Диссертация - Институт химической физики им. Н.Н. Семенова
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ «МЕЖДУНАРОДНЫЙ ТОМОГРАФИЧЕСКИЙ ЦЕНТР» СО РАН На правах рукописи ФИШМАН НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА КИНЕТИКА И МЕХАНИЗМ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫХ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ КОРОТКОЖИВУЩИХ РАДИКАЛОВ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ И ПУРИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ 01.04.17 – химическая физика, горение и взрыв, физика экстремальных состояний вещества Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель: кандидат химических наук Морозова Ольга Борисовна Новосибирск 2016 2 Оглавление Введение .........................................................................................................................................4 Глава 1. Литературный обзор .......................................................................................................9 1.1. Фотосенсибилизированные реакции при окислении белков. .........................................9 1.2. Фотоиндуцированное окисление ароматических аминокислот триплетновозбужденными 2,2'-дипиридилом и производными флавина ............................................13 1.3. Фотосенсибилизированные реакции при повреждении ДНК. Фотосенсибилизация хромофорами экзогенного происхождения на примере производных бензофенона ........18 1.4. Применение метода ХПЯ с временным разрешением для изучения фотоиндуцированных радикальных реакций. .......................................................................25 Глава 2. Экспериментальная часть ............................................................................................ 31 2.1. Материалы и реактивы .....................................................................................................31 2.2. Методы исследования ......................................................................................................31 2.2.1. ХПЯ с временным разрешением...............................................................................31 2.2.2. Наносекундный лазерный импульсный фотолиз ....................................................33 2.2.3. Измерение рН .............................................................................................................34 2.2.3. Расчеты DFT ...............................................................................................................35 2.3. Математическая обработка экспериментальных данных .............................................35 2.3.1. Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции тушения kqobs от рН водного раствора ..................................................................................................................35 2.3.2. Зависимость амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора .................................................................................................................................39 2.3.3. Кинетика ХПЯ ............................................................................................................39 Глава 3. Фотоиндуцированное окисление ароматических аминокислот триплетновозбужденным 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном (TCBP) ................................................42 3.1. Определение значений рКа для TCBP, N-ацетилтирозина, дипептидов гистидилгистидин, гистидил-фенилаланин и фенилаланил-гистидин ..............................................42 3.2. Реакции тушения триплетного состояния TCBP ароматическими аминокислотами 48 3.2.1. Триптофан и N‐ацетил‐триптофан ...........................................................................49 3.2.2. Гистидин и N‐ацетил‐гистидин ................................................................................50 3.2.3. Тирозин и N‐ацетил‐тирозин ....................................................................................52 3.3. Зависимости амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора.....................................................................................................................................54 3.3.1. Триптофан и N‐ацетил‐триптофан ...........................................................................55 3.3.2. Гистидин и N‐ацетил‐гистидин ................................................................................56 3 3.3.3. Тирозин и N‐ацетил‐тирозин ....................................................................................57 3.3.4. Гистидил-гистидин, гистидил-фенилаланин и фенилаланил-гистидин ...............58 3.4. Кинетический изотопный эффект в фотореакции гистидина с ТСВР .........................60 3.5. Механизмы реакций .........................................................................................................62 3.6. Заключение ........................................................................................................................65 Глава 4. Кинетика и механизм фотоиндуцированного окисления дипептида триптофилтриптофан (Trp-Trp) триплетно-возбужденным 2,2'-дипиридилом (DP)............................... 67 4.1. Определение рКа дипептида Trp-Trp ..............................................................................67 4.2. Спектры ХПЯ в фотореакции дипептида Trp-Trp с DP и механизм этой реакции ....68 4.3. Кинетика ХПЯ в фотореакции дипептида Trp-Trp с DP ...............................................71 4.4. Влияние реакции депротонирования короткоживущих радикалов на кинетику ХПЯ ...................................................................................................................................................76 4.4.1 Депротонирование короткоживущего катион-радикала гуанозина ......................76 4.4.1 Депротонирование короткоживущего катион-радикала дипептида Trp-Trp ........80 4.5. Заключение ........................................................................................................................80 Глава 5. Окисление пуриновых нуклеотидов триплетно-возбужденным ТСВР...................82 5.1. Реакции тушения триплетного состояния TCBP пуриновыми нуклеотидами ...........82 5.2. Зависимости амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора.....................................................................................................................................87 5.3. Механизмы реакций .........................................................................................................93 5.4. Заключение ........................................................................................................................97 Основные результаты и выводы ................................................................................................ 99 Список используемых сокращений .........................................................................................100 Список литературы ....................................................................................................................101 4 Введение Актуальность темы исследования. Во многих биологических системах важные функциональные процессы происходят с участием промежуточных короткоживущих радикалов. Роль радикалов аминокислотных остатков в качестве промежуточных звеньев при передаче электрона или атома водорода вызывает растущий научный интерес. Установлено, что триптофан и тирозин участвуют в качестве промежуточных окислительно-восстановительных реагентов в многостадийных процессах внутримолекулярного переноса электрона (ВПЭ) на большие расстояния в белках [1, 2]. Предполагается также, что гистидин может являться одним из промежуточных агентов в цепи передачи неспаренного электрона к конечному акцептору [3], а также напрямую участвовать в окислительных процессах в живой клетке [4, 5]. Для процессов одноэлектронного окисления некоторых белков и пептидов показано, что процессы переноса электрона протекают с локализацией неспаренного электрона на имидазольном кольце гистидина [6]. Из перечисленного выше следует, что радикалы триптофана, тирозина и гистидина играют важную роль в целом ряде биохимических процессов. Наибольшее количество работ относятся к исследованию переноса электрона между остатками триптофана и тирозина методами оптической спектроскопии промежуточного поглощения и химической поляризации ядер (ХПЯ) с временным разрешением. Комбинирование ХПЯ с временным разрешением и лазерного импульсного фотолиза (ЛИФ) и применение этих методов в сходных экспериментальных условиях (одна и та же длина волны для возбуждения красителя, концентрация реагентов и т.д.) позволяет наиболее полно характеризовать фотоиндуцированные радикальные реакции с участием биологически значимых молекул. ХПЯ создается в результате спин-селективной рекомбинации радикалов и наблюдается в виде аномальных интенсивностей и фаз спектральных линий в спектрах ядерного магнитного резонанса (ЯМР) диамагнитных продуктов радикальных реакций. Преимущество метода ХПЯ с временным разрешением состоит в том, что он позволяет легко разделять вклады от геминальных и внеклеточных процессов и определять константы скоростей радикальных химических реакций. Метод ХПЯ с временным разрешением позволяет изучать радикальные реакции, не сопровождающиеся изменениями в оптических спектрах поглощения (например, реакции вырожденного электронного обмена). Данный метод необходим также для установления структуры и реакционной способности радикальных интермедиатов, особенно в условиях, 5 когда образующиеся в ходе реакции короткоживущие радикалы обладают низкими коэффициентами поглощения, либо их спектры поглощения перекрываются. Например, ХПЯ используется для изучения оптически недетектируемых радикалов, таких как радикалы гистидина. Тем не менее, при изучении реакций переноса электрона с участием радикала гистидила возникают трудности [7]: среди ароматических аминокислот реакционная способность гистидина по отношению к триплетам производных флавина и дипиридила намного ниже, чем тирозина и триптофана [8]. Таким образом, для изучения радикальных реакций с участием радикалов всех трех ароматических кислот методом ХПЯ с временным разрешением актуальной является задача подобрать такой водорастворимый краситель, триплеты которого реагируют с гистидином, триптофаном и тирозином с примерно одинаковой эффективностью. Что касается нуклеиновых кислот и их строительных блоков, они оказываются вовлеченными в патологические процессы в результате отрыва электрона от оснований ДНК [9, 10]. Ионизирующее излучение, фотоионизация, фотосенсибилизированное окисление эндо- и экзогенными хромофорами, такими как флавины, порфирины, бензофеноны, которые могут находиться в живой клетке, приводят к образованию короткоживущих радикалов легко окисляемых нуклеотидов. Все это предопределяет важность изучения короткоживущих радикалов нуклеотидов. Однако высокая реакционная способность, короткие времена жизни и низкая концентрация радикальных интермедиатов сильно осложняют их выявление и исследование. Использование комбинации двух методов – лазерного импульсного фотолиза и ХПЯ с временным разрешением – дает возможность для детального исследования реакций фотоиндуцированного окисления пуриновых нуклеотидов. Информация о механизмах фотохимических реакций с участием структурных единиц нуклеиновых кислот является важной и актуальной задачей, так как является важным шагом для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живой природе. Цели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы было установление ароматических кинетики и механизма аминокислот и реакции фотоиндуцированного пуриновых нуклеотидов окисления 3,3',4,4'- тетракарбоксибензофеноном (TCBP), а также дипептида Trp-Trp 2,2'-дипиридилом (DP) в широком диапазоне рН водных растворов. Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи: 6 – подобрать короткоживущих водорастворимый радикалов фотосенсибилизатор гистидина, триптофана и для тирозина фотогенерации со сравнимой эффективностью – измерить рН-зависимость константы скорости тушения триплетно- возбужденного TCBP различными тушителями (ароматическими аминокислотами и пуриновыми нуклеотидами) – измерить рН-зависимость интенсивности сигналов ХПЯ геминальной рекомбинации продуктов, полученных в реакции тушения триплетно-возбужденного TCBP различными ароматическими аминокислотами и пуриновыми нуклеотидами – получить кинетические данные ХПЯ в реакции фото-окисления дипептида TrpTrp 2,2'-дипиридилом Научная новизна. фотосенсибилизатора Показано, что при использовании 3,3,4,4-тетракарбоксибензофенона водорастворимого (ТСВР) фотогенерация короткоживущих радикалов гистидина, триптофана и тирозина происходит со сравнимой эффективностью, что открывает возможность изучать реакции с участием радикалов этих биологически значимых молекул методом ХПЯ. Впервые установлен механизм реакции окисления ароматических аминокислот Trp, Tyr, His, и их N-ацетилпроизводных, а также пуриновых нуклеотидов АМР и GMP триплетно-возбужденным ТСВР в диапазоне рН от 2 до 12. Проведены кинетические измерения и установлен механизм радикальных реакций, протекающих при фотоиндуцированном окислении дипептида Trp-Trp триплетно-возбужденным 2,2'дипиридилом в водных растворах в широком диапазоне значения рН. Выявлено влияние заряда аминогруппы на окисление дипептида, состоящего из двух ХПЯ-активных аминокислот. Практическая значимость работы. Получены данные о том, что фотосенсибилизатор 3,3,4,4-тетракарбоксибензофенон может быть использован для генерации радикала гистидина со сравнимой эффективностью, что и радикалов тирозина и триптофана, что позволяет изучать методом ХПЯ реакции переноса электрона на радикал гистидина в пептидах и белках. Данные о константах скорости реакции тушения необходимы для точного определения начального соотношения радикалов тирозина, триптофана и гистидина, образовавшихся на геминальной стадии. Последнее позволяет исключить данный параметр из варьируемых в уравнениях, описывающих кинетику ХПЯ. В результате точность моделирования повышается. 7 Методы исследования. В работе были совместно использованы методы ХПЯ с временным разрешением и лазерного импульсного фотолиза. Методом ЛИФ были измерены наблюдаемые константы скорости тушения триплетно-возбужденного красителя ароматическими аминокислотами и пуриновыми нуклеотидами в широком диапазоне рН водных растворов; методом ХПЯ с временным разрешением были зарегистрированы спектры ХПЯ продуктов геминальной рекомбинации короткоживущих радикалов (геминальные спектры ХПЯ) в широком диапазоне рН водных растворов и получили рН зависимости амплитуды геминальной ХПЯ. Кинетика и механизм реакции фотоиндуцированного окисления ароматических аминокислот и пуриновых нуклеотидов триплетно-возбужденным фотосенсибилизатором был установлен из совместного анализа рН зависимостей наблюдаемой константы скорости тушения и амплитуды геминальной ХПЯ. Положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся: 1. рН-зависимости наблюдаемой константы скорости тушения и интенсивности геминальной ХПЯ, полученные в реакциях триплетно-возбужденного ТСВР с ароматическими аминокислотами (Trp, Tyr, His и их N-ацетилированными производными) и пуриновыми нуклеотидами (AMP и GMP), 2. заключение о влиянии протонированного состояния аминогруппы ароматических аминокислот (Trp, Tyr, His) и фосфатной группы AMP на эффективность тушения триплетно-возбужденного TCBP, 3. зависимость эффективности процесса тушения триплетно-возбужденного DP от положительного заряда аминогруппы дипептида Trp-Trp. Степень достоверности полученных результатов. Достоверность выводов и результатов работы обеспечена применением хорошо известных и апробированных экспериментальных методов. Вновь полученные результаты находятся в согласии с имеющимися в литературе данными. Апробация результатов. Результаты, представленные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на конференциях: XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2010); X Encuentro Latiniamericano de Fotochímica y Fotobiología (Ля Серена, Чили, 2010); Central European conference on photochemistry (Бад Хофгастайн, Австрия, 2010, 2012); EMBO Practical Course «Multidimensional NMR in structural biology» (Йоахимсталь, Германия, 2012); Всероссийская молодежная школа с международным участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике» (Новосибирск, Россия, 8 2012); VIII International Voevodsky Conference «Physics and chemistry of elementary chemical processes» (Новосибирск, Россия, 2012); 13th International Symposium on Spin and Magnetic Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Бад Хофгастайн, Австрия, 2013); School for Young Scientists «Magnetic Resonance and Magnetic Phenomena in Chemical and Biological Physics» (Новосибирск, Россия, 2014). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК. Материалы диссертации полностью изложены в опубликованных работах. Личный вклад соискателя. Весь объем экспериментальных данных выполнен лично либо при непосредственном участии соискателя. Автор также участвовал в разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировке выводов и написании публикаций по теме диссертационной работы. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка работ, опубликованных по теме диссертации и списка литературы. Полный объем диссертации составляет 116 страниц с 41 рисунком и 9 таблицами. Список литературы содержит 157 наименований. 9 Глава 1. Литературный обзор 1.1. Фотосенсибилизированные реакции при окислении белков. Солнечное излучение обеспечивает функционирование и здоровье живых организмов на Земле, однако оно способно оказывать на них и разрушительное воздействие. Верхние слои атмосферы Земли поглощают УФ-излучение с длиной волны ниже 295 нм (т.е. весь УФ-С диапазон, λ=200-280 нм, и значительную часть УФ-В диапазона, λ=280-320 нм), солнечное излучение, достигающее Земной поверхности, которое состоит в основном из УФ-А излучения (λ=320-400 нм, 95% всего УФ-излучения) и видимого света, а также инфракрасного излучения. Основной мишенью для фотоповреждения под действием УФ и видимого света в клетках являются белки вследствие их высокого содержания. Фотоиндуцированное повреждение белков происходит по двум основным механизмам [11, 12]. Первый из них реализуется в основном при действии УФ-В (и в меньшей степени УФ-А) излучения, при котором прямое поглощение некоторыми аминокислотными остатками (например, триптофаном, Trp, тирозином, Tyr, гистидином, His, метионином, Met, фенилаланином, Phe, цистеином, Cys, и цистином) приводит к образованию электронно-возбужденных состояний и реакциям фотоионизации. В дополнение к прямому поглощению света могут происходить фотосенсибилизированные реакции посредством поглощения УФ или видимого света сенсибилизаторами. Эти сенсибилизаторы могут быть эндогенного происхождения (например, порфирины [13, 14], ароматические соединения - УФ-фильтры в хрусталике [15-17], витамины, такие как рибофлавин [18, 19]) и экзогенного происхождения (например, лекарства [20]). Под действием света сенсибилизаторы переходят в короткоживущее возбужденное синглетное состояние, которое посредством интеркомбинационной конверсии переходит в долгоживущее триплетное состояние. Последнее либо релаксирует в основное состояние, либо реагирует с другими соединениями по одному из двух путей (так называемые типы фотосенсибилизации 1 и 2), что может привести к повреждению молекул белков и т.д. Тип фотосенсибилизации 1 приводит к образованию свободных радикалов при одноэлектронном окислении или отрыве атома водорода от субстрата (т. е. аминокислоты в составе белка), тогда как тип 2 включает перенос энергии от возбужденного сенсибилизатора к молекулярному кислороду, что приводит сначала к формированию 10 возбужденного синглетного кислорода, который затем быстро окисляет окружающие молекулы-мишени. Сенсибилизаторы редко реагируют преимущественно по одному из двух типов фотосенсибилизации, поэтому реакции фотосенсибилизации обычно происходят через образование смеси синглетного кислорода и радикальных частиц. Профиль повреждений белков обычно формируется пропорционально доли высокореакционноспособных частиц, сформированных при фотосенсибилизации, и поэтому сильно зависит от природы сенсибилизатора, длины волны возбуждающего света и реакционных условий [21]. Повреждения белков, индуцированные УФ/ видимым излучением. Белки являются основными клеточными мишенями для прямого фотоокисления вследствие их высокой концентрации в клетках, а также из-за присутствия эндогенных хромофоров в белках (некоторые аминокислотные остатки, а также флавины и порфирины). Основным механизмом окисления аминокислот, пептидов и белков под действием УФ облучения является прямое поглощение квантов света остатками Trp, Tyr, Phe, His, Cys и цистина, тогда как другие аминокислотные остатки и пептидный остов поглощают УФ излучение с длиной волны λ<230 нм [12]. При поглощении УФ излучения хромофоры обычно переходят в их первое возбужденное синглетное состояние с коротким временем жизни. Это синглетное состояние легко теряет энергию при интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние, или при переносе энергии на другие группы при столкновениях с другими молекулами. Образующиеся в результате триплетные состояния обычно обладают более длинными временами жизни (порядка микросекунд), чем синглетное состояние, и могут вступать в реакции переноса электрона или отрыва атома водорода. Фотофизические свойства образующихся гидратированного триплетов электрона, хорошо охарактеризованы, образующегося при прямой как и свойства фотоионизации. Преобладающей является реакция гидратированного электрона с O2 с образованием O2–•. Также гидратированный электрон реагирует со свободными карбоксильными группами в белках (С-конец и остатки Asp/Glu), аминогруппами (N-конец и остатки Lys), что приводит к деаминированию и отрыву атома водорода, и с другими белковыми остатками [12]. Непрямое фотоокисление белков происходит через формирование и последующие реакции синглетного кислорода с остатками Trp, His, Tyr, Met и Cys [21, 22]. В щелочных растворах (рН>10) 1O2 реагирует также с Arg и Lys в депротонированной форме [12]. 11 1. Реакции с остатками Trp Индольное кольцо триптофана является самым сильным УФ-хромофором в белках (с полосой поглощения, отличающейся высоким молярным коэффициентом поглощения, которое происходит на бóльших длинах волн, чем для любого другого из аминокислотных остатков), однако важность триптофана как хромофора невысока вследствие его относительно низкого содержания во многих белках. Тем не менее, фотовозбуждение триптофана приводит к целому ряду фотохимических реакций. Первое триплетное состояние триптофана (3Trp) быстро вступает в реакции переноса электрона с подходящими акцепторами электрона [23], что приводит, например, в реакциях с дисульфидами к образованию катион-радикала триптофана (Trp+•) и анион-радикалов (RSSR–•). Образующийся образованием катион-радикал нейтрального радикала Trp•. триптофана быстро Последующие депротонирует реакции с нейтрального • индолильного радикала Trp с кислородом O2 дают кольцевой С-3 пероксильный радикал, который далее участвует в реакции отрыва атома водорода [24, 25]. В литературе есть упоминания о репарации индолильного и пероксильного радикалов антиоксидантами, такими как аскорбат, селеноцистеин и глутатион [26-30]. Остатки триптофана также могут участвовать в процессах прямой фотоионизации, которая происходит в результате как в одно-, так и двух-фотонных процессах [31]. В дополнение к прямой фотоионизации, остатки триптофана легко окисляются в присутствии синглетного кислорода 1O2, что приводит к образованию диоксетановых интермедиатов через образование С2-С3 двойной связи в триптофане или гидропероксидов в позиции С3 [32-34]. Данные интермедиаты могут впоследствии превращаться в N-формилкинуренин (и далее в кинуренин при гидролизе), а также в производные гидроксипироллоиндола. N-формилкинуренин и кинуренин являются наиболее важными продуктами окисления триптофана, так как являются более сильными фотосенсибилизаторами по сравнению с исходной аминокислотой и могут участвовать в большом количестве деградирующих белки процессов, в том числе в реакциях с белками хрусталика глаза [35-37]. 2. Реакции с остатками Tyr и Phe Катион-радикал тирозина может образоваться в результате прямой фотоионизации [12, 38]. Tyr участвует в похожих реакция переноса электрона, как для случая Trp, что ведет к образованию TyrОН+•, который быстро депротонирует, образуя феноксильный радикал [12]. Формирующиеся в результате этих процессов феноксильные радикалы тирозина вступают в большое количество реакций: окисления подходящих субстратов, 12 димеризации с образованием дитирозиновых аддуктов и отрыва атома водорода. Также феноксильный радикал тирозина эффективно восстанавливается низкомолекулярными антиоксидантами, такими как аскорбат, глутатион и селеноцистеин. Фотоокисление остатков тирозина синглетным кислородом приводит к формированию нестабильных эндопероксидов, которые быстро разлагаются с образованием С1 гидропероксидов и циклических продуктов [12, 38]. Вызываемое УФ-излучением окисление остатков фенилаланина протекает относительно просто по сравнению с другими ароматическими аминокислотами. Возбуждение фенилаланина в первое триплетное состояние приводит к реакции фотодиссоциации, продуктом которой является бензильный радикал [39]. При прямой фотодиссоциации Phе образуется катион-радикал, который быстро гидратируется с образованием o-, m-, p-Tyr. Однако, данные процессы имеют значение лишь при облучении Рhe коротковолновым УФ-светом [38]. 