Обзоры УДК 630*813.11:577.15 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ
advertisement
ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2009. №2. С. 5–18. Обзоры УДК 630*813.11:577.15 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА И ЕГО МОДЕЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ © М.А. Айзенштадт*, К.Г. Боголицын Архангельский государственный технический университет, наб. Северной Двины, 17, Архангельск, 163002 (Россия) E-mail: fishim@agtu.ru В обзоре рассмотрены литературные данные по применению ферментов суперсемейства пероксидаз растительного и грибного происхождения в качестве катализаторов процесса окисления лигнина и его модельных соединений пероксидом водорода. Дана сравнительная характеристика строения и механизма каталитического действия данных ферментов. Ферменты семейства пероксидаз грибного и растительного происхождения имеют схожее строение, однако отмечается более высокая стабильность и рН-оптимум для растительных пероксидаз. Сделан вывод о перспективности проведения исследований по изучению влияния функциональной природы, полимолекулярных свойств и закономерностей редокспревращений в процессе каталитического окисления лигнинных веществ растительными пероксидазами. Ключевые слова: ферменты, лигнинпероксидаза, марганецпероксидаза, лакказа, пероксидаза хрена, каталитическое окисление, лигнин, модельные соединения лигнина. Введение В настоящее время ведущую роль в окислительной деструкции лигнина отводят ферментам, относящимся к классу оксидоредуктаз, а именно к суперсемейству пероксидаз растений. Изучение данного суперсемейства ферментов ведется сравнительно давно. Первое упоминание о пероксидазах появилось в 1855 г., после того как Шейнбен провел окисление ряда органических соединений разбавленными растворами пероксида водорода в присутствии экстрактов из растений и животных. Однако выделением пероксидаз в сравнительно чистом виде и изучением основных их свойств наиболее полно занимался А.Н. Бах с сотрудниками, в ряде их работ 1903– 1904 гг. сообщается о выделении пероксидазы и изучении ее каталитической активности [1]. Несмотря на вековую историю, интерес к изучению и использованию данных ферментов не ослабевает. Они являются достаточно широко используемыми в иммуноферментных анализах; на основе рекомбинантных пероксидаз разрабатываются высокочувствительные биосенсоры для определения различных соединений в сложных многокомпонентных смесях, в том числе и при анализе загрязнений в окружающей среде. В настоящее время они получают все более широкое распространение в исследованиях, связанных с изучением биотрансформации и биодеградации лигнина (одной из проблем целлюлозно-бумажной и лесохимической промышленности). Это одно из самых молодых направлений биотехнологии, получившее свое развитие после того, как удалось выделить данный класс окислительных ферментов, охарактеризовать и подтвердить их окислительную способность (лигнолитическую способность) по отношению к лигниноподобным веществам, устойчивым к действию других классов окислительных ферментов. Рассматриваемое суперсемейство пероксидаз подразделяется на три класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей. Класс I включает микробиальные пероксидазы, бактериальные каталазы – пероксидазы (КФ 1.11.1.6), дрожжевую цитохром С пероксидазу (КФ 1.11.1.5) и аскорбатпероксидазы растений (КФ 1.11.1.11). Класс II – это пероксидазы грибов, включающие лигнинпероксидазу (LiP), марганецпероксидазу (МпР) и секреторные пероксидазы растительного типа. Класс III – это классические пероксидазы растений, такие как пероксидаза хрена (HRP), арахиса и сои. Пероксидазы двух последних классов (КФ * Автор, с которым следует вести переписку. 6 М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН 1.11.1.7) гликозилированы, содержат четыре дисульфидные связи и два катиона кальция на молекулу фермента [2, 58]. Большинством авторов [3–8] установлено, что наиболее перспективное применение для процесса окисления лигнина и его модельных соединений имеют следующие пероксидазы: лигнинпероксидаза, марганецпероксидаза и лакказа; в ряде работ [9–13] представлены данные по применению пероксидазы, выделенной из корней хрена. Основной функцией данных ферментов является прямое, как у LiP, или опосредованное медиатором (катионрадикалом у LiP, хелатированными органическими кислотами ионами Мn3+ у МnР) одноэлектронное окисление ароматических субстратов до соответствующих радикалов и двухэлектронное восстановление пероксида водорода до воды. 1. Особенности строения пероксидаз Лигнинпероксидаза (LiP) является хорошо изученной пероксидазой грибного происхождения, вместе с другими грибными пероксидазами ее относят к классу II надсемейства пероксидаз. Молекулярная масса ее составляет около 40 кДа. Изоэлектрические точки лежат в области pI = 3,2–4,7. Она обладает высоким окислительно-восстановительным потенциалом, в результате чего имеет способность окислять не только фенольные, а еще и нефенольные модельные соединения лигнина, ароматические эфиры и полициклические ароматические соединения. Изоферменты Н2 и Н8 имеют очень близкие структуры с единой общей укладкой, принципиально сходной с укладкой пероксидазы хрена (HRP) – типичного представителя класса III растительных пероксидаз. Однако четыре дисульфидных мостика изофермента Н2 (Cys3–Cys15, Cys14–Cys285, Cys34–Cys120, Cys249–Cys317) расположены иначе, чем четыре аналогичных мостика HRP [14]. LiP содержит как соседствующие с гемом, так и