ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ. ЛИПИДЫ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ
БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ им. Р.Е. АЛЕКСЕЕВА»
Кафедра «Биотехнология, физическая и аналитическая химия»
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ.
ЛИПИДЫ
Методические указания к лабораторным занятиям
по дисциплине «Биохимия»
для студентов, обучающихся по направлению
«Биотехнология» дневной формы обучения
Нижний Новгород 2013
Составители: Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, Д.В. Белов, В.Р. Карташов
1
УДК 541.1
Лабораторный практикум по биохимии. Липиды: метод. указания к
лаб. занятиям по дисциплине «Биохимия» для студентов, обучающихся по
направлению «Биотехнология» дневной формы обучения/ НГТУ; сост.: Т.Н.
Соколова и др., Н. Новгород, 2013. – 20 с.
Методические указания предназначены для проведения лабораторных
занятий по курсу биохимии. Представлены следующие разделы курса: простые липиды, вещества, родственные липидам.
Методические указания предназначены для самостоятельной и аудиторной работы студентов.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать 10.03.2013. Формат 60841/16. Бумага газетная.
Печать офсетная. Усл. п. л. 0,5. Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2013
2
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКИХ КОНСТАНТ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИНОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРИРОДНОГО МАТЕРИАЛА
Цель работы:
определить у исследуемых образцов масла или жира числа: кислотное, омыления, эфирное, йодное;
рассчитать по эфирному числу выход глицерина при омылении и содержание
триацилглицеринов.
1. Краткие сведения из теории
В широком смысле липидами называют практически нерастворимые в воде
компоненты клетки, которые могут быть экстрагированы из нее органическими
неполярными растворителями.
Липиды, которые легко извлекаются из растительного сырья неполярными
растворителями, называются свободными.
В растениях липиды накапливаются главным образом в клетках запасающих
тканей семян и плодов. В цитоплазме клеток зародыша и эндосперма масличных
растений липиды находятся в виде шарообразных гранул, так называемых липидных капель, или липидных сферосом, разделенных между собой тонкими оболочками, в которые встроены белки – ферменты класса гидролаз, а также ферменты, осуществляющие биосинтез триацилглицеринов. Липидные сферосомы имеют сферическую или сплющенную форму диаметром 0,4–3,0 мкм и полностью
заполняют весь свободный объем клетки. В неповрежденной клетке они не сливаются друг с другом (рис. 1).
Липидные капли
(сферосомы)
Рис. 1. Электронная фотография (х7500) отложений запасных триацилглицеринов
в виде сферосом в клетках семян
Содержание липидов в семенах и плодах зависит от ряда факторов, в первую
очередь от сортовых особенностей и условий выращивания, так, в семянке подсолнечника содержание липидов составляет 33-57%, в зародыше кукурузы – 1850%, в какао-бобах – 49-57%, в семенах сои – 14-25%.
У животных жиры локализованы в основном в так называемой жировой ткани, являющейся разновидностью рыхлой соединительной. В состав клеток жировой ткани входят обычные для всех клеток структурные компоненты, но их цен3
тральная часть заполнена жировой каплей, а цитоплазма и ядро оттеснены к периферии (рис. 2). Жиры составляют до 98 % массы жировой ткани. Именно эту
ткань применяют как сырье для пищевых продуктов и для получения топленых
жиров пищевого и технического назначения.
Ядро
Волоконца
межклеточного
вещества
Жировая клетка
Жировая капля
Цитоплазма
Рис. 2. Строение жировой ткани
До настоящего времени отсутствует строгая химическая классификация липидов, что связано с большим разнообразием структурных компонентов и многовариантностью их связей с основной тканью. По взаимодействию с щелочами липиды подразделяются на две группы – омыляемые и неомыляемые. Омыляемые
липиды при взаимодействии с щелочами гидролизуются с образованием жирных
кислот и образуют соли высших жирных кислот – мыла. Неомыляемые липиды не
содержат жирнокислотных остатков. Это стеролы, каротиноиды, хлорофиллы,
жирорастворимые витамины, другие изопреноидные соединения. В связи с чем, в
биохимии используют более узкую формулировку липидов. Липидами называют
группу веществ органического происхождения различного химического строения,
прямо или опосредованно связанных с монокарбоновыми (жирными) кислотами.
