На правах рукописи Левцова Ольга Владимировна ДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ С БИОМЕМБРАНАМИ
advertisement
На правах рукописи Левцова Ольга Владимировна ДИНАМИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ НЕКОТОРЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ С БИОМЕМБРАНАМИ Специальность: 03.00.02. – “Биофизика” АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук Крупянский Юрий Федорович доктор химический наук Немухин Александр Владимирович Ведущая организация: Институт математических проблем биологии РАН, г. Пущино Защита состоится “ ” ноября 2008 г. в : на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория “новая”. С диссертацией можно ознакомиться факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Автореферат разослан: Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор в библиотеке “ биологического ” октября 2008 г. Т.Е. Кренделева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время наблюдается рост устойчивости инфекционных заболеваний к применяемым в медицине антимикробным препаратам. В этой связи все большее внимание привлекают мембранактивные антимикробные пептиды, к которым не возникает резистентность микроорганизмов. Изучение механизма действия и выявление закономерностей между первичной последовательностью, структурой и функциональной активностью мембранактивных антимикробных пептидов началось относительно недавно. До сих пор ведутся дискуссии по целому ряду фундаментальных вопросов формирования структуры пептид- мембранных комплексов. В связи с этим изучение методами полноатомного молекулярного моделирования взаимодействия мембран активных пептидов с биомембранами является актуальным как с прикладной точек зрения. В перспективе фундаментальной, так и с эти исследования позволят конструировать принципиально новые мембранактивные агенты с заданной активностью и специфичностью. Цель исследования. Объектом исследования данной работы является зервамицин IIB (ZrvIIB) – представитель класса пептаиболов, продуцируемый грибом Emericellopsis salmosynnemata, который проявляет каналообразующую активность. Целью настоящей работы было исследование динамики и механизма действия ZrvIIB на атомном уровне методами равновесной и управляемой молекулярной динамики. Основные задачи исследования. Определение с помощью полноатомых моделей 1. Стабильности спиральной структуры зервамицина IIB в воде и в метаноле. 2. Влияния точечных аминокислотных замен на изменение амплитуды шарнирных движений, изгибающих спираль по сравнению с длинными пептаиболами. 1 3. Сравнение связывания молекулы зервамицина IIB с поверхностью модельных мембран эукариот, состоящих из пальмитоилолеоилфосфатидилхолиновых (ПОФХ) липидов, и мембран прокариот, состоящих из молекул пальмитотлолеоилфосфатидилэтаноламиновых (ПОФЭ) пальмитоилолеоилфосфатидилглицероловых (ПОФГ) соотношении действием 4:1 соответственно, под и липидов в внешнего электрического поля. 4. Оценка взаимовлияния молекул зервамицина IIB на связывание с модельной мембраной прокариот. 5. Изучение динамики встраивания молекул зервамицина IIB в мембрану и оценка эффектов агрегации 4, 5 и 6 молекул зервамицина IIB с образованием проводящего канала в модельной мембране прокариот. Научная новизна и практическая значимость работы. В данной диссертационной работе впервые: 1. методом МД показана стабильность спиральной структуры в воде, в метаноле и на поверхности мембраны. 2. исследованы шарнирные движения ряда мутантов и определена последовательность аминокислотных остатков, отвечающая за изменение их амплитуды в растворителях различной полярности. 3. показана склонность молекул зервамицина IIB к димеризации на поверхности мембраны 4. определена динамика встраивания молекулы зервамицина IIB в мембрану 5. предложены модели каналов, состоящие из 4, 5 и 6 молекул зервамицина IIB Полученные данные позволили предложить детальную модель механизма действия зервамицина IIB и определить функциональную роль отдельных остатков. 2 Достоверность результатов диссертации обеспечивается использованием универсальных законов и уравнений классической и квантовой механики и проведением тестовых расчетов систем, сравнимых с экспериментальными данными Апробация работы. Результаты данной работы были представлены на международной конференции «Ломоносов-2005» (Москва 2005 г.), на третьем съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2005 г.), на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, 2005 г.), на пятой международной конференции по биоинформатике и геномной регуляции и структуре (Новосибирск, «Ломоносов-2007» 2006 (Москва, г.), 2007 на г.), международной на четвертом конференции международном симпозиуме по компьютерным методам в токсикологии и фармакологии (Москва, 2007 г.), биотехнологической выставке «РосБиоТех-2007», на третьей международной школе по молекулярному моделированию в биологии и науках о материалах (Дубна, 2008 г.) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, включая 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней, 2 статьи находятся в печати. Личный вклад автора. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке задач, проведении расчетов, обработке и анализе результатов, подготовке статей и докладов на конференциях, а также в разработке программного обеспечения для проведения, обработки и анализа результатов экспериментов. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа ( ___ страниц) состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы ( ___ ссылки), иллюстрирована ___ рисунками и содержит ___ таблицы. 3 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы задачи работы, кратко охарактеризованы методы и их решения, отражены научная новизна и практическая значимость результатов. В первой главе представлен краткий обзор литературы, посвященный биохимии и каналообразующему действию пептаиболов, в частности зервамицина IIB. Также проведен обзор работ по компьютерному моделированию длинного пептаибола – аламетицина. Во второй главе описаны основные методики проведения вычислительного эксперимента, методами равновесной и управляемой молекулярной динамики и методики экспериментальных исследований для изучения динамики пептид-мембранных систем. Также рассмотрено влияние различных параметров МД-протокола на динамику исследуемых систем. В третьей главе в полноатомном силовом поле исследована динамика зервамицина IIB и ряда его аналогов в воде и в метаноле и проведено сравнительное изучение стабильности спиральной структуры. Молекула зервамицина IIB имеет следующую первичную последовательность: Ace0-Trp1-Ile2- Gln3-Iva4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9-Hyp10-Gln11-Aib12-Hyp13-Aib14-Pro15-Phl16, где Aib - α-аминоизомаслянная кислота, Iva – D-изовалин, Phl – Lфенилаланинол, Hyp – L-4-транс-гидроксипролин. Начальная структура зервамицина IIB была взята из Protein Data Bank (код структуры 1IH9). В отличие от длинных пептаиболов, например аламетицина, которые не имеют определенной структуры вне поверхности мембраны, молекула зервамицина IIB обладает достаточно жесткой спиральной структурой в водном окружении и в метаноле. За 10 нс траектории среднеквадратичное отклонение (RMSD) Сα-атомов аминокислотных остатков составило порядка 1,4 Å. 4 Также молекула ZrvIIB не совершает высокоамплитудных движений, изгибающих спираль (шарнирные движения), которые свойственны для длинных пептаиболов (Shenkarev Z.O. и др., 2004). Для определения последовательности, отвечающей за амплитуду шарнирных движений, были изучены следующие 3 мутанта с заменами в области изгиба спирали: с заменой Aib-Gly в положении 7 (ZrvIIB-gly7) и 9 (ZrvIIB-gly9) и с добавленным Gly в 8-е положение (ZrvIIB-gly8). Амплитуда шарнирных движений оценивалась с помощью распределения плотности вероятности расстояния между N- и C-концами пептидов для всех 4-х пептидов в двух растворителях (вода и метанол). А Б В Рис. 1 А. Распределение расстояний между Сα-атомами первого и последнего остатков для молекулы зервамицина IIВ (при замене aib9 на gly9) в воде и в метаноле. Структура зервамицина IIВ с заменой aib9-gly9 в воде (Б) и в метаноле (В). (выделен Gly9) 5 В нативном зервамицине IIB и зервамицине IIB с заменой Aib-Gly в 7ом и 9-ом положениях не наблюдается высокоамплитудных шарнирных движений изгибающих спираль. Отметим, что ZrvIIB-gly9 в метаноле компактизуется за счет изгиба в области Gly9 (Рис. 1) благодаря реорганизации водородных связей, в воде подобных структурных изменений не наблюдалось. Добавление Gly в положение 8 полностью воссоздает консервативную последовательность Aib-Gly-Leu-Aib-Pro, ответственную за наличие высокоамплитудных движений в длинных пептаиболах. Для ZrvIIB-gly8 наблюдается появление значительных флуктуаций длины пептида в метаноле, в воде амплитуда колебаний значительно меньше. Это свидетельствует о том, что данная замена делает зервамицин IIB чувствительным к полярности растворителя: при уменьшении полярности жесткость структуры уменьшается, и появляются движения, изгибающие спираль. Рис. 2 . Распределение плотности вероятности расстояния между С атомами первого и последнего остатка молекулы зервамицина IIВ с добавленным остатком gly в 8-е положение в воде и в метаноле. Таким образом, в мутантах ZrvIIB-gly9 ZrvIIВ-gly8 наблюдаются определенные структурные изменения при уменьшении полярности растворителя. Это может критически повлиять на активность зервамицина II, 6 так как длина молекулы ZrvIIВ составляет около 24Å, при наличии шарнирных движений длина молекулы может уменьшаться до 16Å, как в случае с ZrvIIB-gly9, что недостаточно для образования мембранного канала. Также в данной главе определены водородные связи, которые отвечают за структурные изменения и подвижность в разных растворителях в каждом из четырех пептидов. В четвертой главе изучалось взаимодействие молекулы зервамицина IIB с модельными мембранами эукариот и прокариот. В качестве модели эукариотической клетки использовался липидный бислой состоящий из молекул ПОФХ, а для моделирования мембраны бактериальной клетки липидный бислой из ПОФЭ и ПОФГ в соотношении 1:4. Проводились 2 типа эксперимента: равновесная МД для изучения связывания зервамицина IIB с поверхностью мембраны и управляемая МД для изучения процесса встраивания пептида в липидный бислой, причем внешнее ускорение прикладывалось к различным атомам пептида. В начальной конформации молекула ZrvIIB помещалась выпуклой (полярной) стороной к поверхности мембраны на расстоянии 0,7 нм. При изучении поверхностного связывания молекулы зервамицина IIB с мембраной особое внимание уделялось ориентации пептида относительно поверхности, стабильности спиральной структуры и образованию водородных связей между аминокислотными остатками и молекулами липидов. Для определения положения пептида относительно поверхности мембраны в первые и последние 500 пс траектории было определено среднее положение Сα-атомов для каждого аминокислотного остатка молекулы зервамицина IIB относительно поверхности мембраны. Граница мембраны определялась как z координата (вдоль оси нормали мембраны) центра масс атомов фосфора. При взаимодействии ZrvIIB с липидным бислоем ПОФХ молекула ориентируется параллельно поверхности мембраны вогнутой (неполярной стороной), при этом молекула ZrvIIB не взаимодействует с гидрофобными 7 хвостами липидов, а остается в водном окружении, взаимодействуя с полярными головками липидов. Особую роль в стабилизации данной конформации пептида относительно мембраны играют остатки Gln3 и Gln11, которые взаимодействуют с полярными головками липидов и образуют три водородные связи. Остальные полярные аминокислотные остатки Thr6, Hyp10 и Hyp13 обращены в воду. Также наблюдается небольшое структурное изменение в области N-конца пептида, которое вызвано поворотом остатка Gln3 к поверхности мембраны. А Б Рис. 3 Положение Cα-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя ПОФХ (А) и ПОФЭ/ПОФГ (Б) в начальной конформацим и после 10нс равновесной динамики Молекула зервамицина IIB за счет ориентации внутримолекулярных водородных связей, стабилизирующих спираль, обладает дипольным моментом, направленным от С-конца к N-концу и приблизительно равным 50D, что эквивалентно зарядам +0,4е и -0,4е на N- и C-концах. Фосфатидилглицероловые липиды придают поверхности мембраны суммарный отрицательный заряд. Таким образом, N-конец молекулы ZrvIIB, несущий локальный положительный заряд, притягивается к поверхности мембраны, а С-конец удаляется от поверхности мембраны на расстояние ~ 1,7 нм. Внешнее электрическое поле также способствует такой ориентации пептида. Также как и в случае с мембраной ПОФХ, пептид взаимодействует исключительно с полярной частью мембраны, но в данном эксперименте Nконец входит в область липидных головок и образует как минимум четыре 8 водородные связи с молекулами липидов. В образовании водородных связей с полярными головками липидов участвуют остатки Ace0, Gln3 и Thr6. Также было исследовано взаимовлияние двух молекул ZrvIIB на процесс связывания с поверхностью модельной мембраны прокариот. В начальной конформации пептиды располагались параллельно друг другу на расстоянии 2,4 нм между центрами масс. Расстояние между молекулами зервамицина IIB сократилось за первые 6 нс с 2,4 нм до 1 нм. При этом молекулы образовали димер. В димере пептиды расположены параллельно друг другу. Две молекулы зервамицина IIB взаимодействуют гидрофобными областями, изолируя тем самым неполярные аминокислотные остатки от молекул воды и полярных головок липидов. Предположительно, образование такого димера должно облегчить прохождение молекул через область липидных головок. Как видно из Рис. 4, взаимодействие молекул зервамицина IIB в данном эксперименте с мембраной сильнее, чем в случае одиночной молекулы. Обе молекулы приблизились N-концами к липидам и расположены под углом ~ 20° к поверхности мембраны. N-конец основной цепи одной молекулы димера входит в область липидных голов ниже плоскости атомов фосфора. У второй молекулы основная цепь находится в водном окружении, но боковые радикалы 4-рех аминокислотных остатков находятся в области липидных голов. Вероятно, для дальнейшего встраивания в мембрану димер должен претерпеть конформационные изменения, чтобы гидрофобные аминокислотные остатки оказались снаружи и могли взаимодействовать с гидрофобными хвостами жирных кислот. 9 А Б Рис. 4 Положение Cα-атомов относительно атомов фосфора липидных головок бислоя в начальной конформацим и после 10нс равновесной динамики отдельно для каждой молекулы (А, Б). При взаимодействии с липидными головками молекулы зервамицина IIB образуют порядка 8 водородных связей. Молекула, которая глубже проникла в липидный бислой образует 3 водородные связи с участием боковых радикалов остатков Gln3 и Thr6. Второй пептид образует 5 связей с участием Ace0, Gln3, Thr6 и Gln11. Первая молекула, проникая в область липидных головок, стерически расталкивает молекулы липидов, тем самым, удаляя потенциальных доноров и акцепторов водородных связей. При взаимоперпендикулярном расположении двух молекул ZrvIIB на поверхности мембраны ПОФЭ/ПОФГ, через 16 нс наметилась тенденция к образованию комплекса. Таким образом, при высокой концентрации