отдаленные Са-связывающие сайты, однако в ней отсутствуют дополнительные структурные элементы между α-спиралями F и G, характерные для пероксидаз класса III. Активный центр LiP сходен с закрытой структурой активного центра HRP (так называемый гемовый карман) и отличается от других гемсодержащих белков: глобинов, каталазы, хлоропероксидазы и др., у которых гем экспонирован наружу. Как и у HRP, у изоферментов LiP, по данным разных авторов, ион Fe3+ имеет пять [15] или шесть лигандов [16] (рис. 1). Вероятно, различия в трактовке связаны с тем, что в определенных условиях координационное число гемового железа может изменяться. В работе [17] показано, что фермент может переходить из одной формы в другую. При 25 °С высокоспиновое трехвалентное железо в ферменте преимущественно имеет пять лигандов, как у HRP, а при 2 °С и ниже – шесть. Таким образом, LiP так же, как и HRP, имеет вакантную позицию для координации шестого лиганда, расположенную напротив пятого. Спектральное сходство рассматриваемых пероксидаз подтверждается исследованиями [29, 30], данные пероксидазы принадлежат к гемопротеинам с высокоспиновым железом Fe3+. Полоса Соре и другие полосы поглощения в видимой области близки для данных ферментов (табл. 1). Согласно литературным данным [18], предполагается, что для LiP и HRP окисление небольших субстратов происходит на δ-мезосайте гема (атом углерода между метильными группами 1 и 3, обеспечивающий перенос электрона от восстанавливающего субстрата окисленным интермедиатом фермента). Между тем LiP менее способна к модификации мезосайта гема и быстро инактивируется пероксидом водорода, в отличие от HRP. 1 2 Также было высказано предположение о существовании в молекуле LiP двух различных субстрат-связывающих N центров. Прямыми доказательствами этого предположе8 ния являются данные рентгеноструктурного анализа на3+ 3 N Fe N 7 4 тивного фермента, приведенные в работе [19]. Первый (неспецифический) субстрат – связывающий центр – наN ходится на δ-мезосайте гема, а второй (специфический) – O вблизи Тrр171, который необходим для окисления клас6 5 OH сических субстратов данной пероксидазы. Сходство строения активного центра ферментов, а O именно наличие проксимального гистидинового остатка, дистального гистидинового остатка и аргининового осOH татка, расположенных сходным образом, подтверждаютРис. 1. Структура активного центра пероксидазы ся также с помощью ЯМР-спектроскопии [32]. 7 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА … Таблица 1. Полосы поглощения лигнинпероксидазы (LiP), Mn-зависимой пероксидазы (МnР) из Ph. chrysosporium и пероксидазы хрена (HRP) [31] Форма фермента LiP, pH 4,5 MnP, pH 4,5 HRP, pH 6,0 407 406 403 LiP–CN MnP–CN HRP–CN LiP–N3 MnP–N3 HRP–N3 423 421 422 418 417 416 LiP MnP HRP 435 433 437 LiP–СО MnP–СО HRP–СО 420 423 423 LiP 38 MnP 37 HRP 33 Максимумы полос, нм Ферри-, высокоспиновая 500 – 502 – 500 – Ферри-, низкоспиновая – 540 – 546 – 539 – 540 – 542 – 534 Ферро– – – – – – Ферро-СО – 535 – 541 – 541 AHESIRLVFHDSIAISP 54 – – – 632 632 641 – – – 575 580 565 – – – – – – 556 554 556 – – – 568 570 575 – – – …166 E L E L V W M L S A H S V A 179 A H E V I R L T F H D A I A I S R 53…163 P F E V V S L L A S H S V A 176 A A S I L R L HF H D C F VNGC а) 49 …160S S D L V A L S G G H T F G 173 б) Рис. 2. Гомология в области активного центра у LiP, MnP, HRP. Идентичные и сходные остатки выделены [33]: а – проксимальный гистидин; б – дистальный гистидин В настоящее время сложилось мнение, что субстраты классических пероксидаз растений можно разбить на три группы. К первой относят двухэлектронные доноры электронов, для которых главным является связывание вблизи активного центра (у плоскости гема, иодит-ион) или даже проникновение внутрь активного центра. Вторая группа представляет собой достаточно простые одноэлектронные ароматические субстраты, которые (как это было показано для феруловой кислоты) связываются вблизи активного центра HRP. Третья группа – это субстраты, окисляющиеся по цепи переноса электронов. В случае первой группы субстратов, механизм их окисления включает перенос феррильного кислорода на субстрат, для которого необходимо прямое взаимодействие субстрата с феррильным кислородом. Субстраты второй группы связываются вблизи активного центра фермента. В третьей группе субстратов, если предполагать отсутствие специфических взаимодействий субстрата с активным центром, субстратная специфичность определяется редокс-потенциалами субстратов и окисленных форм фермента и их стабильностью, так как каталитический процесс представляет собой окислительно-восстановительную реакцию. Это мнение основано на данных Данфорда о возрастании констант скорости восстановления окисленных форм фермента с ростом восстановительного потенциала в ряду замещенных аминов и фенолов [20–22]. В отличие от LiP и HRP марганецпероксидаза (МnР) не способна окислять наиболее устойчивые нефенольные подструктуры лигнина. Активность МnР полностью зависит от наличия Мn2+, который окисляется ферментом до Мn3+. Поэтому механизм действия МnР заключается в образовании сильного окислителя – Мn3+, который далее, независимо от фермента, окисляет различные соединения, т.