МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
advertisement
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра иммунологии На правах рукописи ШИЛОВ ЕВГЕНИЙ СЕРГЕЕВИЧ Модель генетического нокдауна соматического цитохрома c мыши Специальность: 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор С.А.Недоспасов Москва, 2015 г. ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ______________________________________________2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ _________________4 ВВЕДЕНИЕ _________________________________________________5 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ____________________________________ 8 1.1 Место цитохрома c в регуляции процессов жизнедеятельности клетки _____________________________________8 1.2 Цитохром с, вариабельность его структуры и связанные с ним генетические модели _________________________15 1.3 Значение процессов, в которых участвует цитохром с, для различных клеток иммунной системы_____________25 1.4 Избирательное редактирование генома в определенных типах клеток in vivo и генетические модели митохондриальных заболеваний________________________________32 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ _______________________________38 2.1 Материалы_______________________________________________38 2.2 Методы клеточной биологии _______________________________40 2.3 Методы молекулярной биологии ____________________________43 2.4 Статистическая обработка данных___________________________46 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ _________________________47 3.1 Описание модели с различными вариантами кондиционного нокдауна гена Cycs _____________________________47 3.2 Влияние снижения количества цитохрома c на жизнеспособность мышей __________________________________51 3.3 Определение механизма снижения количества цитохрома с и оценка этого количества в клетках иммунной системы ___________________54 3.4 Анализ жизнеспособности цитохромдефицитных лимфомиелоидных клеток ____________________________________60 3.5 Влияние снижения количества цитохрома c на клеточный метаболизм и апоптоз ________________________________________63 2 3.6 Проверка иммунных функций цитохромдефицитных макрофагов_________________________________________________68 3.7 Обсуждение дыхательной функциональности цитохромдефицитных клеток __________________________________71 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ____________________________________________74 ВЫВОДЫ _________________________________________________77 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ___________________________________78 БЛАГОДАРНОСТИ_________________________________________97 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОПРЕДЕЛЕНИЙ АФК – активные формы кислорода АТФ – аденозинтрифосфат МЭФ – мышиные эмбриональные фибробласты ПЦР – полимеразная цепная реакция п.н. – пары нуклеотидов ФНО (TNF) – фактор некроза опухолей ЭПР – эндоплазматический ретикулюм BCR – B-клеточный рецептор CD – cluster of differentiation – поверхностные молекулы лейкоцитов CDP – commited dendritic progenitor –коммитированый предшественник миелоидных дендритных клеток DN – double negative – тимоцит, не имеющий на своей поверхности маркеров CD4 и CD8 MPT – mitochondrial permeability transition – переход к пермеабилизации митохондрий NADH – востановленный никотинамидаденозиндинуклеотид THC – тромбоцитопения wt – wild type (аллель дикого типа) Остатки аминокислот в зависимости от контекста обозначены трехбуквенными либо однобуквенными сокращениями Дни мышиного онтогенеза: E – эмбриональный период, Р – постнатальный период Генетический нокаут – удаление гена-мишени либо полное подавление его функции. Генетический нокин – нуклеотидная замена последовательности генамишени, приводящая к изменению аминокислотной последовательности кодируемого белка. Генетический нокдаун – снижение экспрессии гена-мишени с сохранением его кодирующей последовательности. 4 ВВЕДЕНИЕ Исследования биологических систем зачастую осложняются тем, что одни и те же белки в живых организмах могут иметь в отдельных типах клеток или в разные периоды онтогенеза различающиеся функции, количество и свои собственные особенности регуляции. Иногда изучение отдельных функций белков в определенных типах клеток методом нарушения функции представляется невозможным из-за летального эффекта такого нарушения для организма в целом. проблему, применяют методы обратной Для того чтобы обойти эту генетики, основанные на использовании прецизионного редактирования генома в отдельных типах клеток либо в определенный момент времени. Для подобного редактирования можно использовать высокоспецифичные рекомбиназы, экспрессия которых регулируется тканеспецифическими промоторами, и трансгены-мишени, фланкированные последовательностями нуклеотидов, узнаваемыми этими рекомбиназами, например, рекомбиназу Cre, впервые использованную для кондиционного генетического нокаута в лаборатории Клауса Раевского (Gu et al., 1993). Такой подход позволяет преодолеть проблему летальности, вызванной полным нарушением функции генамишени во всех клетках организма, и позволяет исследовать отдельные частные функции генов и их белковых продуктов в определенных типах клеток на определенных этапах развития. В то же время вместе с высокой продуктивностью такого подхода необходимо отметить довольно большую сложность его реализации на уровне животных объектов. Создание новых животных моделей на основе кондиционных генетических дефектов представляется оправданным в отношении белка, обладающего несколькими различающимися функциями и возможной клинической значимостью нарушения их функций. Обоим этим условиям удовлетворяет цитохром c – один из наиболее пристально изучаемых эукариотических белков на протяжении последних десятилетий. Это один из первых белков, для которого была получена полная 5 аминокислотная последовательность (Margoliash et al., 1961), трехмерная структура (Dickerson et al., 1967) и построено первое филогенетическое дерево (Margoliash, 1963). Цитохром c представляет собой небольшой гемсодержащий белок, который электрон-транспортной цепи необходим для функционирования митохондрий (Cooper, Lehninger, 1956), участвует в активации внутреннего пути апоптоза (Liu et al., 1996), а также способствует обезвреживанию эндогенной перекиси водорода при помощи цитохром c-пероксидазы (Yonetani, Ray, 1965) и имеет несколько других минорных функций. В норме цитохром c находится в межмембранном пространстве митохондрий, где служит переносчиком электронов между комплексами III и IV дыхательной цепи, а в случае выхода из митохондрий в цитоплазму взаимодействует с белком Apaf-1 и стимулирует образование апоптосомы – комплекса, активирующего каспазу-9. Интересно, что сам цитохром c был описан дважды, Чарльзом МакМанном в 1886 году под названием «гистогематин» (MacMunn, 1886), и Дэвидом Кейлин в 1925 под современным названием (Keilin, 1925). Именно Кейлин впервые описал участие цитохрома c во внутриклеточных окислительно-восстановительных процессах за счет изменения степени окисления иона железа в составе гема. Некоторые ранние опыты с этим белком представляются нам сейчас странными и бессмысленными, например, эксперименты по внутривенному и внутримышечному введению экзогенного цитохрома c в организмы крыс, кроликов и собак (Proger et al., 1945). Что интересно, выводами той работе 70-летней давности стали утверждения о том, что цитохром c содержится в тканях в недостаточном количестве для обеспечения функций цитохромоксидазы, цитохром c может мобилизоваться тканями из кровотока, после чего в них повышается потребление кислорода и нормализуется метаболизм. С современной точки зрения очевидна абсурдность второго утверждения, однако и первое утверждение является неверным, доказательством чему является данная диссертационная работа. 6 Цитохром c является весьма консервативным белком, причем ряд исследований in vitro и in vivo с использованием генно-инженерных животных показывает важность для сохранения его функций некоторых ключевых аминокислотных остатков (Kulikov et al., 2012). Исследования последних лет показали, что при отсутствии цитохрома c в митохондриях не происходит сборки функциональных комплексов дыхательной цепи (Vempaty et al., 2009). Полный генетический нокаут цитохрома c приводит к гибели мышиных эмбрионов к середине периода внутриутробного развития (Li et al., 2000). Популяционно-генетические исследования выявили у человека две изоформы цитохрома c, G41S (Morison et al., 2008) и Y48H (De Rocco et al., 2014), в гетерозиготном состоянии обе мутации приводят к тромбоцитопении. И дыхательная, и проапоптотическая функции цитохрома c в контексте их нарушений представляют интерес для клеточной биологии и медицины. Особый моделирования интерес связан с использованием митохондриальных заболеваний. цитохрома Как c для правило, эти заболевания связаны с мутациями генов, расположенных в геноме митохондрий. При этом митохондриальные заболевания затрагивают строго определенные типы клеток и отличаются по своей симптоматике (Rossignol et al., 1999). С учетом того, что генная инженерия надежно позволяет манипулировать ядерными генами в разных типах клеток, представляется перспективной разработка на модельных животных генетической модели, имитирующей митохондриальные заболевания с использованием технологии кондиционного нокдауна ядерных генов, таких как ген Cycs. Этот подход и был реализован в настоящей диссертационной работе. 7 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Место цитохрома c в регуляции процессов жизнедеятельности клетки Цитохром c имеет несколько различающихся функций и обладает способностью связываться с множеством белков-партнеров, а также с липидами и нуклеиновыми кислотами. Очевидно, что не все такие взаимодействия функциональны и специфичны, однако нельзя исключать, что наши текущие представления о роли этого белка в регуляции процессов жизнедеятельности клетки могут в ближайшие время измениться, подобно тому как они изменились после идентификации цитохрома c в качестве индуцирующего апоптоз белкового фактора Apaf-2, партнера Apaf-1. На данный момент известны два партнера с наибольшим временем жизни комплексов с цитохромом с: белок Apaf-1 и липид кардиолипин. В процессе активации внутреннего пути апоптоза цитохром c должен выйти из межмембранного пространства митохондрий вместе с несколькими другими проапоптотическими белками, такими как Smac и Omi. При этом выход может осуществляться различными путями: при разрыве внешней мембраны митохондрии в случайном месте после поступления в матрикс большого количество осмотических веществ и воды (Munoz-Pinedo et al., 2006); через так называемую MPT-пору, включающую в себя потенциалзависимый транспортер анионов VDAC, транслоказу аденозиновых нуклеозидфосфатов ANT и пролин-изомеразу матрикса - циклофилин D (Crompton et al., 1999); а также через пору, образованную белками ВАХ/ВАК (Wei et al., 2001). В цитоплазме цитохром c связывается с белком Apaf-1, который для активации апоптоза должен находиться в изоформе XL и иметь 13 WD40-повторов на C-конце (Benedict et al., 2000). Взаимодействие Apaf-1 и цитохрома c осуществляется посредством электростатических контактов, в которых участвуют боковые цепи лизина цитохрома c и остатки аспарагиновой кислоты из состава доменов WD40. Связывание носит временный характер и необходимо для проявления АТФазной активности 8 Apaf-1, а также для олигомеризации семи молекул этого белка в апоптосому – инициирующий апоптоз молекулярный комплекс, напоминающий по форме колесо со спицами (Cain, 2003). После этого к субъединицам Apaf-1 за счет гомотипического взаимодействия CARD-доменов присоединяются молекулы прокаспазы-9, которые протеолитически активируются и входят в состав апоптосомы в виде каспазы-9, в то время как цитохром с покидает апоптосому (Acehan et al., 2002). Активированная апоптосома приобретает способность расщеплять прокаспазы 3 и 7, которые становятся эффекторными каспазами 3 и 7 и, в свою очередь, обеспечивают протеазную активность, необходимую для последуюших событий апоптоза (Shiozaki et al., 2001). Последовательность событий, связанная с участием цитохрома с во внутреннем пути активации апоптоза, отражена на Рис. 1. При этом необходимо отметить, что выход цитохрома с из митохондрий, во-первых, не всегда является необходимым для индукции внутреннего пути апоптоза, а вовторых, не обязательно приводит к апоптозу, и может быть частью нормальной программы дифференцировки клеток (Xiong et al., 2014). Так, например, активация NMDA-рецепторов в нейронах гиппокампа приводит к слабой пермеабилизации митохондрий и выходу в цитоплазму некоторого количества цитохрома c, однако вызывает не апоптоз, а долговременную синаптическую депрессию этих нейронов (Li et al., 2010). В свою очередь клетки, лишенные Apaf-1, либо каспазы-9, либо Bax и Bak были устойчивы к апоптозу, вызываемому стрессом ЭПР, повреждением ДНК и подавлением синтеза белка, однако претерпевали апоптоз в ответ на ингибитор протеинкиназ стауроспорин (Imao, Nagata, 2013). Таким образом, активация внутреннего пути апоптоза возможна и без участия цитохрома c и Apaf-1, поскольку после пермеабилизации наружной мембраны митохондрии в цитоплазму выходят также митохондриальный флавопротеин AIF и эндонуклеаза G, способные к каспазонезависимой активации апоптоза (Ekert and Vaux, 2005). 9 Рисунок 1. Участие цитохрома с в индукции апоптоза (по Ow et al., 2008, с изменениями). Слева показана клетка в нормальных условиях, справа – индукция апоптоза. Активированные проаптотические белки показаны красным, неактивированные – желтым, ингибирующие апоптоз белки обозначены синим. Одним из важнейших лигандов цитохрома с является кардиолипин, уникальный липид внутренней мембраны митохондрий, обладающий четырьмя ацильными хвостами. До 20% от общего количества цитохрома с в клетке может быть связано с внутренней митохондриальной мембраной за счет кардиолипина (Kagan et al., 2004). Кардиолипин может взаимодействовать с цитохромом с при помощи одного из остатков жирной кислоты, заходящей в гидрофобный карман этого белка, (Tuominen et al., 2002) или сразу двух остатков жирных кислот (Sinibaldi, et al., 2010), либо при помощи отрицательно заряженной полярной головки, электростатически связывающейся с многочисленными аминогруппами лизина и аргинина (Rytomaa and Kinnunen, 1994). Участок цитохрома с, отвечающий за гидрофобное взаимодействие с кардиолипином, носит название С-сайт связывания, а отвечающий за электростатическое – А-сайт связывания. При 10 этом цитохром с обладает способностью катализировать перекисное окисление кардиолипина, что позволяет реализовать функциональную обратную связь: окисленный кардиолипин теряет сродство к цитохрому и тот может более легко покинуть межмембранное пространство митохондрии после пермеабилизации ее внешней мембраны (Kagan et al., 2005). Такое свойство цитохрома с может обеспечивать механизм синхронизации его выхода из межмембранного пространства митохондрий в процессе внутреннего пути индукции апоптоза (Ott et al., 2007). Возможно, иммобилизованный на мембране посредством кардиолипина цитохром с может регулировать также работу дыхательной цепи, поскольку цитохромоксидаза также обладает несколькими сайтами связываний кардиолипина (Arnarez et al., 2013), следовательно, кардиолипин может выступать в качестве якоря, удерживающего цитохром с в непосредственной близости от электрон-акцепторного сайта цитохром-оксидазы. Нужно отметить, что взгляды на архитектуру и функционирование дыхательной цепи в начале XXI века претерпели некоторые изменения по сравнению с классическим представлениями, возникшими около 50 лет назад. В работе Шеггера и Пфайфер в 2000 году (Schagger and Pfeiffer, 2000) была предложена модель респирасомы, единого суперкомплекса, включающего в себя отдельные комплексы электрон-транспортной цепи. В дальнейшем существование респирасом было подтверждено несколькими независимыми группами исследователей, а структура дыхательного суперкомплекса, выделенного из сердца быка, была определена методом рентгеноструктурного анализа в работе Дудкиной и коллег (Dudkina et al., 2011). Показано, что респирасома состоит из двух единиц комплекса III дыхательной цепи и одиночных комплексов цитохром-оксидазы и NADHдегидрогеназы. При этом расстояния, которые должны проходить низкомолекулярные переносчики электронов от комплекса донора к комплексу акцептора, становятся экстремально малыми. Так, убихинол, восстановленная форма убихинона, в респирасоме перемещается от 11 связывающей поверхности комплекса I до цитохрома b в составе комплекса III всего на 13 нанометров, а цитохром c между III и IV комплексом – на 10 нанометров в составе респирасомы (Dudkina et al., 2011), и всего на 4 нанометра в составе суперкомплекса III2 + IV2 (Heinemeyer et al., 2007). Считается, что такая плотная структурная упаковка отдельных молекул в составе суперкомплексов и такие малые расстояния миграции для переносчиков электронов способствуют более эффективному функционированию дыхательной цепи. В целом, сосуществование в одной митохондрии и отдельных комплексов дыхательной цепи, и её суперкомплексов, между которыми могут мигрировать убихинон и цитохром c, может повышать гибкость её регуляции в условиях различных концентраций окисляемых субстратов (Lapuente-Brun et al., 2013). Схемы организации электронно-транспортной цепи до и после открытия респирасомы представлены ниже на Рис. 2. При этом до настоящего момента неизвестно, насколько плотно ассоциированы с респирасомой или другими дыхательными суперкомплексами убихинон и цитохром c. Значение цитохрома с для функционирования респирасомы до настоящего времени так же не выяснено, однако предполагается, что стадия переноса электронов с цитохрома с на цитохром-оксидазу и накопления четырех электронов для передачи их молекулярному кислороду, является лимитирующей для скорости работы всей дыхательной цепи (Villani, Attardi, 1997). 12 Рисунок 2. Эволюция структурных представлений о функционировании и пластичности дыхательной цепи (по Acin-Perez and Enriquez, 2014, с изменениями). Жидкостная модель отражает представления о свободной диффузии переносчиков электронов между отдельными независимыми комплексами. Респирасома показана в ассоциации с АТФ-синтазой. Пластическая модель дыхательной цепи сочетает в себе набор суперкомплексов дыхательной цепи различного состава и некоторое количество отдельных независимых друг от друга комплексов. Геометрические фигуры обозначают отдельные комплексы дыхательной цепи. Тонкие стрелки показывают генерацию и использование протонного градиента внутренней мембраны митохондрий, толстая стрелка обозначает возможность динамической сборки и разборки суперкомплекса. Вопросительным знаком отмечены комплексы, существование которых постулируется, но еще не доказано экспериментально. Цитохром c необходим для образования дисульфидных связей в белках межмебранного пространства митохондрии, поскольку на него передаются электроны от белка Erv1, обслуживающего тиол-оксидазу Mia40, которая окисляет два остатка цистеина до цистина (Chacinska et al., 2004). При этом оба белка Erv1 и Mia40 сами содержат цистеины, которые способны к обратимому окислению и восстановлению (Ang et al., 2014). Цитохром c может также получить электрон в процессе обезвреживания супероксид 13 анион-радикала, при этом происходит регенерация молекулярного кислорода (Korshunov et al., 1999). Еще одним способом борьбы с АФК в митохондриях является разложение перекиси водорода цитохром c–пероксидазой (Yonetani, Ray, 1965). Этот белок содержит гем, который окисляется перекисью водорода, а для регенерации гема необходимы электроны, принимаемые от цитохрома c. В дрожжевой системе было показано, что для этого процесса являются критическими остатки Arg13 цитохрома и Tyr39 пероксидазы (Volkov et al., 2009). В свою очередь, цитохром с также может участвовать в генерации активных форм кислорода, окисляя белок p66Shc, относящийся к Src-семейству (Nemoto et al., 2006). Интересно, что p66Shc в отличие от своих гомологов является не адаптерным белком, а оксидоредуктазой межмембранного пространства митохондрий, которая генерирует перекись водорода (Giorgio et al., 2005). Таким образом, цитохром c является ключевым переключателем между утилизаций и генерацией АФК в митохондрии. Вышеописанные белки и ряд других лигандов цитохрома с более подробно описаны в обзоре Диаз-Моррено и коллег (Díaz-Moreno et al., 2011b). Относительно других лигандов цитохрома с следует отметить, что этот белок способен связывать полианионы, такие как полинуклеотиды, АТФ и АДФ (Ferguson-Miller et al., 1976), а также различные тРНК (Mei et al., 2010). При этом связывание тРНК в цитоплазме препятствует взаимодействию с Apaf-1 и образованию апоптосомы (Mei et al., 2010), а связывание с АТФ в митохондриях негативно регулирует перенос электронов на цитохром-оксидазу (Craig, Wallace, 1995), а в цитоплазме - препятствует образованию апоптосомы (Chandra et al., 2006). Учитывая большое число взаимодействующих партнеров как в митохондрии, так и в цитоплазме, для цитохрома c была предложена концепция сигналосомы – совокупности комплексов, в образовании которых принимает участие цитохром c. Партнеры цитохрома c и его основные взаимодействия представлены на Рис. 3. Предполагается, что цитохром c – сигналосома служит для гомеостатирования уровня АФК в митохондриях (Díaz-Moreno et al., 2011b). 