDDPTYT
GIAFDDPAYV
GIAFDDPAYV
SITFDDPTFD
----TWLAYN
----TWIAYN
----TWLAYN
DPTYTWLAYN
PEPETELLRY
PESETARLRY
PEPETSRLRY
PEPETALLRY
GYSSMTTPTT
GYSSMTTPDT
GYSSMTTPDT
GYSSMTTPSS
LYELNLDSDE
LFELDMDTGE
LFELDMDTGE
MFEINMDSGE
RVMLKQQEVK
RRVLKQTEVP
RRVLKQTEVP
RQLLKQQEVK
SP94
EC
SE
YP
408 NFTPENYRSE
GFDAANYRSE
GFDSGCYQSE
DFTPEKYRSE
RVWVKARDGV
HLWIVARDGV
HLWITARDGV
RIWVTASDGV
EVPVSLVYRH
EVPVSLVYHR
EVPVSLVYHQ
KIPVSLVYHR
DSFARGTNPL
KHFRKGHNPL
KYFRKGQNPL
DYFVSGSNPL
MVYGYGSYGS
LVYGYGSYGA
LVYGYGSYGS
LVYAYGSYGS
SMDPAFSASR
SIDADFSFSR
SIDADFSSSR
SMDPVFSSSR
SP94
EC
SE
YP
468 LSLLDRGFVF
LSLLDRGFVY
LSLLDRGFVY
LSLLDRGFVF
VLAHIRGGGE
AIVHVRGGGE
AIVHVRGGGE
ALAHIRGGGE
LGQLWYEDGK
LGQQWYEDGK
LGQQWYEDGK
LGQQWYEDGK
LFKKQNTFND
FLKKKNTFND
FLKKRNTFND
LLNKLNTFSD
FIDVTEALIA
YLDACDALLK
YLDACDALLK
FTDVTKALVN
QGYGDAKRVF
LGYGSPSLCY
LGYGSPSLCY
EGYGDAQRVF
SP94
EC
SE
YP
9
*
528 AMGGSAGGLL
AMGGSAGGML
GMGGSAGGML
AMGGSAGGLL
588 YYDYILQYSP
YYEYMKSYSP
YYDYMKSYSP
YYDYIKQYSP
*
648 MDSGHGGKSG
MDSGHGGKSG
MDSGHGGKSG
MDSGHGGKSG
MGAVINQAPE
MGVAINARPE
MGVAINERPE
MGVIVNQAPE
FVDVVTTMLD
FVDVVTTMLD
FVDVLTTMLD
FVDVVTTMLD
ESIPLTTGEY
ESIPLTTGEF
ESIPLTTGEF
ESIPLTTGEY
DEWGNPNQQA
EEWGNPQDPQ
EEWGNPQDIE
DEWGNPNDKV
SP94
EC
SE
YP
YDQVKAQDYP
YDNVTAQAYP
YDNVKAQDYP
YDQVKAQDYP
LFNGIVAQVP
LFHGVIAQVP
LFHGVIAQVP
LYKAVVAQVP
*
HMLVTTGLHD
HLLVTTGLHD
HLLVTTGLHD
HMLVTTGLHD
SQVQYWEPAK
SQVQYWEPAK
SQVQYWEPAK
SQVQYWEPAK
WVAKLRELKT
WVAKLRELKT
WVAKLRELKT
WVAKLREMKT
DDRQLLLYTD
DDHLLLLCTD
DQRLLLLCTD
DDHQLLLYTD
SP94
EC
SE
YP
RFKAYEDIAL
RFKSYEGVAM
RFKSYEGVAL
RFKAYEDIAL
EYAFILALAE
EYAFLVALAQ
EFAFLIGLAQ
EYAFILSLI-
--------GTLPATPAD
GTLHSA-----------
SP94
EC
SE
YP
Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей OpdB S. proteamaculans 94
(SP94), E. сoli (ЕС), S. enterica (SE) и Y. pestis (YP). Курсивом выделены 11
аминокислотных остатков OpdB S. proteamaculans 94, отличающихся от соответствующих
остатков OpdB S. proteamaculans 568; серой заливкой выделены фрагменты, совпадающие
для PSP S. proteamaculans и хотя бы одного аналогичного фермента из трех других
источников; остатки Asp/Glu субстрат-связывающих центров S1 и S2 выделены черной
заливкой; помечены звездочками и взяты в рамки остатки аминокислотные остатки (Ser,
His, Asp) каталитической триады
Получение рекомбинантного PSP (His6-PSP)
На основе коммерческой экспрессионной системы, включающей штамм
E. coli BL-21 (DE3) и вектор pET23b+ был получен продуцент
олигопептидазы B S. рroteаmaculans 94 – E. coli BL-21 (DE3) [pOpdB].
