Е Кс п Е ри м Е н та л...

Е Кс п е р и м е н т а л ь н і р о б о т и
УДК 577.152.3
фосфорилирование чувствительной к гамк а-Эргическим
лигандам cl-, нсо3--стимулируемой mg2+-атр-азы
плазматических мембран мозга карпа сyprinus carpio L.
С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА
Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва, Россия;
e-mail: menzikov@lansp.ru
Исследовано фосфорилирование Cl-, НСО3 --стимулируемой Mg2+-АТР-азы плазматических мембран мозга рыб с помощью [g-32Р]АТР в присутствии Mg2+. Установлено, что образование фосфопротеи­
на при температуре 0–1 °С зависит от времени инкубации и концентрации Mg2+ в среде инкубации.
Гидроксиламин (50 мМ) и рН 10 практически полностью ингибируют образование фосфорилированного
интермедиата. Ионы Cl (10 мМ)+НСО3 (2 мМ), а также ГАМК (1–100 мкМ) дефосфорилируют
АТР-азу. В присутствии бикукуллина дефосфорилирующий эффект ГАМК на мембранный препарат не
проявляется. о-Ванадат (10 мкМ) устраняет дефосфорилирующее действие анионов и ГАМК на фосфопротеин. Методом Ds-Na-ПААГ-электрофореза и авторадиографии установлено, что исследуемое
фосфорилирование и ГАМК А-индуцируемое дефосфорилирование осуществляет белок с молекулярной
массой ~ 56 кДа, представляющей собой субъединицу, входящую в олигомерный состав чувствительной
к ГАМК А-эргическим лигандам Cl-, НСО3 --АТР-азы мозга рыб. Полученные данные демонстрируют,
что Cl-, НСО3 -- АТР-аза мозга рыб может напрямую фосфорилироваться АТР в присутствии Mg2+ и
образовывать фосфорилированный интермедиат.
К л ю ч е в ы е с л о в а: рыбы; мозг; Cl-, НСО3 --АТР-аза; ГАМК; бикукуллин; фосфорилирование;
авторадиография.
В
плазматических мембранах мозга рыб
выявлена чувствительная к ГАМК А-эргическим лигандам Cl-, НСО3--стимулируемая Mg2+-АТР-аза (Cl-, НСО3-АТР-аза),
состоящая из активной “базальной” Mg2+-АТРазы, которая может активироваться одновременно Cl- и НСО3- [1,2]. Высокая чувствительность Cl-, НСО3- -АТР-азы к специфическим
лигандам ГАМК А-рецепторов указывает на
ее функциональную сопряженность с рецепторами торможения. В частности, активность
этого фермента регулируется активаторами (ГАМК, пентобарбиталом, диазепамом) и
блокаторами (пикротоксином, бику­куллином)
ГАМК А-бензодиазепинового Cl-‑ка­нала,что про­
является в активировании или ингибировании активности “базальной” Mg2+-АТР-азы и
ее стимуляции анионами [2–4]. Определение
молекулярной массы субъединичного состава Cl-, НСО3- -АТР-азы из мозга рыб показало ее сходство с молекулярными свойствами
ГАМК А­-ре­цепторов из мозга этих животных
[5]. Такие данные предполагают структурную
сопряженность исследуемого фермента с рецепторами торможения и близкое располоISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
жение его АТР-гидролизующих мест и мест
связывания ГАМК А-эргических лигандов на
молекуле белка. Механизм функционирования
Cl-, НСО3- -АТР-азы в нейрональной мембране
и природа ее регуляции ГАМК А-эргическими лигандами остаются неясными. Ранее мы
предположили, что фермент может подвергаться фосфорилированию–дефосфорилированию в процессе каталитического цикла [6].
В пользу такого предположения указывают
данные об ингибировании Cl-, НСО3- -АТР-азы
SH-реагентами, о‑ванадатом и олигомицином
[7]. Известно, что высокой чувствительностью
к этим лигандам обладают транспортные АТРазы Р-типа (или типа Е1–Е2), для функционирования которых необходимо присутствие
каталитической субъединицы, участвующей в
многоэтапном гидролизе АТР и образующей
в этом процессе фосфорилированные интермедиаты с различными свойствами [8,9]. В
связи с этим представляет интерес выяснение
способности исследуемого фермента, подобно
транспортным АТР-азам Р-типа, напрямую
фосфорилироваться АТР и образовывать в ходе
ее гидролиза фосфорилированный интермедиат­.
