На правах рукописи ЧЕВКИНА ЕЛЕНА МАКСИМОВНА
advertisement
На правах рукописи ЧЕВКИНА ЕЛЕНА МАКСИМОВНА ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ И ФУНКЦИЙ БЕЛКОВ, МОДУЛИРУЮЩИХ ПРОЦЕССЫ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ И ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ Специальность 14.01.12 – онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва — 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор – академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. Михаил Иванович Давыдов) Официальные оппоненты: Народицкий Борис Савельевич Доктор биологических наук., профессор, ФГБУ «НИИ Эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Министерства здравоохранения Российской Н.Ф.Гамалеи» Федерации, заместитель директора по научной работе Карпухин Александр Васильевич Доктор биологических наук., профессор, ФГБУ «МедикоГенетический Научный Центр» РАМН, заведующий лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний Боженко Владимир Константинович Доктор медицинских наук, заслуженный врач России, профессор, ФГБУ «Россйиский научный центр рентгенрадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной диагностики Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН. Защита диссертации состоится «__» _________ 2014 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) или на сайте http://www.ronc.ru Автореферат разослан «___» _________ 2014 года. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Юрий Андреевич Барсуков 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Диссертационная работа посвящена одной из важнейших задач экспериментальной онкологии - идентификации роли различных белков и сигнальных путей, регулирующих злокачественный потенциал опухолевых клеток. Как известно, в процессе селекции опухолевые клетки (или клоны клеток) за счет генетической нестабильности приобретают дополнительные качества, позволяющие им выживать в условиях гипоксии, проникать в окружающую ткань и в кровоток, выживать в кровяном русле, противостоять атакам со стороны иммунной системы, прикрепляться и проникать в органы-мишени и, в конечном счете, пролиферировать в новом микроокружении, создавая очаги вторичного роста, то есть метастазы. Несмотря на появление новых методов диагностики, онкологические заболевания часто обнаруживают уже в ходе процесса метастазирования. Очевидно, что это клинически значимое явление невозможно предотвратить без понимания фундаментальных механизмов, определяющих процесс метастазирования на молекулярном и клеточном уровнях. Перечисленные выше характеристики клеток, приобретаемые ими в процессе отбора, являются результатом многочисленных изменений активности как отдельных генов и их продуктов, так и целых каскадов, передающих внутриклеточные и дистанционные сигналы. Несмотря на достижения последних лет, касающиеся роли отдельных белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, имеющиеся данные в значительной степени противоречивы и фрагментарны и далеко не в полной мере объясняют картину событий, происходящих в процессе приобретения трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа. Этим во многом объясняется тот факт, что таргетная терапия злокачественных новообразований, направленная на подавление отдельных онкогенов и регулируемых ими процессов, в ряде случаев оказывается недостаточно эффективной, поскольку зачастую направленное подавление активности одного белка (и активируемого им сигнального каскада) вызывает активацию альтернативных сигнальных путей, которые приводят к приобретению опухолевой клеткой дополнительных селективных преимуществ. Иногда такая терапия приводит к отбору еще более агрессивных клонов, и после короткой ремиссии происходит стремительное прогрессирование заболевания. Поэтому все активнее развиваются идеи одновременного (параллельного или последовательного) подавления нескольких белков и сигнальных путей, вовлеченных в процесс трансформации и опухолевой прогрессии. Очевидно, что такой комплексный подход требует понимания всей совокупности событий, происходящих в опухолевой клетке, и, прежде всего, четких представлений о функциях и механизмах регуляции отдельных белков, их взаимосвязи с другими белками и внутриклеточными сигнальными путями, а также их роли в различных аспектах процесса 3 злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. Данная работа посвящена выявлению белков, внутриклеточных участвующих сигнальных в путей, регуляции таких как важнейших Ha-Ras-, в аспекте канцерогенеза PLD-mTORC1- и Erk1/2- ассоциированные каскады, и исследованию функциональной роли в опухолевой прогрессии и метастазировании малых ГТФаз суперсемейства Ras: RalA, RalB, Arf6, а также белка, связывающего ретиноевую кислоту, CRABP1. Идентификация и функциональный анализ новых белков и сигнальных каскадов, задействованных в регуляции опухолевой прогрессии и процесса метастазирования, является важнейшей фундаментальной задачей молекулярной биологии и экспериментальной онкологии. Цель исследования. Целью данной работы является поиск и исследование функциональной роли новых внутриклеточных сигнальных путей и белков, участвующих в регуляции процессов опухолевой прогрессии и метастазирования. Задачи исследования. 1. На экспериментальной модельной системе клеток трансформированных фибробластов сирийского хомяка исследовать влияние экспрессии онкогена H-Ras на уровень метастатической активности клеток. 2. Идентифицировать основные эффекторные белки и сигнальные пути, реализующие прометастатическую активность онкогена H-Ras. 3. Определить функциональное значение активации и подавления активности малой ГТФазы Ral для модуляции спонтанной метастатической активности клеток данной экспериментальной системы. 4. Провести сравнительный анализ влияния изоформ RalA и RalB на характеристики клеток in vivo и in vitro, ассоциированные с опухолевой прогрессией. 5. Определить важнейшие молекулы-эффекторы белков RalA и RalB, задействованные в Ral-зависимом усилении метастатической активности. Изучить влияние белков RalA/RalB на продукцию и активность ряда белков, вовлеченных в различные аспекты опухолевой прогрессии, таких как протеиназы внеклеточного матрикса, МАР киназы, белки CD24, Cav-1, Cyclin D1 и др. 6. Определить влияние экспрессии малой ГТФазы Arf6 (а также совместной экспрессии белков Arf6, RalA и RalB) на уровень спонтанной метастатической активности исследуемых клеток. Определить значение экспрессии Arf6 для пролиферативной и инвазивной активности клеток. 7. Идентифицировать сигнальные пути и молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arf6. Исследовать роль данной ГТФазы в отношении активности 4 фосфолипазы PLD, комплекса mTORC1 и его мишеней: рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4E-BP1, а также МАР киназ Erk1/2, p38 и Jnk. 8. Провести немелкоклеточного анализ рака экспрессии легкого. генов Ral Сопоставить и Arf6 в полученные клинических образцах данные клинико- с морфологическими характеристиками исследуемых образцов. 9. Определить функциональную роль экспрессии белка CRABP1 в формировании высокоагрессивного фенотипа клеток на модели трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Изучить влияние данного белка на туморогенность и метастатический потенциал клеток in vivo. 10. Исследовать экспрессию мРНК CRABP1 в образцах сарком мягких тканей. Исследовать продукцию белка CRABP1 в монофазных синовиальных саркомах. Научная новизна исследования. В ходе работы были получены результаты, свидетельствующие о значительном влиянии онкогена H-Ras на усиление метастатического потенциала трансформированных клеток, и определены основные мишени и сигнальные пути, реализующие про-метастатическую функцию H-Ras. Результаты, полученные в процессе данной работы, являются одними из первых в мире опубликованных доказательств первостепенной значимости H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути в H-Ras-зависимой стимуляции метастазирования, а также роли собственно малых Gбелков, RalA и RalB, в данном процессе. В работе первые показано, что среди двух гомологичных белков, RalA и RalB, активация RalB в большей степени усиливает спонтанную метастатическую активность клеток in vivo. Ранее аналогичных работ по сравнению влияния гомологов RalA и RalB на спонтанную метастатическую активность клеток не проводилось. При этом обнаружено, что про-метастатическая активность белка RalB осуществляется за счет взаимодействия с фосфолипазой D (PLD). Также впервые показано, что малая ГТФаза Arf6, также относящаяся к суперсемейству малых G-белков Ras, активируя PLD, потенцирует один из ключевых в аспекте канцерогенеза белков, киназу mTOR, стимулируя PLD/mTORC1/-S6K1-S6 и PLD/mTORC1/-4E-BP1 сигнальные пути, приводящие к активации комплекса инициации трансляции. Кроме того, экспрессия Arf6 стимулирует важнейшие митоген-активируемые киназы (MAP киназы) Erk1/3 и p38, причем активация последней также приводит к активации компонентов комплекса инициации трансляции. Ранее данных об Arf6-зависимой активации киназы р38 опубликовано не было. Полученные данные также впервые свидетельствуют о промитогенной функции Arf6, реализуемой за счет активации Arf6/PLD/mTOR- и Arf6/p38зависимых сигнальных путей. 5 Еще одним исследуемым в работе белком является связывающий ретиноевую кислоту белок CRABP1, значение которого в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования ранее не изучалось. Автором впервые показано, что в рамках данной экспериментальной модели экспрессия CRABP1 прямо коррелирует с уровнем спонтанной метастатической активности клеток. Более того, впервые обнаружено, что экспрессия CRABP1 усиливает туморогенность опухолевых клеток, а подавление экспрессии CRABP1 – снижает как туморогенность, так и метастатическую активность клеток. На основании полученных на экспериментальной модели результатов в рамках данной работы было впервые проведено исследование экспрессии гена CRABP1 в образцах опухолей человека мезенхимального происхождения – саркомах мягких тканей. Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования привели к обнаружению новых внутриклеточных сигнальных путей, приводящих к приобретению трансформированными клетками высоко агрессивного фенотипа и метастатической активности. Получен ряд приоритетных данных, свидетельствующих о ранее не известных функциях в опухолевой прогрессии отдельных белков (таких, как белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1) и внутриклеточных путей передачи сигналов. Так, представленные в работе результаты выявили важнейшую роль HRas/RalGDS/Ral сигнального пути в приобретении высоко-метастазного фенотипа трансформированными клетками. Также большое значение имеет обнаружение про-митогенной активности малой ГТФазыArf6 и ее участия в регуляции таких ключевых в канцерогенезе белков, как киназы mTOR и Erk1/2. Идентификация новых сигнальных путей, Arf6→PLD→mTORC1→S6K1→S6, Arf6→PLD→mTORC1→4E-BP1 и p38→S6, приводящих к активации компонентов комплекса инициации трансляции, также является крайне значимым как для понимания молекулярных механизмов регуляции mTOR и процесса инициации трансляции, так и для направленного изменения активности комплекса mTORС1 при разработке новых таргетных препаратов. Основная масса полученных результатов опубликована как в отечественных, так и в известных международных научных журналах и имеет большое теоретическое значение, существенно расширяя уровень знаний о фундаментальных аспектах молекулярных нарушений и функциональных изменений трансформированных клеток, лежащих в основе опухолевой прогрессии и метастазирования. Полученные данные будут служить основой для дальнейших фундаментальных исследований в области молекулярных механизмов канцерогенеза. Ряд данных (в частности, новые механизмы регуляции mTOR и Erk1/2, а также обнаружение протуморогенной активности CRABP1 и его убиквитарной экспрессии в синовиальных саркомах) имеет также и практическое значение, и может быть использовано в клинических исследованиях для оценки агрессивности, дифференциальной диагностики, прогнозировании течения и 6 разработки мишеней для направленной трансляционной терапии злокачественных опухолей человека. На основании полученных результатов предложено дальнейшее исследование белка CRABP1 в патогенезе синовиальных сарком (в частности, ИГХ анализ данного белка в образцах бифазных синовиальных сарком) и злокачественных фиброзных гистиоцитом в качестве потенциального диагностического и прогностического маркера. Апробация работы. Диссертация апробирована 28 октября 2013 г. на совместной научной конференции отдела трансформирующих генов опухолей, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов, лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза ФГБУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Публикации результатов исследования. По итогам исследования опубликовано 33 научные работы (21 в зарубежной печати), из них 15 статей в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Основные положения, выносимые на защиту. 