Add to collection(s) Add to saved
  1. No category

Приложение № 1 - Казанский (Приволжский) федеральный

advertisement 
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный
университет»
УДК 53.082.722.56, 53.083.2
№ госрегистрации 01201060140
Инв.№ 1.1.2.06.2.20/87/11
УТВЕРЖДАЮ
Проректор по научной деятельности
д-р геол.- минерал. наук, профессор
______________ Д.К.Нургалиев
«___»_________ ______ г.
ОТЧЕТ
О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ
В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические
кадры инновационной России» на 2009-2013 годы
по теме:
ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ АB-ПЕПТИДОВ И ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ
СВОЙСТВА ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН В УСЛОВИЯХ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ.
КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДАМИ ЯМР
Шифр заявки «2010-1.1-142-043-024»
(промежуточный, этап № 4)
Наименование этапа: «Межпротонные расстояния в исследованных пептидах и в
комплексах пептид - поверхность липидных мембран»
Руководитель проекта: ___________________ (д.х.н., профессор, А.В.Аганов)
подпись, дата
Казань 2011
СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ
Научный руководитель,
д.х.н., профессор
Аганов А.В.
подпись, дата
(разделы 1, 2, 3, 4)
Исполнители
В.н.с., д.х.н., профессор
Клочков В.В.
подпись, дата
Г.н.с., д.ф-м.н., профессор
(разделы 1, 2, 3, 4)
Скирда В.Д.
подпись, дата
В.н.с., д.ф.-м.н.
(разделы 1, 4)
Филиппов А.В.
подпись, дата
Ведущий инженер, к.ф.-м.н.
(разделы 2, 3 )
Клочков А.В.
подпись, дата
Ассистент, к.ф.-м.н.
(разделы 1, 3)
Юльметов А.Р.
подпись, дата
С.н.с., к.ф.-м.н.
(разделы 1, 4)
Васильев Г.И.
подпись, дата
Ассистент, к.ф.-м.н
(разделы 1, 2)
Рудакова М.А..
подпись, дата
Инженер
(разделы 2, 3 )
Халуиллина А.В..
подпись, дата
Аспирант
(разделы 2,3 )
Мунавиров Б.В.
подпись, дата
Аспирант
(разделы 2, 3)
Ефимов С.В.
подпись, дата
Аспирант
(разделы 1, 2)
Усачев К.С.
подпись, дата
Аспирант
(разделы 1,2,3,4)
Блохин Д.С.
подпись, дата
Аспирант
(разделы 1,2)
Николаева Т.Н.
подпись, дата
2
(разделы 1,4)
Техник
Попова Г.К.
подпись, дата
Нормоконтролер
(разделы 1,2)
Рыбасова В.И.
подпись, дата
3
РЕФЕРАТ
Отчёт – 59 страниц, 15 рисунков, 4 таблицы, библиография - 32 источника, 3
приложения
ОЛИГОПЕПТИДЫ, А - ПЕПТИДЫ, ЯМР, СПЕКТРОСКОПИЯ, ДВУМЕРНАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ,
NOESY,
COSY,
HSQC,
TOCSY,
HSQC-TOCSY
МОДИФИКАЦИИ
На данном этапе целью выполнения Проекта “Пространственное строение
Аb-пептидов и фундаментальные свойства липидных мембран в условиях их
взаимодействия. Комплексное исследование методами
ЯМР” планировалось
проведение исследований по разделу: “Межпротонные расстояния в исследованных
пептидах и в комплексах пептид - поверхность липидных мембран” и получение
следующих результатов:
- проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для синтетического
А(1-40) пептида нативного типа и его активного фрагмента А(16-22) в растворе;
обработка результатов экспериментов и определение количественной информации о
межпротонных расстояниях в исследованных пептидах;
- проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для исследуемых
комплексов: пептид - поверхность липидных мембран в растворе; обработка
результатов двумерных ЯМР NOESY экспериментов и определение количественной
информации о межпротонных расстояниях в этих комплексах;
- описание строения комплексов: пептид - поверхность липидных мембран в
растворе на основании количественной информации о межпротонных расстояниях в
этих комплексах.
Объектами исследований на данном этапе Проекта были: синтетический А(140)
пептид нативного типа (H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Try--Glu-Val-His-
His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-GlyLeu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH), его активный фрагмент А(16-22) (NAc-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2).
В результате проведены двумерные ЯМР NOESY эксперименты для
синтетического А(1-40) пептида нативного типа и его активного фрагмента А(16-22) в
растворе; показано, что применение двумерной NOESY ЯМР спектроскопии к
исследованию олигопептидов, подпадающих под условие быстрого движения
неэффективно; в этом случае не наблюдаются, либо наблюдаются слабые по
4
интенсивности кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что затрудняет получение
количественной
информации
о
межпротонных
расстояниях;
предложено
информацию о пространственном строении синтетического А(1-40) пептида и его
активного фрагмента А(16-22) в растворах извлекать из таблиц координат атомов
этих пептидов (в pdb-формате) определенных в результате анализа величин
остаточного диполь-дипольного взаимодействия (см. отчет по Проекту, 3-этап)
Проведены двумерные ЯМР NOESY эксперименты для исследуемых
комплексов: пептид - поверхность мицелл на основе додецилсульфата натрия в
растворе; обработаны результаты двумерных ЯМР NOESY экспериментов и
определены межпротонные расстояния в бета-амилоиде А(1-40) и в гептапептиде
А(16-22) в этих комплексах.
Впервые
описано
пространственное
строение
комплексов:
пептид
-
поверхность мицелл на основе додецилсульфата натрия в растворе на основании
количественной информации о межпротонных расстояниях в олигопептидах в этих
комплексах и качественном рассмотрении изменений химических сдвигов протонов
олигопептидов при переходе от растворов к комплексам на основе додецил сульфата
натрия.
Областью применения полученных результатов может быть фундаментальная
наука (биофизика, биохимия, физиология клетки), фармакология, медицина.
Подобная полученная структурная информация
является практически
значимой, поскольку позволит провести исследования биохимических свойств
изучаемых пептидов в комплексах пептид-модель мембраны, выяснить роль
мембраны при образовании промежуточных структур агрегации и механизмы
изменения свойств мембраны (проницаемости) при взаимодействии с пептидами,
что является последующими задачами Проекта.
5
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ЯМР
ядерный магнитный резонанс
COSY
Correlation spectroscopy – двумерная корреляционная
спектроскопия
TOCSY
Total correlation spectroscopy – полная корреляционная
двумерная спектроскопия
HSQC
Heteronuclear single-quantum correlation – двумерная
гетероядерная корреляционная спектроскопия
HMBC
Heteronuclear multiple-quantum correlation - двумерная
много-квантовая
гетероядерная
корреляционная
спектроскопия
HMQC
Heteronuclear multiple-bond correlation
- двумерная
полная много-квантовая гетероядерная корреляционная
спектроскопия
CP/MAS NMR 13С
Cross polarisation magic angle spinning NMR
13
С – ЯМР
метод кросс-поляризации и вращение под магическим
углом на ядрах 13С
NOESY
Nuclear Overhauser effect spectroscopy –спектроскопия
ядерного эффекта Оверхаузера
ХС
химический сдвиг
ТМС
тетраметилсилан, его сигналы в спектрах ЯМР 1Н и
13
С
приняты за 0 м.д.
м.д.
миллионная доля – единица измерения химических
сдвигов в спектрах ЯМР 1Н и 13С
ТФЭ
трифторэтанол
6
СОДЕРЖАНИЕ
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
6
СОДЕРЖАНИЕ
7
ВВЕДЕНИЕ
8
1. Проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для исследуемых
15
пептидов растворе; обработка результатов экспериментов и определение
количественной
информации
о
межпротонных
расстояниях
в
исследованных пептидах.
2. Проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для исследуемых
19
комплексов: пептид- поверхность липидных мембран в растворе.
3. Обработка результатов двумерных ЯМР NOESY экспериментов и
30
определение количественной информации о межпротонных расстояниях
в комплексах пептид - поверхность липидных мембран.
4. На основании данных о межпротонных расстояниях описание
33
строения комплексов: пептид- поверхность липидных мембран в
растворе.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
35
Список использованных источников
36
Приложение А. Список работ, выполненных в рамках проекта,
40
опубликованных в 2011 г.
Приложение Б.
42
Приложение В.
46
7
Введение
Как отмечалось в предыдущих отчетах по Проекту, агрегация амилоидных
пептидов сопровождает развитие таких нейродегенеративных заболеваний как
болезни Альцгеймера, Хантингтона, и другие [1]. Результат агрегации наблюдается в
форме амилоидных фибрилл, в которых молекулы протеина в конформации складки уложены поперек направления оси фибриллы, а также нефибриллярных
агрегатов.
Цитотоксичность
олигомерные
продукты
[2].
проявляют
В
не
настоящее
сами
время
фибриллы,
а
исследованы
некоторые
процессы
фибриллярной агрегации в протеинах, связанных с развитием болезни Альцгеймера
[3, 4]. Начальные стадии агрегации пептидов исследованы мало, в частности Апептиды и лизоцим в растворе были исследованы методом ЯМР с импульсным
градиентом магнитного поля [5-8]. Открытым остается вопрос - образуются ли
олигомерные агрегаты при агрегации амилоидного А-пептида.
Хорошо известно, что биологическая активность протеинов или белков связана с
их пространственным строением, что, несомненно, делает актуальным данное
исследование. Изучение конформаций олигопептидов также важно, поскольку их
можно рассматривать в качестве структурных блоков протеинов и знание их
строения может быть использовано для предсказания конфигурации цепей
полипептидов [9,10]. Нейротоксичное действие альцгеймеровских амилоидных
пептидов проявляется в результате их взаимодействия с клеточной мембраной [3].
Отсюда описание пространственного строения как самих амилоидных А-пептидов,
так комплексов бета-амилоиды – мембрана, позволит подойти к фундаментальному
пониманию механизмов протекающих на поверхности клеток, что может дать
возможность поиска лекарственных препаратов, ингибирующих образование
сенильных бляшек.
Строение относительно небольших органических молекул в растворах, как
правило, определяется по данным одномерной ЯМР спектроскопии, двумерных
методик (NOESY, корреляционных методик COSY, HSQC) [11,12], динамического
ЯМР [13-15]. Спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (2D NOESY) позволяет
также определять расстояния между магнитными ядрами до 5 Å, и, тем самым,
устанавливать пространственную структуру растворённых соединений [11,12]. К
сожалению, применение двумерной NOESY ЯМР спектроскопии к исследованию
низкомолекулярных органических соединений, подпадающих под условие быстрого
8
движения ( 0 *
c << 1, где c - время корреляции молекулярного движения, 0 -
угловая скорость прецессии магнитных ядер) не всегда эффективно. В этом случае
наблюдаются слабые по интенсивности кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что
затрудняет получение количественной информации о межпротонных расстояниях.
Проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для комплексов протеина
с мицелярными системами на основе поверхностно-активных веществ, позволяет
надеяться на определение расстояний между магнитными ядрами в олигопептидах
методом двумерной ЯМР NOESY спектроскопии. С точки зрения ЯМР
спектроскопии, комплексобразование увеличивает молекулярную массу системы,
что может перевести протеин из разряда малых молекул, подпадающих под условие
быстрого движения, в разряд молекул, подпадающих под условие медленного
движения. Последнее обстоятельство позволит использовать спектроскопию ЯМР
NOESY при решении структурных задач и для небольших по количеству
аминокислотных остатков протеинов.
Одной
из
составляющих
данного
Проекта
является
установление
пространственной структуры, а именно определение конформаций и геометрических
параметров (координат атомов) ряда пептидов: синтетический А(1-40) пептид
нативного типа (Рисунок 1), его вариации при изменении одной из аминокислот в
первичной структуре А(10-35) и активный фрагмент пептида А(1-40) - пептид А(16-22)
в растворе и твердой фазе. В качестве методов исследования использованы ЯМР 1Н,
13
С спектроскопия, включая подход, основанный на анализе остаточных величин
диполь-дипольного взаимодействия между магнитными ядрами
использованы
двумерная
модификации),
13
спектроскопия
ЯМР
(COSY,
13
С и 1Н. Также
HSQC
и
NOESY
C CP/MAS ЯМР и HR-MAS спектроскопия и теоретическое
моделирование молекулярных структур с программным обеспечением MOPAC 7.0
(PM 3).