Рекомбинантный фермент содержал N-концевую гексагистидиновую
последовательность.
Рис. 8. Препараты His6-PSP на разных
стадиях очистки (Ds-Na-электрофорез в
10% ПААГ)
1 – Суммарный белковый препарат после
разрушения клеток;
2 – хроматография на Ni-NTA-агарозе;
3 – ионообменная
хроматография
на
Q-сефарозе;
4 – маркеры молекулярных масс
Наработка биомассы производилась при 37 °С, индукцию осуществляли
при 25 °С. Клетки собирали центрифугированием и разрушали обработкой
лизоцимом и ультразвуком. Бесклеточный экстракт наносили на колонку с
Ni-NTA-агарозой и после промывки элюировали линейным градиентом
имидазола 10-100 мМ. Степень чистоты после аффинной хроматографии на
10
Ni-NTA-агарозе составляла примерно 90%; гомогенный препарат получен
дополнительной хроматографией на Q-сефарозе. Результаты очистки His6PSP представлены на рис. 8 и в табл. 3.
Таблица 3. Очистка His6-PSP
Стадия oчистки Активный
фермент,
нмоль PSP
Белок, Содержание
мг
PSP,
нмоль/мг
белка
Степень
очистки
Выход, %
Бесклеточный
экстракт
2616
0,062
1
100
Аффинная
68
хроматография
на
Ni-NTAагарозе
13,9
4,9
78,9
41,7
Ионообменная
хроматография
на Q-сефарозе
5,1
12,1
194,1
37,7
163,1
61,6
Выход экспрессированного His6-PSP составил 150 мг из 100 г биомассы.
Исследование рН- и температурной зависимости активности PSP
Изучено влияние pH на гидролиз стандартного трипсинового субстрата
BAPNA. рН-зависимость гидролиза имеет стандартную для сериновых
протеиназ и, в частности, OpdB, колоколообразную форму (рис. 9).
Рассчитанные методом нелинейной аппроксимации экспериментальных
данных величины pKa (6,96 ± 0,06 и 9,89 ± 0,10) аналогичны
соответствующим данным для OpdB из E. сoli; показано, что нижнее значение
pKa (≈7) соответствует ионизации остатка имидазола активного центра, а
верхнее pKa (≈9-10) – неидентифицированной аминокислоты (Lys или Tyr),
контролирующей активную конформацию фермента [Juhasz et al., 2002].
Рис. 9. Влияние pH на активность PSP;
[PSP] = 8,96 нМ, [BAPNA] = 0,03 мM,
[Ca2+] = 50 мМ
pH 4,8-5,20 – 0,1 М ацетатный буфер;
pH 6,0-9,45 – 0,1 М Трис-HCl-буфер
11
Исследовано влияние температуры на стабильность (рис. 10) и
активность (рис. 11) PSP. Показано, что фермент достаточно быстро
инактивируется: инкубация в течение 15 мин при 43 °C приводит к 90%-ной
инактивации; даже при 30 °C через 30 мин сохраняется лишь 50-60%
активности. В то же время олигопептидаза В из E. сoli обладает значительно
более высокой термостабильностью, сохраняя активность вплоть до 50 °C
[Yan et al., 2006].
Рис. 10. Термостабильность PSP в
сравнении с мезофильным ферментом
1 – PSP;
2 – OpdB из E. сoli [Yan, et al., 2006]).
Прединкубации в 0,1 М Трис pH 8,0
при соответствующей температуре в
течение 15 мин. Активность измеряли
по BAPNA (0,2 мМ)
Рис. 11. Влияние температуры на
активность PSP в сравнении с
мезофильным ферментом
1 – AcLKR-pNa (30,6 мкM); PSP (0,53
нМ); 0,1 М Трис pH 8,0
2 – OpdB из T. cruzi [da Silva-Lopez et
al., 2008]
Кажущийся температурный оптимум PSP находится при 25 °C; при
10 °C активность составляет более 60% максимальной. Температурные
характеристики PSP (рис. 10 и 11) – высокая активность при низких
температурах и инактивация фермента при температуре выше 25 °C
характерны для психрофильных ферментов.
Субстратно-ингибиторный анализ PSP
Проведен субстратный анализ PSP c использованием серии пнитроанилидных субстратов (pNA) и высокоффективного для протеиназ
трипсинового типа тиобензилового эфира Nα-бензилоксикарбонил-L-лизина
(Z-Lys-S-Bzl). Показано, что рекомбинантный фермент (His6-PSP) не
12
отличается по специфичности и активности от природного фермента (PSP)
(табл. 4). В отличие от трипсина, свободный N-конец не является
необходимым условием ферментативной активности олигопептидазы В [Yan et
al., 2006; Morty et al., 2002]. Для олигопептидазы В из S. proteamaculans (PSP)
мы впервые провели более или менее систематический анализ вторичной
специфичности как в отсутствие, так и в присутствии (50 мМ) Са2+.