14 Рисунок 3. Основные взаимодействия цитохрома c и его партнеров (по DíazMoreno et al., 2011b, с изменениями). Цитохром c обозначен как Сс, цитохром c– пероксидаза обозначена СсР. Пунктирные стрелки показывают перенос электронов, сплошные стрелки показывают взаимодействия молекул и их перемещения. 1.2 Цитохром с, вариабельность его структуры и связанные с ним генетические модели Почти все белковые компоненты дыхательной цепи, в том числе и цитохром c, кодируются ядерными генами, синтезируются рибосомами в цитоплазме и затем экспортируются в митохондрии. Цитоплазматический апоцитохром c сам по себе не способен ни переносить электроны, ни стимулировать образование апоптосомы, однако после того как митохондриальный фермент холоцитохром-c-синтаза присоединяет к белку молекулу гема b, получившийся холоцитохром c становится функционально активным (Mavridou et al., 2013). У многих животных этот белок существует в нескольких изоформах, так, у грызунов есть два гена цитохрома с, Cycs и Cyct, кодирующие соответственно его соматическую и тестикулярную изоформы (Hake et al., 1994). Дивергенция генов цитохрома с произошла до разделения предков птиц и млекопитающих, однако у общего предка приматов работа тестикулярного гена была нарушена нонсенс-мутацией 15 (Pierron et al., 2011). Тестикулярная форма цитохрома c экспрессируется только в созревающих мужских гаметах в ходе сперматогенеза, в то время как соматическая форма экспрессируется во всех клетках в ходе всего онтогенеза с момента активации генов эмбриона (Hennig, 1975). Оба белка способны выполнять один и тот же набор функций, причем тестикулярный цитохром с оказался более эффективен, чем соматический, в in vitro тестах на индукцию апоптоза и утилизацию активных форм кислорода (Liu et al., 2006). У цитохрома с в геномах млекопитающих также иммется множество псевдогенов, в том числе 49 псевдогенов у человека, и более 40 – у мышей (Zhang, Gerstein, 2003). У почкующихся дрожжей S. cerevisiae также существуют две изоформы цитохрома с, которые отличаются друг от друга уровнем экспрессии (Sherman et al., 1965), и кодируются двумя разными генами, CYC1 и CYC7 (Downie et al., 1977). Примерно 95% общего количества это белка дрожжевой клетки приходится на изоформу 1, и только 5% - на изоформу 2. В то же время известно, что дрожжи с мутациями cyc1, нарушающими работу изоформы 1 цитохрома с, способны поддерживать работу дыхательной цепи посредством оставшегося небольшого количества белка изоформы 2 (Sherman et al., 1974). При этом критерием, позволяющим отличить мутантов по гену CYC1, кодирующему эту мажорную изоформу, от двойных мутантов или мутантов по другим, уникальным генам белков дыхательной цепи, является способность дрожжей расти на среде с глицеролом либо этанолом в качестве единственного метаболического субстрата. Что интересно, повышение экспрессии CYC7 в 20-30 раз в результате делеции регуляторной области CYC7-Н3 приводило к росту чувствительности дрожжевых клеток к ультрафиолетовому излучению и другим индуцирующим клеточную гибель воздействиям, однако это было связано с нарушениями работы сцепленных генов RAD23 и ANP1, но не проапототическим действием самого цитохрома с, которое на тот момент было неизвестно (McKnight et al., 1981). Дрожжевые модели также показали, что отсутствие цитохрома c в митохондриях 16 приводит к нарушению сборки полноразмерного цитохромоксидазного комплекса дыхательной цепи и ускоренной деградации его отдельных субъединиц (Pearce and Sherman, 1995). Интересно, что цитохром c для этого необходим только в качестве лиганда, а не в качестве переносчика электронов, (Schweingruber поскольку et al., даже функционально восстанавливал 1979) неактивный нативную белок сборку и ферментативную активность цитохромоксидазы (Barrientos et al., 2003). Активность других комплексов дыхательной цепи у дрожжей от дефицита цитохрома c не страдает. В целом дрожжевые модели показали, что дыхательная цепь митохондрий может функционировать в широком динамическом диапазоне внутриклеточного количества цитохрома c, который, тем не менее, необходим для приобретения цитохром-оксидазой нативной четвертичной структуры. Более релевантными для человека моделями по сравнению с описанными ранее являются различные линии трансгенных мышей. Генетический нокаут тестикулярного цитохрома с у мышей приводит к преждевременной атрофии семенников, однако никак не сказывается на качестве спермы и фертильности самцов (Narisawa et al., 2002). В то же время генетический нокаут Cycs приводит к гибели мышиных эмбрионов в период восьмого-десятого дней эмбриогенеза (Li et al., 2000). Именно в это время происходит переключение энергетического метаболизма клеток развивающегося зародыша с гликолиза на окислительное фосфорилирование, которое далее будет обеспечивать примерно 95% потребности организма в АТФ (Morriss and New, 1979). При этом тестикулярная изоформа является полноценным аналогом соматической, поскольку в некоторых клеточных линиях с нарушенной экспрессией соматического цитохрома с происходит компенсаторная экспрессия тестикулярного цитохрома с, который может полностью заместить соматическую изоформу (Vempati et al., 2007). На уровне первичных культур мышиных фибробластов отсутствие в них цитохрома с не является препятствием для культивирования (Vempati et al., 17 2007), однако требует добавления в среду пирувата и уридина, так же как в случае ρ0 клеток с повреждением митохондриальной ДНК (King and Atardi, 1989). Однако лишенные цитохрома с клетки имеют дефекты сборки полноразмерных комплексов дыхательной цепи I и IV, снижение доли кардиолипина среди мембранных липидов митохондрии (Vempati et al., 2009), а также нарушения индукции клеточного ответа на гипоксию из-за неспособности к накоплению стабилизированных прогипоксических факторов транскрипции HIF-1 и HIF-2 (Mansfield et al., 2005). При этом нативный комплекс III присутствует в бесцитохромных клетках, хотя и в меньшем количестве по сравнению с нормальными клетками (Vempati et al., 2009). Нарушение нативной четвертичной структуры не только цитохромоксидазы, но и NADH-оксидазы позволяет считать, что цитохром с у мыши необходим для сборки нескольких комплексов дыхательной цепи из отдельных субъединиц. Также можно предположить, что этот белок может участвовать в образовании суперкомплексов дыхательной цепи, в том числе респирасомы, что более подробно рассмотрено в следующем разделе. Рассматривая значимость отдельных аминокислот в составе цитохрома c, необходимо отметить, что этот белок довольно консервативен с эволюционной точки зрения, что позволило использовать его для построения одной из первых молекулярно-филогенетических схем более 50 лет назад (Margoliash, 1963). Тем не менее, у человека существует несколько распространенных в отдельных популяциях однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), приводящих к аминокислотным заменам. Их перечень, составленный на основе базы данных GeneCards, приведен в таблице 1 ниже. 18 Таблица 1. Генетический полиморфизм и возможные вариабельные аминокислотные остатки цитохрома с человека № 1 Название Аминокислотная Нуклеотидная замена SNP замена rs121918552 Gly41Ser AGACAA/GGTCAG Примечание Вызывает тромбоцитопению 2 - Tyr48His ACTCTT/CACACA Вызывает тромбоцитопению 3 rs11548785 Lys87Arg TAAGAA/GGAAGG Не подтверждена на уровне белка 4 rs11548795 Lys55Arg GAACAA/GAGGCA Не подтверждена на уровне белка 5 rs11548783 Ser47Pro GATACT/CCTTAC Не подтверждена на уровне белка 6 rs201336975 Val20Phe TTCAAA/CGGTGT Не подтверждена на уровне белка 7 rs367666281 Thr102Ala ATTAGC/TAGCTT Не подтверждена на уровне белка 8 rs11548778 Met80Thr AAAAAC/TGATCT Не подтверждена на уровне белка 9 rs146569499 Ile11Phe CATAAT/AAAAAA Не подтверждена на уровне белка 10 rs113106786 Met12Thr ACTTCA/GTAATA Не подтверждена на уровне белка При этом особый интерес представляют первые две замены, связанные с семейными формами тромбоцитопении – Gly41Ser (Morison et al., 2008) и Tyr48His (De Rocco et al., 2014). Было показано, что обе эти мутации приводят к аутосомно-доминантной тромбоцитопении, характеризующейся снижением количества тромбоцитов, повышением проапоптотической активности и, возможно, снижением уровня клеточного дыхания. В то же 19 время данные о снижении клеточного дыхания являются противоречивыми, поскольку исходно для замены Gly41Ser была показана нормальная активность дыхательной цепи в экспериментальной системе очищенных и пермеабилизованных митохондрий с добавлением различных концентраций экзогенного цитохрома (Morison et al., 2008). Для аминокислотной замены Gly41Ser получена кристаллографическая структура молекулы цитохрома c и показано, что замена приводит к перераспределению электронной плотности в тетрапиррольной системе гема, что может влиять на взаимодействие цитохрома c и его партнеров (Liptak et al., 2011). При этом обе замены в работе ДиРокко и коллег приводили к снижению дыхательной активности, однако эти данные были получены на гораздо более грубой системе, на основе трансгенных дрожжей S. cerevisiae, которых трансформировали плазмидами с нормальными и мутантными генами CYC1. Мутации в гене по CYC1 аминокислотным остаткам соответствовали обеим рассматриваемым мутациям человека. При этом в работе отсутствовал даже контроль одинаковой эффективности трансгенеза. В случае с проверкой исходных замен в гене Cycs человека, были трансформированы мышиные легочные фибробласты, нокаутные по цитохрому c, однако, несмотря на различающуюся для разных конструкций эффективность трансфекции, активность дыхательной цепи оказалось одинаковой. Тем не менее, вклад мутаций цитохрома c в развитие семейных форм тромбоцитопении бесспорен, одна из форм этого заболевания, THC4 связана исключительно с этим белком, для более подробного знакомства с этой областью можно порекомендовать, например, обзор Бальдуини и Савойи (Balduini and Savoia, 2012). Помимо аминокислотных замен, связанных с мутациями кодирующей части гена Cycs, цитохром c подвергается посттрансляционным химическим модификациям, которые влияют на его свойства. В составе цитохрома c могут фосфорилироваться остатки тирозина Tyr48 и Tyr97, причем первая модификация показана для белка, выделенного из бычьей печени (Yu et al., 20 2008), а вторая – из бычьего сердца (Lee et al., 2006). Обе модификации несколько снижали эффективность переноса электронов с цитохрома c на цитохром-оксидазу. Наблюдаемая кинетика этой реакции не позволяет считать фосфорилирование тирозинов лимитирующим для дыхательной цепи, однако фосфорилирование способно в некоторой степени регулировать её активность (Hüttemann et al., 2011). Помимо тирозина могут фосфорилироваться также остатки Thr48 и Ser47, но влияют ли эти модификации на какой-либо аспект функционирования этого белка, неизвестно (Zhao et al., 2011). Киназа, которая способна к фосфорилированию цитохрома с, пока не установлена. Также, остатки тирозина Tyr46 и Tyr48 способны к нитрованию - присоединению оксида азота по ароматическому кольцу (Díaz-Moreno et al., 2011b), что не влияет на способность цитохрома взаимодействовать с комплексами дыхательной цепи, но снижает его проапоптотическую активность (García-Heredia et al., 2012). Интересно, что способный к нитрованию и фосфорилированию остаток Tyr48 был при помощи направленного мутагенеза заменен на глутаминовую кислоту, которую используют в качестве функционального аналога фосфорилированных аминокислот. Эта модификация негативно сказалась на времени переноса электронов между цитохромом с и цитохромоксидазой, на способности связываться с кардиолипином, а также на способности активировать внутренний путь апоптоза (Pecina et al., 2010). В то же время, замена Tyr48Phe не повлияла на указанные параметры, что рассматривается фосфорилирования в качестве тирозина-48 доказательства регуляторной для апоптоза. регуляции роли Впрочем, описанные эффекты наблюдались с рекомбинанатным белком в in vitro модели, что в случае цитохрома с не всегда находит подтверждение in vivo. Эффекты от замены многих аминокислот и взаимосвязь между функцией белка и его первичной структурой были показаны для цитохрома c in vitro или на модельных организмах при помощи направленного мутагенеза. Оказалось, что аминокислотные остатки K7, K25, K39, K72, и 6221 65 (ETLM) являются критическими для связывания цитохрома c Apaf-1, причем наиболее значимым из них является K72 (Yu et al., 2001). Остальные перечисленные аминокислотные остатки также уменьшали способность цитохрома c активировать внутренний путь апоптоза, однако в меньшей степени и только при кумулятивном взаимодействии. Нужно отметить, что при экспрессии цитохрома с млекопитающих в клетках S. cerevisiae полученный белок сохраняет функциональную активность в дыхательной цепи, но неспособен к индукции апоптоза и взаимодействию с Apaf-1 именно по причине триметилирования в клетках дрожжей аминокислотного остатка лизина К72 (Kluck et al., 2000). Эти работы стимулировали создание панели рекомбинантных цитохромов c, экспрессируемых в клетках E. coli, с различными аминокислотными заменами в положении К72 (Abdullaev et al., 2002; Sharonov et al., 2005; Chertkova et al., 2008). Далее эти варианты цитохрома c вводились в бесклеточную систему на основе ооцитов шпорцевой лягушки (Abdullaev et al., 2002), в клеточную линию миелоидного происхождения WEHI-3 путем электропорации (Sharonov et al., 2005), а также в клеточные линии HL60, K562 и Jurkat (Chertkova et al., 2008). Оказалось, что из всех клеточных линий на введение экзогенного цитохрома с отвечала апоптозом только линия WEHI-3. На ней и на экстрактах ооцитов шпорцевой лягушки было показано, что замена лизина на аргинин слабо влияет на проапоптотическую функцию цитохрома c, однако замены K72G, K72А, K72E, K72L и в наибольшей степени K72W снижают проапоптотический эффект этого белка. В целом, нужно отметить, что эти работы подтвердили различие в механизмах индукции апоптоза между клеточными линиями миелоидного (цитохром-зависимый механизм) и лимфоидного происхождения (цитохром-независимый). Для замены K72W был показан доминантный негативный эффект в отношении индукции апоптоза нативным цитохромом с (Sharonov et al., 2005), однако затем та же группа исследователей указала на отсутствие такого эффекта (Chertkova et al., 2008). Все варианты цитохрома с из этой панели сохраняли способность 22 нормально поддерживать работу дыхательной цепи. Более подробно роль отдельных аминокислотных остатков и модификаций цитохрома с рассмотрена в обзоре Куликова и соавторов (Kulikov et al., 2011). Первичная структура цитохрома с некоторых организмов, а также ключевые для взаимодействия с Apaf-1 остатки аминокислот показаны на Рис. 4. Рисунок 4. Первичная структура цитохромов с дрожжей, мыши, лошади и человека (по Kulikov et al., 2011). Столбики показывают относительную консервативность аминокислот в определенных положениях, затемненные рамки показывают аминокислоты, важные для взаимодействия с Apaf-1. На рисунке представлены последовательности соматического и тестикулярного цитохромов с мыши, соматических цитохромов с лошади и человека, а также изоформы-1 и -2 цитохрома с почкующихся дрожжей. Помимо двух мышиных моделей генетического нокаута генов Cycs и Cyct соответственно, существуют также две модели генетического нокина Cycs по наиболее критическому с точки зрения предыдущих исследований аминокислотному остатку К72 (Hao et al., 2005; Kanungo et al., 2008; Муфазалов и др., 2009; Муфазалов и др., 2011). Аланиновый генетический нокин К72А был описан на смешанном генетическом фоне мышей линий 129Ola и C57BL/6 и характеризовался сниженной жизнеспособностью эмбрионов и новорожденных мышат, наличием мышат с гидроцефалией, кахексией и острой лимфопенией, кроме того, у части эмбрионов наблюдались аномальные разрастания переднего мозга (Hao et al., 2005). Опыты in vitro с МЭФами, гомозиготными по замене К72А показали, что они 23 характеризуются нормальным уровнем клеточного дыхания, но более устойчивы к таким индукторам апоптоза как стауроспорин и ультрафиолетовое излучение. При этом гомозиготные лимфоциты К72А/ К72А отвечали на проапоптотические стимулы практически так же эффективно, как и лимфоциты дикого типа. При пересадке костного мозга от мышей К72А/К72А к Rag1-дефицитным мышам, у которых было полностью нарушено развитие лимфоцитов, через 2 месяца после пересадки происходило восстановление нормального количества Т- и В-клеток, однако у 3 мышей из 7 через год после пересадки развилась спленомегалия. На фоне постнатальной аксотомии лицевого нерва у мышей К72А/К72А было показано предотвращение апоптоза поврежденых мотонейронов (Kanungo et al., 2008). В целом, опыты с К72А/К72А мышами показали, что среди них существует высокая степень гетерогенности фенотипа, на которую авторы, однако, не обратили должного внимания или предпочли ее не обсуждать. Для полученного ранее в нашей лаборатории триптофанового генетического нокина K72W также была характерна в первую очередь гетерогенность проявлений антиапоптотического фенотипа у потомства от первых возвратных скрещиваний. Так же как и в случае гомозиготности по замене К72А, наблюдалась эмбриональная и постнатальная летальность, а также появление гидроцефалов и кахектичных мышат. Часть первичных культур МЭФов показывала большую устойчивость к проапоптотическим стимулам, в то время как другая часть культур с тем же генотипом демонстрировала нормальный ответ на индукцию апоптоза. После десяти возвратных скрещиваний на генетическую основу линии C57BL/6 явные фенотипические отличия мышей К72W/К72W перестали воспроизводиться (данные не опубликованы), что указывает на ключевую роль гибридного генетического бэкграунда 129Ola/C57BL/6 для проявления антиапоптотического действия аминокислотной замены K72W и, повидимому, K72A. Вопрос, с какими генами-модификаторами или эпигенетическими изменениями были связаны дефекты запуска апоптоза у 24 мышей гибридного генетического бэкграунда 129Ola/C57BL/6, остается на данный момент открытым, также как и вопрос, насколько сохраняется антипоптотическое действие замены K72W в условиях чистого генетического бэкграунда линии В6. 