е. служит в этой реакции редокс-медиатором. В настоящее время МnР найдена у нескольких десятков видов базидомицетов. Ее молекулярная масса составляет около 45 кДа, изоэлектрическая точка лежит в области pI = 3–4, содержание сахаров 10–17% [23]. Однако в литературе описаны некоторые истинные МnР, способные к марганецнезависимому окислению [24]. Так, МnР Ceriporiopsis subvermispora непосредственно окисляет некоторые ароматические амины, однако для окисления гваякола присутствие марганца необходимо. Структура МnР сходна 8 М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН со структурой HRP, LiP и других пероксидаз грибов и растений. Однако уникальной характеристикой фермента является марганецсвязывающий сайт. Сайт связывания Мn2+ в МnР впервые предсказан на основании гомологии фермента и LiP, а затем изучен рентгенографически в ферменте, закристаллизованном в присутствии Мn2+. Сайт его связывания расположен на поверхности белка и свободно доступен из раствора. Никаких других сайтов прочного продуктивного связывания Мn2+ в МnР не обнаружено, хотя ранее считалось, что сайт связывания марганца близок к δ-мезосайту гема в LiP и HRP (в нативном ферменте Мn2+ окружен четырьмя карбоксильными группами, одна из которых образует ионную пару с соседним остатком Argl77) [25]. Поэтому при окислении олигомерных фенольных моделей лигнина МnР гораздо менее реакционноспособна, чем LiP и HRP. Важным моментом является чувствительность ферментов к избытку пероксида водорода: LiP наиболее чувствительна к инактивации избытком пероксида водорода (инактивация наблюдается уже при 25-кратном его избытке), МnР менее чувствительна (требует 250-кратного избытка пероксида водорода), а наименее чувствительна HRP (выдерживает более чем 500-кратный избыток пероксида водорода), что характеризует последнюю как наиболее стабильную форму. Данный факт связан с повышением рНоптимума этих ферментов (LiP – 3,0; МnР – 4,5; HRP – 6,0) [26]. Еще один фермент, относящийся к классу грибных пероксидаз (группа медьсодержащих оксидаз), – лакказа. Данный фермент один из немногих, исследуемых с конца XIX в. Все растительные лакказы являются мономерными белками с молекулярной массой 90–130 кДа и изоэлектрической точкой, находящейся в области pI = 3,0–5,1, и высоким содержанием углеводов 22–45%.[27]. До настоящего времени все функции лакказ не определены. Считается, что в растениях лакказы участвуют в синтезе лигнина, катализируя реакцию полимеризации структурных единиц лигнина, которая протекает по свободно-радикальному механизму. Основными физиологическими функциями грибных лакказ считается участие в процессах деградации лигнина, развития и морфогенеза грибов, в патогенезе и детоксикации. Однако лакказы не обладают специфичностью по отношению к субстрату-донору и способны катализировать окисление широкого круга неорганических и органических соединений. Таким образом, субстратами лакказы являются органические ароматические соединения, многие из которых представляют собой фенольные подструктуры лигнина. Разрушение нефенольных подструктур лигнина определяется редокс-потенциалом Т1 центра фермента (редокспотенциал лакказ не превышает 800 мВ, в то время как потенциалы ионизации большинства нефенольных подструктур лигнина весьма высоки, более 1,4 В) [28]. Таким образом, особенности строения вышеприведенных пероксидаз, обуславливающие их субстратную специфичность по отношению к лигнинным соединениям, достаточно хорошо изучены; данные пероксидазы имеют схожее строение активного центра, однако наиболее широкое применение в процессе окисления лигнина нашли грибные пероксидазы: МпР, LiP, лакказа. Что же касается пероксидазы хрена, то ее использование ограничено небольшим кругом исследований в области окисления простых мономерных фенольных структур. При этом, с точки зрения практического применения, необходимо отметить ее высокую стабильность и более высокий рабочий рН-оптимум, в отличие от грибных пероксидаз. Отмеченные факты дают возможность предположить перспективность использования фермента – пероксидазы хрена, как катализатора процессов биодеградации лигнина. 2. Обобщенная схема пероксидазного окисления субстратов Рассмотрим каталитический цикл окисления субстратов пероксидаз. Как было отмечено выше, сходство строения активного центра рассматриваемых грибных (LiP, MnP, лакказа) и растительных пероксидаз (HRP) дает основание предположить однотипность протекания процесса окисления ими ароматических субстратов различной природы. Согласно литературным данным, рассмотренные выше ферменты катализируют окисление различных электрон–донорных субстратов пероксидом водорода. Механизм их пероксидазного окисления является трехстадийным, включающим образование двух промежуточных соединений (рис. 3) [8]. Каталитический цикл гемсодержащих пероксидаз включает следующие этапы: 1. Ферри-фермент подвергается двухэлектронному окислению пероксидом водорода, превращаясь в так называемое «Соединение 1»; 2. «Соединение 1» производит одноэлектронное окисление субстрата, восстанавливаясь в форму, называемую «Соединением 2»; 9 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА … 3. «Соединение 2» производит еще одно одH2O H2O2 ноэлектронное окисление субстрата, восстанавливаясь в исходный ферри-фермент (табл. 2). В соответствии с вышесказанным, процесс окисления лигнина и родственных ему соединений Соединение 1 O O включает следующие элементарные стадии: 4+ 3+ Ферри-фермент 1) окисление фермента пероксидом водорода; Fe Fe основное состояние 2) одноэлектронное окисление субстрата H2O S окисленными формами фермента с образованиS ем субстратного катион-радикала; 2H+ O 4+ 3) депротонирование и/или фрагментация каFe (S) (S) тион-радикала, приводящие к дочерним радикаСоединение 2 лам; 4) одноэлектронное окисление дочерних радиH+ H+ (X) (X) X X