Задача 29. Ферментативный гидролиз N

Задача 29. Ферментативный гидролиз N-ацетилаланина: пример
экологически безопасного процесса
Введение
Биологические процессы катализируются ферментами. Многие ферменты обладают высокой
каталитической селективностью и могут селективно катализировать реакции только с одним
из энантиомеров в рацемате. В современной химии ферменты используются во многих
процессах in vitro, особенно в синтезе оптически чистых продуктов. В данном эксперименте
изучается гидролиз N-ацетилаланина в присутствии фермента ацилазы I.
H
N
O
H
N
LiOH
OH
O
O Li
O
O
N-ацетилаланин
(рацемат)
H
N
ацилаза I
O
O
O Li
H2N
O Li
O
N-ацетилаланин
аланин
За ходом реакции можно следить, если в реакционную смесь добавить нингидрин, который
взаимодействует с образующимся аланином:
O
O
OH
O
O
нингидрин
индан-1,2,3-трион
O
O
H2N
∆
аланин
CH3CHO
Ν
OH
Ο
O
Ο
Ο
O
2
H2O
O
OH
CO 2
H3O+
Ο
пурпурный анион λмакс = 592 нм
Методика
Растворите рацемат N-ацетилаланина (262 мг; 2,0 ммоль) в 10 мл воды. Медленно, при
осторожном перемешивании прибавляйте раствор моногидрата гидроксида лития (84 мг; 2,0
ммоль) в воде (4 мл) до тех пор, пока pH раствора не станет равным 7. Контролируйте pH
лакмусовой бумагой. В течение 2 минут, при интенсивном перемешивании прибавьте
раствор ацилазы I (10 мг) в воде (водный раствор ацилазы I готовится следующим образом:
навеска фермента добавляется к 5 мл воды, затем раствор отфильтровывается на стеклянном
фильтре, покрытом диатомитом). После этого доведите объем раствора водой до 20,0 мл
(точно). Поместите реакционную смесь в водяную баню (37оС) на 60 минут. Затем
перенесите ровно 0,25 мл (для этого используйте шприц или мерную пипетку) реакционной
смеси в пробирку и добавьте туда нингидрин (Sigma N 1632) (1,25 мл). Эту смесь нагревайте
в кипящей воде в течение 20 минут, при этом появится интенсивная пурпурная окраска.
После охлаждения аккуратно добавьте содержимое пробирки к буферному раствору,
состоящему из 4 М литий-ацетатного водного буфера (рН = 5,2) и диметилсульфоксида в
соотношении 1:3, находящемуся в мерной колбе на 250 мл. Доведите объем раствора до 250
мл. Измерьте оптическую плотность на спектрофотометре при λ = 592 нм. В качестве
стандарта используйте раствор нингидрина в том же литий-ацетатном буфере в
диметилсульфоксиде. εпурпурного комплекса = 13350 л⋅моль-1⋅см-1.
Запишите следующие данные:
1.
Начальную концентрацию рацемического N-ацетилаланина.
2.
Значение оптической плотности при λ = 592 нм.
3.
Используя закон Бугера-Ламберта-Бера, рассчитайте количество аланина (в
ммоль), образовавшегося в результате ферментативной реакции.
4.
Рассчитайте степень превращения.
Вопросы:
29-1 Будет ли образующийся аланин оптически активен: да или нет?
29-2 Будет ли непрореагировавший N-ацетилаланин: (1) оптически неактивен, (2) обогащен
одним из энантиомеров, (3) оптически чист, если степень превращения меньше 50%?
29-3 Будет ли непрореагировавший N-ацетилаланин: (1) оптически неактивен, (2) обогащен
одним из энантиомеров, (3) оптически чист, если степень превращения составит ровно
50%?
29-4 Достижима ли степень превращения больше 50%, да или нет?
Особое замечание:
Если позволяет время, остановите реакцию и определите концентрацию аланина через 10, 25,
40 и 60 минут после начала реакции. Постройте график зависимости концентрации аланина
от времени и оцените оптимальное время проведения реакции.
Список необходимых реактивов:
N-ацетилаланин, рацемат
ацилаза I
гидроксид лития
раствор нингидрина (Sigma N 1632)
265 мг
10 мг
85 мг
2 мл
Коды безопасности:
RSRSR 23-34
S 45-26-27-36/37/39
R 11-20/21/22, 34 S 16-26-27-36/37/39
диметилсульфоксид
литий-ацетатный буфер
ок. 70 мл
рН 5,2
R 36/37/38
R 20/21/22-63
S 26-36-23
S 22-36