Методические рекомендации по применению биологических
advertisement
Методические рекомендации по применению биологических активных добавок, содержащих бета-аланин и карнозин для повышения адаптации спортсменов к физическим нагрузкам Москва 2013 СОДЕРЖАНИЕ Стр. Введение……………………………………………………………………….. 3 1. Механизм действия бета-аланина и карнозина на организм человека.. 5 2. Эффекты применения бета-аланина и карнозина на физическую работоспособность…………………………………………................. 3. Методические рекомендации по применению бета-аланина 9 и карнозина с целью повышения адаптации к физическим нагрузкам спортсменов, занимающихся видами спорта на выносливость и скоростно-силовыми видами спорта…………………………………… 22 Заключение………………………………………….…………………………. 32 2 Введение Поиск новых препаратов, повышающих физическую работоспособность, в последние годы направлен в сторону природных биологически активных веществ ввиду их низкой токсичности и минимуму побочных эффектов. Одним из таких соединений является дипептид карнозин. Карнозин (бета-аланил-L-гистидин) - дипептид природного происхождения, широко встречающийся в тканях (преимущественно в быстрых мышечных волокнах и головном мозге) животных и человека. Карнозин окислительное обусловлен Карнозин влияет на метаболические фосфорилирование. антиоксидантным ингибирует и перекисное процессы: гликолиз, действия карнозина мембранопротекторным действием. Механизм окисление липидов, усиливает антиоксидантную защиту, повышает устойчивость организма к воздействию различных патологических факторов при кислородозависимых состояниях. К настоящему времени продемонстрирована способность карнозина защищать клетки от окислительного стресса, а также увеличивать их устойчивость при избыточной функциональной нагрузке и при накоплении возрастных изменений. Карнозин снижает уровень ацидоза мышечных клеток и улучшает их сократительные свойства. Концентрация карнозина выше в мышцах спринтеров и мужчин (по сравнению со стайерами и женщинами) и снижается с возрастом. В 1984 году исследователи заметили, что профессиональные спринтеры обладают необычными способностями выдерживать анаэробную нагрузку значительно дольше, чем можно было предположить, основываясь на общих принципах мышечной физиологии. Накапливание побочных продуктов анаэробной активности создает в мышцах кислотную среду, вызывая усталость. Ученые теоретически предположили, что спринтеры обладали большей буферной 3 способностью, что давало им особые преимущества во время соревнования. Карнозин явился одним из внутриклеточных буферов, вероятно, способствующих улучшению качества физической работы спортсменов. Бета-аланин является естественным биологическим предшественником карнозина. Систематическое применение бета-аланина, как эргогенного вещества может существенно (до 80%) повысить уровень карнозина скелетных мышц человека, что способствует повышению физической работоспособности как тренированных, так и нетренированных лиц. Таким образом, разработка методических рекомендаций по применению бета-аланина и карнозина с целью повышения адаптации к физическим нагрузкам спортсменов является актуальной задачей современной спортивной медицины. 4 1. Механизм действия бета-аланина и карнозина на организм человека Карнозин (Carnosine или beta-alanyl-L-histidine) – дипептид (схема), состоящий из бета-аланина и гистидина. Наибольшая концентрация карнозина в организме определяется в мозге и мышцах. Открытие в начале XX в. B.C. Гулевичем и сотрудниками его школы новых азотсодержащих соединений - карнозина, анзерина, карнитина и метилгуанидина - поставило вопрос об их функции. Исследования распространения этих экстрактивных веществ позволили определить карнозин и анзерин как постоянные (практически у всех позвоночных животных) и специфические составные части мышечной ткани. рH-буферное действие карнозина Расчеты показывают, что количество дипептидов в активно гликолизирующих тканях (в основном рассматривались скелетные мышцы) так велико, что может обеспечить до 60% всей буферной емкости клеток. Благодаря малым размерам и относительно высокой подвижности дипептиды оказываются предпочтительнее белков в условиях малого объема цитозоля, затрудняющего диффузию ионов водорода. Особенно важно наличие подвижной Н-буферной функционирования системы в митохондриально-го мышцах для ретикулума - нормального разветвленной 5 трехмерной структуры, пронизывающей все мышечное волокно и обеспечивающей возможность распространения мембранного потенциала, создаваемого дыхательной цепью, по всей длине миоцита (Скулачев, 1992). У человека, в отличие от других живых существ, карнозин обладает ограниченной возможностью (в среднем 7% от общей буферной емкости мышцы) предотвращать снижение рН, наблюдаемое при интенсивной мышечной работе. В целом не вызывает сомнения, что рН-буферные свойства ГСД играют существенную роль в клеточном метаболизме. Депо биологически активных соединений Помимо соображений, представленных выше, для понимания механизма действия ГСД важно учесть их возможную роль как депо биологически активных соединений. Действительно, карнозин служит источником срочного образования гистидина и бета-аланина. Первый представляет собой важную аминокислоту для синтеза белка и является источником гистамина, второй оказывается стимулятором образования коллагена, принимающего участие в репарации поврежденных тканей. Регуляция энергетического обмена Основанием для предположения об участии карнозина и анзерина в регуляции анаэробного гликолиза в скелетных мышцах путем хелатирования иона меди послужили работы Jencks, Hyatt (1959) и Davey (1960) посвящение изучению связывания меди карнозином в мышечной ткани. Скелетные мышцы содержат приблизительно одну треть всей меди организма. Физиологические границы концентраций меди равны 20-60 мкмоль/кг влажного веса, причем для скелетных мышц они находятся на нижнем пределе концентраций. Таким образом, в норме концентрация меди в мышцах ненамного меньше той, которая ингибирует анаэробный гликолиз. 