Электрофорез в агарозном геле - EU

Анализ образцов пищевых продуктов на
присутствие генетически
модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
М.Сомма, М.Кверчи
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Электрофорез в агарозном геле
2
Содержание
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
Введение
3
Физические принципы электрофореза в агарозном геле
3
Компоненты электрофореза в агарозном геле
6
Экспериментальная часть
9
Литература
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
13
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
3
Введение
Электрофорез в гелях – это метод, который служит для разделения макромолекул на
основе их размера, электрического заряда и других физических свойств. Термин
электрофорез
описывает
миграцию
заряженных
частиц
под
воздействием
электрического поля. Первая часть слова «электро» относится к электричеству, а
вторая часть слова «форез» происходит от греческого форос (phoros), что означает
«переносить». Таким образом, электрофорез в гелях, - это метод, в котором молекулы
вынуждены перемещаться через пространство геля под воздействием электрического
тока. Движущей силой электрофореза является напряжение, прикладываемое к
электродам на каждом конце геля. Свойства молекул определяют, насколько быстро
электрическое поле может перемещать их через желеобразную среду.
Много важных биологических макромолекул (например, аминокислоты, пептиды,
белки, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты) обладают ионизируемыми группами, и при
любом заданном рН, существуют в растворе как электрически заряженные частицы,
либо как катионы (+), либо как анионы (-). В зависимости от природы заряда среды,
заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду. Например, когда
электрическое поле прилагается к гелю при нейтральном рН, отрицательно
заряженные фосфатные группы ДНК способствуют ее перемещению в сторону анода
(Westermeier, 1997).
Электрофорез в агарозном геле является стандартным методом, используемым для
разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. Эта методика проста, быстро
осуществляется, и способна разделять фрагменты ДНК, которые не могут быть
разделены
надлежащим
образом
с
помощью
других
процедур.
Более
того,
локализация ДНК в геле может быть определена путем окрашивания бромистым
этидием, - флуоресцентным интеркалярным красителем, в низких концентрациях. В
следующих разделах будут описаны физические принципы, компоненты (матрикс геля,
буфер, буфер для нанесения и маркер), а также процедуры, применяемые для
подготовки электрофореза в агарозном геле (Sambrook et al., 1989).
Физические принципы электрофореза в агарозном геле
Гель-электрофорез – это метод, используемый для разделения нуклеиновых кислот и
белков. Разделение макромолекул зависит от двух переменных: заряда и массы.
Когда биологический образец, такой как ДНК, смешивается в буферном растворе и
наносится на гель, две эти переменные действуют одновременно. Электрический
заряд от одного электрода отталкивает молекулы, в то время как другой электрод
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
4
одновременно притягивает молекулы. Силы трения материала, образующего гель,
действуют как «молекулярное сито», разделяя молекулы по размеру. В процессе
электрофореза макромолекулы вынуждены перемещаться через поры, и скорость их
перемещения через электрическое поле зависит от следующих параметров:
•
сила электрического поля
•
размер и форма молекул
•
относительная гидрофобность образцов
•
ионная сила и температура буфера, в котором движутся молекулы
Для
полного
понимания
процесса
разделения
заряженных
частиц
в
гель-
электрофорезе, важно посмотреть на простое уравнение, имеющее отношение к
электрофорезу. Когда к электродам прикладывается напряжение, создается градиент
потенциала Е, что может быть выражено уравнением:
E = V/d
(1)
где V, - прилагаемое напряжение, измеряемое в вольтах, и d – расстояние между
электродами в сантиметрах.
Когда создается градиент потенциала E, на заряженной молекуле образуется сила F,
что выражается уравнением:
F = Eq
(2),
где q – заряд на поверхности молекулы в кулонах. Эта сила, измеряемая в ньютонах,
перемещает заряженную молекулу к электроду.
Существует также сопротивление трения, которое замедляет движение заряженных
молекул. Эта сила трения является функцией от следующих параметров:
•
гидродинамический размер молекулы
•
форма молекулы
•
размер пор среды, в которой происходит электрофорез
•
вязкость буфера
Скорость v заряженной молекулы в электрическом поле является функцией градиента
потенциала, заряда и силы трения молекулы и может быть выражена уравнением:
v = Eq / f
(3)
где f – это коэффициент трения.