Все другие соединения, извлекаемые неполярными растворителями из клеток,
принято называть веществами, родственными липидам.
В зависимости от химического строения липиды подразделяются на простые
и сложные.
К простым липидам относят триацилглицерины (сложные эфиры жирных
кислот и глицерина) и воски (сложные эфиры монокарбоновых кислот и высокомолекулярных спиртов).
Сложные липиды, помимо спирта и монокарбоновых кислот, содержат и другие составные части: фрагменты фосфорной кислоты, углеводы.
Триацилглицерины часто называют маслами и жирами. Термины «жиры» и
«масла» используются как равнозначные. Выбор термина обычно основан на физическом состоянии триацилглицеринов при комнатной температуре и определяется традицией. Обычно жиры при комнатной температуре находятся в твердом
состоянии, а масла – в жидком. Причем триацилглицерины, которые извлекаются
из растительного сырья, традиционно называют маслами. В большинстве случаев
растительные масла имеют жидкую консистенцию при комнатной температуре,
например подсолнечное, соевое, кукурузное масла, но встречаются и твердые
4
масла, например пальмоядровое, кокосовое. Триацилглицерины, извлекаемые из
источников животного происхождения и гидробионтов, принято называть жирами, хотя, например, при комнатной температуре рыбий жир является жидким.
Физико-химические свойства триацилглицеринов определяются составом
жирных кислот и их распределением в триацилглицеринах.
Жирные кислоты могут различаться по трем параметрам: длине углеводородной цепи, количеством и положением двойных связей, положением в молекуле триацилглицерина. Изменения в этих характеристиках приводят к различию в
свойствах. Всего в триацилглицеринах обнаружено свыше 400 карбоновых кислот
различного строения. Наиболее распространенными являются кислоты с четным
числом атомов углерода, чаще от 12 до 18, табл. 1, которые и называют жирными. Жирные кислоты подразделяются на насыщенные и ненасыщенные. Из
насыщенных жирных кислот наиболее часто встречаются пальмитиновая, миристиновая и стеариновая. Эти три насыщенные кислоты относят к категории главных жирных кислот, причем пальмитиновая кислота является первичным продуктом, образующимся в клетке под действием синтазы жирных кислот. Она присутствует во всех жирах и маслах, ее содержание составляет 15-30% от общего количества жирных кислот. Другие насыщенные и мононенасыщенные кислоты синтезируются на основе пальмитиновой.
Непредельные жирные кислоты в природных маслах и жирах находятся
только в цис-конформации. Это обусловливает жесткий изгиб углеродной цепи
под углом около 300. Еще более короткая цепь формируется за счет изгибов у
кислот, имеющих две или три двойные связи, что имеет существенное значение
при функционировании биомембран клетки. Среди непредельных наиболее распространенной является олеиновая кислота. Она присутствует во всех исследованных маслах и жирах и в большинстве случаев в количестве не менее 30% от
общей массы кислот. Например, в оливковом масле ее не менее 80%. Линолевая и
пальмитоолеиновая кислоты также очень широко распространены, но встречаются в значительно меньших количествах. В целом в составе растительных масел
высока доля (до 90%) ненасыщенных кислот. Так, подсолнечное масло содержит
примерно 55-65% линолевой кислоты, 33-36% олеиновой и 5-10% пальмитиновой
и стеариновой кислот. Льняное масло состоит из -линоленовой (45-55%), линолевой (22-30%), олеиновой (15-25%) кислот. Кроме того, оно содержит 6-10%
пальмитиновой кислоты. Такие полиненасыщенные жирные кислоты как линолевая (две двойные связи), -линоленовая (три двойные связи) и арахидоновая (четыре двойные связи) относятся к так называемым эссенциальным (незаменимым),
так как не синтезируются в организме высших животных и человека и должны
поступать извне с пищей. Потребность организма человека в полиненасыщенных
жирных кислотах составляет 16-24 г/сут.
Большинство природных масел и жиров представляет собой сложную смесь
триацилглицеринов. Триацилглицерины с тремя одинаковыми жирными кислотами называются монокислотными, или простыми. Триацилглицерины, содержащие
более чем один вид жирных кислот, называются смешанными, или разнокислотными.