1.3. Значение процессов, в которые участвует цитохром с, для различных клеток иммунной системы Следует отметить, что модели, в которых бы напрямую изучались последствия изменения количества цитохрома с в различных клетках иммунной системы, в литературе к настоящему времени не описаны. Можно обсуждать только общие характеристики метаболизма различных клеток иммунной системы, а также значимость для них внутреннего пути апоптоза, чему и посвящен данный раздел диссертационной работы. Следует отметить, что все клетки иммунной системы после активации нуждаются в большом количестве АТФ и других метаболитов, однако решают эту задачу разными способами. Неслучайно «сигнал два», который Т-клетка получает от антигенпрезентирующей клетки при помощи костимуляторных молекул семейства В7 и собственного рецептора CD28 также иногда называют «fuel signal» (Jones and Thompson, 2007). Наивный Т-лимфоцит имеет довольно скромные метаболические потребности, которые удовлетворяет в основном при помощи окислительного фосфорилирования, однако после активации Тклетка увеличивает объем цитоплазмы и переключается на аэробный гликолиз, выделяя большое количество молочной кислоты. Для большинства клеток нашего организма гликолиз возможен только при гипоксии, в то время как при нормальном содержании кислорода глюкоза метаболизируется до пировиноградной кислоты, которая затем декарбоксилируется, а полученный ацетил-кофермент А окисляется в цикле Кребса. Таким образом, для активированных Т-лимфоцитов, также как и для опухолевых клеток, свойственен эффект Варбурга – гликолитический метаболизм в присутствии кислорода. Интересно, что эта особенность лимфоцитов была замечена 25 самим Отто Варбургом, спустя много лет после открытия эффекта Варбурга для опухолей (Warburg et al., 1958). После перехода Т-лимфоцита из эффекторного состояния в состояние Т-клетки памяти его метаболизм возвращается к преобладанию окислительного фосфорилирования (Рис. 5). При этом первый раз переход к повышению гликолитической активности и обратно будущая Т-клетка претерпевает еще в тимусе, во время прохождения стадий DN3 и DN4 двойного отрицательного по маркерам CD4 и CD8 тимоцита (MacIver et al., 2013). Рисунок 5. Особенности метаболизма Т-лимфоцитов (по MacIver et al., 2013, с изменениями). Показаны биохимические пути и основные метаболиты. Покоящиеся наивные Т-клетки в тимусе и на периферии имеют ограниченную метаболическую активность, поскольку они не пролиферируют и расходуют энергию только на процесс миграции и поддержание постоянства энергетическими субстратами внутриклеточного для них состава. являются Основными жирные кислоты, подвергаемые β–окислению, а также пировиноградная кислота и глутамин (van der Windt, Pearce, 2012). Все эти вещества катаболизируются до ацетилкофермента А, который затем используется в цикле Кребса, а полученные восстановительные эквиваленты окисляются дыхательной цепью митохондрий. Нужно отметить, что уровень дыхания у покоящихся лимфоцитов является низким относительно других типов клеток. Так, в 26 работе Эсманна и Хедескова (Hedeskov and Esmann, 1966) для покоящихся лимфоцитов человека было показано потребление 117 мкМоль кислорода в час на 1010 клеток, что примерно соответствует 0,2 нМоль/106 клеток мин. х При этом потребление глюкозы в том же эксперименте составило приблизительно 0,1 нМоль/106 клеток 0,15 нМоль/106 клеток х х мин, а выход молочной кислоты - мин, что позволяет оценить долю глюкозы, используемой для гликолиза, для совокупной популяции лимфоцитов как составляющую около 75%. Следует отметить, что в этом эксперименте основной вклад в дыхание и гликолиз смешанной популяции лимфоцитов, вероятно, вносили В-клетки, которые, во-первых, используют гликолиз наряду с дыханием в наивном состоянии (Walker et al., 2014), а во-вторых, после активации, как через BCR так и через TLR4, существенно наращивают интенсивность обоих этих путей катаболизма (Dufort et al., 2007). Кроме того, для лимфоцитов in vitro характерен «краудинг эффект» - высокая плотность клеток в суспензии значительно снижает дыхательную активность в пересчете на одну клетку, поскольку в этом случае происходит интенсивная конкуренция между клетками за молекулы кислорода (Hedeskov, Esmann, 1966). При этом лимфоциты для поддержания базового уровня метаболизма, по-видимому, нуждаются в IL-7, поскольку нокаут IL7R в клетках острой Тклеточной лейкемии приводит к гибели этих клеток на фоне ослабления интенсивности гликолиза (Barata et al., 2004). На уровне внутриклеточной регуляции метаболизма активация Тклеток через костимуляторную молекулу CD28 и рецепторы пролиферативных цитокинов, таких как IL-2, приводит к активации киназы АКТ и mTORпути (Frauwirth et.al., 2002), что в свою очередь вызывает слияние с плазматической мембраной «резервных» везикул с транспортером глюкозы Glut1 и увеличение экспрессии ферментов гликолиза (Wieman et.al., 2007). Следствием зависимости активированных Т-лимфоцитов от гликолиза является то, что в них находится меньше митохондрий, чем в клетках памяти и наивных Т-клетках. При этом количество митохондрий в CD8+ Т-клетках 27 памяти и активность в них карнитинового транспорта жирных кислот для дальнейшего окисления в митохондриальный матрикс зависят от интерлейкина-15 (van der Windt et al., 2012). Ситуация, когда Т-лимфоцит получает сигнал от Т-клеточного рецептора, но не получает костимулирующий сигнал, приводит к тому, что вместо активации клетка переходит в состояние анергии, которое сопровождается невозможностью интенсифицировать гликолиз и её последующей гибелью. У клеток в состоянии анергии на поверхности оказывается слишком малое число молекул Glut1, транспортера аминокислот CD98 и трансферринового рецептора CD71 (Zheng et al., 2009). При этом вывести клетки из состояния анергии можно при помощи добавления только одного цитокина – интерлейкина-2 (Beverly et al., 1992). Направление дифференцировки эффекторной Т-клетки также влияет на её метаболизм. Интенсивный аэробный гликолиз и почти полное прекращение клеточного дыхания после активации характерны для CD8+ цитотоксических клеток (He et al., 2011), а также для CD4+ хелперов Th1, Th2, Th17, но не для регуляторных CD4+ Т-клеток (Shi et al., 2011). Для популяции Treg характерно получение АТФ при помощи аэробного метаболизма, в основном, β–окисления жирных кислот и последующего окислительного фосфорилирования. Таким образом, Т-лимфоциты в основном используют для интенсификации метаболизма гликолитический путь метаболизма глюкозы, чем отличаются от других клеток иммунной системы. В специфичности ходе своего может развития неоднократно Т-клетка менять одной свой определенной метаболизм с окислительного на гликолитический и обратно. При этом Т-лимфоциты в наименьшей степени зависят от интенсивности работы дыхательной цепи по сравнению с другими клетками иммунной системы и представляют собой систему, в которой эффекты дисбаланса компонентов дыхательной цепи проявлялись бы в наиболее мягкой форме, что и подтвердила данная диссертационная работа. 28 Миелоидные клетки также способны к переключению основного метаболического пути в процессе дифференцировки. Дендритные клетки развиваются из клеток-предшественниц CDP, при этом в них увеличивается число митохондрий, однако после активации дендритных клеток происходит интенсификация гликолиза, а затем и подавление окислительного фосфорилирования (Pearce, Everts, 2014). Учитывая то, что активация дендритных клеток сопряжена с развитием локального воспаления, сопровождающегося местной гипоксией, переключение на бескислородный тип метаболизма представляется единственно возможной стратегией для всех активированных миелоидных клеток. Действительно, более сорока лет назад было показано, что макрофаги после активации коринебактериями в два раза снижают потребление кислорода и скорость синтеза белков, во столько же раз увеличивают интенсивность гликолиза и в пять раз снижают количество внутриклеточного АТФ (Hard, 1970). Также было показано, что макрофаги используют примерно 75% потребляемого клеткой кислорода на работу дыхательной цепи, причем добавление карбонилцианид хлорфенилгидразона, протонофора, разобщающего процессы окисления и фосфорилирования, приводит лишь к двукратному увеличению потребления кислорода. При этом добавление к клеткам экзогенных субстратов цикла Кребса, например, сукцината или пирувата, увеличивала потребление кислорода всего лишь в 1,5 – 1,7 раза (Newsholme et al., 1987). Таким образом, в покоящихся или классическим образом активированных макрофагах дыхательная цепь уже работает в режиме, близком к максимально возможному для нее, однако ее вклад в общий энергетический баланс клетки невелик. Так же как и в случае лимфоцитов, у макрофагов наблюдается эффект Варбурга и гликолиз не подавляется кислородом (Galvan-Pena, O'Neill, 2014). Однако помимо классического пути активации макрофагов, приводящего к их поляризации в М1-тип, существует также альтернативный путь, дающий М2-макрофаги. Он запускается не лигандами патогенраспознающих рецепторов и провоспалительными 29 цитокинами, а интерлейкином-4 (Stein et al., 1992), а также интерлейкином-13 (Sinha et al., 2005). Кроме того, перевести макрофаги в состояние М2 можно при помощи иммунных комплексов антител в сочетании с интерлейкином-1β или ЛПС, либо действием противовоспалительных цитокинов TGFβ и интерлейкина10, а также глюкокортикостероидов (Martinez et al., 2008). В зависимости от выбранного способа альтернативной активации макрофаги обозначаются М2а, M2b и М2c, соответственно. Разные популяции М2 макрофагов, повидимому, используются в различных процессах – антипаразитарном иммунном ответе, остановке иммунного ответа и ремоделировании тканей после повреждений, однако на данный момент вопросы их взаимозаменяемости и функциональных различий не вполне ясны (Рис. 6). При этом все М2-макрофаги используют для получения АТФ в основном клеточные дыхание, основанное на β-окислении жирных кислот и цикле Кребса (Odegaard, Chawla, 2011). Рисунок 6. Особенности метаболизма и поляризации М1 и М2 макрофагов (по Galvan-Pena, O'Neill, 2014, с изменениями). Показаны биохимические пути и основные метаболиты. Интересно, что М1 и М2 макрофаги по-разному используют избыточно потребляемый ими аргинин – в М1 клетках он окисляется индуцибельной NO-синтазой iNOS (Green et al., 1990), а в М2-клетках трансаминируется с помощью аргиназы в реакциях орнитинового цикла (Corraliza et al., 1995). Очевидно, что это - два альтернативных способа утилизировать избыточный 30 внутриклеточный азот, образующийся в результате расщепления аминокислот из состава фагоцитированных частиц. Нейтрофилы имеют небольшое количество митохондрий, которые необходимы для осуществления апоптоза, однако не вносят какого-либо значительного вклада в энергетические потребности, удовлетворяемые за счет гликолиза (Geering, Simon, 2011). При этом пермеабилизация внутренней мембраны митохондрий нейтрофилов является ключевым событием для их апоптоза, а следовые количества цитохрома с оказываются достаточными для активации апоптосомы (Murphy et al., 2003). Предполагается, что для компенсации малого количества цитохрома с в нейтрофилах может служить увеличенное количество цитоплазматического Apaf-1 и проапоптотических митохондриальных белков Smac и Omi (Maianski et al., 2004). Что касается значения выхода цитохрома с из митохондрий в активации апоптоза клеток иммунной системы в целом, то надо отметить, что лимфоциты относятся к клеткам первого типа – рецепторзависимый апоптоз у них происходит без участия белков Bcl-семейства и каскада, связанного с пермеабилизацией внешней мембраны митохондрий (Strasser et al., 1995). Клетки второго типа в ответ на активацию «рецепторов смерти» расщепляют проапоптотический белок Bid с помощью каспазы-8 (Yin et al., 1999), а получившийся фрагмент tBid вызывает образование на мембране митохондрий порового комплекса из белков Bax/Bak (Yi et al., 2003). Митохондриальный путь запуска апоптоза крайне важен для развития как лимфоидных, так и миелоидных клеток, на что указывают деплеции клеток иммунной системы в случае нокаутов генов Bcl-2-семейства, контролирующих этот путь. Нокаут самого Bcl-2 не приводит к летальности эмбрионов, однако Bcl-2-/- мыши страдают от почечной недостаточности, прогрессирующей лимфопении, которая затрагивает как В-, так и Т-клетки, а также меняют окраску шерсти на светлую на втором цикле волосяных фолликулов в возрасте примерно 5-6 недель (Veis et al., 1993). Нокаут Bcl-x приводит к гибели эмбрионов возраста Е13, при этом их фенотип можно 31 изучить с использованием химерных мышей Bcl-х-/-:Rag2-/-, у которых нет собственных лимфоцитов дикого типа, а Bcl-х-дефицитные лимфоциты имеют аномально высокую гибель на незрелых стадиях (Motoyama et al., 1995). Более подробно эта проблема обсуждается в Главе 29 монографии под редакцией Дугласа Грина и Джона Рида (Reed, Green, 2011). 1.4. Избирательное редактирование генома в определенных типах клеток in vivo и генетические модели митохондриальных заболеваний Для изучения последствий отдельных мутаций, приводящих к генетическим заболеваниям человека, можно использовать животные модели, полученные методами так называемой «обратной генетики». Суть обратной генетики состоит в том, что в геном модельного животного вносятся изменения, либо воспроизводящие известную у больных людей мутацию, либо нарушающие экспрессию тех генов, регуляция которых у больных нарушена (Landel et al., 1990). Впервые такой подход был применен группой Марио Капеччи в отношении протоонкогена int-2 мыши, для которого была получена линия эмбриональных стволовых клеток с делецией этого гена, затем эти клетки были пересажены в бластоцисту дикого типа, из которой развилась химерная мышь, в организме которой присутствовали клетки двух генотипов (Mansour et al., 1988). Если потомки трансформированных стволовых клеток становились клетками зародышевой линии, то в следующем поколении рождались мыши, имеющий нарушенный ген-мишень во всех клетках организма. Скрестив двух гетерозиготных мышей, можно получить гомозиготную мышь, у которой нарушены обе аллельные копии гена-мишени (Hogan, Lyons, 1988), так называемый «генетический нокаут» (Hinrichs et al., 1991). В 2007 году Марио Капеччи был удостоен Нобелевской премии за разработку этой технологии. Однако использование технологии генетического нокаута не всегда позволяет сделать заключение о функциях гена и последствиях их нарушения. Для значительного числа генов нарушение их работы на уровне 32 всего организма несовместимо с нормальным онтогенезом и приводит к гибели эмбрионов. Проблема летальности фенотипа определенных мутаций, получаемых с помощью подхода обратной генетики, может быть решена двумя способами: либо посредством создания соматических химер на основе стволовых клеток, либо при помощи избирательного редактирования генома только в определенном типе клеток. Наиболее хорошо эта область разработана для мышей, другие модельные объекты пока не могут похвастаться таким обширным арсеналом молекулярно-генетических методов, поэтому в дальнейшем речь будет идти именно о методах работы с мышами и мышиных моделях. Для лимфоцитов в качестве реципиентов обычно используют иммунодефицитных Rag2-нокаутных мышей, у которых не развиваются В- и Т-клетки, а в качестве доноров – эмбриональные стволовые клетки из зародышей с предлетальной стадии (Chen et al., 1993a). Такой подход получил название «комплементация в бластоцисте» и впервые был применен лабораторией Фредерика Альта для изучения последствий делеции экспрессирующегося в лимфоцитах онкосупрессора Rb (Chen et al., 1993b). Что интересно, никаких последствий для лимфоцитов нокаут гена Rb не имел. Впрочем, подход с использованием химерных мышей для изучения особенностей фенотипа генетических нарушений в клетках определенного типа не получил широкого распространения, поскольку оказался более трудоемким и менее универсальным по сравнению с предложенным в то же время лабораторией высокоспецифических Клауса Раевского рекомбиназ под методом с использованием тканеспецифическими или индуцибельными промоторами (Gu et al., 1993). Наиболее широко в настоящее время для этих целей используется рекомбиназа Сre, узнающая специальные последовательности длиной 34 п.н., называющиеся LoxP. Эта рекомбиназа была открыта у умеренного бактериофага Р1 (Hoess, et al., 1982), однако может проводить специфическую рекомбинацию двух сайтов узнавания LoxP вне зависимости от того, в каком геноме они находятся (Sauer, Henderson, 1988). Последовательность LoxP представляет собой два 33 инвертированных повтора размером 13 п.н. и специфический спейсер между ними. Последовательность внутри спейсера может варьировать, при этом рекомбиназа Cre сможет осуществить рекомбинацию только между Loxсайтами с одинаковыми спейсерами, таким образом можно создавать сложные конструкции с большим числом Lox-сайтов, которые рекомбиназа тем не менее будет перестраивать единственно возможным способом (Missirlis et al., 2006). Мыши, несущие ген рекомбиназы Cre, называются Creделитерами, в настоящее время описано несколько сотен различных линий Cre-делитеров, обеспечивающих широкое разнообразие выбора клетокмишеней (Kuhn, Wurst, 2009). Они могут быть использованы для получения гибридных мышей, у которых рекомбиназа будет синтезироваться и удалять ген-мишень только в клетках определенного типа. Принцип использования мышей Cre-делитеров и каноническая последовательность LoxP показаны на Рис. 7. При этом активность рекомбиназы может регулироваться тканеспецифическими промоторами, ограничивающими популяцию клеток, в которых будет синтезироваться рекомбиназа, либо при помощи химерного белка, у которого димеризация рекомбиназы будет зависеть от связывания регуляторной субъединицы с добавляемым извне лигандом (Lewandoski, 2001). Как правило, такой субъединицей служит фрагмент эстрогенового рецептора человека, а селективным лигандом - химический аналог стероидных гормонов тамоксифен и его производные (Metzger et al., 1995). Наиболее распространенной рекомбиназой для такой технологии в настоящее время является фермент CreERT2, обладающий повышенной селективностью к 4-гидрокситамоксифену (Leone et al., 2003). 34 Рисунок 7. Принцип кондиционного редактирования гена с использованием тканеспецифической cre-рекомбиназы (по Kuhn and Wurst, 2009 с изменениями). Обозначены схема скрещивания, последовательность LoxP-сайта и ориентация LoxP для делеции или инверсии LoxP-фланкированной последовательности. Помимо мышей с различными вариантами рекомбиназы Cre для специфического удаления генов-мишеней можно применять мышей с рекомбиназой Flp, впервые почкующихся дрожжей открытой (Dymecki, на двухмикронной Кроме 1996). плазмиде рекомбиназ для высокоточного редактирования геномов у эукариот можно использовать также генноинженерные высокоспецифические нуклеазы, специфичность которых задается с помощью ДНК-связывающих доменов типа «цинковый палец» (Santiago et al., 2008), ДНК-связывающих TAL-доменов бактерии Xanthomonas (Li et al., 2011) или комплементарно связывающейся с ДНК гена мишени гидовой РНК, направляющей бактериальную нуклеазу Cas9 (Ran et al., 2013). Мыши с тканеспецифическими нокаутами и нарушениями экспресcии генов широко используются как собственно для физиологических исследований, так и для создания животных моделей заболеваний человека. При этом следует высокоспецифических недоступна отметить, что рекомбиназ митохондриальная для манипуляций доступен ДНК. ядерный при помощи геном, однако Митохондриальные заболевания человека преимущественно связаны с компонентами дыхательной цепи, гены 35 которых закодированы как в ядерном геноме (субъединицы NADHдегидрогеназы NDUFS1, NDUFS4, NDUFS7, цитохром-оксидазы COX10, АТФ-синтетазы ATPAF2 и др.), так и в геноме самих митохондрий (ND1, ND4, ND6, CYTB, COX3 и др.). Из 85 полипептидов, участвующих в образовании комплексов дыхательной цепи, в митохондриальной ДНК закодированы 13 (Ryan, Hoogenraad, 2007). Кроме того, к развитию некоторых митохондриальных заболеваний приводят мутации в тРНК, обслуживающих синтез белка в митохондриях. В основном, эти заболевания затрагивают метаболически высоко активные органы и ткани, такие как нервная и мышечная ткани, а также печень. Как правило, митохондриальные заболевания сопровождаются разнообразным набором симптомов и приводят к слепоте, миопатии, миодистонии, атаксии, дисфункции печени и диабету (Chinnery, Turnbull, 2000). В настоящее время описано несколько фармакологических животных моделей таких заболеваний, основанных на применении блокаторов комплексов дыхательной цепи, таких как ротенон (Heitz et al. 2012; Chadderton et al., 2013) или искусственном снижение активности супероксиддисмутазы (Qi et al., 2003). Также существует несколько мышиных моделей с мутациями непосредственно в генах субъединиц NADH-дегидрогеназы, кодируемых митохондриальной ДНК. Например, ND6 G13997A мыши с синдромом Лебера были получены при помощи УФ-индуцированного мутагенеза фибробластов линии LMTK, отбора клеток с требующейся мутацией, последующего слияния их с эмбриональными стволовыми клетками и инъекция гибридных клеток в бластоцисту (Lin et al., 2012). Другие мыши с синдромом Лебера и мутацией ND4 G11778A были получены с помощью введения гена с мутацией в клетки сетчатки глаза при помощи адено-ассоциированного вируса (Yu et al., 2012). При заболеваний этом фармакологическим свойственен существенный моделям митохондриальных недостаток – блокаторы дыхательной цепи, такие как ротенон, неизбирательно действуют на все клетки организма, оказывая существенные системные побочные эффекты. 