молекулы зервамицина IIB образуют димеры, однако при произвольном начальном положении пептидов на это требуется достаточно большое время, и не смотря на то, что этот процесс облегчает взаимодействие пептидов с мембраной, он не является обязательным. Для исследования динамики встраивания зервамицина в модельные мембраны прокариот и эукариот с помощью метода управляемой молекулярной динамики был проведен ряд численных экспериментов, в которых внешняя сила прикладывалась отдельно к С и N-концам и к Сαатомам. В качестве начальной структуры 10 использовались системы, состоящие из липидного бислоя и молекулы зервамицина IIB после 10нс релаксации на поверхности мембраны. В обеих исследуемых системах (с липидными бислоями ПОФХ и ПОФЭ/ПОФГ) под действием силы 4,3 ккал/(моль·Å), приложенной к Сконцу ZrvIIB в течение 10нс развернулся С-концом к мембране, но не углубился в область гидрофобных хвостов. Вероятно, это связано с торможением за счет образования водородных связей между остатками Hyp10, Gln11, Hyp13, Phl16 и липидными головками. В эксперименте, где сила 0,27 ккал/(моль·Å) была приложена ко всем Сα-атомам пептида, ZrvIIB в течение 10 нс оставался в области липидных головок параллельно поверхности бислоя. Когда сила была приложена к N-концу, пептид за 10 нс вошел в область липидных головок, не вызвав при этом структурных изменений в липидном бислое. Таким образом, данные численные эксперименты подтверждают гипотезу, что встраивание в мембрану происходит N-концом. Так как приложение силы ко всем Сα-атомам не привело к встраиванию пептида, можно сделать вывод, что воздействие на пептид, переводящее его из поверхностного состояния в трансмембранное, в основном направлено на N-конец молекулы, что хорошо согласуется с моделью потенциал-зависимой активации канала, согласно которой трансмембранный потенциал разворачивает дипольный момент молекулы, то есть «тянет» несущий локальный положительный заряд N-конца внутрь мембраны. На следующем этапе работы более детально был исследован процесс встраивания молекулы зервамицина IIB в липидные бислои. Для этого были рассчитаны три траектории, в которых к N-концу (к Cα-атому остатка ACE0) были приложены силы, равные 4,3; 5,7 и 8,6 ккал/(моль·Å) соответственно, с целью определить оптимальное значение силы для моделирования встраивания. При ускорении эквивалентном 4,3 ккал/(моль·Å) встраивание происходит медленно, и за 10 нс N-конец преодолевает только верхний монослой. Под действием 5,7 ккал/(моль·Å) ZrvIIB полностью встраивается 11 за 7 нс и остается в трансмембранной положении. При значении силы 8,6 ккал/(моль·Å) пептид проходит сквозь мембрану и выходит в водное окружение, не испытывая значительного торможения от энергетических барьеров. Таким образом, для изучения динамики встраивания ZrvIIB в липидный бислой было выбрано использовать значение внешней силы 5,7 (ккал/моль·Å). Рис. 5 Изменение z-координаты N-конца зервамицина IIB относительно границы мембраны ПОФХ под действием внешней силы Динамика встраивания ZrvIIB в липидный бислой ПОФХ происходит неравномерно. Можно выделить три стадии. В начале N-конец движется в водном окружении, приближаясь к липидным головкам. На первой стадии аминокислотные остатки Ace0-Tpr1-Ile2 входят в гидрофобную область мембраны. Далее Gln3 и Thr6 образуют водородные связи с полярными головками липидов и тем самым замедляют дальнейшее встраивание пептида. На второй стадии в гидрофобную область входят остатки Gln3Dva4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9, а Hyp10 и Gln11 взаимодействуют с полярной областью мембраны и вызывают замедление динамики встраивания. На третьей (заключительной) стадии весь пептид встраивается в липидный бислой. 12 А Б Рис. 6 Кулоновская, ван-дер-ваальсовская энергии взаимодействия и их сумма (энергия взаимодействия) для молекулы зервамицина IIB с липидами ПОФХ (А) и водой (Б) При встраивании молекулы ZrvIIB в липидный бислой энергия взаимодействия пептида с липидами, рассчитанная как сумма кулоновских и ван-дер-ваальсовских взаимодействий, уменьшилась на величину ~800 кДж/моль (Рис. 6). А энергия взаимодействия пептида с водой возросла примерно на 800 кДж/моль. Как видно из графиков, основной составляющей энергии взаимодействия пептида с водой является кулоновское взаимодействие, а пептида с липидами – ван-дер-ваальсовское. Однако в сумме они дают примерно одинаковые вклады в изменение энергии при встраивании. Таким образом, потенциальная энергия взаимодействия зервамицина IIB с окружением при встраивании в липидный бислой практически не изменяется. На графике зависимости энергии взаимодействия от времени видно изменение энергии на каждой стадии процесса встраивания. Так на первой стадии энергия падает приблизительно на 200 кДж/моль, на второй стадии на ~370 кДж/моль, а на третьей - на ~230 кДж/моль. Изменение энергии на каждой стадии пропорционально количеству аминокислотных остатков, вошедших в липидный бислой на данной стадии. При встраивании ZrvIIB в липидный бислой ПОФЭ/ПОФГ динамика движения N-конца пептида более линейна и стадийность