1.H-Ras является стимулятором метастатической активности трансформированных фибробластов сирийского хомяка in vivo и реализует про-метастатическое действие посредством активации внутриклеточного сигнального пути: H-Ras―RalGDS―Ral. 2.Основными мишенями H-Ras, увеличивающими метастатический потенциал клеток данной экспериментальной модели, являются малые ГТФазы RalA и RalB, причем RalB обладает большей про-метастатической активностью. 3.Как RalA-, так и RalB-зависимое увеличение метастатического потенциала исследуемых клеток in vivo сопровождается сходным повышением показателей уровня малигнизации клеток in vitro, однако про-метастатическое действие RalA и RalB опосредуется различными сигнальными путями. 4.Малая ГТФаза Arf6 активирует PLD и усиливает активность киназы mTOR и ее мишеней (рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4E-BP1), а также активирует МАР киназы Erk1/2 и р38. Идентифицированы активируемые белком Arf6 сигнальные пути: PLD→mTORC1→S6K1→S6, PLD→mTORC1→4EBP1, p38→S6, приводящие к активации комплекса инициации трансляции. 5.Arf6 усиливает пролиферативную активность трансформированных фибробластов и их способность к автономному росту, однако не оказывает значимого влияния на метастатическую активность исследуемых клеток. Молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arf6, включают активацию сигнального пути PLD―mTORC1 и усиление активности р38. 7 6.Белок, связывающий ретиноевую кислоту (CRABP1) обладает протуморогенной и прометастатической активностью в отношении трансформированных фибробластов. 7. мРНК CRABP1 дифференциально экспрессируется в злокачественных опухолях мягких тканей в зависимости от гистологического типа опухоли. Белок CRABP1 убиквитарно и на высоком уровне экспрессирован в монофазных синовиальных саркомах. Степень достоверности результатов исследования. Представленная работа выполнена с использованием современных методов молекулярной биологии и экспериментальной онкологии. Результаты иллюстрированы рисунками, таблицами, схемами и фотографиями. Выводы вытекают из полученных результатов, Достоверность полностью доказаны результатов и адекватно обеспечивается отражают содержание использованием диссертации. современных методов исследования, наличием адекватных положительных и отрицательных контролей, проведением всех экспериментов в трех и более независимых повторах, применением современных способов статистической обработки данных. Все непосредственно изложенные в работе результаты опубликованы в ведущих отечественных и международных журналах. Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 294 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, 11 выводов, списка сокращений и списка литературы, содержащего 643 источника. Материал диссертации иллюстрирован 13 таблицами и 97 рисунками. Содержание работы Материалы и методы исследования Материалы исследования: 1.Панель клеточных линий мезенхимального происхождения — фибробластов сирийского хомяка, трансформированных штаммом Шмидт-Руппин Д вируса саркомы Рауса (система линий HET-SR), либо спонтанно трансформированных в культуре in vitro (линии STHE), принципиально отличающихся между собой по уровню органоспецифического метастазирования в легкие при введении экспериментальным животным. Панель включает: исходно низкометастазные варианты — линии HET-SR, STHE; исходно высокометастазные линии: HET-SR-1, HET-SR-8; линии, приобретшие высокометастазный фенотип в ходе селекции in vivo: HET-SR-LNM, STHE 83/20, STHE LNM8. Данная модель позволяет исследовать причины и молекулярные механизмы, определяющие различия в метастатической активности клеток единого происхождения, другими достоинствами данной модели являются возможность проведения теста на спонтанную метастатическую активность (СМА), органоспецифический характер метастазирования и использование иммунокомпетентных экспериментальных животных. 8 2.Для исследования влияния экспрессии, активации, подавления или модификации отдельных белков на исследуемые клеточные линии были использованы следующие кодирующие генетические последовательности дикого типа или несущие точечные замены: Ha-RasV12, HaRasV12G37, Ha-RasV12C40, Ha-RasV12S35, RalAG23V, RalBG23V, RalAS28N, RalAG23VD49N, RalAG23VD49E, RalAG23VΔN11, RalBG23VD49N, RalBG23VD49E, RalBG23VΔN11, Arf6Q67L, Arf6WT, Arf6T27N, Arf6N48I, CRABP1WT. Для введения данных последовательностей в клетки использовались ретровирусные векторы pLXSN, pBabe-puro, лентивирусные векторы pLV-CMV и pLKO.1-puro. Для получения псевдо-ретровирусных частиц использовали клетки GP293. Для получения псевдо-лентивирусных частиц использовали клеточную линию 293FT. 3.Клинические образцы опухолей и условно-нормальных тканей, включая немелкоклеточный рак легкого (аденокарциномы и плоскоклеточные раки) и саркомы мягких тканей (синовиальные саркомы, злокачественные гистиоцитомы, липосаркомы и злокачественные шванномы. 4.Парафиновые блоки опухолевых тканей монофазных синовиальных сарком. Методы исследования 1. Работа с культурами эукариотических клеток, фенотипирование in vitro: анализ пролиферации, подвижности, инвазивности, клоногенности, способности к неприкрепленному росту и др.). 2. Трансфекция бактериальных и эукариотических клеток. 3. Ретровирусная инфекция эукариотических клеток. 4. Лентивирусная инфекция эукариотических клеток. 5. Выделение нуклеиновых кислот из культур клеток и клинических образцов с последующим их анализом с помощью различных модификаций ПЦР (прямой ПЦР, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени). 6. Получение кДНК и молекулярное клонирование. 7. Получение малых шпилечных РНК. 8. Выделение белков из культур клеток и клинических образцов с последующим анализом методом иммуноблоттинга. 9. Анализ активности белков: субстрат-специфическая зимография, анализ фосфорилированных форм белков, анализ ГТФ-связанных форм G-белков (Pull-down assay), флуоресцентный анализ ферментативной активности фосфолипазы Д. 10. Иммуногистохимический анализ. 11. Фенотипирование клеток in vivo: анализ туморогенности (трансплантационный тест), спонтанной (СМА) и экспериментальной (ЭМА) метастатической активности. 12. Статистическая обработка результатов. Для определения значимых различий в случае сравнения двух выборок применялся двухсторонний критерий Манна-Уитни. Для определения 9 значимых различий при сравнении трех и более групп применяли критерий Крускала-Уоллиса. Расчеты производились с помощью программы GraphPad Prizm версия 5.02 (GraphPad Software Inc.) и IBM SPSS Statistics ver. 21 (IBM). Для определения статистической значимости взаимосвязи между клиническими характеристиками опухолей и экспрессией исследуемых белков использовался двухсторонний точный критерий Фишера. Уровень достоверности определялся как p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Анализ влияния онкогена H-Ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов и идентификация H-Ras-зависимых сигнальных путей, обеспечивающих усиление метастатического потенциала 1.1.Экспрессия метастатическую активированного активность онкогена H-Ras трансформированных увеличивает спонтанную фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути. Одним из основных подходов к изучению механизмов метастазирования и опухолевой прогрессии являются исследования in vitro и in vivo на экспериментальных моделях. Одна из таких моделей представляет собой систему стабильных клеточных линий общего происхождения – первичных трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка (Mesocricetus auratus). Часть линий этой системы была получена с помощью трансформации путем инфекции разными изолятами штамма Schmidt-Ruppin D (SR-D) вируса саркомы Рауса (RSV) (линии группы HET-SR). Другая группа линий была получена при спонтанной трансформации эмбриональных фибробластов в культуре in vitro (линии группы STHE) (рис. 1А). Описываемая панель линий была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина, ранее подробно охарактеризована и многократно использовалась в работах российских ученых и зарубежных коллег, посвященных исследованию процесса метастазирования. Клетки всех линий данной панели обладают типично трансформированным фенотипом и выраженной туморогенностью при подкожном введении сингенным животным, но при этом принципиально различаются по уровню органоспецифического метастазирования в легкие в тесте на спонтанную метастатическую активность (рис. 1Б). Так, в состав описываемой коллекции входят исходно высокометастазные линии, приобретшие метастатический фенотип в процессе трансформации, низкометастазные линии, а также линии, приобретшие высокий уровень метастатической активности в ходе селекции in vivo на экспериментальных животных (рис. 1А). К основным достоинствам этой модели следует отнести: а - возможность исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе различий в уровне метастазирования клеток единого происхождения; б – исследование процессов метастазирования in vivo с использованием иммунокомпетентных животных; в возможность изучения метастазирования с использованием теста на спонтанную метастатическую 10 активность (СМА). Данный тест моделирует все этапы прогрессии - возникновение первичной подкожной опухоли, интравазию и распространение опухолевых клеток по кровотоку, выживание в кровотоке, экстравазию в органы-мишени и пролиферацию в очаге вторичного роста в условиях активного противоопухолевого иммунитета. Таким образом, данная модель представляется чрезвычайно перспективной для изучения механизмов опухолевой прогрессии и обнаружения потенциальных маркеров метастазирования, поскольку позволяет наиболее адекватно моделировать процессы развития первичной опухоли и метастазирования, имеющие место в естественных условиях. Для исследования влияния Ras на СМА клеток данной экспериментальной системы мы экспрессировали последовательность H-rasV12 в составе ретровирусного вктора pLXSN, содержащую типичную мутацию, приводящую к замене глицина на валин в 12 положении, которая кодирует конститутивно-активный белок. В отобранных после селекции на антибиотике G418 клетках HET-SRH-RasV12 была проанализирована экспрессия H-Ras (рис. 2А). Далее клетки HET-SRH-RasV12, а также клетки контрольной линии HET-SRpLXSN, были тестированы на уровень СМА. Для этого исследуемые клетки вводили хомякам подкожно в концентрации 2х104. Через два месяца животных усыпляли и проводили макроскопический визуальный подсчет количества легочных метастазов. Для каждого опыта использовали 10 хомяков. Здесь и далее каждый эксперимент проводили в трех независимых повторах. Рис. 1.