Семинар Состав биологических мембран Липиды

МИТХТ
Семинар
Состав биологических мембран
Липиды, формирующие мембрану
микобактерии
•Состав биологических мембран
• Структура мембранных липидов
• Типы и классы липидов
•Схема клеточной стенки микобактерий
• Типы миколовых кислот
•Исследование липидов Mycobacterium smegmatis
(активное и дормантное состояние)
МИТХТ
Состав биомембран
•
•
•
•
Основные компоненты биомембран:
Липиды
Белки
Углеводы (в составе гликолипидов и
гликопротеинов)
Мембраносвязанная вода
Липиды и белки - 93-99%,
Углеводы – 1-7%
МИТХТ
Соотношение между белками и липидами в составе
различных мембран варьирует в широких пределах:
Мембра
на
Белки,
%
Липиды, Углеводы,
%
%
Печень
мыши
44
52
4
Внутрен
няя
митохон
дрий
76
24
0
Миелин
18
79
3
Эритро
цит
49
43
8
МИТХТ
Липиды
Липиды – производные высших жирных кислот,
спиртов и альдегидов.
• В состав молекул липидов входят гидрофобные и
гидрофильные компоненты.
• По химическому строению липиды очень разнообразны.
• Физические свойства липидов – нерастворимые в воде
маслянистые вещества, из клеток липиды
экстрагируют неполярными растворителями (эфир,
хлороформ).
Глицерофосфолипиды
МИТХТ
Структура
Название
Фосфатидовая кислота
(ФК)
CH2CH2N (CH3)3
Фосфатидилхолин
(ФХ)
CH2CH2NH2
Фосфатидилэтаноламин (ФЭА)
CH2 CH COOH
Фосфатидилсерин
(ФС)
Фосфатидилглицерин
(ФГ)
Фосфатидилинозит
(ФИ)
H
+
CH2OCOR1
R2OCO C H
CH2
O
O P O
-
NH2
CH CH2OH
O
CH2
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
CH2 O P O CH2
CH2OCOR1
R2OCO C H
CH2
O
CHOH
O P O CH2
-
O
-
O H C OCOR2 Дифосфатидилглицерин (ДФГ)
CH2OCOR1
(Кардиолипин)
МИТХТ
2. Гликоглицеролипиды
Структура
Название
H2COH
O
HO
O
CH2
Моногалактозилдиглицерид
Моногалактозил(МГДГ)
диглицерид (МГДГ)
CHOCOR 2
OH
CH2OCOR1
OH
H2COH
O
HO
OH
O
O
OH HO
Дигалактозил(ДГДГ)
диглицерид
(ДГДГ)
Дигалактозилдиглицерид
CH2
O
CH2
CHOCOR 2
OH
CH2OCOR 1
OH
H2C
SO3H
O
OH
Сульфолипид
OH
O
OH
CH2
CHOCOR 2
CH2OCOR 1
Сульфолипид
Гликоглицеролипиды
содержаться в
основном в
мембранах растений ,
сине-зеленых
водорослях и
бактериях.
Сфинголипиды
МИТХТ
Название
Структура
Церамид (Сеr)
Фосфосфинголипиды
H
O
+
CH3(CH2)12 CH CH CH OH
CH3(CH2)n
C
O
P OCH2CH2N (CH3)3 Сфингомиелин
-
O
O
NH C H
CH2 O
Cer-1-фосфорилэтаноламин
P OCH2CH2NH2
-
O
Гликосфинголипиды
β
D
Gal
β
D
Glc
Галактозилцерамид
Глюкозилцерамид
Ганглиозиды
Glc
Gal
NeuNAc
Glc
Gal
GalNAc
GM3
GM2
NeuNAc
Glc
Gal
GalNAc
NeuNAc
Gal
GM1
Липидный состав некоторых
биологических мембран
МИТХТ
( в % от общего количества)
Митохондрии E. coli
сердца быка
Липид
Эритроциты
человека
Миелин
человека
ФК
1,5
0,5
0
0
ФХ
19,0
10,0
39,0
0
ФЭ
18,0
20,0
27,0
65
ФГ
0
0
0
18
ФИ
1,0
1,0
7,0
0
ФС
8,5
8,5
0,5
0
ДФГ(КЛ)
0
0
22,3
12
СМ
17,5
8,5
0
0
Гликолипиды
10,0
26,0
0
0
Холестерин
25,0
26,0
3,0
0
МИТХТ
•
•
•
•
Минорные липидные компоненты
биомембран
Свободные жирные кислоты
Лизофосфолипиды
Моноацил- и диацилглицерины
Полиизопреноидны (убихиноны и менахиноны)
МИТХТ
Высшие жирные кислоты (ж.к.) RCOOH
• двойные связи в цис-кофигурации приводят к сильному
изгибу цепей ж.к.