не так ярко выражена. На первой стадии ZrvIIB погружается в липидный бислой до Gln3, 13 который, образуя водородные связи с липидными головками, удерживает пептид на поверхности. При этом пептид ориентируется перпендикулярно поверхности мембраны, так как сила дополнительно разворачивает пептид вдоль действия поля. В случае с ПОФХ мембраны из липидов такой сильный разворот не наблюдался. Это может быть объяснено отталкиванием отрицательно заряженного С-конца от поверхности мембраны. Дальнейшее продвижение пептида вызывает деформацию мембраны и изгиб спирали пептида за счет сильного взаимодействия положительного N-конца с отрицательно заряженной поверхностью мембраны. Липидные головки, находящиеся рядом с пептидом, двигаются вместе с ним в гидрофобную область мембраны. Через 7 нс Hyp10 образует водородные связи с липидными головками и частично разворачивает пептид к поверхности бислоя. В течение следующих 2-х нс разрываются водородные связи между Gln3 и липидными головками, и структура бислоя нормализуется. Пептид встраивается до Hyp10, который вместе с Gln11 взаимодействует с липидными головками. Последующие 5 нс продвижение N-конца в гидрофобную область мембраны вызывается распрямлением спирали пептида. Все это время Hyp10 и Gln11 находятся в области липидных головок. На последней стадии Hyp10 и Gln11 разрывают водородные связи с полярными головками и пептид полностью встраивается в липидный бислой. А Рис. 7 Кулоновская, Ван-дер-Ваальсова энергии взаимодействия и их сумма (энергия взаимодействия) для молекулы зервамицина IIB с липидами ПОФЭ/ПОФГ (А) и водой (Б) 14 Б На Рис. 7 видно, что энергия взаимодействия пептида с липидами при встраивании уменьшилась на величину порядка 600 кДж/моль, а энергия взаимодействия с молекулами воды увеличилась приблизительно на 400 кДж/моль. Следовательно, в процессе встраивания потенциальная энергия взаимодействия пептида с окружением уменьшается на ∼200 кДж/моль. Потенциальная энергия трансмембранного состояния в случае с мембраной ПОФЭ/ПОФГ меньше, чем для пептида, связанного с поверхностью бислоя. Однако, при одинаковой внешней силе времени на встраивание пептида в ПОФЭ/ПОФГ мембрану требуется больше, чем в случае с мембраной ПОФХ, что свидетельствует о том, что пептиду необходимо преодолеть более высокий энергетический барьер. При сравнении Рис. 6А и Рис. 7А видно, что во втором случае минимумы кулоновской энергии более выражены, что свидетельствует о более сильном взаимодействии полярных остатков с липидными головками. На суммарной энергии взаимодействия также видны энергетические барьеры, соответствующие образованию водородных связей остатков Gln3, Hyp10, Gln11 с липидными головками. Потенциальная энергия взаимодействия ZrvIIB с окружением при встраивании в мембрану ПОФХ не изменяется, а при встраивании в мембрану ПОФЭ/ПОФГ уменьшается на ∼200 кДж/моль, однако пептиду надо преодолеть более высокий энергетический барьер из-за более сильного взаимодействия пептида с головками липидов ПОФЭ и ПОФГ. В пятой главе исследовалась динамика трех моделей зервамицинового канала, состоящего из 4 (N4), 5 (N5) и 6 (N6) молекул ZrvIIB, в мембране ПОФЭ/ПОФГ, а также миграция иона Na+ через пору канала, образованного пятью молекулами ZrvIIB. Начальные структуры каналов собирались так, чтобы пептиды были расположены параллельно друг другу, и остаток Gln11 был обращен в пору канала. Конформационная стабильность молекул ZrvIIB в каналах была оценена с помощью среднеквадратичного отклонения (RMSD) относительно начального положения Сα-атомов пептидов. За 2 нс RMSD для тетрамера 15 выросло до 0,27 нм, в то время как RMSD для N5 и N6 каналов составило 0,17 нм и 0,16 нм соответственно. В начальной конформации каналов молекулы ZrvIIB были параллельны оси канала, после 10 нс в N5 канале пептиды повернулись под небольшим углом к его оси и сформировали суперспираль (Рис. 8А). В N6 канале молекулы ZrvIIB остались параллельно оси канала (Рис. 8Б). Вероятно, что формирование суперспирали стабилизирует канал и увеличивает время жизни. Предположительно, не только пентамер способен формировать суперспираль, но и каналы, состоящие из большего количества субъединиц. Но на такой процесс требуется больше времения, так как в согласованном повороте участвует большее количество молекул. А Б Рис. 8 Положение молекул зервамицина IIB в канале N5 (А - вид сбоку, Б - вид сверху) и в канале N6 (В - вид сбоку, Г - вид сверху). Прямыми и стрелками указаны направления молекул пептидов от N-конца к С-концу. Большее по сравнению с N5 и N6 каналами значение RMSD для тетрамера обусловлено отсутствием непрерывного ряда молекул воды в полости канала. Так как водородные связи, образованные молекулами воды в поре и гидрофильными аминокислотными остатками, стабилизируют положение пептидов в связке относительно другу друга. В случае каналов N5 и N6 непрерывная колонна молекул воды хорошо выражена (Рис. 9Б, В). В узких областях N5 канала количество молекул воды недостаточно для 16 формирования гидратной «шубы» проводимых ионов. На данных участках, вероятнее