Первичная специфичность. PSP, подобно другим олигопептидазам В,
обладает трипсиноподобной первичной специфичностью, гидролизуя
субстраты, содержащие в Р1-положении остатки Arg и Lys. Как следует из
табл. 4, очевидно, что PSP проявляет в основном аргиназную активность.
При сравнении эффективности гидролиза лизиновых
субстратов с
соответствующими аргининовыми (особенно в случае пары Suc-AAPR-pNA и
Suc-AAPK-pNA) очевидно 10-кратное предпочтение аргининовых субстратов
над лизиновыми, как в присутствии, так и в отсутствие ионов кальция. По
литературным данным, для олигопептидаз В из других источников
(трипаносом, E. сoli, S. enterica) это предпочтение остатка аргинина над
лизином значительно менее выражено (≤2); в некоторых случаях
аргининовые и лизиновые субстраты вообще не отличаются по
эффективности гидролиза [Morty et al., 2002; 2005; Kanatani et al., 1991].
Вторичная специфичность. В числе интересных особенностей
первичной структуры PSP является отсутствие одного из пары остатков
Asp/Glu, контролирующих Р2-специфичность OpdB – остаток Asp462 заменен
на Ala. Однако оба субстрат-связывающих центра PSP остаются отрицательно
заряженными, что способствует эффективному гидролизу пептидов с
положительно заряженными остатками в P1 и Р2-положениях.
Действительно, Ac-LKR-pNA (в отсутствие Са2+) является самым
эффективным в ряду исследованных нами субстратов (табл. 4).
Эффективность гидролиза субстрата с положительно заряженным Р2остатком в присутствии Са2+, способного блокировать карбоксильные группы
Asp/Glu S1 и S2-центров, понижается на порядок за счет ухудшения
связывания субстрата.
Ухудшение связывания в присутствии ионов кальция наблюдается также
для более коротких субстратов – сложных эфиров и амидов N-ацил-аргинина
(или лизина). В случае Z-Lys-S-Bzl Са2+ (50 мМ) вызывает 3-х кратное
увеличение Km, не влияя на kcat; общее падение эффективности гидролиза ZLys-S-Bzl в присутствии Са2+ 3-кратное против 10-кратного для Ac-LKR-pNA
(табл. 4). Для амидного субстрата BAPNA обнаружено аналогичное 3-х
кратное повышение величины Km в присутствии Са2+, однако оно
сопровождается
также
повышением
(2-кратным)
величины
kcat.
Одновременное одинаковое изменение двух этих констант обычно объясняют
непродуктивным связыванием [Juhasz et al., 2002].
13
Таблица 4. Кинетические константы гидролиза субстратов олигопептидазой В из S. рroteаmaculans (PSP);
0,1 М Трис, рН 8,0; 2% ДМСО; 25 °С. Ошибка эксперимента не превышает 20%
Субстрат
1
Ac-LKR-pNA
Ac-LKR-pNA
1
Ac-LLR-pNA
2
Ac-LLR-pNA
1
Z-FR- pNA
2
Z-FR- pNA
1
Bz-PFR-pNA
2
Bz-PFR-pNA
2
1
BAPNA
BAPNA
2
1
Z-Lys-S-Bzl
Z-Lys-S-Bzl
1
Suc-AAPR-pNA
2
Suc-AAPR-pNA
1
Suc-AAPK-pNA
2
Suc-AAPK-pNA
2
1
Z-AAR-pNA
Suc-GPK-pNA
1
PSP 2 His6-PSP
1
kcat; мин-1
[Са2+] = 0
1463,24
1429,46
457,15
1682,26
12120
kcat/Km; мкM-1 мин-1
Km; мM
[Са2+] = 50 мМ [Са2+] = 0
1917,59
0,0226
0,0196
1013,08
834,14
0,224
2112,84
0,0578
3455,9
1094,0
1265,8
0,537
[Са2+] = 50 мМ
0,265
0,559
0,457
0,0513
0,0732
0,062
0,084
[Са2+] = 0
64,77
72,93
2,04
29,13
22,57
[Са2+] = 50 мМ
7,2
1,8
1,83
41,2
47,2
17,6
15,07
869,09
-
2263,13
2213,50
0,09
-
0,302
0,309
9,65
-
7,5
7,2
3331,9
30,26
-
3233
72,04
62,5
56,14
0,0956
-
34,95
-
1,05
-
0,3215
0,323
0,306
2,2
0,029
0,004
9,09
10,4
0,22
0,205
0,018
0,0255
-
-
-
-
-
0,79
0,067
14
Классический случай непродуктивного связывания в отсутствие Са2+
наблюдается для Ac-LLR-pNA: введение 50 мМ Са2+ приводит к
одновременному 2-кратному увеличению значений kcat и Km; общая
эффективность гидролиза (kcat/Km при этом не меняется (табл. 4). Повидимому, при наличии двух карбоксильных аминокислотных остатков
(Glu576 и Glu578) в S1–центре и третьего (Asp460) в S2-центре PSP,
вероятность непродуктивного связывания для субстратов, содержащих лишь
один положительно заряженный остаток Arg, достаточно велика, а Са2+ эту
возможность понижает.