А. Схема получения используемых в работе клеточных линий; Б. Схема анализа спонтанной метастатической активности (СМА) клеток in vivo. 11 Рис. 2. А. Анализ экспрессии H-Ras методом Вестерн блот гибридизации. Б. Сравнение СМА линий HET-SRH-RasV12 и контрольной линии; приведены средние значения количества метастазов на одного хомяка (ΔСМА); В. Фотографии легких экспериментальных животных через 8 недель после введения клеток HET-SR H-RasV12. Результаты анализа СМА здесь и далее приводятся в виде среднего значения количества метастазов в легких на одного хомяка (параметр ΔСМА). Введение H-RasV12 в линию HET-SR вызвало увеличение ΔСМА со значения 1,7 (контроль) до ΔСМА = 107,2 (рис 2Б). Это означает, что экспрессия активированной формы H-Ras усиливает метастатическую активность исследуемой линии почти на два порядка. Для идентификации H-Ras-ассоциированных сигнальных путей, ответственных за усиление метастатической активности клеток, мы использовали так называемые эффекторные мутанты активированного H-rasV12. Благодаря точечным аминокислотным заменам в эффекторном домене белка H-RasV12, эти мутанты не способны взаимодействовать с отдельными эффекторами. В данном случае дефектные белки были не способны к связыванию двух из трех основных (Raf, PI3K или RalGDS) эффекторов. Гиперэкспрессия в клетках каждой из таких последовательностей за счет блокирования взаимодействия с двумя мишенями значительно активирует сигнальные пути, которые проходят через неблокированные эффекторы. Схематично функциональная активность используемых эффекторных мутантов белка Н-Ras в отношении белков-мишеней представлена в таблице 1. Последовательности мутантных форм H-Ras в ретровирусном векторе pLXSN были трансдуцированы с помощью ретровирусной инфекции в низкометастазную линию HET-SR. В полученных после отбора клетках HET-SRH-RasV12, HET-SRH-RasV12S35, HET-SRH-RasV12G37 и HET-SRH-RasV12C40 была проведена проверка экспрессии белка H-Ras методом вестерн блот анализа (рис 3А). Как видно на рисунке 3Б, введение конструкций, экспрессирующих H-RasV12S35 и H-RasV12C40, достоверно не изменило СМА по сравнению с контролем – линией HET-SR, экспрессирующей «пустой» вектор: значения ΔСМА составили 1,8 и 1,0 соответственно. 12 Аминокислотные замены в Способность взаимодействовать с эффекторном домене белка H- эффекторами RasV12 Raf PI3K RalGDS H-RasV12 (Gly→Val) + + + H-RasV12S35 (Ser→Tre) + - - H-RasV12C40 (Сys→Tyr) - + - H-RasV12G37 (Gln→Gly) - - + Таблица 1. Используемые мутантные формы белка H-Ras. В линии HET-SRH-RasV12G37 метастазирование статистически значимо отличалось от контрольной группы (p<0,05). При этом значение СМА увеличилось почти на два порядка по сравнению с клетками контрольной линии и оказалось на уровне СМА клеток линии HET-SRHRasV12. Рис. 3. А. Экспрессия белка H-Ras в производных линии HET-SR с различными мутантными формами H-Ras. Приведены значения денситометрического обсчета разницы в экспрессии (по сравнению с контрольной линией) Б. Анализ СМА соответствующих производных линий. Поскольку мутант H-RasV12G37 преимущественно проводит сигнал в направлении RalGDS, можно предположить, что в данной модели именно RalGDS является ключевым эффектором H-Ras, опосредующим его про-метастатическую активность. RalGDS является основным фактором обмена нуклеотидов малой ГТФазы Ral. 1.2 Роль малой ГТФазы RalА в H-Ras-зависимой стимуляции метастатической активности клеток. Для проверки гипотезы о том, что именно H-Ras-RalGDS-Ral каскад является основным сигнальным путем, реализующим про-метастатическое влияние Ras в данной модели, далее мы исследовали участие малой ГТФазы Ral в метастатической активности клеток. Мы сравнили уровень активности белка RalA в клетках, экспрессирующих мутантный H-RasV12G37, с таковым в родительских клетках (рис 4А, приведен в следующем подразделе для того, чтобы не 13 разделять блоты на иллюстрации). Уровень активности RalA определяли методом, основанном на методике “pull down assay”, с помощью коммерческого набора реактивов для определения активности RalA (“Ral Activation Assay”, Upstate Biotech). Метод основан на иммунопреципитации RalA c его эффектором, белком RalBP1, с которым он образует комплекс, находясь в активном ГТФ-связанном состоянии. Проводимый после преципитации вестерн блот анализ выявляет только активную форму RalA. На рисунке 4А видно, что экспрессия мутантного H-RasV12G37 приводит к увеличению активности RalA. Далее для проверки роли RalA в обнаруженном эффекте стимуляции СМА при экспрессии эффекторного мутанта HRasV12G37 мы попытались «cкомпенсировать» H-Ras-зависимое повышение метастазирования в линии HET-SRH-RasV12G37 подавлением активности Ral с помощью экспрессии в клетках доминантно-негативного мутанта RalA, RalAS28N. Последовательность RalAS28N была переклонирована в лентивирусный вектор pLV-CMV и трансдуцирована в клетки с помощью лентивирусной инфекции. На иллюстрациях и далее в тексте клеточные линии, экспрессирующие доминантно-негативный мутант RalAS28N, обозначены как Ral(-). Анализ активности RalA показал, что экспрессия доминантно-негативной формы RalA снижает активность этого белка в клетках HET-SRH-RasV12G37. Анализ СМА полученной клеточной линии - НET-SRH-RasV12G37-RalA(-) - выявил резкое снижение метастатической активности: значение ΔСМА снизилось с уровня контрольной линии НET-SRH-RasV12G37pLV-CMV ΔСМА =112 до ΔСМА=7 (рис. 4В). То есть подавление активности RalA в клетках с активированным H-Ras-RalGDS сигнальным путем привело к реверсии метастазирования до уровня исходных клеток HET-SR (р<0,05). Таким образом, можно заключить, что именно активность белка Ral, а не какого-либо другого потенциального эффектора RalGDS, обуславливает повышение метастазирования клеток НET-SRH-RasV12G37. 1.3 Значение активации RalА в усилении метастатической активности фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса, спонтанно трансформированных фибробластов и трансформированных фибробластов, прошедших селекцию in vivo. Для проверки значения RalA для метастатической активности клеток исследуемой экспериментальной модели мы, в первую очередь, проанализировали уровень экспрессии и активности эндогенного RalA в высоко-метастазных (В/М) клетках. Для сравнения были выбраны две В/М линии: исходно В/М линия HET-SR8 и линия HET-SR-LNM, приобретшая высокую СМА при селективном отборе на животных. В качестве контроля использовали линию HET-SRpLXSN (негативный контроль) и линию НET-SRH-RasV12G37 (позитивный контроль, в котором RalА был активирован под воздействием гиперэкспрессии HRasV12G37) (рис. 4А). В результате было обнаружено, что при равном количестве белка 14 RalA во всех клеточных линиях, в культурах HET-SR8 и HET-SR-LNM, как и в линии HETSR-H-RasV12G37, уровень экспрессии активного RalA выше, чем в линии HET-SRpLXSN. Это свидетельствует о том, что эндогенный RalA активирован в обеих В/М линиях клеток наравне с клетками, в которых активность RalA увеличилась вследствие экспрессии мутанта H-RasV12G37. Важно отметить, что в линии HET-SR-LNM в ходе селекции in vivo параллельно с усилением СМА увеличилось количество активной формы RalA. Чтобы проверить, насколько уровень СМА клеточных линий HET-SR8 и HET-SR-LNM зависит от активности эндогенного RalA, мы экспрессировали в них RalAS28N в составе лентивирусного вектора pLV-CMV. Как видно на рисунке 4Б, повышение общего количества RalA в клетках, экспрессирующих его доминантно-негативный мутант, сопровождалось снижением количества активной формы данного белка. Далее в производных обеих линий был исследован уровень спонтанной (рис. 4В) и экспериментальной (рис. 4Г) метастатической активности (ЭМА), поскольку исходно обе исследуемые линии обладали высокими показателями активности в обоих тестах. Рис. 4. Исследование активности RalA и влияния подавления активности RalA на спонтанную и экспериментальную метастатическую активность клеток. А. Анализ продукции и количества активной формы белка RalA в исходных линиях с разным уровнем СМА и в клетках НET-SRHRas V12G37 со стимулированным H-Ras/RalGDS сигнальным путем. Б. Анализ продукции и количества активной формы белка RalA в клетках, экспрессирующих доминантно-негативный мутант RalAS28N (обозначены как Ral(-)). В. Влияние подавления активности RalA на СМА клеток. Г. Влияние подавления активности RalA на ЭМА клеток. 15 Линия HET-SR-LNM-Ral(-) продемонстрировала существенное снижение обоих показателей – ЭМА (с ΔЭМА>300 до ΔЭМА=17,2, p < 0,01) и СМА (с ΔСМА=143 до ΔСМА=4,4, р < 0,001). В производной линии HET-SR8RalA(-) по сравнению с контрольной HET-SR8pLV-CMV также принципиально снизились как СМА (со значения ΔСМА=130 до ΔСМА=5), так и ЭМА (со значений ΔЭМА>300 до ΔЭМА=5,6) (p < 0,01). Провести точный подсчет количества метастазов в легких, превышающего значение 300, практически не представлялось возможным, поэтому здесь указываются приблизительные значения. Из полученных результатов можно заключить, что уровень активного RalA играет принципиальную роль как в поддержании высокой метастатической активности, так и в формировании В/М фенотипа в ходе in vivo селекции. Далее мы исследовали влияние экспрессии экзогенного активного RalA на метастатический потенциал Н/М клеток. Для этого мы использовали последовательность ralA крысы с точечной мутацией, кодирующую конститутивно активный (связанный с ГТФ) белок с аминокислотной заменой глицина на валин в 23 положении (G23V) в составе ретровирусного вектора pLXSN. Трансдукцию вектора в Н/М клетки HET-SR проводили методом ретровирусной инфекции. Результаты анализа показали, что количество активной формы RalA в линии HET-SR RalA-G23V было больше, чем в родительской линии, и соответствовало уровню линии НET-SR H-Ras V12G37 (рис. 5А). Анализ метастатической активности клеток HET-SRRalAV23 выявил, что экспрессия конститутивно активной формы RalA статистически достоверно повышает СМА линии HET-SR: со значения ΔСМА=1,7 до ΔСМА=145 (p < 0,05) (рис. 5Б). Рис. 5 А. Анализ уровня продукции белка RalA и количества его активной формы в линиях HET-SRpLXSN, HET-SRH-RasV12G37 и HET-SR RalA-G23V. Б. Анализ СМА тех же линий. 16 Аналогичные результаты, свидетельствующие о значении белка RalA для СМАбыли получены и на системе спонтанно трансформированных в культуре in vitro эмбриональных фибробластов хомяка – панели линий STHE (рис 1А). 2.Сравнение роли гомологичных белков RalA и RalB в приобретении трансформированными фибробластами высоко агрессивного фенотипа и метастатической активности 2.1 RalB в большей степени, чем RalA, стимулирует спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов. Для сравнения влияния активности белков RalA и RalB на СМА клеток описанной выше экспериментальной модели необходимо было получить стабильные производные линии HETSR, экспрессирующие активированные формы данных белков. Последовательности конститутивно активных мутантов RalA (RalAG23V) и RalB (RalВG23V) были переклонированы из вектора для транзиентной трансфекции pSRα в ретровирусные векторы pLXSN и pBabe-puro соответственно. Необходимость использования различных ретровирусных векторов (с генами устойчивости к различным антибиотикам – гентицину (G418) и пуромицину) для экспрессии генов RalА и RalB диктовалась дальнейшими планами по осуществлению совместной экспрессии в одной и той же линии клеток обеих изоформ Ral. Последовательности были экспрессированы в клетках HET-SR методом ретровирусной инфекции. Проверка экспрессии белков RalA и RalB представлена на рисунке 6. Рис. 6. Вестерн блот анализ экспрессии белков RalA и RalB в производных линии HET-SR и денситометрический анализ экспрессии в сравнении с контрольными линиями, экспрессирующими соответствующие «пустые» векторы. 17 В отличие от данных СМА, представленных выше, где приводились результаты визуального макроскопического подсчета метастазов, здесь и далее количество легочных метастазов определяли гистологически. Для этого фиксированные в формалине легкие экспериментальных животных заключались в парафиновые блоки, с которых получали серийные ультратонкие срезы (72 среза с одной и той же доли каждого легкого). Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, после чего проводили микроскопический подсчет метастазов с одной доли легкого каждого животного. Результаты анализа показали, что обе линии клеток, экспрессирующие изоформы Ral, статистически значимо отличались от соответствующих контролей по уровню СМА. При этом экспрессия активированного RalB привела к значимо большему увеличению СМА, чем экспрессия активированного RalA. Так, значение ΔСМА клеток, экспрессирующих RalB, составило 63,7 при аналогичном значении 7,2 для клеток контрольной линии HET-SR pBabe, в то время как значение ΔСМА клеток, экспрессирующих RalА, составило 20,4 при значении ΔСМА 4,2 для клеток контрольной линии HET-SR pLXSN (рис.7). Рис. 7. Сравнение ΔСМА клеток, экспрессирующих белки RalA и RalB. *p<0.05 2.2 Совместная экспрессия RalA и RalB не приводит к дополнительному усилению СМА. Чтобы понять, насколько два гомолога Ral кооперируют в стимуляции метастатической активности клеток, мы проанализировали эффект одновременной экспрессии RalA и RalB на уровень СМА клеток HET-SR. Для этого мы экспрессировали активированный мутант RalBG23V в составе ретровирусного вектора pBabe-puro в клетках HET-SR RalA, уже экспрессирующих активированную форму RalA, с помощью ретровирусной инфекции. Анализ СМА проводили по описанной выше методике. В качестве контроля использовали линию клеток HET-SR RalApBabe. СМА полученных клеток достоверно не изменилась по сравнению с контрольным уровнем и, соответственно, совместная экспрессия двух белков Ral не оказала синергичного эффекта на метастатическую активность клеток. 