всего роль молекул воды гидратной оболочки выполняют атомы кислорода полярных остатков. В полости канала N6 молекул воды достаточно, чтобы проводимые ионы могли двигаться сквозь него, не нарушая целостность гидратной оболочки. А Б Рис. 9 Положение молекул воды в поре каналов N4 (А), N5 (Б) и N6 (В). Красным выделена область молекулы зервамицина, утратившая начальную спиральную структуру. В С помощью программы HOLE были получены профили радиусов для исследуемых каналов (Рис. 10). N4 канал имеет радиус поры ~0,2Å, что слишком мало для прохождения иона. Поскольку N4 не имеет выраженной колонны молекул воды в поре и радиус канала слишком мал, предположительно, тетрамер не формирует проводящий ионный канал, а является «предшественником» каналов из большего количества субъединиц. N5 и N6 каналы после 10 нс релаксации имеют по две области с минимальным радиусом (2.7 Å и 2.5 Å у N5; 3.8 Å и 3.7 Å у N6) обе эти области сформированы глутаминовыми кольцами (Gln3 и Gln11). Согласно теоретическим представлениям о структуре зервамициновых каналов, молекулы пептидов должны быть обращены полярной (выпуклой) стороной в полость канала, а гидрофобной (вогнутой) в область гидрофобных хвостов. В пентамере все полярные аминокислотные остатки обращены в полость канала или к соседним пептидам. К липидным хвостам направлены 17 только боковые радикалы гидрофобных аминокислотных остатков. В случае гескамера два полярных аминокислотных остатка (Thr6 и Hyp13) обращены в гидрофобную часть мембраны. Рис. 10 Профили радиусов для каналов N4, N5 и N6 после релаксации. Для исследования прохождения иона был выбран канал N5. Выбор обусловлен тем, что тетрамер не формирует проводящий канал, а радиус поры N6 канала достаточно большой и внутренний «интерьер» канала не сильно влияет на движение иона. Исследования проводились с помощью метода управляемой молекулярной динамики. К иону Na+ прикладывалась внешняя сила равная 4.38 ккал/(моль·Å). Ион под ее действием двигался от С-концов к N-концам пептидов. 18 А Б Рис. 11 А. Изменение z коодинаты (вдоль оси канала) иона Na+ от времени. Б. Зависимость энергия взаимодействия иона Na+ с молекулами зервамицина и воды от z-координаты. На Рис. 11А представлена динамика изменения z координаты (вдоль оси канала). Как видно, динамика движения не линейна, есть области, где скорость движения иона падает до нуля. Первая область соответствует самому узкому месту канала – кольцу Gln11, в этой области ион теряет часть молекул воды своей гидратной оболочки, и их место занимают атомы кислорода бокового радикала остатка Gln. Изменение энергии взаимодействия иона Na+ с молекулами зервамицина IIB и молекулами воды показано на Рис. 11Б. Энергия взаимодействия иона с окружением рассчитывалась как сумма Ван-дер-ваальсовых и кулоновских взаимодействий иона со всеми атомами окружения. Через 250 пс энергия взаимодействия с молекулами воды выросла на ~ 100 кДж/моль, что свидетельствует о потере молекул воды в гидратной оболочке. Далее на 450 пс траектории ион преодолевает кольцо Gln11 и переходит в более широкую область канала, где восстанавливает гидратную оболочку, о чем свидетельствует уменьшение энергии взаимодействия иона с водой. На 660 пс траектории ион попадает в зону второго глутаминового кольца, где также происходит частичная потеря гидратной оболочки, и в этой области снова наблюдается увеличение энергии взаимодействия с молекулами воды. Изменения энергии противоположны взаимодействия изменениям энергии 19 иона с молекулами взаимодействия с ZrvIIB водой, что свидетельствует о том, что атомы ZrvIIB замещают утерянные молекулы воды гидратной оболочки. Каждая реорганизации гидратной «шубы» является потенциальным барьером для движения иона через пору канала. Поэтому в этих областях наблюдается замедление движения. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Методами равновесной и управляемой молекулярной динамики были исследованы различные стадии действия антимикробных пептидов на примере зервамицина IIB. Было показано, что замены в области изгиба спирали Aib7-Leu8-Aib9Hyp10 способны не только изменить структуру и динамику молекулы зервамицина IIB и сделать его чувствительным к растворителю, а также могут в значительной степени сказаться на мембранной активности пептида. При взаимодействии молекулы ZrvIIB с модельной мембраной прокариот пептид ориентируется под углом к поверхности мембраны и направлен N-концом к ней. Данное положение стабилизируется водородными связями между остатками Ace0, Gln3 и фосфатными и аминными группами липидов. В случае с модельной мембраной эукариот ZrvIIB не входит глубоко в липидный бислой, а располагается параллельно поверхности. При этом Gln3 и Gln11 образуют водородные связи с полярными головками липидов. Димеризация молекул зервамицина IIB на поверхности мембраны способствует более глубокому проникновению пептидов в полярную область бислоя. Процесс приложенной встраивания ZrvIIB к N-концу, имеет под действием стадийный внешней характер. Сам силы, процесс встраивания происходит в три стадии: встраивание N-конца до