Субстраты Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPK-pNA, содержащие отрицательно
заряженную сукцинильную группу, являются наименее эффективными из
исследованных (табл. 4). Сукцинильная группа достаточно удалена (на три
аминокислотных остатка) от гидролизуемой связи, однако при этом очевидно
ее негативное влияние на субстрат-связывающие центры PSP – наблюдается
не только плохое связывание субстрата (высокие значения Km), но и низкая
каталитическая эффективность – величины kcat Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPKpNA почти на два порядка ниже соответствующих констант всех остальных
субстратов (табл. 4). В противоположность Ac-LKR-pNA, введение ионов
кальция, блокирующих карбоксильные группы фермента и/или субстрата, на
порядок повышает эффективность гидролиза Suc-AAPR-pNA и Suc-AAPKpNA; эффект складывается из повышения величины kcat и уменьшения
величины Km (табл. 4).
Таким образом, величина кинетических констант гидролиза всех
изученных нами субстратов PSP оказалась в ярко выраженной зависимости
от наличия или отсутствия ионов кальция в инкубационной среде, причем
для субстратов с разной вторичной специфичностью эффект часто носит
противоположный характер (табл. 4, рис. 12). Поэтому ряд специфичности
гидролиза субстратов выглядит по-разному при [Са2+ ] = 0 и 50 мМ.
Для ряда субстратов PSP (табл. 4) можно отметить практически
одинаковую величину Km (~0,3 мМ) в присутствии 50 мМ Са2+. К таким
субстратам относятся как наилучший – Ac-LKR-pNA, так и наихудший –
Suc-AAPR-pNA из исследованных, а также BAPNA. Исходя из этого, можно
предположить, что эта величина характеризует связывание остатка Arg в
первичном субстрат-связывающем центре (S1) PSP, а вторичный (S2) центр
блокирован ионами кальция. В отсутствие Са2+ в связывании субстрата
принимают участие оба центра – S1 и S2, что приводит к повышению
эффективности гидролиза на порядок в случае Ac-LKR-pNA, и, наоборот,
понижению – в случае Suc-AAPR-pNA; при гидролизе BAPNA и Ac-LLRpNA наблюдается непродуктивное связывание.
Сравнение эффективности гидролиза субстратной пары Ac-LKR-pNA и
Ac-LLR-pNA демонстрирует, что остаток лейцина в Р2-положении субстрата
неблагоприятен для PSP (табл. 4). Эффективность гидролиза наилучшего
субстрата PSP – Ac-LKR-pNA, по отношению к Ac-LLR-pNA изменяется от
30-кратной в отсутствие Са2+ до 4-х кратной в присутствии 50 мМ Са2+.
15
Нами было обнаружено, что по эффективности гидролиза в отсутствие
ионов кальция, на втором месте после субстрата с двумя положительно
заряженными остатками находится Z-FR-pNA, субстрат с гидрофобным
остатком в P2-положении, а в присутствии таковых, величина kcat/Km Z-FRpNA является наивысшей для исследованных нами субстратов (табл. 4,
рис. 12).
Рис. 12. Активность PSP в отсутствие
и в присутствии ионов Са2+
При этом как величина kcat, так и Km практически не зависит от
присутствия или отсутствия ионов кальция, и величина kcat/Km,
характеризующая эффективность гидролиза этого субстрата, в присутствии
50 мМ Са2+ лишь незначительно выше соответствующей величины в их
отсутствие. Величина Km, характеризующая эффективность связывания
субстрата с ферментом, в случае Z-FR-pNA значительно ниже Km для других
аргининовых субстратов (табл. 4). Поэтому нами было выдвинуто
предположение, что PSP содержит еще один дополнительный, гидрофобный
связывающий центр, ответственный за связывание ароматических остатков
субстрата. В случае другого субстрата с ароматическим Р2-остатком, BzPFR-pNA, содержащего в Р3 – положении остаток пролина, гидролиз
характеризует сильное непродуктивное связывание – величины kcat, и Km
параллельно изменяются на порядок в зависимости от наличия Са2+ (табл. 4).
Однако,
в
противоположность
рассмотренному
выше
случаю
2+
непродуктивного связывания Ac-LLR-pNA и BAPNA, Са способствует
непродуктивному связыванию Bz-PFR-pNA.