9
Leu Val Phe Phe Ala Glu
Lys
Lys
Asp
Val
Gln
Gly
His
Ser
Asn
His
Lys
Val
Gly Ala
Glu
Tyr
Ile
Ile
Gly
Ser
Gly
Asp
His
Leu
Met
Val
Arg
Phe
Glu
Gly
Gly
Ala
Asp
Val
Val
Рисунок 1 - Схематическое изображение бета-амилоида Aβ1-40 (H-Asp-Ala-Glu-PheArg-His-Asp-Ser-Gly-Try--Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-ValGly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH). Черным
цветом выделен участок Aβ16-22, который, как предполагается, отвечает за агрегацию
между амилоидами.
На четвертом этапе выполнения Проекта “Пространственное строение Аbпептидов и фундаментальные свойства липидных мембран в условиях их
взаимодействия. Комплексное исследование методами
ЯМР” планировалось
проведение исследований по разделу: “Межпротонные расстояния в исследованных
пептидах и в комплексах пептид - поверхность липидных мембран” и получение
следующих результатов:
- проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для синтетического
А(1-40) пептида нативного типа и его активного фрагмента А(16-22) в растворе;
обработка результатов экспериментов и определение количественной информации о
межпротонных расстояниях в исследованных пептидах;
- проведение двумерных ЯМР NOESY экспериментов для исследуемых
комплексов: пептид - поверхность липидных мембран в растворе; обработка
результатов двумерных ЯМР NOESY экспериментов и определение количественной
информации о межпротонных расстояниях в этих комплексах;
10
- описание строения комплексов: пептид - поверхность липидных мембран в
растворе на основании количественной информации о межпротонных расстояниях в
этих комплексах.
Подобные исследования являются практически значимыми, поскольку
полученные результаты позволят проводить исследования биохимических свойств
изучаемых пептидов в комплексах пептид-модель мембраны.
Объекты исследования
Методом ЯМР NOESY спектроскопии исследованы, следующие пептиды:
синтетический А(1-40) пептид нативного типа (H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-SerGly-Try--Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-LysGly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH), и активный фрагмент А(16-22)
(NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2) пептида А(1-40) в растворах и в комплексах:
пептид - поверхность липидных мембран в растворе.
Подготовка образцов и условия проведения ЯМР исследований пептидов А(1622)
и А(1-40)
Пептиды А(16-22) и А(1-40) были синтезированы по стандартному методу
твердофазного синтеза FMOC [16-18] с помощью автоматического синтезатора
пептидов ABI 433A (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) на кафедре
прикладной химии Технического Университета Лулео (Швеция) [18]. Отделение
пептидов от подложки и защитных групп производилось в кислой среде на основе
трифторуксусой
кислоты.
Очистка
пептидов
производилась
методом
высокопроизводительной жидкостной хроматографии на приборе Series 200 Perkin
Elmer HPLC System (Waltham, MA, USA) в градиенте вода - ацетонитрил. Качество
конечного продукта характеризовали методом MALDI-TOF (matrix-assisted laser
desorption-ionization) масс-спектрометрии в университете Карлсруэ (Karlsruhe
Institute of Technology, Germany).
Регистрация ЯМР 1H (500 МГц) и 13C (125.69 МГц) спектров пептидов А(16-22)
и А(1-40) в растворах боратного буфера (Na2B4O7·10H2O+HCL+D2O), фосфатного
буфера (NaH2PO4·2H2O/ Na2HPO4·2H2O +D2O) и трифторэтанола (CF3CD2OD) и в
комплексах: пептид - поверхность липидных мембран в растворе проводилась на
ЯМР спектрометре высокого разрешения AVANCE-500 IITM фирмы «Bruker».
11
Спектрометр работает в режиме внутренней стабилизации поля по линии резонанса
дейтерия (2H). При записи протонных спектров в изотропном растворителе
использовались 900 импульсы и поднасыщение сигнала воды, либо 300 импульсы без
поднасыщения растворителя. Задержки между импульсами составляли 2 сек., число
накоплений – от 4 до 100, ширина спектра – 11 м.д., число точек – 26832. При записи
спектров ЯМР
13
C использовались 300 импульсы и развязка от протонов (WALTZ–
16). Межимпульсные задержки равнялись 2 сек., число накоплений – 19485, ширина
спектра – 236,6 м. д., число точек – 65536. При обработке спектра применялась
цифровая экспоненциальная фильтрация с константой 3 Гц. Одномерные спектры
регистрировались при стабилизированной температуре 200 C или 250 C. Точность
определения химических сдвигов на ядрах 1H равнялась 0.01 м.д., на ядрах 13С - 0.1
м.д., констант спин-спинового взаимодействия – 0.3 Гц.
Концентрации пептидов в растворах была не менее 10 % по массе.
Концентрация боратного буфера: Na2B4O7·10H2O составляла 5.82% по массе и 0.1 М
соляной кислоты в воде (отношение H2O к D2O - 10/1); фосфатного буфера:
NaH2PO4·2H2O 28,16% по массе, Na2HPO4·2H2O 26.71% по массе, H2O – 44.13% по
массе, D2O –1% по массе [19-24].
Двумерные
эксперименты
ЯМР
NOESY
(1H-1H)
соответствующих спектров пептидов А(16-22) и А(1-40)
буфера
(Na2B4O7·10H2O+HCL+D2O),
фосфатного
[25,26]
по
записи
в растворах боратного
буфера
(NaH2PO4·2H2O/
Na2HPO4·2H2O +D2O), трифторэтанола (CF3CD2OD) и в комплексах: пептид поверхность липидных мембран в растворе также были проведены на ЯМР
спектрометре AVANCE-500 IITM фирмы «Bruker».
Двумерная
ЯМР
спектроскопия
NOESY
в
определении
пространственного строения органических соединений
Сегодня
при
проведении
исследований
строения
органических
и
биоорганических соединений в растворах широко используются приемы и подходы
двумерной ЯМР (COSY, HSQC, и NOESY модификации) спектроскопии. Идея
применения двумерного (2М) преобразования Фурье в спектроскопии ЯМР впервые
была предложена Джинером Дж. в 1971 году. Он предложил проводить 2М-Фурье
преобразование сигнала ЯМР, полученного в виде функции двух временных
переменных, вследствие чего интенсивность сигнала становится зависимой от двух
частотных переменных.
12
Любой двумерный ЯМР эксперимент можно разбить на четыре временных
интервала: первый - подготовительный, система спинов приходит (или приводится)
в начальное состояние, обычно состояние теплового равновесия. Второй - период
эволюции длительностью t1, в течение которого выведенная из равновесия спиновая
система эволюционирует. Третий - период смешивания (в некоторых экспериментах
может отсутствовать), в течение которого в изучаемой спиновой системе происходит
перенос когерентности или поляризации. Четвёртый - период регистрации. В
течение времени t2 регистрируется интенсивность сигнала ЯМР S как функция от t2.
Такая процедура повторяется многократно с различной величиной t1 при
неизменных остальных параметрах. Результирующий сигнал во временной области
S(t1,t2) становится зависимым от двух переменных t1 и t2. Двумерное Фурьепреобразование переводит сигнал S(t1,t2) в спектр частотной области S(1,2).
Идея использования двумерной ЯМР спектроскопии для изучения таких
процессов как химический обмен, кросс-релаксация и спиновая диффузия была
предложена
Эрнстом
Предложенный
[11,12].
алгоритм
эксперимента
и
соответствующая импульсная последовательность (Рисунок 2) получили название
NOESY (Nuclear Overhauser Exchange Spectroscopy- спектроскопия ядерного эффекта
Оверхаузера и обмена).
Физическую
сущность
данного
эксперимента
можно
представить,
рассматривая случай взаимного обмена между двумя состояниями А и В (т.е. когда
kAB = kBA) в системе невзаимодействующих спинов (JAB= 0). Примем, что времена
продольной
релаксации
равны,
т.е.
Т1А=Т1В
и
обозначим
равновесную
намагниченность в позиции А как МА, а в позиции В - МВ.
Рисунок 2. Импульсная последовательность в эксперименте NOESY.
В результате действия первого 90- импульса намагниченность повернётся по
часовой стрелке на 90 вокруг оси x и в момент t1= 0 будет направлена вдоль оси -y.
Если обмен медленный, то в период t1 эволюцию намагниченностей МА и МВ можно
13
рассматривать независимо. В таком случае намагниченности будут независимо
прецессировать в плоскости xy с частотами равными химическим сдвигам А и В.
Благодаря поперечной релаксации намагниченность уменьшится в exp(-t1/T2) раз.
Второй 90- импульс переводит намагниченности МА и МВ в плоскость xz, zкомпонента намагниченности МА оказывается пропорциональной cos At1, а
МBZ(m=0)cosBt1.
Модулированные
таким
образом
компоненты
z-
намагниченности отличаются от равновесных. В течение m будет происходить
процесс перераспределения продольной намагниченности в сторону состояния
равновесия
за
счет
химического
обмена
(процесс
идентичен
переносу
намагниченности в экспериментах Форзена - Гофмана) или процессов кроссрелаксации. X-компоненты намагниченности в период смешивания не содержат
полезной
информации.
Они
уничтожаются
либо
импульсом,
создающим
неоднородности в плоскости ху, либо в серии экспериментов с чередующимися
фазами импульсов.
Последний 90- импульс переводит z- намагниченность в плоскость x,y,
обуславливая
наблюдаемую
поперечную
намагниченность.
Часть
спинов,
прецессировавших в течении t1 с частотой А, в результате процессов обмена или
процессов кросс-релаксации в течение m, стала в период t2 прецессировать с
частотой В. Это приводит к появлению на 2М спектре так называемых кросс пиков
с координатами (1,2) = (А,В). Появление таких кросс пиков в системе
невзаимодействующих
спинов
свидетельствует
о
процессах
обмена
намагниченностями или процессов кросс-релаксации.
Количественная двумерная спектроскопия ЯМР NOESY недостаточно
адаптирована к исследованию структуры относительно малых молекул, попадающих
под условие быстрого движения (0с <<1; с – время корреляции, 0 – резонансная
частота ядер). Нами предложен способ получения количественной информации о
меж-протонных расстояниях для малых органических молекул путем комбинации
ЯМР NOESY эксперимента с методами обработки данных [27].
14
1. ПРОВЕДЕНИЕ ДВУМЕРНЫХ ЯМР NOESY ЭКСПЕРИМЕНТОВ ДЛЯ
ИССЛЕДУЕМЫХ ПЕПТИДОВ РАСТВОРЕ; ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
ЭКСПЕРИМЕНТОВ
ИНФОРМАЦИИ
И
О
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
МЕЖПРОТОННЫХ
КОЛИЧЕСТВЕННОЙ
РАССТОЯНИЯХ
В
ИССЛЕДОВАННЫХ ПЕПТИДАХ
Ранее (см. отчет по Проекту, 1-этап) были проведены исследования методами
ЯМР синтетического А(1-40) пептида нативного типа и активного фрагмента А(1-40)
пептида (16-22): проведена регистрация одномерных ЯМР (1Н и
13
С) спектров
синтетического А(1-40) пептида нативного типа, его фрагмента А(10-35) и активного
фрагмента А(16-22)
пептида А(1-40) в растворах и CP/MAS ЯМР
13
С спектров
исследуемых пептидов в твердой фазе; проведена запись двумерных спектров ЯМР
(COSY, HSQC, TOCSY, HSQC-TOCSY модификации) исследуемых пептидов в
растворах; произведено полное отнесение сигналов ЯМР на ядрах 1H и 13C.
Структурная формула гептапептида Aβ(16-22) NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-AlaGlu-NH2 приведена на рисунке 1.1.
Рисунок 1.1 - Структурная формула гептапептида Aβ(16-22) (NAc-Lys-Leu-Val-PhePhe-Ala-Glu-NH2).
На рисунке 1.2 представлен одномерный
1
Н (500 МГц) спектр ЯМР
гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе боратного буфера
(Na2B4O7·10H2O+D2O). Представленное на рисунке 1.2 отнесение сигналов в ЯМР 1Н
спектре гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 было сделано с
15
использованием двумерных гетеро-корреляционных экспериментов ЯМР (см. отчет
по Проекту, 1-этап).