калов окисленными формами фермента; O2 5) окисление дочерних радикалов кислородом O2 с промежуточным образованием гидроперекисей. X OO X OO O Подтверждением корректности применения Fe представленной схемы пероксидазного окисления X OOH X OOH по отношению к модельным соединениям и преFe H OH H OH паратам лигнина могут служить данные следующих исследований. Рис. 3. Схема пероксидазного окисления субстрата (S), Так, проведенный в работах [36, 37] анализ образующего катионрадикал стационарной кинетики пероксидазного окисления вератрилового спирта показал, что данная реакция протекает по обычному для пероксидаз «пинг-понг» механизму, согласно которому реакция фермента с одним из субстратов (Н2О2) приводит к образованию окисленной формы фермента, которая в свою очередь, взаимодействует со вторым субстратом (вератриловым спиртом). Стехиометрия окисления в данном случае 1± 0,05 моль Н2О2 на 1 моль вератрилового спирта. При окислении фенил-гваякола, а также фенольных олигомеров с β-О-4-связью (ди-, три-, и тетрамера) соединение LiP I существенно активнее соединения 2. Константы скоростей окисления этих субстратов соединением LiP I в ряду ди-, три-, и тетрамера снижаются от 12 до 3,6 ·105 M–1с–1. Значения констант для соединений 2 тоже снижаются с увеличением размера субстрата. Однако диапазон изменения констант окисления олигомеров не превышает трех-четырех раз, что позволяет сделать предположение о несущественной роли длины субстрата в непосредственном окислении лигнина. Для стационарной реакции значения Km и kkat составляют 0,16 мМ и 7,7 с–1 (в литературе представлены данные по активности пероксидазы хрена в отношении гваякола: для стационарной реакции значение Кm составляет 0,27 мМ) [45]. При окислении олигомерных фенольных моделей лигнина соединение 1 Мn-пероксидазы значительно реакционноспособнее соединения 2, но гораздо менее реакционноспособно, чем LiP I. Константы скоростей окисления этих субстратов MnPI варьируют от 1·105 для гваяцильного димера до 1,1 ·103 M-1c-1 для тетрамера. МnРII обладает незначительной активностью к этим субстратам [40]. Таким образом, окисление субстратов различными пероксидазами осуществляется однотипно, с образованием промежуточных соединений 1 и 2, однако в силу структурных особенностей и свойств данных ферментов, эти соединения образуются с различной скоростью, характеризующей полноту протекания процесса окисления. Далее проанализируем механизм каталитических редокс-превращений лигнинных соединений в условиях пероксидазного окисления. Таблица 2. Полосы поглощения в спектрах окисленных форм LiP [34] и HRP [35] Фермент LiP HRP Максимумы, нм Соединение 1 408, 550, 608, 650 400, 557, 662, 650 Соединение 2 420, 525, 556 420, 527, 554 М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН 10 3. Механизм пероксидазного окисления лигнина и родственных ему соединений Согласно представленному выше механизму пероксидазного окисления различных субстратов их превращение начинается с одноэлектронного окисления, приводящего к образованию катион-радикала. Поэтому при рассмотрении химических аспектов пероксидазного окисления лигнина основным является вопрос о трансформации образующихся катион-радикалов лигнина и родственных ему соединений. На рисунке 4 представлены наиболее типичные примеры превращений синтетических моделей лигнина, окисляемых пероксидом водорода в присутствии лигнинпероксидазы. Основная часть этих реакций (1–3) интерпретируется на основе схемы, предложенной Шумейкером для описания превращений катион-радикалов фенилкарбинолов (1) (рис. 5). Такие катион-радикалы (2) либо отщепляют протон и подвергаются повторному одноэлектронному окислению в кетоны или альдегиды (3) (путь А), либо распадаются на фрагменты с разрывом Сα–Сβ связи (путь В). Один из этих фрагментов представляет собой катион (4), теряющий далее протон и превращающийся в нейтральную молекулу (5), а другой – радикал (6), который окисляется ферментом или атмосферным кислородом. Соотношение этих альтернативных путей зависит от прочности Сα–Сβ связи в первичном катион-радикале. У первичных фенилкарбинолов (в частности, у вератрилового спирта) оба пути совпадают. Для окислительно-гидролитического деметилирования (реакция 4, рис. 4) ключевой стадией, повидимому, является атака воды на катион-радикал. Об участии воды в этой реакции свидетельствует включение кислородной метки в хинон при проведении реакции в среде Н218O [38]. Последняя реакция (реакция 5, рис. 4), представляет собой окислительное сочетание фенолов при их окислении пероксидом водорода, которое катализируется многими пероксидазами. Наличие большого объема исследований в данной области все же не дает полного понимания о механизме действия ферментов на сам лигнин. LiP, MnP и лакказы считаются ключевыми ферментами в окислении фенольных и нефенольных структур лигнина до катионрадикалов, подвергающихся затем серии неферментативных реакций, включающих расщепление С–С и С–О-связей и фрагментацию трехмерной сетки лигнина. Существует несколько мнений о действии ферментов на лигнин. Некоторые исследователи утверждают [8], что деполимеризация лигниновой матрицы и других высокомолекулярных субстратов опосредуется низкомолекулярным деметоксифенильным медиатором типа вератрола, образующим под действием фермента стабильную катионрадикальную частицу. CH2OH 1. HO R O 2. HO R O R H CH2OH + OMe OMe OMe OMe OMe OH OH HO 3. OMe OMe OMe 4. OMe O + 5. OMe OMe OMe Me3C CMe3 O CMe3 OMe OMe OMe 2MeOH OMe OMe OH OH Рис. 4. Примеры превращений