18 2.3 Сравнение влияния белков RalA и RalB на характеристики роста, подвижности и инвазивной активности исследуемых клеток. Для выявления Ral-зависимых фенотипических изменений клеток, ассоциированных с увеличением метастатического потенциала, был проведен сравнительный анализ влияния белков RalA и RalB на основные характеристики роста клеток в культуре и in vivo. Исследование динамики пролиферации клеток in vitro, а также туморогенности (минимальной прививочной дозы, инициирующей рост подкожного ксенографта), динамики роста и размера формируемых первичных опухолей не выявило Ral-зависимых изменений. Также не было обнаружено влияния экспрессии гомологов Ral на способность клеток к неприкрепленному росту. В тоже время, было выявлено влияние белков Ral на способность к автономному росту в тесте на клоногенность. Способность к формированию колоний из единичных клеток отражает снижение потребности опухолевых клеток в ростовых факторах, секретируемых клетками микроокружения. Таким образом, рост в условиях сильно разреженной популяции является одной из важнейших характеристик автономного роста, присущих наиболее агрессивным клеткам. Статистический анализ полученных результатов выявил значительное увеличение среднего размера колоний в линиях с экспрессией активных форм как RalA, так и RalB, по сравнению с соответствующими контрольными линиями (p<0,01) (рис. 8). Экспрессия RalA увеличивала размер колоний в 1,9 раза, а RalB – в 2,6 раза. Интересно, что результаты анализа данной характеристики хорошо соотносятся с данными анализа СМА, что может свидетельствовать о важности Ral-зависимого стимуляции автономного роста клеток для формирования высоко метастатического потенциала. Рис. 8. Средняя площадь колоний, формируемых клетками, экспрессирующими RalA и RalB Следующим этапом было исследование возможного участия белков Ral в приобретении инвазивных свойств. Оценку инвазивной активности in vitro проводили с использованием камер Бойдена, покрытых матригелем (искусственным аналогом внеклеточного матрикса (ВКМ). На рисунке 9А видны окрашенные кристаллическим 19 фиолетовым красителем клетки, преодолевшие покрывающий дно камеры слой матригеля и поры в мембране. Результаты анализа показали (рис. 9Б), что обе линии клеток, HET-SR RalA и HET-SR RalB, инвазируют лучше, чем соответствующие контрольные линии HET-SR-pLXSN и HET-SR-pBabe (р<0,05). Рис. 9. Анализ инвазивной активности in vitro клеток, экспрессирующих белки RalA и RalB. А. Пример окрашивания клеток в камерах Бойдена. Б. Среднее значение количества инвазировавших клеток. При этом клетки линии HET-SR RalB показали значительно большую инвазивную активность и по сравнению с клетками HET-SR RalA (р<0,05). Таким образом, оба белка способствуют усилению инвазивной способности клеток, но RalB более активен в этом отношении. Этот результат хорошо соотносится с данными анализа СМА и свидетельствует, по-видимому, о том, что про-метастатическая активность данных белков реализуется, как минимум отчасти, за счет их участия в усилении инвазивной активности клеток. Способность клеток преодолевать барьер из матригеля во многом определяется активностью секретируемых протеиназ, ремоделирующих ВКМ. К наиболее известным семействам секретируемых эндопептидаз относится семейство матриксных металлопротеаз (MMP) и система активации плазминогена, в которой большое значение в контексте канцерогенеза отводится урокиназа-подобному активатору плазминогена (uPA). Поэтому далее мы исследовали потенциальное влияние экспрессии белков RalA и RalB на активность ММР и uPA с помощью субстрат-специфичной зимографии - электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле с сополимеризованным субстратом для эндопептидаз (рис. 10). 20 Рис.10. Анализ активности секретируемых протеиназ внеклеточного матрикса в клетках, экспрессирующих RalA и RalB. А. Анализ активности ММР с желатиназной активностью. Б. Анализ активности uPA. Желатиназная и казеин-плазминогеновая зимограммы соответственно приводятся со значениями денситометрического рассчета. Для анализа использовали Активность ММР кондиционированные культуральные среды исследуемых клеток. оценивали с помощью желатиназной зимографии. Результаты денситометрического обсчета результатов анализа показали, что RalA, в отличие от RalB, увеличивает секрецию про-энзима и количество активной формы ММР-1 (рис. 10А). Анализ активности uPA проводился методом казеин-плазминогеновой зимографии. Сравнение активности данной протеиназы выявило ее значительное увеличение (в 2,8 раза) в клетках, экспрессирующих RalA (рис. 10Б). Таким образом, мы обнаружили значимые изменения в активности секретируемых протеиназ внеклеточного матрикса (ММР-1 и uPA) только в клетках HET-SR RalA. Поскольку полученные данные не объясняли обнаруженных различий в инвазивной активности между клетками, экспрессирующими RalA и RalB, мы предположили, что эти различия могут быть результатом различия клеток в способности направленному движению по градиенту ростовых факторов. Для проверки этого предположения мы использовали тест на направленную миграцию в камерах Бойдена без покрытия матригелем. Результаты анализа показали, что клетки, экспрессирующие как RalA, так и RalB, обладали значительно большей способностью к направленной миграции, чем соответствующие контрольные клетки (p<0,05) (рис.11). Более того, мы обнаружили, что RalB значительно сильнее стимулирует направленную миграцию, чем RalA (p<0,05). Эти данные хорошо согласуются с результатами исследования инвазивной активности клеток, а также с результатами анализа СМА. 21 Рис.11. Анализ направленной миграции исследуемых клеток в камерах Бойдена. А. Пример эксперимента Б. Среднее количество мигрировавших клеток по результатам трех независимых повторов. 2.4 Анализ изменения экспрессии белков: Cyclin D1, CD-24, Cav-1, а также активности белков Erk1/2, Jnk, p38 и Stat3 под влиянием экспрессии экзогенных белков RalA и RalB. Одной из задач данного исследования было проведение сравнительного анализа влияния гиперэкспрессии фосфорилирования активированных ряда белков, RalA и RalB на ассоциированных уровень с экспрессии опухолевой или статус прогрессией и метастазированием. Результаты анализа экспрессии поверхностного высоко-гликозилированного белка CD24, который ассоциирован с метастазированием, (в частности, за счет усиления адгезии опухолевых клеток к эндотелию сосудов), выявили более чем трехкратное повышение его продукции в клетках HET-SR RalA по сравнению с HET-SRpLXSN. Таким образом, RalA, в отличие от RalB, способствует усилению экспрессии CD24. Сравнение уровня белка CyclinD1 выявило, что обе изоформы Ral усиливают его продукцию, при этом RalB-зависимое увеличение белка CyclinD1 в 2,5 раза превышало RalA-зависимое изменение. Учитывая литературные данные о функциональной роли CyclinD1 в качестве мотогена (помимо известной промитогенной активности), эти данные хорошо согласуются с Ral-зависимым усилением подвижности и с метастатической активностью клеток. Результаты сравнения экспрессии компонента липидных рафтов, белка Cav-1, в исследуемых клетках показали более, чем трехкратное снижение его продукции в клетках, экспрессирующих RalB. Экспрессия RalA не повлияла на уровень Cav-1. Таким образом, снижение количества Cav-1 в исследуемых клетках коррелирует с более агрессивным метастатическим потенциалом. Анализ влияния белков RalA и RalB на активность МАР киназ не выявил существенных изменений в экспрессии и статусе фосфорилирования киназ Erk1/2 и р38. В то же время, уровень активирующего фосфорилирования киназы Jnk1 (Thr180/Tyr182) был увеличен в клетках, экспрессирующих как RalA, так и RalB. Сравнительный анализ продукции и уровня фосфорилирования (по Tyr705) транскрипционного фактора Stat3 22 выявил значительное и сопоставимое между собой увеличение активной формы белка Stat3 в клетках, экспрессирующих как RalA, так и RalВ . 2.5 Определение эффекторных мишеней белков RalA и RalB, взаимодействие с которыми необходимо для реализации их про-метастатической функции. Для определения Ral-зависимых сигнальных путей, реализующих обнаруженную нами про-метастатическую активность Ral, последовательности, кодирующие мутантные варианты белков RalA и RalB с аминокислотными заменами или делециями, блокирующими взаимодействие с одной из мишеней, были экспрессированы в линии HET-SR. Таким образом анализировали вклад одного из эффекторов (точнее, его потери) в изменение СМА. Для исследования были выбраны основные эффекторы белков Ral: Ral связывающий белок RalBP1, компонент комплекса экзоциста Sec5 и фосфолипаза PLD. В таблице 2 приведены использованные варианты белков Ral : Аминокислотные замены в Способность взаимодействовать с эффекторами белках RalA и RalB PLD RalBP1 Экзоцист RalA/B V23 (Gly→Val) + + + - + + RalA/B V23 D49N(Asp→Asn) + - + RalA/B V23 D49E (Asn→Glu) + + - RalA/B V23 delta N11 (делеция 11 N-концевых а.о.) Таблица 2. Исследованные мутантные формы белков RalA и RalB Мутантные последовательности RalA были переклонированы из исходного вектора pRK5 в ретровирусный вектор pLXSN, а RalB - из вектора pSRα в ретровирусный вектор pBabe-puro. Результаты ретровирусной инфекции проверялись при помощи Вестерн-блот анализа (рис.12). Рис. 12. Вестерн-блот анализ экспрессии мутантных форм RalA и RalB в полученных клеточных линиях. Далее клетки полученных производных и контрольной линий вводили в количестве 2 × 104 подкожно экспериментальным животным для оценки СМА. Результаты гистологически 23 верифицированного микроскопического подсчета метастазов в виде среднего значения количества метастазов на одну долю легкого одного животного представлены на рисунке 13. Было обнаружено, что все эффекторные мутанты RalA, наряду с активированной формой без эффекторных мутаций, значимо (p < 0,05) повышают, хотя и в разной степени, СМА клеток по сравнению с контрольными клетками, экспрессирующими «пустой» вектор. В то же время, СМА клеток, экспрессирующих RalB V23 delta N11, оказалась значительно ниже СМА клеток, экспрессирующих RalB V23, и практически не отличалась от СМА клеток контрольной линии. Это означает, что утрата возможности взаимодействовать с PLD приводит к потери прометастатической активности белка RalB. Полученные результаты свидетельствуют о различиях в молекулярных механизмах, опосредующих RalA- и RalB-зависимое усиление СМА, и демонстрируют, что PLD является основным партнером RalB в реализации его прометастатической активности. Рис. 13. Сравнение СМА клеток, экспрессирующих различные эффекторные мутанты RalA и RalB. *p<0,05 3. Роль малой ГТФазы Arf6 в пролиферации, инвазии и активации ключевых в аспекте канцерогенеза внутриклеточных сигнальных путей. 