3. Реакции с остатками His Гистидин не имеет хромофорных групп, поэтому для гистидина поглощение УФили видимого света не является основным механизмом фотоиндуцированных повреждений, а большинство реакций с участием His, приводящих к повреждениям, происходят посредством фотосенсибилизированных процессов [4, 18]. Исследования модельных соединений фотосенсибилизаторов, гистидина показали в присутствии формирование флавинов, а короткоживущих также других радикалов с радикальным центром на имидазолиле. Методом ЭПР с применением спиновых ловушек было показано, что взаимодействие (по механизму фотосенсибилизации I типа) триплетно-возбужденного флавина и His сильно зависит от рН, а именно было выявлено влияние протонированных состояний иминогруппы His на скорость реакции с триплетновозбужденным флавином [4, 18]. Окисление гистидина как в свободном состоянии, так и в составе пептидов синглетным кислородом происходит через формирование эндопероксидов, разложение которых при комнатной температуре в органических растворителях ведет к образованию аспарагиновой кислоты, аспарагина, мочевины и других продуктов. В водных растворах свободный гистидин также дает бицикличные продукты [12]. Таким образом, повреждения белков, инициированные УФ-А и видимым светом, возникают в реакциях фотосенсибилизации, а также с синглетным кислородом и другими активными формами кислорода. Синглетный кислород реагирует с остатками Trp, His, Tyr, Met, Cys в основном с образованием эндопероксидов и цвиттерионных частиц. 13 Образующиеся интермедиаты подвергаются дальнейшим превращениям, в том числе и по радикальному механизму, что ведет к нарушению белковой структуры. В дополнение к фотосенсибилизированным реакциям, также могут происходить прямые реакции фотоокисления некоторых аминокислотных остатков (например, Trp), что приводит к образованию возбужденных состояний и радикальных частиц, которые также важны в фотоиндуцированной деградации белка. 1.2. Фотоиндуцированное окисление ароматических аминокислот триплетно-возбужденными 2,2'-дипиридилом и производными флавина Для изучения методом ХПЯ фотоиндуцированных реакций биологически важных молекул – аминокислот, пептидов и нуклеотидов – наиболее часто используются красители 2,2'-дипиридил и водорастворимые производные флавина: люмофлавин, рибофлавин, флавин мононуклеотид (FMN). Совместное применение ХПЯ с временным разрешением и лазерного импульсного фотолиза дает возможность для наиболее полной характеризации фотоиндуцированных радикальных реакций с участием биологически значимых молекул. В работах [8, 40-47] методом лазерного импульсного фотолиза изучены механизмы фотоиндуцированных реакций с участием триплетно-возбужденного флавина и ароматических аминокислот: триптофана, тирозина и гистидина. При облучении импульсами лазера (λ=308 нм) раствора, содержащего флавин мононуклеотид и аминокислоту (триптофан, тирозин или гистидин), происходит образование триплетновозбужденного красителя 3FMN (λmax=370 нм), который затем реагирует с аминокислотой с образованием короткоживущих радикалов FMN–• (λmax=360 нм) либо FMNН• (λmax=340 нм) [41, 47]. На рисунке 1 приведена зависимость константы скорости тушения триплетного флавина kq тремя аминокислотами, N-ацетилтирозином, N- ацетилтриптофаном и N-ацетилгистидином, от рН раствора [8, 41]. Тушение триплетновозбужденного флавина N-ацетилтирозином и N-ацетилтриптофаном происходит с постоянной во всем диапазоне рН константой скорости kq, близкой к диффузионноконтролируемому пределу. Этот факт, а также наблюдение семихинонового анионрадикала показывают, что первичным актом реакции в данном случае является перенос электрона. В отличие от N-ацетилтирозина и N-ацетилтриптофана, в случае N- ацетилгистидина константа скорости тушения триплетно-возбужденного флавина сильно 14 зависит от рН среды (см. рисунок 1). В сильнокислотной среде (рН<3) тушение не наблюдается, потому что в этой среде оба исходных реагента, триплетно-возбужденный флавин и N-ацетилгистидин, протонированы и заряжены положительно. Реакция, повидимому, является энергетически невыгодной, так как отрыв электрона привел бы к формированию высоко нестабильного дважды заряженного катион-радикала гистидина, а в случае переноса атома водорода образовался бы положительно заряженный радикал флавина. При увеличении рН в диапазоне от 3 до 7 наблюдается рост константы скорости тушения kq. При дальнейшем повышении рН наблюдается некоторое уменьшение константы скорости kq в области рН~10, а при рН>11 константа скорости резко возрастает. Уменьшение значения kq в области рН~10 связано с депротонированием исходного флавина [48]. В сильнощелочных растворах происходит депротонирование гистидина HisH→His–+H+ (символ «Н» обозначает лабильный протон имидазольного фрагмента гистидина, рКа=14.3). Анион гистидина реагирует с триплетно-возбужденным флавином по механизму переноса электрона с диффузионными скоростями [8, 41]. Первичным актом тушения триплетно-возбужденного 3FMN как протонированным HisH2+, так и HisH является перенос атома водорода, хотя константы скоростей для этих тушителей и различаются на два порядка: kq1=3.0106 М-1с-1 для HisH2+ и kq2=2.5108 М-1с-1 для HisH [8, 41]. Рисунок 1. Зависимость константы скорости тушения триплетного флавина от рН раствора. Тушители: N-AcTrp (кружки), N-AcTyr (треугольники), N-AcHis (квадраты) [8]. Фотофизика и фотохимия 2,2-дипиридила изучены довольно подробно, также как и фотохимические реакции дипиридила с ароматическими аминокислотами триптофаном, 15 тирозином и гистидином, в которых были зарегистрированы значительные эффекты ХПЯ. В зависимости от рН раствора, 2,2-дипиридил может находиться либо в протонированном (DPН+) или депротонированном (DP) состояниях (рКа=4.3) [49]. Максимум поглощения DP приходится на 281 нм с макс=14.600 M-1см-1 и 308=1.200 M-1cм-1, тогда как для протонированного DPН+ max=301 нм, 308=12.900 M-1cм-1 [42]. Таким образом, для облучения растворов дипиридила на длине волны 308 нм при рН<4.3, основным (>90%) светопоглощающим компонентом является DPН+, который интеркомбинационной конверсии дает триплетно-возбужденный рН>6.3 образуются нейтральный триплетно-возбужденный в результате Т DPН+ [50, 51]. При Т DP. При промежуточных значениях рН, 4.3<pH<6.3, свет могут поглощать как протонированные, так и депротонированные молекулы DP [50, 51]. В работе [42] методами лазерного импульсного фотолиза и ХПЯ с временным разрешением была изучена фотореакция между триплетно-возбужденным 2,2′- дипиридилом и N-ацетилтриптофаном. Было показано, что первичным фотохимическим актом в реакции триплетно-возбужденного DP с N-ацетилтриптофаном является реакция переноса электрона (kq=4109 M-1с-1). Константа скорости kq близка к диффузионно контролируемому пределу и немного снижается с повышением рН (см. рисунок 2). Авторы предполагают, что снижение происходит из-за увеличения разности зарядов реагирующих веществ. При высоких значениях рН DP присутствует в нейтральном состоянии, тогда как при pH<4.3 триплетный 3 DPH+ заряжен положительно, N- ацетилтриптофан - отрицательно (pKa=2.4) и кулоновские взаимодействия ускоряют бимолекулярную реакцию. В нейтральной или основной среде, образующийся в результате тушения триплетов красителя катион-радикал триптофан депротонирует (pKa=4.3) с образованием нейтрального радикала триптофана. Эта реакция играет ключевую роль зависимости ХПЯ от времени: вырожденный электронный обмен между протонированным катион-радикалом триптофана и триптофаном в основном состоянии приводит к значительному уменьшению сигнала ХПЯ, в то время как для нейтральных радикалов электронный обмен не эффективен. 16 Рисунок 2. Зависимость константы скорости тушения триплетного 2,2 -дипиридила от рН раствора. Тушители: N-AcTrp (кружки), N-AcTyr (треугольники), N-AcHis (квадраты) [8]. Фотоиндуцированные реакции триплетного дипиридила и N-ацетилтирозина были изучены методами лазерного импульсного фотолиза и ХПЯ с временным разрешением в работе [40]. В зависимости от рН раствора, после облучения лазерным импульсом раствора, содержащего дипиридил и N-ацетилтирозин, могут образоваться следующие пары реагентов: 2<pH<5 – TDPH+ и ТyrOH; 6<pH<9.5 – TDP и ТyrOH; pH>10.5 – TDP и ТyrO. Зависимость константы скорости тушения kq от рН показана на рисунке 2. Механизм фотореакции 2,2-дипиридила с N-ацетилтирозином существенным образом зависит от рН раствора. В кислотных и основных растворах, первичной стадией является перенос электрона, тирозин тушит триплетно-возбужденный дипиридил с константой скорости реакции тушения kq=(2-3.5)109 M-1с-1, что близко к диффузионно- контролируемому пределу. В нейтральном растворе константа скорости тушения почти на два порядка меньше: kq=7107 M-1c-1, что характерно для реакций переноса атома водорода. Механизм реакции фотовозбужденного 2,2′-дипиридила с N-ацетилгистидином в широком диапазоне рН раствора установлен в работе [43]. В зависимости от рН раствора, имидазольное кольцо гистидина может иметь положительный заряд (HisH2+, pKa= 6.1), быть в нейтральном состоянии (HisH, pKa= 14.5) или иметь отрицательный заряд (His). Константа скорости тушения kq триплетно-возбужденного 2,2-дипиридила N- ацетилгистидином существенным образом зависит от рН среды. В растворах с высокой кислотностью как дипиридил (DPH+), так и гистидин (HisH2+) находятся в 17 протонированном состоянии, в то время как в интервале 8<pH<10 и дипиридил, и имидазольное кольцо гистидина (HisH) нейтральны. Как в кислой среде (рН<4), так и при pH=9.5 тушения триплетно-возбужденного дипиридила гистидином не происходит. Это заключение подтверждается измерениями ХПЯ: в указанных интервалах рН не было обнаружено ядерной поляризации ни на протонах дипиридила, ни на гистидине. В интервале 4<pH<8 TDP реагирует с протонированным HisH2+ по механизму переноса атома водорода с константой скорости kq=1.2108 M-1 с-1. В сильнощелочных растворах DP реагирует анионом His по механизму переноса электрона с константой скорости T kq=7.5109 M-1 с-1. Из результатов, полученных для фотореакции флавинмононуклеотида и 2,2дипиридила с аминокислотами, в работах Центаловича с соавторами было выведено следующее эмпирическое правило: реакция между фотовозбужденными триплетными красителями и аминокислотами протекает через перенос электрона со скоростями, близкими к диффузионным (109 M-1с-1 и выше), и через перенос атома водорода с гораздо меньшими скоростями (около 108 M-1с-1 и ниже) [40-43]. Для исследования реакций переноса электрона в дипептидах, содержащих одновременно гистидин и тирозин либо триптофан необходимо генерировать радикалы этих аминокислот со сравнимой эффективностью. Применение производных дипиридила и флавина в данном случае не оправдано, так как реакционная способность гистидина намного ниже, чем тирозина и триптофана. Например, изучение реакции внутримолекулярного переноса электрона от тирозина к радикалу гистидина в окисленных триплетно-возбужденным 2,2-дипиридилом дипептидах Tyr-His и His-Tyr методом ХПЯ с временным разрешением было возможным только при одном значении рН, в котором генерирование радикала гистидина происходит в концентрациях, достаточных для детектирования наблюдающихся при этом эффектов [52]. Таким образом, поиск такого фотосенсибилизатора, триплеты которого реагируют с гистидином, триптофаном и тирозином со сравнимой эффективностью, является на настоящий момент актуальной задачей. В работе [53] сообщалось, что ароматические аминокислоты Trp, His, и Tyr тушат триплетно-возбужденный бензофенон с сопоставимыми константами скорости в водно-ацетонитрильной смеси при рН=7. Поэтому использование триплетно-возбужденных производных бензофенона может быть пригодным для нашей цели. 18 1.3. Фотосенсибилизированные реакции при повреждении ДНК. Фотосенсибилизация хромофорами экзогенного происхождения на примере производных бензофенона Известно, что воздействие на человека УФ-А- и УФ-В-излучений, присутствующих в солнечном свете, представляет собой важный фактор экологического риска для развития рака кожи [54]. Все более широкое использование искусственных источников УФизлучения в соляриях также представляет серьезную проблему для здоровья с точки зрения возникновения рака кожи [55]. В настоящее время хорошо известно, что ДНК является важной внутриклеточной мишенью при действии УФ-света. Для понимания биологической роли УФ-индуцированных повреждений ДНК требуется точное определение характера и частоты возникновения фотопродуктов. Более 50 лет назад были начаты первые исследования фотореакций ДНК, в результате которых были выделены и охарактеризованы циклобутантиминовые димеры (Т<>Т) в УФ-C-облученной ДНК [56]. Т<>Т димеры, как было показано впоследствии, являются преобладающими фотопродуктами, образующимися при облучении клеточной ДНК УФ-B и солнечным излучением [57]. Вторым важным классом тиминовых димерных фотопродуктов, выделенным из УФ-C-облученной ДНК, является тимидил-(3-5)-тимидин (ТрТ) – пиримидин-(6-4)-пиримидоновый фотопродукт [58, 59]. Третий класс бипиримидиновых фотопродуктов, выделенный при УФ-C-облучении TpT димеров относится к валентным изомерам Девара Результаты других (Dewarvalenceisomer, ранних пиримидин-(6-4)-пиримидона DEW) исследований, касающихся [60]. УФ-А-индуцированных фотопродуктах ДНК, сообщали об образовании циклобутанпиримидиновых димеров [61, 62] и продуктах окислительного повреждения, включая 8-оксо-7,8-дигидро-2- деоксигуанозин (8-oxoGua) в клеточной ДНК [63]. Были также получены доказательства о протекании фотосенсибилизированных реакций, вызванных соединениями экзогенного происхождения, возбуждение которых УФ-А-излучением, приводит к образованию различных типов ДНК-фотопродуктов [54, 64]. По прошествии более полувека с открытия Т<>Т димеров накоплено большое количество информации о базовой фотохимии ДНК как в модельных системах, так и в изолированной и клеточной ДНК. На настоящий момент хорошо известно, что УФ-свет может взаимодействовать с ДНК путем прямого поглощения, что приводит в основном к образованию бипиримидиновых фотопродуктов, или через фотосенсибилизацию хромофорами эндогенного или экзогенного происхождения. Так как энергия УФ-А- и 19 УФ-В-излучений не достаточна для прямого одноэлектронного окисления оснований ДНК, присутствие данных фотосенсибилизаторов расширяет «активную» часть солнечного спектра в УФ-A области и за ее пределами, а значит, увеличивает вероятность рака кожи под действием солнечного излучения. Поэтому, понимание механизмов фотосенсибилизированного повреждения ДНК имеет большое значение, во-первых, чтобы предвидеть возможные фотобиологические риски и, во-вторых, в целях разработки эффективных стратегий фотозащиты. К настоящему времени получены доказательства того, что окисление изолированной и клеточной ДНК инициируется при взаимодействии УФ-А-излучения с эндогенными и экзогенными фотосенсибилизаторами [57]. Однако точная природа фотосенсибилизаторов остается неясной: таковыми могут являться производные флавина, порфирины, различные витамины и даже меланин [65], образующиеся в процессах клеточного метаболизма, а также различные лекарственные препараты, которые используются в терапевтических целях [66-69]. Фотосенсибилизаторы вызывают те или иные повреждения в ДНК в зависимости от свойств их возбужденных состояний и местонахождения в клетке. Выделяют два типа фотосенсибилизаторов: соединения первого типа взаимодействуют с основаниями ДНК независимо от присутствия кислорода; фотосенсибилизаторы второго типа требуют присутствия кислорода. По тому же принципу выделяют механизмы фотосенсибилизации первого и второго типа, включающие преимущественно перенос электрона (или отрыв атома водорода) от триплетно-возбужденного фотосенсибилизатора (тип 1) и образование синглетного кислорода при переносе энергии (тип 2), соответственно [69]. Следует различать три основных механизма фотосенсибилизированного окисления ДНК (см. рисунок 3): (1) повреждения, вызванные синглетным кислородом (1О2), (2) фотосенсибилизированные реакции одноэлектронного окисления, (3) повреждения, вызванные гидроксильным радикалом ОН•. 20 Разрывы цепи Thd гликоли Рисунок 3. Виды окислительных повреждений ДНК, вызванные синглетным кислородом ( 1О2), фотосенсибилизированными реакциями одноэлектронного окисления (Phsens*) и гидроксильным радикалом (ОН•) [54]. (1) Окисление гуанина в ДНК синглетным кислородом. Общий механизм фотосенсибилизации включает образование синглетного кислорода (1О2) при переносе энергии от фотовозбужденного фотосенсибилизатора к молекулярному кислороду (тип фотосенсибилизации 2) [70, 71]. Образующийся в состоянии 1 Δg синглетный кислород имеет большое сродство к молекулам, богатым двойными связями, что приводит к образованию диоксетанов, эндопероксидов и т.д. Единственной мишенью среди оснований ДНК является гуанин, который превращается в 4,8-эндопероксид через индуцированную синглетным кислородом реакцию Дильса-Альдера [4+2] фотоциклоприсоединения. Образующийся эндопероксид превращается в двухцепочечной ДНК в 8-гидроксипероксигуанин [72, 73], который затем восстанавливается в 8-oxoGua – единственный продукт окисления синглетным кислородом. (2) путь Фотосенсибилизированные реакции одноэлектронного окисления. Второй фотосенсибилизации ДНК заключается в одноэлектронном окислении возбужденными хромофорами молекулы ДНК (тип фотосенсибилизации 1) [74]. Эффективность данной реакции зависит от редокс-потенциалов нуклеиновых оснований [75, 76]. В этом отношении гуанин является основной мишенью реакций одноэлектронного окисления по 1-му типу фотосенсибилизации, так как обладает самым низким потенциалом окисления среди остальных компонент ДНК. Другие три основания окисляются в меньшей степени, тогда как сахаро-фосфатный остов не подвержен окислению по данному механизму. Также было показано, что распределение окислительных повреждений может изменяться из-за наличия переноса заряда в ДНК [77, 78]. 21 При отрыве электрона гуанин превращается в катион-радикал (G•+), который может гидратироваться с последующим восстановлением в 8-гидрокси-7,8-дигидрогуанильный радикал [74]. Последний промежуточный радикал последовательно превращается в 8оксо-гуанин (8-oxoGua, см. рисунок 3) или 2,6-диамино-4-гидрокси-5-формамидопиридин (FapyGua, см. рисунок 3) путем одноэлектронного окисления и одноэлектронного восстановления, соответственно. Также катион-радикал G•+ может депротонировать с образованием нейтрального радикала G(-Н)•, который обладает высокой окислительной способностью. Реакция присоединения нейтрального радикала G(-Н)• и радикала О2•– приводит к образованию 2,2,4-триамино-5(2Н)-оксазолона (Oz) через сложный путь превращений, включающий промежуточное образование производного имидазолона [74]. Повреждения ДНК, вызванные гидроксильным радикалом ОН•. Третий (3) окислительный механизм с участием гидроксильных радикалов ОН• также связывают с патологическим действием УФ-A-излучения, хотя данный процесс инициируется фотохимическими реакциями косвенным образом [54, 79]. Частица ОН• является высокореакционноспособным кислородсодержащим радикалом и играет важную роль в радиобиологии, участвуя в большом количестве реакций, инициируемых при радиолизе воды. Что касается УФ-A-излучения, реакционноспособного О2 •– радикала, ОН• возникает который при образуется гибели в менее результате фотосенсибилизации 1-го типа в реакциях анион-радикала фотосенсибилизатора с молекулярным кислородом. Радикал О2•– выделяется также в больших количествах в митохондриях в ответ на облучение клеток УФ-A-излучением. Затем, О2•– спонтанно или при действии фермента супероксиддисмутазы превращается в пероксид водорода (H2O2). Последний является прямым прекурсором ОН• в реакциях восстановления ионов Fe2+ или Cu+ [54]. Радикал ОН• не проявляет высокой селективности и реагирует со всеми компонентами ДНК с диффузионно-контролируемыми скоростями [80]. Реакция ОН• с пуриновыми основаниями ведет к формированию С8-гидроксилированных радикалов, которые впоследствии превращаются в 8-oxoGua и FapyGua в случае гуанина, а также с меньшим выходом в 8-оксо-7,8-дигидроаденин (8-oxoAde) и 4,6-диамино-5- формамидопиримидин (FapyAde) в случае аденина [80]. Кроме того, известно, что ОН• взаимодействует с пиримидиновыми основаниями по двойной связи С5-С6 с образованием 5,6-дигидрокси-5,6-дигидротимина и 5,6-дигидрокси-5,6-дигидроцитозина [80]. Следует также добавить, что ОН• эффективно реагирует с остатками 2-деоксирибозы в соответствии с несколькими механизмами, которые приводят в большинстве случаев к образованию разрывов в ДНК [81]. На рисунке 4 приведена краткая информация об 22 относительном распределении повреждений ДНК, вызванных в клетках УФ-B- и УФ-Aизлучением. Рисунок 4. Типичное относительное распределение основных видов повреждений ДНК в УФ-B- и УФ-A-облученных клетках [54]. В данном контексте бензофенон (ВР) является классическим модельным хромофором для изучения различных повреждений, фотосенсибилизированных в нуклеозидах, олигонуклеотидах и ДНК [66]. Показано, что облучение ВР в присутствии ДНК или ее компонентов ведет к окислению нуклеиновых оснований, формированию циклобутан-пиримидиновых димеров, одноцепочечных разрывов, сшивок между молекулами ДНК и белков, а также апуриновых и апиримидиновых сайтов в ДНК. Такая высокая фотореакционная способность связана с хорошо установленными фотофизическими свойствами бензофенона: ВР поглощает ультрафиолетовый свет до 360 нм; квантовый выход триплетов близок к 1; энергия nπ* его самого низкого триплетного состояния (ET) порядка 290 кДж×моль-1 [82]. Молекулярный кислород тушит триплеты ВР с константой скорости 2.36×109 М-1с-1 в бензоле, квантовый выход синглетного кислорода (1О2) составляет порядка 0.3 [82, 83]. Методом лазерного импульсного фотолиза были обнаружены и идентифицированы различные короткоживущие частицы бензофенона в растворах [84]. В смеси ацетонитрил/вода для 3ВР максимум поглощения соответствует следующим параметрам: λmax=525 нм, εmax=7320 М-1см-1. Кетильный радикал ВРН•, образующийся в результате отрыва атома водорода от молекулы-донора, имеет максимум поглощения на λmax=545 нм, при этом εmax=3220 М-1см-1. Анион-радикал ВР•–, образующийся в процессе переноса электрона, имеет максимум поглощения на λ~615 нм. Процессы переноса электрона, а также взаимодействие с синглетным кислородом происходят в основном с участием гуанина – нуклеиновым основанием с наименьшим 23 потенциалом окисления [75, 85-87]. Напротив, триплет-триплетный перенос энергии происходит в основном от 3 BP* к тимину, основанию с самой низкой энергией триплетного состояния в ДНК (ET=310 кДж×моль-1) [88]. Этот процесс приводит к образованию циклобутан-пиримидиновых димеров, либо к образованию оксетанов в результате реакции [2+2] циклоприсоединения Патерно-Бюхи [67]. Стоит отметить, что данный процесс происходит с большей вероятностью для тимина в составе ДНК, нежели для свободного основания, так как π-стэкинг и образование водородных связей между нуклеотидами приводят к понижению ET тимина до 267 кДж×моль-1 [67]. С нашей точки зрения наиболее интересными являются реакции фотоокисления ДНК триплетно-возбужденным бензофеноном (3BP), так как эти реакции приводят к образованию короткоживущих радикалов нуклеиновых оснований. По сравнению с рибофлавином – типичным фотосенсибилизатором первого типа, приводящим к окислению гуанина и в меньшей степени аденина [89] – бензофенон проявляет бóльшую окислительную способность и способен окислять все нуклеиновые основания [90], в том числе тимин – нуклеиновое основание с самым высоким потенциалом окисления [75, 85]. Кинетика и механизм реакции фотоокисления дезоксигуанозина бензофеноном в смеси ацетонитрил/вода (а также его производным кетопрофеном в нейтральном водном растворе) были изучены методом ЛИФ. Было показано, что данная реакция фотоокисления протекает с высокой эффективностью с константой скорости kq>109M-1c-1, что характерно для реакций переноса электрона [66, 86, 87]. Однако существенным недостатком использования бензофенона для изучения фотоиндуцированных реакций переноса электрона с участием аминокислот и азотистых оснований является слабая растворимость бензофенона в воде. Введение гидрофильных заместителей (например, карбоксильной группы) значительно увеличивает растворимость бензофенона в воде, а значит, позволяет изучать реакции фотоокисления ДНК и ее компонент в зависимости от значения рН водного раствора. Недавно, в работе Нгуена с соавторами [91] методом лазерного импульсного фотолиза была изучена фотореакция между триплетно-возбужденным 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном, компонентами ДНК (аденином, аденозином, 3 ТСВР, и тимином и тимидином) в широком диапазоне рН водных растворов. Регистрация спада триплетного поглощения проводилась на длине волны λ=590 нм (в кислотных растворах) и λ=550 нм (в нейтральных и щелочных растворах), где 3ТСВР имеет максимум поглощения (см. рисунок 5). Тушение 3ТСВР аденином, аденозином и тимидином в диапазоне рН от 2 до 12 приводило к образованию анион-радикала ТСВР•–, λmax=630 нм, механизмом реакции тушения является перенос 24 электрона (константа скорости тушения kqobs при этом была близка к диффузионноконтролируемому пределу). На рисунке 5 показан спектр промежуточного поглощения анион-радикала ТСВР•–, полученный в результате фотореакции 3ТСВР с тимином при рН=2.0. Для реакции 3ТСВР с тимином при рН от 2 до 8 в качестве механизма тушения был предложен перенос электрона с последующим переносом протона, при рН от 8 до 10 – перенос электрона. При рН>10 реакция тушения 3ТСВР тимином не наблюдалась. Однако структура образующихся радикалов аденина, аденозина, тимина и тимидина не Поглощение Поглощение была установлена. Длина волны, нм Длина волны, нм Рисунок 5. (а) Спектры промежуточного поглощения ТСВР (1×10–4 М) в воде, полученные сразу 3 после лазерного импульса. (б) Спектр промежуточного поглощения анион-радикала ТСВР•– в присутствии тимина (1.5×10–2 М) при рН=2.0. Вставка: спад промежуточного поглощения ТСВР •–, полученный на длине волны λobs = 630 нм [91]. К сожалению, оптические методы регистрации часто имеют недостаточное спектральное разрешение и не позволяют однозначно идентифицировать радикальные интермедиаты пуриновых оснований [92-94], а их прямое детектирование методом ЭПР при физиологических условиях проблематично из-за очень короткого времени жизни таких радикалов. Большинство наблюдений радикалов, образованных из пуриновых оснований, выполнены с использованием методов ЭПР при низких температурах [95-98]. Мы нашли только ограниченное количество примеров обнаружения радикалов, образованных из пуриновых оснований, в растворе с помощью метода ЭПР [99, 100]. Принимая во внимание то, что 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофенон хорошо растворим в воде, поглощает на длинах волн 308 и 355 нм, а магниторезонансные параметры (константы СВТ и значения g-фактора) его радикальных интермедиатов известны из литературы [101-103], перспективным является использование 3,3',4,4'- 25 тетракарбоксибензофенона для изучения фотоиндуцированных радикальных реакций с участием аминокислот и нуклеотидов методом ХПЯ с временным разрешением. 