лигниноподобных соединений при лигниназном окислении HO R 11 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА … A OH Ar C R OH -e Ar C R H H (1) (2) OH Ar C -H+ R -H+ B O -e, -H + Ar Ar C R (3) CHO (5) OH Ar C H (4) + R (6) Рис. 5. Пероксидазное окисление арилкарбинолов [39] Другие исследователи придерживаются иной точки зрения, что фермент способен непосредственно действовать на лигнин [40]. Известно, что окислительная деполимеризация ферментами модельных димеров лигнина с разными типами связей (рис. 6) не требует участия медиатора. Далее рассмотрим более детально, как протекает пероксидазное окисление некоторых соединений, представляющих собой модели лигнина. В процессе окисления гваяцильных структур лигнина со свободной реакционной ОН-группой наблюдается инактивация фермента данными субстратами. Образующиеся при окислении данных фенольных субстратов феноксирадикалы не могут участвовать в реакциях переноса заряда, а в отсутствие катионрадикалов становится возможной реакция соединения II с пероксидом водорода с образованием неактивного соединения III [45]. Типичный пример данного явления – окисление фенольного субстрата феруловой (4-окси-3метоксикоричной) кислотой. В ходе ее окисления наблюдается инактивация фермента по двум возможным путям. Первый – пероксид зависимая инактивация, вызванная накоплением соединения III даже при относительно низких концентрациях пероксида. Второй механизм инактивации включает взаимодействие феноксирадикалов или продуктов окисления феруловой кислоты с ферментом [47]. Так, в результате пероксидазного окисления феруловой кислоты пероксидом водорода наблюдается образование димеров и тримеров с последующей их дальнейшей полимеризацией (рис. 7) [48]. Данное явление наблюдается и для эвгенола, при окислении его пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена (рис. 8) [49]. Гваякол (2-метоксифенол) также хорошо окисляется и соединением I и соединением II фермента, с образованием димера (рис. 9) [46]. Согласно представленной схеме, явление дальнейшей полимеризации не наблюдается, что объясняется строением данного соединения, а именно отсутствием заместителя в п-положении. Данное предположение подтверждают работы [53, 54], в которых исследуется лигнинпероксидазное окисление препаратов лигнина, предварительно подвергнутых исчерпывающему метилированию. Этот процесс приводит не к конденсации, а к тем же низкомолекулярным продуктам деградации, что и окисление моделей лигнина. HO OH HO MeO Me Me O OMe OMe O OMe OMe OMe 1 2 OMe MeO OMe 3 Рис. 6. Модельные нефенольные димеры лигнина с разными типами связей: β-1 (1), β-О-4 (2) и β-5 (3) М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН 12 H3CO H3CO H3CO H3CO O O O OH HRP H2O2 HO HO O O HO 1a + 1b HO 1b + 1c 1b 1a 1 O O 1c OH OCH3 H3CO OH OH OCH3 O H3CO HO HO O 2b 2a OH OH H3CO H3CO 1a + 2b HO O OH OH + OCH3 O OCH3 O H3CO 3a HO O O HO HO O HO OCH3 O O 3b OH H3CO 1a + 2a O O H3CO 3c HO O Рис. 7. Образование димерных и тримерных структур в результате пероксидазного окисления феруловой кислоты пероксидом водорода 13 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА … Polimers OH OCH3 O O OCH3 OCH3 Рис. 8. Предполагаемая полимеризация структур, полученных в ходе пероксидазного окисления эвгенола пероксидом водорода OH O OCH3 O OCH3 HRP OCH3 H2O2 OH OCH3 OCH3 CH3O H O O H CH3O HO OCH3 OH CH3O [O] OCH3 O Рис. 9. Образования окрашенного продукта 3,3-диметокси-4,4-дибензохинона пероксидазного окисления гваякола пероксидом водорода O в ходе реакции Несколько иной характер носит ферментативное окисление диметоксилированных ароматических соединений. Так, 1,2,4,5-тетраметоксибензол окисляется пероксидом водорода в присутствии всех вышерассмотренных ферментов через катоионрадикал до 2,5-диметокси-п- и 4,5-диметокси-о-бензохинона в соотношении 4 : 1 с выделением двух молей метанола на моль субстрата. При этом в случае пероксидазы хинонные атомы кислорода заимствуются из молекул воды, т.е. происходит отщепление метоксильной группы как целого. Вообще, катионрадикалы являются короткоживущими промежуточными продуктами при окислении ди- и тетраметоксибензолов и их производных. Их образование включает как ферментативные так и целый ряд последовательных неферментативных стадий. Примером в данном случае может служить окисление 3,4-диметоксибензилового спирта (вератрола) до вератрового альдегида. В процессе окисления затрагивается не ароматическое кольцо, а, в основном, боковая цепь. Образующийся катионрадикал подвергается неферментативным превращениям в результате нуклеофильной атаки молекулой воды: происходит отщепление протона с образованием бензильного радикала (рис. 10) [44]. В аэробных условиях этот радикал может присоединять молекулу кислорода, образуя при этом оксибензилпероксирадикал. Разложение последнего дает супероксиданион и вератральдегид (до 83%). Таким образом, при ферментативном окислении ароматических субстратов кислород отвечает за образование пероксирадикалов, которые могут затем вовлекать в цепные неферментативные реакции новые молекулы субстрата, значительно ускоряя его превращение. Но роль кислорода в данном процессе особенно важна, так как необходимо преодолевать явление рекомбинации углеродных радикалов, образуемых при выбросе протона катионрадикалами – непосредственными продуктами ферментативного окисления. М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН 14 O OH OCH3 OCH3 H+ OH O2 O OH OCH3 H + OCH3 H O O2 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 