63
Експериментальні роботи
Целью данной работы явилось исследование с
помощью [g-32Р]АТР фосфорилирования мем­
браносвязанной Cl-, НСО3- -АТР-азы мозга
рыб и влияние на образование фосфопротеи­
на анио­нов, ГАМК А-эргических лигандов и
блокаторов фосфорилирования транспортных
АТР-аз Р-типа – о-ванадата, гидроксиламина и щелочного рН.
Материалы и методы
Исследования проводили на мозге карпа
Cyprinus carpio. После декапитации рыб мозг
быстро извлекали и гомогенизировали при 4 °С
в 10 мМ буфере Hepes-Tris (рН 7,0) в соотношении 1 : 8. Фракцию плазматических мембран,
содержащих Cl-, НСО3- -АТР-азу, получали по
ранее описанному методу [5], замораживали
при –20 °С и использовали в течение 30 дней.
Фосфорилирование фермента. Преинкубирование мембранных препаратов проводили
с добавлением 10 мкМ о-ванадата, 5–75 мМ
NaCl, 1–15 мМ NaНСО3, 1–100 мкМ ГАМК, 25
мкМ бикукуллина, 50 мМ гидроксиламина в
течение 15 мин при температуре 0–1 °С в инкубационной среде, содержащей 25 мМ HepesTris (рН 7,0), 3 мМ MgSO4 и 10–20 мкг белка. Объем пробы составлял 30 мкл. Процесс
фосфорилирования мембранного препарата
проводили по схеме, описанной в литературе
[8,10]. Реакцию начинали добавлением в среду
инкубации 70 мкМ [g-32Р]АТР (удельная радиоактивность 10 -6 распад/мин/нмоль) и инкубировали 2 мин при 0–1 °С. Для определения
уровня включения фосфата в белковый препарат из инкубационной среды отбирали аликвоты по 5 мкл и наносили их на хроматографическую бумагу Whatman 3 MM (15 × 15 мм).
Белки фиксировали на бумаге в течение 20 мин
в 10%-м растворе ТХУ, содержащем 10 мМ
Na2P2О7 и 10 мМ NaH2РО4. Образцы отмывали
от свободной метки в растворе того же состава
четыре раза по 20 мин при постоянном перемешивании. Отмытые фильтры высушивали,
помещали в стеклянные флаконы, содержащие
по 5 мл толуольной сцинтилляционной жидкости ЖС-106, и просчитывали в фосфорном
канале жидкостного сцинтилляционного счетчика “Delta” (CША). Образование фосфопротеина рассчитывали как разность включения
32
Р в мембранный препарат после инкубации
с [g-32Р]АТР при отсутствии и в присутствии
Mg2+ и выражали в пмоль 32Р на 1 мг белка.
Ds-Na-ПААГ-электрофорез. После проведения фосфорилирования для остановки реакции к белковым препаратам добавляли равные
объемы буфера, содержащего 0,01 М натрийфосфат (рН 7,0), 2%-й Ds-Na, 2%-й 2‑меркап64
тоэтанол, 10%-ю cахарозу, и инкубировали в
течение 2 ч при 37 °С. Электрофорез проводили в 12%-м Ds-Na-ПААГ по методу Вебера и
Осборна при силе тока 35 мА [11]. Электрофореграммы окрашивали 0,1%-м кумасси голубым.
Окрашенные и высушенные гели помещали в
авторадиографическую камеру («Sigma», США)
и экспонировали 72–96 ч при комнатной температуре. Пленку проявляли стандартным
проявителем до получения максимально конт­
растного изображения. Молекулярную массу
белков определяли общепринятым методом,
сравнивая их электрофоретическую подвижность с подвижностью стандартных маркерных белков (БСА, овальбумин, химотрипсиноген А, миоглобин и цитохром с).