5
Таблица 1. Основные карбоновые кислоты, входящие в состав
природных жиров и масел
Тривиальное название кислоты
Насыщенные кислоты
Масляная
Капроновая
Каприловая
Каприновая
Лауриновая
Миристиновая
Пальмитиновая
Стеариновая
Арахиновая
Бегеновая
Лигноцериновая
Церотиновая
Ненасыщенные кислоты
Пальмитоолеиновая
Олеиновая
Эруковая
Лилолевая
-Линоленовая
Арахидоновая
Систематическое название
(общее число атомов углерода : число двойных связей)
Бутановая (4:0)
Гексановая (6:0)
Октановая (8:0)
Декановая (10:0)
Додекановая (12:0)
Тетрадекановая (14:0)
Гексадекановая (16:0)
Октадекановая (18:0)
Эйкозановая (20:0)
Доэйкозановая (22:0)
Тетраэйкозановая (24:0)
Гексаэйкозановая (26:0)
цис-Гексадецен-9-овая (16:1)
цис-Октадецен-9-овая (18:1)
цис-Доэйкозен-13-овая (22:1)
цис-цис-Октадекадиен-9,12овая (18:2)
цис-цис-цис-Октадекатриен9,12,15-овая (18:3)
цис-цис-цис-цис-Эйкозатетраен-5,8,11,14-овая (20:4)
При обозначении триацилглицеринов принято, что первый атом углерода
глицерина находится на верху углеродной цепи и обозначается sn-1, насыщенные
жирные кислоты располагаются преимущественно в положениях sn-1 и sn-3, а
ненасыщенные в положении sn-2.
Триацилглицерины с преобладанием ненасыщенных или низкомолекулярных
кислотных фрагментов характеризуются более низкой температурой плавления,
чем жиры, в состав которых входят насыщенные высокомолекулярные кислоты.
Например, 1-олео-2,3-дипальмитин имеет температуру плавления 34 0С, 1,2-олео3-пальмитин – 19 0С, триолеин плавится при температуре 5 0С.
Для характеристики жиров и масел служат так называемые числа жира, которые дают представление об их жирнокислотном составе и служат в какой-то степени показателями качества.
Кислотным числом называют количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, находящихся в 1 г жира
или масла. Содержание свободных жирных кислот в свежих образцах очень невысокое, на уровне следовых количеств.
6
Свободные жирные кислоты накапливаются в жирах и маслах в результате
ферментативного гидролиза под действием липаз:
CH2OCOR1
CHOCOR2
CH2OCOR3
CH2OH
липаза
+ 3 H2O
CHOH
+ R1COOH + R2COOH + R3COOH
CH2OH
Процесс гидролиза осуществляется последовательно. Сначала образуются
диацилглицерины и свободная жирная кислота, затем – моноацилглицерины и,
наконец, глицерин. При этом скорость отщепления жирнокислотного остатка от
триацилглицеринов существенно выше, чем от ди- и моноацилглицеринов. Хотя
большая часть известных липаз не обладает специфичностью относительно
остатка жирной кислоты, имеются существенные различия в скорости гидролиза.
Например, установлено, что липазы гидролизуют активнее сложноэфирные связи
с высокомолекулярными жирными кислотами.
Липазы классифицируют на две группы в соответствии с их позиционной
специфичностью. Липазы первой группы не обладают позиционной специфичностью и гидролизуют сложноэфирные связи во всех трех положениях глицерина.
Диацилглицерины и моноацилглицерины являются промежуточными продуктами
реакции. Вторая группа липаз – позиционно специфичные. Основными продуктами липолиза являются 2-моноацилглицерины и свободные жирные кислоты.
Гидролитическое расщепление липидов является одной из причин ухудшения их качества, в конечном итоге – порчи. Особую роль липолиз играет в случае
молочных продуктов. Это связано с тем, что молочный жир в отличие от жиров и
масел животного и растительного происхождения содержит большое количество
низкомолекулярных монокарбоновых кислот. Содержание кислот от масляной до
лауриновой может достигать до 21%, причем масляная кислота неограниченно, а
капроновая ограниченно растворимы в воде. Именно летучие водорастворимые
монокарбоновые кислоты, входящие в состав молочного жира, и определяют его
органолептические свойства, а также уникальные потребительские свойства сыров и сливочных масел. Однако предельно допустимая концентрация низших
свободных жирных кислот составляет всего 0,009 мг кислоты в 1 кг жира. Любое
превышение этой концентрации ведет к отрицательному влиянию на качество
жира, обусловливая формирование неприятного прогорклого вкуса и запаха.