Наиболее интересным свойством субстратов с ароматическим
аминокислотным остатком в Р2-положении является обнаруженное нами
ингибирование субстратом в области их высоких концентраций, причем
эффект этот значительно более выражен в отсутствие ионов кальция (рис. 13,
табл. 5). Такое ингибирование для субстратов с ароматическим остатком в Р2
положении не было обнаружено ни для одной из OpdB из других источников.
Кинетика субстратного ингибирования гидролиза Z-FR-pNA и Bz-PFRpNA PSP не соответствует кинетике классического субстратного
ингибирования, когда присоединение второй молекулы субстрата к
продуктивному фермент-субстратному комплексу ES приводит к
16
образованию непродуктивного комплекса ES2. Мы предположили, что
наблюдаемое резкое падение начальной скорости гидролиза Z-FR-pNA и BzPFR-pNA при повышении [S] может быть вызвано присоединением к
комплексу ES не одной дополнительной молекулы субстрата, а нескольких
(n). Показано [Бресткин и др., 1961], что начальная скорость такого
гидролиза может быть рассчитана по формуле:
v = kcat [E] [S]/{(Km + [S] + [S]n+1/ (KS’)n}
где предполагается, что каждая из n дополнительных молекул субстрата
присоединяется независимо от других с одной и той же константой KS’.
На рис. 13 приведены теоретические кривые зависимостей v/[Е] от [S]
для Z-FR-pNA и Bz-PFR-pNA, соответствующие приведенной выше формуле.
Рис. 13. Различный характер зависимостей начальных скоростей гидролиза некоторых
субстратов PSP от их концентрации и присутствия ионов кальция. Для корректного
сравнения скорости нормированы по концентрации фермента
Результаты расчета показали, что при отсутствии ионов кальция в
фермент-субстратном комплексе PSP c Bz-PFR-pNA n = 2,55, то есть
фермент способен дополнительно сорбировать 2-3 молекулы этого субстрата,
что приводит к неактивному комплексу. Число дополнительных молекул ZFR-pNA еще больше: 4-5 (табл. 5). Величины кинетических констант
гидролиза этих субстратов kcat и Km практически совпадают с их значениями
в табл. 4, полученными по обычному уравнению Михаэлиса-Ментен в
области низких концентраций. Способность PSP сорбировать большое число
молекул аргинин-содержащих ди- и трипептидов с остатком Phe в P2положении указывает на то, что наше предположение о наличии в молекуле
этой олигопептидазы В гидрофобного субстрат-связывающего центра не
только подтверждается, но и что этот гидрофобный центр является
достаточно объемным. Более того, ингибиторный анализ подтверждает
наличие такого центра, способного сорбировать не только молекулы
субстратов, но и ароматических ингибиторов (см. раздел «Ингибиторный
анализ»).
17
В присутствии 50 мМ Са2+ эффект субстратного ингибирования
значительно менее выражен (рис. 13). Величины констант субстратного
ингибирования KS’ Z-FR-pNA и Bz-PFR-pNA в присутствии ионов кальция
значительно выше, чем в их отсутствие; однако число дополнительных
молекул субстрата, присоединяющихся к фермент-субстратному комплексу,
не изменяется (табл. 5).
Таблица 5. Субстратное ингибирование PSP; 0,1 М Трис, рН 8,0;
2% ДМСО; 25 °C
Субстрат
Ac-LKR-pNA
Z-FR-pNA
1
Z-FR-pNA
Bz-PFR- pNA
1
Bz-PFR- pNA
Ac-LLR-pNA
BAPNA
Эффектор
–
–
–
–
–
м-фенантролин; 2,28 мМ
о-фенантролин; 1,2 мМ
м-фенантролин; 2,28 мМ
о-фенантролин; 1,2 мМ
n
1,0±0,2
5,2±0,8
5,9±0,4
2,7±0,1
2,0±0,4
1,6±0,4
2,0±0,6
2,0±0,5
2,0±0,6
KS’
мкМ
409±204
45,1±4,4
126±4
26,9±1,8
192±50
86±41
100±20
126±30
223±48
1
[Са2+] = 50 мМ
Для изучения действия PSP на олигопептиды мы выбрали в качестве
субстрата 26-членный пептид – мелиттин GIGAVLK7-VLTTGLPALISWIK-R22KRQQ, содержащий несколько потенциальных сайтов гидролиза этим
ферментом – остаток Lys7 и последовательность 21-24 из четырех
положительно заряженных аминокислотных остатков -KRKR-. Обнаружено,
что первоначально практически одновременно образуются два фрагмента: 122 и 8-22, соответствующие гидролизу мелиттина после остатков Arg22 и
Lys7; очевидно, что фрагмент 8-22 образуется путем дополнительного
гидролиза фрагмента 1-22, и скорость гидролиза полипептидной цепи после
остатка лизина как минимум в 2 раза меньше, чем после остатка аргинина;
продукты гидролиза после остатков Lys23 и Arg24 не обнаружены. Таким
образом, по отношению к олигопептидам PSP, также как по отношению к пнитроанилидным субстратам, проявляет преимущественно аргиназную
активность.