36 Мутагенез мышиной митохондриальной ДНК требует большого объема работы и сложен в технологическом исполнении, а также не позволяет снижать активность дыхательной цепи тканеспецифически и контролировать в митохондриях количественное соотношение нормального и мутантного генов. Для субъединиц комплексов дыхательной цепи, кодируемых ядерными генами, существует несколько генетических моделей, воспроизводящих особенности митохондриальных заболеваний с разной степенью эффективности (Torraco et al., 2009). Например, нокаут субъединицы цитохром-оксидазы CoxVIaH приводит к незначительному снижению ее активности и повышает риск систолической дисфункции миокарда, однако не влияет на продолжительность и качество жизни мышей (Radford et al., 2002). Кондиционный нокаут субъединицы Cox10 в мышцах при помощи рекомбиназы Cre под промотором легкой цепи миозина mlc1f приводил к снижению активности цитохром-оксидазы на порядок, однако симптомы миопатии проявлялись у мышей в разной степени тяжести и только через несколько месяцев после этого (Diaz et al., 2005). Аналогичная модель, в которой ген Cox10 удалялся Cre под гепатоцит-специфическим альбуминовым промотором показала, что гепатомегалия и стеатоз возникают только у гомозиготных по рекомбиназе мышей, в то время как гетерозиготные мыши инактивировали рекомбиназу и регенерировали печень (Diaz et al., 2008). Делеция Cox10 в клетках мозга при помощи CamKIIα-Cre парадоксальным образом приводила к амилоидозу, напоминающему болезнь Альцгеймера, но не влияла на уровень окислительного стресса и выживаемость нейронов (Fukui et al., 2007). Таким образом, существует необходимость в дальнейшей разработке генетических моделей митохондриальных заболеваний, которые могли бы релевантно и специфично регулируемым образом нарушать активность дыхательной цепи в определенных типах клеток (Vempati et al., 2008). 37 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Материалы 2.1.1 Линии мышей с кондиционным дефицитом цитохрома с В работе использовались мыши на генетической основе линии C57BL/6, несущие генетическую конструкцию cfKW и один из четырех различных трансгенов cre под управлением специфического промотора. Создание генетической конструкции cfKW проводилось по стандартной схеме получения генетических нокинов у мышей (Capecchi, 2005) и было подробно описано ранее (Муфазалов и др, 2009). Для получения мышей с дефицитными по цитохрому c макрофагами использовали ген рекомбиназы cre под промотором макрофагального лизоцима LysM (Takeda et al., 1999), для Т-клеток использовали ген cre под управлением промотор-энхансерной области гена Cd4 (Lee al., 2001), для стволовых клеток, экспресссирующих белок нестин – использовали ген cre под контролем нестинового промотора крысы (Tronche et al., 1999). Для полной делеции Cycs во всех клетках организма использовали трансген CMV-cre (Schwenk et al., 1995). В качестве контроля использовались мыши других генотипов из тех же пометов, что и цитохромдефицитные, то есть сиблинги, которые имели нормальное количество этого белка во всех клетках организма. Мышей содержали в питомнике лабораторных животных «Пущино», а также виварной комнате НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ. Животные содержались в апатогенных условиях в клетках размера Т2 с непылевым подстилом («Rehofix») при искусственном световом режиме 12 ч. света/12 ч. темноты, получая ad libitum стерилизованные корм («Чара») и воду. 2.1.2 Генотипирование мышей Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции на основе ДНК из кончиков хвостов мышей возраста >Р25. Протокол лизиса тканей и выделения ДНК идентичен таковому для процедуры выделения ДНК из макрофагов и описан в соответствующем разделе. Для определения 38 генотипа локуса Сycs использовали праймеры cytex2 5`- AGAGATGCAGAGGTTAAGTG-3` и cytl2 5’-TGACCTTGCCTTCTTCGG-3` (локус дикого типа дает ПЦР-продукт размером 520 п.н., локус cfKW дает ПЦР-продукт размером 609 п.н. Для определения присутствия рекомбиназы проводили CMV-cre ПЦР с праймерами Cre-3 5`- CAATTTACTGACCGTACAC-3` и Cre-4 5`-CATCGCCATCTTCCAGCAG-3`. Проверку наличия в мышах гена рекомбиназы LysM-сre проводили с использованием праймеров Cre8 5`-CCCAGAAATGCCAGATTACG-3` и Mlys2 5`-CTTGGGCTGCCAGAA TTTCTC-3`. Для определения генотипа локуса Cd4 использовали конкурентную ПЦР с тремя праймерами: CD4cre1 5`-ATCAAGGTCCTGAGGAAGAG-3`, CD4cre2 5`-ACCTCATCACTCGTTGC ATC-3`, CD4cre3 5`-CTAGGAGTTGTGCTGCACAG-3`. Для генотипирования Nes-cre применяли праймеры Cre-F1 5`-TCCAATTTACTGACCGTACAC-3` и Cre-R1 5`- ATCGCCATCTTCCAGCAG -3`. Для всех вышеуказанных ПЦР использовали одинаковую оптимизированную программу: денатурация при 940С в течение 3 мин; затем 35 циклов – денатурация при 940С в течение 40 с; отжиг праймеров при 600С в течение 45 с; элонгация при 720С в течение 60 c; заключительная элонгация - 720С, 5 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в буфере TAE и визуализировали при помощи окрашивания бромистым этидием. 2.1.3 Прочие материалы и реактивы Большинство использованных в ходе выполнения работы химических реактивов, реагентов и материалов указаны в соответствующих разделах, посвященных отдельным методам. В целом, надо отметить, что при выполнении работы использовался одноразовый культуральный, расходный и мерный пластик: планшеты, чашки и культуральные флаконы («Greiner BioOne»), флаконы и шприцы «BD Biosciences», микропробирки и наконечники к пипеткам («SSI», «Axygen», «Vertex»). В работе использовались стандартные культуральные среды и буфера, такие как PBS, 39 PBST, TAE, TBE, SSC и так далее, реактивы для их изготовления приобретались у отечественных («Синтол», «Хеликон») и зарубежных («Fermentas», «Amresco», «Sigma-Aldrich») производителей. Синтез олигонуклеотидных праймеров для ПЦР был проведен компанией «Синтол». 2.2 Методы клеточной биологии 2.2.1 Выделение и поляризация костномозговых макрофагов Мышей возраста 6-8 недель эвтаназировали, препарировали, извлекали бедренные кости и выделяли из них костный мозг, вымывая его из диафиза кости в пробирку стерильной бессывороточной средой DMEM («Gibco»). Затем вели подсчет клеток костного мозга в камере Горяева, далее их рассаживали на чашки Петри диаметром 100 мм из расчета 7 млн. на 7 мл культуральной среды. Состав среды стимулировал дифференцировку клеток костного мозга в макрофаги и соответствовал стандартному протоколу, описанному ранее: 50% среды RPMI 1640 («Gibco»), 30% среды DMEM кондиционированной M-CSF, выделяемым клетками фибросаркомы L929, 20% лошадиной сыворотки крови («HyClone»), с добавлением L-глутамина, но без добавления антибиотиков (Boltz-Nitulescu et al., 1989). На 7 день культивирования клетки снимали с чашек стерильным раствором Версена (0.05% EDTA в PBS) и пересевали для поляризации на чашки Петри диаметром 35 мм в количестве 1 млн клеток на чашку, в 2 мл культуральной среды. Для поляризации макрофагов использовали рекомбинантные мышиные цитокины IFN-гамма и IL-4 («Peprotech»), а также ЛПС E. coli («Sigma»). Для каждого клона использовали М1 поляризацию (IFN-гамма в концентрации 50 нг/мл и ЛПС в концентрации 50 нг/мл, также проводили поляризации гамма-интерфероном в той же концентрации отдельно от ЛПС), М2 поляризацию (IL-4 в концентрации 20 нг/мл), неполяризованные клетки использовались в качестве контроля. Через сутки производили окрашивание клеток на специфические маркеры, а также проводили выделение ДНК и РНК. 40 2.2.2 Проточная цитофлуориметрия Перед окрашиванием макрофагов и Т-клеток любыми антителами на клетках блокировали Fc-рецепторы при помощи специфических антител к ним (анти-FcγR, клон дифференцировавшихся разведение 2.4G2; макрофагов в 1 популяции к 400). Долю оценивали путем окрашивания на специфический макрофагальный маркер F4/80 (клон ВМ8, конъюгат с FITC), либо на Mac-1 (клон М1/70, конъюгат с PE). Для окрашивания макрофагов на маркеры поляризации применяли антитела против CD206 и MHCII, коньюгированные с флуорохромами APC (клон C068C2), и PE (клон М5/114), соответственно («Biolegend»). Также в работе использовали антитела к CD11c (клон N418, конъюгат с APC). Для всех антител использовали рабочие разведения 1 к 400, окрашивание на поверхностные маркеры проводили по стандартной методике, время инкубации с антителами составляло 30 минут. Для оценки количества мертвых клеток, потерявших целостность плазматической мембраны, использовали окраску иодидом пропидия («Sigma»). Уровень активных форм кислорода измеряли с помощью окрашивания соединением H2DCFDA («Sigma»), которое в клетках сначала гидролизуется до H2DCF, а затем окисляется перекисными радикалами до флуорохрома DCF. Для внутриклеточного окрашивания цитохрома с макрофаги и лимфоциты фиксировали 2% раствором параформальдегида, затем вызывали их пермеабилизацию 0,5% раствором тритона Х-100 и окрашивали специфическими антителами по протоколам производителей. Для окрашивания цитохрома с использовали специфические моноклональные антитела мыши клона 6Н2.В4 («BD Pharmingen») в разведении 1:200 и вторичные моноклональные анти-IgG1-антитела крысы клона M1-14D12 («eBioscience»), конъюгированные с фикоэритрином в разведении 1:200. Для определения фагоцитарной активности макрофагов использовали смесь меченых флуоресцентными красителями бусин Flow-Check Pro 41 («Beckman Coulter»). Суспензию бусин (размером 3, 6 и 10 мкм) добавляли к суспензии макрофагов в среде DMEM из расчета 1 млн. бусин на 1 млн. макрофагов, и инкубировали в течение часа при 370С. Фагоцитарную активность определяли (макрофаг+бусина) в по доле высокофлуоресцентных макрофагальном гейте от общего объектов числа высокофлуоресцентных объектов. Помимо этого, фагоцитарную активность также измеряли по доле поглощенных бактерий E. coli, меченых флуорофором DCF. Измерения проводили на капиллярном проточном цитофлуориметре Guava 8HT («Millipore»). Клеточный сортинг лимфоцитов проводили на проточном цитометре BD FacsAria, для выделения отдельных популяций CD4+ и CD8+ Т-клеток использовали антитела к CD3 (клон 145-2C11, Alexa750), CD4 (клон GK 1.5, FITC) и CD8 (клон 53-6.72, PE). 2.2.3 Индукция апоптоза и анализ клеточной гибели. Для индукции апоптоза макрофагов использовали неспецифический блокатор протеинкиназ стауроспорин («Sigma») в концентрации 500 нМ, а также обратимый ингибитор гликолиза 2-дезоксиглюкозу в концентрации 20 мМ. 2-дезоксиглюкоза способна к фосфорилированию гексокиназой, но не претерпевает гексозофосфатизомеразной реакции и накапливается в гликолитических клетках. Макрофаги инкубировали с обоими веществами по одиночке или в сочетании в течение 6 часов, затем клетки снимали с культурального пластика холодным фосфатно-солевым буфером на льду, и окрашивали аннексином V, конъюгированным с FITC («BD Pharmingen») и иодидом пропидия в соответствии с протоколом производителя. Анализ окрашивания проводили на проточном цитофлуориметре BD FacsCanto II. 2.2.4 Измерение дыхательной активности клеток. Интенсивность дыхания суспензии клеток проводили с помощью полярографического электрода Кларка на приборе Oxygraph («Hansatech») c 42 использованием 2-3 млн. макрофагов, либо 10 млн. тимоцитов/спленоцитов (количество клеток предварительно подсчитывали в камере Горяева) в объеме 0,3 мл среды DMEM. После записи кривой нормального потребления клетками кислорода из среды в течение 2-3 минут в рабочую камеру добавляли разобщитель окислительного фосфорилирования в этаноле (протонофор, карбонилцианид хлорфенилгидразона, «Sigma») до конечной концентрации 6,7 мкМ. Затем пересчитывали потребление кислорода в пикомолях на 1 млн клеток за 1 мин в нормальном состоянии и в присутствии протонофора. 2.3 Методы молекулярной биологии 2.3.1 Вестерн-блоттинг Для вестерн-блоттинга использовали макрофаги, лизированные в буфере Лэммли, в количестве по 2х106 клеток на пробу. Лизат макрофагов нормировали по количеству белка, определенному с использованием бицинхониновой кислоты («Pierce»), и подвергали процедуре денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли (плотность геля 12%) с SDS (SDS-PAGE) в системе Mini-Protean («Bio-Rad»), затем переносили методом влажного переноса на активированную метанолом PVDF-мембрану Amersham Hybond-P («GE Healthcare»), блокировали раствором 0,5% бычьего сывороточного альбумина («Sigma») в PBS и проявляли при помощи первичных моноклональных антител к цитохрому с («BD Pharmingen») и поликлональных кроличьих антител к гистону H2B («Аbcam»). Для проявки использовали соответствующие вторичные антитела IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена («eBioscience»), и набор для люминисцентной проявки ECL West Dura («Pierce»), сигнал регистрировали с помощью люминесцентного имиджера ChemiDoc («Bio-Rad»). 2.3.2 Выделение ДНК 43 Для количественной оценки работы LysMcre/loxP-системы и определения эффективности вырезания аллеля дикого типа Cycs, ДНК выделяли из 2-5 млн. костномозговых макрофагов. Выделение проводили по стандартному протоколу с протеиназой K («Amresco») по стандартному протоколу для выделения ДНК из клеток мышей от Jackson Laboratory. 2.3.3 Выделение РНК Выделение РНК для последующего синтеза первой цепи кДНК и анализа экспрессии методом ПЦР в реальном времени для культур костномозговых макрофагов и других типов клеток проводили по методу Хомчинского (Chomczynski, Sacchi, 1987) с использованием реактива TRI Reagent («Sigma») в соответствии с протоколом производителя. 2.3.4 Обратная транскрипция Реакцию обратной транскрипции проводили со случайными девятинуклеотидными праймерами с помощью набора Reverse Transcriptase SS III («Invitrogen») в соответствии с протоколом производителя. Для каждого образца в реакции использовали по 400 нг суммарной РНК, прошедшей предварительную обработку ДНКазой I («Thermo Scientific») для удаления остаточной геномной ДНК. 2.3.5 Секвенирование последовательности мРНК цитохрома с Для анализа экспрессии цитохрома c полученную кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с различными парами праймеров, отражающими различные структурные участки локуса fKW, включая аллели neor, wt, K72W и их различные сочетания. Далее полученные ПЦР-продукты были разделены в агарозном геле, выделены из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit («Qiagen») по протоколу производителя, на них была проведена реакция секвенирования по Сенгеру с использованием набора BigDye Terminator Sequencing Kit («LifeTechnologies») и капиллярного 44 секвенатора Abi Prism последовательности 3100 («Applied анализировались Biosystems»). при помощи Полученные программного обеспечения ChromasPro 1.7.6 («Technelysium»). 2.3.6 ПЦР в реальном времени Относительную экспрессию и соотношение аллелей Cycs определяли с помощью метода ΔΔСt (Livak, Schmittgen, 2001). Для определения экспрессии в качестве референсного гена использовали ген бета-актина мыши, при определении соотношения аллелей wt и K72W референсной считали аллель K72W, которая не подвержена Cre-зависимому вырезанию. Для определения экспрессии аллели дикого типа использовали праймеры Cyc-1exF 5`- и CGTCTGTCTTCGAGTCCG-3` CycLys-R 5`- TTCCAGGGATGTACTTTTTG-3`, для определения экспрессии аллели K72W - праймеры Cyc-1exF и CycTrp-R 5`-TTCCAGGGATGTACTTCCAT-3`, для определения экспрессии тестикулярной формы цитохрома c применяли праймеры CycT-F 5'-CAGGGCACGGCTGCTGTGAT-3` и CycT-R 5'- CCACCGTGTGGCACTGAGCA-3`, для определения экспрессии бета-актина использовали праймеры actin-longF 5´-CAGGGTGTGATGGTGGGAATG-3´ и actin-longR 5´-CCAGAGGCATACAGGGACAGC-3´, экспрессии интерлейкина-6 использовали для праймеры определения IL6-F 5´- CTCTGCAAGAGACTTCCATCC-3´ и IL6-R 5´-TTCTGCAAGTGCATCAT CGT-3´, для TNF – праймеры TNF-F 5´-TCTGTCTACTGAACTTCGGG-3´ и TNF-R 5´-TTGGTGGTTTGCTACGAC-3´. При определении соотношения аллелей wt и K72W для аллели wt использовали праймеры Cyc-2intF 5`AGAACAAAGGTAACGGGG-3` и вышеуказанный CycLys-R, для аллели K72W – вышеуказанные праймеры Cyc-2intF и CycTrp-R. Полимеразную реакцию проводили на приборе CFX96 OneTouch («BioRad») с использованием наборов реагентов для ПЦР в реальном времени с интеркалятором EvaGreen («Synthol»). Амплификацию для всех пар праймеров проводили по программе: 94 0С, 3 мин; затем 40 циклов - 940С, 20 45 с; 580С, 20 с; 720С, 20 c; затем для ПЦР-продуктов строили кривую плавления от 500С до 950С. Амплификацию проводили с использованием контролей «реакционная смесь минус матрица» и «реакционная смесь плюс РНК из ревертазной смеси без обратной транскриптазы»). 2.3.7 Саузерн-блоттинг Саузерн-блоттинг на выделенной из макрофагов ДНК проводили по стандартному протоколу (Brown, 1993), пробу ДНК подвергали реакции рестрикции с помощью рестриктазы BamHI («Thermo Scientific») в течение 16 часов. В реакции использовали 10 мкг ДНК на пробу, рестриктазу брали в соотношении 5 ед.а/мкг ДНК. Далее продукты рестрикции разделяли в 0,8% агарозном геле и переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану HybondTM-N+ («Amersham Biosciences») методом капиллярного переноса в SSC-буфере. Пробы для блоттинга получали при помощи двухраундовой ПЦР с геномной ДНК, в которой использовали внешние праймеры Cyc1intF 5`-GCGACGGGGATGCGGACC-3` и Cyc1intR 5`CTTCAATAGCAAATACATCACC-3`, и внутренние праймеры CycProbeF 5`и CCTAACCTACAAAGCCATGC-3` CycProbeR 5`- TCAAGACAGGTCCATGCCAAG-3`. Пробы метили изотопом 32P с помощью набора Megaprime DNA Labeling System («Amersham Biosciences»). Для визуализации радиоактивной метки использовали рентгеновскую пленку («Kodak»). 2.4 Статистическая обработка данных Соотношения частот генотипов в потомстве проверялись при помощи критерия χ2 и точного критерия Фишера; анализируемые путем проточной цитометрии соотношения клеточных популяций попарно сравнивались при помощи U-критерия Манна-Уитни. Для статистической оценки всех остальных данных использовался парный t-критерий Стьюдента. 46 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Описание модели с различными вариантами кондиционного нокдауна гена Cycs В предыдущих работах нашей группы было изучено влияние аминокислотной замены K72W на участие цитохрома c в индукции апоптоза. Для выполнения этой работы были получены мыши с заменой гена соматического цитохрома с Cycs на генетическую конструкцию cfKW. Она встроена в локус Cycs и несет две копии кодирующей последовательности этого гена: аллель дикого типа и аллель с заменой K72W. На основе мышей линии cfKW/cfKW при помощи двух последовательных скрещиваний с мышами, несущими трансгены рекомбиназ Flp и Cre соответсвенно, ранее были получены мыши, имеющие генетический нокин - Cycs K72W (Муфазалов, 2011). Однако возможности использования линии cfKW/cfKW оказались шире, чем только получение генетического нокина K72W. В настоящей диссертационной работе эта линия была использована для созданная трех новых линий мышей с кондиционным нокдауном соматического цитохрома c в различных клетках-мишенях. Для понимания принципа работы предложенной модели далее необходимо рассмотреть структуру гена соматического цитохрома с, конструкцию cfKW и локус fKW, результат ее Cre-зависимой перестройки (Рис. 8). Ген Cycs дикого типа находится на 6-й аутосоме мыши и состоит из трёх экзонов: короткого некодирующего первого (58 п.н.), второго экзона (178 п.н.), в котором начинается рамка считывания, и длинного третьего экзона, в котором рамка считывания заканчивается. Размер третьего экзона варьирует в зависимости от положения точки терминации транскрипции на 3`-конце, но составляет не менее 289 п.н., хотя для большинства сплайсформ Cycs размер третьего экзона примерно 900 п.н. В гене Cycs присутствуют два интрона: первый размером 747 п.н. и второй размером 106 п.н. При получении конструкции cfKW второй и третий экзоны Cycs гена дикого типа были фланкированы LoxP-сайтами для рекомбиназы Cre (в данной 47 конструкции была использована последователньность третьего экзона размером 1150 п.н.). После третьего экзона аллели wt в конструкции располагается фланкированная Frt-сайтами neor – кассета размером 1930 п.н., представляющая собой ген аминогликозидфосфотрансферазы neor под управлением конститутивного промотора фосфоглицераткиназы человека. Аминогликозидфосфотрансфераза, кодируемая neor – кассетой, инактивирует такие аминогликозидные антибиотики как неомицин и G418. Рисунок 8. Схема организации локуса Cycs у использованных в работе мышей различных генотипов. Генотип cfKW отличается от Cycs дикого типа наличием на 3`конце дополнительной аллели с заменой четырех нуклеотидов (CAAA/ATGG), приводящей к аминокислотной замене K72W, фланкированием аллели дикого типа LoxPсайтами и наличием FRT-фланкированной neor-кассеты. Генотип fKW (Δcyt) возникает из генотипа cfKW после удаления рекомбиназой cre аллели Cycs дикого типа. После neor – кассеты располагается последовательность аллели цитохрома с K72W, у которой лизин в положении 72 заменён на триптофан. Различие между аллелями wt и K72W составляет четыре нуклеотида, обуславливающие вышеназванную аминокислотную замену. У обеих аллелей имеются общие промоторный участок и первый экзон. Данная замена была предложена в наших предыдущих исследованиях с целью потенциальной супрессии внутреннего пути апоптоза (Муфазалов и др., 2009). Экспрессия 48 нокинной аллели для генотипа cfKW невозможна, так как между общим первым экзоном и вторым экзоном нокинной аллели находится достаточно длинная вставка размером 4373 п.