6 Точкой приложения дипептидов в гликолизе может быть фруктозо-1,6дифосфатаза. Этот фермент принимает участие в превращении фруктозо-1,6дифосфата во фруктозо-6-фосфат, которое сопровождается гидролизом АТФ. В мышцах, где интенсивность утилизации энергии меняется в широких пределах от продолжительного покоя до максимальной активности, эта реакция необходима для поддержания связи между скоростью фосфорилирования фруктозо-6-фосфата и изменениями концентрации АТФ. Активность фруктозо-1,6-дифосфата-зы, выделенной из белых скелетных мышц, ингибируется ионами цинка и меди и восстанавлияается в присутствии карнозина и анзерина. Функция дипептидов в мышце может не ограничиваться только регуляцией анаэробного гликолиза. Поскольку медь требуется также и цихохромоксидазе, можно полагать, что хелатирование меди карнозином и его метилированными аналогами имеет отношение к внутриклеточному транспорту меди в митохондриях и регуляции окислительного метаболизма. Мембранопротекторное действие карнозина С.Е. Северин и Юй-Шуюй впервые отметили мембранотропный эффект карнозина на митохондрии. При использовании карнозина было показано значительное удлинение срока хранения митохондрий из грудных мышц голубя при сохранении сопряженности между дыханием и фосфорилированием. Позднее было установлено благоприятное влияние карнозина на АТФ-зависимый транспорт Са2+ фрагментами саркоплазматического ретикулума, а также ионов Na+ и К+- через плазматическую мембрану. Эти данные свидетельствуют о благоприятном действии карнозина на структуру мембран, сохраняющих способность осуществлять без утечки активный транспорт ионов Н+, Са2+, Na+, К+. Мембранопротекторное действие карнозина показано на примере лимфоцитов человека, образующих розетки с эритроцитами барана благодаря 7 мембранным Е-рецепторам. Инкубация крови с карнозином (10 мМ) в течение 1 ч не влияла на количество экспрессируемых лимфоцитами Ерецепторов. Однако при последующем изменении осмотического давления среды мембраны лимфоцитов из крови, об-работаннной карнозином, оказывались значительно более стабильными: в контроле (необработанная кровь) осмотический шок сокращал количество Е-розеткообразуюших лимфоцитов более чем на 40%, а после инкубации с карнозином лишь на 1520% (Мальцева и др., 1988, 1990). Эффекты карнозина реализуются не только за счет связывания продуктов реакции взаимодействия с окисления, ее но инициаторами и путем - АФК. нейтрализации Первые или косвенные подтверждения этого были получены в экспериментах по инициации ПОЛ различными АФК. Так, карнозин защищал генетический аппарат бактерий от повреждения, вызванного продукцией синглетного кислорода (Dahl et al., 1988), а в химической модели индукции окисления линолевой кислоты пероксильными радикалами - скорость ее окислительных превращений (Kohen et al., 1988). Позднее были получены и прямые подтверждения взаимодействия карнозина с основными известными АФК. Сравнение эффективности карнозина и ряда других тушителей супероксид-аниона показывает, что хотя карнозин гораздо менее эффективен, чем супероксидцисмутаза (СОД), но по эффективности сравним с витаминами Е и С. Таким образом, для тех тканей, которые бедны СОД, аскорбатом и а-токоферолом, но для которых существует повышенная опасность окислительного стресса (возбудимые клетки), карнозин может явиться реальной защитой от супероксид-аниона. 8 2. Эффекты применения бета-аланина и карнозина на физическую работоспособность В 1984 году исследователи заметили, что профессиональные атлетыспринтеры обладают необычными способностями выдерживать анаэробную нагрузку значительно дольше, чем можно было предположить, основываясь на общих принципах мышечной физиологии. Накапливание побочных продуктов анаэробной активности создает в мышцах кислотную среду, вызывая усталость. Ученые теоретически предположили, что атлетыспринтеры обладали большей буферной способностью, что давало им особые преимущества во время соревнования. Карнозин явился одним из внутриклеточных буферов, вероятно, способствующих улучшению качества физической работы спортсменов. B.C. Гулевичем (1926) была высказана гипотеза, что эти вещества имеют прямое отношение к тем процессам, которые протекают в мышцах при их сокращении. Это предположение неоднократно проверялось в различных лабораториях. В 1911г. Furth, Schwarz определяли карнозин в мышцах конечностей собаки после их длительной сократительной работы под влиянием электрического тока. После многочасовой ритмической работы мышцы содержали карнозина на 10% больше, чем неработавшие. Позднее было изучено влияние долговременной тренировки мышц на содержание в них карнозина. Так, поданным Нормарка и Савроня (1932), неоднократно подтвержденным разными авторами в последующие годы, при тренировке содержание карнозина в мышце повышается по сравнению с одноименной мышцей другой конечности, находившейся в покое. Подвергая анализу данные о связи карнозина с мышечной функцией, Юдаев (1950) показал, что максимальное количество карнозина содержится в мышцах, способных к совершению сократительной работы без пауз отдыха, 9 и сделал допущение, что роль карнозина сводится к ускорению ресинтеза необходимых для мышечной работы макроэргических соединений. Данные Северина и Мешковой об ускоряющем влиянии карнозина на процессы окислительного фосфорилирования находились в полном согласии с высказанным предположением. Роль дипептидов в функции мышц. Неоднократно было показано, что работоспособность мышцы и содержание в ней дипептидов взаимосвязаны: так, мышца, несущая большую нагрузку, как правило, содержит больше дипептидов; в их присутствии возрастает работоспособность и изолированных мышечных препаратов. Что же управляет содержанием карнозина в мышечной ткани? Если карнозин представляет собой инертное депо запасаемых соединений, его уровень должен зависеть от содержания предшественников. Если накопление дипептидов имеет функциональное значение, их содержание должно коррелировать с функциональной нагрузкой ткани. Регуляция уровня карнозина в тканях. В нормальных физиологических условиях концентрация гистидина в тканях достаточна для эффективной работы карнозинсинтетазы, а при дефиците в пищевом рационе гистидина концентрация карнозина в тканях и у зрелых, и у развивающихся животных снижается. В анаэробных мышечных волокнах II типа, т.е. гликолизирующих, медленносокращающихся, концентрации карнозина и анзерина относительно более высокие, чем в волокнах типа I, окислительных, быстросокращающихся. В биоптатах средней ягодичной мышцы лошадей среднее содержание карнозина в волокнах типа I, типа ПА и типа IIВ составляло 54, 85 и 180 ммолей/кг сухой массы соответственно.