Гидролитическое расщепление животных жиров и растительных масел, в состав которых не входят низкомолекулярные жирные кислоты, не приводит к образованию продуктов со специфическим неприятным вкусом и запахом, так как
высвобождающиеся высокомолекулярные кислоты (с числом атомов углерода
более 14) не имеют вкуса и запаха. Их отрицательное влияние на качество жира
определяется образованием продуктов окисления (кетонов, альдегидов и др.) свободных жирных кислот, особенно ненасыщенных.
Кислотное число является, таким образом, характеристикой степени гидролитического расщепления триацилглицеринов во времени и показателем степени
7
свежести продукта. Для большинства растительных масел (подсолнечного, оливкового, кукурузного, льняного) в норме кислотное число имеет значение 1,5 – 2.
Замедление гидролитических процессов, особенно у животных жиров, достигается охлаждением жира-сырца и переработкой его в топленый жир. Для топленых жиров ферментативный гидролиз не характерен, так как при нагревании липазы инактивируются. Следует учитывать, что гидролиз будет подавлен и в том
случае, когда в жиросодержащих системах будет отсутствовать вода как необходимый фактор любого гидролитического процесса.
Йодное число характеризует количество ненасыщенных жирных кислот в составе триацилглицеринов. Оно определяется количеством йода в граммах, которое присоединяется к 100 г непредельного органического вещества. Это один из
важнейших показателей по двум причинам. Во-первых, йодное число может служить показателем консистенции жиров и масел. Чем больше содержание ненасыщенных кислот, тем ниже температура плавления. Во-вторых, высокое содержание непредельных кислот всегда связано с перекисным окислением, в результате
чего в жирах и маслах увеличивается количество перекисей, альдегидов и других
продуктов окислительного распада. Уменьшение йодного числа, например, при
хранении жиров и масел, всегда является показателем их порчи.
Определение йодного числа основано на реакции присоединения галогенов
или их производных по месту двойной связи. Одним из простых и быстрых методов определения йодного числа является способ, основанный на способности
йода реагировать с водой c образованием йодноватистой кислоты по уравнению
I2 + H2O = HI + HOI
Реакция при обычных способах ее проведения в прямом направлении не
идет. Но в присутствии ненасыщенных соединений, которые чрезвычайно реакционноспособны по отношению к йодноватистой кислоте, происходит постоянное удаление HOI из зоны реакции за счет ее присоединения по двойной связи, в
результате чего становится термодинамически возможным протекание реакции в
прямом направлении до тех пор, пока в системе присутствует ненасыщенное соединение:
CH2OCO
(CH2)7
CH
CH
(CH2)7
CH3
CHOCOR2
CH2OCOR3
+ HOI
CH2OCO
(CH2)7
CHI
CH(OH)
(CH2)7
CH3
CHOCOR2
CH2OCOR3
Для твердых животных жиров йодное число имеет значения 35–85, для растительных масел – 100–200, например, для подсолнечного масла йодное число в
норме равно 119–145; молочного жира 28–45; свиного жира 41–66.
Определение числа омыления основано на нейтрализации раствором едкого
кали всех жирных кислот, находящихся в исследуемом образце жира после его
полного гидролиза, а также свободных жирных кислот.
8
Число омыления показывает количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации жирных кислот, как свободных, так и входящих в
состав триацилглицеринов, содержащихся в 1 г жира.
Для растительных масел число омыления составляет 170–270, для животных
жиров 170–200, например, для сливочного масла число омыления в норме 220–
234; для подсолнечного масла 186–194; для кокосового 251– 264.
Эфирное число определяется количеством миллиграммов гидроксида калия,
которое необходимо для омыления триацилглицеринов, содержащихся в 1 г жира
или масла. Таким образом, если число омыления показывает расход гидроксида
калия на нейтрализацию свободных жирных кислот и омыление триацилглицеринов, а кислотное – на нейтрализацию только свободных жирных кислот, то эфирное определяют расчетным методом по разности между числом омыления и кислотным числом. Эфирное число не является постоянной величиной и зависит от
кислотного числа.