При дальнейшей инкубации наряду с фрагментами 1-22 и 8-22
обнаруживаются нарастающие количества фрагментов 1-21 и 8-21 (рис 14).
Ранее для трипаносомных олигопептидаз В была обнаружена необычная
карбоксипептидазная активность – удаление С-концевых остатков Arg
(удаления других аминокислотных остатков, включая Lys, не обнаружено)
[Hemerly et al., 2003; Morty et al., 2005], однако только если в Р2-положении
находится Arg или Lys.
18
а
б
Рис. 14. Хроматограмма гидролиза мелиттина PSP; [S] = 90 мкМ, [E] = 105 нМ; 0,1 М
Трис, рН 8,0, 25 °С; инкубация 3 ч. Условия хроматографии: колонка Luna C8 2×250 мм
(«Phenomenex», США); элюцию проводили в 0,1%-ной TFA с градиентом ацетонитрила
(95%) 0-100% за 60 мин.; скорость элюции 0,3 мл/мин. a – исходный препарат мелиттина,
б – продукты гидролиза гидролиза мелиттина PSP; 1 – мелиттин; 2 – фрагмент 1-7 (657,4
Да); 3 – фрагмент 8-22 (1668 Да); 4 – фрагмент 8-21 (1512,2 Да); 5 – фрагмент 1-22 (2308
Да); 6 – фрагмент 1-21 (2151,8 Да)
Фрагменты мелиттина 1-21 и 8-21 являются продуктами такого удаления
С-концевых остатков Arg из фрагментов 1-22 и 8-22; таким образом, PSP
также обладает свойственной олигопептидазам В из других источников
узкоспецифической карбоксипептидазной активностью.
Ингибиторный анализ. Предварительный ингибиторный анализ PSP мы
провели с использованием частично очищенных препаратов (табл. 1). После
получения гомогенных препаратов этого фермента (природного и
рекомбинантного) был проведен детальный ингибиторный анализ наиболее
важных из обнаруженных в предварительном исследовании ингибиторов с
определением типа и констант ингибирования (табл.6).
В отличие от всех ранее известных олигопептидаз В из других
источников, PSP достаточно эффективно ингибируется основным
панкреатическим трипсиновым ингибитором быка (BPTI). BPTI является
конкурентным ингибитором PSP, как в отсутствие ионов кальция, так и в
присутствии 50 мМ Са2+, где эффект ингибирования более чем на два
порядка ниже (табл. 6). Характер ингибирания BPTI трипсина и других
трипсиноподобных сериновых протеиназ (тромбина, калликреина,
энтеропептидазы и др.) также конкурентный.
Предварительный ингибиторный анализ показал, что препараты PSP
эффективно ингибируются ионами Cu2+, Cd2+, Zn2+ (табл.1). Оказалось, что
Zn2+ является неконкурентным ингибитором этого фермента (табл. 6). Также
мы обнаружили ингибирование PSP о-фенантролином (табл.1), известным
комплексоном и стандартным ингибитором цинк-зависимых ферментов
[Stocker et al., 1988, Park et al., 2002]. Это привело нас к предположению, что
PSP является сериновым и одновременно Zn-зависимым ферментом.
19
Таблица 6. Ингибирование PSP некоторыми соединениями. Субстрат
BAPNA; 0,1 М Tris-HCl-буфер, pH 8,0; 25 °С. Ошибка эксперимента не
превышает 20%
Ингибитор
BPTI
Характер
ингибирования
конкурентный
Ki
34, 5 нМ
7,35 мкМ
24,4 мкМ
1
ZnCl2
о-фенантролин
неконкурентный
антиконкурентный
1,59 мМ
0,82 мМ
0,31 мМ
2
0, 44 мМ
2
м-фенантролин
антиконкурентный
1
[Ca2+] = 50 мМ
2
субстрат Ac-LLR-pNA
Для решения задачи, содержит ли PSP ионы цинка или нет, был
использован метод атомной абсорбционной спектрометрии. Ионы цинка в
составе белковой молекулы PSP обнаружены не были. Достаточно
эффективное (Ki = 24,4 мкМ) ингибирование активности этого фермента при
внесении ионов цинка можно по- видимому объяснить связыванием их с
поли-His-кластером -277HYHQH281-. Такой кластер отсутствует в молекулах
всех ранее исследованных олигопептидаз В из других источников.