3.1 Сравнение влияния экспрессии экзогенного Arf6, а также его совместной экспрессии с белками RalA/RalB на метастатическую активность клеток На основании изложенных в предыдущей главе результатов, указывающих на необходимость взаимодействия белка RalB с фосфолипазой PLD для осуществления RalBзависимой стимуляции СМА, а также на основе литературных данных, свидетельствующих о том, что активация PLD достигается с помощью совместного действия малых ГТФаз Ral и Arf6, мы предположили, что гиперэкспрессия белка Arf6 (одного или в сочетании с белками RalA/B) так же (или в большей степени) может приводить к изменению метастатического потенциала клеток. Для анализа влияния Arf6 на СМА и другие характеристики, определяющие злокачественный потенциал исследуемых клеток, были получены производные линии HET-SR с 24 конститутивной экспрессией различных вариантов гена Arf6 человека. Приведенные в таблице 3 последовательности Arf6, меченые гемагглютинином, были переклонированы в ретровирусный вектор pLXSN-neo из панели векторов pSRα. Аминокислотная замена Функциональное значение замены Arf6Q67L (Gln→Leu) конститутивная связь с ГТФ Arf6 WT дикий тип Arf6N48I (Asn→Ile) отсутствие взаимодействия с PLD Arf6T27N (Thr→Asn) конститутивная связь с ГДФ Таблица 3. Последовательности Arf6, трансдуцируемые в линию HET-SR. Результаты инфекции проверялись при помощи вестерн блот анализа с антителами к Arf6 и HA (рис.14А и 14Б). Необходимо отметить, что из-за гемагглютининовой метки экзогенные формы белка Arf6 обладали большей молекулярной массой по сравнению с эндогенным Arf6. Рис. 14. Вестерн блот анализ экспрессии экзогенного Arf6 в клеточных линиях производных HET-SR. А. Антитела к Arf6. Б. Антитела к HA. Сравнение СМА линий, экспрессирующих различные мутантные формы Arf6, с контрольной линией HET-SRpLXSN показало, что ни одна из форм Arf6 не оказала значимого влияния на метастатический потенциал клеток. Также не было выявлено изменений СМА клеток, экспрессирующих совместно активированные RalA или RalB с активной или доминантно-негативной формами Arf6. 3.2 Arf6-зависимая стимуляция пролиферации и активация фосфолипазы D На следующем этапе исследования мы протестировали влияние экспрессии Arf6, ее активации, а также способности к взаимодействию с мишенью PLD на основные характеристики клеток в культуре in vitro, ассоциированные с усилением злокачественного потенциала. Анализ динамики роста (рис.15) показал, что экспрессия Arf6 дикого типа и активированной формы, в отличие от мутанта, не связывающего PLD, приводит к достоверному увеличению пролиферации клеток HET-SR (р<0,05 для сравнения обеих линий с контролем). Таким образом, нами впервые показано, что экспрессия Arf6 увеличивает 25 пролиферативную активность клеток, и эта про-митогенная активность опосредуется PLDзависимым сигнальным путем. Рис. 15. Динамика роста производных клеток HET-SR, экспрессирующих различные формы Arf6. Каждая точка – среднее значение по результатам трех независимых повторов ± стандартное отклонение. Результаты анализа клоногенности показали увеличение количества колоний в линиях с экспрессией всех мутантных форм Arf6, а также Arf6 дикого типа (p<0,05). Таким образом, экспрессия Arf6 вне зависимости от активности и взаимодействия с PLD усиливала способность клеток к автономному росту. Инвазивную активность определяли в камерах Бойдена, покрытых матригелем. Результаты анализа (рис.16) показали, что клетки HET-SR Arf6N48I обладали статистически достоверно большей инвазивной активностью по сравнению с контрольной линией. При этом остальные производные линии не отличались от контрольных по этому параметру. Рис. 16. Анализ инвазивной активности клеток in vitro. А. Сравнение количества инвазировавших клеток * - р<0,05; Б. Характерный пример фотографии внешней стороны мембраны камеры Бойдена после проведения теста. 26 Анализ активности движения по градиенту ростовых факторов определяли в камерах Бойдена. Как видно на рисунке 17, единственной культурой, которая продемонстрировала значимое (p<0,05) увеличение направленной миграции, оказалась линия HET-SRN48I. Этот результат оказался неожиданным, однако хорошо согласовывался с данными, полученными в тесте на инвазивность in vitro. Рис. 17 Анализ направленного движения клеток. А. Сравнение количества мигрировавших клеток. * - р<0,05; Б. Характерный пример фотографии внешней стороны мембраны В связи с полученными данными по инвазивной активности, представлялось интересным проанализировать влияние экспрессии различных форм Arf6, и в особенности Arf6N48I, на секрецию протеиназ ВКМ, в частности, матриксных металлопротеиназ (ММР) и урокиназаподобного активатора плазминогена (uPA). При этом оказалось, что активность MMP1, ММР2 и MMP9 не отличалась между исследованными клеточными линиями (рис.18А). Таким образом, экспрессия различных форм Arf6 практически не повлияла на активность ни одной из исследованных секретируемых ММР. В то же время, в клетках HET-SR Arf6N48I активность uPA оказалась значительно повышена по сравнению с остальными линиями (р<0,05) (рис.18Б). Это позволяет предположить, что усиление инвазивных свойств линии HET-SR Arf6N48I in vitro может объясняться увеличением протеолитической активности uPA, позволяющей клеткам этой линии более активно расщеплять матригель. 27 Рис. 18. Анализ активности секретируемых протеиназ внеклеточного матрикса. А. Анализ активности ММР; Б. Анализ активности uPA с денситометрическим анализом результатов сравнения с контрольной линией. * - р<0,05. 3.3 Идентификация Arf6/PLD/mTORC1/S6K1/S6 и Arf6/PLD/mTORC1/4E-BP1 сигнальных путей, приводящих к Arf6-зависимой активации комплекса инициации трансляции Полученные данные о влиянии Arf6 на пролиферативную активность исследуемых клеток поставили вопрос о молекулярных механизмах промитогенной активности данного белка, а необходимость взаимодействия с PLD послужила отправной точкой при поиске дальнейших мишеней и сигнальных путей. На первом этапе уровень активности PLD был проанализирован во всех имеющихся производных линиях, экспрессирующих различные варианты Arf6 с помощью коммерческого набора для флуоресцентного определения активности PLD (Amplex Red Phospholipase D assay kit, Molecular probes, Invitrogen) (рис.19А). Рис. 19 А. Анализ активности PLD в клеточных линиях, экспрессирующих различные формы Arf6, * - р<0,05; Б. Анализ продукции белка PLD методом вестерн блот анализа; в качестве контроля нанесения здесь и далее использовались антитела к β-актину. 28 Результаты анализа показали, что экспрессия активной формы Arf6 (рис. 19А) статистически значимо увеличивала активность PLD по сравнению с контрольной линией HETSR pLXSN (p < 0,05), что говорит о том, что активность PLD зависит от ГТФ-связанного состояния Arf6. При этом уровень продукции белка PLD в исследуемых клетках не отличался (рис. 19Б). Клетки HET-SRArf6N48I демонстрировали уровень активности PLD, аналогичный контрольной линии, что подтверждает необходимость взаимодействия Arf6 с PLD для ее активации. На основании отдельных литературных данных о механизмах активации mTOR мы предположили, что Arf6-зависимая стимуляция активности PLD может приводить к активации данной киназы в составе комплекса mTORC1. В первую очередь, мы исследовали уровень активной S6K1 (статус фосфорилирования остатка Thr389, который является общепринятым критерием активности mTORС1). Вестерн блот анализ исследованных клеточных линий показал, что, хотя уровень экспрессии S6K1 был равным во всех исследованных клеточных линиях, уровень фосфорилированной формы S6K1 был в четыре раза повышен в линии HET-SR Arf6Q67L (рис. 20). Рис. 20. Анализ количества активной формы и продукции белка S6K1 в клетках, экспрессирующих различные формы Arf6. Приведен денситометрический анализ результатов сравнения с контролем, * - р<0,05 Чтобы подтвердить, что Arf6-зависимая активация S6K1 происходит по PLD-mTORC1 зависимому пути, мы подавляли активность каждой из молекул и анализировали влияние этого подавления на уровень фосфорилирования S6K1. Для этого клеточные линии инкубировали c селективными ингибиторами PLD и mTORC1 комплекса, бутанолом-1(1%) и рапамицином (100 нМ) соответственно (рис.21). Как видно на рисунке 21, обработка рапамицином, также как и бутанолом-1, приводит к снижению количества активной формы этой киназы. Таким образом, мы показали, что Arf6 активирует S6K1 посредством активации Arf6→PLD→mTOR→S6K1 сигнального пути. Поскольку в настоящее время считается, что основным путем активации mTOR является PI3K-Akt сигнальный каскад, мы проверили возможность влияния Arf6 на активацию данного сигнального пути, для чего провели анализ фосфорилирования, активирующего Akt (Ser473). При этом мы обнаружили, что количество фосфорилированной 29 киназы Akt, также как и общий уровень белка Akt, не изменился в Arf6-экспрессирующих клеточных линиях по сравнению с контрольной линией (рис. 21Г). Этот результат подтверждает, что Arf6 активирует киназу S6K1 независимо от PI3K-Akt сигнального пути. Рис. 21. Количество активной формы киназы S6K1 в зависимости от подавления активности PLD и mTORC1. А. Проверка подавления активности PLD при инкубации клеток с бутанолом-1. Б. Анализ количества активной формы S6K1 в зависимости от обработки бутанолом-1. В. Анализ количества активной формы S6K1 в зависимости от инкубации клеток с рапамицином. Г. Анализ количества активной формы и продукции белка Akt * - р<0,05. Для определения дальнейшего сигнального пути и поиска мишеней, участвующих в Arf6-зависимой стимуляции пролиферации, мы исследовали статусы фосфорилирования эффекторов mTOR сигнального пути: белка 4E-BP1(мишени mTOR) и рибосомального белка S6 (мишени S6K1). Оба белка участвуют в mTOR-зависимом контроле инициации трансляции. Белок 4E-BP1 функционирует как репрессор “cap-зависимой” трансляции, поскольку связывает Фосфорилирование эукариотический Thr70 считается фактор инициации необходимым трансляции условием для 4E (eIF4E). необратимого высвобождения 4E-BP1 из комплекса с eIF4E. Рибосомальный белок S6 (или rpS6) является компонентом 40S субъединицы рибосом и одной из основных мишеней активированной S6K1 и также участвует в контроле инициации трансляции. Предполагается, что фосфорилирование четырех остатков серина Ser235/236 и Ser240/244 может осуществляться как рибосомальными киназами группы RSK, так и S6K1 киназой, хотя данные относительно фосфорилирования 30 каждого из этих сайтов достаточно противоречивы. Чтобы проследить дальнейшие изменения в Arf6-зависимой активации PLD-mTOR сигнального пути, мы исследовали уровень фосфорилирования белков 4E-BP1 (по остаткам Thr37/46 и Thr70), и S6 (по остаткам Ser235/236 и Ser240/244) (рис. 22). Рис. 22. Влияние экспрессии различных форм Arf6 на активность мишеней mTORC1.А. Анализ статуса фосфорилирования 4E-BP1. Б. Анализ статуса фосфорилирования rpS6. Приведен денситометрический анализ сравнения количества каждой из фосфорилированных форм белков с контрольной линией * - р<0,05 Анализ показал, что все клеточные линии, включая родительскую культуру HET-SR, отличались высоким уровнем фосфорилирования белка 4E-BP1 по остаткам Thr37/46, и экспрессия различных форм Arf6 принципиально не повлияла на этот показатель. В то же время, уровень фосфорилирования Thr70 оказался значительно выше в клетках, экспрессирующих Arf6Q67L. Анализ rpS6 также показал статистически значимое повышение уровня фосфорилирования по сайту Ser235/236 в линии HET-SRArf6Q67L. В то же время, 31 фосфорилирование сайта Ser240/244 осталось неизменным во всех исследуемых линиях. Полученные результаты подтвердили наше предположение о том, что Arf6 посредством активации PLD может стимулировать mTOR – зависимый сигнальный путь и активировать важнейшие белки, участвующие в процессе инициации трансляции. Роль идентифицированного сигнального пути Arf6→PLD→mTORC1→S6K1→S6/mTORC1→4EBP1 в описанном выше эффекте Arf6-зависимой стимуляции пролиферации была проанализирована в последующих экспериментах. 