Та же закономерность установлена для мышечных волокон I и II типа у крысы. В то же время стимулирующее действие дипептидов в процессе окислительного фосфорилирования, в частности в сохранении сопряженности между дыханием и образованием АТФ, не оставляет сомнений. Феномен Северина. Результаты изучения функционально и 10 морфологически различающихся мышц позволили сделать заключение о связи рассматриваемых соединений с функцией сократительной ткани и подкрепляли точку зрения Юдаева, согласно которой функциональные различия мышц базируются не только на морфологических, но и на биохимических различиях. На основании систематических исследований содержания дипептидов в мышечных волокнах разного типа С.Е. Северин сделал общее заключение, что мышцы, несущие большую функциональную нагрузку, содержат и большие количества карнозина или анзерина (или даже оба дипептида). Руководствуясь этим обстоятельством, С.Е. Северин предпринял прямую оценку значения карнозина и анзерина для мышечной функции. Опыты, описывающие характер влияния дипептидов на сократительную активность мышц, заключались в регистрации ритмических мышечных сокращений изолированного нервно-мышечного препарата, помешенного в ванночки в раствором Рингера (использовались нервно-мышечные препараты т. sartorius лягушки Rana temporaria). Карнозин быстро и эффективно увеличивал силу сокращений утомленного препарата, обеспечивая длительное последующее выполнение мышечной работы, зачастую превышающее объем работы, которую утомленная мышца могла выполнить после периода длительного отдыха. Такое действие дипептидов получило в литературе название феномена Северина. В более поздних экспериментах была показана убыль карнозина при интенсивной сократительной активности нервно-мышечного препарата лягушки, но оставалось непонятным, на что расходуется это соединение, поскольку этот процесс не сопровождался появлением гистидина и бетааланина. Механизмы действия карнозина на работоспособность мышцы 11 При мышечном сокращении возможна реализация нескольких путей, по которым дипептиды способны повышать работоспособность мышц. Дипептиды благоприятно влияют на сократительные структуры мышечной ткани, точнее на сократительную, и на ферментативную активность миофибриллярных белков. В присутствии карнозина формируется более отчетливая сократительная реакция глицеринированных мышечных волокон при добавлении АТФ и фосфокреатина. Карнозин значительно уменьшал пластифицирующее действие АТФ на пленочные актомиозиновые нити и в значительной мере снижал влияние расслабляющего фактора (фрагментов саркоплазматичес-кого ретикулума). Таким образом, первые исследования в этом направлении выявили влияние дипептидов непосредственно на регуляцию сократительной и ферментативной активности миофибриллярных белков. С другой стороны, была продемонстирована возможность участия дипептида в самом акте сокращения. Так, Yun, Parker показали, что имидазол, гистидин и карнозин активируют акто-миозиновую АТФазу. Более того, Parker, Ring в 1970 г. сообщили об активирующем влиянии карнозина на Mg-активируемую АТФазу миофибрилл. По данным этих авторов, карнозин в концентрации 10 мМ вдвое повышал активность АТФазы кролика и цыпленка, но не оказывал влияния на АТФазу миофибрилл омара, земляного червя и двустворчатого моллюска. Позже Avena, Bowen (1969) сообщили о том, что карнозин активирует и миозиновую АТФазу, и его действие проявляется при различных условиях. Авторы наблюдали также активирующее влияние анзерина, метилгистидина, гистидина и бета-аланина (по сравнению с трис-буфером). Транспорт ионов через клеточную мембрану Имеются сообщения о влиянии дипептидов и их предшественников на активный транспорт ионов через мышечную мембрану. Карнозин и анзерин активируют Na/K-АТ Фазу сарколеммы скелетных мышц кролика, а также 12 мембран эритроцитов. Показано также, что карнозин стимулирует транспорт натрия в мышце мочевого пузыря лягушки и это влияние реализуется через Na/K-A7 Фазу. В той же постановке опыта карнозин ингибировал активный транспорт натрия (Haulica ct al., 1968). Фрагменты саркоплазматического ретикулума, содержащие Са-насос, регулирующий мышечное сокращение через доступность для актомиозина ионизированного кальция, также испытывают благоприятное влияние дипептидов. Все приведенные данные в совокупности указывают на возбудимые мембраны как вероятный объект действия дипептидов. Связывание карнозина миозином Элюция миозина карнозином в ходе очистки карнозинсинтетазы из мышц цыплят методом аффинной хроматографии указывает на то, что миозин имеет карнозинсвязывающий участок. Это косвенно поддерживает предположение о том, что карнозин может быть физиологическим регулятором АТФазной активности миозина. Связывание карнозина митохондриями скелетных мышц Обнаружено, что при инкубации митохондрий скелетных мышц с дипептидами в процессе окислительного фосфорилирования карнозин может проникать в митохондрии и связываться с ними. Связывание происходит только в процессе образования АТФ, т.е. в присутствии различных субстратов дыхания - а-кетоглутарата, сукцината, пирувата, малата. В присутствии а-кетоглутаровой кислоты количество связанного карнозина растет дозозависимым способом вплоть до его концентрации 40 мМ, а затем начинает снижаться. При разобщенном дыхании и протекании АТФ-азной реакции избыточного связывания карнозина митохондриями также не происходит. В 13 отсутствие субстратов дыхания увеличение концентрации карнозина не приводит к его связыванию с мембранами митохондрий. Разница в количестве связанного карнозина при наличии и отсутствии а- кетоглутаровой кислоты за время инкубации отражает количество карнозина, проникшего внутрь митохондрий при окислительном фосфорилировании. Такая трактовка подтверждается тем, что ингибитор окислительного фосфорилирования олигомицин препятсявует связыванию карнозина в присутствии субстратов дыхания. По-видимому, связывание карнозина митохондриями обеспечивается мембранным потенциалом митохондрий, генерируемым в процессе сопряженного дыхания. Однако в отличие от митохондрий грудной мышцы митохондрии сердца не накапливают карнозин в процессе окислительного фосфорилирования. Это хорошо согласуется с отсутствием стимулирующего влияния карнозина на процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях сердечной мышцы голубя. Цитозоль содержит вещества, как усиливающие, так и ослабляющие влияние карнозина на окислительное