Общий белок определяли методом Брэдфорд [12]. В таблице и на рисунках представлены среднеарифметические величины
активности фермента (n = 3). Достоверность
различия сравниваемых значений оценивали с
помощью t-критерия Стьюдента при р < 0,05.
В работе использовали Tris, Hepes, бикукуллин, ГАМК, Ds-Na, о-ванадат, гидроксиламин, набор маркерных белков: БСА,
овальбумин, химотрипсиноген А, мио­глобин
и цитохром с фирмы «ICN» (США), реактивы
для электрофореза («Bio-Rad», США), меркаптоэтанол, сульфат магния («Sigma», США), остальные реактивы российского производства.
Результаты и обсуждение
Известно, что прямое фосфорилирование
с помощью [g-32Р]АТР транспортных АТР-аз, в
том числе анионактивируемых Mg2+-АТР-аз,
происходит с участием катионов Mg2+ и зависит от времени инкубации фермента с субстратом [8]. Мы исследовали влияние ионов Mg2+ в
диапазоне 0,2–4,0 мМ на включение 32Р в мембранный препарат при инкубации с 25, 70 и
100 мкМ [g-32Р]АТР и показали, что в заданном
диапазоне концентраций Mg2+ образование
фосфопротеина наблюдается начиная с концентрации его 0,5 мМ, а при 2–4 мМ достигает
максимальных значений (рис. 1). Включение
32
Р в мембранный препарат регистрируется уже
в первые 20 сек, через 1,5–2,0 мин достигает
максимальной величины и выходит на плато
(рис. 2). Исходя из полученных результатов в
дальнейшем мы инкубировали образцы в течение 2 мин в присутствии в среде инкубации
3 мМ Mg2+ и 70 мкМ [g-32Р]АТР.
При исследовании влияния Cl- и НСО3на включение 32Р в мембранный препарат мы
установили, что эти ионы снижают уровень
образования фосфопротеина с максимальным
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА
150
2
100
32
Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ
3
50
1
эффектом при концентрации их 10 мМ Cl-+
+2 мМ НСО3-, а также 15 мМ Cl-+3 мМ НСО3(рис. 3). В присутствии анионов в этих концентрациях уровень включения 32Р в мембранный
препарат снижается на 82%, тогда как только
ионы Cl- (10–15 мМ) снижают уровень фосфорилирования мембранного препарата на 53%.
о-Ванадат в концентрации 10 мкМ устраняет
дефосфорилирующий эффект Cl-+НСО3- на
фосфопротеин, восстанавливая уровень фосфорилирования белка до контрольных значений, в то время как в отсутствие анионов о-ванадат практически не влияет на этот процесс
(рис. 3).
Химическую природу связывания Рi с белком мембранного препарата мы оценивали по
его чувствительности к гидроксиламину и щелочному рН. В присутствии 50 мМ гидроксил­
амина и защелачивании среды инкубации до
0
0
1
2
3
4
150
2+
[Mg ], ɦɆ
Рис.
Ɋɢɫ.
1
1
100
2
32
100
32
Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ
150
3
Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ
1. Влияние концентрации Mg2+ на образование фосфопротеина в мембранном препарате из
мозга рыб.
50
50
0
-
Cl , ɦɆ
0
0
ɇɋɈ3-, ɦɆ 0
0
50
100
150
200
250
ȼɪɟɦɹ, ɫɟɤ
Рис. 2. Влияние времени инкубации на образование фосфопротеина в мембранном препарате из
мозга рыб.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
10
2
20
4
30
6
40 50 60
8 10 12
70
14
80
16
[Ⱥɧɢɨɧɵ], ɦɆ
Рис. 3. Влияние Сl- (1) и Сl- + НСО3 - (2) на образование фосфопротеина в мембранном препарате
из мозга рыб при отсутствии и в присутствии
(3) 10 мкМ о-ванадата.
65
Експериментальні роботи
120
32
Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ, ɩɦɨɥɶ Ɋ ɧɚ 1 ɦɝ ɛɟɥɤɚ
160
80
40
1
2
0
5
7
9
11
ɪɇ
Рис. 4. Влияние рН и 50 мМ гидроксиламина на
Ris-4
образование фосфопротеина в мембранном препарате из мозга рыб.