Рис. 10. Неферментативное превращение катионрадикала вератрола и образование вератральдегида в аэробных условиях За последнее время активно стали развиваться исследования, направленные на получение «синтетического лигHO нина» – вещества, сходного по структуре, свойствам и строению с природным лигнином (так называемый дигидроR полимер – ДГП). Он образуется при пероксидазном окислении мономерных структур как гваяцильного, так и HO сирингильного ряда. Примером может служить процесс R1 R2 R2 синтеза лигнина при пероксидазном окислении моноOH Peroxidase + H2O2 лигнола синапового спирта (рис. 11) [50]. ДГП как близкий аналог природного лигнина широко применяется в научных исследованиях, поскольку можно управлять его молекулярной массой и мономерным состаHO вом, а также включать в нужные места изотопные метки. Показано, что данный полимер – аналог елового R лигнина – разрушается пероксидазой напрямую, согласно рисунка 12 [41]. O В литературе приведены сведения о процессе окисления R2 R1 R2 димерных соединений, принадлежащих к классу β-О-4 OH ROH моделей, лигнинпероксидазой [51, 52]. Данные модели имитируют наиболее распространенный в лигнинах тип димерных фенилпропановых блоков. В молекуле субстрата, HO R принадлежащего к классу β-О-4 моделей, присутствуют два несопряженных диалкоксифенильных остатка, коRO O торые могут окисляться лигнинпероксидазой независимо. R2 Если реакция начинается с одноэлектронного окисления диметоксифенильной части молекулы, происходит либо Сα–Сβ R1 R2 фрагментация первичного катион-радикала, приводящая к OH вератровому альдегиду (8) и продуктам (9), (10), либо его депротонирование и повторное окисление дочернего раРис. 11. Димеризация монолигнолов дикала в кетон (11) (рис. 13). сирингильного типа под действием системы Если же реакция начинается с одноэлектронного пероксид водорода + пероксидаза хрена окисления метоксифеноксильного фрагмента молекулы, то происходит гидролитическое расщепление С-О-связей в катион-радикале (в частности, ведущее к соединению (14)) или внутримолекулярная атака γ-гидроксильной группы с образованием промежуточного кеталя (15) (рис. 14). Таким образом, катион-радикалам лигниноподобных веществ свойственно множество превращений. Выбор направления зависит от прочности Сα–Сβ -связи (фрагментация), доступности для атаки воды (гидролитическое деметилирование), вероятности одноэлектронного окисления дочернего радикала (образование кетонов и альдегидов без фрагментации), а также вида самого фермента. 15 ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА … + + HO O OH OCH3 OCH3 1 O 4 OCH3 A o O O B + 2 OCH3 OCH3 OCH3 B O OCH3 CH3 H H O O OH O HO 3 2 A OH H O OCH3 OCH3 A OH OH O H OCH3 OCH3 OCH3 5 B 6 OCH3 OCH3 OH B R 8 + OH ? OCH3 OCH3 B 7 R=HOH 8 R = =O 8 O HO H H O o HO OH OCH3 B OCH3 OCH3 O 1 + OCH3 H O OCH3 OCH3 9 O HO OH H O O O HO = O O OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 11 12 10 OH O O HO O O OH OCH3 O OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 13 14 Рис. 12. Пероксидазное окисление структуры лигнина с образованием ряда продуктов Данные схемы наглядно демонстрируют, что природа и положение заместителей определяют распределение электронной и спиновой плотности, пространственные взаимодействия, а значит и ход реакции пероксидазного окисления. Так, для модельных соединений лигнина, имеющих заместителей в п-положении, свойственна полимеризация мономерных структур с образованием димеров и тримеров, что существенно снижает скорость их ферментативного окисления. М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН 16 H O OH OMe OMe O HO (9) (8) HO O OMe OMe OMe OH OH + + H (10) O MeO OH OMe O O O OMe (7) O H O MeO H Me O O MeO + (9) OMe OMe OMe (11) OMe OMe OMe (12) (13) Рис. 13. Лигнинпероксидазное окисление модели лигнина типа β-О-4 в аэробных условиях. Основные реакции с разрывом С–С связей OH R1 R1 = H R1 = H R2 = OH (14) R2 = O (16) OH R2 OMe OMe OMe OH HO HO O O H O MeO H O HO OMe OH O MeO 8 + OMe OMe OMe OMe (7) HO OH (17) O O H O O OMe (15) O H OMe HO O OH O O O O OH HO OMe O O OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe OMe (19) (20) (21) (22) Рис. 14. Лигнинпероксидазное окисление модели лигнина типа β-О-4 в аэробных условиях. Основные реакции с разрывом С–О связей Заключение Таким образом, анализ результатов исследований, приведенный выше, позволяет нам сделать следующие выводы. 1. Ферменты семейства пероксидаз грибного и растительного происхождения имеют схожее строение, однако отмечается более высокая стабильность и рН-оптимум для растительных пероксидаз. 2. Природными катализаторами процесса окисления являются растительные пероксидазы, которые входят в состав фенолоксидазно-пероксидазного комплекса ферментов и используются микроорганизмами для деструкции лигнина [42, 43]. 3. Механизм пероксидазного окисления лигнина включает следующие основные стадии: – двухэлектронное окисление фермента пероксидом водорода с образованием соединения 1; ПЕРОКСИДАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИНА … 17 – одноэлектронное окисление субстрата окисленной формой фермента (соединением 1) с образованием субстратного катион-радикала и соединения 2; – одноэлектронное окисления субстрата соединением 2 с образованием продукта окисления субстрата и восстановления исходной формы фермента. Рассмотрение вопросов взаимодействия лигнина и его модельных соединений с комплексом пероксидаза – пероксид водорода свидетельствует о перспективности использования данного класса ферментов как катализаторов процесса окисления в силу их стабильности, специфичности и эффективности действия. Поэтому, несомненно, актуальными и приоритетными для химии лигнина являются исследования по изучению влияния функциональной природы, полимолекулярных свойств и закономерностей редокспревращений в процессе каталитического окисления лигнинных структур растительными пероксидазами. Список литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. Андреева В.