Из литературных данных известно, что ингибирование ферментов
о-фенантролином может объяснятся не комплексообразованием с ионами
металлов, а гидрофобными взаимодействиями с самой белковой молекулой
[Drum et al., 1970]. Для решения задачи, носит ли ингибирование
о-фенантролином гидрофобный характер, нами был использован его
нехелатирующий аналог, м-фенантролин. Оказалось, что м-фенантролин
ингибирует PSP более эффективно. При этом в присутствии 50 мМ Са2+
эффект ингибирования почти полностью снимается, не только в случае
комплексона – о-фенантролина, но и его нехелатирующего мета-аналога. При
детальном изучении кинетики ингибирования PSP о- и м-фенантролином
было выяснено, что ингибирование носит антиконкурентный характер, когда
ингибитор взаимодействует только с фермент-субстратным комплексом. При
варьировании концентраций как ингибитора, так и субстрата, в координатах
Лайнуивера-Берка (1/v от 1/[S]) и Диксона (1/v от [I]) получены серии
параллельных прямых (рис. 15), что является характерным признаком
антиконкурентного ингибирования:
1/ v = 1/(kcat [E])(1+[I]/Ki)+ (Km/ kcat [E])1/[S].
С ферментом связывается одна молекула ингибитора; соответствующие
величины констант ингибирования приведены в табл. 6.
20
Однако из рис. 15 очевидно, что параллельность серий прямых как в
случае графиков Лайнуивера-Берка, так и Диксона, имеет место лишь при
низких концентрациях и субстратов, и ингибиторов.
Рис. 15. Ингибирование м-фенантролином и о-фенантролином гидролиза Ac-LLR-pNA.
[His6-PSP] = 2,58 нМ; 0,1 М Трис-HCl-буфер рН 8,0; 25 °C
При высоких же [S] и [I], что особенно наглядно демонстрируют
зависимости 1/v от 1/[S], наблюдается отклонение кинетики гидролиза от
линейной зависимости, аналогичное отклонению от кинетики МихаэлисаМентен в случае ингибирования субстратом. Таким образом, комплекс PSP с
субстратом способен не только связывать объемные гидрофобные молекулы
о- и м-фенантролина, но в результате образовавшиеся тройные комплексы
фермент-субстрат-фенантролин сорбируют еще одну молекулу субстрата с
образованием четверного комплекса. Субстраты BAPNA и Ac-LLR-pNA,
кинетика гидролиза которых в отсутствие о- и м-фенантролина не
отклоняется в области высоких концентраций от уравнения МихаэлисаМентен, в присутствии гидрофобных ароматических ингибиторов
(присоединяющихся к фермент-субстратному комплексу) приобретают
характерное для субстратов, содержащих в Р2-положении ароматический
аминокислотный остаток, свойство субстратного ингибирования. Константы
такого ингибирования для некоторых концентраций фенантролинов
приведены в табл. 5.
21
В заключении можно отметить, что обнаруженная нами регуляция
ферментативной активности PSP с помощью гидрофобных эффекторов
может быть направлена как на предотвращение гидролиза определенных
нежелательных субстратов, так и на промотирование гидролиза какого-либо
природного субстрата, содержащего специфический гидрофобный центр.
Влияние ионов кальция на активность PSP настолько велико, что
практически PSP при [Са2+] = 0 и PSP при [Са2+] = 50 мМ – это два разных
фермента, различающихся по ряду эффективности гидролиза субстратов
(табл. 4, рис. 12) и эффективности ингибирования как самими субстратами,
так и собственно ингибиторами (табл. 5, 6, рис. 13). Можно предположить,
что комплекс PSP с Са2+ имеет другую конформацию, чем свободный
фермент. Из наших экспериментальных данных следует также, что при
связывании одной молекулы субстрата в субстрат-связывающих центрах S1 и
S2 молекула PSP также подвергается значительной конформационной
перестройке, так как не свободный фермент, а комплекс ES становится
способным сорбировать дополнительные молекулы ароматических
субстратов и ингибиторов. Однако в настоящее время трехмерная структура
ни одной из олигопептидаз В не известна, и делать какие-либо
предположения как о природе такого изменения структуры белка, так и о
локализации потенциального гидрофобного центра затруднительно.
1.
2.
3.
4.
Выводы
Разработана методика выделения и очистки новой психрофильной
протеиназы из S. proteamaculans (PSP).
Определена полная аминокислотная последовательности PSP и
установлена принадлежность PSP к семейству олигопептидаз B.
Обнаружена высокая гомология аминокислотной последовательности
PSP с последовательностями олигопептидаз B патогенов человека и
животных – Yersinia pestis, Salmonella enterica, Trypanosoma cruzi,
Klebsiella pneumoniae, Leishmania amazonensi, рыб и земноводных –
Aeromonas hydrophila, растений – Erwinia carotovora.