66
140
32
32 1 мг белка
Фосфопротеин,
пмоль
Р на
Ɏɨɫɮɨɩɪɨɬɟɢɧ,
ɩɦɨɥɶ
Ɋ/ ɦɝ ɛɟɥɤɚ
рН 10 практически не наблюдается включения
Pi в мембранный препарат (рис. 4).
При исследовании влияния ГАМК А-эргических лигандов на фосфорилирование мембранного препарата установлено, что ГАМК
(1–100 мкМ) снижает уровень включения 32Р в
мембранный препарат с максимальным эффектом при концентрации в пределах 10–100 мкМ
(рис. 5). В присутствии 25 мкМ бикукуллина
эффект ГАМК на образование фосфопротеина
не проявляется и остается на уровне контроля.
о-Ванадат (10 мкМ) также устраняет дефосфорилирующий эффект ГАМК на фосфопротеин
(рис. 5).
Идентификацию белка, который фосфорилируется [g-32Р]АТР в присутствии Mg2+ и
дефосфорилируется Cl-+НСО3- и ГАМК А-эргическими лигандами, мы проводили методом
авторадиографии с использованием Ds-Naэлектрофореза в 12%-ом полиакриламидном
геле. Обработанный Ds-Na исходный белковый
препарат представлен на электрофореграмме
более чем 24 белками (рис. 6).
Авторадиографическое исследование­ спе­к­
т­­­ра фосфорилируемых [g-32Р]АТР белков плазматических мембран показало, что 32Р, который
включается в мембранный препарат и дефосфорилируется бикукуллином, обнаруживается
2
120
3
100
80
60
1
40
20
0
0
1
10
100
log [ȽȺɆɄ], ɦɤɆ
Рис. 5. Влияние ГАМК на образование фосфо­
протеина в мембранном препарате мозга рыб при
отсутствии (1) и в присутствии 25 мкМ бикукуллина (2) или 10 мкМ о-ванадата.
в мажорной белковой полосе с молекулярной
массой ~ 56 кДа.
Таким образом, результаты наших исследований показали, что максимальное включение 32Р в белковый препарат регистрируется
через 1,5–2,0 мин инкубации с [g-32Р]АТР в
присутст­вии 3 мМ Mg2+. При фосфорилировании Cl--АТР-азы из эпителиальных клеток
моллюска включение 32Р тоже наблюдается
после 2 мин инкубации фермента с 2,2 мкМ
[g-32Р]АТР в присутствии высоких концентраций Mg2+ (>2 мМ) [13]. Известно, что ионы
Cl ингибируют образование фосфопротеина
с максимальным эффектом 80% при концентрации 10 мМ. Кроме того, при исследовании Na+,K+-АТР-азы из мозга морской свинки
было показано, что ионы Na увеличивают, а
ионы K снижают фосфорилирование фермента в присутствии 50 мкМ [g-32Р]АТР и 50 мкМ
Mg2+, а при совместном действии эти катионы ингибируют фосфорилирование фермента
[14]. В наших опытах Cl- и Cl-+НСО3- также
снижали уровень образования фосфопротеина
в мем­бранных препаратах мозга рыб на 53% и
82% соответственно. Максимальный эффект
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА
1
67 кДа
2
3
4
56 кДа
45
24
18
13
Рис.6. Электрофореграмма маркерных белков
(1) – БСА, овальбумина, химотрипсиногена А,
миоглобина и цитохрома с; мембранного препарата мозга рыб (2) и его авторадиограмма при
отсутствии (3) и в присутствии (4) 25 мкМ бикукуллина.
анионов­ наблюдался при концентрациях 10 мМ
Cl-+2 мМ НСО3- и 15 мМ Cl-+3 мМ НСО3-. При
увеличении концентрации анионов их эффект
уменьшается. Важно отметить, что эти данные
сходны с результатами, полученными нами ранее при исследовании активности Cl-, НСО3- АТР-азы плазматических мембран мозга рыб.