А. Фермент пероксидаза: участие в защитном механизме растений. М., 1988. 128 с. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 303–322. Young R.A. and Akhtar M. Environmentally friendly technologies for paper industry. Canada : John Wiley &Sons, Inc., 1998. 307 p. Have R., Teunissen P.J. Oxidative mechanisms involved in lignin degradation by White-Rot Fungi // Chem. Rev. 2001. №101. P. 3397–3413. Левит М.Н., Шкроб А.М. Лигнин и лигниназа // Биоорганическая химия. 1992. Т. 18. №3. С. 309–345. Беккер Е.Г. Выделение, свойства и основные закономерности действия лигнолитических ферментов (лакказы, лигниназы, Мn- пероксидазы): Дис. … канд. хим. наук. М., 1993. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондратенко В.И., Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. II: Ферменты, модели, процессы. М., 2002. 343 с. Shimada M., Higuchi L. Degradation of lignin // Wood and cellulosic chemistry / Ed. D. N.-S. Hon, N. Shiraishi.: N. Y. and Basel: Mercek Dekker. 1991. P. 525–591. Стрельский В.А., Бейгельман А.В., Чупка Э.И. Спектрофотометрическое исследование кинетики окисления модельных соединений и лигнина комплексом пероксидаза-Н2О2 // Химия природных соединений. 1982. №1. С. 109–112. Стрельский В.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений: Дис. … канд. хим. наук. Л., 1986. Hewson W.D., Dunford H.B. Oxidation of p-Cresol by Horseradish Peroxidase Compound I // The Journal of Biological chemistry. 1976. V. 251. №19. P. 6036–6042. Thompson D., Norbeck K., Olsson L., Constantin-Teodosiu D. Peroxidase-catalysed oxidation of Eugenol: formation oa a cytotoxic metabolite (s) // The Journal of Biological chemistry. 1989. V. 264. №2. P. 1016–1021. Banci L., Bertini I., Bini T. et al. Binding of horseradish, lignin, and manganese peroxidases to their respective substrates // Biochemistry. 1993. V. 32. №22. P. 5825–5831. Smith А.Т., Veitch N.C. Substrate binding and catalysis in heme peroxidases // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V. 2. P. 269–278. Kuila D., Tien M., Fee J.A., Ondrias M.R. Resonance raman spectra of extracellular ligninase: evidence for a heme active site similar to those of peroxidases // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 3394–3397. Andersson L.A., Renganathan V., Chiu A.A. et al. Spectral characterization of diarylpropane oxygenase, a novel peroxidedependent, lignin- degradation heme enzyme // The Journal of Biological chemistry. 1985. V. 260. №10. P. 6080–6087. Andersson L.A., Renganathan V., Loehr T.M. et al. Lignin-peroxidase: resonance Raman spectral evidence for compound II and for a temperature – dependent coordination-state equilibrium in the ferric enzyme // Biochemistry. 1987. V. 26. №8. P. 2258–2263. Henricsen A., Smith A.T., Gajhede M. Structural alignment of rsAPX and CcP // The Journal of Biological chemistry. 1999. V. 274. P. 35005–35011. Montellano O. Catalytic sites of hemoprotein peroxidases // Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. 1992. V. 32. P. 89–107. Rodrigues-Lopez J.N., Gilabert M.A., Tundela J., Thorneley R.N. Reactivity of Horseradish peroxidase Compound II toward substrates: kinetic evidence for a two-step mechanism // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 13201–13209. Dunford H.B., Adeniran A.J. Hammet rho sigma correlation for reactions of horseradish peroxidase Compound II with phenols // Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 251. P. 536–542. Van Haandel M.J., Claassens M.M., Van der Hount N. Differential substrate behavior of phenol and aniline derivatives during conversion by HRP // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1435. P. 22–29. Schneegab I., Hofrichter M., Scheibner K., Fritsche W. Purification of the main manganese peroxidase isoenzyme MnP2 from the white-rot fungus Nematoloma frowardii // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 602–605 Crestini C., DAnnibale A., Sermanni G.G., Saladino R. The reactivity of phenolic and nonphenolic residual kraft lignin model compounds with Mn (II) - peroxidase from Lentinula edodes II // Bioorg. Med. Chem. 2000. V. 8. №2. P. 433–438. Gelpke M.D.S., Youngs H.L., Gold M.N. Role of arginine 177 in the Mn2+ binding site of manganese peroxidase // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 7038–7045. Bockle В., Martinez M.J., Guillen F., Martinez A.T. Mechanism of peroxidase inactivation in liquid cultures of the ligninolytic fungus Pleurotus pulmonarius // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. №3. P. 923–928. 18 М.А. АЙЗЕНШТАДТ, К.Г. БОГОЛИЦЫН 27. Marbach I., Harel E., Mayer A.M. Pectin a second inducer for laccase production by Botrytis cinerea // Phytochemistry. 1985. V. 24. P. 2559–2561. 28. Xu F. Effects of Redox potential and hydroxyl inhibition on the pH activity profile on fungel laccases // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. №2. P. 924–928. 29. Tien M., Kirk Т.