МИТХТ
Биосинтез жирных кислот
• Практически все организмы способны к превращениям:
8СН3СООН → 16:0 → 18:0 → 18:1n-9 (ф-ты элонгазы и десатуразы)
• Грибы, водоросли, растения могут синтезировать
полиеновые ж.к.: 18:1n-9 → 18:2n-6 → 18:3n-3
• Для животных полиненасыщенные ж.к. являются
незаменимыми, однако затем эти п.н.ж.к. могут
претерпевать сложные превращения:
18:2n-6 → 18:3n-6 → 20:3n-6 → 20:4n-6 → 22:4n-6 → 22:5n-6
18:3n-3 → 18:4n-3 → 20:4n-3 → 20:5n-3 → 22:5n-3 → 22:6n-3
МИТХТ
Распространенные жирные кислоты
в составе мембранных липидов
МИТХТ
Полярные липиды археобактерий
имеют необычное строение
Дифитанильные
группы
Глицерин
Фосфат
Глицерин
Углевод
МИТХТ
SL
TDM
LOS
P
PIM
LAM
PGL
Схема клеточной стенки микобактерий
outer layer (~12 nm):
phospholipids, complex catamphiles,
phenolic glycolipids, sulfolipids, etc.
electron transparent layer (~8 nm):
mycolic acids
cell wall skeleton (~13 nm):
arabino galactan, peptidoglycan
cytoplasmic membrane (~7 nm)
PGL- фенольные гликолипиды, РIM-фосфатидилинозитманнозид,
LAM-липоарабиноманнан, Р-белки-порины, LOS-липоолигосахарид,
SL-сульфолипиды, TDM-димиколат трегалозы.
Схематическое изображение клеточной оболочки M.
tuberculosis;
А-плазматическая
мембрана,
Впептидогликан,
С-арабиногалактан,
D-кепированный
маннозой
липоарабиноманнан,
Е-плазматические
и
связанные с клеточной оболочкой белки, F-миколовые
кислоты, G-поверхностные молекулы ГЛ, связанные с
миколовыми кислотами
Схематичное представление клеточной стенки M. tuberculosis
Схема расположения липидных классов на пептидогликан-арабиногалактоновом
скелете
(1)-после обработки стеклянными шариками, (2)-Tween 80 в течение одного часа,
(3)-стеклянные шарики после Tween 80 в течение одного часа, (4)- Tween 80 в
течение четырех часов, (5)- стеклянные шарики после Tween 80 в течение
четырех часов, (6)- Tween 80 в течение ночи. PGLs-ГПЛ, LOSsлипоолигосахариды, DIMs-димикоцерозат фтиоцерола (Ι) или фтиодиолона (Ι Ι),
PE-фосфатидилэтаноламин, PIMs-ФИМ, DATs-2,3-диацил-трегалоза, PPTsполифтиеноил трегалозы DMTs-димиколат трегалозы, MMTs-мономиколат
трегалозы, TAGs-триацилглицериды.
Нейтральные липиды
Триглицериды – резерв энергии
Эфиры вторичных спиртовдиэфир фтиоцерола и микоцерозиновой кислоты
Димикоцерозат фтиоцерола –
ответственен за вирулентность
патогенных микобактерий.
Гликолипиды
Микозиды –
фенольные
гликолипиды
Обуславливают
вирулентность
микобактерий
Микозид A: R — трисахарид, х=16, 17, 18, 19, 20; микозид, В: R — 2-0 метил-D- рамноза, х=14, 15, 16, 17, 18; R' — везде ацил (нормальные
жирные и микоцерозиновые кислоты).
Кордфактор – 6,6-димиколаттрегалозы
Микобактерии,
содержащие это вещество,
образуют на плотных
средах жгутообразные колонии
(cord — жгут).
Обуславливает токсичность
микобактерий.