2. Экспериментальная часть
Исследуемый материал: растительное масло или жир.
2.1. Определение кислотного числа
Реактивы: 0,1М спиртовой раствор КОН, нейтральная смесь этанола и диэтилового эфира, 1%-й спиртовой раствор фенолфталеина.
Оборудование и посуда: конические колбы емкостью 150 – 200 мл, бюретка,
мерный цилиндр, мерная пипетка.
Порядок выполнения работы
Перед титрованием готовят 50 мл нейтральной смеси, для чего смешивают
33 мл диэтилового эфира и 17 мл этилового спирта, смесь нейтрализуют 0,1М
спиртовым раствором КОН в присутствии 5 капель фенолфталеина до едва заметного изменения окраски смеси.
В коническую колбу помещают 5 г исследуемого масла или жира (в случае
анализа жидких масел необходимое количество добавляют пипеткой, используя
для пересчета массы в объем данные табл. 2).
К навеске исследуемого масла или жира приливают 50 мл нейтральной смеси
и перемешивают. Полученный раствор быстро оттитровывают 0,1М раствором
КОН до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 0,5–1 мин.
Таблица 2. Плотности растительных масел
Наименование масла
Подсолнечное
Соевое
Оливковое
Хлопковое
Кукурузное
Рапсовое
Плотность, г/см3 (15 0С)
0,920 – 0,927
0,922 – 0,934
0,914 – 0,919
0,918 – 0,932
0,924 – 0,926
0,911 – 0,918
9
Расчет кислотного числа
В 1000 мл 0,1М спиртового раствора КОН содержится (0,156,1) г КОН, где
56,1 – молекулярная масса КОН; V мл раствора КОН, пошедшего на титрование
навески жира массой m, содержит КОН в количестве, равном
х
V  0,1  56,1
 5,61V , мг .
1000
Для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира, потребуется количество КОН в мг, которое и определяет кислотное число:
5,61V
ЧК 
.
m
Если молярность титранта отличается от 0,1, то в расчетную формулу вводится поправочный коэффициент Т:
5,61VT
ЧК 
.
m
2.2. Определение числа омыления
Реактивы: 0,5М раствор HCl, 0,5М спиртовой раствор КОН, 1%-й спиртовой
раствор фенолфталеина.
Оборудование и посуда: конические колбы емкостью 250 мл, бюретки, мерная пипетка, обратный холодильник, круглодонная колба емкостью 50–100 мл,
электрическая плитка.
Порядок выполнения работы
В круглодонную колбу помещают 2 г (для жидких масел соответствующий
объем, табл. 2) анализируемого жира или масла и приливают из бюретки 25 мл
0,5М спиртового раствора КОН. Колбу соединяют с обратным холодильником и
смесь кипятят в течение 30 минут. По окончании гидролиза (мыльный раствор
должен быть прозрачным) содержимое колбы количественно переносят в коническую колбу и в теплом виде титруют 0,5М раствором соляной кислоты в присутствии 10 капель 1%-го раствора фенолфталеина (титрование можно проводить
непосредственно в круглодонной колбе).
Параллельно проводится контрольный опыт с таким же количеством едкого
кали, но без навески жира (масла).
Расчет числа омыления
В 1000 мл 0,5 М раствора соляной кислоты содержится (0,536,5) г HCl, а в
объеме V (мл), пошедшем на нейтрализацию КОН, оставшегося после омыления
навески жира массой m, содержится HCl в количестве
V 0,5  36,5
х
 18,25V , мг.
1000
В соответствии со стехиометрией реакции 36,5 г соляной кислоты нейтрализует 56,1г едкого кали, а (18,25V) мг HCl будет взаимодействовать с количеством
КОН, равным
18,25V 56,1
y
 28,05V , мг.
36,5
10
Число омыления определяют по разности результатов титрования контрольного и исследуемого образца, содержащего m (г) жира в расчете на 1 г жира (масла):
28,05(VК  V )
ЧО 
,
m
где V – объем 0,5М раствора соляной кислоты, пошедший на титрование исследуемого образца, мл;
VК – объем 0,5 М раствора соляной кислоты, пошедший на титрование контрольной пробы.