К. Lignin – degradating enzyme from Phanerocha ete Chrysosporium: purification, characterization and catalytic properties of a unique H2O2-requiring oxygenaze // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. №8. P. 2280–2284. 30. Kuila D., Tien M., Fee J.A., Ondrias M.R. Resonance Raman spectra of extracellular ligninase: evidence for a heme active site similar to those of peroxidases // Biochemistry. 1985. V. 24. №14. P. 3394–3397. 31. Gold M.H., Wariishi H., Valli K. Degradation of 2,4-dinitrotoluene by the lignin-degradation fungus // ACS Symposium Series. 1989. V. 389. P. 127–140. 32. La Mar G.N., Thanabal V., De Ropp J.S. Peroxidase catalyzed polymerization of phenol // Biochemistry. 1989. V. 28. №4. P. 1934. 33. Godfrey B. J., Mayfield M.B., Brown J.A., Gold M.H. Characterization of a gene encoding a manganese peroxidase from Phanerochaete Chrysosporium // Gene. 1990. V. 93. №1. P. 119–124. 34. Renganathan V., Gold M.H. Role of molecular oxygen in lignin peroxidase reactions // Biochemistry. 1986. V. 25. №7. P. 1626–1631. 35. Dure L., Cormier M.J. Additional of the peroxidase // J. Biol. Chem. 1964. V. 239. P. 2351–2359. 36. Tien M., Kirk Т., Bull C., Fee J.A. Steady-state and transident state kinetic studies on the oxidation of 3,4-dimetoxybenzyl alcohol catalyzed by the ligninase of Phanerochaete Chrysosporium Burds // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. №4. P. 1687–1693. 37. Glenn J.K., Gold M.H. Purification and characterization of an extracellular Mn (II) – dependent peroxidase from the lignin – degradating basidiomycete, Phanerochaete Chrysosporium // Arch. Biochem. And Biophys. 1985. V. 242. №2. P. 329–341. 38. Kersten P.J., Kalyanaraman В., Hammel K.E., Reinhammar В., Kirk Т.К. Mechanism of oxidative С alpha- С beta cleavage of a lignin model dimmer by Phanerochaete Chrysosporium ligninase. Stoichiometry and involvement of free radicals // Biochem. J. 1990. V. 268. №2. P. 475–480. 39. Schoemaker H.E., Harvey P.J., Bowen R.M., Palmer J.M. On the mechanism of enzymatic lignin breakdown // FEBS Lett. 1985. V. 183. №1. P. 7–12. 40. Band L., Ciofi-Baffoni S., Tien M. Lignin and Mn peroxidase- catalyzed oxidation of phenolic lignin oligomers // Ibid. 1999. V. 38. №10. P. 3205–3210. 41. Kirk Т.К., Farrel R.L. Enzymatic «combustion»: the microbial degradation of lignin // Ann. Rev. Microbiol. 1987. P. 125–131. 42. Cardwell E.S., Steellink С. The oxidation-reduction potentials of compound I/compound II and compound II/ferric couples of horseradish peroxidases A2 and C // Biochem. Biophys. Acta. 1969. P.105–109. 43. Loung M., Steellink С On the mechanism of enzymatic lignin breakdown // Phytochemistry. 1973. V. 12. P.2152–2157. 44. Khindaria A., Grover T.A., Aust S.D. Evidence for formation of the veratryl alcohol cation radical by the lignin peroxidase // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 6020–6025. 45. Koduri R.S., Tien M. Oxidation of quaiacol by lignin peroxidase. Role of veratryl alcohol // The Journal of Biological Chemistry. 1995. V. 270. №38. P. 22254–22258. 46. Laszlo J.A., Compton D.L. Comparison of peroxidase activities of hemin, cytochrom С and microperoxidase-11 in molecular solvents and imidasolum - based ionic liquids // J. Mol. Cat. B. 2002. V. 18. P. 109–120. 47. Ward G., Hadar Y., Dosoretz C.G. Inactivation of lignin peroxidase during oxidation of the highly reactive substrate ferulic asid // Enzyme Microb. Technol. 2001. V. 29. №1. P. 34–41. 48. Outgenoeg G., Dirksen E., Ingemann S., Hilhorst R. Horseradish Peroxidase – catalyzed oligomerization of Ferulic Asid on a Template of a Tyrosine – containing tripeptide // The Journal of Biological Chemistry. 2002. V. 277. №24. P. 21332–21340. 49. Tompson D., Norbeck K., Olsson L., Constantin-Teodosiu D. Peroxidase-catalyzed oxidation of Eugenol: formation of a carbotoxic metabolite (s) // The Journal of Biological Chemistry. 1989. V. 264. №2. P. 1016–1021. 50. Holmgren A. Biochemical control aspects in lignin polymerization: Doctoral thesis, Royal Institute of Technology. Stockholm, 2008. 51. Kirk Т.К. Biochemistry and genetics of cellulose degradation // Acad. Press. Inc. 1988. P. 315–332. 52. Hwang R.H., Kennedy J.F., Melo E.H.M A probable lignin structure by conformational analysis // Carbohydrate polymers. 1989. V. 10. №1. P. 15–30. 53. Kurek В., Monties В., Odier E. Influence of the physical state of lignin on its degradability by the lignin peroxidase of Phanerochaete Chrysosporium // Enzyme Microb. Technol. 1990. V. 12. №10. P. 771–777. 54. Hammel K.E., Moen M.A. Depolymerization of a synthetic lignin in vitro by lignin peroxidase // Enzyme Microb. Technol. 1991. V. 13. №1. P. 15–18. 55. Howes B.D., Feis A., Raimondi L., Smulevich G. The critical role of the proximal calcium ion in the structural properties of horseradish peroxidase // The Journal of Biological Chemistry. 2001. V. 276. №44. P. 40704–40711. 56. Klapper M., Hackett D.P. The Oxidatic Activity of Horseradish Peroxidase // The Journal of Biological Chemistry. 1963. V. 238. №11. P. 3736–3742. 57. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение. М., 1981. 92 c. 58. Neilsen K.L., Indiani G., Henriksen A. et al. Differential activity and structure of highly similar peroxidases. Spectroscopic, crystallographic and enzymatic analyses of lignifying Arabidopsis thaliana peroxidase A2 and HRP A2 // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 11013–11021. Поступило в редакцию 28 января 2009 г. После переработки 8 мая 2009 г.