Рисунок 1.2 - Одномерный 1Н (500 МГц) спектр ЯМР гептапептида NAc-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе боратного буфера (Na2B4O7·10H2O+D2O) при
pH = 8.4. Т= 293 К.
Для определения межпротонных расстояний, напрямую характеризующих
пространственную геометрию гептапептида Aβ16-22 (NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-AlaGlu-NH2) в растворе, записывали двумерные ЯМР NOESY спектры (рисунок 1.3, как
пример) с вариацией времени смешивания τm. Как следует из одномерного 1Н (500
МГц)
спектра
ЯМР
гептапептида
NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2,
в
двумерном ЯМР NOESY спектре мы вправе ожидать большое число кросс-пиков,
отражающих
близкое
пространственное
расположение
(до
5
Ао)
между
разнообразными протонами, в частности между протонами алкильных групп и NH
протонами (область 1-3 м.д. – 7.5-9 м.д.).
16
Рисунок 1.3 - Двумерный 1Н-1H NOESY (τm=100 мс) спектра ЯМР гептапептида Aβ1622 в растворе боратного буфера (Na2B4O7·10H2O+D2O) при pH = 8.4. Т= 293 К.
Как следует из рисунка 1.3, подобных кросс-пиков в двумерном ЯМР спектре
не наблюдается, что объяснимо неэффективностью применения двумерной NOESY
ЯМР спектроскопии к исследованию низкомолекулярных органических соединений,
подпадающих под условие быстрого движения (
корреляции молекулярного движения,
0
*
c
<< 1, где
c
- время
0 - угловая скорость прецессии магнитных
ядер). В этом случае не наблюдаются, либо наблюдаются слабые по интенсивности
кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что затрудняет получение количественной
информации о межпротонных расстояниях.
На рисунке 1.4 представлен двумерный 1Н-1H NOESY (τm=100 мс) спектр ЯМР
бета-амилоида Aβ1-40 в растворе H2O+D2O, в котором наблюдаются слабые по
интенсивности кросс-пики (выделено). К сожалению, подобные спектры также не
позволяют получить количественную информацию о межпротонных расстояниях в
исследуемых молекулах, подпадающих под условие быстрого движения.
17
Рисунок 1.4 - Двумерный 1Н-1H NOESY (τm=100 мс) спектр (фрагмент) ЯМР бетаамилоида Aβ1-40 в растворе H2O+D2O при Т= 293 К.
Таким образом, информацию о пространственном строении синтетического
А(1-40) пептида нативного типа (H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Try--GluVal-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-IleIle-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH), и его активного фрагмента А(16-22) (NAcLys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2) в растворах мы можем извлечь из таблиц
координат атомов этих пептидов (в pdb-формате) определенных в результате анализа
величин остаточного диполь-дипольного взаимодействия между магнитными
ядрами
13
С и
1
Н, разделенных одной химической связью (1D) по программе
DYNAMO (см. отчет по Проекту, 3-этап).
18
2. ПРОВЕДЕНИЕ ДВУМЕРНЫХ ЯМР NOESY ЭКСПЕРИМЕНТОВ ДЛЯ
ИССЛЕДУЕМЫХ КОМПЛЕКСОВ: ПЕПТИД- ПОВЕРХНОСТЬ ЛИПИДНЫХ
МЕМБРАН В РАСТВОРЕ
Протеины могут взаимодействовать с мембраной клетки преимущественно
двумя способами: проникая сквозь бислой (и тогда говорят об интегральных
мембранных
белках)
или
образовывать
комплекс
с
поверхностью
бислоя
(периферийные или внешние мембранные белки) [28]. В настоящее время ЯМР
спектроскопия широко используется для исследования структуры липидной
мембраны, однако ее приложения к исследованию комплексов протеин – мембрана
клетки все еще ограничены.
Известно, что хорошей моделью мембранной поверхности, в том числе и для
структурных исследований методом ЯМР спектроскопии [29], являются мицеллы и
мицеллярные комплексы. Одной из наиболее полных работ, выполненных в этом
направлении является работа [30], в которой методами спектроскопии ЯМР (TOCSY,
HSQC, HMBC, NOESY) изучена структура комплекса протеин (Gly-Leu-Phe-AspLys-Leu-Lys-Ser-Leu-Val-Ser-Asp-Asp-Lys-Lys) – мицеллы.
Для исследования комплексов протеин-поверхность мембраны доступны два
варианта синтетической модели поверхности мембраны клетки: мицеллы на основе
поверхностно-активных веществ, и небольшие фосфолипидные везикулы [29,30].
Среда, которая наиболее близко соответствует нативному бислою липида, состоит из
фосфолипидных везикул, минимальный размер частиц которых составляет 250-300
Å в диаметре. Частицы такого размера имеют большое вращательное время
корреляции
(τc ~ 4 x 10-6 секунд). Длинные времена корреляции приводят к
коротким значениям времен поперечной релаксации Т2, что, в свою очередь,
приводит к уширению резонансных сигналов в спектрах ЯМР и к увеличению
спиновой диффузии в
1
Н NOE экспериментах. Короткие времена поперечной
релаксации Т2 приводят к уменьшению информативности двумерных ЯМР
экспериментов (TOCSY, HSQC, HMBC, NOESY), необходимых как для отнесения
резонансных сигналов, так и для определения пространственной структуры
протеинов в комплексе [11,12]. Таким образом, частицы такого размера не подходят
для двумерных экспериментов и, отсюда следует, что структурные исследования,
использующие
1
Н NOE эксперименты, ограничены для молекул больших
молекулярных масс, связанными с небольшими мицеллами поверхностно-активных
веществ.
19
Известно, что поверхностно-активные вещества образуются амфифильными
молекулами,
имеющими
гидрофобные
и
гидрофильные
участки.
Кроме
фосфолипидов, формирующих бислои или мультибислои в водных средах,
существуют и другие органические соединения, формирующие мицеллярные
системы, в которых мицеллы рассредоточены по всему объему и находятся в
быстром обмене с мономерными структурами. Критической концентрацией
мицеллообразования поверхностно-активных веществ является концентрация ПАВ в
растворе, при которой в системе образуются в заметных количествах устойчивые
мицеллы. Полярная группа мицелл поверхностно-активных веществ в водной среде
расположена на оболочке мицеллы, которая является гидрофильной, а центральная
часть мицеллы является гидрофобной [29,30].
В водном растворе мицеллы ведут себя как глобулярные белки, содержащие
от 60 мономерных молекул, при этом частицы такого размера имеют относительно
небольшое вращательное время корреляции (τc ~ 5 x 10-8 секунд). Важным с точки
зрения ЯМР спектроскопии, является то, что при связывании протеина с мицеллами
образуется комплекс протеин-мицелла, молекулярная масса которого становится
больше, чем у несвязанного протеина, что может перевести молекулу протеина из
разряда малых молекул, подпадающих под условие быстрого обмена, в разряд
молекул, подпадающих под условие медленного обмена [11,12]. Последнее
обстоятельство позволяет использовать спектроскопию ЯМР NOESY при решении
структурных задач и для небольших по количеству аминокислотных остатков
протеинов.
Мицеллярные системы на основе додецилсульфата натрия (ДСН) (рисунок
2.1) образуются в воде при минимальной концентрации 8.1 мМ.
Рисунок 2.1 - Структурная формула додецилсульфата натрия.
Мицеллы ДСН могут быть использованы для моделирования поведения
протеинов на биологических мембранах для небольших гидрофобных протеинов,
которые образуют комплексы, связываясь непосредственно с мицеллой ДСН.
20
Отметим, что у синтетических мицелл ДСН, подобно многим биологическим
мембранам, имеется поверхностно-отрицательный заряд. От величины этого заряда
зависит критическая концентрация мицеллообразования ДСН при формировании
мицеллы.
Определение концентрации додецилсульфата натрия в воде, при которой
образуются мицеллярные системы, проводили с помощью ЯМР 1Н спектроскопии
[31].
Если поместить олигопептид в раствор с мицелярными образованиями на
основе додецилсульфат натрия [15,16], то можно ожидать образование комплекса
протеин - мицелла, молекулярная масса которого будет существенно больше, чем у
несвязанной молекулы протеина. При этом протеин из разряда малых молекул, для
которого сохраняется условие быстрого движение, переходит в разряд молекул, для
которых
справедливо
условие медленногодвижения, что дает
возможность
применить метод NOESY спектроскопии ЯМР для установления структуры
исследуемого пептида в комплексе с мицеллой.
Были исследованы следующие системы: олигопептиды (амилоидные пептиды
А(16-22) и А(1-40))– водный раствор с додецил сульфатом натрия (ДСН), который
использовался в качестве модели мембраны. При концентрации (ККМ) ДСН в
растворе воде большей, чем 4.3 г/л, происходило образование мицелл, что
контролировалось с помощью ЯМР 1Н спектроскопии.
ЯМР 1Н спектр гептапептида Aβ16-22 (NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2),
растворенного с мицеллами на основе додецил сульфата натрия, представлен на
рисунке 2.2 (химические сдвиги приведены в таблице 2.1). Большие по
интенсивности сигналы на спектре принадлежат сигналам протонов от ДСН.
Отнесение сигналов в спектре ЯМР 1Н гептапептида Aβ16-22 (NAc-Lys-Leu-ValPhe-Phe-Ala-Glu-NH2) в растворе Н2О+D2О с ДСН сделано на основании двумерных
экспериментов ЯМР 1Н-1H TOCSY (рисунок 2.3, как пример), данных предыдущих
исследований и сведений из литературы (таблица 2.1).
21
Рисунок 2.2 - ЯМР 1Н (500 МГц) спектр гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-AlaGlu-NH2 в растворе Н2О + D2O с додецилсульфатом натрия, находящемся в
мицеллярном состоянии. Т 293 К, 0 м.д. соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС.
Рисунок 2.3 - Область двумерного 1Н-1H TOCSY спектра ЯМР (7.2-8.5 м.д.)
гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе Н2О+ D2O с
додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии. Т 293 К, 0 м.д.
соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС.
22
Таблица 2.1. ЯМР 1H химические сдвиги (Н, м.д., относительно ТМС) гептапептида
NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе Н2О + D2O с додецил сульфатом
натрия, находящемся в мицеллярном состоянии. Т 293 К (в скобках, приведены
данные ХС в растворе боратного буфера из таблицы 2.1, отчет по Проекту, 1 этап).
Остаток
Химические сдвиги, м.д.
NH
CαH
CβH
CγH
прочие
Lys16
7.41
4.10 (4.26)
1.75 (3.00)
1.45
1.65 (δ), 2.94 (ε)
Leu17
8.02
4.30 (4.36)
1.72 (1.60)
1.52
0.93(δ1), 0.86 (δ2)
Val18
7.57
3.80 (4.06)
1.97 (1.94)
0.82(γ1), 0.70
(γ2)
Phe19
7.64
4.23 (4.20)
2.84;2.75 (2.07;2.28)
6.86(2/6);7.1
2(3/5)
Phe20
7.52
4.44 (4.20)
3.17;2.93 (2.07;2.28)
7.2
(2/6),
6.95 (3/5)
Ala21
7.85
4.15 (4.15)
1.36 (1.34)
Glu22
8.01
4.13 (4.35)
2.02;1.89 (2.38;2.11)
2.27
Сравнивая химические сдвиги гептапептида в растворе Н2О + D2O с
додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии (таблица 2.1) и в
растворе боратного буфера (Na2B4O7·10H2O+D2O), можно видеть изменения этих
величин. Отличие химических сдвигов в этих растворах возможно обусловлено
изменением конформации молекулы гептапептида и образованием комплекса
гептапептид - мицеллы на основе додецилсульфата натрия. Кроме того, в двумерном
ЯМР 1Н NOESY спектре гептапептида наблюдаются кросс-пики положительного
знака, что характерно для молекул, подпадающих под условие медленного
движения. Все выше приведенные факты подтверждают образование комплекса
гептапептид – мицеллы на основе додецилсульфата натрия.
23
Рисунок 2.4 - Область двумерного ЯМР 1Н-1H NOESY спектра (6.4-9.0 м.д.)
гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе Н2О+ D2O с
додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии. Т 293 К, 0 м.д.