3.4 Влияние Arf6 на активацию МАР киназ Erk1/2, Jnk и p38. Arf6 активирует МАР-киназы Erk1/2 и р38, и эта активация зависит от взаимодействия Arf6 с PLD. Поскольку обнаруженный нами эффект стимулирования пролиферации наблюдался под воздействием как активированной формы Arf6, так и белка дикого типа, а активация PLD→mTORC1 сигнального пути осуществлялась только активированной формой Arf6, мы предположили, что про-митогенная функция Arf6 опосредуется и другими белками. Предполагаемым кандидатом на роль посредника Arf6 в стимуляции пролиферативной активности клеток была широко известная в контексте канцерогенеза МАР киназа Erk1/2. Для прояснения возможности Arf6-зависимой активации Erk1/2 мы сравнили уровень фосфорилирования данной киназы по сайту Tyr202/204, который является показателем ее активации (рис. 23А). Рис. 23 А. Анализ продукции белка и количества активной формы киназы Erk1/2. Б. Анализ уровня фосфорилирования киназы р38. Приведен денситометрический анализ сравнения количества фосфорилированных формы белков с контрольной линией. * - р<0,05. Результаты выявили достоверное увеличение (р<0,05) количества фосфорилированной формы Erk1/2 как в клетках HET-SR Arf6Q67L (в 3,5 раза), так и в клетках HET-SR Arf6WT (в 3 32 раза) по сравнению с контрольной линией. В отличие от этих линий, в клетках HET-SR Arf6N48I уровень фосфорилирования Erk1/2 был даже ниже, чем в контрольной линии, что указывает на PLD-зависимый путь активации Erk1/2. Мы проверили возможность влияния Arf6 на статус фосфорилирования двух других киназ из параллельных МАР-киназных сигнальных каскадов, Jnk1 и p38. Результаты анализа показали отсутствие Arf6-зависимых изменений в уровне фосфорилирования Jnk1 и значительное увеличение фосфорилирования киназы р38 в клетках, экспрессирующих как активированную форму (4-х кратное увеличение), так и дикий тип Arf6 (2-х кратное увеличение) (рис. 23Б). Как и в случае с киназой Erk1/2, в клетках HET-ST Arf6N48I уровень фосфорилированной р38 был даже несколько ниже, чем в контрольной линии клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что Arf6 активирует МАР киназы Erk1/2 и p38, при этом активация Arf6 дает лишь слабый дополнительный эффект относительно действия Arf6 дикого типа, в то время как возможность взаимодействия с PLD является принципиальной. 3.5.Молекулярные механизмы Arf6-зависимой стимуляции пролиферации включают активацию комплекса mTORC1 и МАР киназы р38 В результате описанных выше экспериментов нами обнаружены три сигнальных пути и три белка, которые могут опосредовать промитогенную функцию Arf6, а именно, mTORC1 (посредством активации белков-мишеней S6K1-S6 и 4E-BP1), МАР киназ Erk1/2 и р38. Следующим этапом нашей работы было исследование значения каждого из этих сигнальных путей в реализации эффекта стимуляции пролиферации. Для решения этой задачи клетки линии Arf6Q67L, которые показали наибольший эффект изменения динамики пролиферации, инкубировали в среде с добавлением селективных ингибиторов, специфичных для каждого из белков. Для подавления mTORC1, Erk1/2 и p38 использовали, соответственно, рапамицин (100nM), CI-1040 (2 mM) и SB-SB203580 (25 mM). Анализ действия ингибиторов в разной концентрации на количество активной формы (уровень активирующего фосфорилирования) Erk1/2 и p38 методом вестерн блотинга представлен на рисунке 24А. График динамики пролиферации, представленный на рисунке 24 Б, показывает, что подавление mTORC1-S6K1- и (в меньшей степени) р38-зависимого сигнальных путей достоверно снижает пролиферативную активность клеток HET-SR Arf6Q67L. В то же время, подавление активности киназы Erk1/2 не повлияло на динамику пролиферации клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в отличие от Erk1/2, оба сигнальные пути, опосредованные белками mTORC1-S6K1 и р38, задействованы в Arf6-зависимом усилении пролиферативной активности. Исследуя возможные механизмы участия р38 в Ar6-зависимом усилении пролиферации, мы предположили, что данная МАР киназа наряду с mTORC1-зависимым сигнальным путем, может участвовать в регуляции сборки комплекса инициации трансляции. 33 Рис. 24. Анализ влияния подавления активности белков mTORC1, Erk1/2 и р38 на динамику пролиферации клеток, экспрессирующих активированный Arf6. А. Проверка эффекта действия и подбор концентрации ингибиторов CI-1040 и SB203580 активности белков Erk1/2 и р38 соответственно. Б. Динамика пролиферации клеток HET-SRArf6Q67L при инкубации с соответствующими ингибиторами. Для проверки этой гипотезы, а также для подтверждения роли Arf6-зависимой активации mTORC1 в этом процессе мы далее исследовали влияние подавления mTORC1 и p38 на статус фосфорилирования представленных выше белков, регулирующих инициацию трансляции, rpS6 и 4E-BP1. Мы также проанализировали эффект подавления киназы Erk1/2, которое не вызвало снижение пролиферации исследуемых клеток, поскольку, согласно литературным данным, Erk1/2-регулируемые и mTORC1-зависимые сигнальные пути имеют множество «точек пересечения» и могут совместно регулировать отдельные белки комплекса инициации трансляции. Результаты исследования показали, что, как и в случае оценки динамики пролиферации, подавление активности Erk1/2 не отразилось на статусе фосфорилирования ни одного из белков (рис. 25). В то же время, как и ожидалось, ингибирование mTOR-S6K1 сигнального пути привело к значительному снижению фосфорилирования S6, причем как по сайту Ser235/236, так и по остаткам Ser240/244. Количество соответствующих фосфорилированных форм белка сократилось в 10 и 5 раз соответственно. Интересно, что подавление активности киназы р38 также достоверно (р<0,05) снизило (в 2,5 раза) фосфорилирование S6 по остаткам Ser235/236 и не повлияло на уровень фосфорилирования по сайту Ser240/244. Важно отметить, что ингибирование р38 привело к снижению фосфорилирования именно тех остатков серинов, фосфорилирование которых повысилось в результате активности Arf6. Этот сайт фосфорилируется преимущественно киназами RSK. Полученные данные, по-видимому, означают, что Arf6-зависимая активация S6 опосредуется 34 двумя путями: p38→RSK→S6, реализующим преимущественно фосфорилирование остатков Ser235/236, и mTORC1→S6K1→S6, фосфорилирующим оба сайта, Ser235/236 и Ser240/244. Что касается белка 4E-BP1, то, как видно на рисунке 25, на его фосфорилировании сказалось только подавление mTORC1-зависимого сигнального пути. При этом, так же, как и в случае белка S6, преимущественное снижение фосфорилирования наблюдалось по остатку треонина Thr70, фосфорилирование которого было Arf6-зависимым. Уровень снижения фосфорилирования по этому остатку после обработки рапамицином составил четыре раза. То есть Arf6-зависимое фосфорилирование 4E-BP1 осуществляется строго посредством активации комплекса mTORC1. Рис. 25. Анализ влияния подавления киназ Erk1/2, p38 и mTOR (под действием ингибиторов CI1040, SB203580 и рапамицина соответственно) на статус фосфорилирования мишеней mTORC1, белков S6, 4E-BP1 и S6K1 в клетках HET-SR Arf6Q67L. Приведен денситометрический анализ количества фосфорилированных форм белков в сравнении с таковым в контрольной линии HETSR Arf6Q67L * - р<0,05. 35 3.6.Анализ экспрессии Arf6 и RalA в клинических образцах опухолей немелкоклеточного рака легкого. В целях определения потенциальных изменений в исследуемых белках Ral и Arf6 при злокачественных новообразованиях человека нами проанализирована экспрессия мРНК Arf6 и продукция белков Arf6 и RalA в образцах двух основных гистологических типов немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) – плоскоклеточного рака (ПКРЛ) и аденокарциномы (АК). Образцы опухолей и условно нормальных тканей (24 образца АК и 29 образцов ПКРЛ) были получены от больных, оперированных в 2005–2008 гг. по поводу РЛ в НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Весь материал проходил двойную гистологическую верификацию согласно последней классификации ВОЗ (Histological Typing of Lung and Pleural Tumors третьего пересмотра, IARC Prеss, Lyon, 2004) в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и охарактеризован в соответствии с TNM классификацией шестого пересмотра (версия 2003 г.). Вкратце, результаты исследования показали, что в 64% образцов НМРЛ, независимо от их морфологической структуры, продукция белка RalA снижена по сравнению с условно нормальной тканью. Для образцов ПКРЛ обнаружена связь (p=0,01) между снижением уровня белка RalA и отсутствием регионарных метастазов. В 55% образцов НМРЛ уровень белка Arf6 повышается, причем при плоскоклеточном раке легкого такое увеличение встречается чаще (в 62%). Обнаружено статистически значимое снижение уровня белка RalA (p = 0,015) и повышение уровня белка Arf6 (p = 0,049) по сравнению с образцами условно нормальной легочной ткани в группах так называемых “малых раков” плоскоклеточного генеза (T1–2N0M0 и Т1–2N1–2M0 соответственно). 4. Белок, связывающий ретиноевую кислоту, CRABP1, в усилении высоко агрессивного фенотипа трансформированных клеток 4.1.Корреляция экспрессии CRABP1 с уровнем спонтанной метастатической активности трансформированных фибробластов. Ранее при сравнении профилей экспрессии белков высоко- и низко-метастазных линий из вышеописанной экспериментальной системы клеточных линий трансформированных фибробластов сирийского хомяка методом двумерного гель-электрофореза было обнаружено отсутствие продукции белка CRABP1 в Н/М линии HET-SR и высокий уровень данного белка в В/М линии HET-SR1. Этот результат поставил вопрос о связи CRABP1 с метастатической активностью клеток и о возможном его участии в приобретении трансформированными клетками агрессивного фенотипа. Для проверки этого предположения уровень продукции данного белка был исследован в клетках с различной метастатической активностью. В анализ были включены исходно В/М линии HET-SR1 и 36 HET-SR8, а также линия HET-SR-LNM, приобретшая высокий уровень СМА в ходе селекции клеток HET-SR in vivo (после двух последовательных подкожных введений животным и последующего отбора клеток из метастаза в лимфоузле) (см.рис.1А). Результаты анализа показали, что продукция CRABP1 отсутствует в клетках HET-SR, в то время как во всех В/М линиях данной панели (рис.26), включая линию, полученную путем отбора in vivo, данный белок экспрессируется на высоком уровне. Это означает, что в процессе селекции in vivo клетки приобрели параллельно высокую СМА и высокий уровень экспрессии CRABP1. Полученные данные позволяют говорить о наличии корреляции между экспрессией CRABP1 и уровнем СМА исследуемых клеточных линий. Рис. 26. Сравнение продукции белка CRABP1 в линиях с различной СМА 4.2.Модуляция туморогенности и метастатической активности клеток при активации и подавлении экспрессии CRABP1 Для определения роли белка CRABP1 в формировании высоко-метастазного фенотипа клеток была выбрана следующая стратегия: а - гиперэкспрессировать экзогенный CRABP1 в Н/М линии HET-SR, в которой отсутствует экспрессия эндогенного белка; б – подавить экспрессию эндогенного CRABP1 в В/М линии (была выбрана HET-SR-1); в - оценить влияние экспрессии CRABP1 на важнейшие характеристики злокачественности клеток in vivo, включая туморогенность и СМА. Чтобы получить производную линии HET-SR, стабильно экспрессирующую экзогенный CRABP1, кодирующая последовательность Crabp1 хомяка была клонирована в ретровирусный вектор pLXSN. Подавление экспрессии эндогенного CRABP1 проводили с помощью экспрессии малых шпилечных РНК (shRNA). Поскольку геном сирийского хомяка на момент исследования не был секвенирован, использовали праймеры, подобранные на консенсусные последовательности, фланкирующие кодирующую область мРНК CRABP1 мыши и крысы. В качестве матрицы для ПЦР использовали кДНК из линии HET-SR1, поскольку мРНК СRABP1 экспрессируется там на высоком уровне. Все манипуляции проводили в двух независимых повторах и осуществляли секвенирование каждого повтора. Полученная кодирующая последовательность CRABP1 сирийского хомяка была опубликована в открытой базе последовательностей GenBank, ей был присвоен регистрационный номер GQ139546.1. Анализ аминокислотной последовательности CRABP1 показал, что она идентична 37 аналогичным последовательностям крысы и мыши. Ретровирусный вектор с кодирующей последовательностью CRABP1 был экспрессирован в клеточной линии HET-SR. Проверка экспрессии белка CRABP1 представлена на рисунке 27А. Далее мы провели анализ in vivo двух основных клеточных характеристик линии HET-SR CRABP1 – туморогенности и СМА. Анализ туморогенности или опухоль-инициирующей способности клеток полученной линии, определяемой как частота инициации роста опухолей в зависимости от количества прививаемых клеток, проводили с помощью трансплантационного теста на сингенных животных. Для эксперимента использовали по 25 животных экспериментальной и контрольной групп. Для анализа клетки в суспензии в четырех последовательных разведениях (прививочные дозы: 2х104, 2х103, 2х102 и 2х101 клеток) прививались подкожно каждому экспериментальному животному. Количество опухолей, сформированных на месте введения клеток, подсчитывали спустя восемь недель после привития. На рисунке 27Б представлены результаты анализа - количество животных из обеих групп с отсутствием опухолей, наличием опухоли (прививочная доза 2х104), 2-х опухолей (прививочные дозы 2х104 и 2х103) и так далее. Результаты анализа показали, что экспрессия CRABP1 статистически значимо (p<0,05) увеличивает туморогенность (уменьшает минимальную прививочную дозу) клеток HET-SR. Рис. 27. А. Вестерн блот анализ экспрессии CRABP1 в производной линии HET-SR CRABP1. Отрицательный контроль – клетки HET-SRpLXSN, экспрессирующие «пустой» вектор; положительный контроль – клетки линии HET-SR1. Б. Сравнение туморогенности производной линии HET-SR CRABP1 и контрольной линии. * - p<0,05) При анализе СМА статистически значимые отличия (p<0,05) были получены лишь в трех из пяти экспериментов, в двух других экспериментах исследуемые выборки значимо не отличались (p<0,1). Полученные данные позволяют говорить лишь о тенденции к повышению 38 СМА клеток HET-SR при гиперэкспрессии CRABP1. Для подавления экспрессии CRABP1 в В/М были созданы лентивирусные конструкции на основе вектора pLKO.1-puro, кодирующие предшественники малых шпилечных РНК к кодирующей последовательности мРНК CRABP1 хомяка. В качестве контроля использовали вектор pLKO.1-puro с последовательностью, кодирующей shRNA к мРНК зеленого флуоресцентного белка eGFP (pLKO.1-shGFP). В эксперименте были использованы три варианта малых шпилечных РНК CRABP1. Как видно на рисунке 28, наибольшей эффективностью подавления обладали конструкции shB (более 90% снижения CRABP1) и (в меньшей степени) HET-SR1shA. Рис. 28. Сравнение продукции CRABP1 в производных линии HET-SR1, экспрессирующих shRNA к CRABP1. Положительный контроль - клетки HET-SR1. Приведен денситометрический анализ экспрессии CRABP1 в сравнении с контрольной линией HET-SR1shGFP. В трансплантационном тесте обе производные линии продемонстрировали статистически достоверное (р<0,05) снижение туморогенности по сравнению с контролем (рис. 29А). Сравнение иза СМА выявило достоверное снижение метастатической активности клеток линий HET-SR1 shA и HET-SR1 shB. Интересно, что линия HET-SR1 shB продемонстрировала наименьший уровень СМА, то есть снижение метастазирования коррелировало с уровнем подавления экспрессии CRABP1 (рис. 29Б). Поскольку линия HET-SR1 обладает высоким уровнем экспериментальной метастатической активности (ЭМА), мы далее изучали, насколько подавление экспрессии CRABP1 влияет на этот показатель. В отличие от анализа СМА, в тесте на ЭМА клетки напрямую водятся в кровяное русло (суспензию, содержащую 1x105 клеток каждой линии, вводили хомякам внутриорбитально), соответственно, этот тест моделирует поздние стадии процесса метастазирования – способность клеток к выживанию в кровотоке и вторичному росту в чужеродном микроокружении. 39 Рис. 29. Анализ характеристик полученных клеток in vivo. A. Сравнение туморогенности клеток HET-SR1 с подавленной экспрессией CRABP1. Б. ΔСМА исследуемых линий Проведенный анализ не выявил значимых отличий среднего количества экспериментальных легочных метастазов между двумя группами экспериментальных животных и контрольной группой. Однако в процессе гистологической оценки были обнаружены принципиальные отличия в размерах метастатических поражений. Для стандартизации оценки размеров метастатических узлов была использована трёхбалльная шкала: «1» - крупный метастаз, «2» средний метастаз, «3» – микрометастаз, состоящий из нескольких клеток. Для статистического анализа крупные и средние метастазы были объединены в группу макрометастазов (рис. 30А), которую сравнивали с группой микрометастазов (рис. 30Б). Рис. 30. Сравнение размера экспериментальных метастазов, формируемых производными линиями HET-SR1 со сниженной экспрессией CRABP1. А. Среднее количество макрометастазов. Б. Среднее количества микрометастазов. Обнаруженное значимое снижение количества макрометастазов, формируемых клетками с подавленной экспрессией эндогенного CRABP1, свидетельствует о важности данного белка для успешного роста клеток во вторичных очагах в условиях чужеродного микроокружения. 40 Таким образом, мы впервые показали, что CRABP1 обладает про-туморогенной и прометастатической активностью. 4.3 Анализ экспрессии мРНК и продукции белка CRABP1 в клинических образцах опухолей мезенхимального происхождения – мягкотканых сарком различного генеза. 4.3.1 Изучение экспрессии мРНК СRABP1 и CRABP2 в образцах опухолей мягких тканей человека Поскольку ранее аналогичных исследований не проводилось, на первом этапе мы изучили экспрессию мРНК обоих гомологов - генов CRABP1и CRABP2 - в небольшой выборке злокачественных опухолей мягких тканей различных гистологических типов. Далее, выявив тип опухолей, в которых будут обнаружены изменения экспрессии CRABP, мы планировали провести ИГХ анализ образцов соответствующих новообразований. Исследование операционного материала от больных (образцы опухолевой и условно нормальной тканей того же гистогенеза от каждого пациента), проходивших лечение в НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan-зондов. Весь полученный материал проходил гистологическую верификацию в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и был классифицирован по системе FNCLCC (мезенхимальные опухоли). Всего было проанализировано 28 образцов (10 липосарком, 7 злокачественных фиброзных гистиоцитом (ЗФГ), 6 синовиальных сарком и 5 злокачественных шванном). Выравнивание количеств внесенных кДНК опухолевой и условно нормальной тканей проводилось по значениям Ct и эффективности для референсных генов, в качестве которых использовали три гена, кодирующих белки «домашнего хозяйства»: Nup85 (белок комплекса ядерной поры), GARS( глицил-тРНК-синтетаза) и HPRT (гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза). Анализ данных изменения экспрессии референсных генов показал, что разброс значений этих изменений составляет 0,6–1,87. В качестве условной границы изменения экспрессии изучаемых генов приняли значение, равное двум. Проведенный анализ выявил частые изменения экспрессии исследуемых генов. Повышение количества мРНК CRABP1 наблюдалось в 21% общей выборки исследуемых образцов, а понижение – в 39% случаев. Повышение количества мРНК CRABP2 наблюдалось в 25% исследуемых образцов, а понижение – в 18% случаев. Важно отметить, что характер изменений экспрессии существенно зависел от гистологического типа опухоли. Так, повышение экспрессии как CRABP1, так и CRABP2, было характерно исключительно для группы синовиальных сарком и злокачественных фиброзных гистиоцитом. Среди образцов этой группы повышение экспрессии CRABP1 и CRABP2 было обнаружено в 46 и 54% случаев соответственно. В сумме повышение экспрессии одного или обоих генов было обнаружено в 4 из 6 образцов СС (66%) и в 4 из 7 образцов (57%) ЗФГ. В двух образцах СС и трех ЗФГ наблюдалось параллельное увеличение экспрессии обоих 41 генов. Соответственно, в группе СС и ЗФГ повышение экспрессии белков CRABP1 и/или CRABP2 было отмечено в 8 из 13 (61,5%) образцов. В отличие от СС и ЗФГ, в липосаркомах и злокачественных шванномах не было отмечено ни одного случая повышения экспрессии CRABP1 либо CRABP2. Более того, для 40 и 37% данных опухолей было характерно снижение количества мРНК CRABP1 или CRABP2 сответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения экспрессии данных генов характерны только для СС и ЗФГ, поэтому на следующем этапе мы провели анализ продукции белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком с помощью иммуногистохимического (ИГХ) анализа. 4.3.2 Анализ экспрессии белка CRABP1 в образцах синовиальных сарком ИГХ реакция послеоперационного проводилась материала. на ультратонких Коллекция срезах парафиновых с блоков парафиновых блоков послеоперационного материала от 27 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом «монофазная синовиальная саркома» была предоставлена архивом Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ КО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, анализ проводился в сотрудничестве со с.н.с. отдела, Г. Ю. Чемерис. В зависимости от морфологии клеток, монофазные синовиальные саркомы делились на веретеноклеточные, круглоклеточные и смешанные варианты. Гистологически все эти опухоли были оценены в соответствии с FNCLCC классификацией и отнесены к новообразованиям высокой (третьей) степени злокачественности (G3). Результаты ИГХ анализа экспрессии CRABP1 показали высокий уровень данного белка (интенсивность реакции от «умеренной» (2 балла) до «высокой» (3 балла)) в 100% исследованных образцов синовиальных сарком. Процент опухолевых клеток, демонстрирующих позитивную реакцию, варьировал в диапазоне от 50 до 90% и не зависел от морфологического строения опухоли. Позитивная реакция наблюдалась как в ядрах, так и в цитоплазме опухолевых клеток (ядерно-цитоплазматическая реакция). При этом окружающие нормальные ткани не окрашивались, то есть были CRABP1-негативны (рис.31). Рис. 31. Экспрессия белка CRABP1 в образцах монофазных синовиальных сарком. А. Характерный пример положительной реакции в опухолевых клетках и отсутствия специфической реакции в окружающих клетках; Б. Характерный пример «умеренной» интенсивности реакции; В. Характерный пример «высокой» интенсивности реакции. 42 Нами не было обнаружено каких-либо корреляций между уровнем экспрессии CRABP1 и клиническими характеристиками. Это объясняется как гетерогенным характером выборки, и достаточно гомогенным (преимущественно высоким) уровнем экспрессии CRABP1 во всех изучаемых образцах. Кроме того, как уже говорилось, все образцы относились к низкодифференцированным (G3) опухолям. В целом, результаты впервые проведенного анализа свидетельствуют об убиквитарном характере экспрессии белка CRABP1 в монофазных синовиальных саркомах. Выводы: 1. Показано, что онкоген H-Ras является активатором метастатической активности трансформированных фибробластов in vivo. Идентифицирован основной внутриклеточный сигнальный путь, опосредующий прометастатическую активность H-Ras: H-Ras―RalGDS―Ral. Основными мишенями H-Ras, стимулирующими метастатическую активность, являются малые ГТФазы RalA и RalB. 2. Доказана роль обоих гомологов Ral, малых ГТФаз RalA и RalB, в усилении метастатического потенциала трансформированных фибробластов. Показано, что RalB обладает большей прометастатической активностью. Одновременная экспрессия обоих гомологов Ral не приводит к синергическому эффекту в отношении метастатической активности клеток. 3. Обнаружено, что основным белком-эффектором RalB, задействованным в RalB-зависимой активации метастазирования, является фосфолипаза PLD. В отличие от RalB, RalA-зависимая стимуляция метастазирования требует участия всех основных эффекторов: комплекса экзоциста, белка RalBP1 и фосфолипазы D. 4. Ral-зависимое увеличение метастатического потенциала исследуемых клеток in vivo сопровождается изменением ряда характеристик трансформированных клеток, являющихся показателями уровня малигнизации in vitro: а – усилением способности клеток к автономному росту; б – увеличением инвазивной активности; в – активацией направленного движения по градиенту факторов роста. 5. RalA и RalB обладают сходным эффектом в отношении ряда белков, ассоциированных с опухолевой прогрессией: активация МАР киназы Jnk и транскрипционного фактора Stat3, а также усиление экспрессии белка CyclinD1. При этом RalA, в отличие от RalB, усиливает экспрессию молекулы адгезии CD24 и активность протеиназ внеклеточного матрикса, ММР-1 и uPA. RalB в большей степени, чем RalA, усиливает экспрессию CyclinD1 и снижает продукцию компонента липидных микродоменов, белка Cav-1. 6. Показано, что малая ГТФаза Arf6 усиливает пролиферативную активность трансформированных фибробластов и их способность к автономному росту, однако не 43 оказывает значимого влияния на метастатическую активность исследуемых клеток. Arf6зависимая стимуляция пролиферации опосредуется PLD-зависимым сигнальным путем. Отсутствие возможности взаимодействия Arf6 с PLD приводит к отмене эффекта стимуляции пролиферации, но усиливает клеточную подвижность, инвазивную активность и способность деградировать внеклеточный матрикс. 