н., в которой к тому же содержится рамка считывания аллели wt. Поскольку конструкция cfKW содержит все регуляторные элементы нативного гена Cycs, в норме в локусе cfKW транскрибируется последовательность дикого типа, причем её уровень экспрессии соответствует нормальному уровню экспрессии соматического цитохрома c на уровне как мРНК, так и белка (Рис. 9 А и Б). Тем самым, предложенная модель выгодно отличается от единственной ранее описанной в литературе модели кондиционного нокаута цитохрома c (Vempati et. al., 2007), в которой использовался LoxP-фланкированный трансген Cycs под управлением убиквитарного промотора ROSA-26. В рамках нашей генетической модели предполагалось, что Creопосредованное удаление из цитохромного локуса флоксированной аллели дикого типа (генотип fKW) приведет к прекращению экспрессии цитохрома с, поскольку между первым общим экзоном и вторым экзоном нокинной аллели останется neor – кассета. В этом случае размер первого интрона за счёт neor – кассеты увеличивается с 747 п.н. до 2800 п.н. Аллель K72W не присутствует в пуле мРНК клеток cfKW/cfKW, поскольку на 3`- конце аллели дикого типа находится последовательность, терминирующая транскрипцию, а также сигнал для полиаденилирования. Действительно, анализ методом аллелеспецифической ПЦР в реальном времени на кДНК показал у гомозигот cfKW/cfKW отсутствие транскриптов с заменой K72W и нормальное количество транскриптов дикого типа. В присутствии рекомбиназы Cre аллель Cycs дикого типа может быть удалена путем рекомбинации по LoxPсайтам, и таким образом возникает новый генотип, обозначаемый fKW. Ранее в диссертационной работе И.А. Муфазалова была показана летальность генотипа fKW/fKW и было высказано предположение о том, что эта летальность связана со значительным снижением количества цитохрома c и нарушением работы гена Cycs, вплоть до полного нокаута. В настоящей 49 работе этот результат был подтвержден, а также было показано, что такое снижение количества белка действительно происходит, однако не до полного исчезновения цитохрома c, а до уровня, приблизительно в десять раз меньшего, чем его нормальное содержание в клетке. Именно последнее обстоятельство послужило основанием для дополнительных исследований с использованием этой генетической модели. Рисунок 9. Локус cfKW обеспечивает нормальный уровень экспрессии гена Cycs. А) Вестерн-блоттинг лизата костномозговых макрофагов различного генотипа, показано окрашивание антителами к цитохрому с и контрольными к гистону H2B. Сокращение Δcyt обозначает генотип fKW/fKW cre. Б) Количество мРНК цитохрома с в костномозговых макрофагах, нормированное на количество β–актина (принято за 100 единиц) определенной методом РТ-ПЦР. Экспрессия Cycs стабильна и по уровню сопоставима с экспрессией β–актина и GAPDH. Во cfKW/cfKW втором и поколении от скрещивания мышей-делиторов, имеющих гомозиготных трансген мышей cre под тканеспецифическим промотором, можно ожидать мышей, сочетающих генотип cfKW/cfKW и рекомбиназу Cre (Рис. 10). У таких мышей в клеткахмишенях будет происходить переход генотипа cfKW/cfKW в fKW/fKW, что позволяет создать модель значительного дефицита цитохрома c в определенном типе клеток организма. В данной работе подобный подход был применен с использованием трех типов кондиционных (тканеспецифических) делиторов: Cd4-cre Т-клетки), (затрагивает LysM-cre (затрагивает миелоидные клетки, преимущественно макрофаги), Nes-cre (мишенью являются стволовые клетки, экспрессирующие белок нестин) и одного убиквитарного делитора CMV-cre, обеспечивающий удаление Cycs во всех типах клеток организма. 50 Рисунок 10. Схема скрещивания для получения потомства с кондиционным снижением экспрессии цитохрома с. Экспрессия рекомбиназы сre контролируется специфическим промотором и позволяет удалять ген цитохрома с в отдельных типах клеток, таких как макрофаги (на рисунке) или Т-клетки. После удаления аллели дикого типа начинается экспрессия аллели K72W, однако ее уровень незначителен по сравнению с базовым уровнем экспрессии. 3.2 Влияние снижения количества цитохрома c на жизнеспособность мышей При разведении мышей с конструкцией cfKW, несущих рекомбиназы CMV-cre и Nes-cre, наблюдались отклонения от ожидаемого менделевского соотношения потомков. Мыши генотипа cfKW/cfKW CMV-cre с полной делецией аллели Cycs дикого типа погибали в период Е9,5-Е11,5 (Муфазалов, 2011; Шилов и др., 2013). При этом цитохромдефицитные эмбрионы отставали в развитии от нормальных, а затем подвергались атрофии и редукции (Рис. 11А). Статистика для мышей этой линии приведена далее в Таблице 2. Подобное нарушение развития характерно для ранее описанного полного нокаута Cycs (Li et al., 2000), что подтверждает эффективность 51 предложенной нами модели, несмотря на её более сложный характер и неполное блокирование активности цитохрома с. Таблица 2. Соотношение генотипов в потомстве мышей с CMV-cre опосредованной делецией аллели дикого типа гена Cycs Скрещивание: wt/fKW CMV-cre х wt/fKW CMV-cre Период: Е9,5 wt/wt fKW/wt fKW/fKW Пометов: 7 15 35 11 Особей: 61 Скрещивание: wt/fKW CMV-cre х cfKW/cfKW Период: Е13,5 fKW/wt cfKW/fKW сfKW/wt fKW/fKW Пометов: 9 37 19 14 0 Особей: 70 Скрещивание: wt/fKW CMV-cre х wt/fKW CMV-cre Период: Р10 Р0- wt/wt fKW/wt fKW/fKW Пометов: 8 16 39 0 Особей: 55 В связи с этим несколько неожиданным оказалось то, что полученные мыши генотипов cfKW/cfKW Cd4-cre и cfKW/cfKW LysM-cre оказались жизнеспособны и морфологически неотличимы от мышей дикого типа (Рис. 11Б). При этом в линиях cfKW/cfKW Cd4-cre и cfKW/cfKW LysM-cre никаких отклонений от ожидаемого менделевского соотношения потомков не наблюдалось, сложностей с разведением этих линий не возникало. Мыши генотипа cfKW/cfKW Nes-cre продемонстрировали частичную эмбриональной летальность, однако такие мыши могли рождаться и быть жизнеспособными, хотя число потомков этого генотипа было значительно снижено по сравнению с теоретически ожидаемым (Таб. 3). У единичных особей эмбрионов cfKW/cfKW Nes-cre возраста Е17,5 гистологический анализ мозга выявил аномалию развития – увеличенную вентрикулярную зону коры больших полушарий (Рис. 11В). 52 Таблица 3. Соотношение генотипов в потомстве мышей cfKW с рекомбиназой Nes-cre Скрещивание: cfKW/wt Nes-cre х cfKW/wt Nes-cre wt/wt 10 cfKW/ cfKW/ wt/wt cfKW/wt cfKW/cfKW wt cfKW Nes-cre Nes-cre Nes-cre 6 7 7 12 1 Пометов: 5 Особей: 38 Скрещивание: cfKW/wt Nes-cre х cfKW/cfKW cfKW/wt cfKW/cfKW cfKW/wt Nes-cre cfKW/ cfKW Nes- Пометов: 3 cre 9 6 7 1 Особей: 23 Рисунок 11. Последствия снижения количества цитохрома c для разных линий мышей. А) Редуцированный эмбрион возраста Е11 генотипа cfKW/cfKW CMV-cre (указан стрелкой) в матке cfKW/wt CMV-cre матери. Б) Фенотипически нормальная мышь cfKW/cfKW LysM-cre (то же самое характерно и для cfKW/cfKW Cd4-cre мышей). В) Эмбрион генотипа cfKW/cfKW Nes-cre (справа) в возрасте Е17,5 имеет увеличенную вентрикулярную зону мозга по сравнению с контрольным сиблингом (слева). Вентрикулярная зона коры показана белой стрелкой, её размер обозначен красным прямоугольником. 53 Интересно, что вентрикулярная зона и у грызунов, и у человека является пролиферативным компартментом мозга и служит источником нестин-положительных нейрогенных стволовых клеток (Roy et al., 2000), а также клеток эпендимоглии, при этом гиперпролиферация в ней сопутствует некоторым формам генетически детерминированной гидроцефалии (Batiz et al., 2011). Однако в нашей модели размер мозга у единичных аномальных эмбрионов cfKW/cfKW Nes-cre был немного меньше нормы, а размеры желудочков были пропорциональны размеру мозга. Несмотря на эмбриональную летальность и дефекты развития рождение мышей с потенциальным дефицитом цитохрома c в нестинэкспрессирующих клетках возможно, и в потомстве из 61 мышонка от 8 проанализированных скрещиваний были найдены одна самка и один самец генотипа cfKW/cfKW Nes-cre, при ожидаемом количестве 13 мышей этого генотипа. При этом у самки cfKW/cfKW Nes-cre в возрасте 10-25 недель происходила постепенная гипопигментация шерсти. Поведение и реакция мыши на внешние раздражители при этом остались нормальными. Родившиеся cfKW/cfKW Nes-cre мыши являются фертильными. Самец cfKW/cfKW Nes-cre, а также его потомки и потомки гипопигментированной самки с генотипом cfKW/cfKW Nes-cre в первом приближении не показали никаких аномалий фенотипа, в том числе сохранили нормальную пигментацию шерсти. 3.3 Определение механизма снижения количества цитохрома с и оценка этого количества в клетках иммунной системы В ходе данной работы была определена причина снижения суммарного количества цитохрома c у мышей генотипа cfKW/cfKW после удаления обеих аллелей дикого типа. Такое снижение не является вполне тривиальным фактом – кассета neor оказывается после удаления аллели дикого типа по сути внутри первого интрона гена Cycs, причем сохраняются исходные донорный и акцепторный сайты сплайсинга, а также последовательность в 54 середине интрона, необходимая для замыкания структуры «лассо» во время сплайсинга. В итоге размер первого интрона в результате перестройки генотипа cfKW в fKW увеличивается с 747 п.н. до 2800 п.н. Критически нарушает экспрессию цитохрома c то, что внутри neor–кассеты находится последовательность, альтернативный интерпретируемая акцепторный сайт аппаратом сплайсинга. сплайсинга При этом как данный акцепторный сайт находится проксимальнее к 5`-концу пре-мРНК чем канонический акцепторный сайт сплайсинга первого интрона Cycs, что делает его выбор более предпочтительным. В результате большая часть первичного транскрипта сплайсирует с образованием химерной мРНК, содержащей первый экзон Cycs и далее фрагменты neor (Рис. 12А). Химерная мРНК была выделена, на ее основе была получена и количественно охарактеризована кДНК. Последовательность химерной кДНК была определена методом секвенирования по Сэнгеру, в ней была найдена граница Cycs - neor и определено положение альтернативного акцепторного сайта сплайсинга. Надо отметить, что ориентация neor – кассеты противоположна ориентации гена Cycs, поэтому химерные РНК оказываются нефункциональны не только для гена цитохрома с, но и для гена аминогликозид-фосфотрансферазы. Тем не менее, параллельно с альтернативным сплайсингом часть премРНК претерпевают правильный вариант сплайсинга с использованием канонического сайта на границе первого интрона и второго экзона Cycs, однако при этом происходит образование мРНК, кодирующей изоформу цитохрома c K72W. Транскриптом цитохромдефицитных костномозговых макрофагов был изучен при помощи реакции обратной транскрипции и последующей аллелеспецифической ПЦР (Рис. 12Б). Вероятно, ещё одной причиной падения суммарной экспрессии Cycs в цитохромдефицитных клетках может служить механизм РНК-интерференции. Действительно, последовательность химерной мРНК комплементарна последовательности 55 мРНК neor, которая транскрибируется со второй нити ДНК локуса fKW, таким образом, вместе они могут образовать двунитевую РНК. Рисунок 12. Механизм снижения экспрессии гена Cycs основан на образовании химерных транскриптов. А) Схема образования химерной мРНК Cycs-neor и фрагмент её секвенированной последовательности. Курсивом и размером шрифта выделены границы донорного и акцепторного сайтов сплайсинга. Б) Некоторые фрагменты транскриптов, детектируемых в Δcyt-макрофагах при помощи ПЦР на кДНК: 1- первый интрон Cycs, 2, 3 и 7 – различные ПЦР-продукты на основе химерной мРНК Cycs-neor, 4 – фрагмент мРНК neor, 5) мРНК аллели K72W, 6) мРНК аллели wt, 8) – отсутствие фрагмента, соответствующего мРНК Cyct – гена тестикулярного цитохрома с. Следует отметить, что в транскриптоме популяции цитохромдефицитных клеток присутствуют как мРНК K72W, так и мРНК дикого типа, что связано с неполным вырезанием соответствующей аллели, 56 но отсутствует РНК тестикулярного цитохрома с. Последнее обстоятельство важно, так как эта изоформа цитохрома может оказать компенсаторное действие и затруднить интерпретацию фенотипов (Vempati et al., 2007). Для оценки степени делеции LoxP-фланкированной аллели дикого типа с помощью метода блот-гибридизации по Саузерну (Рис. 13А) было определено соотношение аллелей cfKW и fKW. Также для этой цели с помощью метода аллелеспецифической ПЦР в реальном времени (Рис. 13Б) было определено соотношение аллелей дикого типа (лизиновой, «Lys») и К72W (триптофановой, «Trp»). Оба метода подтвердили высокую эффективность работы рекомбиназы cre под промотором LysM - на 94 – 95%, что соответствует её ожидаемой эффективности в этой системе. Степень делеции аллели wt в T-клетках в системе делитора Cd4-cre составляла примерно 97-98%, что более подробно рассмотрено в следующем разделе (Рис. 17). Метод количественного Саузерн-блоттинга позволяет отличить перестроенный локус от неперестроенного при помощи гибридизационного зонда на первый интрон Cycs, поскольку сайты рестрикции для BamHI находятся перед промотором Cycs, внутри LoxP-фланкированной аллели дикого типа и перед вторым экзоном аллели K72W. Таким образом, в случае перестроенного локуса cfKW зонд гибридизуется с фрагментом размером 3143 п.н., от промотора до аллели K72W, а в случае не перестроенного локуса fKW – с фрагментом 1183 п.н., от промотора до аллели дикого типа. Метод аллелеспецифической ПЦР использовал один общий прямой праймер, картируемый на границу второго экзона и второго интрона Cycs, а также два специфических обратных праймера, различающихся четырьмя нуклеотидами на 3`-конце, соответствующими последовательностям аллелей K72W и wt. Поскольку в локусе cfKW содержатся обе аллели, а в локусе fKW – только аллель K72W, определив количественное соотношение аллелей, можно напрямую оценить эффективность работы рекомбиназы Cre. 57 Рисунок 13. Определение степени делеции лизиновой (wt) аллели Cycs в макрофагах мышей cfKW/cfKW LysM-cre. А) Метод блот-гибридизации по Саузерну. Геномную ДНК подвергали специфическому расщеплению рестриктазой BamHI, электрофорезу, а затем гибридизовали с зондом, связывающим последовательность первого интрона Cycs. Фрагмент размером 1183 п.н. соответствует аллели cfKW, фрагмент размером 3143 п.н. – аллели fKW, их соотношение составляет 6:94. Боковые дорожки соответствуют отрицательному контролю - макрофагам cfKW/cfKW. Б) Метод аллельспецифической ПЦР в реальном времени. Амплификацию последовательностей WT и K72W проводили на геномной ДНК, количественное соотношение аллелей определяли методом ΔΔСТ. Для контрольного генотипа cfKW/wt соотношение аллелей wt:K72W составляет 2:1, для генотипа cfKW/cfKW LysM-cre – примерно 6:100. Для определения уровня экспрессии цитохрома c в клетках fKW/fKW (также обозначаются как Δcyt) были использованы методы РТ-ПЦР, вестернблоттинга, а также проточной цитофлуориметрии (Рис. 14). В результате было показано, что суммарная экспрессия цитохрома с на уровне мРНК в Δcyt клетках для разных особей варьирует от 5% до 20% относительно его нормального количества (Рис. 14А и 14Б), что подтверждается на уровне белка данными вестерн-блоттинга (Рис. 14В). В тех случаях, когда оценка проводилась не в количественном, а в качественном формате, также было показано значительное снижение количества цитохрома с в Δcyt клетках (Рис. 14 Г-Е). Необходимо отметить, что различия в количестве цитохрома с между контрольными и Δcyt клетками более четко проявляются в случае макрофагов, а не лимфоцитов, поскольку исходное количество этого белка в пересчете на одну клетку у макрофагов значительно выше. 58 Рисунок 14. Экспрессия цитохрома c в цитохромдефицитных клетках снижена приблизительно на порядок. А и Б) Соотношение количества кДНК разных аллельных вариантов гена Cycs для нормальных и цитохромдефицитных макрофагов (А) и спленоцитов/тимоцитов (Б), определенное при помощи РТ-ПЦР и нормированное на нормальный уровень экспрессии цитохрома c. В и Г) Суммарное количество цитохрома c в клетках, определенное методом вестерн-блоттинга для макрофагов (В) и спленоцитов/ тимоцитов (Г). Д и Е) Внутриклеточное окрашивание на цитохром c нормальных и цитохромдефицитных макрофагов (Д), а также лимфоцитов из селезенки и тимуса мыши с Т-клеточным нокдауном цитохрома c. Резюмируя количественные данные по определению экспрессии цитохрома с, можно отметить, что в нашей модели достигается снижение количество этого белка на клетку-мишень примерно до 10% от его исходного 59 уровня, при этом преобладающей изоформой становится K72W. Таким образом, Δcyt-генотип fKW/fKW представляет собой сочетание генетических нокина и нокдауна. По поводу замены K72W необходимо отметить, что ранее было исключено влияние этой мутации на дыхательную функцию цитохрома с, но было отмечено некоторое повышение устойчивости к апоптозу части первичных клеточных линий мышиных эмбриональных фибробластов (Муфазалов и др, 2009). 3.4 Анализ жизнеспособности цитохромдефицитных лимфомиелоидных клеток После количественного обоснования корректности предложенной модели у мышей с дефицитом цитохрома c в Т-клетках и макрофагах был более подробно исследован их клеточный фенотип. Поскольку генотип fKW/fKW приводит к эмбриональной летальности в тот же период, что и полный генетический нокаут Cycs, естественным казалось предположение о том, что и для отдельных клеток, включая иммуноциты, этот генотип может воспроизводить последствия полной функциональной утраты цитохрома c. Сразу следует сказать, что это ожидание не подтвердилось, более того, снижение количества цитохрома c практически никак не затронуло жизнедеятельность и функции Т-лимфоцитов и макрофагов. Очевидно, что летальность эмбрионов со сниженным количеством цитохрома c во всех клетках организма объясняется дисфункцией других клеток-мишеней, более чувствительных, чем рассмотренные в данной работе клетки иммунной системы. Так, мыши линий cfKW/cfKW Cd4-cre и cfKW/cfKW LysM-cre имели нормальную клеточность костного мозга, тимуса и селезенки. Количество Тклеток, а также соотношение популяций СD4+ и CD8+ у цитохромдефицитных мышей не отличалось от таковых параметров у контрольных мышей (Рис. 15А), также как и доля CD11b+ клеток моноцитарно-макрофагального ряда в костном мозге (Рис. 15Б). 60 А Б Рисунок 15. Соотношение популяций клеток-мишений у нормальных и цитохромдефицитных мышей одинаково. А) Соотношение субпопуляций CD4+, CD8+ и CD4+CD8+ клеток в тимусе и селезенке контрольных cfKW/cfKW и цитохромдефицитных мышей cfKW/cfKW Cd4-cre. Б) Доля CD11b+ (Mac-1) клеток в костном мозге контрольных cfKW/cfKW и цитохромдефицитных мышей cfKW/cfKW LysMcre. В ходе культивирования клеток костного мозга in vitro и стимуляции их дифференцировки в направлении костномозговых макрофагов было показано, что Δcyt-клетки не имеют отличий в исходной численности на мышь, уровне пролиферации и скорости дифференцировки от контрольных клеток (Рис. 16 А-В). При этом параллельно дифференцировке и созреванию культуры костномозговых макрофагов, под действием рекомбиназы Cre, происходило удаление аллели Cycs wt, которое прекращалось на девятый день культивирования, оставляя около 5% неперестроенного локуса (Рис. 16Г). В дальнейшем в более старых культурах доля цитохромдефицитных макрофагов не изменялась, что указывает на их одинаковую жизнеспособность с теми макрофагами в культуре, которые не удалили аллель Cycs wt. Причины, по которым снижение количества цитохрома c не имеет влияния на жизнеспособность иммуноцитов, будут рассмотрены в следующем разделе настоящей диссертационной работы. 