соответствует сигналу ЯМР 1Н ТМС. Время смешивания τm 0,4 с.
Для определения межпротонных расстояний, напрямую характеризующих
пространственную геометрию гептапептида Aβ16-22 (NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-AlaGlu-NH2) в комплексе в исследованном растворе, записывали двумерные ЯМР
NOESY спектры (рисунок 2.4) с вариацией времени смешивания τm. Наблюдались
кросс-пики в двумерных ЯМР спектрах NOESY между сигналами протонов
исследуемого соединения, относящихся к различным аминокислотным фрагментам.
Анализируя и обрабатывая интегральные интенсивности данных кросс-пиков,
используя методику, изложенную в работе [27], можно получить межпротонные
расстояния в гептапептиде в комплексе: олигопептид – мицеллы на основе ДСН.
Одномерный 1Н (500 МГц) спектр ЯМР пептида H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-HisAsp-Ser-Gly-Try--Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser24
Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH в растворе фосфатного
буфера (pH=7.4) и додецил сульфата натрия представлен на рисунке 2.5.
Рисунок 2.5 - Одномерный 1Н (500 МГц) спектр ЯМР пептида Aβ1-40 в растворе
фосфатного буфера и додецил сульфата натрия при Т= 293 К.
Отнесение сигналов в 1Н ЯМР спектре пептида Aβ1-40 (H-Asp-Ala-Glu-PheArg-His-Asp-Ser-Gly-Try--Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-ValGly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH)
фосфатного
буфера
(NaH2PO4·2H2O/
Na2HPO4·2H2O
+D2O)
при
в
растворе
pH=7.4
в
присутствии 10 мМ додецил сульфата натрия было проведено с помощью двумерной
ЯМР 1Н-1H TOCSY спектроскопии.
На рисунке 2.6 приведен двумерный ЯМР
1
Н-1H TOCSY спектр бета-
амилоида Aβ1-40 в растворе фосфатного буфера и додецил сульфата натрия при Т=
293 К.
25
Рисунок 2.6 - Двумерный 1Н-1H TOCSY спектр ЯМР бета-амилоида Aβ1-40 в растворе
фосфатного буфера и додецил сульфата натрия при Т= 293 К.
Анализируя данные о расположении кросс-пиков в двумерном 1Н-1H TOCSY
спектре и используя литературные данные о химических сдвигах протонов в
аминокислотных фрагментах бета-амилоида Aβ1-40 были отнесены сигналы протонов
CH, CH2 и CH3 групп аминокислот исследуемого пептида. Полученные данные о 1H
ЯМР химических сдвигах исследуемого пептида приведены в таблице 2.2.
26
Таблица 2.2. ЯМР 1H химические сдвиги (Н, м.д., относительно ТМС) бетаамилоида Aβ1-40 в растворе фосфатного буфера с додецил сульфатом натрия,
находящемся в мицеллярном состоянии. Т 293 К.
Остаток
Химические сдвиги
CγH
прочие
CαH
CβH
Asp1
4,18
2.93, 2.76
Ala2
4,13
1,15
Glu3
4,12
1.87, 1.80
Phe4
4,39
2.87, 2.71
Arg5
4,14
1,46
His6
3,60
2.45, 2.35
Asp7
4,17
2.94, 2.81
Ser8
4,27
3,73
Gly9
3,76
2,19
Tyr10
4,39
2,9
Glu11
4,11
1.77, 1.72
2,05
Val12
3,88
1,89
0,73
His13
3,58
2.44, 2.33
His14
3,53
2.43, 2.29
Gln15
3,43
1.76, 1.71
2,36
6.87, 6.55
Lys16
4,17
1,50
1,30
2.79(e), 1.25(d)
Leu17
4,00
1,41
1,20
0.71, 0.68
Val18
3,90
1,86
0,73
Phe19
4,28
2.95, 2.78
7.48, 6.73
Phe20
4,26
2.95, 2.78
7.50, 6.76
Ala21
4,09
1,22
Glu22
4,11
1.73, 1.69
Asp23
4,16
2.93, 2.81
Val24
3,98
1,93
Gly25
3,76
Ser26
4,34
3,71
Asn27
4,17
2.96, 2.78
Lys28
4,17
1,50
2,11
7.52, 6.76
1.59, 1.35
2.99(d)
1,99
0,80
6,95
1,30
27
2.79(e), 1.25(d)
Продолжение таблицы 2.2.
Gly29
3,80
Ala30
4,16
1,21
Ile31
3,99
1,71
1.30, 0.73
Ile32
4,01
1,71
1.30, 0.77
Gly33
3,74
Leu34
4,06
1,43
1,21
Met35
3,55
2.44, 2.23
2.8, 2.75
Val36
4,01
1,93
0,78
Gly37
3,84
Gly38
3,82
Val39
4,00
1,87
0,73
Val40
4,00
2,01
0,78
0.75, 0.70
Сравнивая химические сдвиги бета-амилоида Aβ1-40 в растворе фосфатного
буфера с додецилсульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии и в
растворе фосфатного буфера (таблицы 2.3, отчет по Проекту, 1 этап), можно видеть
изменения этих величин. Отличие химических сдвигов в этих
растворах
обусловлено, так же как и в случае с гептапептидом Aβ16-22, изменением
конформации молекулы бета-амилоида Aβ1-40 и образованием комплекса бетаамилоид - мицеллы на основе додецилсульфата натрия.
Для определения межпротонных расстояний, напрямую характеризующих
пространственную геометрию бета-амилоида Aβ1-40 в растворе, записывали
двумерные ЯМР NOESY спектры (рисунок 2.7) с вариацией времени смешивания τm
(50мс, 75 мс, 100 мс, 200 мс). Наблюдались кросс-пики в двумерных ЯМР спектрах
NOESY между сигналами протонов исследуемого соединения, относящихся к
различным аминокислотным фрагментам.
28
Рисунок 2.7 - Область двумерного 1Н-1H NOESY (τm=50 мс) спектра ЯМР бетаамилоида Aβ1-40 в растворе фосфатного буфера и додецил сульфата натрия,
находящемся в мицеллярном состоянии. Т= 293 К.
29
3.
ОБРАБОТКА
ЭКСПЕРИМЕНТОВ
РЕЗУЛЬТАТОВ
И
ДВУМЕРНЫХ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ЯМР
NOESY
КОЛИЧЕСТВЕННОЙ
ИНФОРМАЦИИ О МЕЖПРОТОННЫХ РАССТОЯНИЯХ В КОМПЛЕКСАХ
ПЕПТИД - ПОВЕРХНОСТЬ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН
Анализируя и обрабатывая интегральные интенсивности кросс-пиков в
двумерных ЯМР спектрах NOESY [27], определены межпротонные расстояния в
исследованных олигопептидах в комплексах: олигопептид – мицеллы на основе
додецил сульфата натрия. Отметим, поскольку наблюдались кросс-пики в
двумерных ЯМР спектрах NOESY между сигналами протонов исследуемого
соединения, относящихся к различным аминокислотным фрагментам, становится
возможным определить пространственное строение основной цепи олигопептидов.
Данные о пространственном строении гептапептида Aβ16-22 в растворе Н2О +
D2O в комплексе пептид – мицеллы приведены в таблице 3.1. В качестве
калибровочной интенсивности кросс-пиков был выбран кросс-пик в ароматическом
кольце фенилаланина Phe19(2/6)–Phe19(3/5) на основании того, что протоны в нём
принадлежат ароматическому кольцу и не могут быть изменены при изменении
внешних условий. Расстояние между этими протонами определяли различными
методами и приняты равными 2.49 Å.
Аналогичным образом были получены межпротонные расстояния для бетаамилоида Aβ1-40 в растворе фосфатного буфера в комплексе пептид – мицеллы на
основе додецилсульфата натрия. Данные приведены в таблице 3.2. В качестве
калибровочной интенсивности кросс-пиков была выбрана интенсивность кросс-пика
в ароматическом кольце фенилаланина Phe4(2/6)–Phe4(3/5). Расстояние между этими
протонами определяли различными методами и приняты равным 2.49 Å.
30
Таблица 3.1. Экспериментально определенные межпротонные расстояния для
гептапептида NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 в растворе Н2О+ D2O в
комплексе пептид – мицеллы на основе додецилсульфата натрия. Знаком (*)
обозначено калибровочное расстояние.
Пара протонов
Межпротонное расстояние r, Å, NOESY
F19(2/6)/F19(3/5)
2,49*
E22(NH)/A21(NH)
3.08±0.62
F19(2/6)/F19(NH)
3.48±0.70
K16(NH)/K16(a)
3.43±0.69
K16(NH)/E22(b)
2.93±0.59
A21(NH)/A21(a)
2.97±0.59
E22(NH)/E22(b)
4.54±0.91
E22(a)/E22(b)
3.58±0.72
A21(NH)/F20(a)
2.54±0.51
F19(NH)/F19(a)
2.98±0.60
F19(NH)/V18(a)
3.10±0.62
F19(NH)/F19(b)
3.30±0.66
F19(2/6)/F19(a)
3.35±0.67
F20(NH)/F19(a)
3.27±0.65
F19(b)/F19(2/6)
3.60±0.72
V18(NH)/V18(b)
3.02±0.60
V18(a)/V18(NH)
2.80±0.56
F19(b)/F19(a)
2.85±0.57
V18(NH)/V18(g)
3.95±0.79
V18(a)/V18(b)
3.03±0.61
V18(g)/V18(a)
4.98±1.00
F20(NH)/F20(a)
2.45±0.49
F20(2/6)/F20(a)
2.14±0.43
F20(NH)/F20(b)
3.12±0.62
F20(2/6)/F20(b)
2.88±0.58
31
Таблица 3.2. Экспериментально определенные межпротонные расстояния для бетаамилоида Aβ1-40 в растворе фосфатного буфера в комплексе пептид – мицеллы на
основе додецилсульфата натрия. Знаком (*) обозначено калибровочное расстояние.
Пара протонов
Межпротонное расстояние r, Å,
NOESY
F19(2/6)/F19(3/5)
2,49*
D1(b)/K28 (a)
1,73±0,35
R5(g)/R5(g)
1,55±0,31
F4(2/6)/F4(3/5)
2,79±0,56
F20(b)/K28 (a)
2,08±0,42
S26(b)/F20(a)
3,30±0,66
F19(3/5)/F19(2/6)
3,84±0,77
A2(b)/I31(a)
4,31±0,86
M35(g)/M35(a)
2,25±0,45
R5(a)/R5(g)
2,92±0,58
L17(g)/Q15(a)
3,20±0,64
R5(b)/K16, K28 (e)
2,99±0,60
L34(d)/E22(b)
3,59±0,72
A21(b)/A21(a)
3,84±0,77
L17(d)/L17(b)
2,67±0,53
H13(b)/H13(a)
2,58±0,52
Y10(a)/D7(b)
2,49±±0,50
L17(d)/I31(g)
3,12±0,62
H14(b)/H14(a)
2,66±0,53
D1(b)/R5(a)
2,15±0,43
A21(b)/V24(b)
4,39±0,88
F4(a)/F4(b)
2,36±0,47
L34(b)/V24(b)
4,31±0,86
F19(a)/V24(b)
2,86±0,57
Q15(b)/A21(a)
2,80±0,56
32
4. НА ОСНОВАНИИ ДАННЫХ О МЕЖПРОТОННЫХ РАССТОЯНИЯХ
ОПИСАНИЕ СТРОЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ: ПЕПТИД - ПОВЕРХНОСТЬ
ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН В РАСТВОРЕ
С целью определения пространственного строения гептапептида Aβ 16-22 в
растворе Н2О + D2O в комплексе пептид – мицеллы на основе додецилсульфата
натрия, проведены расчеты по методу молекулярной механики с использованием
программного обеспечения DYNAMO [32]. Эти расчеты позволили однозначно
определить конформер, как наиболее выгодную структуру для гептапептида. В
качестве исходных экспериментальных данных использовали межпротонные
расстояния, полученные из анализа интенсивностей кросс-пиков ЯМР NOESY
спектров гептапептида (таблица 2.1).
Координаты атомов в pdb формате пространственной структуры Aβ16-22 (NAcLys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2) в растворе и в комплексе пептид – мицеллы на
основе додецилсульфата натрия в H2O+D2O приведены в Приложении Б.