7. Arf6 активирует PLD и усиливает активность киназы mTOR и ее мишеней: рибосомальной киназы S6K1, рибосомального белка S6, белка, связывающего фактор инициации трансляции eIF-4E, 4E-BP1. Идентифицированы активируемые белком Arf6 сигнальные пути: PLD→mTORC1→S6K1→S6, PLD→mTORC1→4E-BP1, p38→…→S6, приводящие к активации комплекса инициации трансляции. 8. Arf6 активирует МАР киназы Erk1/2 и p38. Молекулярные механизмы, реализующие промитогенную активность Arf6, включают активацию сигнального пути PLD―mTORC1 и усиление активности р38. 9. Показано, что в 64% образцов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) продукция белка RalA снижена по сравнению с условно нормальной легочной тканью. Обнаружена связь между снижением уровня белка RalA и отсутствием регионарных метастазов при плоскоклеточном раке легкого (ПКРЛ). Уровень белка Arf6 повышен в 55% образцов НМРЛ, при ПКРЛ повышение обнаружено в 62%. Среди образцов «малых раков» ПКРЛ обнаружено значимое снижение уровня белка RalA в группе T1–2N0M0 и повышение уровня белка Arf6 в группе Т1–2N1–2M0 . 10. Обнаружена корреляция между экспрессией белка, связывающего ретиноевую кислоту CRABP1 и уровнем спонтанной метастатической активности трансформированных фибробластов. Доказана роль CRABP1 в стимуляции туморогенности и метастатической активности клеток. 11. Показан дифференциальный характер экспрессии мРНК CRABP1 в злокачественных опухолях мягких тканей в зависимости от гистологического типа опухоли. Белок CRABP1 убиквитарно и на высоком уровне экспрессирован в монофазных синовиальных саркомах. Рекомендовано дальнейшее исследование белка CRABP1 для использования в качестве маркера дифференциальной диагностики синовиальных сарком. Список работ по теме диссертации Список научных работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ: 1.Tchevkina, E. M. Suppression and restoration of v-src expression in RSV transformed cells after transfection with N-ras and its antagonists / E. M. Tchevkina, N. P. Kisseljova, M. S. Shtutman, E. A. Musatkina, O. A. Mizenina, A. Tavitian, F. L. Kisseljov // Int. J. Oncology . — 1995. — V.7., №3. — P. 453-459. 44 2.Зуева, Э. Ш. Снижение метастатического потенциала v-src-трансформированных клеток в результате активности DAP киназы / Э. Ш. Зуева, Е. М. Чевкина, A. Kimchi, А. Г. Татосян // Молекулярная биология клетки. — 2002. — Т. 36., №3. — С.472-479. 3. Tchevkina, E. The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells / E. Tchevkina, L. Agapova, N. Dyakova, A. Martinjuk, A. Komelkov, A. Tatosyan // Oncogene. — 2005. — V.24., №3. — P. 329-335. 4.Рыбко, В. А. Активность протеиназ внеклеточного матрикса в экспериментальной модели опухолевой прогрессии / В. А. Рыбко, А. В. Книжник, Я. А. Каинов, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2008. — Т.19. — C.16-22. 5.Любченко, Л. Н. Рак молочной железы и/или яичников в составе наследственного онкологического синдрома / Л. Н. Любченко, Н. И. Поспехова, А. А. Пароконная, А. А. Лушникова, Е. М. Чевкина // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2009. — Т.1., № 2. — C.59-63. 6. Книжник, А. В. Белки Arf6, RalA и BIRC5 при немелкоклеточном раке легкого/ А. В. Книжник, О. В. Ковалева, К. К. Лактионов, В. В. Мочальникова, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина, И. Б. Зборовская // Молекулярная биология клетки. — 2011. — Т. 45., №2. — С.307-315 7. Боярских, Ю.А. Прогнозирование чувствительности клеток немелкоклеточного рака легких к действию цисплатина и паклитаксела на основании уровня экспрессии маркерных генов / Ю. А. Боярских, Ю. В. Кондрахин, И. С. Евшин, Р. Н. Шарипов, А. В. Комельков, Е. А. Мусаткина, Е. М. Чевкина, М. А. Сукоян, Ф. А. Колпаков, К. Н. Кашкин, М. Л. Филиппенко // Молекулярная биология клетки. — 2011. — Т. 45., №4. — С.600-607. 8.Rybko, V. A. Different metastasis promotive potency of small G-proteins RalA and RalB in in vivo hamster tumor model / V. A. Rybko, A. V. Knizhnik, A. V. Komelkov, V. N. Aushev, L. S. Trukhanova & E. M. Tchevkina // Cancer Cell International. — 2011. — Vol. 11., №22. — P.1-12. 9.Каинов, Я. А. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSVтрансформированных фибробластов сирийского хомяка / Я. А. Каинов, И. А. Фаворская, Е. Е. Антошина, Т. Г. Горькова, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина // Российский биотерапевтический журнал. — 2011. — Т.10., №2. – С. 37-44. 10. Ковалева, О. В. Сурвивин и его роль в патогенезе злокачественных опухолей / О. В. Ковалева, А. Н. Шнейдерман, Е. М. Чевкина // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. – 2011. — № 4. – С. 62-72. 11.Knizhnik, A. V. Arf6 promotes cell proliferation via the PLD-mTORC1 and p38MAPK pathways / A. V. Knizhnik, O. V. Kovaleva, A. V. Komelkov, L. S. Trukhanova, V. A. Rybko, I. B.Zborovskaya & E. M. Tchevkina // Journal of Cellular Biochemistry. — 2012. — Vol. 113., №1. — P.360-371. 12.Kaminsky, V.O. Suppression of basal autophagy reduces lung cancer cell proliferation and enhances caspase-dependent and -independent apoptosis by stimulating ROS formation/ V. O. Kaminsky, T. 45 Piskunova, I. B. Zborovskaya, E. M. Tchevkina, B. Zhivotovsky // Autophagy. — 2012. — Vol. 8., №7. — P. 1032- 1044. 13.Kaminsky, V.O. Upregulation of c-FLIP-short in response to TRAIL promotes survival of NSCLC cells, which could be suppressed by inhibition of Ca2+/calmodulin signaling / V. O. Kaminsky, O. V. Surova , T. Piskunova, I. B. Zborovskaya, E. M. Tchevkina, I.Andera, B. Zhivotovsky // Cell Death and Disease. — 2013. —Vol. 4. — P. 1-10. 14.Чевкина, Е. М. Экспрессия CRABP1 и CRABP2 в саркомах мягких тканей / Е. М. Чевкина, И. А. Фаворская, Я. А. Каинов, Г. Ю. Чемерис, А. В. Комельков, Н. А. Дьякова // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. – 2013. — № 1. — С. 47-53. 15.Kainov, Y. CRABP1 provides high malignancy of transformed mesenchymal cells and contributes to the pathogenesis of mesenchymal and neuroendocrine tumors / Y. Kainov, I. Favorskaya, V. Delektorskaya, G. Chemeris, A. Komelkov, A. Zhuravskaya, L. Trukhanova, E. Zueva, B. Tavitian, N. Dyakova, I. Zborovskaya, E. Tchevkina // Cell Cycle. — 2014. — Vol. 13, №10— С. 1530-2539. Статьи, опубликованные в монографиях: 1. Tchevkina, E. Protein Phosphorylation as a Key Mechanism of mTORC1/2 Signaling Pathways / E. Tchevkina, A. Komelkov // Chapter in book: Protein Phosphorylation in Human Health. Editor: Cai Huang; Publisher: InTech, Open Access Publisher — 2012. — Ch.1. — P. 5-50. Другие опубликованные научные работы: 1. Tchevkina, E. Modulation of signal transduction protein expression in v-src-transformed cells with different level of metastatic potential / E. Tchevkina, I. Rodina, E. Musatkina, A. Martinuk, A. Tatosyan // 17th EACR meeting, 8-11 June 2002, Granada, Spain // Revista de Oncologia. — V. 4/1. — P.48-49 2. Zueva, E. Exogenous DAP-kinase gene activity suppresses metastatic potential of RSV-transfromed fibroblasts and induces changes in signal transduction pathways and in the transcription of several genes involved in carcinogenesis / E. Zueva, E. Tchevkina, A. Kimchi // 17th EACR meeting, 8-11 June 2002, Granada, Spain // Revista de Oncologia. — V. 4/1. — P.46-47 3. Tchevkina, E. Ha-ras oncogene induces the metastatic ability of transformed cells in vivo through RalGDS downstream signalling pathway / E. Tchevkina, A. Martinjuk, A. Komelkov, A. Tatosyan // ECCO 12 - the European Cancer Conference, 21-25 September 2003, Copenhagen, Denmark // European Journal of Cancer. — 2003. — V.1, №5. — P. 180 4. Rybko, V. RalA and RalB proteins contribute to metastasis stimulation through distinct pathways / V. Rybko, K. Ukraintsev, A. Martinjuk, N. Dyakova, A. Komelkov, O. Kovaleva and E. Tchevkina // Second International Congress on Molecular Staging of Cancer, 22–26 June 2006, Heidleberg, Germany // European Journal of Cancer. —2006. — V. 4 № 6. — P. 31-32 5. Knizhnik, A. Arf6 participates in modulation of cell metastatic activity in vivo / A. Knizhnik, V. Rybko, Y. Kainov, A. Komelkov and E. Tchevkina // European Small GTPase meeting, 29-31 August 2007, Umea, Sweden // Abstracts. – 2007 – P. 59 46 6. Tchevkina, E. Extracellular Proteases Activity In A Tumor Progression Experimental Model/ E. Tchevkina, A. Knizhnik, V. Rybko, Y. Kainov, A. Komelkov // Eighth international conference of anticancer research, 17-22 October 2008, Kos, Greece// Аnticancer Research — 2008. – V. 28, № 5C. — P. 3513. 7. Книжник, А. Модуляторы активности фосфолипазы D белки RalA и Arf6: влияние на различные характеристики трансформированных клеток / А. В. Книжник, В. А. Рыбко, Я. А. Каинов, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина // Школа-конференция «Методы культивирования клеток», 6-10 октября 2008, Санкт-Петербург, Россия // Цитология. — 2008. — Т.50. — C.807. 8. Knizhnik, A. Extracellular matrix proteases activity in hamster tumor progression experimental model/ A. Knizhnik, V. Rybko, Y. Kainov, A. Komelkov and E. Tchevkina // Cancer Degradome Symposium, 8-9 October 2008, London, UK.// Abstracts– 2008. – P. 28 9. Knizhnik, A. Arf6-dependent signaling contributes to cancer progression in in vivo animal model and lung cancer / A. Knizhnik, V. Rybko, O. Kovaleva, Y. Kainov, A. Komelkov and E. Tchevkina // Beatson international cancer conference “Microenvironment, motility and metastasis”, 5–8 July 2009, Glasgow, Scotland // Abstracts – 2009. – P. 98 10. Kainov, Y. Modulation of extracellular matrix remodelling system associated with different metastatic phenotype of v-src transformed cells / Y. Kainov, V. Rybko., E. Tchevkina, A. Knizhnik, A. Komelkov // International cancer conference “Molecular Mechanism in Signal Transduction and Cancer”, 16–24 August 2009, Spetses, Greece // Abstracts – 2009.–– P. 43 11. Чевкина, Е. Участие фосфолипазы D в RALB и ARF6-зависимой стимуляции опухолевой прогрессии трансформированных фибробластов сирийского хомяка / Е. М. Чевкина, О. А. Ковалева, А. В. Комельков, А. В. Книжник, В. А. Рыбко, Е. Е. Антошина, Т. Г. Горькова // Евразийский форум по диагностике злокачественных опухолей, 9-10 июня 2011, Киев, Украина // Тезисы докладов. – 2011. – С.40 12. Каинов Я. А. Роль белка CRABP1 в формировании высокометастазного фенотипа RSVтраесформированных фибробластов сирийского хомяка /Я.А. Каинов, И.А. Фаворская, Л.С. Труханова, A.Ю. Журавская, A.В. Комельков, E.М. Чевкина // Евразийский форум по диагностике злокачественных опухолей, 9-10 июня 2011, Киев, Украина // Тезисы докладов. – 2011. – С.26 13. Kainov, Y. CRABP1 stimulates tumorigenicity and metastasis of RSV-transformed fibroblasts / Y. Kainov, I. Favorskaya, L. Trukhanova, G. Chemeriz, A. Komelkov, E. Tchevkina // 40th congress of the International society of oncology and biomarkers, 13-17 Oktober 2012, Jerusalem, Israel // Tumor Biology. – 2012. – V. 33, Suppl1. – P.113. 14. Tchevkina, E. PLD is a downstream partner of Arf6 and RalB in stimulation of transformed hamster fibroblasts proliferation and metastasis / E. Tchevkina, O. Kovaleva, A. Knizhnik, I. Zborovskaya, V. Rybko // 40th congress of the International society of oncology and biomarkers, 13-17 Oktober 2012, Jerusalem, Israel // Tumor Biology. – 2012. – V. 33, Suppl.1. – P.115. 47 15. Журавская, А. Влияние экспрессии малой ГТФазы ARF6 на mTOR- и MAPK-зависимые сигнальные пути в опухолевых клетках человека различного гистогнеза // А. Ю. Журавская, О. В. Ковалева, Е. М. Чевкина // II Евразийская онкологическая конференция для молодых исследователей, 25 апреля 2013, Москва, Россия // Тезисы докладов. – 2013. – С.20 16. Фаворская, И. Участие CRABP1 в формировании агрессивного фенотипа рансформированных мезенхимальных клеток человека / И. А. Фаворская, Я. А. Каинов, А. В. Комельков, Е. М. Чевкина, И. Б. Зборовская // VIII Всероссийский съезд онкологов, 11-13 сентября 2013, Санкт-Петербург, Россия // Вопросы онкологии. — 2013. — Т. 59, № 3.— С. 137-138 17. Kainov, Y. CRABP1 is ubiquitously expressed in synovial sarcomas and promotes tumorigenicty and metastatic activity of transformed mesenchymal cells / Y. Kainov, I. Favorskaya, G. Chemeriz, N. Dyakova, A. Komelkov, E. Tchevkina // 5th EMBO meeting, 21-24 September 2013, Amsterdam, Netherlands// Abstracts – 2013. – P. 139-140 48