61 Рисунок 16. Созревание культур цитохромдефицитных костномозговых макрофагов in vitro проходит нормально. А) Количество клеток костного мозга, млн на 2 бедренные кости (1 мышь). Б) Количественный выход зрелых макрофагов на 1 культивируемую клетку костного мозга. В) Созревание костномозговых макрофагов контрольной и Δcyt мыши с 7 по 10 день с момента выделения костного мозга. Окрашивание на маркер макрофагов Mac-1, проточная цитофлуориметрия. Г) Динамика количества остаточной аллели дикого типа в ходе созревания костномозговых макрофагов. В качестве контроля использованы клетки генотипа cfKW/wt, у которых соотношение аллелей Lys и Trp составляет 2:1, аллелеспецифическая ПЦР в реальном времени. Для того чтобы сопоставить жизнеспособность Δcyt клеток с нормальными in vivo, было проанализировано соотношение аллелей K72W и wt у отсортированных популяций Т-клеток CD4+, CD8+ и CD4+CD8+ (для тимуса) мышей генотипа cfKW/cfKW Cd4-cre. Соотношение этих аллелей определяется эффективностью работы рекомбиназы Сre и формируется в тимусе на стадии двойных положительных тимоцитов. Предположение о том, что дефицит цитохрома c может повлиять на прохождение лимфоцитами стадий селекции в тимусе или на их жизнеспособность в периферических органах иммунной системы, позволяло ожидать различного соотношения аллелей для CD4+, CD8+ тимоцитов и CD4+ и CD8+ Т-клеток селезенки. Однако оказалось, что это соотношение остается постоянным для всех проанализированных типов клеток, а следовательно, Δcyt лимфоциты 62 нормально проходят тимус-зависимую селекцию и обладают такой же жизнеспособностью на периферии, как и клетки, оставшиеся с нормальным содержанием цитохрома c (Рис. 17). Более того, доля лимфоцитов, у которых Cycs wt остается невырезанным, имет тенденцию к снижению на периферии, однако она статистически недостоверна. В целом, эти результаты соответствуют тому факту, что митохондриальные заболевания не приводят к иммунодефицитам и дисфункциям отдельных клеточных компартментов иммунной системы. Рисунок 17. Доля цитохромдефицитных Т-лимфоцитов не меняется после выхода Тклеток на периферию. Соотношение аллелей wt и K72W у CD4+CD8+ тимоцитов, а также CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток остается одинаковым, около 2:100, что указывает на сохранение доли клеток без делеции аллели дикого типа в общем пуле лимфоцитов и одинаковую интенсивность тимусной селекции Т-лимфоцитов с нормальным и сниженным количеством цитохрома с. 3.5 Влияние снижения количества цитохрома c на клеточный метаболизм и апоптоз Особый интерес в контексте анализа метаболизма представляло изучение дыхания цитохромдефицитных клеток. Можно было ожидать, что десятикратное снижение количества незаменимого переносчика электронов дыхательной цепи могло бы приводить к снижению дыхательной активности клеток, однако этого не произошло. Ни для тимоцитов (рис. 18А), ни для спленоцитов (Рис. 18Б), ни для макрофагов (Рис. 18В) не было выявлено достоверных различий между интенсивностью потребления кислорода контрольными и цитохромдефицитными клетками, как в состоянии покоя, 63 так и в результате хлорфенилгидразона, действия разобщающего протонофора окисление и карбонилцианид фосфорилирование. Впрочем, коэффициенты дыхательного контроля (отношение разобщенного дыхания к нормальному) у всех типов цитохромдефицитных клеток были в среднем ниже, чем у контрольных клеток: у макрофагов на 12%, у спленоцитов на 14%, и у тимоцитов на 3%. Это означает, что цитохромдефицитные клетки в условиях повышения нагрузки на дыхательную цепь имеют несколько меньший резерв для увеличения в ней потока электронов. Тем не менее, с учетом разбросов экспериментальных значений потребления кислорода, для всех рассмотренных типов клеток можно говорить только о наблюдаемой тенденции, но не о достоверных отличиях от нормальных клеток. Безусловно, суммарное потребление клетками кислорода включает и его расход на другие метаболические процессы, помимо работы дыхательной цепи. Однако удвоение интенсивности дыхания в присутствии протонофора, такое же, как было описано ранее для макрофагов (Newsholme et al., 1987) и лимфоцитов (Hedeskov and Esmann, 1966), позволяет считать, что расход кислорода на другие метаболические процессы составляет небольшую часть его потребления по сравнению с дыханием. Наличие первичных культур цитохромдефицитных клеток, которые обладают нормальным клеточным дыханием и дыхательным контролем, показывает, что активность дыхательной цепи митохондрий тем самым не лимитируется – в определенных пределах – количеством цитохрома с в клетке. При этом необходимо подчеркнуть, что подобная избыточность цитохрома с для процесса клеточного дыхания характерна не для всех типов клеток, поскольку как было указано в разделе 3.2, при генерализованном снижении количества цитохрома c с использованием CMV-cre происходила атрофия и прекращение развития эмбрионов. Тем не менее, для клеток иммунной системы утверждение об избыточности нативного количества цитохрома с для дыхательной функции будет справедливо. 64 Рисунок 18. Интенсивность клеточного дыхания нормальных и цитохромдефицитных иммуноцитов не имеет различий. Среднее потребление кислорода контрольными и Δcyt тимоцитами (А), спленоцитами (Б) и макрофагами (В), пМоль О2 /мин х 106 клеток, в нормальном состоянии и на фоне добавления разобщителя окисления и фософорилирования (6,7 мкМ карбонилцианид хлорфенил-гидразона). Показаны кривые падения концентрации О2 в среде, а также гистограммы средней скорости потребления кислорода. Красным обозначены цитохромдефицитные клетки, синим – контрольные. Числа над кривыми показывают скорость клеточного дыхания на данном участке показанной на рисунке кривой потребления кислорода. Моменты времени, в которые добавляли разобщитель, отмечены стрелками. Временной интервал для всех дыхательных кривых составляет 5 минут. Отдельно было необходимо рассмотреть проблему чувствительности макрофагов с дефицитом цитохрома c к апоптозу. В качестве индукторов апоптоза в настоящей работе были использованы 2-дезоксиглюкоза 65 (Nirenberg, Hogg, 1958), ингибитор фосфогексозоизомеразы, подавляющий гликолиз и независимо от этого вызывающий стресс эндоплазматического ретикулума (Xi et al., 2011), а также неспецифический ингибитор протеинкиназ стауроспорин (Tamaoki et al., 1986). В зависимости от концентрации 2-дезоксиглюкоза, действуя на макрофаги, способна вызывать либо аутофагию, либо апоптоз (Matsuda et al., 2009). При этом 2дезоксиглюкоза в сочетании с другими индукторами апоптоза может усиливать их действие (Halicka et al., 1995). Стауроспорин используется в качестве индуктора внутреннего пути апоптоза (Bertrand et al., 1994), который способен действовать на любые клетки включая макрофаги. Показано, что под действием стауроспорина у макрофагов происходит выход цитохрома c в цитоплазму, активируются эффекторные каспазы, фрагментируется ДНК и происходит апоптоз (Hortelano et al., 2002). В то же время, сведения о действии этого агента являются противоречивыми, поскольку существуют работы, в которых показано блокирующее действие стауроспорина на апоптоз активированных макрофагов, вызываемый форболовым эфиром (Munn et al., 1995) или эстрогеном (Zhang et al., 1997). Более того, есть данные, что стауроспорин запускает у макрофагов как внутренний путь апоптоза, так и внешний, модулируя аутокринный сигналинг через TNF-рецептор (Nakamura-Lopez et al., 2009), а также может вызывать некроптоз (Dunai et al., 2012). В целом, с уверенностью можно утверждать одно – в концентрациях выше 100 нМ стауроспорин вызывает гибель части клеток для практически любой клеточной культуры. Действие отдельно взятых стауроспорина и 2-дезоксиглюкозы оказалось для контрольных и цитохромдефицитных макрофагов одинаковым, однако в случае сочетания этих двух агентов цитохромдефицитные клетки показали достоверно большую устойчивость к апоптозу (Рис. 19). Из этих данных нельзя однозначно заключить, что сниженное количество цитохрома с само по себе вызывает повышение устойчивости костномозговых макрофагов к апоптозу, поскольку в Δcyt клетках снижение количества 66 цитохрома c сочетается с переключением на его изоформу K72W. Возможно, что большая устойчивость Δcyt макрофагов к сочетанному воздействию дезоксиглюкозы и стауроспорина объясняется синергичностью эффекта аминокислотной замены K72W и снижения количества цитохрома c в митохондриях. Следует учесть, что сами использованные здесь индукторы имеют комплексные и не полностью понятые на данный момент механизмы действия. Так, стауроспорин, обычно рассматриваемый в качестве стимулятора митохондриального пути клеточной гибели, может вызывать апоптоз даже у нокаутных по Apaf-1 клеток (Imao, Nagata, 2013), что явно противоречит некоторым существующим парадигмам. Поэтому вопрос о том, насколько физиологически релевантным является сочетанное воздействие стауроспорина и 2-дезоксиглюкозы, и возможно ли наблюдать различия в индукции апоптоза между нормальными и цитохромдефицитными клетками in vivo, остается открытым. Рисунок 19. Макрофаги генотипа fKW/fKW более устойчивы к апоптозу, вызываемому подавлением гликолиза. Окрашивание при помощи PI/AnnexinV-FITC контрольных и Δcyt макрофагов, у которых вызывали клеточную гибель, инкубируя в течение 6 часов с 20 мМ 2-дезоксиглюкозой (2DG), 500 нМ стауроспорином (STS), а также с их сочетанием в тех же концентрациях. 67 3.6 Проверка иммунных функций цитохромдефицитных макрофагов Помимо оценки клеточного дыхания и устойчивости к индукции апоптоза для цитохромдефицитных макрофагов были проанализированы также их специфические клеточные функции, такие как поляризация в М1 и М2 типы под действием экзогенных цитокинов (Рис. 20А), включая экспрессию MHC II при классической активации (Рис. 20Б) и маннозного рецептора CD206 при альтернативной активации (Рис. 20В). Учитывая известные метаболические различия между М1 и М2-макрофагами, можно было бы ожидать различной степени эффективности поляризации для нормальных и цитохромдефицитных клеток. Рисунок 20. Цитохромдефицитные макрофаги экспрессируют MHC II и способны к нормальной поляризации. А) Поляризация макрофагов в М1 (повышение уровня MHC II) и М2-направлениях (повышение уровня CD206), определенная методом проточной цитометрии. Б) Диаграмма количества MHC II на поверхности макрофагов, определенного методом проточной цитометрии. В) Диаграмма количества CD206 на поверхности макрофагов, определенного методом проточной цитометрии. 68 При этом необходимо понимать, что поверхностные молекулы, используемые в качестве маркеров классической либо альтернативной активации макрофагов, всегда присутствуют в каком-то количестве на повехности неполяризованных клеток, а поляризующие сигналы смещают равновесие в сторону определенной популяции, но никогда полностью не элиминируют альтернативную. Анализ как неполяризованных, так и М1- М2поляризованных макрофагов выявил одинаковые для нормальных и цитохромдефицитных клеток паттерны поверхностых маркеров. Отсутствие деффектов поляризации, в том числе в М2-направлении, подтверждает метаболическую нормальность цитохром с - дефицитных клеток. Одной из основных функций цитохрома c является утилизация АФК. Однако макрофаги имеют контролируемую систему продукции активных форм кислорода и азота, задействованную в умерщвлении фагоцитированных ими патогенов. В связи с этим обстоятельством методом проточной цитометрии с использованием окисляемого флуорофора дигидро- дихлорфлуоресцеин диацетата (H2DCFDА) нами было проведено определение спонтанного уровня активных форм кислорода (Рис. 21А). Спонтанный уровень АФК для нормальных и цитохромдефицитных клеток оказался одинаковым, после активации макрофагов он повышался, однако также не показывал достоверных различий. Макрофаги были проверены на фагоцитарную активность при помощи флуоресцентных бусин (Рис. 21В) и DCF-меченых бактерий E. coli (данные не показаны). В первом подходе анализировалось число бусин, поглощенных макрофагами, во втором случае - число макрофагов, фагоцитировавших флуоресцентно меченых бактерий. В обоих вариантах фагоцитарного теста не было обнаружено различий между контрольными и цитохромдефицитными макрофагами. Таким образом, снижение количества цитохрома c не ограничивает способности макрофагов к поляризации как в гликолитический М1-тип, так и в оксидативный М2-тип. Кроме того, методом проточной цитометрии были определены уровни других поверхностных маркеров макрофагов: связанного с G-белками 69 рецептора F4/80 - EMR1 (Рис. 21Г), рецептора компонента С3 комплемента Mac-1 (Рис. 21Д); в ходе работы методом РТ-ПЦР измерялась экспрессия провоспалительных цитокинов TNF и IL-6 (Рис. 21Б). Оказалось, что цитохром с - дефицитные клетки по всем этим параметрам так же не имеют отличий от контрольных макрофагов и являются вполне функциональными с точки зрения их роли в иммунной системе. Рисунок 21. Цитохромдефицитные макрофаги функциональны с точки зрения иммунной системы. А) Цитохромдефицитные макрофаги имеют нормальный уровень внутриклеточных АФК. Показаны профили флуоресценции DCF неокрашенных клеток (К-), окрашенных, что отражает внутриклеточный уровень АФК, а также клеток, обработанных пероксидом водорода (К+), у которых H2DCFDА полностью окислен. Столбики указывают среднее значение флуоресценции нормальных (зеленый) и цитохромдефицитных (красный) макрофагов. Б) Базальный уровень экспресии TNF и IL-6 в нормальных и цитохром-дефицитных макрофагах. Данные получены методом RT-PCR и нормированы на 1% от уровня экспрессии β-актина. В) Фагоцитарная активность макрофагов не зависит от количества цитохрома c. Верхний ряд показывает прямое и боковое светорассеивание флуоресцентных бусин, макрофагов и их смеси, нижний ряд – прямое и боковое светорассеяние объектов, имеющих высокий уровень флуоресценции от бусин. Г) и Д) – Количество специфических для макрофагов рецепторов F4/80 и Mac-1 не зависит от количества цитохрома с в митохондриях. 70 3.7 Обсуждение дыхательной функциональности цитохромдефицитных клеток Основным итогом данной работы является подтверждение справедливости биологического принципа «Всё или ничего» в отношении цитохрома с, одного из ключевых белков аэробного метаболизма. Парадоксально, но, хотя модель полного генетического нокдауна Cycs связана с гибелью эмбрионов, модели генетического нокдауна Cycs в лимфомиелоидных клетках приводят к фенотипам, неотличимым от нормальных. Несмотря на то, что в предложенных иммунологических моделях в клетках-мишенях было достигнуто десяткратное снижение содержания цитохрома с, в контексте целого организма пока не было обнаружено никаких последствий этого для их функций и жизнедеятельности, за исключением несколько большей устойчивости к апоптозу, причем в условиях его весьма специфической индукции. Модель с нестин-регулируемым снижением количества цитохрома с демонстрирует промежуточную ситуацию – эмбриональная летальность не является полной, в линии присутсвуют как нормальный, так и аномальный фенотипы. Таким образом, в нашей работе показано, что базовая схема дыхательной цепи, оставаясь одинаковой по сути, в разных типах клеток модифицируется и приобретает разную степень пластичности и устойчивости к количественному дисбалансу своих компонентов. По-видимому, для лимфомиелоидных клеток млекопитающих десятикратно сниженное количества цитохрома с вполне достаточно для нормальной работы дыхательной цепи. В связи с этим мы можем предложить, что в биологических системах может реализовываться принцип, аналогичный сформулированному итальянским экономистом Вильфредо Парето (Reed, 2001). При этом принцип Парето в случае подчиняющихся закону «всё или ничего» биологических систем может формулироваться более жестко, в соотношении не «20 к 80», а «10 к 90» или даже при большем 71 соотношении. Применительно к дыхательной цепи митохондрий это означает, что в некоторых клетках 90% случаев переноса электронов могут осуществлять всего 10% молекул цитохрома с. Учитывая данные о том, что отсутствие в митохондриях цитохрома с нарушает сборку не только полноразмерного комплекса IV, но также и сборку комплекса I (Vempati et al, 2009), который не взаимодействует с цитохромом с, можно предположить, что цитохром с тесно ассоциирован с дыхательным суперкомплексом – респирасомой. Такая связь может осуществляться за счет известного взаимодействия молекулы цитохрома с и остатка жирной кислоты в составе кардиолипина либо других липидов. Можно предположить, что большая часть потока электронов между комплексами III и IV происходит не между отдельными дыхательными комплексами в ходе переноса их свободно плавающими молекулами цитохрома с, а в пределах одной респирасомы, которая обслуживается относительно небольшим и, возможно, стехиометрическим количеством мембрано-связанного цитохрома с. Данную гипотезу и общее изменение представлений о работе дыхательной цепи митохондрий иллюстрирует Рис. 22. Архитектура и стехиометрия дыхательной цепи могут быть различны в разных типах клеток, поскольку митохондриальные заболевания, связанные с мутациями в митохондриальной ДНК, поражают определенные метаболически активные типы клеток (фоторецепторы, нейроны, мышечные клетки), и никогда не затрагивают другие типы клеток. В этом случае противоречие между летальностью полного генетического нокдауна Cycs и нормальной жизнеспособностью отдельных цитохромдефицитных клеток у кондиционных генетических нокдаунов объясняется тем, что в этих экспериментах не было затронуто «уязвимое звено» - тот тип клеток, в котором наблюдаемое снижение уровня цитохрома с будет приводить к более радикальным последствиям. Исходя из наблюдений за cfKW/cfKW Nes72 cre мышами, таким «уязвимым звеном» являются некоторые стволовые клетки, а также их коммитированные к дифференцировке потомки. Рисунок 22. Эволюция представлений об организации электронтранспортной цепи митохондрий. А) классические представления о независимо расположенных во внутренней мембране отдельных комплексах, между которыми свободно плавают молекулы цитохрома с. Б) Модель респирасомы (дыхательного суперкомплекса), который по-прежнему обслуживается свободноплавающим в межмебранном пространстве молекулами цитохрома с (по Dudkina et al, 2011). В) Модель респирасомы, с которой стационарно ассоциирован цитохром с, связанный с кардиолипином или другими фосфолипидами внутренней мембраны митохондрий (предложена в настоящей работе). 73 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В последние два десятилетия развитие подхода обратной генетики и технологий кондиционных генетических нокаутов и нокинов создали возможности для изучения функций отдельных генов и их продуктов в конкретных типах клеток-мишеней. Этот подход позволяет изучать регуляцию внутриклеточных путей передачи сигнала, межклеточные взаимодействия, метаболические особенности отдельных клеток и многие другие их параметры в максимально релевантных in vivo моделях. С помощью метода кондиционного редактирования генома можно создавать животные модели, воспроизводящие заболевания человека, связанные с определенными типами клеток, например, митохондриальные заболевания. Для этого необходимо создать генетическую систему, обеспечивающую удаление в определенном типе клеток-мишеней гена, ключевого для функционирования электрон-транспортной цепи митохондрий. Мы разработали такую генетическую систему на основе мышиной панели тканеспецифических рекомбиназ Cre и полученной нами ранее линии cfKW, (Муфазалов и др., 2009), несущей LoxP-фланкированный ген соматического цитохрома с мыши Cycs. В результате работы была создана одна модель полного генетического нокдауна, и три модели кондиционного генетического нокдауна. При генерализованном снижении экспрессии Cycs с помощью CMV-cre во всех типах клеток происходила гибель организма в середине периода внутриутробного развития. Это согласуется с данными о летальности эмбрионов с делецией кодирующей части гена Cycs на той же стадии развития (Li et al., 2000). При снижении экспрессии Cycs в нестинэкспрессирующих клетках с помощью рекомбиназы Nes-cre наблюдалась частичная эмбриональная летальность, а также отдельные фенотипические аномалии выживших мышей. Таким образом, экспрессирующие нестин клетки относятся к числу клеток-мишеней, для которых количество цитохрома с является критически значимым. 74 Напротив, снижение количества цитохрома с в Т-лимфоцитах и в макрофагах в обычных условиях не привело к какому либо эффекту для организма мышей и не нарушило баланс типов клеток в иммунной системе. Степень этого снижения была определена независимыми методами на уровне мРНК и белка, и варьировала для клеточных популяций отдельных индивидуумов от 5% до 20% с медианой 10% относительно нормального количества цитохрома с. Несмотря на это цитохромдефицитные клетки сохранили нормальную жизнедеятельность и поддерживали нормальный уровень клеточного дыхания с сохраняющимся ответом на разобщитель окисления и фосфорилирования. Это наблюдение, а также литературные данные о том, что удаление цитохрома с нарушает сборку I и IV комплексов дыхательной цепи (Vempati et al., 2009), позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что цитохром с может быть ассоциирован с дыхательным суперкомплексом – респирасомой. При этом меньшая, мембраносвязанная часть пула цитохрома с митохондрии обслуживает респирасому и обеспечивает большую часть потока электронов для потребностей окислительного фосфорилирования. Большая часть пула цитохрома с более мобильна и необходима для выполнения других его функций включая регуляцию уровня АФК в митохондриях. Снижение количества цитохрома с в Т-лимфоцитах не повлияло на их тимус-зависимую селекцию. Снижение количества цитохрома с в макрофагах не отразилось на их дифференцировке, поляризации, фагоцитозе, продукции ими АФК и провоспалительных цитокинов. Наблюдаемое снижение степени индукции апоптоза цитохромдефицитных макрофагов в ответ на стауроспорин в сочетании с дезоксиглюкозой может объясняться не только эффектом снижения количества цитохрома с, но, с большой долей вероятности, следствием замены K72W. В целом, нами показано, что клетки иммунной системы обладают довольно широким функциональным динамическим диапазоном количества цитохрома с, что объясняется их способностью к быстрой пролиферации 75 и характерными для них переключениями метаболизма с респираторного на гликолитический и обратно в ходе дифференцировки и иммунного ответа. 