Анализируя изменения ЯМР 1Н химических сдвигов протонов гептапептида
при переходе от раствора боратного буфера (Na2B4O7·10H2O+D2O) к раствору Н2О+
D2O с додецил сульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии, можно на
качественном уровне описать пространственное строение комплекса гептапептид
NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2 – мицеллы на основе додецил сульфата
натрия, который представлен на рисунке 4.1.
Рисунок 4.1. Строение комплекса гептапептид NAc-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-GluNH2 – мицелла на основе додецилсульфата натрия.
33
С целью определения пространственного строения бета-амилоида Aβ1-40 в
растворе фосфатного буфера в комплексе мицеллы на основе додецилсульфата
натрия, были проведены расчеты по методу молекулярной механики по программе
DYNAMO [32]. Эти расчеты позволили однозначно определить структуру, как
наиболее
выгодную
для
бета-амилоида
Aβ1-40.
В
качестве
исходных
экспериментальных данных использовали межпротонные расстояния, полученные из
анализа интенсивностей кросс-пиков ЯМР NOESY спектров (таблица 2.2).
Координаты атомов в pdb формате пространственной структуры бета-амилоида
Aβ1-40 в растворе и в комплексе пептид – мицеллы на основе додецилсульфата
натрия приведены в Приложении С.
Анализируя изменения ЯМР 1Н химических сдвигов протонов бета-амилоида
Aβ1-40 при переходе от раствора к комплексу, можно на качественном уровне описать
пространственное строение самого комплекса бета-амилоида Aβ1-40 – мицеллы на
основе додецил сульфата натрия, который представлен на рисунке 4.2.
Рисунок 4.2. Строение комплекса бета-амилоид Aβ1-40 - мицелла на основе
додецилсульфата натрия.
34
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Объектами исследований на данном этапе Проекта были: синтетический А(140)
пептид нативного типа (H-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Try--Glu-Val-His-
His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-GlyLeu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OH), его активный фрагмент А(16-22) (NAc-Lys-LeuVal-Phe-Phe-Ala-Glu-NH2).
В результате проведенных двумерных ЯМР NOESY экспериментов для
синтетического А(1-40) пептида нативного типа и его активного фрагмента А(16-22) в
растворе показано, что
применение
этого метода
ЯМР
спектроскопии
к
исследованию олигопептидов, подпадающих под условие быстрого движения
неэффективно; в этом случае не наблюдаются, либо наблюдаются слабые по
интенсивности кросс-пики в спектрах ЯМР NOESY, что затрудняет получение
количественной
информации
о
межпротонных
расстояниях;
предложено
информацию о пространственном строении синтетического А(1-40) пептида и его
активного фрагмента А(16-22) в растворах извлекать из таблиц координат атомов
этих пептидов (в pdb-формате), определенных в результате анализа величин
остаточного диполь-дипольного взаимодействия (см. отчет по Проекту, 3-этап)
Проведены двумерные ЯМР NOESY эксперименты для исследуемых
комплексов: пептид - поверхность мицелл на основе додецилсульфата натрия в
растворе; обработаны результаты двумерных ЯМР NOESY экспериментов и
определены межпротонные расстояния в бета-амилоиде А(1-40) и в гептапептиде
А(16-22) в этих комплексах.
Описано пространственное строение комплексов: пептид - поверхность
мицелл на основе додецилсульфата натрия в растворе на основании количественной
информации о межпротонных расстояниях в олигопептидах в этих комплексах и
качественном
рассмотрении
изменений
химических
сдвигов
протонов
олигопептидов при переходе от растворов к комплексам на основе додецил сульфата
натрия.
Полученная структурная информация позволит выявить биохимические
свойства исследуемых пептидов в комплексах пептид-модель мембраны; выяснить
роль мембраны при образовании промежуточных структур агрегации; описать
механизм изменения свойств мембраны (проницаемости) при взаимодействии с
пептидами, что является последующими задачами Проекта.
35
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Ross, C. A. Protein aggregation and neurodegenerative diseases [Text] / C. A.
Ross, M.A Poirier // Neurodegeneration. - 2004. – V. 6. - P. S10-S17.
2. Rochet, J.-C. Amyloid fibrillogenesis: themes and variations [Text] / J.-C.
Rochet, P. T. Lansbury // Current Opinion in Structural Biology. - 2000. –V. 10(1) - P. 60
-68.
3. Gorbenko, G. P. The role of lipid–protein interactions in amyloid-type protein
fibril formation [Text] /. G. P. Gorbenko, P. K. J. Kinnunen // Chemistry and Physics of
Lipids. - 2006. – V. 141.- P. 72–82.
4. Antzutkin, O. N. Amyloidosis of Alzheimer's A beta peptides: solid-state
nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance, transmission electron
microscopy, scanning transmission electron microscopy and atomic force microscopy
studies [Text] / O. N.Antzutkin // Magnetic Resonance in Chemistry. - 2004. – V. 42. - P.
231-246.
5. Narayanan, S. Characterization of chemical exchange between soluble and
aggregated states of beta -amyloid by solution-state NMR upon variation of salt
conditions [Text] / S. Narayanan, B. Reif // Biochemistry.- 2005. – V. 44 .- P. 1444 1452.
6. Jarvet, J. Reversible random coil to b-sheet transition and the early stage of
aggregation of the Ab(12-28) fragment from the Alzheimer peptide [Text] / J. Jarvet, P.
Damberg, K. Bodell, L. E. G. Eriksson, A. Gräslund // Journal of the American Chemical
Society.- 2000.- V. -122 .- P. 4261 - 4268.
7. Filippov, A. V. Diffusion and aggregation of Alzheimers's Abeta(1-40)
peptide in aqueous trifluoroethanol solutions as studied by pulsed field gradient nmr
[Text] / A. V. Filippov, A. V. Sulejmanova, O. Antzutkin, G. Gröbner // Applied
Magnetic Resonance.- 2005. - V. 29. - P. 439-449.
8. Filippov, A.V. Effect of freezing on amyloid peptide aggregation and selfdiffusion in an aqueous solution [Text] / A. V. Filippov, A.V. Suleimanova, G. Grobner,
N. Antsutkin // Colloid Journal. - 2008. – V. 70.- P. 501–506.
9. Bradley, E. K. NMR structural characterization of oligo-N-substituted glycine
lead compounds from a combinatorial library [Text] / E. K. Bradley, J. M. Kerr, L. S.
36
Richter, G. M. Figliozzi, D. A. Goff, R. N. Zuckermann, D. C. Spellmeyer, J. M. Blaney
// Molecular Diversity. - 1997. - V. 3. - P. 1-15.
10. Anishetty, S. Tripeptide analysis of protein structures [Text] / S. Anishetty, G.
Pennathur, R. Anishetty // BMC Structural Biology - 2002. - V. 2. - P. 1472-1507.
11. Ernst, R. R. Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two
Dimensions [Text] / R. R. Ernst, B. Bodenhausen, A. Wokaun. - Oxford: Oxford
University Press, 1987.- 610 p.
12. Van der Ven, Multidimensional NMR in liquids: basic principles and
experimental methods [Text] / Van der Ven, J. M. Frank, - N-Y: Wiley-VCH, 1995. - 399
p.
13. Jackman, L. M. Dynamic Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy [Text] /
L. M. Jackman, F. A.Cotton, N-Y: Academic Press, 1975. - 660 p.
14. Sandstrom, J. Dynamic NMR Spectroscopy [Text] / J. Sandstrom // London:
Academic Press, 1982. - 226 p.
15. Application of dynamic NMR spectroscopy to organic chemistry [Text] /
M.Oki . - N-Y: Wiley-VCH, 1985. - 423 p.
16. Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a
tetrapeptide [Text] / R.B. Merrifield // J. Am. Chem. Soc. - 1963. - Vol.85. – P.2149.
17. Jones, J. Amino Acid and Peptide Synthesis [Text] / J. Jones - New York:
Oxford University Press, 2002. - P.92.
18. Filippov, A. Synthesis and aggregation studies on amyloid oligomers of
Alzheimer’s Abeta peptides [Text] / A.Filippov // Licentiate of Technology Thesis.
Department of Chemical Technology and Geosciences. Division of Chemical
Engineering. Lulea University of Technology, 2010. - 26 p. ISSN: 1402-1757 ISBN 97891-7439-069-8. Lulea University of Technology 2010.
19. Li, T. Gene transfer with echo-enhanced contrast agents: Comparison between
Albunex, Optison, and Levovist in mice—Initial results [Text] / T. Li, K. Tachibana, M.
Kuroki // Radiology. - 2003. - V. – 229. – P. 423–428.
20. Wolf, M. Stabilisation and determination of the biological activity of Lasparaginase in poly(D,L-lactideco-glycolide) nanospheres [Text] / M. Wolf, M. Wirth,
F. Pittner, F. Gabor // International Journal of Pharmaceutics. - 2003. – V. 256. – P. 141–
152.
37
21. Mason, T. J. Practical sonochemistry: Uses and applications of ultrasound
[Text] / T. J. Mason, , D. Peters. – Chichester, UK.: Horwood Publishing, 2002. – 543 p.
22. Soto, C. The alpha-helical to beta-sheet transition in the amino-terminal
fragment of the amyloid beta-peptide modulates amyloid formation [Text] / C. Soto, E.
Castano, B. Frangione, N. Inestrosa // Journal of Biological Chemistry. – 1995. – V. 271.
– P. 3963–3967.
23. Lomas, D. A. Serpinopathies and the conformational dementias [Text] / D. A.
Lomas, R. W. Carrell // Nature Reviews Genetics. – 2002. - V. 3 (10). – P. 759.
24. Stefani, M. Protein aggregation and aggregate toxicity: new insights into
protein folding, misfolding diseases and biological evolution [Text] /M .Stefani, C. M.
Dobson // Journal of Molecular Medicine. - 2003. – V. 81. – P. 678-699.
25. Berger, S. 200 and More NMR Experiments [Text] / S. Berger, S. Braun. –
Weinheim: Wiley-VCH, 2004. - 810 p.
26. Friebolin, H. Basic one- and two dimensional NMR spectroscopy [Text] / H.
Friebolin // Weinheim; Basel; New York: Wiley-VCH, 1991. - P. 344
27.
Gadiev, T.A. Analysis of the spatial structure of calixarenes in solutions by
2-D NMR (NOESY) spectroscopy. [Text] / T.A. Gadiev, B.I. Khairutdinov, I.S. Antipin,
V.V. Klochkov// Applied Magnetic Resonance. – 2006. – V. 30, N 2. - P. 65-73.
28.
Coles, M. Solution Structure of Amyloid β-Peptide (1-40) in a Water-
Micelle Enviroment. Is the Membrane-Spanning Domain Where We Think It Is? [Text]
/M. Coles, W. Bicknell, A. Watson, D.P. Fairlie, D.J. Craik // Biochemistry. – 1998. – V.
37. – P.11064-11077.
29.
Motta, A. Solution conformation of salmon calcitonin in sodium dodecyl
sulfate micelles as determined by two-dimensional NMR and distance geometry
calculations [Text] / A. Motta, A. Pastore, N.A. Goud, M.A. Castiglione // Biochemistry
— 1991. — V. 30. — P.10444-10450.
30.
Wang, G. Solution structure of the N-terminal amphitropic domain of
Escherichia coli glucose-specific enzyme IIA in membrane-mimetic micelles [Text] / G.
Wang, P. Keifer, A. Peterkofsky // Protein Science. – 2003. - V. 12. – P. 1087–1096.
31.
Блохин, Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-
Ser-Thr-Ala-Leu-Leu-Gly в комплексе протеин – мицеллы додецилсульфата натрия
[Текст] /Д.С. Блохин, С.В. Ефимов, А.В. Клочков, А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов,
А.В. Аганов, В.В. Клочков // Ученые Записки Казанского Университета. - 2011. - Т.
153, Серия Естественные науки, книга 1. - С. 59-70.
38
32.
Delaglio, F. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system
based on UNIX pipes [Text] / F. Delaglio, S. Grzesiek, G. Vuister, G. Zhu, J. Pfeifer, A.
Bax// J. Biomol. NMR. – 1995. – V. 6. – P. 277-293.
39
ПРИЛОЖЕНИЕ А.
Список работ, выполненных в рамках проекта, опубликованных в 2011 году.