1.4. Применение метода ХПЯ с временным разрешением для изучения фотоиндуцированных радикальных реакций. Зачастую радикальные частицы обладают довольно короткими временами жизни, и их появление следует ожидать в низких стационарных концентрациях. Поэтому для обнаружения короткоживущих радикалов необходимо создание инертной среды, чтобы исключить возможность их гибели. Соответственно, необходимо использовать тщательно осушенные и обескислороженные растворители, также необходимо исключить такие реагенты, которые способны преобразовать радикалы в диамагнитные молекулы (например, путем реакций рекомбинации или реакций переноса электрона). Соблюдая такие меры предосторожности, можно добиться того, что радикальные частицы будут существовать в течение нескольких минут или даже часов и могут быть исследованы стандартными методами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Такие условия для проведения реакций, однако, не могут быть выполнены во всех случаях, так как зачастую желаемым является обнаружение радикальных интермедиатов реакций в "реальном времени", а также кинетический анализ быстропротекающих радикальных реакций. Методы ЭПР часто не позволяют детально охарактеризовать радикалы аминокислот и пуриновых оснований из-за их низкой концентрации, а также высокой реакционной способности и короткого времени жизни в условиях, близких к физиологическим (водный раствор при различных рН при комнатной температуре). Оптические методы регистрации обладают низким спектральным разрешением и зачастую не позволяют надежно различить протонированные и депротонированные формы этих короткоживущих радикалов. Методы регистрации короткоживущих радикальных частиц, основанные на спиновой химии (например, МАРИ спектроскопия, от англ. MARY=Magnetically Affected Reaction Yield, метод химической поляризации ядер с временным разрешением) характеризуются высоким временным разрешением и, в отличие от метода ЭПР, высокой чувствительностью. Термин «химическая поляризация ядер» используется для обозначения неравновесной заселенности ядерных уровней, которая детектируется в ЯМР спектрах продуктов радикальных реакций и проявляется в виде аномальных интенсивностей и фаз 26 их спектральных линий. ХПЯ возникает в результате спин-селективной рекомбинации радикальных пар, а также действия правил отбора по спину для рекомбинации радикальной пары. Основные механизмы формирования ХПЯ хорошо изучены и описаны в литературе [104-106]. Важные практические аспекты применения метода ХПЯ в органической химии подробно изложены в обзорах и монографиях [107-111]. Наблюдаемые эффекты ХПЯ классифицируются как интегральный и мультиплетный [112]. Оба эффекта могут проявляться как одновременно, так и по отдельности. Интегральный эффект ХПЯ заключается в преимущественной ориентации ядерных магнитных моментов в продуктах реакции по полю (положительная поляризация, абсорбция в спектрах ЯМР) или против него (отрицательная поляризация, эмиссия). Мультиплетный эффект характеризуется взаимной упорядоченностью ядерных спинов, причем спектру типа EA соответствует поглощение компоненты мультиплета в более сильном поле и эмиссия в более слабом. Для спектра типа AE ситуация противоположна. Каптейном были сформулированы правила [113], которые в случае короткоживущих РП отражают основные качественные закономерности эффектов ХПЯ. Согласно этим правилам, знак интегральной ХПЯ в сильном магнитном поле определяется произведением следующих величин: Г = g Ak, а в случае мультиплетного эффекта знаком: Г = Ai Aj jijij, где = +1 или -1 для триплетного или синглетного предшественника; = +1 или -1 для продуктов геминальной или внеклеточной рекомбинации; g – разность g-факторов радикала, которому принадлежит рассматриваемое k-е магнитное ядро, и радикала партнера; Ak – изотропная часть константы СТВ с ядром, поляризация которого рассматривается; jij – константа спин-спинового взаимодействия в молекуле; Ai и Aj константы СТВ с ядрами i и j. В случае если эти ядра относятся к одному и тому же радикалу пары, то ij = +1, в противном случае ij = -1. Мультиплетному эффекту типа EA отвечает Г > 0, а AE – Г < 0. Для F-пар (от англ. Free pairs) знак ХПЯ совпадает со случаем геминальной пары с начальным триплетным состоянием. 27 Рисунок 6. Схема формирования ХПЯ по радикально-парному механизму [107]. Кратко рассмотрим процессы, приводящие к возникновению ХПЯ при лазерном инициировании фотореакций (см. рисунок 6) [107]. Пусть в растворе есть два типа молекул: краситель (D) и тушитель (Q). Для простоты предполагается, что молекула тушителя имеет одно магнитное ядро со спином ½, тогда как молекула красителя не имеет магнитных ядер. При облучении молекула красителя поглощает квант света и переходит из основного синглетного состояния S0 в некоторое возбужденное синглетное состояние Si. За счет интеркомбинационной конверсии (ИКК) молекула красителя из состояния Si переходит в триплетное состояние Ti, после чего за счет внутренней конверсии молекула красителя переходит в нижнее по энергии долгоживущее триплетное состояние T1. Образование триплетов обычно происходит быстро (<<1 нс) по сравнению с длительностью лазерного импульса (5-15 нс). Следующий процесс – реакция тушения триплетов красителя молекулами Q. В результате образуется спин-коррелированная радикальная пара (РП), мультиплетность которой совпадает с таковой для красителя. В данном случае мультиплетность РП триплетная (Т). В дальнейшем радикалы могут рекомбинировать в "клетке" или диффузионно разойтись в раствор и только после этого прорекомбинировать во вторичных столкновениях. Время жизни РП в «клетке» мало (~10 нс), поэтому основное время жизни радикалы диффундируют в растворе. Допустим, что рекомбинация радикалов возможна только из синглетного состояния радикальной пары, для этого пара должна перейти в S-состояние. Спиновая мультиплетность РП может измениться под влиянием слабых магнитных взаимодействий в РП – зеемановское электронное и СТВ. Рассмотрим пару с одним ядерным спином ½. При малом межрадикальном расстоянии величина электронного обменного взаимодействия (2J) велика, и смешивание спиновых состояний в РП подавлено. Обменное взаимодействие J экспоненциально уменьшается с расстоянием. Поэтому при определенном разделении радикалов (то есть при наличии молекул растворителя между радикалами) идут синглет-триплетные переходы под действием СТВ и разности g- 28 факторов двух радикалов. Скорости этих переходов не одинаковы для различных ядерных спиновых состояний. Предположим, что для ядерной проекции α (↑) скорость перехода из триплета в синглет выше, чем для проекции β (↓). Поскольку рекомбинация возможна только из синглетной пары, то геминальный продукт будет обогащен преимущественно одной ядерной проекцией (α), а радикалы (•Q↓) с другой ядерной проекцией (β) выйдут в объем и дадут внеклеточные продукты. Такой процесс сортировки по ядерным спиновым состояниям приводит к геминальной поляризации и равной ей по абсолютной величине, но противоположной по знаку ядерной поляризации в радикалах, избежавших клеточной рекомбинации. Отметим также то, что доля РП, которые перешли в синглетное состояние и претерпели геминальную рекомбинацию, ничтожно мала, и основная часть радикальных пар выходит из «клетки», а радикалы свободно диффундируют в растворе. При очередных столкновениях радикалов формируются пары, которые называются F-пары (от англ. Free pairs). Спиновая мультиплетность F-пар не зависит от того, какой она была до выхода из «клетки» и определятся статистическим фактором. Следует отметить также, что радикалы, вышедшие в раствор (•Q↓), претерпевают релаксацию со временем Т1 (парамагнитная ядерная релаксация). Компенсация поляризации происходит за счет того, что ХПЯ радикалов, избежавших геминальной рекомбинации, противоположна по знаку. Однако парамагнитная релаксация приводит к тому, что часть поляризации в продуктах радикальной реакции не скомпенсирована. Основным каналом гибели свободнодиффундирующих радикальных пар является их рекомбинация при повторном столкновении в растворе в синглетном состоянии. Вероятность таких встреч составляет 25%, все остальные встречи триплетные. Поскольку существует три триплетных состояния: Т+, Т0 и Т-, то вероятность этих встреч составляет 75%. При повторных встречах в триплетном T0 состоянии ХПЯ формируется так же, как и в геминальных парах. Время жизни геминальных пар зависит от вязкости раствора и для невязких растворов, как правило, составляет 10 нс. Формирование F-парной поляризации продолжается до тех пор, пока радикалы присутствуют в растворе, то есть происходит в микро- и миллисекундном временном диапазоне. Таким образом, поляризация, которая формируется в F-парах, увеличивает общий вклад в сигнал ХПЯ в спектре ЯМР. Долгое время анализ эффектов ХПЯ качественном уровне. Количественное сравнение проводился преимущественно на экспериментальных результатов с теоретически предсказанными началось относительно недавно и было связано с развитием метода ХПЯ с временным разрешением [107]. Химическая поляризация ядер – это эффект, зависящий от времени. ХПЯ формируется в короткоживущих радикальных парах и 29 сохраняется в течение времени Т1 релаксации в диамагнитных продуктах реакции, сигналы которых детектируются методом ЯМР. В условиях непрерывной генерации радикалов детектируют спектры ХПЯ, усредненные во времени, и поэтому эффекты ХПЯ, возникающие в первичных радикальных парах на наносекундной временной шкале, не могут быть отделены от влияния радикальных реакций на микросекундной временной шкале. Более того, ядерная релаксация в продуктах реакций сильно влияет на детектируемую поляризацию. Однако комбинирование наносекундного импульсного фотолиза с импульсным ЯМР-спектрометром с Фурье преобразованием позволило достичь субмикросекундного временного разрешения при детектировании ХПЯ, возникающей в радикальных фотохимических реакциях. Современное состояние исследований в данной области определяется высокой чувствительностью, кинетическими и спектральными возможностями метода ХПЯ с временным разрешением, сочетающим импульсное лазерное инициирование реакции и импульсное ЯМР детектирование продуктов реакции, поляризованных по ядерному спину. Для изучения кинетики и механизмов сложных радикальных реакций биомолекул в водных растворах при комнатной температуре методом ХПЯ используются следующие оригинальные подходы: (1) Количественный анализ амплитуды сигналов в геминальных спектрах ХПЯ ключ к определению интермедиатов. сверхтонкой Теоретически и структуры радикальных экспериментально было короткоживущих показано, что для короткоживущих радикальных пар амплитуда геминальной ХПЯ магнитных ядер прямо пропорциональна их константам СТВ в промежуточных радикалах, которые, в свою очередь, пропорциональны спиновой плотности на ядрах [103, 114]. Соотношение прямой пропорциональности, как правило, прекрасно выполняется в случае большого числа магнитных ядер в системе в рамках S-T0 приближения для короткоживущих радикальных пар. Отклонения от пропорциональности могут указывать на наличие скрытых процессов (например, протонирование и депротонирование радикалов, димеризация и другие реакции) на геминальной стадии радикальной реакции и открывает возможность их охарактеризовать. Таким образом, метод ХПЯ дает возможность количественно исследовать магниторезонансную структуру короткоживущих свободных радикалов, регистрация которых методом ЭПР в растворах комнатной температуры невозможна. (2) Влияние вырожденного электронного обмена (ВЭО) между радикалом и исходной молекулой на кинетику ХПЯ – это основа для идентификации участия короткоживущих радикалов, так как ВЭО виден в том случае, когда структура радикала отличается от структуры исходной диамагнитной молекулы на один электрон. ВЭО 30 проявляется как ускорение кинетики спада сигнала при повышении концентрации участвующего в обмене диамагнитного реагента. По этому признаку можно определять степень протонирования короткоживущих радикалов, так как структура диамагнитных молекул и значения рКа хорошо известны [115-117]. Это особенно важно в водных растворах, где структура реагентов, радикальных интермедиатов и продуктов реакции сильно зависит от рН. Этот подход позволяет оценить значения рКа радикалов, которые зачастую неизвестны. Отметим, что вырожденные обменные реакции радикалов не приводят к изменениям в оптических спектрах, но проявляются в виде уширения и даже исчезновения сигналов ЭПР, что затрудняет исследования этими методами. (3) Изучение зависимости ядерной поляризации от напряженности внешнего магнитного поля [118-120] дает возможность определять такие магнитные параметры короткоживущих радикалов, как величина и знак разности g-факторов радикалов в паре, а также параметры обменного взаимодействия короткоживущих радикалов, которое существенно в спиновой динамике короткоживущих радикалов, связанных цепочкой ковалентных связей или в системах с ограниченной молекулярной подвижностью. Отметим, что определение обменного взаимодействия из спектров ЭПР является крайне затруднительным. 31 Глава 2. Экспериментальная часть 2.1. Материалы и реактивы 2,2'-дипиридил (>99%), 3,3,4,4-тетракарбоксибензофенон (>99%), L-гистидин (>99%), N-ацетил-L-гистидин (>99%), L-тирозин (>99%), N-ацетил-L-тирозин (>99%), Lтриптофан (>99%), N-ацетил-L-триптофан (>99%), дейтерированная вода D2O (>99.9%), DCl (35% раствор в D2O), NaOD (30% раствор в D2O) приобретены в Sigma-Aldrich. 2,2'дипиридил-d8 (>99%) приобретен в С/D/N Isotopes. Дипептиды L-триптофил-L-триптофан (>99%), L-гистидил-L-гистидин фенилаланин приобретены в (>99%), Bachem. L-гистидил-L-гистидин, Дипептид L-гистидил-L- L-фенилаланил-L-гистидин был синтезирован в лаборатории д.х.н. Сильникова В. Н. (ИХБФМ СО РАН). Гуанозин-5монофосфат (>99%), аденозин-5-монофосфат (>99%), аденозин (>99%) приобретены в Fluka. 2.2. Методы исследования 2.2.1. ХПЯ с временным разрешением Подробное описание установки для детектирования ХПЯ с временным разрешением можно найти в следующих работах [116, 121]. Схема установки представлена на рисунке 7. Образец в стандартной пирексовой ампуле облучался в датчике ЯМР-спектрометра DRX-200 фирмы “Brucker” (магнитное поле 4.7 Т, резонансная частота протонов 200 МГц) импульсами XeCl эксимерного лазера COMPEX Lambda Physik (длина волны 308 нм, энергия в импульсе до 120 мДж, длительность импульса около 15 нс). Свет к образцу подводился с помощью оптической системы, включающей сферическую линзу, призму и кварцевый световод диаметром 5 мм. Для получения 1 Н спектров ХПЯ использовали импульсную последовательность, схема которой представлена на рисунке 8. Сначала ядерные спиновые состояния реагентов насыщались импульсами широкополосного гомоядерного декаплера, затем компьютер спектрометра выдавал сигнал на запуск эксимерного лазера, а через время – сигнал на подачу регистрирующего радиочастотного (РЧ) импульса. Лазерный импульс синхронизовался с передним краем РЧ-импульса. Для детектирования 1Н спектров ХПЯ использовался РЧ-импульс длительностью 1 мкс. Спад свободной индукции накапливался в обычном режиме, эксперимент затем повторялся до достижения желаемого отношения 32 сигнал/шум. В результате Фурье-преобразования получали ЯМР-спектры поляризованных продуктов фотохимической реакции, образовавшихся за время . Кинетический профиль появления поляризованных продуктов получали при варьировании задержки . В работе использовались два триплетно-возбужденных красителя 2,2'-дипиридил и 3,3,4,4-тетракарбоксибензофенон (ТСВР), концентрация которых подбиралась таким образом, чтобы (1) концентрация образовавшихся в ходе облучения триплетов была высокой, (2) оптическая плотность на длине волны 308 нм не превышала 1 (для l=1 см), (3) «выгорание образца», связанное с необратимыми фотохимическими реакциями, было минимальным. Исходя из данных условий, концентрации красителей были выбраны следующими С(DP)=0.5-0.6 мМ (кислотные растворы), С(DP)=7-8 мМ (нейтральные и щелочные растворы), С(ТСВР)=2 мМ. Концентрации тушителя в кинетических экспериментах подбирались такими, чтобы характерное время тушения триплетновозбужденного красителя было заведомо короче длительности регистрирующего радиочастотного импульса, то есть произведение (kq×С)-1 < 300 нс, где kq – константа скорости тушения триплетно-возбужденного красителя, С – концентрация молекул тушителя. Непосредственно перед облучением образца через раствор в ампуле в течение 10 минут барботировали аргон для удаления растворенного в воде кислорода. Концентрации тушителей в экспериментах, описанных в главах 3 и 5, были выбраны таким образом, чтобы выявить разницу в реакционной способности между различными тушителями. В кинетических экспериментах с целью уменьшения систематической ошибки, связанной с выгоранием образца в необратимых фотохимических реакциях, и случайной ошибки, обусловленной периодической сменой образца, использовалась разработанная в лаборатории, специальная методика усреднения экспериментальных данных [107, 116]. Был составлен список временных задержек (τi=1…13), и накопление сигнала кинетики ХПЯ проводилось с использованием 8 либо 16 образцов в зависимости от интенсивности сигнала ХПЯ, при этом на каждый образец приходилось 4 скана на каждый из 13 значений τ. Для усреднения результатов спектры ХПЯ для индивидуальных образцов записывались как в прямом, так и в обратном направлении перебора задержек. При накоплении всего списка задержек «выгорание» каждого образца не превышало 30%. 33 Рисунок 7. Схема установки для проведения экспериментов по ХПЯ с временным разрешением [107]. Рисунок 8. Временная диаграмма импульсной последовательности в экспериментах ХПЯ [107, 116]. 2.2.2. Наносекундный лазерный импульсный фотолиз Установка наносекундного лазерного импульсного фотолиза, разработанная в университете г. Грац, Австрия (лаборатория профессора Гюнтера Грамппа) подробно описана в работе [122]. Схема установки представлена на рисунке 9. Образцы помещаются в прямоугольную кварцевую кювету (1x1-см) и облучаются импульсами XeCl эксимерного лазера Lambda Physik LPX-120 (λ=308 нм, энергия импульса до 100 мДж, длительность импульса 10 нс). Регистрирующая система состоит из ксеноновой лампы (номинальная мощность 150 Вт), монохроматора OBB/PTI модели 101/102, ФЭУ Hamamatsu R928, осциллографа LeCroy 9410A. Для записи данных с осциллографа и преобразования данных в формат ASCII используется программное обеспечение, разработанное профессором Штефаном Ладграфом: LD-CALC2 (версия 2.03/32006) и 34 SHANDLER (версия 1.31B/Mar05). Для обработки полученных экспериментальных данных использовали программы Matlab (версия R 2010b) и Microcal Origin (версия 7.5). Концентрация TCBP в растворах составляла 1×10−4 M. Это позволило избежать триплет-триплетной аннигиляции. Все растворы были приготовлены при комнатной температуре в буферных растворах. Для удаления растворенного кислорода растворы предварительно барботировали аргоном в течение 15 минут и сохраняли герметично закрытыми в течение эксперимента. Буферные растворы с концентрацией 0.01 М были приготовлены в бидистиллированной воде с помощью: (1) HCl-KH2PO4, pH=3.0-5.0; (2) KH2PO4-Na2HPO4, pH=5.0-9.0; (3) Na2HPO4-NaOH, pH=9.0-11.0. Значения рН растворов с pH<3 и pH>11 регулировали добавлением HCl и NaOH, соответственно. Рисунок 9. Схема установки наносекундного лазерного импульсного фотолиза. 2.2.3. Измерение рН Измерения рН растворов для экспериментов ЛИФ проводили в протонной воде на калиброванном по растворам соответствующих солей в протонной воде рН-метре. Все эксперименты ЛИФ проводились при комнатной температуре в буферных растворах за исключением растворов с pH<3 и pH>11. Измерения 1Н, 13 С ЯМР проводились в дейтерированной воде D2O. Кислотность водных растворов регулировали добавлением DCl или NaOD. Калибровка рН-метра проводилась в протонных буферных растворах. Таким образом, измеренные значения кислотности и полученные значения констант кислотной диссоциации относятся к так называемым величинам рН* и рКа*, соответственно. Значение рКа может быть рассчитано из полученного значения рКа* в соответствии с формулой: рКа=0.929рКа*+0.42 [123]. Поэтому для моделирования данных ЯМР использовали значения рН* и рКа*. Отметим, что использование термина рН* для нескорректированных измеренных значений рН рекомендуется комитетом IUPAC-IUBMB-IUPAB для опубликования данных ЯМР в химических журналах. Значение pD может быть использовано только для измерений, выполненных с помощью электродов, заполненных D2O [124]. 35 2.2.3. Расчеты DFT Квантово-химические расчеты констант СТВ радикалов дипиридила были выполнены д.х.н. Грицан Н. П. (Лаборатория механизмов реакций, ИХКГ СО РАН). Геометрии нейтральных, катион- и анион-радикалов 2,2'-дипиридила оптимизированы методом UB3LYP/6-31G(d) [125, 126]. Константы СТВ рассчитаны тем же методом с базисом EPR-II с учетом растворителя (воды) с использованием модели поляризованного континуума (PCM) [127]. Все расчеты проведены с использованием пакета программ Gaussian-03 [128]. Результаты расчетов для частиц с открытой электронной оболочкой (радикалов и ион-радикалов) не осложнены примесью состояний со спином S3/2, так как для исследованных частиц расчетное значение S 2 не превышает 0.77. 2.3. Математическая обработка экспериментальных данных 2.3.1. Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции тушения kqobs от рН водного раствора На рисунке 10 а представлена типичная кривая, детектированная осциллографом методом лазерным импульсным фотолизом. Для преобразования этих данных в спад промежуточного поглощения Аt (см. рисунок 10 б) было использовано следующее уравнение: log( U0 I ) log( 0 ) At , Ut It (1) где U0 и I0 напряжение и сила тока в начальный момент времени, Ut и It напряжение и сила тока в момент времени t. 36 0.20 0.0 [His]=0 мМ [His]=0.5 мМ pH=10.0 -0.1 0.15 -0.38 Ut -0.40 A Напряжение, В -0.36 -0.42 U0 0.10 -0.44 -0.46 0.05 -0.48 -0.50 -0.52 Базовая линия -5 0 5 0.00 10 15 0 20 5 10 15 20 Время, мкс Время, мкс Рисунок 10. (а) кривая, детектируемая осциллографом в методе ЛИФ (б) спад сигнала промежуточного поглощения A триплетов ТСВР (1×10−4M) в отсутствие тушителя (сплошная линия) и в присутствии 5×10−4M His (пунктирная линия) в водном растворе при рН=10.0. Как было отмечено ранее, концентрация красителя ТСВР была подобрана таким образом, чтобы триплет-триплетная аннигиляция была пренебрежимо малой. Взаимодействие триплета красителя с тушителем описывается экспоненциальной функцией с константой скорости kobs. Наблюдаемая константа скорости тушения 3ТСВР kqobs входит в уравнения Штерна-Фольмера: kobs kd kq [Q] , obs (2) 0 obs 1 3 0 kq [Q] , 3 (3) 3 где kd – это константа скорости гибели 3ТСВР, 3τ0=(1/kd) собственное время жизни 3ТСВР в отсутствие тушителя, 3 τ=(1/kobs) время жизни 3 ТСВР в присутствии тушителя, [Q] концентрация тушителя. Для всех систем, изученных методом ЛИФ в данной работе временная шкала была выбрана таким образом, что кривая спада промежуточного поглощения является комбинацией двух параллельных реакций: спад поглощения 3ТСВР и рост поглощения радикалов ТСВР (для TCBP•− λmax=630 нм) [91] и радикалов аминокислот (для TyrO• λmax=407 нм [129], для Trp+• λmax=510 нм [130, 131], для Trp• λmax=580 нм [130, 131]). Последующим, относительно медленным спадом промежуточного поглощения, обусловленным гибелью радикалов, можно пренебречь на выбранной временной шкале. Таким образом, промежуточное поглощение (А) описывается следующим уравнением: 37 A AT AR , (4) где AT и AR – промежуточное поглощение триплетно-возбужденного ТСВР и образовавшихся радикалов TCBP. AT A0 exp(kobst ) Aer , (5) AR A (1 exp( kobst )) , (6) где A0 и A∞ – поглощение при 0 мкс и на бесконечности, соответственно. Параметр A er учитывает тот факт, что из-за инструментальной погрешности, значение AT на бесконечности равно не 0, а некоторому малому значению. Таким образом, с помощью уравнения (2) были получены значения наблюдаемой константы скорости тушения триплетов kqobs с использованием значений kobs, полученных с помощью уравнения (4) для каждой концентрации тушителя. Для описания рН-зависимости наблюдаемой константы скорости тушения триплетов kqobs был использован подход, описанный в работе [132]. Полученные рНзависимости были разделены на несколько рН-интервалов с границами на значениях pKa исходных реагентов. В каждом интервале рН пара реагентов (триплетный ТСВР и тушитель) реагирует с так называемой собственной константой скорости тушения (kqi). Для того чтобы получить уравнение, описывающее зависимость kqobs от рН водного раствора необходимо суммировать значения kqi, умноженные на молярные доли реагентов: k q obs kqi (dye) (quencher ). (7) i Молярная доля реагирующей частицы при этом вычисляется с использованием выражения: k n k j 0 k 0 j 0 (H n k A) [H n k A] / C0 ([H ]n k Kaj ) /( [H ]n k Kaj ) , (8) где HnA – это многоосновная кислота начальной концентрации С0, которая подвергается n-ступенчатой диссоциации в водном растворе, при этом образуются соответствующие сопряженные основания и протоны [H+]; каждая ступень диссоциации имеет собственную константу Kaj, j = 1, .., n; 0≤j≤k; 0≤k≤n; Ka0=1. Для примера рассмотрим рН-зависимость реакции тушения триплетно- возбужденного ТСВР триптофаном. Для ТСВР pKa1=2.9 и pKa2=4.9 (см. главу 3), для Trp pKa1=9.4 [133] (с учетом точности наших экспериментов ХПЯ и ЛИФ pKa1=2.4 карбоксильной группы Trp для удобства условно принимаем за 2.9, как и pKa1 ТСВР). 38 Молярные доли всех реагирующих частиц, вычисленные по уравнению (8), показаны на рисунке 11. рН-зависимость kqobs для реакции 3ТСВР с Trp, таким образом, разделяется на 4 интервала рН на основании значений pKa реагентов. Рисунок 11. Молярные доли ТСВР и Trp в водном растворе. TCBPH4 и NH3+Trp pH<2.9 kq1 TCBPH2 и NH3 Trp 2.9<pH<4.9 kq2 TCBP4– и NH3+Trp 4.9<pH<9.4 kq3 TCBP4– и NH2Trp pH>9.4 kq4 2– + Уравнение (9) для рН-зависимости константы скорости тушения 3 ТСВР триптофаном переписывается в виде: k q obs k q1 [H ]2 [H ] TCBP TCBP TCBP Trp [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ]2 [H ] k q2 2 TCBP TCBP TCBP Trp [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 K a1 TCBP K a2 [H ] k q3 2 TCBP TCBP TCBP Trp [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 K a1 TCBP TCBP TCBP TCBP K a1 (9) Trp K a2 K k q4 2 a1 Trp . TCBP TCBP TCBP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 В результате моделирования рН-зависимости наблюдаемой константы скорости тушения триплетов, kqobs, с использованием известных значений параметров kqobs, Kaj, [H+], методом наименьших квадратов были определены значения собственных констант скорости тушения kqi. 39 2.3.2. Зависимость амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора Для описания зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН водного раствора был использован тот же подход, что и для рН-зависимости kqobs: рН-зависимости ХПЯ также были разделены на интервалы рН с границами на значениях pKa исходных реагентов [132]. В общем случае, на амплитуду геминальной ХПЯ влияют два фактора: концентрация образующихся радикалов (другими словами, насколько эффективно происходит реакция тушения триплетов красителя) и магнитные взаимодействия в радикальной паре. Эффективность тушения (qi) зависит от концентрации тушителя в определенном протонированном состоянии (cq), собственного времени жизни триплетов красителя () и от константы скорости тушения для пары реагентов (kqi), и описывается уравнением Штерна-Фольмера: qi 1 1 1 k qicq . (10) Помимо константы скорости тушения (kqi), каждая пара реагентов характеризуется также значением поляризации (pi), сформированной в данной паре. Таким образом, суммарная интенсивность I геминальной ХПЯ, которая возникает в результате фотореакции, может моделироваться в виде суммы интенсивностей ХПЯ, сформированной в каждой паре реагентов, Ii=qi×pi, умноженных на молярные доли () тушителя и красителя: I I i (quencher ) (dye). (11) i Моделирование рН-зависимости интенсивности геминальной ХПЯ по уравнению (11) позволило определить значения Ii, определяющие интенсивность геминальной ХПЯ, возникающей для реакционных пар в определенном протонированном состоянии. 2.3.3. Кинетика ХПЯ Моделирование кинетики ХПЯ было проведено согласно модели, предложенной Фишером с соавторами [134], и успешно используемой в работах Морозовой с соавторами [135] при моделировании кинетики ХПЯ для фотоциклических реакций, в которых продукты геминальной и гомогенной рекомбинации совпадают с исходными реагентами: T T S ИКК kt D Q (D Q ) (D Q ) D Q. Приведем краткую выдержку из этих работ. Моделирование кинетики ХПЯ производится с помощью системы связанных дифференциальных уравнений, 40 описывающих концентрацию радикалов R(t) и ядерную поляризацию радикалов P(R) и диамагнитных продуктов фотоциклической реакции P(Pr) [134]: R(t ) R0 , 1 k t R0t (12) dP( R) P( R) k t P( R)R k t R 2 kex C P( R) , dt T1 (13) dP( Pr ) kt P( R)R kt R 2 kex C P( R) . dt (14) Предполагается, что образование радикалов происходит мгновенно на временной шкале радикальных реакций. Для того, чтобы выполнить это условие, необходимо использовать такие концентрации реагентов, чтобы характерное время тушения триплетного возбужденного состояния красителя было заведомо меньше, чем длительность регистрирующего радиочастотного импульса, т.е. произведение (kq×С)– 1 <300 нс, где kq – константа скорости тушения триплетно-возбужденного красителя, С – концентрация молекул тушителя. Значение Р измеряется в эксперименте; R0– начальная концентрация радикалов; kt – константа скорости бимолекулярной реакции гибели радикалов; T1 – время ядерной парамагнитной релаксации; β – параметр, который представляет собой поляризацию, созданную в F-парах. В случае триплетного предшественника β=PG/R0, где PG–геминальная поляризация при t=0, – постоянная, которая характеризует соотношение ХПЯ в геминальных парах и парах в объеме. В случае триплетного предшественника предел равен 3. Для описания экспериментальных данных обычно используется γ=2.8 [40, 42]. Первые члены в правой части уравнений (13) и (14) описывают перенос поляризации от радикалов к диамагнитным молекулам в бимолекулярной реакции гибели радикалов; вторые члены представляют формирование поляризации в F-парах. Третий член в правой части уравнения (13) соответствует потере поляризации в радикалах из-за ядерной парамагнитной релаксации. Последние слагаемые в правых частях уравнений (13) и (14) описывают перенос поляризации от радикалов к диамагнитным молекулам (с концентрацией С) в реакции вырожденного электронного обмена с константой скорости kex (*RH+∙ + RH →*RH + RH+∙), где звездочкой отмечена ядерная поляризация. Предполагается, что выход радикалов, избежавших геминальной рекомбинации и вышедших в объем, намного больше, чем выход геминальной рекомбинации, а также что радикалы гибнут только рекомбинируя друг с другом (с константой скорости kt). 41 Начальные поляризации принимаются равными: P=PG=-P(R), что согласуется со спинсортирующей природой механизма интеркомбинационной S−T0 конверсии в радикальных парах [104]. Стационарное значение геминальной ХПЯ зависит от соотношения параметров R0×kt и T1: чем больше время жизни радикалов, тем быстрее поляризация, противоположная по знаку геминальной, разрушается за счет парамагнитной ядерной релаксации. 42 Глава 3. Фотоиндуцированное окисление ароматических аминокислот триплетно-возбужденным 3,3',4,4'тетракарбоксибензофеноном (TCBP) Глава 3 посвящена исследованию фотохимических реакций между триплетновозбужденным 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном и различными аминокислотами (триптофан, N-ацетил-триптофан, тирозин, N-ацетил-тирозин, гистидин, N-ацетилгистидин), а также дипептидами Phe-His, His-Phe и His-His в широком диапазоне рН водных растворов. Целью исследования является: установление механизмов фотоиндуцированных реакций между триплетно-возбужденным ТСВР и ароматическими аминокислотами, и выявление влияния суммарного заряда реагентов на окисление высоко реакционноспособных остатков аминокислот. 3.1. Определение значений рКа для TCBP, N-ацетилтирозина, дипептидов гистидил-гистидин, гистидил-фенилаланин и фенилаланилгистидин Структурные формулы реагентов, а также значения констант кислотности pKa в H2O и pKa* в D2O, используемых для расчета равновесных концентраций различных протонированных состояний реагентов при анализе данных ЛИФ и ХПЯ, представлены в таблице 1. Значимые в исследуемом диапазоне рН (2-12) протонированные формы реагентов представлены в таблице 2. Протонированные состояния карбоксильной группы аминокислот (pKa~2) и их N-ацетилпроизводных (pKa~3.5) не показаны явным образом в таблице 2. С экспериментальной точностью наших ХПЯ и ЛИФ измерений, константа кислотности карбоксильной группы может быть для удобства условно принята равной 2.9, как и pKa1 TCBP. таблица 2 также содержит суммарные заряды реагентов, которые включают и заряд карбоксильной группы. Значения констант кислотности N-AcTyr, дипептидов His-His, His-Phe и Phe-His не были известны из литературы. Для определения значений pKa этих соединений были получены спектры 1 H ЯМР при различных значениях рН водных растворов. Моделирование кривых титрования, построенных по изменению хим. сдвига δi сигналов протонов, чувствительных к протонированию функциональных групп (на рисунках показаны не все группы) N-AcTyr (см. рисунок 12, слева), His-His (см. рисунок 12, 43 справа), His-Phe (см. рисунок 13, слева), Phe-His (см. рисунок 13, справа), согласно уравнениям (15) (для соединений с одним значением pKa), (16) (для соединений с двумя значениями pKa), (17) (для соединений с тремя значениями pKa), (18) (для соединений с четырьмя значениями pKa). 0 10 pK 1 10 pH 0 10 pK 10 pK 1 10 pK 10 pH 2 10 2 pH * a1 * * * * a1 (15) , 10 pKa1 10 pH * a2 * a1 * * , 10 pKa1 10 pKa2 10 pKa1 10 pH 10 2 pH * * * * * * a2 * a2 * a3 * a3 * a1 * a1 * a2 * a1 10 pKa1 * (16) 0 10 pK 10 pK 10 pK 1 10 pK 10 pK 10 pH 10 pK 10 pK 10 pK 10 pK 10 pH 10 pK 10 2 pH 10 3pH (17) 2 10 pK 10 2 pH 3 10 3pH , 10 pK 10 pK 10 pK 10 pK 10 pH 10 pK 10 2 pH 10 3pH * a1 10 pKa1 * * a2 * a3 * a1 * * * * a1 * * * a1 * * * * a2 0 A 1 B 2 C 3 D 4 E A B C D E * a2 * (18) , A 10 pKa1 10 pKa2 10 pKa3 10 pKa3 , * * * * B 10 pKa1 10 pKa2 10 pKa3 10 pH , * * * * C 10 pKa1 10 pKa2 10 2 pH , * * * D 10 pKa1 10 3pH , * * E 10 4 pH . * Таблица 1. Значения pKa, pKa* и структурные формулы реагентов Соединение TCBP 3,3,4,4тетракарбокс ибензофенон Структурная формула pKa 2.9; 4.9(a) pKa* 2.7; 4.8 Гистидин His 1.8; 6.0; 9.2 [133]; 14.3(б); 1.5; 6.0; 9.5; 14.9 N-ацетилгистидин N-AcHis ~3.5(в); 7.0 [43]; 14.3 [43] ~3.3; 7.1; 14.9 Тирозин Tyr 2.2; 9.0; 10.1[133] 1.9; 9.2; 10.4 44 N-ацетил-Lтирозин N-AcTyr ~3.5(б); 10.2(a) ~3.3; 10.5 Триптофан Trp 2.4; 9.4 [133] 2.1; 9.7 N-ацетилтриптофан N-AcTrp 3.4 [136] 3.2 Гистидилгистидин His-His 5.7; 6.7; 7.9(a) 5.7; 6.8; 8.0 Гистидилфенилаланин His-Phe 6.1; 7.8(a) 6.1; 7.9 Фенилаланил -гистидин Phe-His 6.7; 7.8(a) 6.8; 7.9 (a) Значения pKa, не известные из литературы, были определены экспериментально из зависимостей хим. сдвига сигналов ЯМР от рН водного раствора. (б)Значение pKa4 для His не известно из литературы; соответствующее значение pKa для N-AcHis составляет 14.3 [43]. (в)Типичное значение pKa карбоксильной группы в пептидах и N-ацетил-производных аминокислот составляет ~3.5 [136, 137]. 45 Рисунок 12. Слева: Зависимости хим. сдвигов Н2,6, Н3,5 и β- протонов N-ацетилтирозина от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнения (15). Справа: Зависимости хим. сдвигов -C и -N протонов гистидил-гистидина от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнения (17). Рисунок 13. Слева: Зависимости хим. сдвигов (His) и H2 (His) протонов гистидил-фенилаланина от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнения (16). Справа: Зависимости хим. сдвигов (Phe) и H2 (His) протонов фенилаланил-гистидина от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнения (16). Краситель TCBP может находиться в одном из пяти протонированных состояний. Соответствующие константы кислотности Ka1–Ka4 не были известны из литературы. Ранее были опубликованы две константы кислотности pKa1=3.2 и pKa2=5.2 основного состояния ТСВР, определенные методом УФ-спектроскопии, а также две константы кислотности pKa1=2.1 и pKa2=4.7 триплетно-возбужденного состояния ТСВР, оцененные методом титрования триплет-триплетного поглощения [91]. Для определения значений pKa 46 красителя ТСВР нами были получены спектры 1H и 13 C ЯМР ТСВР при значениях рН водных растворов от 1.0 до 7.5. Используя зависимости хим. сдвигов 1H и 13C от pH (см. рисунок 14) мы определили константы кислотности TCBP в D2O: pKa1*=2.5±0.1, pKa2*=2.7±0.1, pKa3*=4.5±0.1, и pKa4*=5.2±0.1. Использование четырех значений pKa при моделировании зависимостей хим. сдвигов от рН приводило к лучшему согласию, чем при использовании двух значений pKa. Однако, точность наших экспериментов ЛИФ и ХПЯ была ниже, чем точность экспериментов титрования хим. сдвигов. Поэтому, при моделировании наших данных ЛИФ и ХПЯ мы считали ТСВР двухосновной кислотой с двумя средними константами кислотности pKa1*=2.7, pKa2*=4.8 в D2O и pKa1=2.9, pKa2=4.9 в H2O. С использованием молярных долей ТСВР, вычисленных с помощью констант кислотности ТСВР в основном состоянии нам удалось промоделировать данные ХПЯ и ЛИФ с хорошей точностью. Этот факт можно объяснить тем, что для нашей экспериментальной точности разница между значениями pKa красителя ТСВР в основном и триплетно-возбужденном состоянии пренебрежимо мала. Рисунок 14. Зависимости хим. сдвигов H2, H5, H6 протонов (слева) и C4, C3, C(4)OOH, C(3)OOH ядер углерода (справа) 3,3,4,4-тетракарбоксибензофенона от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнения (18). 47 Таблица 2. Протонированные состояния реагентов, константы скорости тушения триплетно-возбужденного ТСВР аминокислотами (kqi), относительные интенсивности ХПЯ (Ii). Тушитель pH дипазон Протонированные состояния реагентов Суммарный заряд реагентов (ТСВР/амин окислота) Гистидин pH<2.9 TCBPH4 и NH3+HisH2+ 0/ +2 <1.0×106 0 2.9<pH<4.9 TCBPH22– и NH3+HisH2+ -2/ +1 4.3×108 0.14 4.9<pH<6.0 TCBP4– и NH3+HisH2+ -4/ +1 1.0×108 0.49 6.0<pH<9.2 TCBP4– и NH3+HisH -4/ 0 1.6×109 1 9.2<pH<14. 3 TCBP4– и NH2HisH -4/ -1 3.0×108 0.47 pH>14.3 TCBP4– и NH2His– -4/ -2 n/a(б) 0 pH<2.9 TCBPH4 и N-AcHisH2+ 0/ +1 <1.0×106 0 2.9<pH<4.9 TCBPH22– и NAcHisH2+ -2/ 0 7.7×107 0.12 4.9<pH<7.0 TCBP4– и N-AcHisH2+ -4/ 0 1.9×107 0.06 7.0<pH<14. 3 TCBP4– и N-AcHisH -4/ -1 3.1×108 0.41 pH>14.3 TCBP4– и N-AcHis– -4/ -2 n/a(б) 0 pH<2.9 TCBPH4 и NH3+TyrOH 0/ +1 2.1×109 0.9 2.9<pH<4.9 TCBPH22– и NH3+TyrOH -2/ 0 1.9×109 0.97 4.9<pH<9.0 TCBP4– и NH3+TyrOH -4/ 0 1.5×109 1 9.0<pH<10. 1 TCBP4– и NH2TyrOH -4/ -1 (4.0÷10.0)×108(в 0.66 pH>10.1 TCBP4– и NH2TyrO– -4/ -2 <1.0×106 0 pH<2.9 TCBPH4 и N-AcTyrOH 0/ 0 2.7×109 1 2.9<pH<4.9 TCBPH22– и NAcTyrOH -2/ -1 1.7×109 0.7 4.9<pH<10. 1 TCBP4– и N-AcTyrOH -4/ -1 4.2×108 0.18 pH>10.1 TCBP4– и N-AcTyrO– -4/ -2 <1.0×106 0 pH<2.9 TCBPH4 и NH3+Trp 0/ +1 3.5×109 2.9<pH<4.9 TCBPH22– и NH3+Trp -2/ 0 3.5×109 0.22(г) / 0.89 1.05 4.9<pH<9.4 TCBP4– и NH3+Trp -4/ 0 2.2×109 0.99 N-ацетилгистидин Тирозин N-ацетилтирозин Триптофан kqi (M-1c-1) Ii (a) ) 48 N-ацетилтриптофан 0.39 pH>9.4 TCBP4– и NH2Trp -4/ -1 8×108 pH<2.9 TCBPH4 и N-AcTrp 0/ 0 3.4×109 2.9<pH<4.9 TCBPH22– и N-AcTrp -2/ -1 2.1×109 0.55(г) / 0.75 0.34 pH>4.9 TCBP4– и N-AcTrp -4/ -1 7.8×108 0.3 Параметры Ii были вычислены с использованием значений pKa* для растворов в D2O. (б)Значения kqi не удалось определить, так как значение ионной силы растворов не было постоянным при увеличении pH от 12 до 14. (в)Было невозможно определить эту величину с высокой точностью из-за незначительной разницы между pKa2 и pKa3 Tyr; (г)Реакция вырожденного электронного обмена при рН ниже pKa=4.3 [131, 138] (a) • kex • катион-радикала триптофана: PTrpH+ +TrpH PTrpH+TrpH+ (поляризация обозначена как «P») влияет на амплитуду ХПЯ. Поэтому значение pKa=4.3 учитывалось при моделировании зависимости геминальной ХПЯ от рН раствора. 3.2. Реакции тушения триплетного состояния TCBP ароматическими аминокислотами Спад триплетного поглощения регистрировали на длине волны λ=590 нм (pH<pKa2TCBP=4.9) и λ=550 нм (pH>pKa2TCBP=4.9) [91], в условиях, когда триплетновозбужденный краситель имеет максимум поглощения. Облучение импульсами лазера (λ=308 нм) раствора, содержащего 1×10−4 M ТСВР в отсутствие тушителя, приводит к образованию 3 ТСВР, которые гибнут с константой скорости первого порядка kd=(5.5−8)×105 с−1 [91, 139] (триплет-триплетной аннигиляцией можно пренебречь). В присутствии тушителя, 3ТСВР реагирует с ним с константой скорости kobs (см. рисунок 15). В результате из зависимости триплетного поглощения от времени с помощью зависимости Штерна-Фольмера (см. уравнения (2) и (3)) была получена наблюдаемая константа скорости тушения kqobs. 49 Рисунок 15. Спад сигнала промежуточного поглощения (λobs=550 nm) триплетов ТСВР (1×10−4M) в присутствии His (концентрация увеличивается снизу вверх от 0 до 6.6×10 −4 M) в водном растворе при рН=6.5. Вставка: график, полученный с помощью уравнения (3) (зависимость Штерна-Фольмера). 3.2.1. Триптофан и N‐ацетил‐триптофан На длине волны 308 нм при выбранных концентрациях реагентов, поглощение Trp и N-AcTrp намного меньше, чем поглощение ТСВР. Поэтому облучение раствора, содержащего TCBP и Trp (или N-AcTrp), приводит сначала к образованию триплетновозбужденного TCBP и затем к реакции тушения. Зависимости наблюдаемой константы тушения kqobs от рН представлены на рисунке 16. Полученные зависимости были описаны с использованием уравнений (9) (для Trp) и (19) (для N-AcTrp). В таблице 2 содержатся основные пары реагирующих частиц для каждого диапазона рН, определяемого значениями рКа реагентов, а также соответствующие константы скорости kqi, полученные при моделировании зависимостей kqobs от рН (сплошные линии, рисунок 16). Константа скорости тушения максимальна в кислотных рН и уменьшается при депротонировании 3 ТСВР с увеличением рН. Более того, Trp с протонированной аминогруппой в 3 раза более реакционноспособен, чем Trp с нейтральной аминогруппой и N-AcTrp в нейтральном растворе. В щелочных растворах реакционная способность по отношению к 3ТСВР триптофана и N-ацетил-триптофана одинакова. 50 k q obs k q1 [H ]2 TCBP TCBP TCBP [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 [H ] k q2 2 TCBP TCBP TCBP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 TCBP K a1 TCBP (19) TCBP K a2 k q3 2 . TCBP TCBP TCBP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 Рисунок 16. Зависимости наблюдаемой константы скорости тушения от рН: черные квадраты – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с Trp, белые квадраты – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с N-AcTrp. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнений (9) и (19). 3.2.2. Гистидин и N‐ацетил‐гистидин Поскольку гистидин не поглощает свет в УФ и видимой областях, облучение раствора, содержащего TCBP и His либо N-AcHis, приводит к образованию только триплетно-возбужденного TCBP со спектром промежуточного поглощения близким к опубликованному ранее [91, 139]. Соответствующие пары реагентов при различных значениях рН приведены в таблице 2. Полученные зависимости наблюдаемой константы скорости тушения (kqobs) 3ТСВР аминокислотами His и N-AcHis от рН водного раствора показаны на рисунке 17. Моделирование представленных зависимостей проводилось в соответствии с уравнениями (20) для His и (21) для N-AcHis (см. таблицы 1 и 2 для параметров). Полученные из моделирования значения kqi приведены в таблице 2. Протонированные состояния реагентов сильно влияют на скорость реакции тушения 3ТСВР аминокислотой His и ее N-ацетилпроизводной N-AcHis (см. рисунок 17). В кислых растворах (pH<2.9) не наблюдается тушения триплетов 3TCBPH4 тушителями NH3+HisH2+ и N-AcHisH2+. В диапазоне значений рН от 2 до 7.6 (для His) и от 2 до 8.1 (для 51 N-AcHis) наблюдается увеличение значения kqobs, что связано с последовательным депротонированием 3 ТСВР (pKa1=2.9, pKa2=4.9), а также с депротонированием имидазольного кольца His (pKa=6.0) и N-AcHis (pKa=7.0), которое становится нейтральным. Более того, стоить отметить, что константы скорости реакции тушения триплетов 3 TCBPH22– тушителями NH3+HisH2+ и N-AcHisH2+ выше, чем для соответствующих пар с триплетами 3TCBP4–. Для гистидина с нейтральным имидазолом (pKa=6.0) и положительно заряженной аминогруппой (pKa=9.2) константа скорости тушения триплетов 3TCBP4– составляет 1.6×109 M-1с-1, что намного выше, чем характерное значение константы скорости тушения по механизму переноса атома водорода (около 108 M-1с-1 и ниже). Депротонирование аминогруппы гистидина при pH>7.6 уменьшает значение kqobs в 5 раз. В случае N-AcHis значение константы скорости тушения остается неизменным в диапазоне рН от 8.1 до 12. kq obs [H ]2 [H ]2 k q1 2 2 TCBP TCBP TCBP His His His [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 [H ] [H ]2 TCBP TCBP TCBP His His His [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 TCBP k q2 K a2 [H ]2 k q3 2 (20) TCBP TCBP TCBP His His His [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 k q4 k q5 k q obs k q1 TCBP TCBP K a2 K a1 [H ] TCBP TCBP TCBP His His His [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 TCBP TCBP K a1 TCBP TCBP His His His K a2 K a1 K a2 2 , TCBP TCBP TCBP His His His 2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 [H ] TCBP TCBP TCBP N -AcHis [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 K a1 [H ] [H ] TCBP TCBP TCBP N -AcHis [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 TCBP k q2 K a2 [H ] k q3 2 TCBP TCBP TCBP N -AcHis [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 K a1 k q4 TCBP TCBP TCBP TCBP K a1 N -Ac His K a2 K a1 . TCBP TCBP TCBP N -AcHis 2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 (21) 52 Рисунок 17. Зависимости наблюдаемой константы скорости тушения от рН: черные кружки – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с His, белые кружки – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с N-AcHis. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнений (20) и (21). 3.2.3. Тирозин и N‐ацетил‐тирозин На рисунке 18 представлены зависимости от рН наблюдаемой константы тушения kqobs триплетов ТСВР аминокислотой Tyr, а также N-AcTyr. Полученные зависимости kqobs описываются уравнениями (22) для Tyr и (23) для N-AcTyr (см. таблицы 1 и 2 для параметров). Значения kqi, полученные при моделировании зависимостей kqobs (сплошные линии на рисунке 18) находятся в таблице 2. kq obs [H ]2 [H ]2 k q1 2 2 TCBP TCBP TCBP Tyr Tyr Tyr [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 [H ] [H ]2 TCBP TCBP TCBP Tyr Tyr Tyr [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 TCBP k q2 K a2 [H ]2 k q3 2 (22) TCBP TCBP TCBP Tyr Tyr Tyr [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 k q4 k q5 TCBP TCBP K a2 K a1 [H ] TCBP TCBP TCBP Tyr Tyr Tyr [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 TCBP TCBP K a1 TCBP TCBP Tyr Tyr Tyr K a2 K a1 K a2 2 , TCBP TCBP TCBP Tyr Tyr Tyr 2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 53 k q obs k q1 [H ]2 [H ] TCBP TCBP TCBP N - AcTyr [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 K a1 [H ] [H ] k q2 2 TCBP TCBP TCBP N - AcTyr [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 TCBP (23) K a2 [H ] k q3 2 TCBP TCBP TCBP N - AcTyr [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 K a1 k q4 TCBP TCBP TCBP TCBP K a1 N - AcTyr K a2 K a1 N-AcTyr . TCBP TCBP TCBP 2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 Рисунок 18. Зависимости наблюдаемой константы скорости тушения от рН: черные треугольники – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с Tyr, белые треугольники – для реакции триплетновозбужденного ТСВР с N-AcTyr. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнений (22) и (23). В сильнокислых растворах Tyr и N-AcTyr тушат триплетно-возбужденный ТВСР с kqi=2.1109 M-1с-1 и kqi=2.7109 M-1с-1, соответственно. При увеличении значения рН от 2.0 до 6.0 наблюдается уменьшение константы скорости тушения для Tyr и N-AcTyr из-за депротонирования триплетно-возбужденного ТСВР. Это уменьшение наиболее выражено для N-AcTyr вследствие большей разницы в суммарном молекулярном заряде для пар реагентов TCBP4–/N-AcTyrOH и TCBP4–/NH3+TyrOH. С депротонированием аминогруппы Tyr (pKa=9.0) наблюдается уменьшение константы скорости тушения, а именно для реакционной пары TCBP4–/NH2TyrOH константа скорости тушения kq4 равна (4.0÷10.0)×108 M-1s-1 (определить это значение с высокой точностью было невозможно). При моделировании рН-зависимости наблюдаемой константы скорости тушения (kqobs) 54 для Tyr и N-AcTyr константа kq5 полагалась равной 1.0×106 M-1s-1. Это означает, что NH2TyrO– либо N-AcTyrO– не тушат 3TCBP4–. Это предположение было подтверждено измерениями ХПЯ. 3.3. Зависимости амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора Информация о константах скорости тушения важна как для детальной интерпретации механизма формирования ХПЯ, так и для оптимизации условий эксперимента ХПЯ с временным разрешением. Концентрации тушителей были скорректированы таким образом, чтобы показать различие в реакционной способности между свободной аминокислотой и ее N-ацетилированной производной. На рисунке 19 представлены геминальные спектры ХПЯ, полученные в результате фотолиза раствора содержащего ТСВР и (1) Trp при pH*=7.0; (2) Tyr при pH*=6.7; (3) His при pH*=7.6. Вид спектра не зависел от рН раствора, за исключением изменений хим. сдвигов ЯМРсигналов реагентов. Спектры ХПЯ N-ацетилпроизводных соответствующих свободных аминокислот. схожи со спектрами Сигналы ХПЯ наблюдались для не обменивающихся с Н2О протонов, которые имеют ненулевые константы сверхтонкого взаимодействия (СТВ) в короткоживущих радикалах. В соответствии с правилами Каптейна для знаков ХПЯ [113], результатом спинселективной рекомбинации является положительная поляризация (усиленная абсорбция) H2, H6, H4 протонов Trp/N-AcTrp, Н2 и Н4 протонов His/N-AcHis, H2,6 и β протонов Tyr/N-AcTyr; отрицательная поляризация (эмиссия) β протонов Trp/N-AcTrp, β протонов His/N-AcHis и H3,5 протонов Tyr/N-AcTyr. Поляризация красителя ТСВР, формирующаяся в радикальных парах с радикалами триптофана и гистидина с Δg>0, положительная для Н5 протона и отрицательна для Н2, Н6 протонов. Для пары с радикалом тирозина с Δg<0 поляризация Н2, Н6 протонов ТСВР положительна, Н5 протона отрицательна. 55 Рисунок 19. 200 MГц 1 H-ХПЯ спектры, полученные сразу после лазерного импульса в * * фотореакциях 2 мМ TCBP с 1.1 мМ Trp (наверху, pH 7.0), 40 мМ His (в центре, pH 7.6) и 2.2 мМ Tyr * (внизу, pH 6.7). Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН* водного раствора приведены на рисунке 20 для Trp, N-AcTrp, на рисунке 21 для His, N-AcHis, на рисунке 22 для Tyr, N-AcTyr. Вертикальные нормировочные коэффициенты были выбраны таким образом, чтобы максимальное значение ХПЯ в рассчитанной кривой было равно единице, относительные интенсивности ХПЯ N-ацетилированных производных масштабированы соответственно. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН * были промоделированы с помощью уравнения (11), для этого полученные зависимости были разделены на интервалы pH* с границами на значениях pKa* исходных реагентов и основными парами реагентов в каждом рН* диапазоне (см. таблицы 1 и 2). Результат моделирования pH*-зависимостей геминальной ХПЯ – значения интенсивности геминальной ХПЯ, pi×qi, возникающей для каждой пары реагентов в протонированном состоянии, определяемом диапазоном рН* и значениями pKa*– представлен в таблице 2. 3.3.1. Триптофан и N‐ацетил‐триптофан В кислых растворах радикал триптофана существует в протонированной форме +• TrpH (pKa=4.3 [131, 138]) и участвует в реакции вырожденного электронного обмена с 56 kex молекулами в основном состоянии, PTrpH+•+TrpH PTrpH+TrpH+•. Эта реакция ведет к переносу поляризации (обозначенной «P») от катион-радикала к диамагнитной молекуле и определяет спад сигнала геминальной ХПЯ протонов Trp и N-AcTrp в кислотных pH* (см. рисунок 20). В нейтральных и щелочных растворах катион-радикал TrpH+• быстро депротонирует, и образуется нейтральный радикал Trp. Нейтральный радикал триптофана не участвует в реакции вырожденного электронного обмена. В нейтральных и щелочных растворах pH*-зависимости ХПЯ полностью соответствуют зависимостям константы скорости тушения от рН: наблюдается уменьшение амплитуды геминальной ХПЯ вследствие депротонирования аминогруппы Trp, тогда как интенсивность геминальной ХПЯ N-AcTrp не зависит от pH* в диапазоне pH* от 5.5 до 12. Рисунок 20. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН* водного раствора: черные квадраты – для Trp, белые квадраты – для N-AcTrp. 3.3.2. Гистидин и N‐ацетил‐гистидин Точки перегиба кривых титрования ХПЯ His и N-AcHis (см. рисунок 21) коррелируют со значениями pKa протонированных состояний аминокислот и красителя, а также с зависимостями kqobs от рН. В сильнокиcлотных растворах (pH*<2) геминальная ХПЯ не наблюдается. В диапазоне 2<pH*<7.2 (для His) и 2<pH*<8.2 (для N-AcHis) амплитуда геминальной ХПЯ возрастает с депротонированием триплетов красителя и аминокислот (имидазолил His и N-AcHis становится нейтральным). При депротонировании концевой аминогруппы гистидина амплитуда геминальной ХПЯ 57 уменьшается более чем в 2 раза (в диапазоне pH* от 7.1 до 12). Интенсивность геминальной ХПЯ N-ацетилгистидина не изменяется при варьировании pH* от 8.2 до 12. Хотя нам не удалось измерить константу скорости тушения при рН>12 для пар реагентов TCBP4–/NH2His– и TCBP4–/N-AcHis–, мы получили зависимость ХПЯ от pH* для His и N-AcHis при pH*>12. В сильнощелочных растворах имидазолил гистидина и Nацетилгистидина теряет последний титруемый протон. Этот процесс сопровождается сильнопольным сдвигом протонов H2, H4 в спектре ЯМР, а также уменьшением амплитуды сигналов ХПЯ His и N-AcHis. Моделирование pH*-зависимости ХПЯ дало константы кислотности для последнего титруемого протона: 14.2 для His и 14.4 для NAcHis. Спад амплитуды сигнала ХПЯ при pH*>12 означает, что константа скорости тушения 3 TCBP гистидином и N-ацетилгистидином с отрицательно заряженным имидазолилом значительно ниже, чем в случае этих аминокислот с нейтральным имидазолилом. Это наблюдение коррелирует с уменьшением константы скорости тушения 3TCBP тирозином и N-ацетилтирозином при депротонировании фенольного фрагмента. Рисунок 21. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН* водного раствора: черные кружки – для His, белые кружки – для N-AcHis. 3.3.3. Тирозин и N‐ацетил‐тирозин Кривые титрования ХПЯ для Tyr и N-AcTyr (рисунок 22) определяются теми же значениями pKa, что и рН-зависимости kqobs. Амплитуда геминальной ХПЯ максимальна в кислых и нейтральных растворах. Депротонирование аминогруппы Tyr уменьшает 58 амплитуду геминальной ХПЯ. Для пар реагентов TCBP4–/NH2TyrO– и TCBP4–/N-AcTyrO–, геминальная ХПЯ не наблюдается. Рисунок 22. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН* водного раствора: черные треугольники – для Tyr, белые треугольники – для N-AcTyr. 3.3.4. Гистидил-гистидин, гистидил-фенилаланин и фенилаланил-гистидин Чтобы прояснить влияние аминогруппы на реакционную способность аминокислот по отношению к триплетно-возбужденному TCBP, мы получили pH*-зависимости геминальной ХПЯ для дипептидов, в которых только один остаток реагирует с 3TCBP, а именно для His-Phe и Phe-His, а также для His-His. На рисунке 23 показаны спектры ХПЯ, полученные для фотореакции ТСВР с His-Phe, Phe-His и His-His при различных значениях pH*. На рисунке 24 показаны рН*-зависимости геминальной ХПЯ, полученные для дипептидов His-Phe и Phe-His. Для дипептидов His-Phe и Phe-His наблюдается поляризация только остатка His. Это показывает, как и ожидалось, что остаток фенилаланина не вовлечен в реакцию тушения. Кривые титрования ХПЯ His-Phe и PheHis аналогичны pH*-зависимостям ХПЯ His в нейтральных и щелочных pH*. Увеличение амплитуды геминальной ХПЯ вызвано депротонированием положительно заряженного имидазолила Phe-His (pKa*=6.8) и His-Phe (pKa*=6.1). Депротонирование аминогруппы обоих пептидов (pKa*=7.9) уменьшает интенсивность геминальной ХПЯ в 1.7 раза. Таким образом, реакционная способность этих дипептидов зависит от протонированного состояния имидазолила и аминогруппы не зависимо от положения остатка гистидина. 59 Аналогичная тенденция наблюдалась при облучении раствора ТСВР и дипептида His-His при различных значениях pH* водного раствора. В этом случае оба аминокислотных остатка вовлечены в процесс тушения триплетно-возбужденного TCBP, при этом формируются радикалы двух типов: с радикальным центром на С- либо на Nконцевом остатке дипептида His-His. При значениях рН* выше 5.5, наблюдалось увеличение интенсивности геминальной ХПЯ в соответствии с константами кислотности имидазолила для С-, либо на N-концевого остатка, pKa1-N*=5.7, pKa2-C*=6.8, соответственно. При значениях pH* выше pKa2-C*=6.8, сигналы ХПЯ С- и N-концевого остатков почти равны, что указывает на очень близкую реакционную способность этих остатков. При значениях pH* выше pKa* (8.0) аминогруппы His-His, наблюдалось уменьшение интенсивности ХПЯ для обоих остатков в дипептиде. Как и в случае дипептидов His-Phe и Phe-His, депротонирование положительно заряженной аминогруппы вызывает 2-3-кратное снижение эффективности тушения 3TCBP. Рисунок 23. 200 MГц 1 H-ХПЯ спектры, полученные сразу после лазерного импульса в фотореакциях TCBP с дипептидами His-Phe (слева), Phe-His (в центре) и His-His (справа) при различных значениях рН. Относительные интенсивности в спектрах, показанные в каждом столбце, соответствуют тем, что наблюдались в эксперименте. Масштабирование левого и правого столбцов независимо. 60 Рисунок 24. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН водного раствора: черные кружки – для His-Phe, белые кружки – для Phe-His. 3.4. Кинетический изотопный эффект в фотореакции гистидина с ТСВР Для того чтобы оценить константу скорости тушения триплетно-возбужденного ТСВР гистидином и его N-ацетилпроизводной в растворах D2O методом ХПЯ, были измерены зависимости геминальной ХПЯ от концентрации His и N-AcHis при фиксированном значении рН (аналогично Штерн-Фольмеровской зависимости). Измерения для His проводились при pH*=8, когда аминогруппа положительно заряжена, и при pH*=11, когда аминогруппа нейтральна (имидазольное кольцо нейтрально в обоих случаях). Для N-AcHis зависимости были получены при рН=8.4 и 11, когда имидазольное кольцо нейтрально. Зависимость интенсивности ХПЯ от концентрации аминокислоты описывается уравнением: I I c 0 1 1 kqi c0 , (24) где с0 – концентрация аминокислоты, kqi – константа скорости тушения, – собственное время тушения триплетов красителя, I – интенсивность ХПЯ в условиях «насыщения», когда c0>>kq–1–1. Рисунок 25а показывает зависимости геминальной ХПЯ Н4 протона His и N-AcHis, полученные в фотореакции TCBP с соответствующим тушителем от концентрации последнего. Как и ожидалось, не было различия между экспериментальными данными, 61 полученными для N-AcHis при pH* 8.4 и 11. Зависимости на рисунке 25а отражают разницу в интенсивностях ХПЯ (при масштабировании сохранены относительные интенсивности сигналов), а также разницу в значениях kqi: при более высоком значении kqi «насыщение» достигается при более низкой концентрации c0. При моделировании зависимостей с использованием уравнения (24), были получены значения I и kq×. На рисунке 25б эти же данные представлены в координатах I/I - 1/c0 и отражают только разницу в константах скорости тушения: I 1 1 . I kqc0 (25) Тангенсы линейных зависимостей на рисунке 25б соответствуют следующим значениям kqi×: 103M-1 (His, pH* 8), 3.5102M-1 (His, pH* 11), 102M-1 (N-AcHis, pH* 8.4, 11). С использованием =1.4 мкс для триплетно-возбужденного TCBP [91, 140], можно оценить константы скорости тушения триплетно-возбужденного TCBP гистидином и Nацетилгистидином (см. таблицу 3). а Б Рисунок 25. Зависимости геминальной ХПЯ от концентрации аминокислоты при различных значениях рН водного раствора: для фотореакции TCBP с His (кружки) и N-AcHis (треугольники). Открытые кружки – His при pH*=8.0, закрытые кружки – His при pH*=11.0, открытые треугольники – N-AcHis при pH*=8.4, закрытые треугольники – N-AcHis при pH*=11. Линии – расчет с использованием уравнений (24) (для рисунка 25a) и (25) (для рисунка 25б). В таблице 3 приведены также константы скорости тушения триплетновозбужденного ТСВР гистидином и N-ацетилгистидином, полученные методом ЛИФ в 62 растворах D2O. Для проведения экспериментов ЛИФ, как и для вышеописанных экспериментов ХПЯ, было выбрано два значения pH*: pH*=7.8 и pH*=12. Для приготовления растворов с pH*=7.8 использовали буферный раствор, содержащий необходимые количества дейтерированных KD2PO4-Na2DPO4; для приготовления растворов с pH*=12 использовали небольшие количества NaOD. Таблица 3. Сравнение констант скорости тушения триплетно-возбужденного ТСВР гистидином и N-ацетилгистидином, полученных методами ЛИФ и ХПЯ в D2O и H2O растворах. ЛИФ в H2O ХПЯ в D2O pH kqi, M-1с-1 pH* kqi, M-1с-1 pH* kqi, M-1с-1 7.6 1.6×109 7.8 9.3×108 8 7.0×108 12 3.0×108 12 1.7×108 11 2.5×108 12 3.1×108 12 1.7×108 8.4, 11 7.0×107 His N-AcHis ЛИФ в D2O Сравнение данных, полученных методом ЛИФ в D2O и H2O, показывает, что при проведении реакции в D2O константа скорости тушения уменьшается почти в 2 раза по сравнению с растворами в H2O. Данные, полученные методом ХПЯ, с учетом экспериментальной ошибки, согласуются с результатами, полученными методом ЛИФ в D2O. 3.5. Механизмы реакций Как было показано в работах [40-43], константы скорости реакции тушения фотовозбужденного триплетного красителя аминокислотами, близкие к диффузионноконтролируемому пределу (k≥109M-1с-1), типичны для реакций переноса электрона. Таким образом, предполагается, что механизмом тушения 3ТСВР триптофаном и тирозином, а также их N-ацетилпроизводными в кислотных растворах, при pH<2.9 и 2.9<pH<4.9, является перенос электрона. Как следует из таблицы 2, депротонирование 3TCBPH4 и образование 3 TCBPH22– приводит к значительному изменению константы скорости тушения kqobs для Trp (3.5×109 M-1с-1) и к небольшому уменьшению kqobs от 2.1×109 M-1с-1 до 1.9×109 M-1с-1 для Tyr. В случае N-ацетилпроизводных аминокислот наблюдается уменьшение константы скорости тушения 3TCBP с увеличением рН: с 3.4×109 M-1с-1 до 2.1×109 M-1с-1 для N-AcTrp, и с 2.7×109 M-1с-1 до 1.7×109 M-1с-1 для N-AcTyr. Такое 63 уменьшение реакционной способности триплетно-возбужденного TCBP и N-AcTyr или N-AcTrp в ряду TCBPH4>TCBPH22– может быть объяснено кулоновским взаимодействием (отталкиванием) между отрицательно заряженными реагентами при 2.9<pH<4.9 по сравнению с нейтральными реагентами при pH<2.9. В случае Trp, а также Tyr, один из реагентов в паре не имеет заряда в обоих диапазонах рН (pH<2.9 и 2.9<pH<4.9), что приводит к одинаковым или почти одинаковым значениям константы скорости тушения. В щелочных растворах для Tyr и N-AcTyr при pH>10.1, а также для His и N-Ac-His при pH>14.3, когда единственно возможным механизмом реакции тушения триплетновозбужденного ТСВР является переносом электрона, реакция тушения не наблюдается. Это говорит о вовлечении лабильного протона в реакцию тушения, которая не протекает в отсутствие лабильного протона в реагирующем остатке. Альтернативным объяснением является кулоновское взаимодействие между реагентами, которое также может замедлять скорость реакции тушения при значениях рН выше, чем рКа фенольного протона Tyr и NAcTyr, либо рКа последнего титруемого протона His и N-AcHis. Однако, настолько большое влияние кулоновского взаимодействия мы считаем маловероятным. Для всех изученных аминокислот, у которых отсутствовал заряд на аминогруппе, но присутствовал лабильный протон в реакционном центре, константы скорости реакции примерно одного порядка величины и совпадают 8 -1 -1 для ацетилированных 8 и -1 -1 неацетилированных производных аминокислот (8.0×10 M с для Trp и 7.8×10 M с для N-AcTrp; 3.0×108 M-1с-1 для His и 3.1×108 M-1с-1 для N-AcHis; 4.2×108 M-1с-1 для N-AcTyr; (4÷10)×108 M-1с-1 для Tyr, не могла быть определена с надежной точностью). Этот факт косвенно подтверждает решающую роль лабильного протона в реакционном центре в формировании радикалов в реакции тушения 3 TCBP4–. Используя только наши экспериментальные методы, мы не можем различить последовательность индивидуальных стадий в реакциях переноса электрона и протона, а также не можем определить, какой из процессов (последовательный или одновременный перенос электрона и протона) протекает. Для неацетилированных аминокислот существует также дополнительная пара реагентов, которая включает аминокислоту с положительно заряженной аминогруппой. Константы скорости тушения составляют 2.2×109 M-1с-1 для Trp, 1.5×109 M-1с-1 для Tyr, и 1.6×109 M-1с-1 для His, что в 3-5 раз выше по сравнению с соответствующими значениями для аминокислот с незаряженной аминогруппой. На наш взгляд, это может быть связано с отсутствием кулоновского отталкивания в реагирующих парах, а именно в парах с нулевым суммарным зарядом аминокислоты (с положительно заряженной аминогруппой 64 и с отрицательно заряженной карбоксильной группой, см. таблицу 2). С другой стороны, константа скорости тушения ниже, чем в случае тушения 3TCBPH22– триптофаном и тирозином, когда возможным механизмом является перенос электрона. Таким образом, предполагается, что механизм реакции тушения 3TCBP4– изученными аминокислотами – перенос электрона, связанный с переносом протона, который замедляется, если присутствует кулоновское отталкивание между реагентами. Влияние кулоновских взаимодействий также подтверждается измерениями ХПЯ. Амплитуда сигнала положительно геминальной заряженной ХПЯ аминогруппой соответствующими N-ацетилпроизводными для неацетилированных была всегда выше по аминокислот с сравнению с либо с аминокислотами с нейтральной аминогруппой. Это также связано с влиянием электростатического отталкивания, которое значительно уменьшает время жизни промежуточных радикальных пар по сравнению со случаем, когда электростатическое взаимодействие отсутствует. Теперь рассмотрим механизм реакции тушения 3TCBP гистидином с положительно заряженным имидазолилом. В кислотных растворах рН-зависимость константы скорости тушения kqobsдля гистидина отличается от зависимостей для триптофана и тирозина. В сильнокислотных растворах (pH<2.9) не наблюдается реакции тушения между 3TCBPH4 и NH3+HisH2+, а также N-AcHisH2+, тогда как для триптофана и тирозина скорость реакции максимальна. При депротонировании 3TCBPH4, kqobs для гистидина сначала возрастает и затем уменьшаемся, проходя через максимум для 3TCBPH22-. Отчетливое различие между рН-зависимостями для триптофана (тирозина) и гистидина позволяют утверждать, что в этом диапазоне рН механизмы реакции тушения триптофана (тирозина) и гистидина отличаются. В то время как триптофан (тирозин) тушит 3TCBPH4 посредством переноса электрона, отрыв электрона от NH3+HisH2+ и N-AcHisH2+ привел бы к образованию высоко нестабильного дикатион-радикала имидазолила. Из чего мы заключаем, что тушение триплетов красителя гистидином должно происходить либо по механизму переноса атома водорода, либо посредством переноса электрона, сопровождающегося переносом протона до либо после отрыва электрона от аминокислоты. Нами были найдены доказательства того, что перенос протона предшествует переносу электрона, и это позволило нам качественно объяснить все особенности рН-зависимости, полученной для процесса тушения 3 TCBP гистидином. Во-первых, было найдено, что тушение полностью протонированного 3TCBP в кислых растворах происходит с очень низкой скоростью либо вообще не происходит. Это означает, что перенос атома водорода на карбонильную группу красителя происходит неэффективно. Более того, данное наблюдение находится в 65 соответствии с концепцией механизма переноса электрона, связанного с переносом протона, так как нет свободных вакансий на красителе для переноса протона с остатка имидазолила, когда все карбоксильные группы ТСВР протонированы. Во-вторых, увеличение константы скорости тушения с увеличением рН может быть объяснено тем фактом, что с депротонированием ТСВР появляются вакансии для переноса протона на краситель. Уменьшение kqobs при депротонировании 3TCBPH22– в 3TCBP4– может быть связано с тем, что тушение 3TCBP4– происходит через механизм переноса протона, связанного с переносом электрона, как это было установлено для тирозина, триптофана и гистидина с незаряженным остатком имидазолила, и требуется дополнительный перенос протона от гистидина. Таким образом, требуется перенос одного электрона и двух протонов, что проявляется в четырехкратном снижении константы скорости тушения для His и N-AcHis когда протонированное состояние красителя изменяется с 3TCBPH22– на 3TCBP4–: 4.3×108 M-1с-1 по сравнению с 1.0×108 M-1с-1 для His, и 7.7×107 M-1с-1 по сравнению с 1.9×107 M-1с-1 для N-AcHis. Соответствующие значения для His в 5 раз выше, чем для N-AcHis. Это связано с электростатическим притяжением между реагентами в случае His. Стоит отметить, что чем меньше реакционная способность, тем сильнее влияние кулоновских взаимодействий на наблюдаемую константу скорости тушения. Депротонирование имидазольного остатка гистидина переключает механизм тушения на перенос электрона, связанный с переносом протона, и реакционная способность гистидина становится сравнимой с реакционной способностью тирозина и триптофана, как обсуждалось выше. 3.6. Заключение Изучена фотохимическая реакция между 3,3,4,4-тетракарбоксибензофеноном (ТСВР) и ароматическими аминокислотами Trp, His и Tyr. Сравнение реакционной способности свободных аминокислот Trp, His и Tyr, и их N-ацетилпроизводных N-AcTrp, N-AcHis и N-AcTyr по отношению к 3TCBP в диапазоне рН от 2 до 12 позволило определить механизм реакции тушения и выявить влияние суммарного заряда реагентов на эффективность окисления высокореакционных аминокислотных остатков. Взаимодополняющее применение лазерного импульсного фотолиза и ХПЯ с временным разрешением позволило детектировать промежуточное триплетное поглощение, а также получить информацию о короткоживущих радикальных интермедиатах на геминальной 66 стадии реакции. Были получены зависимости амплитуды геминальной ХПЯ и константы скорости тушения триплетов красителя His, Trp и Tyr, а также их N-ацетилпроизводными от рН водного раствора. Было установлено, что наличие положительного заряда аминогруппы увеличивает в 5 раз эффективность тушения триплетно-возбужденного TCBP гистидином по сравнению с N-AcHis и His с нейтральной аминогруппой. Тирозин и триптофан с положительно заряженной аминогруппой в 3 раза более реакционноспособен по сравнению с Tyr и Trp с нейтральной аминогруппой и с N-AcTyr и N-AcTrp. Комбинируя рН-зависимости, полученные методами ХПЯ и ЛИФ для гистидина и тирозина, было установлено, что перенос протона вовлечен в реакцию тушения триплетов красителя посредством переноса электрона. А именно, перенос электрона, связанный с переносом протона (proton-coupled electron transfer, РСЕТ) – механизм тушения полностью депротонированного красителя , 3TCBP4-, всеми изученными аминокислотами, тогда как 3 TCBPH22- и 3TCBPH4 реагируют с тирозином и триптофаном посредством переноса электрона. Гистидин с нейтральным имидазолилом более реакционноспособен, чем гистидин с положительно заряженным имидазолилом, так как реакция с последним требует дополнительного переноса протона. Было найдено, что кулоновские взаимодействия влияют на константу скорости тушения 3TCBP. При этом эффект более выражен в случае низкой реакционной способности реагирующих частиц. Амплитуда сигнала геминальной ХПЯ также зависит от электростатических взаимодействий, которые изменяют время жизни радикальной пары несмотря на высокую полярность растворителя. Таким образом, нами был найден краситель 3,3,4,4-тетракарбоксибензофенон, перспективный с точки зрения изучения реакций радикала гистидина, т.к. именно этот триплетно-возбужденный краситель может быть потушен гистидином с той же (или сравнимой) эффективностью, что и тирозином и триптофаном, в противоположность другим известным нам красителям. Генерация радикалов гистидина необходима для изучения методом ХПЯ реакций переноса электрона в пептидах и белках на этот радикал. Знания о константах скорости реакции тушения необходимы для того, чтобы точно знать начальное соотношение радикалов тирозина, триптофана и гистидина, образовавшихся на геминальной стадии в результате реакции тушения, и, таким образом, исключить этот важный для моделирования кинетики ХПЯ параметр из варьируемых, повысив тем самым точность моделирования. 67 Глава 4. Кинетика и механизм фотоиндуцированного окисления дипептида триптофил-триптофан (Trp-Trp) триплетновозбужденным 2,2'-дипиридилом (DP) При исследовании методом ХПЯ фотоиндуцированных реакций дипептидов, содержащих тирозин и триптофан [8, 141, 142] было обнаружено, что реакционная способность остатков в дипептидах отличается от таковой для свободных аминокислот [42, 43, 143]. Кроме того, на реакционную способность остатков влияет порядок соединения аминокислот в пептидной цепи и наличие/отсутствие заряда на концевой аминогруппе [144, 145], однако систематического исследования этого влияния не проводилось. С целью исследования влияния заряда аминогруппы на окисление дипептида, образованного из двух одинаковых ХПЯ-активных аминокислот, методом ХПЯ с временным разрешением было проведено систематическое изучение кинетики и механизма фотоиндуцированных реакций с участием дипептида триптофил-триптофан (Trp-Trp) в водных растворах в широком диапазоне значений рН. Химические структуры дипептида Trp-Trp и 2,2'-дипиридила представлены на рисунке 26. Trp-Trp DP Рисунок 26. Структурные формулы дипептида триптофил-триптофан (Trp-Trp) и красителя 2,2'дипиридила (DP), участвующих в фотореакциях. 