76 ВЫВОДЫ 1. Получены и обоснованы новые генетические модели кондиционного снижения количества соматического цитохрома c в определенных типах клеток-мишеней, которые могут быть использованы для создания мышиных моделей митохондриальных заболеваний. 2. При снижении количества соматического цитохрома c во всех клетках организма наблюдается полная эмбриональная летальность, при снижении количества только в нестин-экспрессирующих клетках – дефекты развития эмбрионов. 3. Снижение уровня экспрессии цитохрома c после Cre-зависимого удаления аллели Cycs дикого типа вызвано нарушением сплайсинга аллели K72W и образованием химерных РНК Cycs-neor. 4. Для макрофагов десятикратное снижение количества цитохрома c не приводит к нарушению их жизнеспособности, не снижает интенсивности клеточного дыхания, и не затрагивает их специфические иммунные функции. 5. Десятикратное снижение количества цитохрома c в Т-лимфоцитах также не влияет на их жизнеспособность, клеточное дыхание, не приводит к дисбалансу популяций лимфоцитов и не влияет на селекцию Т-клеток. 6. Снижение количества цитохрома c вместе с аминокислотной заменой K72W повышает устойчивость клеток к комбинации стауроспорина и 2дезоксиглюкозы, но не приводит к изменению устойчивости клеток к индукции апоптоза стауроспорином. 7. Предложена гипотеза об ассоциации цитохрома c и респирасомы, в её поддержку свидетельствует избыточность естественного количества цитохрома c для нормального функционирования дыхательной цепи Тлимфоцитов и макрофагов. 77 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Муфазалов, И.А. Биологические эффекты полной и частичной инактивации функций соматического цитохрома С на модели генетически модифицированных мышей: Автореферат диссертации кандидата биологических наук: 03.01.03 / Муфазалов Ильгиз Альбертович. – М., 2011. – 24 с. 2. Муфазалов И.А., Пеньков Д.Н., Черняк Б.В., Плетюшкина О.Ю., Высоких М.Ю., Кирпичников М.П., Долгих Д.А., Круглов А.А., Купраш Д.В., Скулачев В.П., Недоспасов С.А. Эмбриональные фибробласты мыши с мутацией К72W в гене соматического цитохрома С: получение и характеристика. // Молекулярная биология. –2009. –Т. 43. №4. – С. 648-656. 3. Муфазалов И.А., Круглов А.А., Ефимов Г.А., Друцкая М.С., Пеньков Д.Н., Купраш Д.В., Недоспасов С.А. Эффекты мутации в гене цитохрома С и блокаторов активных форм кислорода на ускоренную инволюцию тимуса в мышах, трансгенных по локусу ФНО/ЛТ. // Российский иммунологический журнал. – 2011. – Т. 5. № 2. – С. 112-120. 4. Шилов Е.С., Муфазалов И.А., Шебзухов Ю.В., Зварцев Р.В., Друцкая М.С., Недоспасов С.А. Кондиционный генетический нокдаун соматического цитохрома c мыши в лимфомиелоидных клетках. // Российский иммунологический журнал. – 2013. – Т. 7. № 4. – С. 361-371. 5. Шилов Е.С., Кисляков И.В., Горшкова Е.А., Зварцев Р.В., Друцкая М.С., Муфазалов И.А., Скулачев В.П., Недоспасов С.А. Лимфомиелоидные клетки мыши способны нормально функционировать в условиях значительного снижения экспрессии цитохрома c. // Биохимия. – Т. 79. № 12. – С. 1726-1738. 6. Abdullaev Z.Kh., Bodrova M.E., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Kluck R.M., Pereverzev M.O., Arseniev A.S., Efremov R.G., Kirpichnikov M.P., Mokhova E.N., Newmeyer D.D., Roder H., Skulachev V.P. A cytochrome c mutant with high electron transfer and antioxidant activities but devoid of apoptogenic effect. // Biochem J. – 2002. – № 362(Pt 3). – P.749-754. 78 7. Acehan D., Jiang X., Morgan D.G., Heuser J.E., Wang X., Akey C.W. Three- dimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. // Mol Cell. –2002. –V.9. №2. –P.423-432. 8. Ang S.K., Zhang M., Lodi T., Lu H. Mitochondrial thiol oxidase Erv1: both shuttle cysteine residues are required for its function with distinct roles. // Biochem J. –2014. –V.460 № 2. – P.199-210. 9. Arnarez C., Marrink S.J., Periole X. Identification of cardiolipin binding sites on cytochrome c oxidase at the entrance of proton channels. // Scientific Reports. – 2013. – V.3. №1263. – P.1-8. 10. Balduini C.L., Savoia A. Genetics of familial forms of thrombocytopenia. // Hum Genet. – 2012. –V.131. №12. –P.1821-1832. 11. Barata J.T., Silva A., Brandao J.G., Nadler L.M., Cardoso A.A., Boussiotis V.A. Activation of PI3K is indispensable for interleukin 7–mediated viability, proliferation, glucose use, and growth of T cell acute lymphoblastic leukemia cells. // J. Exp. Med. – 2004. – № 200. – P.659–669. 12. Barrientos A., Pierre D., Lee J., Tzagoloff A. Cytochrome oxidase assembly does not require catalytically active cytochrome c. // J. Biol. Chem. – 2003. –V.278. №11. – P.8881-8887. 13. Batiz L.F., Jimanez A.J., Guerra M., Rodriguez-Perez L.M., Toledo C.D., Vio K., Piez P., Perez-Figares J.M., Rodriguez E.M. New ependymal cells are born postnatally in two discrete regions of the mouse brain and support ventricular enlargement in hydrocephalus. // Acta Neuropathol. – 2011. – V.121. №6. – P.721735. 14. Benedict M.A., Hu Y., Inohara N., Núñez G. Expression and functional analysis of Apaf-1 isoforms. Extra Wd-40 repeat is required for cytochrome c binding and regulated activation of procaspase-9. // J. Biol. Chem. –2000. –V.275. №12. – P.8461-8468. 15. Bertrand R., Solary E., O'Connor P., Kohn K.W., Pommier Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. // Exp Cell Res. – 1994. – V.211. №2. –P.314-321. 79 16. Beverly B., Kang S.M., Lenardo M.J., Schwartz R.H. Reversal of in vitro T cell clonal anergy by IL-2 stimulation. // Int. Immunol. –1992. –№4. –Р.661–671. 17. Boltz-Nitulescu G., Wiltschke C., Holzinger C., Fellinger A., Scheiner O., Gessl A., Förster O. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. // J Leukoc Biol. – 1987. – V.41. №1. – Р.83-91. 18. Brown Т. Southern blotting. // Curr. Protoc. Mol. Biol. Suppl. – 1993. Chapter 21. Methods 2.9.1-2.9.14. p.14. 19. Cain K. Chemical-induced apoptosis: formation of the Apaf-1 apoptosome. // Drug Metab Rev. – 2003. – №35. –Р. 337-363. 20. Capecchi M.R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. // Nat Rev Genet. – 2005. – V. 6. №6. – Р.507512. 21. Chacinska A., Pfannschmidt S., Wiedemann N., Kozjak V., Sanjuan Szklarz L.K., Schulze-Specking A., Truscott K.N., Guiard B., Meisinger C., Pfanner N. Essential role of Mia40 in import and assembly of mitochondrial intermembrane space proteins. // Embo J. – 2004. – V. 23 –P. 3735–3746. 22. Сhadderton N., Palfi A., Millington-Ward S., Gobbo O., Overlack N., Carrigan M., O'Reilly M., Campbell M., Ehrhardt C., Wolfrum U., Humphries P., Kenna P.F., Farrar G.J. Intravitreal delivery of AAV-NDI1 provides functional benefit in a murine model of Leber hereditary optic neuropathy. // Eur J Hum Genet. – 2013. – V. 21. №1– P.62-68. 23. Chandra D., Bratton S.B., Person M.D., Tian Y., Martin A.G., Ayres M., Fearnhead H.O., Gandhi V., Tang D.G. Intracellular nucleotides act as critical prosurvival factors by binding to cytochrome C and inhibiting apoptosome. Intracellular nucleotides act as critical prosurvival factors by binding to cytochrome C and inhibiting apoptosome. // Cell. – 2006. – V.125. №7. – P.1333-1346. 24. Chen J., Lansford R., Stewart V., Young F., Alt F.W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. // Proc Natl Acad Sci USA. – 1993. – V.90. №10. – P.4528-4532. 80 25. Chen J., Gorman J.R., Stewart V., Williams B., Jacks T., Alt F.W. Generation of normal lymphocyte populations by Rb-deficient embryonic stem cells. // Curr Biol. – 1993. – V.3. №7. – P.405-413. 26. Chertkova R.V., Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Latypov R.F., Chernyak B.V., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Proapoptotic activity of cytochrome c in living cells: effect of K72 substitutions and species differences. // Molecular and cellular biochemistry. – 2008. – №314. – P.85-93. 27. Chinnery P.F., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA mutations in the pathogenesis of human disease. // Mol Med Today. – 2000. – V. 6. №11. – P.425-432. 28. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal Biochem. – 1987. – V.162. №1. – P.156-159. 29. Cooper C., Lehninger A.L. Oxidative phosphorylation by an enzyme complex from extracts of mitochondria. III. The span cytochrome c to oxygen. // J Biol Chem. – 1956. – V.219. №1. – P.519-529. 30. Corraliza I.M., Soler G., Eichmann K., Modolell M. Arginase induction by suppressors of nitric oxide synthesis (IL4, IL10, PGE2) in murine bone-marrowderived macrophages. // Biochem Biophys Res Commun. –1995. –V.206. №2. – P.667–673. 31. Craig D.B., Wallace C.J. Studies of 8-azido-ATP adducts reveal two mechanisms by which ATP binding to cytochrome c could inhibit respiration. // Biochemistry. –1995. – №34. –P.2686–2693. 32. Crompton M., Virji S., Doyle V., Johnson N., Ward J.M. The mitochondrial permeability transition pore. // Biochem Soc Symp. –1999. – №66. – P. 167-179. 33. De Rocco D., Cerqua C., Goffrini P., Russo G., Pastore A., Meloni F., Nicchia E., Moraes C.T., Pecci A., Salviati L., Savoia A. Mutations of cytochrome c identified in patients with thrombocytopenia THC4 affect both apoptosis and cellular bioenergetics. // Biochimica et biophysica acta. –2014. –№1842. – P. 269-274. 34. Diaz F., Garcia S., Hernandez D., Regev A., Rebelo A., Oca-Cossio J., Moraes C.T. Pathophysiology and fate of hepatocytes in a mouse model of mitochondrial hepatopathies. // Gut. –2008. – V.57. №2. –P.232-242. 81 35. Diaz F., Thomas C.K., Garcia S., Hernandez D., Moraes C.T. Mice lacking COX10 in skeletal muscle recapitulate the phenotype of progressive mitochondrial myopathies associated with cytochrome c oxidase deficiency. // Hum Mol Genet. – 2005. – V.14. №18. –P.2737-2748. 36. Díaz-Moreno I., García-Heredia J.M., Díaz-Quintana A., De la Rosa M.A. Cytochrome c signalosome in mitochondria. // Eur Biophys J. –2011. –V. 40. №12. – P. 1301-1315. 37. Díaz-Moreno I., García-Heredia J.M., Díaz-Quintana A., Teixeira M., De la Rosa M.A. Nitration of tyrosines 46 and 48 induces the specific degradation of cytochrome c upon change of the heme iron state to high-spin. // Biochim Biophys Acta. –2011. – V. 1807. №12. –P.1616-1623. 38. Dickerson R.E., Kopka M.L., Borders C.L., Varnum J., Weinzier J.E. A centrosymmetric projection at 4A of horse heart oxidized cytochrome c.// J Mol Biol. –1967. –V.29. №1. –P.77-95. 39. Downie J.A., Stewart J.W., Brockman N., Schweingruber A.M., Sherman F. Structural gene for yeast iso-2-cytochrome c. // J Mol Biol. – 1977. –V.113. №2 –P. 369-384. 40. Dudkina N.V., Kudryashev M., Stahlberg H., Boekema E.J. Interaction of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron tomography. // Proc Natl Acad Sci USA. –2011. –V.108. №37 –P. 15196-15200. 41. Dufort F.J., Bleiman B.F., Gumina M.R., Blair D., Wagner D.J., Roberts M.F., Abu-Amer Y., Chiles T.C. Cutting edge: IL-4-mediated protection of primary B lymphocytes from apoptosis via Stat6-dependent regulation of glycolytic metabolism. // Journal of Immunology. – 2007. –V.179. №8. –P. 4953–4957. 42. Dunai Z.A., Imre G., Barna G., Korcsmaros T., Petak I., Bauer P.I., Mihalik R. Staurosporine induces necroptotic cell death under caspase-compromised conditions in U937 cells.// PLoS One. –2012. –V.7. №7. –e41945. 43. Dymecki S.M. Flp recombinase promotes site-specific DNA recombination in embryonic stem cells and transgenic mice. //Proc Natl Acad Sci USA. –1996. –V.93. №12. –P.6191-6196. 82 44. Ekert P.G., Vaux D.L. The mitochondrial death squad: hardened killers or innocent bystanders? // Curr Opin Cell Biol. –2005. –V.17. №6. –P.626-630. 45. Ferguson-Miller S., Brautigan D.L., Margoliash E. Correlation of the kinetics of electron transfer activity of various eukaryotic cytochromes c with binding to mitochondrial cytochrome c oxidase. // J Biol Chem. –1976. –№251. –P.1104–1115. 46. Frauwirth K.A., Riley J.L., Harris M.H., Parry R.V., Rathmell J.C., Plas D.R., Elstrom R.L., June C.H., Thompson C.B. The CD28 signaling pathway regulates glucose metabolism. // Immunity. –2002. –V.16. №6. –P.769-777. 47. Fukui H., Diaz F., Garcia S., Moraes C.T. Cytochrome c oxidase deficiency in neurons decreases both oxidative stress and amyloid formation in a mouse model of Alzheimer's disease. // Proc Natl Acad Sci USA. –2007. –V.104. №35. –P.1416314168. 48. Galvan-Pena S., O'Neill L.A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. // Front Immunol. –2014. –№5. –e.420. 49. García-Heredia J.M., Díaz-Moreno I., Díaz-Quintana A., Orzáez M., Navarro J.A., Hervás M., De la Rosa M.A. Specific nitration of tyrosines 46 and 48 makes cytochrome c assemble a non-functional apoptosome. // FEBS Lett. –2012. –V.586. №2. –P.154-158. 50. Geering B., Simon H.U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. // Cell Death Differ. –2011. –V.18. №9. –P.1457-1469. 51. Giorgio M., Migliaccio E., Orsini F., Paolucci D., Moroni M., Contursi C., Pelliccia G., Luzi L., Minucci S., Marcaccio M., Pinton P., Rizzuto R., Bernardi P., Paolucci F., Pelicci P.G. Electron transfer between cytochrome c and p66Shc generates reactive oxygen species that trigger mitochondrial apoptosis.// Cell. –2005. – V.122. №2. –P. 221-233. 52. Green S.J., Mellouk S., Hoffman S.L., Meltzer M.S., Nacy C.A.. Cellular mechanisms of nonspecific immunity to intracellular infection: cytokine-induced synthesis of toxic nitrogen oxides from L-arginine by macrophages and hepatocytes. // Immunology letters. –1990. – №25. –P.15-19. 83 53. Gu H., Zou Y.R., Rajewsky K. Independent control of immunoglobulin switch recombination at individual switch regions evidenced through Cre-loxP-mediated gene targeting. // Cell. –1993. –V. 73. №6.–P. 1155-1164. 54. Hake L.E., Kuemmerle N., Hecht N.B., Kozak C.A., Zou H., Li Y., Liu X., Wang X. The genes encoding the somatic and testis-specific isotypes of the mouse cytochrome c genes map to paralogous regions of chromosomes 6 and 2. // Genomics. –1994. –№20. –P.503–505. 55. Halicka H.D., Ardelt B., Li X., Melamed M.M., Darzynkiewicz Z. 2-Deoxy-D- glucose enhances sensitivity of human histiocytic lymphoma U937 cells to apoptosis induced by tumor necrosis factor.// Cancer Res. –1995. – V.55. №2. –P.444-449. 56. Hao Z., Duncan G.S., Chang C.C., Elia A., Fang M., Wakeham A., Okada H., Calzascia T., Jang Y., You-Ten A., Yeh W.C., Ohashi P., Wang X., Mak T.W. Specific ablation of the apoptotic functions of cytochrome c reveals a differential requirement for cytochrome c and Apaf-1 in apoptosis. // Cell. –2005. –V.121. №4. – P.579–591. 57. Hard G.C. Some biochemical aspects of the immune macropage. //British Journal of Experimental Pathology. –1970. –V. 51. №1. –P.97-105. 58. He S., Kato K., Jiang J., Wahl D.R., Mineishi S., Fisher E.M., Murasko D.M., Glick G.D., Zhang Y. Characterization of the metabolic phenotype of rapamycintreated CD8+ T cells with augmented ability to generate long-lasting memory cells.// PLoS ONE. –2011. –№6. –e.20107. 59. Hedeskov C.J., Esmann V. Respiration and glycolysis of normal human lymphocytes.// Blood. –1966. – V.28. №2. –P.163-174. 60. Heinemeyer J., Braun H.P., Boekema E.J., Kouril R. A structural model of the cytochrome C reductase/oxidase supercomplex from yeast mitochondria. // J Biol Chem. –2007. –V. 282. №16. –P.1240-1248. 61. Heitz F.D., Erb M., Anklin C., Robay D., Pernet V., Gueven N. Idebenone protects against retinal damage and loss of vision in a mouse model of Leber's hereditary optic neuropathy. // PLoS One. – 2012. –V. 7. №9. –e.45182. 62. Hennig B. Change of cytochrome c structure during development of the mouse.// Eur J Biochem. –1975. –V.55. №1. –P.167-183. 84 63. Hinrichs S.H., Fontes J.D., Bills N.D., Schneider P.D. Transgenic models of human cancer. // Princess Takamatsu Symp. –1991. –№22. –P.259-274. 64. Hoess R.H., Ziese M., Sternberg N. P1 site-specific recombination: nucleotide sequence of the recombining sites. // Proc Natl Acad Sci USA. –1982. –V.79. №11. – P.3398-3402. 65. Hogan B., Lyons K. Gene targeting. Getting nearer the mark. // Nature. –1988. –V.336. №6197. –P.304-305. 66. Hortelano S., Zeini M., Castrillo A., Alvarez A.M., Boscá L. Induction of apoptosis by nitric oxide in macrophages is independent of apoptotic volume decrease. // Cell Death Differ. –2002. –V. 9. №6. –P.643-650. 67. Hüttemann M., Pecina P., Rainbolt M., Sanderson T.H., Kagan V.E., Samavati L., Doan J.W., Lee I. The multiple functions of cytochrome c and their regulation in life and death decisions of the mammalian cell: From respiration to apoptosis.// Mitochondrion. –2011. –V.11. №3. –V.369-381. 68. Imao T., Nagata S. Apaf-1- and Caspase-8-independent apoptosis. // Cell Death Differ.–2013. –V.20. №2. –P. 343-352. 69. Jones R.G., Thompson C.B. Revving the engine: signal transduction fuels T cell activation. // Immunity. –2007. – V.27. №2 –P.173-178. 70. Kagan V.E., Borisenko G.G., Tyurina Y.Y., Tyurin V.A., Jiang J., Potapovich A.I., Kini V., Amoscato A.A., Fujii Y. Oxidative lipidomics of apoptosis: redox catalytic interactions of cytochrome c with cardiolipin and phosphatidylserine. // Free Radic Biol Med. –2004. – V.37. №12. –P.1963-1985. 71. Kagan V.E., Tyurin V.A., Jiang J., Tyurina Y.Y., Ritov V.B., Amoscato A.A., Osipov A.N., Belikova N.A., Kapralov A.A., Kini V., Vlasova I.I., Zhao Q., Zou M., Di P., Svistunenko D.A., Kurnikov I.V., Borisenko G.G. Cytochrome c acts as a cardiolipin oxygenase required for release of proapoptotic factors. // Nat Chem Biol. – 2005. –V.1. №4.–P.223-232. 72. Kamada S., Shimono A., Shinto Y., Tsujimura T., Takahashi T., Noda T., Kitamura Y., Kondoh H., Tsujimoto Y. Bcl-2 deficiency in mice leads to pleiotropic abnormalities: accelerated lymphoid cell death in thymus and spleen, polycystic 85 kidney, hair hypopigmentation, and distorted small intestine. // Cancer Res. –1995. – V.55. №2. –P.354-359. 73. Kanungo A.K., Hao Z., Elia A.J., Mak T.W., Henderson J.T. Inhibition of apoptosome activation protects injured motor neurons from cell death. // J Biol Chem. –2008. –V.283. №32. –P. 22105-22112. 74. Keilin D. On cytochrome, a respiratory pigment, common to animals, yeast, and higher plants. // Proc R Soc Lond, Ser B. –1925. –№98. –P.312–339. 75. King, M.P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. // Science. –1989. –№246. –P. 500503. 76. Kluck R.M., Ellerby L.M., Ellerby H.M., Naiem S., Yaffe M.P., Margoliash E., Bredese, D., Mauk A.G., Sherman F., Newmeyer D.D. Determinants of cytochrome c pro-apoptotic activity. The role of lysine 72 trimethylation. The Journal of biological chemistry // 2000. –№275. –P. 16127-16133. 77. Korshunov S.S., Krasnikov B.F., Pereverzev M.O., Skulachev V.P. The antioxidant functions of cytochrome c. // FEBS Lett. –1999. –V.462. №1-2. –P.192198. 78. Kuhn R., Wurst W. Gene Knockout Protocols. Second Edition. /Edited by Ralf Kuhn and Wolfgang Wurst. –New-Yourk, Humana press, 2009. –p.517. 79. Kulikov A.V., Shilov E.S., Mufazalov I.A., Gogvadze V., Nedospasov S.A., Zhivotovsky B. Cytochrome c: the Achilles' heel in apoptosis. // Cell Mol Life Sci. – 2012. –V.69. №11. –P.1787-1797. 80. Landel C.P., Chen S.Z., Evans G.A. Reverse genetics using transgenic mice.// Annu Rev Physiol. –1990. –№52. –P.841-851. 81. Lapuente-Brun E., Moreno-Loshuertos R., Acín-Pérez R., Latorre-Pellicer A., Colás C., Balsa E., Perales-Clemente E., Quirós P.M., Calvo E., RodríguezHernández M.A., Navas P., Cruz R., Carracedo Á., López-Otín C., Pérez-Martos A., Fernández-Silva P., Fernández-Vizarra E., Enríquez J.A. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. // Science. – 2013. –№340. –P.1567–1570. 86 82. Lee I., Salomon A.R., Yu K., Doan J.W., Grossman L.I., Hüttemann M. New prospects for an old enzyme: mammalian cytochrome c is tyrosine-phosphorylated in vivo. // Biochemistry. –2006. –V.45.№30. –P.9121-9128. 83. Lee P.P., Fitzpatrick D.R., Beard C., Jessup H.K., Lehar S., Makar K.W., Pérez-Melgosa M., Sweetser M.T., Schlissel M.S., Nguyen S., Cherry S.R., Tsai J.H., Tucker S.M., Weaver W.M., Kelso A., Jaenisch R., Wilson C.B. A critical role for Dnmt1 and DNA methylation in T cell development, function, and survival. // Immunity. –2001. –V.15. №5. –P.763-774. 84. Leone D.P, Genoud S., Atanasoski S., Grausenburger R., Berger P., Metzger D., Macklin W.B., Chambon P., Suter U. Tamoxifen-inducible glia-specific Cre mice for somatic mutagenesis in oligodendrocytes and Schwann cells. //Mol Cell Neurosci. –2003. –V.22. №4. –P.430-440. 85. Lewandoski M. Conditional control of gene expression in the mouse. //Nat Rev Genet. –2001. –V.2 №10. –P.743-755. 