1.
Klochkov, V.V. A spatial structure of tripeptides glycylglycyl-L-histidine and
glycylglycyl-L-tyrosine based on residual dipolar couplings and quantum-chemical
computations [Text] /V.V.Klochkov, A.V.Klochkov, M.N.Schamsutdinov, S.V.Efimov,
A.A.Krutikov,
E.M.Gilyazetdinov,
Y.Y.
Zyavkina,
V.G.
Shtyrlin//
Mendeleev
Communications. – 2011 - Vol. 21, N 2. - P. 72-74.
2. Блохин, Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-ThrAla-Leu-Leu-Gly в комплексе протеин – мицеллы додецилсульфата натрия [Текст]
/Д.С.Блохин, С.В.Ефимов, А.В.Клочков, А.Р.Юльметов, А.В.Филиппов, А.В.Аганов,
В.В.Клочков // Ученые Записки Казанского Университета. - 2011. - Т. 153, Серия
Естественные науки, книга 1. - С. 59-70.
3.
Сахарова, А.В. Подвижность молекул и диаграмма состояния системы
глицерилмоноолеат-вода по данным ЯМР [Текст] /А.В.Сахарова, А.В.Филиппов,
Б.В.Мунавиров, В.Д.Скирда //Журнал физической химии. - 2011. – Т .85, N4. – С.
649-659.
4.
Filippov,
А.
Interaction
of
polyacrylic
acid
oligomer
with
dimyristoylphosphatidylcholine bilayers [Text]/ A. Filippov, B. Munavirov, T. Sparrman,
V. Ishmuhametova, M. Rudakova, P. Shriram, S. Tavelin// Langmuir. -2011. - V.27, N.7. P.3754-3761.
5. Blokhin, D.S. Spatial structure of the decapeptide Val-Ile-Lys-Lys-Ser-Thr-Ala-LeuLeu-Gly in water and in a complex with sodium dodecyl sulfate micelles [Text] /D.S.
Blokhin, S.V. Efimov, A.V. Klochkov, A.R. Yulmetov, A.V. Filippov, O.N.Antzutkin,
A.V. Aganov, V.V. Klochkov// Applied Magnetic Resonance. – 2011. – Vol. 41. – In
press.
6. Усачев, К.С. Пространственное строение гептапептида Aβ16-22 в растворе и в
комплексе гептапептид – модель биологической мембраны [Текст] / К.С. Усачев,
А.Р. Юльметов, А.В. Филиппов, О.Н. Анцуткин, С. Афонин, А.В. Аганов, В.В.
Клочков // Ученые Записки Казанского Университета. - 2011. - Т. 153, Серия
Естественные науки, книга 3. – В печати.
7. Блохин, Д.С. Пространственное строение некоторых олигопептидов в растворе и
комплексе: олигопептид – модель биологической мембраны [Текст] / Д.С.Блохин,
40
С.В.Ефимов,
А.В.Клочков,
И.З.Рахматуллин,
К.С.Усачев,
А.Р.Юльметов,
А.В.Филиппов, А.В.Аганов, В.В.Клочков /Тез. докл. V Всероссийской конференции
“Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях” Казань, РФ. Апрель 2011 г.,
С. 22-23.
8. Блохин, Д.С. Пространственное строение декапептида Val-Ile-Lys-Lys-Ser-ThrAla-Leu-Leu-Gly в водном растворе и
в комплексе протеин
– мицеллы
додецилсульфата натрия [Текст] / Д.С. Блохин, С.В. Ефимов, А.В. Клочков, А.Р.
Юльметов, А.В. Филиппов, А.В. Аганов, В.В. Клочков//Тез. докл. V Всероссийской
конференции “Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях” Казань, РФ.
Апрель 2011 г., С. 86-87.
9. Рахматуллин, И.З. Пространственное строение усиливающего ВИЧ гептапептида
Glu-Ile-Leu-Asn-His-Met-Lys в растворе и комплексе: гептапептид – модель
биологической мембраны [Текст] / И.З. Рахматуллин, Д.С.Блохин, А.Р.Юльметов,
А.В.Филиппов,
О.Н.Анцуткин,
Всероссийской
конференции
А.В.Аганов,
“Новые
В.В.Клочков
достижения
ЯМР
/Тез.
в
докл.
V
структурных
исследованиях” Казань, РФ. Апрель 2011 г., С. 131-133.
10.
Усачев, К.С. Определение структуры бета-амилоида А(10-35) (активного
фрагмента бета-амилоида А(1-40)) в растворе методами ЯМР спектроскопии и
анализом констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия [Текст] / К.С.
Усачев, А.В. Филиппов, А.В. Аганов, В.В.Клочков /Тез. докл. V Всероссийской
конференции “Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях” Казань, РФ.
Апрель 2011 г., С. 141-142.
41
ПРИЛОЖЕНИЕ Б.
Координаты атомов в pdb-формате бэта-амилоида Aβ16-22 в растворе Н2О+ D2O с
додецил сульфатом натрия, находящемся в мицеллярном состоянии, рассчитанные в
программе
DYNAMO.
В
качестве
входных
данных
использовались
экспериментально полученные значения расстояний из эксперимента NOESY.
№
атома
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
Обозначение Аминокислота
C
CA
O
HA1
HA2
HA3
C
CA
CB
CD
CE
CG
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HG1
HG2
HN
HZ1
HZ2
HZ3
N
NZ
O
C
CA
CB
CD1
CD2
CG
HA
HB1
HB2
HD11
№
аминокиcлоты
NAC
NAC
NAC
NAC
NAC
NAC
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
42
x
y
z
10.884
10.732
9.954
11.702
10.086
10.301
13.699
12.258
11.907
12.339
13.063
12.697
11.601
10.852
12.159
11.275
12.643
12.826
12.748
13.756
12.450
12.856
14.737
14.895
15.004
12.080
14.535
14.320
16.548
15.597
15.703
16.038
13.729
15.097
15.863
16.735
15.161
15.965
11.874
13.252
11.467
13.618
13.184
13.930
9.504
9.977
10.019
11.185
12.358
11.140
9.278
10.207
9.072
11.313
10.259
13.270
12.441
10.951
12.084
11.766
11.125
12.381
12.714
11.297
12.127
9.018
9.874
9.242
7.701
7.172
7.647
7.028
9.570
7.417
7.361
8.167
2.883
3.507
2.511
3.810
4.370
2.786
2.411
2.240
0.754
-1.410
-2.073
0.076
2.737
0.640
0.298
-1.522
-1.883
-1.549
-3.104
0.184
0.535
3.207
-2.215
-1.082
-2.744
2.835
-2.024
1.475
2.903
3.914
3.840
6.305
5.422
5.094
4.896
3.746
2.967
6.725
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
HD12
HD13
HD21
HD22
HD23
HG
HN
N
O
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
HG12
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
CB
CD1
CD2
CE1
CE2
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HN
HZ
N
O
C
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
3
3
3
3
3
3
3
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
6
43
17.060
15.762
13.859
13.235
13.125
14.963
13.682
14.226
16.160
19.894
18.813
19.511
18.511
20.091
18.356
20.327
17.978
19.032
17.816
20.904
19.317
20.462
18.065
17.797
20.121
22.325
21.562
20.952
18.507
19.049
17.127
17.672
19.474
16.711
22.248
21.075
21.446
18.821
19.779
16.400
17.355
20.283
15.662
20.529
23.618
21.351
6.995
6.452
8.652
7.043
7.683
5.984
10.053
9.655
10.725
8.887
9.943
11.179
12.327
10.851
10.226
11.497
12.449
13.248
12.104
10.151
10.429
11.761
8.739
9.435
7.995
8.625
8.067
6.680
6.539
7.240
6.702
7.381
6.819
7.109
7.948
6.005
6.235
6.215
7.442
6.497
7.700
9.748
7.170
9.012
8.709
10.556
5.999
7.057
5.806
6.168
4.529
4.885
4.343
3.626
2.110
1.720
2.011
2.606
2.740
3.989
1.088
1.947
1.807
2.970
3.532
3.884
4.604
4.453
3.589
2.929
2.536
-0.991
0.167
-0.171
0.537
-1.747
0.263
-2.027
-0.477
-1.025
1.015
0.693
-1.008
1.512
-2.508
1.016
-3.013
-0.034
-1.263
0.557
-0.957
-3.968
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
CA
CB
CD1
CD2
CE1
CE2
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HN
HZ
N
O
C
CA
CB
HA
HB1
HB2
HB3
HN
N
O
C
CA
CB
CD
CG
HA
HB1
HB2
HG1
HG2
HN
N
O
OE1
OE2
HN1
HN2
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
NH2
NH2
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
44
22.280
22.758
20.555
21.837
19.590
20.862
21.688
19.736
23.123
23.675
22.929
20.440
22.701
18.722
20.961
20.703
18.938
21.609
21.489
19.518
19.182
17.889
18.959
17.965
17.592
17.043
20.001
20.236
19.038
23.215
21.241
20.609
18.582
19.123
20.792
20.879
21.193
18.907
18.694
21.012
20.574
23.447
18.383
18.349
23.337
23.570
9.643
8.535
7.643
6.216
6.640
5.223
7.427
5.438
10.216
8.092
8.982
8.599
6.052
6.801
4.259
8.977
4.667
9.049
10.894
13.217
11.806
11.590
11.573
11.916
10.580
12.255
10.653
10.945
14.235
14.761
14.990
15.498
15.948
15.258
15.624
16.440
14.877
14.063
15.513
12.737
13.570
14.317
15.241
17.056
14.467
16.341
-3.258
-4.176
-5.136
-3.634
-5.278
-3.769
-4.308
-4.587
-2.897
-3.813
-5.148
-5.669
-2.996
-5.910
-3.231
-1.994
-4.637
-2.036
-5.106
-3.972
-3.936
-3.103
-4.827
-2.105
-3.205
-3.532
-2.316
-3.300
-4.518
-2.853
-2.968
-1.400
-0.085
-1.291
-3.710
-1.210
-0.534
-1.335
-2.271
-2.554
-3.207
-2.499
0.885
-0.285
-2.249
-2.268
131
132
HN3
N
NH2
NH2
9
9
45
24.073
24.180
15.938
14.284
-4.186
-3.722
ПРИЛОЖЕНИЕ В.
Координаты атомов в pdb-формате бэта-амилоида Aβ1-40 в растворе с мицеллами
додецил сульфата натрия рассчитанные в программе DYNAMO. В качестве входных
данных использовались экспериментально полученные значения расстояний из
эксперимента NOESY.