Если молярность титранта отличается от 0,5, то в расчетную формулу вводится поправочный коэффициент Т:
28,05(VК  V )Т
ЧО 
.
m
Исходя из реакции исчерпывающего омыления, можно найти среднюю молекулярную массу триацилглицеринов:
3М КОН1000
.
МТАГ 
ЧО
2.3. Определение эфирного числа
Эфирное число рассчитывают, как разность числа омыления и кислотного:
ЧЭ = ЧО - ЧК.
На основании эфирного числа определяют выход глицерина Х в процентах
при омылении:
М гл Ч Э
Х
100 ,
3М КОН1000
где Мгл - молекулярная масса глицерина.
По эфирному числу определяют содержание триацилглицеринов ТЖ в процентах:
М ТАГЧ Э
ТЖ 
100 ,
3М КОН1000
где МТАГ – средняя молекулярная масса триацилглицеринов, определяемая по
числу омыления.
2.4. Определение йодного числа
Реактивы: 0,1М раствор тиосульфата натрия, 0,2М спиртовой раствор йода
(25 г йода в 1000 мл 96%-го этанола) , 1%-й раствор крахмала.
Оборудование и посуда: конические колбы емкостью 500 мл с пришлифованной пробкой, бюретки, мерные пипетки, мерные цилиндры.
Порядок выполнения работы
В коническую колбу с пришлифованной пробкой помещают 0,3 г (для жидких масел соответствующий объем, табл. 2) анализируемого жира или масла и
растворяют пробу в 15 мл этанола (в случае плохой растворимости смесь подогревают при встряхивании на водяной бане при температуре 50–60 0С).
11
К раствору добавляют 20 мл 0,2 М спиртового раствора йода и 200 мл дистиллированной воды, подогретой до 25–30 0С. Колбу закрывают пробкой, энергично встряхивают и оставляют в покое на 5 мин (появление жира в виде тонкой
эмульсии не отражается на точности результатов).
После чего непрореагировавший йод оттитровывают 0,1М раствором тиосульфата натрия до слабо-желтого окрашивания, затем добавляют 5–10 капель
крахмала и титруют до обесцвечивания.
Параллельно в таких же условиях проводят контрольный опыт: в коническую
колбу помещают 15 мл этанола, 20 мл 0,2М спиртового раствора йода и 200 мл
дистиллированной воды, подогретой до 25–30 0С, смесь закрывают пробкой, перемешивают и спустя 5 мин титруют тиосульфатом натрия.
Расчет йодного числа
В 1000 мл 0,1М раствора тиосульфата натрия содержится (0,1156) г Na2S2O3,
а в объеме V (мл), пошедшем на титрование непрореагировавшего йода в исследуемой пробе, количество тиосульфата в граммах равно
V 0,1  156
х
 0,0156V , г.
1000
В соответствии с уравнением
I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6
312 г (2 г-моля) тиосульфата натрия прореагируют с 253,8 г (1 г-моль) йода, а
0,0156V г Na2S2O3 будет взаимодействовать с количеством йода, равным
0,0156V 253,8
y
 0,01269V , г.
312
Йодное число определяют по разности результатов титрования контрольного
и исследуемого образца, содержащего m (г) жира (масла) в расчете на 100 г жира
(масла):
0,01269(VК  V )100
ЧИ 
,
m
где VК – объем 0,1М раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование в
контрольном опыте, мл;
V – объем 0,1М раствора тиосульфата натрия, пошедший на титрование анализируемой пробы, мл.
Если молярность титранта отличается от 0,1, то в расчетную формулу вводится поправочный коэффициент Т:
0,01269(VК  V )Т100
ЧИ 
.
m
12
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХОЛЕСТЕРИНА
И ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ
Цель работы:
получить хлороформенную вытяжку холестерина из сухого яичного желтка и доказать наличие в нем холестерина;
провести качественную реакцию обнаружения желчных кислот в биологической
жидкости.