Так, максимальная стимуляция фермента анионами также наблюдается при концентрации
10 мМ Cl-+2 мМ НСО3- [1,2], а при увеличении
их концентрации совместный эффект стимуляции ферментативной активности снижается
и в диапазоне высоких концентраций не выявляется.
Известно, что о-ванадат является специфическим конкурентным ингибитором переходного состояния связывания фосфора
транспортными АТР-азами Р-типа [15]. Было
показано, что активность Na+, K+- АТР-азы из
клеток различного происхождения [8], а также
К+-индуцируемое дефосфорилирование Na+,
K+-АТР-азы, выделенной из почек собаки, ингибируются в присутствии 10–110 мкМ о‑ванадата [16]. Кроме того, фосфорилирование
встроенной в искусственные липосомы Сl-АТР-­азы из эпителиальных клеток кишечника
моллюска в присутствии 2,2 мкМ [g‑32Р]АТР и
3 мМ Mg2+ также ингибируется 0,01 мкМ о‑ваISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
надатом [13]. В нашем исследовании 10 мкМ
о-ванадат не влиял на фосфорилирование мем­
бранного препарата в присутствии Mg2+, однако устранял эффект дефосфорилирования
белка в присутствии ионов Cl-+НСО3-, а также
ГАМК А-­эргических лигандов, что указывает
на наличие на молекуле белка места связывания Рi.
Показано, что Na+, К+-АТР-аза микросомального препарата из мозга морской свинки
[14] и Cа2+, Mg2+-АТР-азы из гладкой мускулатуры [17] и саркоплазматического ретикулума
[8] различных видов животных фосфорилируются через высокоэнергетическую ацил-фосфатную связь, которая разрушается в присутствии 50 мМ гидроксиламина и щелочного
рН (>10). Фосфорилирование Cl--АТР-азы из
эпителиальных клеток кишечника моллюска
[13] и желудка кролика [18] также ингибируется 50 мМ гидроксиламином и рН 10. В нашем
исследовании в присутствии 50 мМ гидроксил­
амина и при защелачивании среды инкубации
до рН 10 также практически не наблюдалось
включения Pi в мембранный препарат, что
предполагает фосфорилирование белка через
высокоэнергетическую ацилфосфатную связь.
В предварительных исследованиях мы
обнаружили, что ГАМК увеличивает “базальную” Mg2+-АТР-азную активность плазматических мембран мозга рыб и ее стимуляцию Clи НСО3- в концентрациях, которые являются
эффективными при действии этого медиатора
на ГАМК А-рецепторы мозга крыс [2–4]. Кроме
того, нами ранее было обнаружено, что эффект
ГАМК на Cl-, НСО3--АТР-азу мозга рыб, подобно действию этого медиатора на тормозные
рецепторы, не проявляется в присутствии бикукуллина и пикротоксина [1–4]. В настоящем
исследовании эффект ГАМК на включение 32Р
в белок мембранного препарата мозга рыб не
проявлялся в присутствии 25 мкМ бикукуллина, что указывает на зависимый от рецептора
путь действия лигандов ГАМК А-рецепторов на
образование фосфопротеина.
Результаты проведенного нами авторадиографического исследования мембранного
препарата мозга рыб показали, что субъединица, которая фосфорилируется АТР и дефосфорилируется анионами и ГАМК А-эргическими лигандами, имеет молекулярную массу
~56 кДа, что подтверждает результаты, полученные нами ранее. Так, при хроматографическом исследовании субъединичного состава
Cl-, НСО3--АТР-азы плазматических мембран
мозга рыб нами было обнаружено, что олигомерная структура этого фермента состоит из
67
Експериментальні роботи
полипептида с молекулярной массой ~ 56 кДа
[5]. В то же время известно, что транспортные
АТР-азы Р-типа, такие как Na+, K+-АТР-аза,
Сa2+, Mg2+-АТР-аза и Н+-АТР-аза имеют един­
ственную каталитическую субъединицу с молекулярной массой ~100 кДа [8, 15], а Cl--АТР-аза
кишечника моллюска – каталитическую субъединицу с молекулярной массой ~ 110 кДа [13].