№
№ аминоОбозначение Аминокислота
атома
ксилоты
1
C
ASP
1
2
CA
ASP
1
3
CB
ASP
1
4
CG
ASP
1
5
HA
ASP
1
6
HB1
ASP
1
7
HB2
ASP
1
8
N
ASP
1
9
O
ASP
1
10
OD1
ASP
1
11
OD2
ASP
1
12
HT1
ASP
1
13
HT2
ASP
1
14
HT3
ASP
1
15
C
ALA
2
16
CA
ALA
2
17
CB
ALA
2
18
HA
ALA
2
19
HB1
ALA
2
20
HB2
ALA
2
21
HB3
ALA
2
22
HN
ALA
2
23
N
ALA
2
24
O
ALA
2
25
C
GLU
3
26
CA
GLU
3
27
CB
GLU
3
28
CD
GLU
3
29
CG
GLU
3
30
HA
GLU
3
31
HB1
GLU
3
32
HB2
GLU
3
33
HG1
GLU
3
34
HG2
GLU
3
35
HN
GLU
3
36
N
GLU
3
37
O
GLU
3
46
x
y
z
72.776
74.126
73.910
75.265
74.625
73.398
73.315
74.961
72.110
75.279
76.264
75.950
74.888
74.642
70.731
71.102
71.192
70.334
71.453
70.238
71.949
72.946
72.376
69.834
71.651
71.150
71.834
72.100
71.370
70.084
71.574
72.905
71.592
70.304
72.127
71.421
70.859
10.931
10.235
8.729
8.017
10.612
8.537
8.360
10.496
10.805
6.810
8.691
10.610
9.696
11.367
12.856
12.376
13.562
11.704
13.214
14.067
14.247
11.733
11.667
12.301
13.463
14.422
15.780
18.062
16.723
14.552
16.200
15.653
16.284
16.884
14.289
13.885
12.779
-4.832
-4.973
-5.135
-5.145
-5.852
-6.066
-4.312
-3.806
-3.805
-4.967
-5.331
-4.105
-3.142
-3.338
-7.236
-5.837
-4.890
-5.483
-3.901
-4.853
-5.241
-6.658
-5.864
-7.872
-10.119
-9.045
-9.210
-8.225
-8.098
-9.160
-10.170
-9.150
-7.137
-8.184
-7.169
-7.716
-10.768
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
OE1
OE2
C
CA
CB
CD1
CD2
CE1
CE2
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HN
HZ
N
O
C
CA
CB
CD
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE
HG1
HG2
HH11
HH12
HH21
HH22
HN
N
NE
NH1
NH2
O
GLU
GLU
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
ARG
3
3
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
47
72.985
71.761
73.516
73.555
75.004
74.972
75.109
74.995
75.132
75.029
75.075
72.993
75.464
75.549
74.911
75.152
74.951
75.193
73.552
75.071
72.967
74.066
74.151
72.766
71.907
69.697
70.497
67.554
72.299
71.852
72.349
69.616
70.201
68.024
70.559
70.005
67.780
66.746
67.146
66.387
72.445
72.866
68.334
67.344
66.985
74.295
18.309
18.816
11.079
12.528
12.938
14.416
15.462
15.691
16.737
14.301
16.852
12.610
12.218
12.971
13.529
15.374
15.779
17.625
13.978
17.828
13.412
10.191
8.873
9.495
8.621
8.452
9.209
9.087
9.546
7.622
8.588
7.413
8.528
9.403
10.251
9.115
7.147
8.040
11.038
10.243
11.589
10.844
9.045
8.007
10.210
7.651
-7.423
-9.122
-10.829
-11.307
-11.578
-13.632
-11.425
-14.237
-12.031
-12.225
-13.437
-12.225
-12.238
-10.646
-14.244
-10.349
-15.313
-11.418
-9.760
-13.899
-10.306
-11.479
-8.998
-9.147
-10.062
-11.216
-10.154
-10.281
-8.175
-9.658
-11.047
-10.933
-12.168
-12.184
-10.428
-9.196
-9.843
-8.779
-10.475
-9.136
-9.216
-9.694
-11.326
-9.580
-9.937
-9.039
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
C
CA
CB
CD2
CE1
CG
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HN
N
ND1
NE2
O
C
CA
CB
CG
HA
HB1
HB2
HN
N
O
OD1
OD2
C
CA
CB
HA
HB1
HB2
HG
HN
N
O
OG
C
CA
HA1
HA2
HN
N
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
9
48
77.471
76.532
77.011
79.476
80.108
78.402
76.548
77.014
76.345
78.294
79.513
80.703
74.997
75.167
78.828
80.552
77.802
78.065
78.800
79.379
80.215
79.611
80.005
78.572
77.604
77.899
77.056
80.052
81.005
78.242
77.947
78.471
76.878
79.524
78.339
77.875
79.376
78.570
78.910
77.745
79.403
77.966
77.317
77.722
77.218
77.744
10.355
9.219
8.589
7.974
7.111
8.050
8.467
9.337
7.784
7.396
8.403
6.643
10.676
9.711
7.493
7.381
10.514
13.382
12.258
12.789
11.695
11.912
13.645
13.078
10.972
11.144
13.888
11.497
11.075
16.197
14.837
14.809
14.683
15.060
13.824
16.618
13.332
13.770
17.033
15.747
17.834
17.680
17.731
18.490
15.719
16.419
-8.277
-8.671
-9.980
-10.650
-8.765
-9.798
-7.897
-10.760
-10.256
-7.786
-11.641
-7.995
-8.798
-8.824
-8.602
-9.995
-7.102
-8.266
-8.990
-10.303
-10.971
-8.367
-10.102
-10.961
-10.176
-9.258
-8.757
-12.164
-10.279
-6.945
-6.322
-4.886
-6.305
-4.883
-4.471
-4.486
-6.755
-7.099
-6.337
-4.103
-9.296
-8.840
-9.702
-8.169
-8.597
-8.157
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
174
175
O
C
CA
CB
CD1
CD2
CE1
CE2
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HH
HN
N
O
OH
C
CA
CB
CD
CG
HA
HB1
HB2
HG1
HG2
HN
N
O
OE1
OE2
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
HG12
GLY
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
TYR
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
12
12
49
79.884
82.303
81.487
81.566
79.484
81.573
78.823
80.912
80.859
79.537
81.901
82.601
81.092
78.937
82.625
77.771
81.458
78.032
79.665
80.096
81.823
78.900
84.476
84.400
83.866
83.321
84.000
85.391
84.434
82.826
83.528
85.047
83.868
83.535
83.568
84.022
82.110
84.529
85.731
85.888
86.250
87.001
86.618
84.958
87.124
85.424
18.951
17.688
16.748
17.213
16.370
15.128
15.438
14.196
16.216
14.350
15.753
17.288
18.179
17.202
15.010
15.556
13.364
13.276
15.849
16.713
18.149
13.461
18.407
18.860
20.292
22.191
20.824
18.839
20.918
20.302
20.137
20.922
17.578
17.972
18.673
23.186
22.218
16.408
17.242
18.417
17.881
19.346
16.629
18.964
17.251
17.305
-9.487
-9.029
-9.910
-11.366
-12.532
-12.801
-13.360
-13.630
-12.252
-13.910
-9.840
-11.664
-11.461
-12.111
-12.587
-13.574
-14.050
-14.384
-9.307
-9.473
-7.993
-14.750
-7.217
-8.671
-8.734
-10.265
-10.163
-9.098
-8.062
-8.443
-10.849
-10.413
-10.273
-9.439
-6.430
-10.195
-10.412
-5.066
-5.495
-4.513
-3.127
-5.005
-5.448
-4.455
-3.202
-2.737
176
177
178
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
CB
CD2
CE1
CG
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HN
N
ND1
NE2
O
C
CA
CB
CD2
CE1
CG
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HN
N
ND1
NE2
O
C
CA
CB
CD
CG
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
HIS
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
12
12
12
12
12
12
12
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
14
15
15
15
15
15
50
86.458
87.944
86.786
87.057
86.253
85.559
83.632
83.303
83.406
83.614
84.975
83.321
83.837
82.485
82.740
84.476
81.846
85.980
82.743
85.250
84.510
82.794
84.647
83.846
81.727
82.444
81.643
83.616
82.814
82.401
83.419
81.492
80.686
81.054
84.228
82.698
82.193
82.606
81.908
83.875
82.312
79.717
79.680
80.231
80.583
80.029
18.707
18.821
19.661
20.212
17.538
17.723
16.905
14.099
14.254
12.881
13.009
13.382
13.046
14.676
12.270
12.404
13.369
12.925
13.566
14.796
15.141
13.286
13.221
13.153
13.687
14.970
16.180
17.913
19.395
17.441
14.989
16.109
16.201
18.366
17.448
20.283
15.758
15.026
18.403
19.147
12.821
12.109
12.378
11.164
10.147
11.359
-2.464
-4.984
-6.016
-4.363
-7.528
-6.861
-4.385
-3.600
-5.114
-5.756
-8.001
-9.350
-7.234
-5.486
-5.590
-5.313
-7.883
-7.615
-10.243
-6.009
-5.467
-8.116
-9.337
-3.030
-1.095
-1.502
-1.019
-0.902
-2.265
-1.333
-1.039
0.048
-1.518
-2.682
-0.143
-2.868
-3.454
-2.951
-2.201
-1.492
-0.445
0.353
-1.148
-1.899
-4.155
-3.403
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244
245
246
247
248
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
261
262
263
264
265
266
267
HA
HB1
HB2
HE21
HE22
HG1
HG2
HN
N
NE2
O
OE1
C
CA
CB
CD
CE
CG
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HG1
HG2
HN
HZ1
HZ2
HZ3
N
NZ
O
C
CA
CB
CD1
CD2
CG
HA
HB1
HB2
HD11
HD12
HD13
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
GLN
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
15
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
16
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
17
51
78.655
79.708
81.285
82.336
82.156
80.551
78.975
80.044
80.460
81.792
79.967
79.909
78.058
79.462
80.416
82.820
84.258
81.854
79.793
80.327
80.163
82.608
82.698
84.386
84.941
81.974
82.069
79.267
83.978
85.552
84.286
79.463
84.540
77.890
74.782
75.655
75.129
74.304
76.755
75.415
75.595
75.608
74.062
73.369
74.550
74.209
12.537
10.275
11.058
10.192
8.954
12.248
11.464
14.285
13.565
9.730
10.982
9.574
13.250
13.024
14.056
14.650
14.186
13.715
12.034
14.040
15.039
14.630
15.656
13.191
14.862
13.840
12.691
14.020
13.430
13.993
15.097
13.148
14.176
13.810
11.890
12.979
14.363
15.498
15.362
14.628
12.900
15.122
14.396
14.957
15.739
16.409
-1.450
-1.580
-1.687
-3.222
-4.370
-3.724
-3.614
-1.999
-1.480
-3.894
0.780
-4.988
3.165
2.617
3.222
3.559
3.320
2.827
2.905
4.298
2.854
4.617
3.185
3.718
3.813
1.762
3.097
0.751
1.400
1.700
1.447
1.153
1.856
4.249
2.213
2.831
2.409
0.297
0.718
0.899
3.908
3.011
2.591
0.324
-0.726
0.869
268
269
270
271
272
273
274
275
276
277
278
279
280
281
282
283
284
285
286
287
288
289
290
291
292
293
294
295
296
297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
307
308
309
310
311
312
313
HD21
HD22
HD23
HG
HN
N
O
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
HG12
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
CB
CD1
CD2
CE1
CE2
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HN
HZ
N
O
C
CA
CB
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
17
17
17
17
17
17
17
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
18
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
19
20
20
20
52
76.888
77.565
76.754
75.449
77.241
77.047
73.608
75.265
74.619
74.603
73.750
76.036
73.601
74.185
73.563
74.273
72.809
76.634
76.455
76.029
76.295
75.357
76.457
76.084
74.999
73.866
72.865
71.728
71.851
70.725
72.795
70.787
75.422
74.254
73.444
73.695
71.678
71.884
69.909
73.537
70.019
74.480
76.908
78.442
77.075
76.651
15.611
14.728
16.269
13.688
12.380
12.817
12.117
8.260
9.581
9.658
10.845
9.829
9.596
8.745
10.763
11.768
10.843
8.988
10.740
9.880
10.580
10.704
8.214
5.437
5.877
4.848
4.882
6.093
5.297
6.502
5.284
6.106
5.935
3.887
4.772
4.259
6.398
4.999
7.121
7.279
6.423
7.188
4.582
6.239
5.681
6.248
-0.324
1.039
1.305
0.364
1.557
2.412
1.923
1.843
1.435
-0.107
-0.567
-0.619
1.798
-0.507
-1.628
-0.367
-0.037
-0.302
-0.218
-1.698
2.269
2.016
2.147
1.242
2.220
2.226
4.549
2.752
5.464
3.657
3.197
5.009
3.211
2.527
1.234
4.877
1.718
6.510
3.313
1.596
5.699
1.848
1.564
-0.577
-0.962
-2.320
314
315
316
317
318
319
320
321
322
323
324
325
326
327
328
329
330
331
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
345
346
347
348
349
350
351
352
353
354
355
356
357
358
359
CD1
CD2
CE1
CE2
CG
CZ
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HN
HZ
N
O
C
CA
CB
HA
HB1
HB2
HB3
HN