фосфорилирование. Стимулирующим действием обладает высокомолекулярная (белковая) фракция. Вещества, ингибирующие действие карнозина, имеют низкую молекулярную массу. Они удаляются при диализе цитозоля, а при ультрафильтрации попадают в низкомолекулярную фракцию. Это позволяет предположить, что высокомолекулярная фракция цитозоля содержит белок, регулирующий проникновение карнозина в митохондрии. Для решения вопроса о механизме этого явления исследовали способность карнозина связываться с цитозольными белками. Сравнение содержание карнозина в ультрафильтрате плазмы скелетных мышц лягушки и ее в трихлоруксусном (ТХУ) фильтрате указывало на возможность специфического взаимодействия карнозина с белками мышц. При осаждении белков ТХУ происходят их денатурация и нарушение связи с карнозином. В результате увеличивается концентрация карнозина в 14 ТХУ-фильтрате по сравнению с ультрафильтратом, так как при ультрафильтрации белок остается в нативном состоянии. Убыль карнозина в ультрафильтрате по сравнению с ТХУ-фильтратом составляет 32-36%. Таким образом, связывание карнозина с сократительными белками составляет 3236%, в то время как альбумин задерживает только 9% карнозина, т.е. почти в 4 раза меньше. По-видимому, остальной карнозин связывался со специфическими белками мыщц ионно-солевыми связями. Модельные эксперименты показали, что карнозин, добавленный к изолированным митохондриям печени крысы, увеличивает скорость АДФстимулируемого дыхания с кетоглутаратом (но не с сукцинатом), а также эффективность окислительного фосфорилирования более чем на 50%. Рост эффективности окислительного фосфорилирования наблюдался также в митохондриях, изолированных из печени крыс, адаптированных к гипобарической гипоксии. После добавления к митохондриям печени глу-тамата и малата или пирувата и глутамата отмечена активация АДФ-стимулируемого дыхания. Это сопровождалось активацией аминотрансферазы и устранением ингибитора трансаминазы за счет аминооксиацетата. Добавление карнозина к митохондриям (как и его накопление в митохондриях при гипоксии) приводило к активации окисления а-кетоглутарата. Способность карнозина проникать в митохондрии и связываться с ними открывает для него возможность участия в процессах окислительного фосфорилирования. Гистидин и имидазол не могут заменить карнозин в его действии на окислительное фосфорилирование; соответственно митохондрии грудной мышцы гораздо хуже связывают гистидин и имидазол, чем карнозин. Значит ли это, что среди мышечных белков имеется рецептор для карнозина, остается пока неизвестным. Действие карнозина на Са-транспортирующие системы в клетке 15 Процесс сокращения мышц различных типов регулируется путем изменения концентрации Са2 в миоплазме, находящегося под контролем Саканалов и Са-насосов. Изучение свойств Са-насоса и регуляции его функции являлось важной задачей на пути к пониманию особенностей сократительного цикла различных мышц в норме и при развитии патологических процессов. Большая часть внутриклеточного Са2+ в мышце сосредоточена во внутренних полостях саркоплазматического ретикулума (CP) - сети мембран, оплетающих миофибриллы и являющихся основным компонентом электромеханического сопряжения. Нервный импульс, приходящий к мышечной клетке, распространяется от синапса по сарколемме вдоль волокна и по Т-системе - внутрь его и, достигнув полости CP, вызывает выброс соответствующей порции ионов Са2+. Эти ионы диффундируют к миофибриллам, взаимодействуют с регуляторными белками, контролирующими образование актомиозина. В результате этих процессов развивается сократительный ответ. Расслабление мышцы обеспечивается аккумуляцией выброшенного кальция Са-насосом СР. Природные ГСД, являющиеся биологическими регуляторами во многих системах, оказывают регулирующее влияние на процессы возбуждения и сокращения в скелетной мускулатуре. Их действие локализовано на уровне электромеханического сопряжения. Дипептиды карнозин и анзерин ускоряют создание Са-градиента фрагментами CP кролика. Этот процесс происходит за счет увеличения эффективности аккумуляции Са2+, а скорость гидролиза АТФ Са-зависимой АТФазой изменяется незначительно. С помощью кинетических методов показано, что дипептиды влияют на Са-аккумулирующую функцию CP, изменяя соотношение между входом и выходом Са2+ из везикул в сторону уменьшения выхода: они увеличивают значение константы для Са2+, характеризующей скорость пассивного выхода кальция из CP. Влияние дипептидов на транспорт Са2+ в CP специфично: 16 оно не объясняется буферным действием этих соединений. В присутствии оптического изомера природного карнозина - D-карнозина (бета-аланил-Огистидина) увеличения скорости аккумуляции по сравнению с синтетическим (трис-HCl) буфером не наблюдалось. После денервации быстрой скелетной мышцы влияние дипептидов на транспорт Са2+ в CP исчезает. Это действие можно, как и в опытах Мешковой, рассматривать как иллюстрацию мембранопротекторного эффекта. Наибольшее значение Са/АТФ при аккумуляции Са2+ фрагментами CP из мышц лягушки наблюдается в присутствии карнозина, тогда как при использовании CP из мышц кролика значения Са/АТР в среде с карнозином или анзерином были почти одинаковыми. Интересно напомнить, что скелетные мышцы лягушки содержат только карнозин, тогда как мышцы кролика - оба дипептида. В присутствии карнозина константа для выхода кальция увеличивалась почти в 2 раза. С одной стороны, это приводило к увеличению скорости аккумуляции Са2+ за счет увеличения эффективности транспорта и должно было обещать в условиях in situ ускорение стадии расслабления мышцы. С другой стороны, этот факт приводил к повышению градиента кальция и сбереганию его в полостях СР. В некоторых случаях, например при утомлении, когда запасы Са2+ в клетке перераспределяются таким образом, что часть его оказывается в митохондриях, снижение градиента кальция в CP может привести к замедлению стадии сокращения мышцы. В этом случае дипептиды могут ускорять и стадию сокращения, и стадию расслабления работающей мышцы. Именно так влияют дипептиды на процесс одиночного мышечного сокращения: они укорачивают как фазу сокращения, так и фазу расслабления утомленной скелетной мышцы лягушки. Эти эксперименты показали, что еще одной точкой приложения действия карнозина могут быть Са-каналы. 