Электрофоретическая скорость М любого иона может быть определена скоростью
иона, разделенной на градиент потенциала:
M=v/E
(4)
В дополнение, из уравнения (3) можно видеть, что электрофоретическая скорость М
может быть также выражена как заряд молекулы q, поделенный на коэффициент
трения f.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
5
M=q/f
(5)
Когда создается разница потенциалов, молекулы с различным суммарным зарядом
начинают
разделяться
подвижностью.
в
соответствии
Электрофоретическая
с
различной
подвижность
электрофоретической
является
очень
важным
параметром, характеризующим заряженную молекулу или частицу, этот параметр
зависит от величины рК заряженной группы и размера молекулы, или частицы. Даже
молекулы с одинаковым зарядом будут разделяться, если различен размер молекул,
так как они будут испытывать воздействие различной по величине силы трения.
Линейная двухцепочечная ДНК перемещается через матрикс геля со скоростью,
которая обратно пропорциональна десятичному логарифму (log10) числа нуклеотидных
пар. Молекулы большего размера перемещаются медленнее, вследствие большего
сопротивления трения и меньшей эффективности прохождения через поры геля.
Ток в растворе между электродами создается в основном за счет ионов буфера и, в
небольшой степени, за счет ионов анализируемого образца. Соотношение между
током I, напряжением V и сопротивлением R выражается как в законе Ома:
R=V/I
(6)
Это уравнение демонстрирует, что при заданном сопротивлении R возможно ускорить
электрофоретическое разделение путем увеличения подаваемого напряжения V, что
приведет к соответствующему увеличению тока I. Пройденное расстояние будет
пропорционально величине тока и времени. Однако, повышение напряжения V и
соответствующее увеличение тока I может стать причиной одной из серьезных
проблем для разных видов электрофореза, а именно – образования тепла. Это может
быть
проиллюстрировано
следующим
уравнением,
в
котором
мощность
W
(измеряемая в ваттах), генерируемая в процессе электрофореза равна произведению
сопротивления и квадрата тока:
W = I2 R
(7)
Так как основная часть мощности, производимая в процессе электрофореза,
растрачивается в виде тепла, могут возникать следующие нежелательные эффекты:
•
возросшая
скорость
диффузии
ионов
исследуемого
образца
и
буфера,
приводящая к расширению зоны разделяемого образца
•
образование конвекционных токов, что приводит к перемешиванию разделенных
образцов
•
термическая
нестабильность
образцов,
которые
более
чувствительны
к
нагреванию (например, денатурация ДНК)
•
уменьшение вязкости буфера, приводящее к снижению сопротивления среды.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
6
Компоненты электрофореза в агарозном геле
Агароза
Агароза, природный коллоид, который выделяют из морских водорослей, является
линейным полисахаридом (средняя молекулярная масса ~12 000 Да), образованным
повторяющимся элементом – агаробиозой, которая в свою очередь состоит из
чередующихся элементов: галактозы и 3,6 –ангидрогалактозы. Агароза очень хрупка, и
легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели имеют «поры» большого
размера и используются преимущественно для разделения больших молекул с
молекулярной массой большей, чем 200 кДа.
Разделение в агарозных гелях происходит быстро, но с ограниченным разрешением,
так
как
полосы,
образующиеся
размываться/диффундировать
и
в
агарозных
распространяться
гелях,
в
имеют
стороны.
Это
тенденцию
является
результатом большого размера пор и не может быть предотвращено. Агарозные гели
получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением
смеси до того момента, когда агароза расплавится и образует прозрачный раствор.
Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры,
чтобы сформировался прочный гель. При застывании агароза формирует матрикс,
плотность которого определяется концентрацией.
Буфер для электрофореза
На электрофоретическую подвижность ДНК воздействуют состав и ионная сила
буфера для электрофореза. В отсутствии ионов, электропроводность минимальна, и
перемещение ДНК происходит медленно, если вообще происходит. В буфере с
высокой ионной силой электропроводность очень эффективна, и образуется
значительное количество тепла. В худшем случае, гель расплавляется и ДНК
денатурирует.