Gln3, на втором этапе - до Hyp10, а на заключительной стадии - встраивание C-конца. Как было показано выше, сам процесс встраивания быстрее протекает для модельной мембраны прокариот. Однако в случае с модельной мембраной эукариот взаимодействие пептида с поверхностью липидного 20 бислоя сильнее. Таким образом, можно сделать вывод, что селективность действия зервамицина IIB имеет место не на стадии встраивания в мембрану, а на стадии адсорбции пептида на поверхности мембраны. Потенциальная энергия взаимодействия ZrvIIB с окружением при встраивании в мембрану ПОФЭ не изменяется, а при встраивании в мембрану ПОФЭ/ПОФГ уменьшается на ∼200 кДж/моль. Однако в этом случае пептиду надо преодолеть более высокий энергетический барьер. Согласно полученным данным четыре молекулы зервамицина IIB не формируют устойчивый проводящий канал, но служат «предшественником» для формирования каналов из большего числа субъединиц. Пентамер и гексамер формируют ионные каналы с минимальным радиусом пор 2.5 Å и 3.7 Å соответственно. Поры обоих каналов заполнены молекулами воды, однако в пентамере их количество не достаточно для проведения ионов без нарушения целостности гидратной оболочки. В случае гексамера одновалентные ионы могут проходить через пору канала без потери молекул воды в гидратной оболочке. Молекулы зервамицина IIB в пентамере поворачиваются относительно оси канала и формируют суперспираль, которая предположительно дополнительно стабилизирует канал. В гексамере все молекулы пептидов остаются параллельно оси канала. При формировании суперспирали в пентамере все боковые радикалы полярных аминокислотных остатков направлены в полость канала или в сторону соседнего пептида, а неполярные остатки в область липидных хвостов. В случае гексамера такого четкого разделения полярных и неполярных аминокислотных остатков не наблюдается. Вероятно, для этого необходим поворот пептидов относительно оси канала с формированием суперспирали. При прохождении иона через пору канала, образованного пятью субъединицами, происходит реорганизация гидратной оболочки в областях глутаминовых колец. В этих зонах движение иона значительно замедляется. Атомы кислорода боковых радикалов остатков Gln замещают потерянные молекулы воды гидратной оболочки. 21 ВЫВОДЫ 1. По данным численного моделирования молекула зервамицина IIB сохраняет стабильную спиральную структуру в воде, в метаноле и на поверхности мембраны в течение не менее 10нс 2. Последовательность Aib7-Leu8-Aib9-Hyp10 отвечает за отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в молекуле зервамицина IIB. Замены в этой области способны не только изменить структуру и динамику молекулы зервамицина II и сделать его чувствительным к растворителю, а также могут в значительной степени сказаться на мембранной активности пептида. 3. ZrvIIB лучше взаимодействует с поверхностью мембраны прокариот, чем эукариот, при этом в первом случае он ориентируется параллельно поверхности мембраны и не входит в область полярных головок, а во втором случае ориентируется под небольшим углом и N-конец входит в область полярных головок. 4. Образование комплекса из двух молекул ZrvIIB на поверхности мембраны способствует его встраиванию в мембрану. Встраивание в мембрану происходит в 3 стадии и начинается с N-конца. 5. Четыре молекулы ZrvIIB не образуют проводящий канал. Пентамер и гексамер образуют проводящие ионные каналы с двумя областями минимального радиуса, образованные глутаминовыми кольцами. 6. При прохождении иона через пору канала, образованного пятью молекулами ZrvIIB в областях сужения происходит частичная потеря ионом гидратной оболочки. Атомы кислорода боковых радикалов глутамина замещают молекулы воды гидратной оболочки при прохождении иона. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. К.Б.Терешкина, К.В. Шайтан, О.В. Левцова, Д.Н. Голик – Молекулярная динамика олигопептидов 6. Сравнительное изучение сечений Пуанкаре монопептидных структур в средах с различной гидрофобностью. // Биофизика, 2005, том 50 (вып.6), стр. 974-985. 2. D.Yu. Mordvintsev, Ya.L. Polyal, O.V. Levtsova, Ye.V. Tourleigh, I.E Kasheverov., K.V. Shaitan, Yu.N. Utkin and V.I. Tsetlin - A model for short α-neurotoxin bound to nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica: comparison with long-chain α-neurotoxins and αconotoxins // Computational Biology and Chemistry, 2005, vol. 29, pp. 398-411. 3. К.В.Шайтан, Е.В. Турлей, Д.Н.Голик, К.Б.Терёшкина, О.В.Левцова, И.В.Федик, А.К.Шайтан, М.П.Кирпичников - Молекулярная динамика и дизайн био- и наноструктур // Вестник биотехнологии, 2005, том.1 (вып. 1) стр. 66-78. 4. К.В.Шайтан, Е.В. Турлей, Д.Н.Голик, К.Б.Терёшкина, О.В.Левцова, И.В.Федик, А.К.Шайтан, А. Ли, М.П.Кирпичников – Динамический молекулярный дизайн био- и наноструктур // Российский химический журнал (ЖРХО им. Д.И. Менделеева), 2006, том L (вып.2), стр. 53-65. 5. К.В.Шайтан, Е.В. Турлей, Д.Н.Голик, К.Б.Терёшкина, О.В.Левцова, И.В.Федик, А.К.Шайтан, М.П.Кирпичников – Неравновесная молекулярная динамика и наноструктур, включая биологические // Химическая физика, 2006, том 25 (вып. 9), стр. 31-48. 