17 Было показано, что карнозин является эндогенным регулятором Саканалов саркоплазматического ретикулума скелетных мышц, от которого зависит сродство этих каналов к различным лигандам. Исследование фракции CP, рианодинового содержащей типа (так Са-каналы, называемая управляемые рецепторами тяжелая фракция ретикулума) позволило установить, что карнозин активирует эти рецепторы, вызывая выброс Са2+ в среду. Родственные соединения обладали различной эффективностью: анзерин и карцинин были вдвое эффективнее карнозина, а офидин действовал существенно слабее. Бета-аланин, гистидин и его метилированное и ацетилированное производные были практически неэффективны. Гомокарнозин, карнозин и их ацетилированные производные оказывают инотропное действие и на мышцу сердца, которое проявляется в увеличении чувствительности к кальцию миофиламентов сердца крысы. Карнозин и анзерин в работающей мышце Интенсивная сократительная работа нервно-мышечного препарата лягушки сочетается с убылью карнозина, и эта убыль не сопровождается появлением в среде гистидина и бета-аланина. Имеет ли отношение эта убыль к совершению мышечной работы и осуществляется ли метаболизм гистидиновых соединений в работающей мышце, оставалось неясным. Эти проблемы и находились в центре внимания Стволинского в исследовании, проведенном с помощью протонной ЯМР-спектроскопии, которая позволяет одновременно определять не только ГСД, но и другие соединения, отражающие метаболическую активность ткани. В экспериментах использовали самцов крыс линии Киото-Вистар; животные были разделены на 4 группы. Крысам I группы однократно вводили перорально 0,5 мл физиологического раствора. Крысам 11 группы таким же способом вводили карнозин из расчета 250 мг на 1 кг массы, а животным III 18 группы - физиологический раствор, после чего через 20 мин их подвергали интенсивной физической нагрузке в течение 20 мин. Животные IV группы получали через зонд карнозин за 20 мин до такой же физической нагрузки. Для ЯМР-спектроскопии использовали водно-спиртовые экстракты тканей. Во всех исследованных типах мышц суммарное содержание дипептидов не меняется при введении в организм карнозина. В то же время при мышечной нагрузке (животные III и IV групп) возрастает количество дипептидов в мышечной ткани главным образом за счет анзерина. При этом в суммарном содержании дипептидов в мышцах у животных III и IV групп различий не наблюдается. Другими словами, работоспособность, но введение не карнозина, приводит к хотя накоплению и увеличивает исследованных дипептидов в мышечной ткани. Таким образом, в целом организме наблюдаются те же закономерности, которые ранее были показаны на изолированных мышечных препаратах. В условиях интенсивной мышечной нагрузки как в мышцах, так и в мозге выявляются характерные изменения уровня лактата. Мышечная работа приводила к возрастанию содержания лактата в мозге, сердце и некоторых мышцах. В мышцах голени и четырехглавой мышце бедра содержание лактата снижалось. Предварительное введение карнозина обеспечивало более низкий по сравнению с контролем уровень лактата в мышцах интенсивно работавших животных, что указывало на глубокое воздействие карнозина на общий метаболизм. В то же время введение карнозина животным, не имевшим физической нагрузки, на уровень лактата в тканях влияния не оказывало. В условиях целого организма введение карнозина отчетливо уменьшает количество лактата в мышце, вероятно, способствуя лучшей диффузии молочной кислоты в кровь. Получавшие карнозин животные отличались более высокой двигательной активностью, лучшей способностью 19 ориентироваться в пространстве и большей выносливостью; после декапитации от них удавалось получить большее количество крови вследствие меньшего кровенаполнения паренхиматозных органов. Проведенное исследование показывает, что в условиях целого организма в ходе физической нагрузки наблюдаются динамические изменения содержания карнозина и анзерина и их соотношения, указывающие на непосредственное участие дипептидов в выполнении мышечной функции. Севериным и его сотрудниками было показано, что карнозин тесно связан с функциональной активностью мышечной ткани: он появляется в онтогенезе в период формирования нервно-мышечных контактов, его содержание соответствует интенсивности мышечной функции, а при мышечных патологиях его накопление мышечной тканью стремительно снижается. Первая гипотеза о механизме действия карнозина и его производных, обнаруженных при исследовании его метаболизма в тканях (карцинина, анзерина, офидина, гомокарнозина и их ацетилированных производных), приписывала этим соединениям роль эффективного природного буфера протонов, препятствующего закислению активно метаболизирующей ткани. Карнозин может также связывать ионы некоторых металлов (железа, меди, кадмия), предотвращая их токсическое действие, а также служить осморегулятором (что особенно важно для «проходных» рыб, меняющих при половом созревании среду обитания). В 1984 г. было показано, что карнозин имеет способность препятствовать окислительному повреждению клеточных мембран, то есть выполнять функцию тканевого антиоксиданта. Анализ этой способности показал, что карнозин может защищать белки, липиды, а также нуклеиновые кислоты возбудимых тканей от окислительного повреждения. Оказалось, что он также способен препятствовать модификации белков 20 углеводами, гликированию, которое делает невозможным нормальное функционирование белковых молекул в клетке. В 2000 г. на международной конференции в Москве, было подчеркнуто, что эта многофункциональная молекула выполняет функции природного протектора возбудимых тканей. В случаях, при которых природные механизмы антиоксидантной защиты нарушаются, что имеет место при возрастных изменениях, нейродегенеративных заболеваниях, а также при нарушениях кровоснабжения мозга и сердца, можно считать оправданным применение карнозина в качестве лекарственного средства. В 2001 г. на двух языках (русском и английском) А.А. Болдырев выпустил книгу «Гистидин-содержащие дипептиды возбудимых тканей», в которой обобщил успехи мировой науки в исследовании карнозина и его производных. В настоящее время карнозин выпускается во многих странах в качестве пищевой добавки и рекомендуется для улучшения качества питания, для устранения последствий эмоционального стресса, при компенсации истощающей физической нагрузки, а также в спортивной медицине. Имеется опыт положительного применения карнозина как антиаллергического средства, укрепляющего природный иммунитет организма. 