4.1. Определение рКа дипептида Trp-Trp Поскольку значения pKa для дипептида Trp-Trp может отличаться от pKa индивидуального триптофана, для определения значений pKa в дипептиде нами были получены спектры 1H ЯМР Trp-Trp при различных значениях рН водных растворов. Для определения констант кислотности мы использовали зависимости химических cдвигов протонов дипептидов от рН водных растворов, которые зависят от протонированного 68 состояния молекул. На рисункe 27 показаны зависимости хим. сдвигов -протонов TrpTrp (рисунок 27) от рН (кривые титрования). Рисунок 27. Зависимости химических сдвигов -C и -N протонов дипептида триптофилтриптофан от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнения (16). Хим. сдвиги α-протонов обоих остатков дипептида Trp-Trp не перекрываются и сильно зависят от рН. К состоянию протонирования карбоксильной группы наиболее чувствителен α-протон С-концевого остатка дипептида, к состоянию протонирования концевой аминогруппы – α-протон N-концевого остатка дипептида. Сильная зависимость хим. сдвига от рН наблюдается для всех протонов дипептида, но для моделирования были выбраны хим. сдвиги α-протонов и Н2-протонов обоих аминокислотных остатков для дипептида Trp-Trp, сигналы которых не перекрываются с сигналами других протонов (на рисунках показаны только α-протоны). Все полученные рН-зависимости хим. сдвигов протонов были обработаны совместно по методу наименьших квадратов, что повысило точность моделирования [146, 147]. Для моделирования кривых титрования было использовано уравнение (16) (см. главу 3). При этом для дипептида Trp-Trp были получены следующие значения pKa* в D2O: pKa1*=3.5±0.1 (карбоксильная группа) и pKa2*=7.6±0.1 (аминогруппа). 4.2. Спектры ХПЯ в фотореакции дипептида Trp-Trp с DP и механизм этой реакции Исходя из полученных значений рКа*, для изучения фотоиндуцированной реакции переноса электрона между дипептидом Trp-Trp и триплетно-возбужденным дипиридилом DP были выбраны три значения рН* водных растворов: рН*=2.0, 6.6 и 9.9. При рН*=2.0 69 дипептид существует в форме катиона с положительным зарядом на атоме азота аминогруппы, при рН*=6.6 – в цвиттер-ионной форме с положительным зарядом на атоме азота аминогруппы и отрицательным зарядом на карбоксильной группе, при рН *=9.9 – в форме аниона с отрицательным зарядом на карбоксильной группе и неподеленной парой на атоме азота аминогруппы. Значение рКа протона, присоединенного к атому азота индольной группы превышает значение 14 для диамагнитной молекулы и составляет 4.3 для катион-радикала триптофана TrpН+• и 4.3÷5.4 для катион-радикала триптофана в составе пептидов [98, 148]. Рисунок 28. Вверху: 200 МГц 1H ЯМР спектры 3 мМ Trp-Trp и 0.6 мМ 2,2-дипиридила при рН*=2.0 (слева) и 3 мМ Trp-Trp и 8.3 мМ 2,2-дипиридила при рН*=9.9 (справа). Внизу: 200 МГц 1H ХПЯ спектры, полученные в фотореакциях этих растворов сразу после лазерного импульса. Тушение протонированного триплетно-возбужденного 2,2-дипиридила(TDPH+, pKa=5.8) [43] в кислых растворах и нейтрального триплетно-возбужденного 2,2дипиридила (TDP) в нейтральных и щелочных растворах триптофаном происходит по механизму переноса электрона [42]. Методами оптической регистрации промежуточного поглощения различить радикалы с радикальными центрами на C- и N-концевом остатках дипептида Trp-Trp не представляется возможным. Спектр ЯМР 1Н обладает высоким разрешением (доли герца) и позволяет различить сигналы обоих остатков дипептида. Поскольку метод 1Н ХПЯ сохраняет типичное для ЯМР-спектроскопии разрешение, из геминального спектра ХПЯ можно определить вклад каждого остатка, участвующего в тушении триплетно-возбужденного красителя. Спектры ХПЯ, полученные сразу после лазерного импульса для раствора, содержащего 3 мМ Trp-Trp и 0.6 мМ DP при pH* 2.0 и 3 мМ Trp-Trp и 8.3 мМ DP при pH* 9.9, показаны на рисунке 28 вместе с соответствующими 70 спектрами ЯМР. Сигналы в спектрах ХПЯ наблюдались для протонов, не обменивающихся с водой и имеющих ненулевые константы СТВ в промежуточных радикалах. Использование изотопно-обогащенного [D8]-2,2'-дипиридила позволило предотвратить перекрывание сигналов поляризованных протонов красителя и дипептида. При рН*=6.6 наблюдались качественно те же спектры ХПЯ, что и в кислом растворе. Различие состояло диамагнитных в изменении молекул, но для рН-зависимых радикальной химических стадии сдвигов реакции это протонов не имеет принципиального значения. Использование метода ХПЯ позволило установить механизм реакции окисления дипептида триплетно-возбужденным красителем. Хотя известна высокая реакционная способность Trp, входящего в состав пептидов и белков, было обнаружено, что степень селективности тушения триплетно-возбужденного дипиридила дипептидом Trp-Trp зависит от рН. В кислых и нейтральных растворах концевая аминогруппа дипептида заряжена, и ядерная поляризация дипептида Trp-Trp наблюдалась только для остатка триптофана на С-конце. Следовательно, в этом случае тушение путем переноса электрона происходит селективно и в реакции участвует только С-концевой остаток дипептида (см. рисунок 29). pH<pKa2: TrpH-TrpH+3DPH+ 3 pH>pKa2: TrpH-TrpH+ DP pH>4.3÷5.4: TrpH-TrpH+• kq TrpH-TrpH+•+DPH• kq kd TrpH-TrpH+•+DP–• TrpH+•-TrpH+DP–• TrpH-Trp•+H+ Рисунок 29. Схема фотоиндуцированных реакций дипептида Trp-Trp с триплетно-возбужденным 2,2-дипиридилом. Символ «Н» относится к атому водорода, связанному с азотом в индольном кольце Сили N-концевого остатка дипептида. Протоны H2 и Н6 триптофана магнитно не эквивалентны. Однако, в большинстве случаев, например, в 200 МГц 1H ЯМР-спектре N-ацетилтриптофана и, соответственно, в 200 МГц 1H ХПЯ-спектре сигналы этих протонов перекрываются. В 200 МГц 1H ЯМРспектре дипептида Trp-Trp сигналы протонов Н2 и Н6 С-концевого остатка не перекрываются между собой, но перекрываются с сигналами протонов Н6 и Н5 Nконцевого остатка. Спектры ХПЯ, полученные при рН водных растворов ниже рКа Nконцевой аминогруппы, не содержат сигналов N-концевого остатка, следовательно сигналы протонов Н2 и Н6 могут быть проинтегрированы независимо друг от друга. В спектрах ХПЯ присутствуют сигналы только исходных дипептида и красителя, что указывает на высокую степень обратимости фотоиндуцированной реакции переноса 71 электрона. Во всех спектрах, полученных во временном интервале от 0 до 100 мкс, поляризованными оставались только сигналы H2, H4, H6 и β-CH2 С-концевого остатка дипептида. Таким образом, можно сделать вывод, что при данных условиях не происходит внутримолекулярного переноса электрона (ВПЭ) между триптофановыми остатками дипептида, и спиновая плотность на радикальной стадии реакции остается только на Сконцевом остатке. При рН выше pKa концевой аминогруппы дипептида Trp-Trp геминальная ядерная поляризация наблюдалась как для N-, так и для С-концевого остатков дипептида (см. рисунок 28). В этом случае оба остатка дипептида участвуют в тушении триплетновозбужденного дипиридила и образуется два типа катион-радикалов дипептида с радикальными центрами на С- или N-концевых остатках Trp-Trp. Сигналы протонов H4-N и H6-N, H2-N и H6-C перекрываются и не могут быть разделены в спектре ХПЯ при этом рН. Однако соотношение сигналов не меняется со временем, и, следовательно, в этих условиях также не происходит внутримолекулярный перенос электрона между триптофановыми остатками. 4.3. Кинетика ХПЯ в фотореакции дипептида Trp-Trp с DP Кинетики ХПЯ дипептида Trp-Trp, зарегистрированные при рН*=2.0, 6.7 и 9.9, показаны на рисунках 30, 31 и 32, соответственно. Нормировочные коэффициенты подбирались таким образом, чтобы начальное значение ХПЯ в рассчитанной кривой было равным единице. Точки на графиках соответствуют абсолютным значениям интенсивностей сигналов, т.е. знаки поляризации не показаны. В кислых растворах наблюдается быстрый спад сигналов ХПЯ (см. рисунок 30), и кинетика ХПЯ на протонах Trp-Trp определяется реакцией вырожденного электронного обмена в паре катион-радикал дипептида /диамагнитная молекула дипептида, которая ведет к переносу поляризации от катион-радикалов к диамагнитным молекулам (поляризация обозначена как «P»): kex TrpH-PTrpH+•+ TrpH-TrpH TrpH-PTrpH + TrpH-TrpH+• Радикальный центр при этом формируется только на С-концевом остатке дипептида; знак перенесенной поляризации противоположен знаку геминальной ХПЯ. Концентрация реагентов намного больше, чем концентрация радикалов, поэтому реакцию вырожденного электронного обмена можно считать необратимой реакцией псевдопервого порядка с константой скорости, пропорциональной концентрации молекул, 72 участвующих в обмене: kex kexbiC0 , где kexbi – бимолекулярнаяконстанта скорости электронного обмена. Рисунок 30. Кинетические данные ХПЯ для Н2 протонов С-концевого остатка Trp-Trp, полученные при фотолизе 0.6 мМ 2,2′-дипиридила с 2 мМ (черные кружки) и с 4 мМ (белые кружки) Trp-Trp и рН*=2.0. Сплошные линии получены при расчете с использованием следующих параметров: T1(H2)=25 мкс, T1(H4)=31 мкс,T1(H6)=33 мкс,T1(β-CH2)=53 мкс, γ=2.8, R0×kt=1.8×105 с-1 и kex=4×108 М-1с-1. Кинетики ХПЯ, полученные при pH*=6.7 (рисунок 31), выше, чем pKa катионрадикала дипептида, не воспроизводят кинетики, типичные для вырожденного электронного обмена, как это было получено в кислых растворах. Вместо этого, за быстрым спадом следует относительно медленный спад. Такое поведение кинетической кривой можно объяснить тем, что катион-радикал дипептида TrpH-TrpH+•, продукт фотохимической реакции, депротонирует (pKa=4.3÷5.5 [131, 149, 150]) с образованием нейтрального радикала TrpH-Trp• на микросекундной временной шкале. Возникающий нейтральный радикал не может эффективно участвовать в вырожденном электронном обмене, а вырожденный перенос атома водорода слишком медленный и не конкурирует с бимолекулярной гибелью радикалов. Таким образом, депротонирование останавливает вырожденный электронный обмен. 73 Рисунок 31. Кинетические данные ХПЯ для протонов H2 (звездочки), H6 (черные кружки) и β-CH2 (белые треугольники) протонов С-концевого остатка Trp-Trp, полученные при фотолизе 8 мM 2,2′дипиридила с 3 мМ Trp-Trp при pH*=6.7. Сплошные линии получены при расчете с использованием следующих параметров: катион-радикал Trp-Trp – T1(H2)=25 мкс, T1(H4)=31 мкс, T1(H6)=33 мкс, T1(βCH2)=53 мкс, γ=2.8; нейтральный радикал Trp-Trp – T1(H2)=51 мкс, γ (H2)=1.1, T1(H4)=38 мкс,T1(H6)=38 мкс, T1(β-CH2)=52 мкс, γ(H6, β-CH2)=2.8. R0×kt=6×105 с-1, kex=4×108 М-1с-1 и kd=6×105 с-1. Рисунок 32. Кинетические данные ХПЯ для протонов H4 (белые треугольники), H2 (белые кружки) С-концевого остатка Trp-Trp и для суммы β-CH2 протонов С- и N-концевого остатков Trp-Trp (черные кружки), полученные при фотолизе 8 мM 2,2′-дипиридила с 3 мМ Trp-Trp при pH*=9.9. Сплошные линии получены при расчете с использованием следующих параметров: T1(H2)=51 мкс, γ(H2)=1.1, T1(H4)=38 мкс,T1(β-CH2)=52 мкс, γ(H4, β-CH2)=2.8, R0×kt=2.1×105 с-1. 74 В щелочных растворах депротонирование катион-радикалов дипептида происходит настолько быстро, что вырожденный обмен электрона не влияет на кинетику ХПЯ (см. рисунок 32). В этом случае вначале наблюдается рост поляризации, за счет сформированной поляризации в бимолекулярных реакциях в объеме, а затем спад до стационарного значения, зависящего от времени релаксации ядер в радикалах. Поскольку внутримолекулярный перенос электрона не был выявлен, а вырожденный электронный обмен происходит селективно между С-концевыми остатками дипептида, кинетики ХПЯ, полученные в кислых и щелочных растворах, были рассчитаны с помощью системы дифференциальных уравнений (12)-(14) (см. Экспериментальную часть). В результате моделирования кинетики ХПЯ для дипептида Trp-Trp при рН*=2.0 было получено значение kex=(4±1)×108 М-1 с-1. Константа скорости вырожденного электронного обмена между катион-радикалом N-ацетилтриптофана и диамагнитной молекулой составляет (91)108M-1с-1[42], а для дипептида Тrр-Tyr kex=(1.81)108M-1с-1 [142]. Уменьшение константы скорости реакции электронного обмена почти в 2 раза в случае дипептида Trp-Trp по сравнению с N-AcTrp связано, по-видимому, со стерическими затруднениями. Для моделирования кинетики ХПЯ в щелочном растворе мы учли, что для нейтральных радикалов триптофана, формирующихся в результате депротонирования катион-радикалов, электронный обмен с диамагнитной быстрого молекулой дипептида не происходит. Также вследствие депротонирования катион-радикала дипептида геминальная радикальная пара и радикальные пары в объеме отличаются. Для того чтобы учесть это при моделировании кинетических данных, мы вычислили относительные интенсивности в спектре ХПЯ в соответствии с моделью Адриана [151] для двух типов триплетных радикальных пар. Первая пара содержит нейтральный радикал 2,2-дипиридила DPН• и катион-радикал дипептида, вторая пара – анион-радикал 2,2дипиридила DP–• и нейтральный радикал дипептида. В обоих радикалах дипептида электронная плотность находится исключительно на одном из остатков дипептида: либо С-концевом, либо N-концевом аминокислотном остатке. Мы использовали следующие магниторезонансные параметры: катион-радикал и нейтральный радикалы триптофана g=2.0027 [152], изотропные и анизотропные значения констант СТВ, полученные в результате расчетов DFT, приведены в таблице 4; нейтральный и анион-радикал 2,2- 75 дипиридила g=2.0030 [153], изотропные значения констант СТВ, полученные в результате расчетов DFT приведены в таблице 5. Таблица 4. Изотропные ( Аизо ) и анизотропные ( Аанизо,i ) константы СТВ катион-радикала и нейтрального радикалов триптофана, рассчитанные методом UB3LYP/EPR-II// UB3LYP/631G(d,p) c учетом растворителя (РСМ модель). TrpH+ Атом Аизо / Гс Trp Аизо / Гс A 2 анизо,i [154] A 2 анизо,i [154] H(2) -4.210 22.9 -0.53 5.82 H(1) -4.13 32.28 – – H(4) -5.043 13.62 -4.47 10.03 H(7) -0.502 1.21 -0.35 0.94 H(6) -4.12 13.58 -3.68 11.00 H(5) 1.24 1.03 0.79 0.86 H(β) 11.89 4.01 15.42 5.19 H(β) 25.44 4.88 27.87 5.7 Таблица 5. Изотропные константы СТВ катион-радикала, нейтрального радикала и анион-радикала 2,2-дипиридила, рассчитанные методом UB3LYP/EPR-II// B3LYP/631G(d) с учетом растворителя (модель РСМ). Атом Аизо /Гс DPH2+ DPH DP– N(1) 3.09 4.07 2.08 N(1) 3.09 2.26 2.08 H(1) -2.85 -6.79 – H(1) -2.85 – – H(3) -0.19 2.16 -1.94 H(3) -0.19 -2.4 -1.94 H(4) -3.6 -7.56 -0.70 H(4) -3.6 0.3 -0.70 H(5) -2.36 -1.9 -5.79 H(5) -2.36 -4.19 -5.79 H(6) -1.1 -2.12 0.99 H(6) -1.1 1.12 0.99 76 Расчеты показали, что коэффициент усиления ХПЯ для протона Н2 во второй радикальной паре в 6.5 раз ниже, чем в первой радикальной паре, в результате чего γ(Н2)=0.46. Полученное нами при моделировании значение γ(Н2)=1.1, возможно, связано с неточностью DFT-расчетов и с тем, что они проведены для свободной аминокислоты, а не для триптофана в составе пептидов. Поэтому реальное значение констант СТВ может несколько отличаться от приведенного в таблице 4. В результате моделирования кинетических кривых, зарегистрированных при рН*=9.9, определены времена релаксации протонов нейтрального радикала дипептида, которые приведены в таблице 6. Таблица 6. Времена (T1) ядерной парамагнитной релаксации протонов катион-радикала и нейтрального радикала триптофил-триптофана, полученные при моделировании кинетики ХПЯ в кислой и щелочной среде. T1/ мкс Протон TrpH-TrpH+• TrpH-Trp• TrpH+• (Nацетил) [42] H2 25±5 51±10 44 H6 33±6 н/о 44 H4 31±6 38±8 63 53±10 52±8 91 Отметим, что в нейтральном радикале существенно удлинилось время релаксации для протона H2 по сравнению с катион-радикалом, что является следствием более высокой анизотропии тензора СТВ в катион-радикале дипептида (см. таблицу 4). 4.4. Влияние реакции депротонирования короткоживущих радикалов на кинетику ХПЯ 4.4.1 Депротонирование короткоживущего катион-радикала гуанозина Влияние реакции депротонирования на кинетику ХПЯ было изучено нами на примере катион-радикала гуанозина (pKa= 3.9), образующегося при тушении триплетновозбужденного 2,2-дипиридила гуанозин-5-монофосфатом в водном растворе [117]. В кислотных растворах реакция незаряженного гуанозина G с триплетно-возбужденным 2,2-дипиридилом (G+3DPH+→G+•+DPH•) приводит к образованию катион-радикала гуанозина G+•, который вступает в реакцию вырожденного электронного обмена с 77 диамагнитными молекулами гуанозина: PG+•+G→PG+G+• («Р» отмечена поляризация). Это проявляется в быстром спаде сигнала ХПЯ (звездочки на рисунке 33). В нейтральных растворах образуется нейтральный радикал G(-H)•, кинетика которого характеризуется быстрым ростом (квадраты на рисунке 33). При промежуточных значениях рН, например при рН 5, катион-радикал гуанозина депротонирует: G+•→G(-H)•+H+. Это проявляется в кинетике ХПЯ следующим образом: сначала быстрый спад, а затем рост сигнала ХПЯ (кружки на рисунке 33). Рисунок 33. Кинетики 1H ХПЯ, полученные в фотореакции 0.5 мM DP с 3.8 мM GMP при pH* 2.9 (звездочки); c 3 мM GMP при pH* 5.0 (кружки); c 20 мM GMP при pH* 7.5 (квадраты). Сплошные линии получены при расчете с использованием следующих параметров: T1=20 мкс, kex=3×108 M-1с-1, kd=106 с-1, kp= kd/19,R0×kt=3.1×105 с-1 (для звездочек), R0×kt=2.2×105 с-1 (для кружков и квадратов). Для моделирования кинетики ХПЯ, полученной при pH*=5.0 для гуанозина, общий подход был видоизменен с учетом депротонирования катион-радикала гуанозина: RD (t ) R (t ) R0 , 1 kt R0t (26) R0 (k p k d e ( kd k p ) t , (27) R k (1 e p d ) Rn (t) 0 d . (k p k d )(1 k t R0t ) (28) (k p k d )(1 k t R0t ) ( k k ) t Уравнения (26)-(28) выражают концентрации RD радикалов красителя, R+ катион-радикала гуанозинаи Rn нейтрального радикала гуанозина, при этом kd – константа скорости реакции депротонирования, kp – константа скорости реакции протонирования, R0 – 78 начальная концентрация радикалов; kt – константа скорости бимолекулярной реакции гибели радикалов. При этом мы пренебрегли разницей между константами скорости гибели радикалов в двух типах пар. Предполагается, что формирование геминальных радикальных пар посредством тушения триплетов красителя происходит мгновенно. Уравнения, которые описывают поляризацию в двух типах радикалов гуанозина ( PR и PnR ) и в соответствующих продуктах (P+ и Pn) представлены ниже: dPR PR k t PR RD k t R RD kex C PR kd PR k p PnR , dt T1 (29) dP k t PR RD k t R RD kex C PR , dt (30) dPnR PnR R k t Pn RD k t n Rn RD k d PR k p PnR , dt T1 (31) dPn k t PnR RD k t n Rn RD , dt (32) где T1 – время ядерной парамагнитной релаксации; β – параметр, который представляет собой поляризацию, созданную в F-парах в случае триплетного предшественника β=PG/R0, где PG – геминальная поляризация при t=0, – постоянная, которая характеризует соотношение ХПЯ в геминальных парах и парах в объеме, в случае триплетного предшественника предел равен 3. Основное отличие системы уравнений (26)-(32) от системы уравнений (12)-(14) заключается в том, что поляризация катионрадикала дипептида P+ и нейтрального радикала дипептида Pn связаны между собой через член kd PR k p PnR , который описывает перенос поляризации в обратимой реакции депротонирования. Таким образом, в поляризацию продуктов, P+ + Pn, дают вклад как протонированный, так и депротонированный радикалы. Так как коэффициенты усиления ХПЯ формируются в двух типах радикальных пар, два параметра β – β+ и βn – были использованы при моделировании. Параметр n был вычислен в соответствии с моделью Адриана [151] для двух типов триплетных радикальных пар (нейтральный радикал дипиридила с катион-радикалом гуанозина и нейтральный радикал дипиридила с нейтральным радикалом гуанозина). Полученное значение параметра n составило 2.1. Также в ходе моделирования считалось, что депротонирование – это обратимый процесс. При pH*=5 и для рК*а=3.75, kp=kd×10-pKa*/10-pH*=19. Подгоночными параметрами были значения kd, R0×kt и вертикальный масштабирующий фактор. В результате моделирования была получена константa скорости kd=106 с-1, значение которой находится в соответствии 79 с оценкой, полученной исходя из значений рК*а=3.9 и kp=10×1010 M-1с-1: kd=10pKa ×kp=1.3×106 с-1. Также нами была получена кинетика ХПЯ для фотореакции 2,2-дипиридила и гуанозин-5-монофосфата в буферном растворе, а именно при добавлении 10 мМ ацетата натрия. Взаимодействие с буфером увеличивает константу скорости депротонирования пропорционально разнице между значениями pKa донора и акцептора протона. А именно, при рН*=5, 67% ацетата (рК*а=4.7) находится в форме, которая является акцептором протона. На рисунке 34 показано как изменяется кинетическая кривая при добавлении 10 мМ ацетата натрия к раствору, содержащему GMP и DP. Рисунок 34. Кинетические данные 1H ХПЯ, полученные в фотореакции 0.5 мM DP с 3.8 мM GMP при pH* 5.0 в отсутствие буфера (черные кружки) и в присутствии 10 мM ацетата натрия (белые кружки). Сплошные линии получены при расчете с использованием следующих параметров: T1=20 мкс, kex=3×108 M1 -1 с , kd=106 с-1, kb=1.5×109 M-1с-1, R0×kt=2.2×105 с-1 (для черных кружков), R0×kt=2.0×105 с-1 (для белых кружков). Для моделирования кинетической кривой, полученной в присутствии буфера, константа kd была заменена на kd+kbCb, где kb – константа скорости депротонирования катион-радикала гуанозина буфером и Cb – концентрация буфера. В результате моделирования была получена оценка константы скорости реакции депротонирования катион-радикала гуанозина ацетатом натрия: G+•+B→G(-H) •+BH+, kb=1.5×109 M-1с-1. 80 4.4.1 Депротонирование короткоживущего катион-радикала дипептида TrpTrp Для моделирования кинетики ХПЯ дипептида Trp-Trp, полученной при pH*=6.7 (рисунок 31), был использован тот же подход что и для описания депротонирования катион-радикала гуанозина. При этом реакция депротонирования считалась необратимой. Чтобы минимизировать количество подгоночных параметров при моделировании, мы использовали параметры, полученные для Trp-Trp в кислых и щелочных растворах, а именно времена ядерной парамагнитной релаксации T1, приведенные в таблице 6, параметр γ+(Н2, H4, Н6, β-CH2)=2.8, γn( H4, Н6, β-CH2)=2.8, γn(Н2)=1.1 и kex=4×108 М-1с-1. Наилучшее согласие с экспериментальными данными было получено при kd=6×105 с-1. Используя полученное значение константы скорости депротонирования и типичное значение константы скорости протонирования kр=1×1010 М-1с-1 можно оценить значение pKa катион-радикала Trp-Trp: Ка=kd/kр=5.6×10-5 М, таким образом pKa*=4.2 в D2O, т.е. pKa=4.3 в Н2О [123]. Следует отметить, что для идентификации интермедиатов (нейтральных и анион- и катион-радикалов) была использована чувствительность ХПЯ к реакции вырожденного электронного обмена между радикалом и его диамагнитным предшественником. Эта реакция не приводит к химическим изменениям, а также не сопровождается изменением оптической плотности раствора, поэтому она не может быть выявлена методами оптической регистрации. 