Обладает адъювантной
активностью
Гликопептидолипиды
1. Микозид С6
2. Воск D – смесь пептидогликолипидов и гликолипидов;
90% - миколатарабиногалактан, 8% - фосфорилированный
мукопептид;
- локализован в клеточной стенке,
- обладает противоопухолевой и адъювантной активностью
Миколовые кислоты
МИТХТ
OH
CH3(CH2)xCH
C
H
H
(CH2)zCH C COOH
(CH3)21CH3
содержат от 60 до
90 атомов
углерода
Типы миколовых кислот микобактерий
Метаболизм миколовых кислот
Разделение миколовых кислот M.smegmatis на
пластине, импрегнированной нитратом серебра
Объекты исследования – M. tuberculosis и M.
smegmatis
А
Б
А
M. tuberculosis,
окрашенные по ЦильНильсену
Характеристика M.
tuberculosis1 (исследовали
штамм H37Rv):
ростовая среда Дюбо,
время роста 14 дней;
M. smegmatis, находящиеся в метаболически активном
(А) и дормантном (Б) состоянии
Характеристика М. smegmatis2
(исследовали штамм mc2155):
ростовая среда Hartman's de
Bont (с добавлением бычьего
-активные клетки - КОЕ> 0;
сывороточного альбумина
для выращивания
-дормантные клетки - КОЕ=0, дормантных клеток), время
роста 72 часа
низкий уровень метаболизма;
1
2
Опыты с M. tuberculosis проводились в ЦНИИТ РАМН
Образцы биомассы M. smegmatis выращивались в Институте Биохимии им. А.Н. Баха
РАН
25
Сравнение липидного
состава M. smegmatis,
находящихся в
активном и
дормантном
состоянии
Схема эксперимента
26
Количественное содержание липидов и
гидрофобных
белковТаблица
в клетках
M. smegmatis
1
Количественное содержание липидов и
белков в клетках
Клетки
Масса
липидов/ма
сса сухой
биомассы,
%
Масса
гидрофобных
белков/масса
сухой
биомассы, %
Активные
15,0±2,8
0,26±0,08
Дормантные
7,2±2,1
1,10±0,10
Таблица 2
Содержание различных классов липидов в
клетках
Клетки
Классы липидов
Масса
ФЛ/масса
суммарных
липидов, %
масса ГЛ и
ГПЛ/масса
суммарных
липидов, %
Масса
НЛ/масса
суммарны
х липидов,
%
Активные
36,9±7,1
15,1±4,1
48,0±3,0
Дормантные
31,6±5,0
25,1±3,0
43,3±1,9
27
ТСХ липидов активных и дормантных
клеток
Х
У
а
г
1
2
3
4
5
5 в системе хлороформТСХ
метанол-вода 65:25:4 (по
объему).
1- ФЛ активных клеток;
2- ФЛ дормантных клеток;
3- стандарт ФЭ;
4-стандарт
фосфатидилсерин (ФС);
5- стандарт ФИ;
6 – стандарт КЛ.
Проявление
–
реактив
молибденовый
синий
6
1
б
в
2
ТСХ в системе
хлороформметанол 9:1 (по
объему).
1ГЛ
и
ГПЛ
дормантных
клеток; 2- ГЛ и ГПЛ
активных клеток.
Проявление αнафтол → серная
кислота
→
нагревание
1
2
3
4
ТСХ в системе гександдиэтиловый эфир 1:1 (по
объему).
1- НЛ дормантных клеток;
2- НЛ активных клеток;
3стандарт
моноацилглицерин;
4стандарт диацилглицерин;
5стандарт
триацилглицерин.
Проявление - 10% серная
кислота
в
этаноле
→
28
нагревание
ТСХ-пластина Метиловых Эфиры Миколовых кислот
МЭЖК, Rf 0,92
МЭОК, Rf 0,81
α
κ
МЭМК
Rf 0,74
Rf 0,59
фракции, содержащие метиловые эфиры МК в системе
гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (55:45:1)
1, 3, 5, 7 – метиловые эфиры МК в липидных экстрактах клеток
M.smegmatis активных (72 ч.) и НК (24 ч., 48ч., 72 ч.) соответственно;
2, 4, 6, 8 – метиловые эфиры МК в гидролизатах клеток M.smegmatis
активных (72 ч.) и НК (24 ч., 48ч., 72 ч.) соответственно;
9, 10, 11 – стандарты миколовых кислот, метилового эфира олеиновой
кислоты, метилового эфира ЖК (пальмитиновой) соответственно.
Визуализация: 60% серная кислота в этаноле с последующим
прожиганием.
МИТХТ
Особенности липидного состава мембран
• Каждая конкретная мембрана уникальна по своему
составу
• Липидный состав различных мембран не является
случайным
• Мембрана может содержать более 100 различных типов
липидных молекул
Причины многообразия мембранных липидов
во многом остаются неясными.
Очевидно, липиды активно участвуют в
биохимических процессах, протекающих
на мембранах клеток.