21 3. Методические рекомендации по применению бета-аланина и карнозина с целью повышения адаптации к физическим нагрузкам спортсменов, занимающихся видами спорта на выносливость и скоростно-силовыми видами спорта Исследования в области спорта показали, что бета-аланин поднимает уровень карнозина в мышцах и тем самым повышает результативность тренировок. В 2005 году, на ежегодной встрече Американского колледжа спортивной медицины были представлены результаты перекрестного исследования, в ходе которого коллектив ученых под руководством д-ра Хилла наблюдал за влиянием потребления бета-аланина (от 4 до 6,5 г в день) на уровень карнозина в мышцах и спортивные показатели нетренированных добровольцев. В среднем карнозин поднялся на 58% к четвертой неделе и еще на 15% к десятой неделе эксперимента. Кроме того, ученые отметили 16%-ное увеличение общей работы в тестах на велоэргометре на четвертой и десятой неделе. В другом исследовании, представленном доктором Джефом Стаутом (Jeff Stout) на ежегодной конференции Общества спортивного питания в 2005 году, было рассмотрено влияние бета-аланина (1,6-3,2 г в день) на рабочую мощность в районе порога утомления у нетренированных мужчин. В результате было зафиксировано 9%-ное увеличение порога утомления и было выдвинуто предположение о том, что прием бета-аланина отодвигает момент наступления нейромышечного утомления. Из научных исследований следует, что карнозин в основном концентрируется в мышечных волокнах типа II. Это даже более очевидно для волокон типа характеристиками. IIX, отличающихся Мышечные волокна быстро типа II сокращающимися превалируют среди спринтеров, и спортсменов, специализирующихся в силовых видах спорта (профессиональные бодибилдеры, штангисты). Теоретически именно это 22 обстоятельство позволяет им строить значительную мышечную массу быстрее и легче. Кроме того, карнозина больше в тех мышцах, которые обладают низким рН (например, у водных млекопитающих). Снижение рН вовсе не является следствием накопления лактата, как думали раньше, а скорее результатом производства ионов водорода в рамках процесса генерации энергии. Как и у названных млекопитающих, собственные системы человека могут быть поставлены в условия длительного снижения рН, когда он работает с высокой интенсивностью. В этом случае происходит значительное возрастание выработки энергии, и в биохимическом смысле это может привести к некоторым осложнениям, например, при забеге на 800 м или тренировке с тяжестями производство ионов водорода значительно увеличивается. С их высвобождением уровень рН в мышцах начинает падать, что ведет к снижению выработки усилий и в конечном итоге к утомлению, если не удается предотвратить уменьшения рН. Степень, в которой карнозин сможет отодвинуть наступление ацидоза (снижение рН), зависит от его концентрации в мышцах, и именно здесь пищевые добавки могут сыграть свою роль. Несомненно, наиболее эффективен он будет для спринтеров или тренирующихся с тяжестями. Было зафиксировано увеличение запасов карнозина в мышцах, причем, уровень его был настолько высок, что на карнозин можно было списать более половины буферизирующей мощности скелетных мышц (4050 ммоль/кг-Ww, т.е. в три раза выше показателя нетренированных людей). Это говорит о том, что упражнения, требующие значительного производства АТФ повышают уровень карнозина в мышцах, что положительно отражается на спортивных показателях. В ходе другого известного исследования д-р Паркхаус (Parrkhouse) и его коллеги проанализировали образцы мышц нескольких спортсменов. 23 Более высокий уровень карнозина оказался у спортсменов спринтерских и силовых видов спорта по сравнению с видами спорта на выносливость. Исследование, проведенное в 2002 году д-ром Сузуки (Suzuki), показало, что концентрация карнозина в мышечных волокнах типа IIХ (быстросокращающихся) напрямую связана с выходом мощности в течение 30-секундного спринтерского велозаезда. Основываясь на этих данных и на том факте, что концентрация карнозина в волокнах типа II почти вдвое выше, чем в волокнах типа I (медленно сокращающихся, выносливостных), можно сказать, что карнозин является соединением, идеально подходящим бодибилдерам, спринтерам или любым атлетам, выполняющим высокоинтенсивные упражнения с сопротивлением. По пищевой добавке бета-аланин имеются данные, представленные в 2005 году на ежегодной встрече Американского колледжа спортивной медицины в Нэшвилле (Теннесси). Доказано, что увеличение содержания карнозина в мышцах, достигнутое благодаря приему бета-аланина, привело к повышению способности выполнять упражнения с максимальными усилиями. Участники эксперимента проходили тест на велоэргометре для выяснения уровня в 110% от финального максимального выхода мощности. Им давали нагрузку в 110% мощности и оценивали степень утомления. Затем участники эксперимента получали или бета-аланин или плацебо и снова проходили тест в четвертую и десятую недели опыта. Исследование однозначно показало, что прием бета-аланина повышает результативность мышечной работы и упражнений. В отличие от гистидина, потенциал бета-аланина по синтезу карнозина впервые был описан исследованием на клеточных культурах еще в 1994 году. Работа тех же авторов, которые выявили многие важные функции карнозина, показала, что бета-L-аспартил-L-гистидин служит естественным биологическим предшественником карнозина и метаболизируется точно так же, как карнозин. 24 Для определения доз следует обратиться к исследованиям д-ра Марка Даннета (Mark Dunnett), который написал докторскую диссертацию о карнозине. Доктор Даннет продемонстрировал, что прием 100 мг бетааланина на килограмм веса тела в течение 30 дней в сочетании с гистидином в дозе 12,5 мг на килограмм веса тела увеличил уровень карнозина в мышечных волокнах типа IIВ лошадей на 18%. Позднее, в 2003 году, исследование, представленное Американским колледжем спортивной медицины, показало, что потребление индивидами 800 мг бета-аланина четыре раза в день на протяжении пяти недель значительно подняло уровень карнозина в мышцах. Диетарные исследования с использованием карнозина проводились редко. Начальные сведения по синтезу карнозина были получены при изучении строгих диет или при исключении из рациона одной из аминокислот, составляющих карнозин. В результатах одного из таких экспериментов, где ученые ограничивали поступление карнозина в организм на период от 24 дней до 12 недель, обнаружено значительное снижение уровней мышечного карнозина. Это указывает на необходимость потребления карнозина в условиях строгой диеты. До настоящего времени было проведено четыре эксперимента на людях с целью выяснения путей увеличения запасов карнозииа в мышцах. В трех из них исследовался бета-аланин, в одном - карнозин. Эксперименты продолжались от четырех до десяти недель, и в каждом из них был отмечен рост запасов мышечного карнозина при дополнительном приеме бетааланина или карнозина. Кроме того, потребление карнозина или бета-аланина в виде пищевых добавок повышает уровень карнозина в волокнах типа I и II почти одинаково, а это означает возможность эффективного применения данных соединений не только при анаэробных упражнениях, но и при высоко интенсивней аэробной активности. 