На основе коммерческой экспрессионной системы, включающей
штамм E. coli BL-21 (DE3) и вектор pET23b+, получен продуцент
олигопептидазы B S. рroteаmaculans 94 – E. coli BL-21 (DE3) [pOpdB].
Разработана методика выделения и очистки рекомбинантного
фермента (His6-PSP), позволяющая получать до 150 мг гомогенного по
электрофорезу препарата фермента из 100 г биомассы.
Проведен
субстратно-ингибиторный
анализ
PSP.
Показана
принадлежность его к протеиназам трипсинового типа. Исследована
вторичная специфичность фермента. Исследована температурная
стабильность фермента; определены температурный и рН-оптимумы.
22
Список публикаций с основными результатами работы
1. Михайлова А.Г., Лихарева В.В., Хайруллин Р.Ф., Лубенец Н.Л., Румш
Л.Д., Демидюк И.В., Костров С.В. Новая психрофильная
трипсиноподобная протеиназа из Serratia proteamaculans // Биохимия.–
2006.– Т. 71.– С. 563-570.
2. Хайруллин Р.Ф., Михайлова А.Г., Себякина Т.Ю., Лубенец Н.Л., Румш
Л.Д., Зиганшин Р.Х., Демидюк И.В., Костров С.В. Олигопептидаза В из
Serratia proteamaculans. I. Определение первичной структуры.
Выделение и очистка природного и рекомбинантного фермента //
Биохимия.– 2009.– T. 74.– С. 1427 - 1437.
3. Михайлова А.Г., Хайруллин Р.Ф., Себякина Т.Ю., Зиганшин Р.Х.,
Демидюк И.В., Громова Т.Ю., Костров С.В., Румш Л.Д. Структурнофункциональная характеристика природной и рекомбинантной
олигопептидазы B из Serratia proteаmaculans. Вестник новых
медицинских технологий // Вестник новых медицинских технологий.–
2009.– Т. XVI.– C. 271-272.
4. Хайруллин Р.Ф., Лихарева В.В., Михайлова А.Г., Румш Л.Д., Демидюк
И. В., Костров С.В. Новая психрофильная протеиназа // Тез. докл. VIII
чтений, посвящ. памяти акад. Ю. А. Овчинникова, Москва, 25 – 27
октября 2006 г., С. 96.
5. Лихарева В.В., Михайлова А.Г., Хайруллин Р.Ф., Румш Л.Д., Демидюк
И.В., Костров С.В. Новая психрофильная трипсиноподобная
протеиназа из Serratia proteamaculans // Материалы XIV
международной конференции и дискуссионного научного клуба
«Новые информационные технологии в медицине, биологии,
фармакологии и экологии». Тезисы докладов. Украина, Ялта-Гурзуф,
31 мая – 9 июня 2006 г., С. 278-279.
6. Михайлова А.Г., Лихарева В.В., Хайруллин Р.Ф., Румш Л.Д., Демидюк
И. В., Костров С.В. Психрофильная трипсиноподобная протеиназа из
Serratia proteamaculans // Материалы XV Международной
конференции
и
дискуссионный
научный
клуб
«Новые
информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и
экологии. Сателлитный симпозиум «Достижения современной
биоорганической химии и перспективы их применения». Тезисы
докладов. Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 31 мая – 9 июня 2007 г., С.
279-280.
7. Габибов А.Г., Колесников А.В., Мельников Э.Э., Михайлова А.Г.,
Калиберда Е.Н., Козырь, А.В., Кнорре В.Д., Белогуров А.А., Смирнов
И.В., Захарова М.Ю., Хайруллин Р.Ф., Румш Л.Д. Комбинаторные
подходы к созданию ингибиторов ключевых протеиназ развития
нейродегенеративных и инфекционных заболеваний. Итоговая
конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в
рамках приоритетного направления «Живые системы», ФЦП
23
«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития
научно-технологического комплекса России 2007-2012 годы». Сборник
тезисов. Москва. 2008, С. 98-99.
8. Хайруллин Р.Ф., Себякина Т.Ю., Михайлова А.Г., Румш Л.Д.
Олигопептидаза B из Serratia proteаmaculans. Выделение, очистка и
характеристика природного и рекомбинантного фермента // IV
Российский симпозиум «Белки и пептиды». Тезисы докладов. Казань,
23 – 27 июня 2009 г., С. 119.
9. Хайруллин Р.Ф., Себякина Т.Ю., Михайлова А.Г., Румш Л.Д.
Выделение, очистка и характеристика новой олигопептидазы в из
психротолерантного микроорганизма Serratia proteаmaculans //
Международная научная конференция по биоорганической химии,
биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня
рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Тезисы
докладов, Т.1 Устные доклады и стендовые сообщения. МоскваПущино, 28 сентября – 2 октября 2009 г., С. 385.
24