4.5. Заключение Методом ХПЯ с временным разрешением изучена кинетика и механизм спинселективных реакций дипептида Trp-Trp в водных растворах при трех значениях рН* (2.0, 6.7 и 9.9). Выявлено пороговое влияние протонирования аминогруппы дипептида Trp-Trp на реакцию тушения триплетно-возбужденного 2,2-дипиридила: при рН растворов ниже рКа*(7.6) концевой аминогруппы только С-концевой остаток дипептида участвует в обратимой реакции переноса электрона. Установлено также, что не происходит внутримолекулярного переноса электрона с остатка триптофана на N-конце на радикал триптофана в дипептиде, однако эффективно протекает межмолекулярный вырожденный электронный обмен с константой скорости (4±1)×108 М-1с-1. При рН растворов выше рКа концевой аминогруппы оба остатка триптофана в равной степени участвуют в тушении триплетно-возбужденного дипиридила, а депротонирование образующихся катион- 81 радикалов триптофана происходит в субмикросекундном временном диапазоне. Численное моделирование кинетики ХПЯ позволило определить времена ядерной парамагнитной релаксации (Т1) протонов нейтральных и катион-радикалов, которые коррелируют с различиями в анизотропии тензора СТВ этих радикалов, рассчитанного методом DFT. 82 Глава 5. Окисление пуриновых нуклеотидов триплетновозбужденным ТСВР В главе 5 для изучения фотоокисления пуриновых оснований ДНК аденозин-5'монофосфата и гуанозин-5'-монофосфата 3,3′,4,4′-тетракарбоксибензофеноном в водных растворах совместно использованы метод лазерного импульсного фотолиза и метод ХПЯ. Измерены рН-зависимости константы скорости тушения 3ТСВР и геминальной ХПЯ в широком диапазоне рН. 5.1. Реакции тушения триплетного состояния TCBP пуриновыми нуклеотидами Сокращения GH+, G и G(–H)– использованы для обозначения катионной, нейтральной и анионной форм остатка гуанина в GMP, AH+ и A – для обозначения катионной и нейтральной форм остатков аденина в АМР или аденозине (Ado), (HPO42–) и (PO43–) – чтобы различать протонированные состояния фосфатной группы нуклеотидов. Константы кислотности реагентов, используемые для вычислений, а также рН-зависимые протонированные состояния реагирующих частиц перечислены в таблицах 7 и 8 соответственно. Для вычисления равновесных концентраций протонированных форм ТСВР мы использовали два средних значения констант кислотности: pKa1*=2.7, pKa2*=4.8 в D2O [145] и pKa1=2.9, pKa2=4.9 в H2O. 83 Таблица 7. Значения pKa, pKa* и структурные формулы реагентов Соединение 3,3,4,4тетракарбоксибензофенон Гуанозин-5'монофосфат Аденозин-5'монофосфат Обозначение Структурная формула pKa pKa* TCBP pKa1=2.9; pKa2=4.9 [145] pKa1*=2.7; pKa2*=4.8 GMP pKa1=2.4; pKa2=6.5; (a) pKa3=9.4 [76] AMP pKa1=4.0; [76] pKa2=6.5 pKa1*=3.9; pKa2*=6.5 pKa1=3.5 [155] pKa1*=3.3 (a) Аденозин Ado pKa1*=2.1; pKa2*=6.5; pKa3*=9.7 (a) Значения pKa фосфата AMP и GMP были определены с помощью титрования хим. сдвига. Поглощение GMP и AMP на длине волны 308 нм при выбранных концентрациях намного меньше, чем поглощение ТСВР. Поэтому при облучении раствора, содержащего ТСВР и GMP или AMP, образуется только 3ТСВР, а затем происходит реакция тушения. Для детектирования спада триплетного поглощения были выбраны две длины волны: 590 нм (pH<pKa2TCBP=4.9) и 550 нм (pH>pKa2TCBP=4.9) [91]. При этих условиях триплетновозбужденный краситель имеет максимум поглощения. Так как концентрация ТСВР была низкой (1×10−4 M) и триплет-триплетная аннигиляция пренебрежимо мала, то в отсутствии тушителя поглощение триплетно-возбужденного ТСВР спадает по кинетике первого порядка с kd=(5.5−8)×105с−1 [91, 139]. В присутствии тушителя происходит реакция между 3ТСВР и тушителем с константой скорости kobs, которая пропорциональная концентрации тушителя [Q] (рисунок 35 а); kobs=kqobs[Q], где kqobs наблюдаемая константа 84 скорости тушения. Зависимости константы скорости kqobs от рН для GMP и AMP представлены на рисунке 35 б. Первое протонированное состояние остатка гуанина в GMP характеризуется константой кислотности pKa1=2.4. Измерения были проведены при pH>2, и наблюдаемая константа скорости тушения оставалась рН-независимой до рН~3.5 в пределах экспериментальной точности. Таким образом, нам не удалось различить все возможные реагирующие пары в кислотной области (TCBPH4 и GH+; TCBPH4 и G; TCBPH22и GH+; TCBPH22 и G). Нам не удалось промоделировать рН-зависимость наблюдаемой константы скорости тушения для АМР, учитывая только значения pKa для остатка аденина; второе значение pKa фосфатной группы AMP (6.5) должно было быть принято в расчет. Для GMP не было необходимости учитывать протонированное состояние фосфатной группы в наших расчетах данных ЛИФ и ХПЯ. Таким образом, расчет рНзависимостей наблюдаемой константы скорости (kqobs) был проведен в соответствии с уравнением (33) (для GMP) и (34) (для AMP). Значения kqi, полученные в результате моделирования (сплошные линии на рисунке 35 б) приведены в таблице 8 вместе с соответствующими парами реагентов. k q obs k q1 [H ]2 [H ]2 TCBP TCBP TCBP GMP GMP GMP [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a3 K a1 [H ] [H ]2 TCBP TCBP TCBP GMP GMP GMP [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a3 GMP k q1 K a1 [H ] [H ]2 k q1 2 2 TCBP TCBP TCBP GMP GMP GMP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a3 TCBP K a1 [H ] K a1 [H ] k q1 2 TCBP TCBP TCBP GMP GMP GMP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a3 TCBP GMP K a2 K a1 [H ] k q2 2 2 TCBP TCBP TCBP GMP GMP GMP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a3 TCBP TCBP TCBP TCBP K a1 k q3 K a1 GMP GMP GMP K a2 K a1 K a3 2 , TCBP TCBP TCBP GMP GMP GMP 2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a3 (33) 85 k q obs k q1 [H ]2 [H ]2 TCBP TCBP TCBP AMP AMP AMP [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 [H ] [H ]2 k q2 2 2 TCBP TCBP TCBP AMP AMP AMP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 TCBP K a1 [H ] K a1 [H ] (34) TCBP TCBP TCBP AMP AMP AMP [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 TCBP k q3 AMP K a2 K a1 [H ] k q4 2 TCBP TCBP TCBP AMP AMP AMP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ]2 K a1 [H ] K a1 K a2 K a1 TCBP TCBP K a1 TCBP TCBP AMP AMP AMP K a2 K a1 K a2 k q5 2 2 . TCBP TCBP TCBP AMP AMP AMP [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 [H ] K a1 [H ] K a1 K a2 Рисунок 35. (a) Cпад сигнала промежуточного поглощения (λobs=550 nm) триплетов ТСВР (1×10−4M) в присутствии GMP (концентрация увеличивается снизу вверх от 0 до 6.7×10 −4 M) в водном растворе при рН=6.8. Вставка: график, полученный с помощью уравнения (3) (зависимость ШтернаФольмера). (б) Зависимости наблюдаемой константы скорости тушения для реакции триплетновозбужденного ТСВР с GMP (квадраты) и с AMP (кружки) от рН. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнений (33) и (34). 86 Таблица 8. Протонированные состояния реагентов, константы скорости тушения (kqi) триплетно-возбужденного ТСВР гуанозин-5'-монофосфатом (GMP), аденозин-5'монофосфатом (AMP) и аденозином (Ado). Тушитель pHдиапазон AMP (c) Ado kqi, M-1с-1 4.9<pH<9.4 TCBPH4 или TCBPH22–, и GH+ или G(a) TCBP4– и G pH>9.4 TCBP4– и G(–H)– 3.5×107 pH<2.9 TCBPH4 и AH+(HPO4–)(б) 1.2×109 2.9<pH<4.0 TCBPH22– и AH+(HPO4–) 1.1×109 4.0<pH<4.9 TCBPH22– и A(HPO4–)(б) 1.0×109 4.9<pH<6.5 TCBP4– и A(HPO4–) 5.0×108 pH>6.5 TCBP4– и A(PO42–)(б) 1.0×108 pH<2.9 TCBPH4 и AH+ 4.9×109 2.9<pH<3.5 TCBPH22– и AH+ 6.8×109 3.5<pH<4.9 TCBPH22– и A 4.0×109 pH>4.9 TCBP4– и A 6.0×108 pH<4.9 GMP Пара реагентов 1.3×109 2.6×108 (a) Изменение константы скорости тушения, вызванное депротонированием GH+ или TCBPH4, не превышает погрешности эксперимента. (б) Сокращение AH+(HPO4–) обозначает, что остаток аденина в АМР заряжен положительно, и фосфатная группа АМР заряжена отрицательно; в A(HPO4–) остаток аденина нейтральный, фосфат – отрицательно заряжен; A(PO42–) обозначает, что остаток аденина нейтральный, фосфатная группа полностью депротонирована, т.е. имеет заряд 2-. (c) Данные взяты из работы [91]. В кислотных растворах GMP и AMP тушат 3TCBP с kqi=1.3109 и kqi=1.2109 M-1с-1, соответственно, что близко к диффузионно-контролируемому пределу. Депротонирование TCBPH4 (pKa=2.8) и образование TCBPH22– не изменяет значительно эффективность тушения. Первое значительное снижение kqobs для реакции 3ТСВР с GMP определяется депротонированием TCBPH22– в TCBP4– (pKa=4.9). Второе изменение характеризуется депротонированием остатка гуанина (pKa=9.4). Из полученных данных ЛИФ невозможно определить механизм реакции тушения триплетно-возбужденного ТСВР пуриновыми нуклеотидами. 87 Депротонирование TCBPH4 и TCBPH22– с увеличением рН не влияет на константу скорости тушения 3 TCBP аденозин-5'-монофосфатом. В отличие от GMP депротонирование фосфата АМР (pKa=6.5) уменьшает константу скорости тушения в 5 раз. По сравнению с фотореакцией между триплетно-возбужденным ТСВР и Ado, изученной в работе [91], можно отметить, что присутствие отрицательно заряженного фосфата уменьшает константу скорости тушения kqobs в 4-6 раз во всем диапазоне рН. Несмотря на тот факт, что аденозин обычно считается менее реакционноспособным по сравнению с гуанозином, так как последний имеет более низкий редокс-потенциал [75], наши результаты показывают, что AMP легко окисляется в реакции с 3TCBP в диапазоне pH от 2 до 12. Более того реакционная способность AMP примерно в 3 выше, чем реакционная способность GMP при 4.0<pH<4.9 и при pH>9.4. 5.2. Зависимости амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора Применение метода ЭПР для изучения радикалов пуриновых оснований в водном растворе при комнатной температуре ограничено низкой концентрацией и коротким временем жизни данных радикалов. В растворах радикалы аденозина и гуанозина могут быть зарегистрированы с использованием промежуточного оптического поглощения [92, 94]. Однако при этом трудно различить катионную, нейтральную и анионную формы радикалов нуклеотидов из-за перекрывания спектров промежуточного поглощения различных протонированных форм этих радикалов. Поэтому в данной работе использовался метод ХПЯ с временным разрешением, чтобы охарактеризовать радикальные интермедиаты, формирующиеся в реакции тушения триплетно- возбужденного ТСВР пуриновыми нуклеотидами аденозин-5'-монофосфатом и гуанозин5'-монофосфатом, а также аденозином, для того чтобы подтвердить влияние протонированного состояния фосфата на константу скорости реакции тушения. Описание радикальных интермедиатов важно с точки зрения механизма реакции тушения триплетно-возбужденного ТСРВ пуриновыми нуклеотидами; механизм данной реакции не может быть определен из данных ЛИФ. Реакция тушения триплетновозбужденного ТСВР GMP или AMP (Ado) приводит к образованию спин- коррелированной радикальной пары в триплетном состоянии. Структура радикалов аденозина и гуанозина, формирующихся в реакции тушения зависит от рН водного раствора (рисунок 36). В данной работе символы G+•и A+• использованы для обозначения 88 катион-радикалов гуанозина и аденозина, соответственно, G(-H)• и A(-H)• – нейтральной формы этих радикалов, G(-2H)•– – анион-радикал гуанозина. Эти обозначения относятся только к протонированному состоянию пуринового основания и не включают протонированное состояние фосфатной группы. Рисунок 36. Структура радикалов гуанозина и аденозина при различных значениях рН водного раствора и значения рКа этих радикалов [76, 156]. Спектры ХПЯ, полученные сразу после лазерного импульса, в фотореакции ТСВР и тушителя (GMP или AMP) при различных значениях рН показаны на рисунке 37. Видно, что амплитуда и знак геминальной поляризации изменяется при варьировании рН. Знак интегральной ХПЯ, Γ, определяется с помощью правил Каптейна [113]: Γ=sgn(∆g)×sgn(A) для продуктов геминальной рекомбинации и триплетного предшественника радикальной пары. Здесь ∆g=g1-g2 – разница g-факторов радикалов в радикальной паре и А – константа СТВ для рассматриваемого протона. В спектрах ХПЯ GMP поляризован только протон Н8. Для протонов рибозы поляризации не наблюдалось. Отрицательная поляризация протона Н8 наблюдалась в кислотных и сильнощелочных растворах, положительная – в нейтральных и щелочных растворах. Последовательное изменение знака ХПЯ наблюдалось также для сигналов протонов ТСВР. Знак константы СТВ, заявленный для протона Н8 катион-, нейтрального и анион-радикалов, отрицателен [98, 132]. Значения g-фактора для радикалов гуанозина, измеренные в замороженном водном растворе при 77 К, составляют 2.0037 (катионрадикал гуанозина), 2.0034 (нейтральный радикал гуанозина), и 2.0036 (анион-радикал гуанозина) [98]. Значение g-фактора для анион-радикала ТСВР составляет 2.0035 [102]. Исходя из этого мы заключаем, что инверсия знака поляризации при изменении рН объясняется изменением знака разности g-фактора в парах радикала красителя и радикала 89 гуанозина. Знаки поляризации соответствуют катион-радикалу гуанозина G+• при pH*<4.8, нейтральному радикало гуанозина G(-H)• при 4.9<pH*<13, и анион-радикалу гуанозина G(2H)• в сильно-щелочных растворах (pH*>13) (рисунок 36). В работе [132] в качестве красителя был использован 2,2'-дипиридил (g=2.0030 для нейтрального радикала дипиридила [153]), с депротонированием катион-радикала гуанозина не происходит изменения знака разности значений g-факторов, и поэтому инверсия знака ХПЯ не наблюдалась. В литературе также упоминается дикатион-радикал гуанозина GН++•. Однако данные о значениях g-фактора и констант СТВ для этого радикала не известны. Метод ХПЯ с временным разрешением позволяет различить катион- и дикатион-радикалы гуанозина, т.к. они участвуют в реакции вырожденного электронного обмена с диамагнитными молекулами (катион гуанозина для дикатион-радикала и нейтральный гуанозин для катион-радикала), и эта реакция протекает с различной эффективностью для двух пар реагентов, GH++•/GH+ и G+•/G, что отражается в кинетике ХПЯ. При моделировании рН-зависимости ХПЯ в данной работе мы учли оба радикала GMP (катион- и дикатион-) с соответствующим значением pKa*=2.1, в противном случае невозможно было получить хорошее согласие эксперимента и моделирования рНзависимости ХПЯ для TCBP (пунктирная линия на рисунке 37). Для аденозина известно два радикала, нейтральный и катион-радикал (см. рисунок 36). Значение g-фактора для катион-радикала аденозина в замороженном водном растворе при 77 К составляет 2.0034, для нейтрального радикала аденозина – 2.0037 [97]. Катионрадикал A+• имеет отрицательные константы СТВ для протонов Н8 и Н2, нейтральный радикал A(-H)• имеет отрицательную константу СТВ для протона Н8 и положительную для протона Н2 [97, 156]. Поляризация на протоне Н8 AМР положительна (усиленная абсорбция) в кислотных растворах и отрицательная (эмиссия) в нейтральных и щелочных растворах. Соответствующее изменение знака поляризации наблюдалось для протонов ТСВР. Знак поляризации протона Н2 AMP остается положительным во всем изученном диапазоне рН. Данные наблюдения согласуются с тем, что ХПЯ возникает в реакции между радикалом красителя и катион-радикалом A+• при pH*<4.9, и между радикалом красителя и нейтральным радикалом A(-H)• при pH*>4.9. Изменение знака g, вызванное замещением катион-радикала аденозина на нейтральный радикал, приводит к инверсии знака поляризации протона Н8 АМР и протонов ТСВР, и сохранению знака поляризации протона Н2 АМР, для которого знаки константы СТВ и g изменяются одновременно. 90 Изменение знака ХПЯ для GMP и AMP в присутствии N3-карбоксиметиллюмифлавина было впервые выявлено Штобом с соавт. методом стационарной ХПЯ [156, 157]. Для объяснения данного явления авторы использовали так называемый «эффект замещения радикальной пары», а именно депротонирование катион-радикалов аденозина и гуанозина с образованием нейтральных радикалов. Из этих данных было оценено значение pKa=4 для катион-радикала AMP. На рисунках 38-40 показаны зависимости интенсивности геминальной ХПЯ ТСВР и тушителей GMP (рисунок 38), AMP (рисунок 39) и Ado (рисунок 40). Вертикальное масштабирование было выбрано таким образом, чтобы значение сигнала ХПЯ для протона Н6 ТСВР в каждой вычисленной кривой было равно единице. Полученные рНзависимости были описаны с использованием уравнения (11), при этом значения pi×qi являлись подгоночными параметрами. Результат моделирования pH*-зависимостей геминальной представлен в таблице 9. При этом точки перегиба кривых титрования ХПЯ для изученных пуриновых производных коррелируют со значениями pKa протонированных состояний тушителя и красителя и с рН-зависимостями наблюдаемой константы скорости тушения kqobs. Рисунок 37. 200 MГц 1H геминальные спектры ХПЯ, полученные в фотореакциях в D 2O 2 мM TCBP и (слева) 10.0 мM GMP; (справа) 20.0 мM AMP. Относительные интенсивности в спектрах, показанные в каждом столбце, соответствуют тем, что наблюдались в эксперименте. Масштабирование левого и правого столбцов независимо. 91 Рисунок 38. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ для Н8 GMP (черные квадраты) и Н6 ТСВР (звездочки) от рН* водного раствора. Рисунок 39. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ для Н8 АMP (черные кружки), Н2 АMP (белые кружки), и Н6 ТСВР (звездочки) от рН* водного раствора. 92 Рисунок 40. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ для Н8 Аdo (черные треугольники), Н2 Аdo (белые треугольники), и Н6 ТСВР (звездочки) от рН* водного раствора. рН-зависимость интенсивности геминальной ХПЯ, полученная в фотореакции триплетно-возбужденного TCBP с GMP (см. рисунок 38) имеет следующие основные особенности: минимум сигнала ХПЯ (максимум абсолютного значения) для протона Н8 GMP наблюдается в кислотных растворах; отрицательная поляризация на Н8 GMP увеличивается с уменьшением кислотности до тех пор, пока при pH*>4 не наблюдается сигнал усиленной абсорбции; депротонирование фосфатной группы (pKa=6.5) GMP не влияет на поведение кривой титрования; уменьшение сигнала ХПЯ в щелочных растворах связано с депротонированием остатка гуанозина (pKa*=9.7). Уменьшение сигнала ХПЯ для GMP и TCBP при pH*>13 и смена знака при pH*=13.2 связано с формированием анионрадикала гуанозина. В случае АМР максимум сигнала ХПЯ также наблюдается в кислотных растворах (см. рисунок 39). Положительная поляризация протона H8 AMP уменьшается с уменьшением кислотности, до тех пор, пока при pH*>4 не начинает наблюдаться эмиссия. Максимум эмиссионного сигнала H8 AMP достигается в pH*=5.5, выше этого значения рН наблюдается уменьшение сигнала ХПЯ, связанное с депротонированием фосфата (pKa=6.5). В противоположность этому, интенсивность сигнала ХПЯ для протона Н2 AMP практически не изменяется до рН*=5.5 и уменьшается с депротонированием -HPO4–. Влияние протонированного состояния фосфата подтверждается отсутствием изменений в 93 интенсивности ХПЯ, полученной в фотореакции триплетно-возбужденного ТСВР и Ado (см. рисунок 40) при рН*>5.9. Таблица 9. Относительные интенсивности ХПЯ (pi×qi) для различных пар реагентов. Тушитель pH*диапазон pH*<2.1 GMP AMP Ado Радикал нуклеотида H8 TCBPH4 и GH+ GH++• -0.54 n/a 0.74 -0.23 1.67 -0.08 0.24 0.38 -0.23 0.28 -0.19 G(-2H)• -2.00 1.41 A+•(HPO4–) 0.80 2.1<pH*<2.7 TCBPH4 и G 2.7<pH*<4.8 TCBPH22– и G +• GH G(-H) 4.8<pH*<9.7 TCBP4– и G 9.7<pH*<13(a) TCBP4– и G(–H)– pH*>13 TCBP4– и G(–H)– 2– pH*<3.9 TCBPH4 или TCBPH2 и AH+(HPO4–) 3.9<pH*<4.8 TCBPH22– и A(HPO4–) 4.8<pH*<6.5 TCBP4– и A(HPO4–) pH*>6.5 TCBP4– и A(PO42–) • 3.3<pH*<4.8 pH*>4.8 TCBP4– и A H2 0.31 H6 (TCBP) -0.83 -0.90 0.32 1.37 -0.73 0.23 1.02 A(-H)•(PO42–) -0.22 0.08 0.20 A+• -0.23 A(-H)•(HPO4–) TCBPH4 или TCBPH22– и AH+ TCBPH22– и A pH*<3.3 pi×qi Пара реагентов A(-H)• 0.24 0.11 -1.11 0.28 0.61 -0.95 0.13 0.68 (a) При рН>13 образуется анион-радикал гуанозина, G(-2H)•– в результате взаимодействия нейтрального радикала G(-H)•с гидроксил-ионом OH–, который ускоряет депротонирование нейтрального радикала гуанозина. 5.3. Механизмы реакций Теперь рассмотрим механизм реакции, который следует из данных, полученных методом ХПЯ. Знак поляризации, возникающей в фотореакции катиона аденозина AH+(HPO4–) при pH*<3.9 соответствует ХПЯ, сформированной в радикальной паре радикала красителя и катион-радикала аденозина A+•(HPO4–). Данный радикал может быть образован через перенос атома водорода от AMP, перенос электрона, связанный с переносом протона (PCET), либо через перенос электрона с последующим депротонированием дикатион-радикала аденозина. Перенос атома водорода исключается из-за высокого значения константы скорости тушения 1.2×109 M-1с-1, нетипичного для этого типа реакций. Дикатион-радикал аденозина, который является возможным 94 продуктом реакции переноса электрона от катиона аденозина, не упоминается в литературе, и поэтому, вероятно, имеет очень низкое значение pKa, что приводит к его быстрому депротонированию с образованием катион-радикала аденозина, который и вносит вклад в наблюдаемый сигнал ХПЯ. Катион-радикал аденозина может быть также образован посредством переноса электрона, связанного с переносом протона. Таким образом, мы не можем различить перенос электрона и перенос электрона, связанный с переносом протона в качестве возможного механизма тушения триплетно-возбужденного ТСВР катионом аденозина. В случае, когда тушителем является нейтральный аденозин (pH>4), перенос электрона приводит к образованию катион-радикала аденозина с pKa=4.0. Известно, что радикалы с аналогичным значением pKa имеют время жизни порядка 1 мкс [117, 131], что достаточно для формирования геминальной ХПЯ в первичном радикале до депротонирования этого радикала в сопряженное основание. В случае переноса электрона, ХПЯ, наблюдаемая в наших экспериментах, должна была соответствовать таковой, возникающей в паре с катион-радикалом аденозина, без каких-либо изменений в знаке ХПЯ. Таким образом, перенос электрона исключается как механизм тушения триплетновозбужденного ТСВР нейтральным аденозином. Возможными механизмами являются перенос атома водорода или перенос электрона, связанный переносом протона, приводящие к образованию нейтрального радикала аденозина. Роль протонированного состояния фосфатной группы в изучаемой реакции тушения хотя и подтверждается измерениями ХПЯ, все еще остается неясной. В случае GMP необходимо учитывать образование дикатион- и катион-радикалов в кислотных растворах (pH*<4.8). Эти радикалы являются продуктами реакции переноса электрона от катиона гуанозина и нейтрального гуанозина, соответственно, этот механизм следует из реакций между TCBPH4 и GH+, TCBPH4 и G, и TCBPH22– и G. Реакция полностью депротонированного 3 TCBP4 с нейтральным гуанозином приводит к формированию нейтрального радикала гуанозина, что проявляется в положительной поляризации протона Н8 GMP и отрицательной поляризации протонов H2 и H6 ТСВР. Знак поляризации не изменяется при депротонировании нейтрального гуанозина с образованием аниона при pH*>9.7. Нейтральный радикал гуанозина в этом случае может быть образован только посредством переноса электрона от аниона гуанозина. Таким образом, константа скорости 3.5×107M-1с-1, измеренная нами для реакции между TCBP4– и G(–H)– соответствует тушению через перенос электрона, и это самое низкое значение 95 константы для реакции переноса электрона, когда-либо измеренное в подобных системах [8, 132]. Изменение знака ХПЯ при pH>13, соответствующее ХПЯ, возникающей в реакциях анион-радикала гуанозина, подтверждает тот факт, что анион-радикал гуанозина возникает в реакции между нейтральным радикалом гуанозина и гидроксил-ионами, а не в ходе реакции тушения: только при увеличении концентрации гидроксил-ионов выше 0.1 M, скорость реакции депротонирования радикала G(-H) (pKa=10.8) становится достаточно высокой, чтобы обеспечить образование радикала G(-2H) за время жизни триплетной спин-коррелированной радикальной пары. Таким образом, как нейтральный гуанозин, так и анион гуанозина тушат триплетное состояние красителя с образованием нейтрального радикала гуанозина. Стоит отметить, что в полученных данных было обнаружено некоторое несоответствие. А именно, несмотря на семикратное различие в реакционной способности гуанозина в нейтральной и анионной формах по отношению к 3TCBP4 (константы скорости тушения составляют 2.6×108 M-1с-1 и 3.5×107 M-1с-1), нет соответствующего различия в зарегистрированных интенсивностях ХПЯ. Значения pi×qi для пары реагентов TCBP4– и G(–H)– незначительно ниже, чем для пары TCBP4– и G, в то время как ожидалось уменьшение в несколько раз. Данное уменьшение значения pi×qi должно быть аналогично тому, которое наблюдается для АМР, когда константа скорости kqi уменьшается с 5.0×108 M-1с-1 до 1.0×108 M-1с-1. Чтобы прояснить это явное несоответствие, была измерена зависимость интенсивности ХПЯ от концентрации GMP при pH* 7.2 и 11.7. Для анализа была выбрана зависимость интенсивности ХПЯ для протона Н6 ТСВР (рисунок 41), так как при pH*>9.7 GMP в анионной форме вовлечен в реакцию вырожденного обмена электрона с нейтральным радикалом GMP, что приводит к уменьшению интенсивности ХПЯ, регистрируемой сразу после лазерного импульса для протона Н8 GMP. 96 Рисунок 41. Зависимости интенсивности геминальной ХПЯ для Н6 ТСВР, полученные в результате фотореакции 3ТСВР и GMP, от концентрации GMP при pH*=7.2 (черные кружки), pH*=11.7 (белые кружки). Сплошные линии получены с использованием выражения (35). Зависимость интенсивности ХПЯ от концентрации GMP C описывается следующим выражением: I I C 1 kq 1 C , (35) где kq – константа скорости тушения, – собственное время жизни триплетов красителя, и I – интенсивность сигнала ХПЯ в условиях насыщения при C>>kq–1–1. Зависимости на рисунке 41 отражают разницу в интенсивностях ХПЯ (при масштабировании сохранены относительные интенсивности сигналов в спектрах ХПЯ), а также в значениях kq: при более высоком значении kq, насыщение наблюдается при более низкой концентрации C. Значения I и kq были получены при моделировании с использованием выражения (35) и =1.4 мкс для триплетно-возбужденного TCBP [140]. Рассчитанные значения kq составили 1.4×108 M-1с-1 при pH*=7.2, и 1.1×107 M-1с-1 при pH*=11.7, что, принимая во внимание двухкратное снижение константы скорости вследствие кинетического изотопного эффекта, находится в удовлетворительном согласии с данными ЛИФ. Принимая I при pH*=7.2 за единицу, при pH*=11.7 получаем I=6.8, хотя в обоих случаях, поляризация формируется в паре радикала красителя и нейтрального радикала GMP, что должно было бы привести к одинаковым значениям I. Было предложено следующее объяснение для 97 разницы в значениях I с точки зрения механизма реакции. Перенос электрона, связанный с переносом протона, который происходит за время жизни спин-коррелированной радикальной пары, изначально сформированной в триплетном состоянии. Перенос электрона приводит к образованию катион-радикала гуанозина. Его магнитно- резонансные параметры способствуют образованию синглетных радикальных пар с отрицательными ядерными проекциями для H8 GMP, и положительными ядерными проекциями для H2 и H6 TCBP. Последующий перенос протона от катион-радикала гуанозина приводит к образованию нейтрального радикала гуанозина и инверсии знака g. Соответственно, проекции ядерных спинов, которые обеспечивают быстрые триплетсинглетные переходы меняются на противоположные. Полученные знаки ХПЯ соответствуют тем, что сформированы с участием нейтрального радикала гуанозина. Однако, интенсивность ХПЯ уменьшена в меру отношения времени жизни катионрадикала гуанозина к времени жизни спин-коррелированной радикальной пары. Таким образом, детальный анализ эффектов ХПЯ, включая анализ рН-зависимости ХПЯ и концентрационной зависимости ХПЯ, позволил нам установить механизм реакции GMP с триплетно-возбужденным TCBP в широком диапазоне значений рН. 5.4. Заключение Изучено фотоокисление пуриновых нуклеотидов аденозин-5'-монофосфата и гуанозин-5'-монофосфата триплетно-возбужденным 3,3′,4,4′-тетракарбоксибензофеноном в диапазоне рН водных растворов от 2 до 12. Методом лазерного импульсного фотолиза была измерена рН-зависимость наблюдаемой константы скорости тушения и объяснена в терминах pKa реагентов. В результате моделирования рН-зависимости были определены константы скорости тушения для каждой пары реагентов. В кислотных растворах константа скорости фотоокисления максимальна: kqi=1.3109 M-1с-1 для GMP и kqi=1.2109 M-1с-1 для AMP. С увеличением рН наблюдается уменьшение константы скорости тушения. Было выявлено, что депротонирование фосфатной группы AMP уменьшает скорость реакции тушения в 5 раз, тогда как протонированное состояние фосфатной группы GMP не влияет на фотореакцию между ТСВР и GMP. Детальный анализ рН-зависимости интенсивности геминальной ХПЯ показал, что механизм реакции между 3ТСВР и GMP или AMP зависит от протонированного состояния реагентов. Реакция между 3TCBPH4 и GH+, 3TCBPH4 и G, 3TCBPH22– и G протекает по механизму переноса электрона. Реакция между полностью депротонированным 3TCBP4 и 98 нейтральным гуанозином протекает по механизму переноса электрона, связанного с переносом протона, с участием так называемого «эффекта последовательных радикальных пар», то есть депротонирование первоначально образованного катион-радикала гуанозина происходит за время жизни геминальной радикальной пары. Тушение триплетов красителя анионом гуанозина происходит через перенос электрона с чрезвычайно низкой константой скорости реакции равной 3.5×107 M-1с-1. При pH*>13 образуется анионрадикал гуанозина G(-2H)•– в результате взаимодействия нейтрального радикала G(-H)• с гидроксил-ионом OH–, который ускоряет депротонирование нейтрального радикала гуанозина. При pH<4 тушение 3TCBP катионом аденозина через перенос электрона либо через перенос электрона, связанный с переносом протона (PCET) приводит к образованию катион-радикала аденозина. Перенос атома водорода или PCET приводит к образованию нейтрального радикала аденозина при pH>4. 