Эти данные демонстрируют, что молекулярная
масса каталитической субъединицы исследуемого фермента отличается от молекулярной
массы каталитической субъединицы транспорт­
ных АТР-аз Р-типа, но сходна с молекулярной массой субъединицы, входящей в состав
олигомерной структуры ГАМК А-рецепторов
мозга рыб. В частности, было показано, что
субъединица, образующая гомоолигомерную
структуру ГАМК А-бензодиазепинового рецептора из мозга рыб и связывающая [3H]ГАМК и
[3H]флунитразепам, имеет молекулярную массу ~56 кДа [19] .
Таким образом, чувствительная к ГАМК А­
эргическим лигандам Cl-, НСОз--АТР-аза моз­
га рыб, подобно транспортным
АТР-азам
Р-типа, может напрямую фосфорилироваться АТР и образовывать фосфорилированный
интермедиат. Реакция гидролиза АТР такими
хорошо изученными транспортными системами, как Na+, K+-АТР-аза и Са2+, Mg2+-АТРаза, является многоступенчатой и состоит из
присоединения субстрата, фосфорилирования, дефосфорилирования и высвобождения субстрата [8,15]. Исходя из этого можно
предположить, что гидролиз АТР исследуемой
Cl-, НСО3--АТР-азой вероятно также является
многоступенчатым, в котором ионы Mg2+ отвечают за начальную стадию фосфорилирования
фермента, а ионы Cl- и НСО3- – за стадию его
дефосфорилирования. Дефосфорилирующий
эффект ГАМК А-ергических лигандов на уровень фосфорилирования Сl-, НСО3--АТР-азы
скорее всего, также как и эффект анионов,
связан с переходным состоянием фосфата на
молекуле белка. Дальнейшие исследования,
направленные на непосредственное выяснение участия фермента в транспорте анионов,
позволят установить сопряженность переноса
ионов с реакцией гидролиза АТР.
68
Работа выполнена при финансовой под­
держке РФФИ (грант 03-04-48056).
фосфорилювання
чутливої до гамк а-ергічних
лігандів стимульованої mg2+
cl-, нсо3--атр-ази плазматичних
мембран мозку коропа сyprinus
carpio L.
С. А. Мензіков, О. В. Мензікова
Інститут загальної патології та
патофізіології РАМН, Москва, Росія;
e-mail: menzikov@lansp.ru
Досліджено фосфорилювання стимульованої Cl- та НСО3- Mg2+-АТР-ази плазматичних
мембран мозку риб за допомогою [g-32Р]АТР
за додавання Mg2+. Визначено, что утворення
фосфопротеїну при температурі 0–1 °С залежить
від часу інкубації та концентрації Mg2+ в середовищі інкубації. Гідроксиламін у кількості
50 мМ при рН 10 практично повністю інгібує
утворення фосфорильованого інтермедіату.
Іони Cl (10 мМ)+НСО3 (2 мМ), а також ГАМК
(1–100 мкМ) дефосфорилюють АТР-азу. За
присутності бікукуліну цей ефект дефосфорилювання не виявляється. о-Ванадат у кількості
10 мкМ усуває дефосфорилюючу дію аніонів
і ГАМК на фосфопротеїн. Методом Ds-NaПААГ-електрофорезу та авторадіографії визначено, що досліджене фосфорилювання та
ГАМК А­-­індуковане дефосфорилювання забезпечує білок з молекулярною масою ~56 кДа,
який є субодиницею, що є складовою чутливої
до ГАМК А-ергічних лігандів Cl-, НСО3- -АТРази мозку риб. Одержані дані демонструють,
що Cl-, НСО3--АТР-аза мозку риб здатна безпосередньо фосфорилюватися АТР у присутності
Mg2+ і таким чином утворювати фосфорильований інтермедіат.