86. Li K., Li Y., Shelton J.M., Richardson J.A., Spencer E., Chen Z.J., Wang X., Williams R.S. Cytochrome c deficiency causes embryonic lethality and attenuates stress-induced apoptosis. // Cell. –2000. №101. –P.389–399. 87. Li L., Fukunaga-Kalabis M., Yu H., Xu X., Kong J., Lee J.T., Herlyn M. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. // J Cell Sci. –2010. –№123(Pt 6). –P.853-860. 88. Li T., Huang S., Zhao X., Wright D.A., Carpenter S., Spalding M.H., Weeks D.P., Yang B. Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. //Nucleic Acids Res. –2011. – V.39. №14. –P.6315-6325. 89. Li Z., Jo J., Jia J.M., Lo S.C., Whitcomb D.J., Jiao S., Cho K., Sheng M. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. // Cell. –2010. –V.141 №5. –P.859-871. 90. Lin C.S., Sharpley M.S., Fan W., Waymire K.G., Sadun A.A., Carelli V., Ross- Cisneros F.N., Baciu P., Sung E., McManus M.J., Pan B.X., Gil D.W., Macgregor G.R., Wallace D.C. Mouse mtDNA mutant model of Leber hereditary optic neuropathy. // Proc Natl Acad Sci USA. –2012. –V.109. №49. –P.20065-20070. 87 91. Liptak M.D., Fagerlund R.D., Ledgerwood E.C., Wilbanks S.M., Bren K.L. The proapoptotic G41S mutation to human cytochrome c alters the heme electronic structure and increases the electron self-exchange rate. // J Am Chem Soc. –2011. – V.133. №5. –P.1153-1155. 92. Liu Z., Lin H., Ye S., Liu Q.Y., Meng Z., Zhang C.M., Xia Y., Margoliash E., Rao Z., Liu X.J. Remarkably high activities of testicular cytochrome c in destroying reactive oxygen species and in triggering apoptosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. –№103. –P.8965–8970. 93. Liu X., Kim C. N., Yang J., Jemmerson R., Wang X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome c. // Cell. –1996. –№86. –P.147-157. 94. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Delta Delta CT Method. // Methods –2001. – V.25. №4. –P.402-408. 95. MacIver N.J., Michalek R.D., Rathmell J.C. Metabolic regulation of T lymphocytes. // Annu Rev Immunol. –2013. –№31. –P.259-283. 96. MacMunn C.A. Researches on Myohaematin and the Histohaematins. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. –1886. №177. –P.267-298. 97. Maianski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Roos D., Kuijpers T.W. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. // Cell Death Differ. –2004. –V.11. №2. –P.143-153. 98. Mansfield K.D., Guzy R.D., Pan Y., Young R.M., Cash T.P., Schumacker P.T., Simon M.C. Mitochondrial dysfunction resulting from loss of cytochrome c impairs cellular oxygen sensing and hypoxic HIF-alpha activation. // Cell Metab. –2005. –№6. –P.393-399. 99. Mansour S.L., Thomas K.R., Capecchi M.R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. // Nature. –1988. –V.336. №6197 –P.348-352. 100. Margoliash E., Smith E., Kreil G., Tuppy H. Amino-acid sequence of horse heart cytochrome c. //Nature. –1961; –№192. –P.1125-1127. 88 101. Margoliash E. Primary structure and evolution of cytochrome c. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –1963. –V.50. №4. –P.672–679. 102. Martinez F.О., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. // Front Biosci. –2008. №13. –P.453-461. 103. Matsuda F., Fujii J., Yoshida S. Autophagy induced by 2-deoxy-D-glucose suppresses intracellular multiplication of Legionella pneumophila in A/J mouse macrophages. // Autophagy. –2009. –V.5. №4. –P.484-493. 104. Mavridou D.A., Ferguson S.J., Stevens, J.M. Cytochrome c assembly. // IUBMB life. –2013. –№65. –P.209-216. 105. McKnight G.L., Cardillo T.S., Sherman F. An extensive deletion causing overproduction of yeast iso-2-cytochrome c. // Cell. –1981. –V.25. №2. –P.409-419. 106. Mei Y., Yong J., Liu H., Shi Y., Meinkoth J., Dreyfuss G., Yang X. tRNA binds to cytochrome c and inhibits caspase activation. //Mol Cell. –2010. –V.37. №5. –P.668-678. 107. Metzger D., Clifford J., Chiba H., Chambon P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. //Proc Natl Acad Sci USA. –1995. –V.92. №15. –P.6991-6995. 108. Missirlis P.I., Smailus D.E., Holt R.A. A high-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics of the loxP spacer region in Cre-mediated recombination. // BMC Genomics. –2006. №7. –P.73. 109. Morison I.M., Cramer Bordé E.M., Cheesman E.J., Cheong P.L., Holyoake A.J., Fichelson S., Weeks R.J., Lo A., Davies S.M, Wilbanks S.M., Fagerlund R.D., Ludgate M.W., da Silva Tatley F.M., Coker M.S., Bockett N.A., Hughes G., Pippig D.A., Smith M.P., Capron C., Ledgerwood E.C. A mutation of human cytochrome c enhances the intrinsic apoptotic pathway but causes only thrombocytopenia. // Nature genetics. –2008. –№ 40. –P.387-389. 110. Morriss G.M., New D.A. Effect of oxygen concentration on morphogenesis of cranial neural folds and neural crest in cultured rat embryos.// Journal of embryology and experimental morphology. –1979. –№54. –P.17-35. 111. Motoyama N., Wang F., Roth K.A., Sawa H., Nakayama K., Nakayama K., Negishi I., Senju S., Zhang Q., Fujii S. Massive cell death of immature hematopoietic 89 cells and neurons in Bcl-x-deficient mice. // Science. –1995. – V.267. №5203. – P.1506-1510. 112. Munn D.H., Beall A.C., Song D., Wrenn R.W., Throckmorton D.C. Activationinduced apoptosis in human macrophages: developmental regulation of a novel cell death pathway by macrophage colony-stimulating factor and interferon gamma. // J Exp Med. 1995. –V.181. №1. –P.127-136. 113. Munoz-Pinedo C., Guio-Carrion A., Goldstein J.C., Fitzgerald P., Newmeyer D.D., Green D.R. Different mitochondrial intermembrane space proteins are released during apoptosis in a manner that is coordinately initiated but can vary in duration. // Proc Natl Acad Sci USA. –2006. –V.103. №31. –P.11573-11578. 114. Murphy B.M., O'Neill A.J., Adrain C., Watson R.W., Martin S.J. The apoptosome pathway to caspase activation in primary human neutrophils exhibits dramatically reduced requirements for cytochrome C. // J Exp Med. –2003. –V.197. №5. –P.625-632. 115. Nakamura-López Y., Sarmiento-Silva R.E., Moran-Andrade J., Gómez-García B. Staurosporine-induced apoptosis in P388D1 macrophages involves both extrinsic and intrinsic pathways. // Cell Biol Int. 2009. –V.33. №9. –P.1026-1031. 116. Narisawa S., Hecht N.B., Goldberg E., Boatright K.M., Reed J.C., Millán J.L. Testis-specific cytochrome c-null mice produce functional sperm but undergo early testicular atrophy. // Mol Cell Biol. –2002. –V.22. №15. –P.5554-5562. 117. Nemoto S., Combs C.A., French S., Ahn B.H., Fergusson M.M., Balaban R.S., Finkel T. The mammalian longevity-associated gene product p66shc regulates mitochondrial metabolism. // Biol Chem. –2006. –V.281. №15. –P.10555-10560. 118. Newsholme P., Gordon S., Newsholme E.A. Rates of utilization and fates of glucose, glutamine, pyruvate, fatty acids and ketone bodies by mouse macrophages. // Biochem J. –1987. –V.242. №3. –P.631-636. 119. Nirenberg M.W., Hogg J.F. Inhibition of anaerobic glycolysis in Ehrlich ascites tumor cells by 2-deoxy-D-glucose. // Cancer Res. –1958. –V.18. №5. –P.518-521. 120. Odegaard J.I., Chawla A. Alternative macrophage activation and metabolism. // Annu Rev Pathol. –2011. –№6. –P.275-297. 90 121. Ott M., Zhivotovsky B., Orrenius S. Role of cardiolipin in cytochrome c release from mitochondria.// Cell Death Differ. –2007. –V.14. №7. –P.1243-1247. 122. Ow Y.P., Green D.R., Hao Z., Mak T.W. Cytochrome c: functions beyond respiration. // Nat Rev Mol Cell Biol. –2008. –V.9. №7. –P.532-542. 123. Pearce D.A., Sherman F. Degradation of cytochrome oxidase subunits in mutants of yeast lacking cytochrome c and suppression of the degradation by mutation of yme1. //J Biol Chem. –1995. –V.270. №36. –P.20879-20882. 124. Pearce E.J., Everts B. Dendritic cell metabolism. // Nat Rev Immunol. –2014. – V.15. №1. –P.18-29. 125. Pecina P., Borisenko G.G., Belikova N.A., Tyurina Y.Y., Pecinova A., Lee I., Samhan-Arias A.K., Przyklenk K., Kagan V.E., Hüttemann M. Phosphomimetic substitution of cytochrome C tyrosine 48 decreases respiration and binding to cardiolipin and abolishes ability to trigger downstream caspase activation. // Biochemistry. –2010. –V.49. №31. –P.6705-6714. 126. Pierron D., Opazo J.C., Heiske M., Papper Z., Uddin M., Chand G., Wildman D.E., Romero R., Goodman M., Grossman L.I. Silencing, positive selection and parallel evolution: busy history of primate cytochromes C. // PLoS One. –2011. –V.6. №10. –e26269. 127. Proger S., Dekaneas D., Schmidt G. Some observations on the effect of injected cytochrome C in animals // J Clin Invest. –1945. –V.24. №6. –P.864–868. 128. Qi X., Lewin A.S., Hauswirth W.W., Guy J. Optic neuropathy induced by reductions in mitochondrial superoxide dismutase. // Invest Ophthalmol Vis Sci. – 2003. –V.44. №3. –P.1088-1096. 129. Radford N.B., Wan B., Richman A., Szczepaniak L.S., Li J.L., Li K., Pfeiffer K., Schägger H., Garry D.J., Moreadith R.W. Cardiac dysfunction in mice lacking cytochrome-c oxidase subunit VIaH. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. –2002. – V.282. №2. –P.726-733. 130. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y., Gootenberg J.S., Konermann S., Trevino A.E., Scott D.A., Inoue A., Matoba S., Zhang Y., Zhang F. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.// Cell. –2013. –V.154. №6. 1380-1389. 91 131. Reed J.C., Green D.R. Apoptosis: physiology and pathology. / Edited by John C. Reed, Douglas R. Green. London: Cambridge University Press, 2011. –468 p. 132. Reed W.J. The Pareto, Zipf and other power laws. // Economics Letters. –2001. –№74. –P.15-19. 133. Rossignol R., Malgat M., Mazat J.P., Letellier T. Threshold effect and tissue specificity. Implication for mitochondrial cytopathies. // J Biol Chem. –1999. –V.274. №47. –P.33426-33432. 134. Roy N.S., Benraiss A., Wang S., Fraser R.A., Goodman R., Couldwell W.T., Nedergaard M., Kawaguchi A., Okano H., Goldman S.A. Promoter-targeted selection and isolation of neural progenitor cells from the adult human ventricular zone. // J Neurosci Res. –2000. –V 59. №3. –P.321-331. 135. Ryan M.T., Hoogenraad N.J. Mitochondrial-nuclear communications. // Annu Rev Biochem. –2007. –№76. 701-722. 136. Rytomaa M., Kinnunen P.K. Evidence for two distinct acidic phospholipidbinding sites in cytochrome c. // J Biol Chem. –1994. –V.269. №3. –P.1770-1774. 137. Santiago Y., Chan E., Liu P.Q., Orlando S., Zhang L., Urnov F.D., Holmes M.C., Guschin D., Waite A., Miller J.C., Rebar E.J., Gregory P.D., Klug A., Collingwood T.N. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.// Proc Natl Acad Sci USA. –2008. –V.105. №15. –P.58095814. 138. Sauer B., Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. // Proc Natl Acad Sci USA. –1988. – V.85. №14. –P.5166-5170. 139. Schägger H., Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. // EMBO J. –2000. –V.19. №8. –P.1777-1783. 140. Schweingruber M.E., Stewart J.W., Sherman F. Primary site and second site revertants of missense mutants of the evolutionarily invariant tryptophan 64 in iso-1cytochrome c from yeast. // J Biol Chem. –1979. –V.254. №10. –P.4132-4143. 141. Schwenk F., Baron U., Rajewsky K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. // Nucleic Acids Res. –1995. –V.23. №24. –P.5080-5081 92 142. Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., Astapova M.V., Dedukhova V.I., Chernyak B.V., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Skulachev V.P., Kirpichnikov M.P. Comparative analysis of proapoptotic activity of cytochrome c mutants in living cells. // Apoptosis. –2005. №10. –P.797-808. 143. Sherman F., Taber H., Campbell W. Genetic determination of iso-cytochromes c in yeast. // J Mol Biol. –1965. –V.13. №1. –P.21-39. 144. Sherman F., Stewart J.W., Jackson M., Gilmore R.A., Parker, J.H. Mutants of yeast defective in iso-1-cytochrome c. // Genetics. –1974. –№77 –P.255-284. 145. Shi L.Z., Wang R., Huang G., Vogel P., Neale G., Green D.R., Chi H. HIF1 alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates a metabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells. // J Exp Med. –2011. –V.208. №7. –P.13671376. 146. Shiozaki E.N., Chai J., Shi Y. Oligomerization and activation of caspase-9, induced by Apaf-1 CARD. // Proc Natl Acad Sci USA. –2002. –V. 99. №7. –P.41974202. 147. Sinha P., Clements V.K., Ostrand-Rosenberg S. Interleukin-13-regulated M2 macrophages in combination with myeloid suppressor cells block immune surveillance against metastasis. // Cancer Res. –2005. –V.65. №24. –P.11743-11751. 148. Sinibaldi F., Howes B.D., Piro M.C., Polticelli F., Bombelli C., Ferri T., Coletta M., Smulevich G., Santucci R. Extended cardiolipin anchorage to cytochrome c: a model for protein-mitochondrial membrane binding. // J Biol Inorg Chem. –2010. –V.15. №5. –P.689-700. 149. Stein M., Keshav S., Harris N., Gordon S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: a marker of alternative immunologic macrophage activation. // J Exp Med. –1992. –V.176. №1. –P.287-292. 150. Strasser A., Harris A.W., Huang D.C., Krammer P.H., Cory S. Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis. // EMBO J. –1995. – V.14. №24. –P.6136-6147. 151. Takeda K., Clausen B.E., Kaisho T., Tsujimura T., Terada N., Förster I., Akira S. Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of Stat3 in macrophages and neutrophils.// Immunity. –1999. –V.10. №1. –P.39-49. 93 152. Tamaoki T., Nomoto H., Takahashi I., Kato Y., Morimoto M., Tomita F. Staurosporine, a potent inhibitor of phospholipid/Ca++ dependent protein kinase. // Biochem Biophys Res Commun. –1986. –V.135. №2. –P.397-402. 153. Torraco A., Diaz F., Vempati U.D., Moraes C.T. Mouse models of oxidative phosphorylation defects: powerful tools to study the pathobiology of mitochondrial diseases. // Biochim Biophys Acta. –2009. –V.1793. №1 –P.171-180. 154. Tronche F., Kellendonk C., Kretz O., Gass P., Anlag K., Orban P.C., Bock R., Klein R., Schütz G. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. // Nat Genet. –1999. –V.23. №1. –P.99-103. 155. Tuominen E.K., Wallace C.J., Kinnunen P.K. Phospholipid-cytochrome c interaction: evidence for the extended lipid anchorage. // J Biol Chem. –2002. –V.277. №11. –P.8822-8826. 156. Van der Windt G.J., Everts B., Chang C.H., Curtis J.D., Freitas T.C., Amiel E., Pearce E.J., Pearce E.L. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. //Immunity. –2012. –V.36. №1. –P.68-78. 157. Van der Windt G.J., Pearce E.L. Metabolic switching and fuel choice during Tcell differentiation and memory development. // Immunol Rev. –2012. –V.249. №1. – P.27-42. 158. Veis D.J., Sorenson C.M., Shutter J.R., Korsmeyer S.J. Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant lymphoid apoptosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. // Cell. –1993. –V.75. №2 –P.229-240. 159. Vempati U.D., Diaz F., Barrientos A., Narisawa S., Mian A.M., Millán J.L., Boise L.H., Moraes C.T. Role of cytochrome c in apoptosis: increased sensitivity to tumor necrosis factor alpha is associated with respiratory defects but not with lack of cytochrome c release. // Mol Cell Biol. –2007. –V.27.№5. –P.1771-1783. 160. Vempati U.D., Han X., Moraes C.T. Lack of cytochrome c in mouse fibroblasts disrupts assembly/stability of respiratory complexes I and IV. //J Biol Chem. –2009. – V.284. №7. –P.4383-4391. 161. Vempati U.D., Torraco A., Moraes C.T. Mouse models of oxidative phosphorylation dysfunction and disease. // Methods. –2008. –V.46. №4. –P.241-247. 94 162. Villani G., Attardi G. In vivo control of respiration by cytochrome c oxidase in wild-type and mitochondrial DNA mutation-carrying human cells. // Proc Natl Acad Sci USA. –1997. –№94. –P.1166–1171. 163. Volkov A.N., Bashir Q., Worrall J.A., Ubbink M. Binding hot spot in the weak protein complex of physiological redox partners yeast cytochrome C and cytochrome C peroxidase. // J Mol Biol. –2009. –V.385. №3. –P.1003-1013. 164. Walker M.A., Volpi S., Sims K.B., Walter J.E., Traggiai E. Powering the immune system: mitochondria in immune function and deficiency. // J Immunol Res. –2014. –e.2014:164309. 165. Warburg O., Gawehn K., Geissler A.W. Metabolism of leukocytes. // Z. Naturforsch. –1958. –№13B. –P.515–516. 166. Wei M.C., Zong W.X., Cheng E.H., Lindsten T., Panoutsakopoulou V., Ross A.J., Roth K.A., MacGregor G.R., Thompson C.B., Korsmeyer S.J. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. // Science. –2001. – V.292. №5517. –P.727-730. 167. Wieman H.L., Wofford J.A., Rathmell J.C. Cytokine stimulation promotes glucose uptake via phosphatidylinositol-3 kinase/Akt regulation of Glut1 activity and trafficking. // Mol Biol Cell. –2007. –№18. –Р.1437–1446. 168. Xi H., Kurtoglu M., Liu H., Wangpaichitr M., You M., Liu X., Savaraj N., Lampidis T.J. 2-Deoxy-D-glucose activates autophagy via endoplasmic reticulum stress rather than ATP depletion. // Cancer Chemother Pharmacol. –2011. –V.67. №4. –P.899-910. 169. Xiong S., Mu T., Wang G., Jiang X. Mitochondria-mediated apoptosis in mammals. // Protein Cell. – 2014. –V.5. №10. –P.737–749. 170. Yi X., Yin X.M., Dong Z. Inhibition of Bid-induced apoptosis by Bcl-2. tBid insertion, Bax translocation, and Bax/Bak oligomerization suppressed. // J Biol Chem. –2003. – V.278. №19. –P.16992-16999. 171. Yin X.M., Wang K., Gross A., Zhao Y., Zinkel S., Klocke B., Roth K.A., Korsmeyer S.J. Bid-deficient mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis. // Nature. –1999. –V.400. №6747. –P.886-891. 95 172. Yonetani T., Ray G.S. Studies on cytochrome c peroxidase. I. Purification and some properties. // J Biol Chem. –1965. –V.240. №11. –P.4503-4508. 173. Yu H., Ozdemir S.S., Koilkonda R.D., Chou T.H., Porciatti V., Chiodo V., Boye S.L., Hauswirth W.W., Lewin A.S., Guy J. Mutant NADH dehydrogenase subunit 4 gene delivery to mitochondria by targeting sequence-modified adenoassociated virus induces visual loss and optic atrophy in mice. // Mol Vis. –2012. – №18. –P.1668-1683. 174. Yu T., Wang X., Purring-Koch C., Wei Y., McLendon G.L. A mutational epitope for cytochrome C binding to the apoptosis protease activation factor-1. // The Journal of biological chemistry. –2011. –№276. –P.13034-13038. 175. Yu H., Lee I., Salomon A.R., Yu K., Hüttemann M. Mammalian liver cytochrome c is tyrosine-48 phosphorylated in vivo, inhibiting mitochondrial respiration. // Biochim Biophys Acta. –2008. –V.1777. №7-8 –P.1066-1071. 176. Zhang X.W, Niu X.L., Guo Z.G. Estrogens induce apoptosis in mouse peritoneal macrophages. // Acta Pharmacol Sin. –1997. –V.18. №3. –P.267-270. 177. Zhao X., León I.R., Bak S., Mogensen M., Wrzesinski K., Højlund K., Jensen O.N. Phosphoproteome analysis of functional mitochondria isolated from resting human muscle reveals extensive phosphorylation of inner membrane protein complexes and enzymes. // Mol Cell Proteomics. –2011. –V.10.№1. 178. Zhang Z., Gerstein M. The human genome has 49 cytochrome c pseudogenes, including a relic of a primordial gene that still functions in mouse.// Gene. – 2003. – №12. –P.61-72. –doi: 10.1074/mcp.M110.000299. 179. Zheng Y., Delgoffe G.M., Meyer C.F., Chan W., Powell J.D. Anergic T cells are metabolically anergic. // J Immunol. –2009. –V.183.№10. –P.6095-6101. В работе были использованы web-ресурсы: The Jackson Laboratories - http://jaxmice.jax.org/findmice/ UCSC Genome Browser - http://genome.ucsc.edu GeneCards - http://www.genecards.org NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov Allen Brain Atlas - http://developingmouse.brain-map.org/static/atlas 96 БЛАГОДАРНОСТИ Хочу поблагодарить моего научного руководителя Сергея Артуровича Недоспасова за предоставление мне возможности внести свой вклад в этот проект, помощь и поддержку в организации экспериментов, а также критический анализ и плодотворное обсуждение результатов. Также хочу поблагодарить Марину Сергеевну Друцкую, Юрия Владимировича Шебзухова и Владимира Георгиевича Гогвадзе за помощь в освоении новых для меня методов работы, Андрея Алексеевича Круглова за участие в подборе мышиных линий, Дарью Марковну Поташникову за помощь в проведении сортировки клеток и Виктора Степановича Тарабыкина за анализ анатомии мозга. Отдельные благодарности хочу выразить Рафаелу Шаеновичу Казаряну за организационную помощь в работе и моей студентке-дипломнице Екатерине Александровне Горшковой за деятельное участие в проекте. Также хочется отметить вклад Ильгиза Альбертовича Муфазалова, благодаря чьей работе у меня появилось широкое поле для деятельности. Большое спасибо моей семье и друзьям, поддерживавшим меня в этот период. В заключение хочется сказать спасибо за теплые и дружеские отношения в коллективе всем сотрудникам и студентам кафедры иммунологии биологического факультета МГУ и лаборатории молекулярных механизмов иммунитета ИМБ РАН. 97