6. Dmitry Y.Mordvintsev, Yakov L.Polyak, Dmitry A.Kuzmine, Olga V.Levtsova, Yegor V.Tourleigh and Igor E.Kasheverov – A Model for Short a-Neurotoxin Bound to Nicotinic Acetylcholine Receptor From Torpedo californica // Journal of Molecular Neuroscience, 2006, vol.30, pp. 71-72. 7. D.Yu. Mordvitsev, Ya.L.Polyak, D.A.Kuzmin, O.V.Levtsova, Ye.V.Tourleigh, Yu.N.Utkin, K.V.Shaitan, V.I.Tsetlin – Computer modeling of binding of diverse weak toxins to nicotinic acetilcholine receptors // Computational Biology and Chemistry, 2007, vol. 31, pp. 7281. 8. И.Н. Николаев, К.Б. Терешкина, О.В Левцова., М.Ю. Антонов, М.П Акимов., К.В. Шайтан - Сравнительное изучение динамики конформационных степеней свободы в серии природных дипептидов // Вестник Якутского государственного университета имени М.К.Аммосова, 2007, том.4 (вып. 2), стр. 37-44. 9. К.В. Шайтан, О.В. Левцова, К.Б. Терёшкина, И.А.Оршанский, 23 М.Ю.Антонов, М.П. Акимов, И.Н.Николаев - Молекулярная динамика олигопептидов. Сравнительное изучение взаимовлияния аминокислотных остатков в дипептидных структурах. // Биофизика, 2008, том 53 (вып. 4), стр. 550-555. 10. K.V. Shaitan, K.B. Tereshkina, A.S. Kitaev, E.B. Tereshkin, O.V. Levtsova, M. Yu. Antonov, M.P. Akimov, and I.N. Nikolaev – Conformational transitions in the nootropic peptide semax (MEHFPGP) and its N-terminal modifications. // Biophysics, 2008, vol. 53 (No. 2), pp. 121-124. 11. К.В. Шайтан, М.Ю. Антонов, Е.В. Турлей, О.В. Левцова, К.Б. Терёшкина, И.Н. Николаев, М.П. Кирпичников - Сравнительное изучение молекулярной динамики, диффузии и проницаемости по отношению к лигандам для биомембран с различным липидным составом // Биологические мембраны,2008, том 25 (вып. 1), стр. 7583 12. К.Б.Егорова, О.В.Левцова – Сравнительное изучение динамического поведения аминокислотных остатков в воде, метаноле и столкновительной среде // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2004". Москва, 2004, том 1, стр. 14 13. О.В.Левцова, К.Б.Егорова – Кинематика конформационных переходов природных аминокислотных остатков // Сборник тезисов Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2004". Москва, 2004, том 1, стр. 19-20 14. K.B.Egorova, O.V.Levtsova, K.V. Shaitan – Aminoacid Residues in Water, Simulated Water and Methanol Environment (a Comparative Molecular Dynamic Study) // “VI International Congress on Mathematical Modeling” Book of abstracts, Nizhny Novgorod, Russia, 2004, p.495 15. О.В.Левцова – Молекулярная динамика грамицидинового канала в модели фосфолипидного бислоя ПОФХ // Материалы XII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005». Москва, 2005, том 2, стр. 22 16. К.В.Шайтан, К.Б.Терёшкина, Е.В.Турлей, О.В.Левцова, А.Ли Д.Н.Голик- Методы управляемой молекулярной динамики для молекуляр-ного дизайна сложных мембранных структур. // Материалы третьего съезда общества биотехнологов России им.Ю.А.Овчинникова, Москва, 2005г., стр.26 17. О.В.Левцова - Молекулярная динамика ионной проводимости грамицидинового канала с помощью молекулярной динамики // Материалы международной школы – конференции молодых ученых 24 “Системная биология и биоинженерия”, Москва, 2005г., стр.107 18. O.V.Levtsova, K.V.Shaitan – Molecular Dynamics Simulation of Membrane Channels by the Example of Gramicidin A // Conference proceeding of Moscow International Conference “Biotechnology and Medicine”, Moscow, Russia, 2006, pp.124-125 19. Левцова О.В. - Молекулярная динамика участка свзязывания ДНК с актиномицином Д //Сборник тезисов XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2006”. Москва, 2006, т.4, стр.62 20. Levtsova Olga, Yegor Tourleigh, Konstantin Shaitan - MD validation of a model for short a-neurotoxin bound to nicotinic acetylcholine receptor from Torpedo californica // Abstracts of 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress, Kyoto Japan, 2006, p.612 21. Shaitan K.V., Tereshkina K.B., Levtsova O.V. - Molecular dynamics and design of transmembrane ion channels // Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure (BGRS'2006), Novosibirsk, Russia, 2006, vol.1, pp. 315-319 22. Левцова О.В. - Молекулярная динамика зервамицина II и ряда его мутантов // Материалы XIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых “Ломоносов-2007”. Москва, 2007, том1, стр.50 23. Olga V. Levtsova, Konstantin V. Sahitan – Molecular Dynamics of Zervamicin II and its Mutants in Different Solvents // Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007), Moscow, Russia, 2007, p.117, 24. Левцова О.В. - Молекулярный дизайн новых пептидных антибиотиков на основе актиномицина Д и зервамицина II // Материалы научно-практической конференции в рамках международной научно-образовательной школы-конференции по биоинженерии и приложениям, , Москва, 2007, стр. 49-50 25. Levtsova Olga V., Shaitan Konstantin V. - Computer simulation of zervamicin IIB action // 3d International workshop MSSMBS'08 “Molecular Simulation Studies in Material and Biological Sciences” Book of abstracts, Dubna, Russia, 2008, p. 35, 25