25 Исследования показывают, что около 3,2 г бета-аланина в день, скорее всего, могут обеспечить желаемые результаты, но лишь после четырех недель регулярного использования. 1 г бета-аланина дает такое же количество L-карнозина, как 80 г индейки. То есть, для получения минимально эффективной дозы карнозина потребуется съесть как минимум 0,5 кг индейки. Для сокращения мышцы ее должен покинуть кальций, а делается это, в частности, с помощью рианодин-рецептора (RR). Во время выполнения интенсивных упражнений высвобождение кальция может быть затруднено, что снижает способности мышцы к сокращению и выработке усилий. В теории это означало бы увеличение выработки усилий мышцей. Исследования показывают, что карнозин не только способен на это, но и усиливает свое воздействие в сочетании с кофеином. В ходе опытов ученые отметили, что эти два соединения значительно повышают способности мышечных волокон к продолжительной выработке усилий путем повышения высвобождения кальция системой RR. В дополнение к кофеину, углеводы в виде простых сахаров улучшают транспорт и окисление нутриентов. В недавно поставленном эксперименте сочетание углеводов и кофеина сравнивалась с только углеводами. Оказалось, что утилизация углеводов оказалась выше на 26% в случае приема вместе с кофеином. Такое повышение окисления помогает лучше поддерживать запасы гликогена в печени и мышцах, отодвигая порог утомления и повышая уровень инсулина быстрее, чем просто углеводы. Таким образом, если соединять углеводы с кофеином, можно повысить содержание бета-аланина и гистидина в мышцах и тем самым поднять уровень в них карнозина. В настоящее время карнозин входит в состав спортивного питания именно с этой целью - предотвратить накапливание химических побочных продуктов во время высокоинтенсивных занятий, понижающих pH концентрацию в мышечных клетках и приводящих к 26 усталости. Теоретически, удерживая высокий уровень pH, можно увеличить время занятия и улучшить его качество. Также было доказано, что карнозин является мощным антиоксидантом, который инактивирует вредные кислородные радикалы, и другие агрессивные соединения. Карнизин обладает большим числом дополнительных положительных эффектов: нейтрализует токсины, модулирует активность иммунной системы, поддерживает кровоток в мозге, благотворно влияет на сердечнососудистую систему, обладает нейропротективным действием и тормозит рост опухолей у опытных животных. Так же было показано, что карназин профилактирует развитие катаракты. Биологические эффекты карнозина • Увеличение выносливости за счет приема карнозина (бета- аланина) • Повышает выносливость при анаэробных нагрузках • Сокращает время отдыха • Увеличивает общую рабочую мощность тренировок Карнозин в спортивном питании Карнозин входит в состав многих добавок, однако чаще всего в спортивном питании встречается бета-аланин. Попадая в пищеварительный тракт, карнозин разрушается до бета-аланина и гистидина пептидазами, поэтому нет никаких преимуществ в употреблении карнозина, по сравнению с бета-аланином, при условии, что организм человека не испытывает недостатка в гистидине. Это подтверждается исследованиями, которые показали, что бета-аланин так же способствует повышению концентрации карнозина в мышцах, как и карнозин в чистом виде. Аминокислота бета-аланин не содержится в еде сама по себе, а является частью пептидов карнозина, ансерина и баленина, которые получают из мяса, рыбы и птицы. Организма человека также обладает 27 способностью синтезировать бета-аланин из нуклеотидов. Лучшим способом получить эту аминокислоту, является употребление спортивного питания, содержащего в своём составе бета-аланин. Конечным результатом анаэробного метаболизма в мышцах является молочная кислота. Как следствие, падает уровень pH в мускулах. Нарушение кислотно-щелочного баланса наступает в тот момент, когда нарушается равновесие между анаэробным и аэробным метаболизмом энергии и молочная кислота скапливается в мышцах. Когда уровень молочной кислоты достигает своего пика, он начинает мешать метаболизму энергии и сокращениям мышечных волокон - сигнал об усталости и окончании подхода к упражнению. Многообразие терапевтических (противовоспалительный, бактериостатический, эффектов карнозина иммуномодулирующий, регуляторный антиоксидантный и др.) позволило считать, что данный фактор играет ключевую роль в поддержании оптимального баланса в организме т.е. гомеостаза. Дефицит карнозина, встречающийся и у здоровых людей сопровождается понижением работоспособности, ухудшением сопротивляемости различным заболеваниям и общей утомляемостью. Как известно, старение, прежде всего, характеризуется усиливающимися нарушениями гомеостаза и, одновременным уменьшением содержания карнозина. Недавно был обнаружен омолаживающий эффект карнозина в культуре клеток соединительной ткани - фибробластов. В присутствие карнозина старые клетки оставались долго молодыми. Более того, добавление карнозина к стареющим клеткам возвращало им молодость и увеличивало их способность к делению. В основе эффекта омоложения (ревитализации) карнозином, как считают учёные, могут играть основную роль его свойства как антиоксидантна, хелатора (захватчика) ионов тяжёлых металлов и 28 перехватчика сахаров, которые, присоединяясь к белкам, приводят к образованию поперечно-сшитых молекул. Вместе с тем некоторые клетки организма (мускулатура, нейроны мозга, хрусталик и др.) не делятся, а обновляют себя изнутри. И как оказалось именно в этих клетках особенно много карнозина. Основным физиологическим механизмом поддержания молодости этих клеток является удаление повреждённых белков (протеолиз) в специальных устройствах – протеосомах, активность которых с возрастом падает. Карнозин усиливает протеолиз, причём особенно сильно в старых клетках и несколько меньше в стареющих, компенсируя тем самым снижение протеолитической активности клеток. Неоднократно было доказано, что работоспособность мышц возрастает при увеличении содержания карнозина. Более того, как показал академик С.