К л ю ч о в і с л о в а: риби, мозок, Cl-,
НСО3- -АТР-аза, ГАМК, бікукулін, фосфорилювання, авторадіографія.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
С. А. МЕНЗИКОВ, О. В. МЕНЗИКОВА
phosphorylation
of cl-, hco3--stimulated
Mg2+-atpase of plasma membranes
of carp (cyprinus carpio l.) brain
sensitive to gaba а-ergic Ligands
S. A. Menzikov, O. V. Menzikova
Institute of General Pathology and
Phathophysiology of Russian Academy of
Medical Sciences, Moscow, Russia;
e-mail: menzikov@lansp.ru
Summary
Phosphorylation of the sensitive to GABA Aergic ligands Cl-, HCO3--stimulated Mg2+-ATP­
ase of the plasma membranes from fish brain by
[g‑32Р]АТР was investigated in the presence of
Mg2+. It was established, that formation of the
phosphoprotein at 0–1 °C is dependent on time
incubation and concentration of Mg2+ in the incubation medium. Hydroxylamine (50 mM) and pH
(10) completely inhibited formation of phosphory­
lated intermediate. Ions of Cl- (10 mM)+HCO3(2 mM) and also GABA (1–100 mM) dephosphorylated the enzyme. The dephosphorylating effect
of GABA on the membrane samples did not appear
in the presence of bicuculline. o-Vanadate (10 mM)
eliminates the dephosphorylating effect of anions
and GABA on the phosphoprotein. It was established by SDS-PAAG electrophoresis and autoradiographia that investigated phosphorylation and
GABA A-induced dephosphorylation is performed
by the protein with molecular weight ~56 kDa.
Such molecular weight has a subunit which forms
oligomer composition of the sensitive to GABA Aergic ligands Cl-, HCO3--ATP­ase from fish brain.
The obtained data demon­strated that Cl, HCO3ATPase from fish brain can be directly phosphory­
lated by [g-32Р]АТР in the presence of Mg2+ and
forms the phosphorylation intermediate.
K e y w o r d s: fish, brain, plasma membranes, Cl-, HCO3--ATPase, GABA, bicuculline,
phosphorylation, autoradiographya, molecular
mass, o-vanadate, hydroxylamine.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2006, т. 78, № 1
1. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Укр.
біохім. журн. – 2004. – 76, № 1. – C. 53–
58.
2. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Докл.
АН. – 2002. – 382, № 6. – C. 833–835.
3. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Био­
химия.– 2002.– 67, № 2. – C. 278–282.
4. Menzikov S. A., Menzikova O. V. // Neurosci.
Let. – 2002. – 334. – P. 161–164.
5. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Известия
РАН. Серия биологическая. – 2006. – № 1
(в печати).
6. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Докл.
АН. – 2002. – 385, № 5. – C. 708–710.
7. Мензиков С. А., Мензикова О. В. // Докл.
АН. – 2002. – 382, № 1. – C. 134–137.
8. Stekhoven F. S., Bonting S. L. // Physiol. Re­
views.– 1981. – 61. – P. 1–76.
9. Глебов Р. Н., Крыжановский Г. Н. Функ­
циональная биохимия синапсов. – M.:
Медицина, 1978. – 328 c.
10. Кондрашев-Луговский А. С., Малышева А. Н.,
Стори К. Б. и др. // Биологические
мембраны.– 2004. – 21. – C. 491–497.
11. Weber K., Osborn M. // J. Biol. Chem. –
1970. – 244. – Р. 4406–4410.
12. Bradford M. M. // Anal. Biochem. – 1976. –
72. – P. 248–254.
13. Gerencser G. A., Zelezna B. // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. – 1993. – 90. – P. 7970–7974.
14. Hokin L. E., Sastry P. S., Galsworthy P. R., Yo­
da A. // Ibid.– 1965. – 54. – P. 177–184.
15. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная струк­
тура и функции. – М.: Мир, 1997. – 624 c.
16. Forbush B. // J. Biolog. Chem. – 1987. – 262. –
P. 11116–11127.
17. Carsten M. E., Miller J. D. // Arch. Biochem.
Biophys. – 1984. – 232. – P. 616–623.
18. Tanisawa A. S.,Forte J. G. // Ibid. – 1971. –
147. – P. 165–175.
19. Deng L., Nielsen M., Olsen R. W. // J. Neu­
rochem. – 1991. – 56. – P. 968–977.
Получено 29.11.2005
69