1. Краткие сведения из теории
К соединениям, родственным липидам, относят холестерин и желчные кислоты. Холестерин и желчные кислоты принадлежат к классу стероидов – производных циклопентанпергидрофенантрена, метилированного в 10-м и 13-м положениях. Все они имеют в положении C3 гидроксильную группу и отличаются
только содержанием атомов углерода в боковой цепи:
в боковую цепь
CH3
20
18
12
CH3
11
13
14
19
2
3
1
10
9
5
4
17
16
15
8
7
6
OH
Холестерин – это ненасыщенный спирт, обнаруженный в тканях человека и
всех животных как в свободном состоянии, так и в виде сложных эфиров – стеридов:
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
O
холестерин
O
C
(CH2)14
CH3
сложный эфир холестерина и
пальмитиновой кислоты - холестерид
Важнейшее биологическое значение холестерина заключается в том, что он
является обязательным компонентом мембран всех клеток, служит предшественником при биосинтезе стероидных гормонов, витамина D3 и желчных кислот.
Вместе с тем, в настоящее время считается, что он способствует отвердению
стенок артерий и вызывает нарушение кровообращения, атеросклероз и ишемическую болезнь сердца.
13
В организме человека нет ферментов, разрушающих стерановое кольцо. Выведение холестерина осуществляется, как правило, в форме желчных кислот. Известны 4 желчные кислоты. Из них две – холевая и хенодезоксихолевая – первичные, синтезируются в печени из продуктов распада холестерина:
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
COOH
COOH
CH3
H
HO
CH3
H
H
H
H
OH
HO
OH
H
H
холевая кислота
H
хенодезоксихолевая кислота
Две другие – дезоксихолевая и литохолевая – вторичные, образуются из первичных желчных кислот под действием ферментов микрофлоры кишечника:
CH3
OH
CH3
CH3
CH3
COOH
CH3
H
HO
COOH
H
CH3
H
H
H
HO
H
дезоксихолевая кислота
H
H
литохолевая кислота
Желчные кислоты присутствуют в желчи в виде натриевых солей Nацилпроизводных глицина (RCO-NH-CH2-COONa) и таурина (RCO-NH-CH2-CH2SO3Na), например:
CH3
OH
CH3
C
CH3
H
HO
H
H
NH
O
CH2
COONa
H
OH
Амидные соли желчных кислот являются поверхностно-активными веществами (ПАВ), способными в водной среде переводить липиды в дисперсные системы – эмульсии, тем самым облегчая их проникновение через стенки кишечника в кровь (рис.1).
14
водная среда
желчная кислота (ПАВ)
.
липидная
фаза
неполярный
фрагмент
полярная часть
Рис. 1. Диспергирование (эмульгирование) липидов под действием желчных кислот
При диспергировании липидной фазы образуется большое число мельчайших
капелек, каждая из которых стабилизирована адсорбционным слоем желчных
кислот. Формирование защитного слоя ПАВ происходит таким образом, что полярный фрагмент желчной кислоты обращен в водную среду, неполярная часть
находится в неполярной липидной фазе (рис.1).
Желчные кислоты способны также самопроизвольно агрегатироваться в более крупные образования, называемые мицеллами, ядро которых представляет
собой жидкую липофильную фазу (рис. 2, а).
липофильное ядро
мицеллы
- солюбилизат
- желчная
кислота
а
б
Рис. 2. Условное обозначение: а – мицеллы в водной среде;
б – мицеллы с включенным в мицеллярное ядро
солюбилизатом
В мицеллярном состоянии желчные кислоты способствуют солюбилизации,
т.е. повышению растворимости мало- и практически нерастворимых в водной
среде веществ. Механизм солюбилизации сводится к проникновению жирорастворимых веществ в липофильное ядро мицеллы (рис. 2, б) и растворению в нем.
Вещество, которое внедряется в мицеллу, называется солюбилизатом. Процесс
солюбилизации облегчает всасывание в кровь в виде мицелл моно-, ди-, триацилглицеринов, свободных высших жирных кислот, жирорастворимых витаминов, а также вывод из организма холестерина и других водонерастворимых веществ.
Все цветные реакции на холестерин – реакции Шиффа, Сальковского и Либермана - Бухардта – сходны друг с другом по природе химических превращений.