Е.Северин, карнозин быстро и эффективно увеличивает силу сокращений утомлённой мышцы, обеспечивая длительное последующее выполнение мышечной работы, зачастую превышающее ту, которую мышца могла бы выполнить после периода длительного отдыха. Применение препарата на основе карнозина не только повышает работоспособность мышц и ускоряет процессы восстановления организма после тренировок, но и увеличивет физические возможности организма, особенно в экстремальных условиях. Во многих областях медицины врачи отмечают благотворное влияние увеличения уровня карнозина. Терапевты отмечают заметное улучшение кровообращения, стоматологи эффективность лечения пародонтоза, офтальмологи - ранних стадий катаракты, отоларингологи - тугоухости, косметологи заметное улучшение состояния кожи. Было организовано клиническое изучение влияния севитина (активное вещество L-карнозин в дозировке 250 мг) на физическую работоспособность у спортсменов (проф. Р.Д. Сейфулла, МНПЦСМ). На основании проведенной работы оказалось возможным констатировать, что «Севитин» при курсовом 29 применении оказывает положительное действие на показатели физической работоспособности спортсменов в аэробной и смешанной зонах энергообеспечения, что чрезвычайно важно для коррекции выносливости спортсменов. При анализе биохимических показателей «Севитин» предотвращал повышение лактата в крови спортсменов, сохранял уровень глюкозы и содержание белка. Ежедневный прием «Севитина» является быстрым способом усиления устойчивости организма и облегчения переносимости физических и эмоциональных нагрузок. Препарат не только повышал тонус, сохранял желание тренироваться, но и ускорял процессы восстановления организма спортсменов. Характерно, что в этих условиях было продемонстрировано увеличение физических возможностей организма практически в экстремальных условиях. Поскольку «Севитин», исходя из классификации запрещенных допинговых средств Медицинской комиссии МОК, не содержит допинговых компонентов, он может быть рекомендован для широкого применения в спортивной медицине. Карнозин сочетает в себе свойства антиоксиданта и мембранопротекторного соединения, способного повышать устойчивость клеточных мембран к действию различных повреждающих факторов. Проведенные Томским НИИ психического здоровья (д.м.н. Бохан Н.А., д.м.н. Прокопьева В.Д.) испытания действия на больных алкоголизмом показали, что данный препарат способен повышать устойчивость эритроцитов к действию гемолизирующих факторов, предохранять клетки от структурных повреждений. Хроническими окклюзирующими заболеваниями артерий нижних конечностей страдает 2-3% населения, из них на долю окклюзионных поражений артерий нижних конечностей атеросклеротического генеза приходится до 90% больных. Рецидивирующая ишемия, являющаяся характерной особенностью облитерирующего атеросклероза артерий нижних 30 конечностей, приводит к тому, что молекулярный кислород, который необходим для поддержания жизнеспособности клетки, может при определенных условиях запускать патогенетические процессы, вызывающие в конечном итоге тканевое повреждение. Обнаружение патогенетической роли свободнорадикальных процессов в возникновении и развитии облитерирующего атеросклероза нижних конечностей обосновывают целесообразность обладающих антиоксидантным и применения цитопротекторным препаратов, эффектом для комплексной терапии таких пациентов. То обстоятельство, что карнозин оказался эффективным фактором усиливающим микроциркуляцию и кровоснабжение тканей, позволило рекомендовать «Севитин» для лечения облитерирующего эндоартериита. Такие испытания были проведены в 20052006 гг. (д.м.н. Баранов А.П. – ГОУ ВПО «РГМУ Росздрава). Было показано, что изучение эффективности и безопасности БАД «Севитин» (2 таблетки по 250 мг 3 раза в сутки на фоне приема аспирина 125 мг однократно) у амбулаторных пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, IIа-IIб стадий. Таким образом, можно сказать, что арсенал практической медицины пополнился новым средством с широким спектром действия, важным достоинством которого является его тождественность соединениям, присущим организму человека. Реконмедуемая доза приема бета-аланина составляет 3,5 г в сутки в течение 4-5 недель для спортсменов, специализаирующихся в видах спорта на выносливость и 4,5 г в сутки в течение 4-5 недель для спортсменов, специализаирующихся в скоростно-силовых видах спорта. 31 Заключение Карнозин (бета-аланил-L-гистидин) - дипептид природного происхождения, широко встречающийся в тканях (преимущественно в быстрых мышечных волокнах и головном мозге) животных и человека. Карнозин влияет на метаболические процессы: гликолиз, окислительное фосфорилирование. антиоксидантным Механизм и действия мембранопротекторным карнозина действием. обусловлен Карнозин ингибирует перекисное окисление липидов, усиливает антиоксидантную защиту, повышает устойчивость организма к воздействию различных патологических факторов при кислородозависимых состояниях. К настоящему времени продемонстрирована способность карнозина защищать клетки от окислительного стресса, а также увеличивать их устойчивость при избыточной функциональной нагрузке и при накоплении возрастных изменений. Карнозин снижает уровень ацидоза мышечных клеток и улучшает их сократительные свойства. Бета-аланин является естественным биологическим предшественником карнозина. Систематическое применение бета-аланина (3,5-4,5 г в день в течение 4-5 недель), как эргогенного вещества может существенно (до 80%) повысить уровень карнозина скелетных мышц человека, что способствует повышению физической работоспособности как тренированных, так и нетренированных лиц. Таким образом, применение бета-аланина и карнозина с целью повышения адаптации к физическим нагрузкам спортсменов может значительно повысить эффективность подготовки спортсменов. 32