Существует несколько буферов для электрофореза нативной двухцепочечной ДНК. О
ни содержат EDTA (рН 8.0) и Tris-ацетат (ТАЕ), Тris-борат (ТВЕ), или Tris-фосфат
(ТРЕ) в концентрации приблизительно 50 мМ (рН 7.5 – 7.8). Буферы для
электрофореза обычно готовят в виде концентрированных растворов и хранят при
комнатной температуре. Буфер ТВЕ первоначально использовали для электрофореза
в агарозном геле при рабочей силе буфера 1х (однократный). Однако, оказалось, что
рабочий раствор 0.5х обеспечивает более чем достаточную емкость буфера, и в
настоящее время почти всегда электрофорез в агарозном геле проводят с
использованием этой концентрации буфера.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
7
Концентрация агарозы
Фрагмент ДНК заданного размера перемещается в геле на различные расстояния в
зависимости от концентрации агарозы. При соответствующих концентрациях агарозы
и/или буфера возможно разделить сегменты ДНК, содержащие от 20 до 50000 н.п.
(нуклеотидных пар).
В горизонтальных гелях агароза обычно используется в концентрации от 0.7% до 3%
(см. Таблицу 1).
Таблица 1. Рекомендуемая концентрация агарозного геля для разделения линейных
молекул ДНК.
Концентрация агарозы
%
0.75
1.00
1.25
1.50
2.00
2.50
Диапазон размеров ДНК (н.п.)
10 000 – 15 000
500 – 10 000
300 – 5 000
200 – 4 000
100 – 2 500
50 - 1 000
Маркерная ДНК
При заданном напряжении, концентрации агарозного геля и буфера, расстояние
перемещения зависит от молекулярного веса исходного материала. Поэтому,
маркерная ДНК известного размера должна наноситься на дорожки и с левого, и с
правого края геля. Маркер обычно содержит определенный набор известных
сегментов ДНК, которые облегчают определение размера исследуемой ДНК, если
какое либо систематическое искривление геля возникнет во время электрофореза.
Буфер для нанесения
Образцы ДНК, которые будут наноситься на агарозный гель, сначала смешивают с
буфером для нанесения, обычно содержащим воду, сахарозу и краситель (например
ксиленцианол, бромфеноловый синий, бромкрезол зеленый и другие). Максимальное
количество ДНК, которое может быть нанесено, зависит от числа фрагментов.
Минимальное количество ДНК, которое может быть выявлено на снимках геля,
окрашенного бромистым этидием, составляет около 2 нг в полосе, шириной 0.5 см.
Если в полосе такой ширины находится более 500 нг ДНК, значит дорожка
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
8
перегружена, что приводит к размыванию полосы. Буфер для нанесения используется
для трех целей:
•
увеличение плотности образца для обеспечения попадания ДНК в лунку
•
добавления красителя к образцу, чтобы облегчить процесс нанесения
•
добавление к образцу такого красителя, который в электрическом поле будет
двигаться в сторону анода на предсказуемое расстояние
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
9
Экспериментальная часть
Предостережение: бромистый этидий является сильным
мутагеном/канцерогеном и умеренно токсичен. Необходимо всегда надевать
перчатки для работы с растворами и гелями, содержащими бромистый этидий
Оборудование
•
прибор для горизонтального электрофореза и источник тока
•
микроволновая печь или мешалка с нагревом
•
микропипетки
•
реакционные пробирки на 1.5 мл
•
весы для взвешивания навесок в 0.1 г
•
шпатели
•
штатив для реакционных пробирок
•
стеклянная посуда
•
ультрафиолетовый трансиллюминатор (длина волны 312 нм)
•
приборы для документирования результатов (например, фотоаппарат – Полароид
или видеокамера)
Реактивы
•
агароза, пригодная для электрофореза ДНК
•
Tris [оксиметил] аминометан (Tris)
•
борная кислота
•
Na2 EDTA
CAS 6381-92-6
•
бромистый этидий
CAS 1239-45-8
•
сахароза
•
ксиленцианол FF
•
ДНК маркеры
•
CAS 77-68-1
CAS 2650-17-1
ДНК фага лямбда, расщепленная EcoRI/HindIII(или другой подходящий
маркер)
•
набор фрагментов ДНК известной длины с шагом 100 н.п.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
10
10х ТВЕ буфер (1 литр)
Tris [оксиметил]аминометан (Tris)
54.0 г
Борная кислота
27.5 г
Na2 EDTA
7.44 г
•
Смешать реагенты с ионизованной водой до получения 1 л раствора при рН 8.3
•
Хранить при комнатной температуре
6х буфер для нанесения (10 мл)
ксиленцианол FF
Сахароза
•
0.025 г
4г
Добавить сахарозу и ксиленцианол FF в деионизованную воду до получения 10 мл
раствора.