N
O
C
CA
CB
CD
CG
HA
HB1
HB2
HG1
HG2
HN
N
O
OE1
OE2
C
CA
CB
CG
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
PHE
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
GLU
ASP
ASP
ASP
ASP
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
21
21
21
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
22
22
22
22
22
22
22
22
23
23
23
23
53
77.290
78.658
78.130
79.498
77.553
79.233
77.143
76.725
75.629
76.445
78.860
77.928
80.342
75.402
79.856
76.082
79.406
80.812
79.782
79.546
80.161
80.489
79.094
78.887
77.724
78.524
81.441
81.429
81.951
82.224
83.716
83.246
82.876
81.305
82.617
84.094
82.790
80.462
80.988
81.673
84.860
82.924
79.008
80.166
81.258
82.293
4.432
6.457
3.919
5.943
5.701
4.674
4.606
7.326
5.962
3.854
7.427
2.948
6.521
6.699
4.296
6.023
6.112
6.328
7.427
8.214
8.099
8.587
7.570
9.045
6.929
6.856
5.841
3.524
4.896
4.914
4.013
3.828
5.091
4.731
5.880
3.905
2.855
6.360
5.939
3.083
4.396
3.770
1.202
1.526
0.462
0.624
-3.964
-3.857
-4.976
-4.869
-3.404
-5.429
-1.038
-2.298
-2.524
-3.619
-3.428
-5.405
-5.215
-0.153
-6.226
0.049
-1.332
1.307
1.063
2.345
0.306
2.717
3.087
2.141
1.159
0.597
0.367
2.489
2.909
4.416
6.209
4.765
2.387
4.953
4.697
4.101
4.657
3.279
2.567
1.366
6.395
7.105
4.028
3.088
3.240
2.126
360
361
362
363
364
365
366
367
368
369
370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
380
381
382
383
384
385
386
387
388
389
390
391
392
393
394
395
396
397
398
399
400
401
402
403
404
405
HA
HB1
HB2
HN
N
O
OD1
OD2
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
HG12
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
HA1
HA2
HN
N
O
C
CA
CB
HA
HB1
HB2
HG
HN
N
O
OG
C
CA
CB
CG
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
ASP
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
SER
ASN
ASN
ASN
ASN
23
23
23
23
23
23
23
23
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
24
25
25
25
25
25
25
25
26
26
26
26
26
26
26
26
26
26
26
27
27
27
27
54
79.803
80.815
81.740
80.546
80.712
78.738
81.944
83.419
76.220
77.201
76.452
75.356
77.437
77.574
76.005
74.948
75.774
74.571
76.907
77.904
78.194
78.583
78.326
75.435
75.421
75.378
75.672
74.368
76.912
76.266
74.980
74.695
76.044
77.094
76.344
77.984
77.342
77.301
76.288
75.952
74.373
76.569
72.000
72.597
71.659
70.341
1.512
-0.521
0.577
3.247
2.849
0.035
0.391
0.978
1.020
2.036
3.358
3.139
4.413
1.667
3.695
4.094
2.641
2.530
5.333
4.061
4.590
3.145
2.235
0.420
0.019
-0.117
-1.121
0.057
1.330
0.826
-0.875
1.142
1.375
0.449
2.398
0.457
0.793
-1.485
1.817
1.138
0.018
-0.869
3.480
2.096
1.272
1.031
2.070
3.175
4.200
4.266
3.387
4.309
0.981
2.437
4.845
5.422
5.667
6.712
6.176
6.366
4.743
7.012
7.574
6.289
6.377
7.084
5.427
4.259
4.514
5.580
1.370
2.879
3.149
3.219
2.994
3.531
0.647
-1.220
-0.547
-1.163
-0.713
-0.549
-2.154
-1.164
1.511
0.889
-1.607
-1.243
-2.214
-1.987
-1.102
-1.841
406
407
408
409
410
411
412
413
414
415
416
417
418
419
420
421
422
423
424
425
426
427
428
429
430
431
432
433
434
435
436
437
438
439
440
441
442
443
444
445
446
447
448
449
450
451
HA
HB1
HB2
HD21
HD22
HN
N
ND2
O
OD1
C
CA
CB
CD
CE
CG
HA
HB1
HB2
HD1
HD2
HE1
HE2
HG1
HG2
HN
HZ1
HZ2
HZ3
N
NZ
O
C
CA
HA1
HA2
HN
N
O
C
CA
CB
HA
HB1
HB2
HB3
ASN
ASN
ASN
ASN
ASN
ASN
ASN
ASN
ASN
ASN
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
LYS
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
ALA
27
27
27
27
27
27
27
27
27
27
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
29
29
29
29
29
29
29
30
30
30
30
30
30
30
55
72.705
71.463
72.122
69.220
68.366
74.215
73.908
69.216
70.797
70.336
71.675
72.374
71.408
71.074
71.657
72.041
73.224
71.198
70.488
70.926
70.126
71.964
72.511
72.251
72.961
73.789
70.971
69.751
70.424
72.840
70.623
71.631
70.012
70.440
69.565
71.099
71.192
71.129
70.536
69.622
68.572
67.287
68.365
67.506
66.588
66.855
1.599
1.809
0.324
1.746
1.203
3.075
2.204
1.354
3.679
0.545
6.352
5.796
5.813
5.102
4.276
5.084
6.420
6.835
5.319
6.119
4.680
3.310
4.790
4.062
5.580
4.223
4.489
4.590
3.083
4.436
4.096
5.697
9.597
8.177
7.592
8.191
8.037
7.558
10.219
12.492
11.473
11.691
11.608
11.687
10.899
12.642
-2.939
-0.187
-0.872
-0.367
-1.730
-1.031
-1.358
-1.265
-2.043
-2.955
-1.607
-2.844
-4.030
-6.402
-7.550
-5.217
-3.076
-4.308
-3.752
-6.732
-6.099
-7.179
-7.966
-4.941
-5.494
-2.720
-9.505
-8.327
-8.730
-2.599
-8.608
-0.566
-0.919
-0.604
-0.364
0.251
-2.574
-1.721
-1.843
0.062
-0.369
0.416
-1.420
1.473
0.189
0.141
452
453
454
455
456
457
458
459
460
461
462
463
464
465
466
467
468
469
470
471
472
473
474
475
476
477
478
479
480
481
482
483
484
485
486
487
488
489
490
491
492
493
494
495
496
497
HN
N
O
C
CA
CB
CD
CG1
CG2
HA
HB
HD1
HD2
HD3
HG11
HG12
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
CB
CD
CG1
CG2
HA
HB
HD1
HD2
HD3
HG11
HG12
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
HA1
HA2
HN
ALA
ALA
ALA
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
ILE
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
30
30
30
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
31
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
32
33
33
33
33
33
56
68.674
69.058
70.258
71.219
70.782
70.191
68.228
68.883
69.916
71.650
70.897
68.981
67.495
67.742
69.095
68.208
69.041
70.766
69.750
69.267
69.802
72.128
72.298
70.911
69.881
67.420
68.466
70.057
70.912
70.028
67.719
66.464
67.334
68.337
68.333
69.674
71.106
69.518
69.857
70.573
72.544
74.588
74.548
74.940
75.169
72.951
9.576
10.115
13.128
13.175
13.594
15.016
16.362
14.975
15.549
13.610
15.668
17.120
16.405
16.542
14.669
14.264
15.065
15.348
16.615
12.112
12.646
13.773
11.030
11.669
10.629
10.157
11.156
10.386
12.506
9.699
9.151
10.373
10.243
11.294
12.104
11.232
10.256
9.495
11.710
12.150
10.069
9.689
11.032
10.917
11.729
12.328
0.570
-0.153
-0.777
3.305
1.904
1.983
2.801
2.786
0.570
1.261
2.479
2.970
3.593
1.854
3.800
2.332
0.163
-0.065
0.615
1.996
1.373
3.882
5.186
5.185
5.673
5.909
5.396
7.178
5.867
5.141
5.651
5.455
6.982
4.333
5.898
7.730
7.403
7.464
3.347
3.850
4.457
6.784
6.082
5.082
6.624
6.563
498
499
500
501
502
503
504
505
506
507
508
509
510
511
512
513
514
515
516
517
518
519
520
521
522
523
524
525
526
527
528
529
530
531
532
533
534
535
536
537
538
539
540
541
542
543
N
O
C
CA
CB
CD1
CD2
CG
HA
HB1
HB2
HD11
HD12
HD13
HD21
HD22
HD23
HG
HN
N
O
C
CA
CB
CE
CG
HA
HB1
HB2
HE1
HE2
HE3
HG1
HG2
HN
N
O
SD
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
GLY
GLY
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
LEU
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
MET
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
33
33
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
34
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
35
36
36
36
36
36
36
36
36
57
73.200
74.244
75.301
75.084
76.217
78.684
77.717
77.600
74.150
76.156
76.096
79.656
78.538
78.622
78.754
77.148
77.335
77.736
75.269
75.007
75.737
74.429
75.166
74.631
76.227
75.516
76.217
74.641
73.619
77.206
76.167
76.058
75.441
76.542
74.653
74.997
75.014
74.968
72.476
72.350
70.864
70.081
70.725
72.706
70.473
70.559
11.563
8.664
8.744
8.449
7.559
7.315
9.588
8.095
7.919
7.532
6.558
7.697
7.427
6.269
9.890
10.167
9.762
7.954
10.532
9.687
7.874
9.387
10.357
11.774
15.325
12.774
10.340
12.004
11.838
15.094
15.010
16.390
12.598
12.651
10.624
9.970
8.418
14.458
7.326
8.782
9.181
8.345
10.664
8.877
9.002
8.411
6.003
6.194
10.295
8.812
8.267
7.932
8.339
8.682
8.702
7.189
8.653
8.204
6.868
8.195
8.384
9.051
7.344
9.745
8.466
8.045
11.050
13.024
12.106
12.324
10.980
11.578
12.350
13.378
11.950
11.371
9.949
11.040
10.515
11.892
10.067
10.710
13.510
11.950
13.689
14.125
14.082
15.096
14.430
15.140
13.090
16.062
544
545
546
547
548
549
550
551
552
553
554
555
556
557
558
559
560
561
562
563
564
565
566
567
568
569
570
571
572
573
574
575
576
577
578
579
580
581
582
583
584
585
586
587
588
589
HG12
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
HA1
HA2
HN
N
O
C
CA
HA1
HA2
HN
N
O
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
HG12
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
O
C
CA
CB
CG1
CG2
HA
HB
HG11
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
GLY
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
36
36
36
36
36
36
36
36
37
37
37
37
37
37
37
38
38
38
38
38
38
38
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
39
40
40
40
40
40
40
40
40
58
70.061
69.071
69.680
71.247
71.150
72.731
73.147
73.134
71.371
71.901
71.310
72.926
71.336
71.846
70.162
70.989
71.872
71.332
72.757
73.223
72.272
71.486
69.012
68.737
67.286
66.924
67.149
68.851
66.620
67.662
66.900
65.952
66.150
67.335
67.866
69.334
69.677
69.369
68.230
69.084
68.748
67.256
69.098
70.125
69.324
67.062
7.314
8.720
10.936
11.257
10.847
10.431
9.646
6.528
4.622
5.622
5.557
5.375
7.658
6.982
4.412
3.638
3.026
2.228
2.618
4.207
4.002
4.206
3.520
4.079
3.743
4.459
2.231
5.152
4.068
4.230
5.525
4.126
2.001
1.728
1.897
3.064
3.526
2.350
2.700
3.921
5.047
5.382
4.595
3.659
5.927
6.294
14.774
15.167
14.436
13.693
15.406
12.849
13.261
14.356
13.076
12.067
11.166
11.834
12.078
12.571
13.174
15.898
14.828
14.341
15.294
13.712
13.831
16.870
18.085
16.693
16.307
15.005
16.111
16.717
17.093
14.251
15.175
14.669
15.770
17.048
15.375
14.930
15.724
18.230
20.808
20.479
21.476
21.395
22.897
20.588
21.226
21.940
590
591
592
593
594
595
596
597
598
HG12
HG13
HG21
HG22
HG23
HN
N
OT1
OT2
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
VAL
40
40
40
40
40
40
40
40
40
59
66.679
66.973
68.987
70.120
68.437
68.562
68.848
67.102
68.713
4.577
5.515
5.427
4.245
3.796
5.275
4.354
2.647
1.841
21.825
20.361
23.577
22.922
23.198
18.934
19.106
20.346
21.528
Related documents
Определение аминокислотного состава пива и сусла
Определение аминокислотного состава пива и сусла
Новый подход к синтезу син-строительного блока молекул
Новый подход к синтезу син-строительного блока молекул
«Спектральные методы исследования природных соединений
«Спектральные методы исследования природных соединений
Задача по расшифровке генетического кода
Задача по расшифровке генетического кода
Cравнение аминокислотных и нуклеотидных
Cравнение аминокислотных и нуклеотидных
Download
advertisement