Под влиянием концентрированной серной кислоты и уксусного ангидрида 2 молекулы холестерина превращаются в бихолестадиены С54Н86 и С54Н88, которые с
серной кислотой образуют диеновые кислоты: с одной молекулой H2SO4 – крас15
ного цвета (RSO3H, R=C54H85 или R=C54H87), двумя молекулами H2SO4 – зеленого цвета (С54Н84(SO3H)2 или С54Н86(SO3H)2):
H3C
CH3
CH3
2
H2SO4
CH3
CH3
-2 H2O
HO
H3C
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
H2SO4
C54H85SO3H
продукт реакции Сальковского
2 C27H45OH
H2SO4
-2 H2O
HO3S
H2SO4
-2H2O
C54H86
C27H42 C27H42 SO3H
продукт реакции
Либермана - Бухардта
Обнаружение желчных кислот основано на их способности к образованию
цветных продуктов конденсации с гидроксиметилфурфуролом. В качестве предполагаемой можно привести следующую структуру продукта конденсации:
COOH
CH3
CH3
OH
CH3
HO
CH3
COOH
H
H
HO
CH3
CH3
O
HC
CH
H
H
H
OH
H
HO
H
OH
H
2. Экспериментальная часть
Исследуемый материал: яичный желток; биологическая жидкость.
Реактивы: хлороформ, концентрированная серная кислота, уксусный ангидрид, 5%-й раствор сахарозы.
Оборудование: фарфоровая ступка с пестиком, коническая колба, пробирки,
пипетки, воронка, бумажный фильтр.
16
Порядок выполнения работы
2.1. Обнаружение холестерина в яичном желтке
В фарфоровой ступке тщательно растирают высушенный яичный желток
( половина желтка) и экстрагируют хлороформом холестерин, для чего к растертому и перенесенному в коническую колбу желтку добавляют 10 мл хлороформа и
перемешивают вращательными движениями в течение 15 минут. Смесь фильтруют. Фильтрат представляет собой хлороформенный раствор холестерина.
Реакция Шиффа. К 1 мл хлороформенного раствора холестерина осторожно
по стенке подслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты, не перемешивая.
Через 10-15 минут на границе двух жидких фаз формируется кольцо красного цвета.
Реакция Сальковского. Пробирку со сформировавшимся кольцом красного
цвета (на границе хлороформенный раствор холестерина – H2SO4) осторожно
встряхивают, перемешивая содержимое. Образуется два ярко окрашенных слоя:
насыщенно-красный и желто-оранжевый.
Реакция Либермана - Бухардта. К 1 мл хлороформенного раствора холестерина добавляют 0,3 мл (10 капель) уксусного ангидрида, затем 2 капли концентрированной серной кислоты. Содержимое осторожно перемешивают, появляется зеленое окрашивание.
2.2. Обнаружение желчных кислот (реакция Петтенкофера) в биологической жидкости
В пробирке № 1 смешивают 5 мл биологической жидкости и 0,2 мл 5%-го
раствора сахарозы. Содержимое осторожно, не допуская перемешивания, подслаивают к 0,5 мл концентрированной серной кислоты, налитой предварительно в
сухую пробирку№ 2. Вторую пробирку оставляют в покое на 5-7 минут. По истечении этого времени на границе двух жидких фаз формируется красно-фиолетовое
кольцо.
3. ВЫВОДЫ
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Соколова, Т.Н. Введение в биохимию. Ч.1: учеб. пособие / Т.Н. Соколова,
В.Р. Карташов/ Нижегород. гос. техн. ун-т; Н. Новгород, 2002. – 281 с.
2. Соколова, Т.Н. Введение в биохимию. Ч.2: учеб. пособие / Т.Н. Соколова,
В.Р. Карташов, О.В. Кузина / Нижегород. гос. техн. ун-т; Н. Новгород, 2003. – 173
с.
3. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. – М.: Мир, 1985. Т. 1-3.
4. Кнорре, Д. Г. Биологическая химия/ Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. – М.:
Высшая школа, 2000. – 279 с.
5. Комов, В.П. Биохимия / В.П. Комов, В.Н. Шведова. – М.: Дрофа, 2004. –
640 с.
6. Щербаков, В.Г. Биохимия/ В.Г. Щербаков [и др.]. – СПб.: ГИОРД, 2003. –
440 с.
7. Брайен, Р.О. Жиры и масла. Производство, состав и свойства, применение / Р.О. Брайен. – СПб.: Профессия, 2007. – 752 с.
17
18
19