•
Перемешать раствор, автоклавировать и хранить при 4 ° С.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
11
Процедура электрофореза
•
Заклейте края чистых, сухих пластиковых подложек для геля либо клейкой лентой,
либо
другим
способом.
Вставьте
соответствующую
гребенку,
так
чтобы
образовались лунки при добавлении агарозного раствора.
•
Разведите 10х ТВЕ буфер для приготовления соответствующего количества 0.5х
ТВЕ буфера, для заполнения электрофоретической камеры и приготовления геля
•
Взвесьте сухую агарозу
в соответствие с Таблицей 2 и добавьте ее к
соответствующему количеству 0.5х ТВЕ буфера в колбу Эрленмейера со свободно
закрывающейся крышкой (обычно требуется 150 мл гелевого раствора для
подложек для геля, размером 15 х 15 см, и 100 мл геля для подложек для геля,
размером 15 х 10 см).
Геномная
ДНК
mg3
mg4
ГМO 7
ГМO 8
CRYIA3
CRYIA4
х
HA-nos118-f
HA-nos118-r
х
P35S–cf3
P35S–cr3
Зеин 3
Зеин 4
0.8-1%
1.5%
2.0%
ГМО 3
ГМО 4
Таблица 2. Концентрации агарозного геля, используемые на Курсах
х
х
х
х
х
х
•
Нагрейте взвесь агарозы в микроволновой печи или на бане с кипящей водой до
•
растворения агарозы (проверьте объем раствора после нагревания)
•
Охладите смесь до 50 - 60° С, добавьте бромистый этидий (базовый раствор с
концентрацией 10 мг/мл) до конечной концентрации 0.2 мкг/мл и тщательно
перемешайте
•
Залейте раствор на подложку для геля, и дайте гелю застыть. Количество
использованного геля должно соответствовать образованию слоя толщиной около
3-5 мм.
•
После того как гель полностью сформируется, аккуратно удалите гребенку и ленту,
и поместите гель в электрофоретическую камеру
•
Добавьте достаточное количество 0.5х ТВЕ буфера в прибор для электрофореза,
чтобы гель был покрыт слоем буфера около 2 – 5 мм.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
12
Приготовьте образцы и маркеры для геномной ДНК как указано далее:
Исследуемый образец
вода
буфер для нанесения
образец
Маркер
3 мкл
2 мкл
5 мкл
10 мкл
вода
буфер для нанесения
λ ДНК EcoRI / Hind III
6 мкл
2 мкл
2 мкл
10 мкл
Приготовьте образцы и маркеры для продуктов ПЦР как указано далее
Исследуемый образец
Маркер
буфер для нанесения
образец
2 мкл
8 мкл
набор фрагментов ДНК
известной длины с шагом
100 н.п
15 мкл
10 мкл
•
Нанесите 10 мкл каждого образца в последовательно расположенные лунки, а
соответствующие ДНК маркеры в первую и последнюю лунки
•
Закройте крышку электрофоретической камеры и подсоедините электропровода
таким образом, чтобы ДНК перемещалась в сторону анода, подайте напряжение 5
– 10 V/см
•
Продолжайте электрофорез до того момента, когда ксиленцианол пройдет
надлежайшее расстояние в геле ( ~ 40 – 60 минут)
•
Отключите ток, отсоедините провода и крышку электрофоретической камеры.
Поместите гель на фильтр УФ трансиллюминатора и сфотографируйте гель
•
Использованный гель поместите в специальный контейнер для твердых отходов,
содержащих бромистый этидий
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5
Электрофорез в агарозном геле
13
Литература
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Gel electrophoresis of DNA. In:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, USA, chapter 6.
Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 5