99 Основные результаты и выводы 1. Установлено, что реакция триплетно-возбужденного 3,3,4,4- тетракарбоксибензофенона с триптофаном и тирозином в кислых растворах происходит по механизму переноса электрона. Взаимодействие триплетно-возбужденного 3,3,4,4тетракарбоксибензофенона с триптофаном и тирозином в нейтральных и щелочных растворах и с гистидином во всех рассмотренных диапазонах рН происходит по механизму переноса электрона, связанного с переносом протона, который замедляется при депротонировании аминогруппы. 2. Показано, что при использовании триплетно-возбужденного 3,3,4,4- тетракарбоксибензофенона в нейтральных растворах фотогенерация радикалов гистидина, триптофана и тирозина происходит со сравнимой эффективностью. 3. Выявлено пороговое влияние протонирования аминогруппы дипептида триптофил- триптофан на реакцию тушения триплетно-возбужденного 2,2-дипиридила: при рН растворов ниже рКа концевой аминогруппы только С-концевой остаток дипептида участвует в обратимой реакции переноса электрона; при рН растворов выше рКа концевой аминогруппы оба остатка триптофана в равной степени участвуют в тушении триплетновозбужденного дипиридила. 4. Установлено, что в кислых и щелочных растворах гуанозин-5'-монофосфат реагирует с триплетно-возбужденным 3,3,4,4-тетракарбоксибензофеноном по механизму переноса электрона, в нейтральных растворах – по механизму переноса электрона, связанного с переносом протона. Депротонирование фосфатной группы аденозин-5'монофосфата уменьшает скорость реакции тушения триплетно-возбужденного 3,3,4,4тетракарбоксибензофенона в 5 раз, тогда как протонированное состояние фосфатной группы гуанозин-5'-монофосфата не влияет на скорость фотореакции. 100 Список используемых сокращений ВПЭ – внутримолекулярный перенос электрона ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИКК – интеркомбинационная конверсия ЛИФ – лазерный импульсный фотолиз РП – радикальная пара РЧ – радиочастотный (импульс) СТВ – сверхтонкое взаимодействие ХПЯ – химическая поляризация ядер ЭНДОР – электронно-ядерный двойной резонанс (от англ. ENDOR Electron-Nuclear Double Resonance) ЭПР – электронный парамагнитный резонанс ЯМР – ядерный магнитный резонанс AMP – аденозин-5'-монофосфат BP – бензофенон 4-CBP – 4-карбоксибензофенон DFT – метод функционала плотности DP – 2,2'-дипиридил FID – спад свободной индукции FMN – флавинмононуклеотид GMP – гуанозин-5'-монофосфат His, HisH – гистидин PCET – перенос электрона, связанный с переносом протона (proton-coupled electron transfer) Phe – фенилаланин TCBP – 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофенон Trp, TrpH – триптофан Tyr, TyrOH – тирозин 101 Список литературы 1. Stuart-Audette M., Blouquit Y., Faraggi M., Sicard-Roselli C., Houee-Levin C., Jolles P. Re-evaluation of intramolecular long-range electron transfer between tyrosine and tryptophan in lysozymes - Evidence for the participation of other residues // European Journal of Biochemistry. - 2003. - V. 270. - N. 17. - P. 35653571. 2. Aubert C., Vos M.H., Mathis P., Eker A.P.M., Brettel K. Intraprotein radical transfer during photoactivation of DNA photolyase // Nature (London). - 2000. - V. 405. - N. 6786. - P. 586-590. 3. Migliore A., Polizzi N.F., Therien M.J., Beratan D.N. Biochemistry and theory of proton-coupled electron transfer // Chemical Reviews (Washington, DC, United States). - 2014. - V. 114. - N. 7. - P. 3381-3465. 4. Agon V.V., Bubb W.A., Wright A., Hawkins C.L., Davies M.J. Sensitizer-mediated photooxidation of histidine residues: evidence for the formation of reactive sidechain peroxides // Free Radical Biology and Medicine. - 2006. - V. 40. - N. 4. - P. 698-710. 5. Chandran K., McCracken J., Peterson F.C., Antholine W.E., Volkman B.F., Kalyanaraman B. Oxidation of histidine residues in copper-zinc superoxide dismutase by bicarbonate-stimulated peroxidase and thiol oxidase activities: pulse EPR and NMR studies // Biochemistry. - 2010. - V. 49. - N. 50. - P. 10616-10622. 6. Giese B., Wang M., Gao J., Stoltz M., Muller P., Graber M. Electron relay race in peptides // The Journal of Organic Chemistry. - 2009. - V. 74. - N. 10. - P. 36213625. 7. Morozova O.B., Hore P.J., Sagdeev R.Z., Yurkovskaya A.V. Intramolecular electron transfer in lysozyme studied by time-resolved chemically induced dynamic nuclear polarization // Journal of Physical Chemistry B. - 2005. - V. 109. - N. 46. - P. 2197121978. 8. Morozova O.B., Yurkovskaya A.V., Tsentalovich Y.P., Forbes M.D.E., Hore P.J., Sagdeev R.Z. Time resolved CIDNP study of electron transfer reactions in proteins and model compounds // Molecular Physics. - 2002. - V. 100. - N. 8. - P. 1187-1195. 102 9. Cadet J., Mouret S., Ravanat J.L., Douki T. Photoinduced Damage to Cellular DNA: Direct and Photosensitized Reactions // Photochemistry and Photobiology. - 2012. V. 88. - N. 5. - P. 1048-1065. 10. Cadet J., Wagner J.R. DNA Base Damage by Reactive Oxygen Species, Oxidizing Agents, and UV Radiation // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. - 2013. V. 5. - N. 2. 11. Davies M.J., Truscott R.J. Photo-oxidation of proteins and its role in cataractogenesis // Journal of Photochemistry and Photobiology B. - 2001. - V. 63. - N. 1-3. - P. 114125. 12. Pattison D.I., Rahmanto A.S., Davies M.J. Photo-oxidation of proteins // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2012. - V. 11. - N. 1. - P. 38-53. 13. Afonso S.G., Enriquez de Salamanca R., Batlle A.M. The photodynamic and nonphotodynamic actions of porphyrins // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. - 1999. - V. 32. - N. 3. - P. 255-266. 14. Silvester J.A., Timmins G.S., Davies M.J. Photodynamically generated bovine serum albumin radicals: evidence for damage transfer and oxidation at cysteine and tryptophan residues // Free Radical Biology and Medicine. - 1998. - V. 24. - N. 5. P. 754-766. 15. Yanshole V.V., Snytnikova O.A., Kiryutin A.S., Yanshole L.V., Sagdeev R.Z., Tsentalovich Y.P. Metabolomics of the rat lens: a combined LC-MS and NMR study // Experimental Eye Research. - 2014. - V. 125. - - P. 71-78. 16. Bova L.M., Wood A.M., Jamie J.F., Truscott R.J. UV filter compounds in human lenses: the origin of 4-(2-amino-3-hydroxyphenyl)-4-oxobutanoic acid O-beta-Dglucoside // Investigative Ophthalmology and Visual Science. - 1999. - V. 40. - N. 13. - P. 3237-3244. 17. Korlimbinis A., Truscott R.J. Identification of 3-hydroxykynurenine bound to proteins in the human lens. A possible role in age-related nuclear cataract // Biochemistry. - 2006. - V. 45. - N. 6. - P. 1950-1960. 18. Huvaere K., Skibsted L.H. Light-induced oxidation of tryptophan and histidine. Reactivity of aromatic N-heterocycles toward triplet-excited flavins // Journal of the American Chemical Society. - 2009. - V. 131. - N. 23. - P. 8049-8060. 19. Clausen M.R., Huvaere K., Skibsted L.H., Stagsted J. Characterization of peroxides formed by riboflavin and light exposure of milk. Detection of urate hydroperoxide as 103 a novel oxidation product // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2010. - V. 58. - N. 1. - P. 481-487. 20. Phillips D. Light relief: photochemistry and medicine // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2010. - V. 9. - N. 12. - P. 1589-1596. 21. Davies M.J. Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequences // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2003. - V. 305. - N. 3. P. 761-770. 22. Davies M.J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2004. - V. 3. - N. 1. - P. 17-25. 23. Creed D. The photophysics and photochemistry of the near-UV absorbing amino acids-tryptophan and its simple derivatives // Photochemistry and Photobiology. 1984. - V. 39. - N. 4. - P. 537-562. 24. Candeias L.P., Wardman P., Mason R.P. The reaction of oxygen with radicals from oxidation of tryptophan and indole-3-acetic acid // Carcinogenesis. - 1997. - V. 67. N. 1-3. - P. 229-237. 25. Kelman D.J., DeGray J.A., Mason R.P. Reaction of myoglobin with hydrogen peroxide forms a peroxyl radical which oxidizes substrates // The Journal of Biological Chemistry. - 1994. - V. 269. - N. 10. - P. 7458-7463. 26. Nauser T., Koppenol W.H., Gebicki J.M. The kinetics of oxidation of GSH by protein radicals // Biochemical Journal. - 2005. - V. 392. - N. Pt 3. - P. 693-701. 27. Gebicki J.M., Nauser T., Domazou A., Steinmann D., Bounds P.L., Koppenol W.H. Reduction of protein radicals by GSH and ascorbate: potential biological significance // Amino Acids. - 2010. - V. 39. - N. 5. - P. 1131-1137. 28. Steinmann D., Nauser T., Beld J., Tanner M., Gunther D., Bounds P.L., Koppenol W.H. Kinetics of tyrosyl radical reduction by selenocysteine // Biochemistry. - 2008. - V. 47. - N. 36. - P. 9602-9607. 29. Domazou A.S., Koppenol W.H., Gebicki J.M. Efficient repair of protein radicals by ascorbate // Free Radical Biology and Medicine. - 2009. - V. 46. - N. 8. - P. 10491057. 30. Hoey B.M., Butler J. The repair of oxidized amino acids by antioxidants // Biochimica et Biophysica Acta. - 1984. - V. 791. - N. 2. - P. 212-218. 31. Tsentalovich Y.P., Snytnikova O.A., Sagdeev R.Z. Properties of excited states of aqueous tryptophan // Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry. 2004. - V. 162. - N. 2–3. - P. 371-379. 104 32. Gracanin M., Hawkins C.L., Pattison D.I., Davies M.J. Singlet-oxygen-mediated amino acid and protein oxidation: formation of tryptophan peroxides and decomposition products // Free Radical Biology and Medicine. - 2009. - V. 47. - N. 1. - P. 92-102. 33. Posadaz A., Biasutti A., Casale C., Sanz J., Amat-Guerri F., Garcia N.A. Rose Bengal-sensitized photooxidation of the dipeptides L-tryptophyl-L-phenylalanine, Ltryptophyl-L-tyrosine and L-tryptophyl-L-tryptophan: kinetics, mechanism and photoproducts // Photochemistry and Photobiology. - 2004. - V. 80. - - P. 132-138. 34. Ronsein G.E., de Oliveira M.C., de Medeiros M.H., Di Mascio P. Characterization of O(2) ((1)delta(g))-derived oxidation products of tryptophan: a combination of tandem mass spectrometry analyses and isotopic labeling studies // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2009. - V. 20. - N. 2. - P. 188-197. 35. Snytnikova O.A., Kopylova L.V., Chernyak E.I., Morozov S.V., Kolosova N.G., Tsentalovich Y.P. Tryptophan and kynurenine levels in lenses of Wistar and accelerated-senescence OXYS rats // Molecular Vision. - 2009. - V. 15. - - P. 27802788. 36. Sherin P.S., Grilj J., Tsentalovich Y.P., Vauthey E. Ultrafast excited-state dynamics of kynurenine, a UV filter of the human eye // Journal of Physical Chemistry B. 2009. - V. 113. - N. 14. - P. 4953-4962. 37. Sherin P.S., Tsentalovich Y.P., Snytnikova O.A., Sagdeev R.Z. Photoactivity of kynurenine-derived UV filters // Journal of Photochemistry and Photobiology BBiology. - 2008. - V. 93. - N. 3. - P. 127-132. 38. Pattison D.I., Davies M.J. Actions of ultraviolet light on cellular structures // Experientia. Supplementum. - 2006. - V. 96. - P. 131-157. 39. Bent D.V., Hayon E. Excited state chemistry of aromatic amino acids and related peptides. II. Phenylalanine // Journal of the American Chemical Society. - 1975. - V. 97. - N. 10. - P. 2606-2612. 40. Tsentalovich Y.P., Morozova O.B. Laser flash photolysis and time resolved CIDNP study of photoreaction of 2,2'-dipyridyl with N-acetyltyrosine in aqueous solutions // Journal of Photochemistry and Photobiology, A: Chemistry. - 2000. - V. 131. - N. 13. - P. 33-40. 41. Tsentalovich Y.P., Lopez J.J., Hore P.J., Sagdeev R.Z. Mechanisms of reactions of flavin mononucleotide triplet with aromatic amino acids // Spectrochimica Acta, Part 105 A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. - 2002. - V. 58A. - N. 9. - P. 20432050. 42. Tsentalovich Y.P., Morozova O.B., Yurkovskaya A.V., Hore P.J. Kinetics and mechanism of the photochemical reaction of 2,2'-dipyridyl with tryptophan in water: Time-resolved CIDNP and laser flash photolysis study // Journal of Physical Chemistry A. - 1999. - V. 103. - N. 27. - P. 5362-5368. 43. Tsentalovich Y.P., Morozova O.B., Yurkovskaya A.V., Hore P.J., Sagdeev R.Z. Time-Resolved CIDNP and Laser Flash Photolysis Study of the Photoreactions of NAcetylHistidine with 2,2'-Dipyridyl in Aqueous Solution // Journal of Physical Chemistry A. - 2000. - V. 104. - N. 30. - P. 6912-6916. 44. Lyon C.E., Lopez J.J., Cho B.-M., Hore P.J. Low field CIDNP of amino acids and proteins: characterization of transient radicals and NMR sensitivity enhancement // Molecular Physics. - 2002. - V. 100. - N. 8. - P. 1261-1269. 45. Muszkat K.A., Khait I., Hayashi K., Tamiya N. Photochemically induced nuclear polarization study of exposed tyrosines, tryptophans, and histidines in postsynaptic neurotoxins and in membranotoxins of elapid and hydrophid snake venom // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - N. 21. - P. 4913-4920. 46. Muszkat K.A., Wismontski-Knittel T. Reactivities of tyrosine, histidine, tryptophan, and methionine in radical pair formation in flavin triplet induced protein nuclear magnetic polarization // Biochemistry. - 1985. - V. 24. - N. 20. - P. 5416-5421. 47. Heelis P.F., Parsons B.J., Phillips G.O. The pH Dependence of the Reactions of Flavin Triplet States with Amino Acids. A Laser Flash Photolysis Study // Biochimica et Biophysica Acta. - 1979. - V. 587. - N. 3. - P. 455-462. 48. Sigel H., Song B., Liang G., Halbach R., Felder M., Bastian M. Acid-base and metal ion-binding properties of flavin mononucleotide (FMN2-). Is a 'dielectric' effect responsible for the increased complex stability? // Inorganica Chimica Acta. - 1995. V. 240. - N. 1-2. - P. 313-322. 49. Linnell R.H., Kaczmarczyk A. Ultraviolet spectra of N:CC:N compounds // Journal of Physical Chemistry. - 1961. - V. 65. - - P. 1196-1200. 50. Buntinx G., Poizat O., Valat P., Wintgens V., Righini R., Foggi P. Transient absorption and resonance Raman studies of the photoreduction of 2,2'-bipyridine by amines // Journal de Chimie Physique et de Physico-Chimie Biologique. - 1993. - V. 90. - N. 9. - P. 1733-1748. 106 51. Castellucci E., Angeloni L., Marconi G., Venuti E., Baraldi I. Mechanisms of deactivation of the low-lying electronic states of 2,2'-bipyridine // Journal of Physical Chemistry. - 1990. - V. 94. - N. 5. - P. 1740-1745. 52. Morozova O.B., Yurkovskaya A.V. Intramolecular Electron Transfer in the Photooxidized Peptides Tyrosine–Histidine and Histidine–Tyrosine: A TimeResolved CIDNP Study // Angewandte Chemie. - 2010. - V. 122. - N. 43. - P. 81688171. 53. Battacharyya S.N., Das P.K. Photoreduction of Benzophenone by Amino-Acids, Aminopolycarboxylic Acids and Their Metal-Complexes - a Laser-Flash-Photolysis Study // Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. - 1984. - V. 80. - P. 1107-1116. 54. Cadet J., Mouret S., Ravanat J.L., Douki T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions // Photochem Photobiol. - 2012. - V. 88. - N. 5. P. 1048-1065. 55. Kanavy H.E., Gerstenblith M.R. Ultraviolet radiation and melanoma // Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. - 2011. - V. 30. - N. 4. - P. 222-228. 56. Beukers R., Berends W. Isolation and identification of the irradiation product of thymine // Biochimica et Biophysica Acta. - 1960. - V. 41. - - P. 550-551. 57. Cadet J., Sage E., Douki T. Ultraviolet radiation-mediated damage to cellular DNA // Mutation Research. - 2005. - V. 571. - N. 1-2. - P. 3-17. 58. Johns H.E., Pearson M.L., Leblanc J.C., Helleiner C.W. The ultraviolet photochemistry of thymidil-(3'-5')-thymidine // Journal of Molecular Biology. 1964. - V. 9. - P. 503-524. 59. Varghese A.J., Wang S.Y. Thymine-thymine adduct as a photoproduct of thymine // Science. - 1968. - V. 160. - N. 3824. - P. 186-187. 60. Taylor J.S., Garrett D.S., Cohrs M.P. Solution-state structure of the Dewar pyrimidinone photoproduct of thymidylyl-(3'-5')-thymidine // Biochemistry. - 1988. V. 27. - N. 19. - P. 7206-7215. 61. Tyrrell R.M. Induction of pyrimidine dimers in bacterial DNA by 365 nm radiation // Photochemistry and Photobiology. - 1973. - V. 17. - N. 1. - P. 69-73. 62. Kvam E., Tyrrell R.M. Induction of oxidative DNA base damage in human skin cells by UV and near visible radiation // Carcinogenesis. - 1997. - V. 18. - N. 12. - P. 2379-2384. 107 63. Pflaum M., Boiteux S., Epe B. Visible light generates oxidative DNA base modifications in high excess of strand breaks in mammalian cells // Carcinogenesis. 1994. - V. 15. - N. 2. - P. 297-300. 64. Cadet J., Wagner J.R. DNA base damage by reactive oxygen species, oxidizing agents, and UV radiation // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2013. - V. 5. - N. 2. 65. Wondrak G.T., Jacobson M.K., Jacobson E.L. Endogenous UVA-photosensitizers: mediators of skin photodamage and novel targets for skin photoprotection // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2006. - V. 5. - N. 2. - P. 215-237. 66. Cuquerella M.C., Lhiaubet-Vallet V., Cadet J., Miranda M.A. Benzophenone photosensitized DNA damage // Acc Chem Res. - 2012. - V. 45. - N. 9. - P. 15581570. 67. Cuquerella C.M., Lhiaubet-Vallet V., Bosca F., Miranda M.A. Photosensitised pyrimidine dimerisation in DNA // Chemical Science. - 2011. - V. 2. - - P. 12191232. 68. Epe B. DNA damage spectra induced by photosensitization // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2012. - V. 11. - N. 1. - P. 98-106. 69. Foote C.S. Definition of type I and type II photosensitized oxidation // Photochemistry and Photobiology. - 1991. - V. 54. - N. 5. - P. 659-659. 70. Ravanat J.L., Di Mascio P., Martinez G.R., Medeiros M.H. Singlet oxygen induces oxidation of cellular DNA // The Journal of Biological Chemistry. - 2001. - V. 276. N. 8. - P. 40601-40604. 71. Ravanat J.-L., Saint-Pierre C., Di Mascio P., Martinez G.R., Medeiros M.H.G., Cadet J. Damage to Isolated DNA Mediated by Singlet Oxygen // Helvetica Chimica Acta. - 2001. - V. 84. - N. 12. - P. 3702-3709. 72. Cadet J., Ravanat J.-L., Martinez G.R., Medeiros M.H.G., Mascio P.D. Singlet Oxygen Oxidation of Isolated and Cellular DNA: Product Formation and Mechanistic Insights // Photochemistry and Photobiology. - 2006. - V. 82. - N. 5. - P. 1219-1225. 73. Sheu C., Kang P., Khan S., Foote C.S. Low-temperature photosensitized oxidation of a guanosine derivative and formation of an imidazole ring-opened product // Journal of the American Chemical Society. - 2002. - V. 124. - N. 15. - P. 3905-3913. 74. Cadet J., Douki T., Ravanat J.L., Di Mascio P. Sensitized formation of oxidatively generated damage to cellular DNA by UVA radiation // Photochemical and Photobiological Sciences. - 2009. - V. 8. - N. 7. - P. 903-911. 108 75. Steenken S., Jovanovic S.V. How Easily Oxidizable Is DNA? One-Electron Reduction Potentials of Adenosine and Guanosine Radicals in Aqueous Solution // Journal of the American Chemical Society. - 1997. - V. 119. - N. 3. - P. 617-618. 76. Steenken S. Purine bases, nucleosides, and nucleotides: aqueous solution redox chemistry and transformation reactions of their radical cations and e- and OH adducts // Chemical Reviews (Washington, DC, United States). - 1989. - V. 89. - N. 3. - P. 503-520. 77. Genereux J.C., Barton J.K. Mechanisms for DNA charge transport // Chemical Reviews (Washington, DC, United States). - 2010. - V. 110. - N. 3. - P. 1642-1662. 78. Kanvah S., Joseph J., Schuster G.B., Barnett R.N., Cleveland C.L., Landman U. Oxidation of DNA: damage to nucleobases // Accounts of Chemical Research. 2010. - V. 43. - N. 2. - P. 280-287. 79. Gniadecki R., Thorn T., Vicanova J., Petersen A., Wulf H.C. Role of mitochondria in ultraviolet-induced oxidative stress // Journal of Cellular Biochemistry. - 2001. - V. 80. - N. 2. - P. 216-222. 80. Cadet J., Delatour T., Douki T., Gasparutto D., Pouget J.P., Ravanat J.L., Sauvaigo S. Hydroxyl radicals and DNA base damage // Mutation Research. - 1999. - V. 424. N. 1-2. - P. 9-21. 81. Pogozelski W.K., Tullius T.D. Oxidative Strand Scission of Nucleic Acids: Routes Initiated by Hydrogen Abstraction from the Sugar Moiety // Chemical Reviews (Washington, DC, United States). - 1998. - V. 98. - N. 3. - P. 1089-1108. 82. Principles of Molecular Photochemistry: an introduction / Turro N.J., Ramamurthy V., Scaiano J.C. - /(University Science Books, USA), 2009. 83. CRC Handbook of Organic Photochemistry and Photobiology / Griesbeck A.G., Oelgemöller M., Ghetti F. - /(CRC Press, USA), 2012. 84. Marciniak B., Bobrowski K., Hug G.L. Quenching of Triplet-States of Aromatic Ketones by Sulfur-Containing Amino-Acids in Solution - Evidence for ElectronTransfer // Journal of Physical Chemistry. - 1993. - V. 97. - N. 46. - P. 11937-11943. 85. Steenken S., Telo J.P., Novais H.M., Candeias L.P. One-Electron-Reduction Potentials of Pyrimidine-Bases, Nucleosides, and Nucleotides in Aqueous-Solution Consequences for DNA Redox Chemistry // Journal of the American Chemical Society. - 1992. - V. 114. - N. 12. - P. 4701-4709. 109 86. Lhiaubet-Vallet V., Encinas S., Miranda M.A. Excited State Enantiodifferentiating Interactions between a Chiral Benzophenone Derivative and Nucleosides // Journal of the American Chemical Society. - 2005. - V. 127. - N. 37. - P. 12774-12775. 87. Lhiaubet-Vallet V., Belmadoui N., Climent M.J., Miranda M.A. The Long-Lived Triplet Excited State of an Elongated Ketoprofen Derivative and Its Interactions with Amino Acids and Nucleosides // The Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - V. 111. - N. 28. - P. 8277-8282. 88. Wood P.D., Redmond R.W. Triplet State Interactions between Nucleic Acid Bases in Solution at Room Temperature: Intermolecular Energy and Electron Transfer // Journal of the American Chemical Society. - 1996. - V. 118. - N. 18. - P. 4256-4263. 89. Lu C.Y., Wang W.F., Lin W.Z., Han Z.H., Yao S.D., Lin N.Y. Generation and photosensitization properties of the oxidized radical of riboflavin: a laser flash photolysis study // Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology. - 1999. V. 52. - N. 1-3. - P. 111-116. 90. Douki T., Cadet J. Modification of DNA bases by photosensitized one-electron oxidation // International Journal of Radiation Biology. - 1999. - V. 75. - N. 5. - P. 571-581. 91. Nguyen T.X., Kattnig D., Mansha A., Grampp G., Yurkovskaya A.V., Lukzen N. Kinetics of Photoinduced Electron Transfer between DNA Bases and Triplet 3,3′,4,4′-Benzophenone Tetracarboxylic Acid in Aqueous Solution of Different pH's: Proton-Coupled Electron Transfer? // Journal of Physical Chemistry A. - 2012. - V. 116. - N. 44. - P. 10668-10675. 92. Candeias L.P., Steenken S. Ionization of purine nucleosides and nucleotides and their components by 193-nm laser photolysis in aqueous solution: model studies for oxidative damage of DNA // Journal of the American Chemical Society. - 1992. - V. 114. - N. 2. - P. 699-704. 93. Candeias L.P., Wolf P., O'Neill P., Steenken S. Reaction of hydrated electrons with guanine nucleosides: fast protonation on carbon of the electron adduct // Journal of Physical Chemistry. - 1992. - V. 96. - N. 25. - P. 10302-10307. 94. Pan J., Lin W., Wang W., Han Z., Lu C., Yao S., Lin N., Zhu D. A kinetic study on the interaction of deprotonated purine radical cations with amino acids and model peptides // Biophysical Chemistry. - 2001. - V. 89. - N. 2-3. - P. 193-199. 95. Nelson W.H., Sagstuen E., Hole E.O., Close D.M. Electron spin resonance and electron nuclear double resonance study of X-irradiated deoxyadenosine: proton 110 transfer behavior of primary ionic radicals // Radiation Research. - 1998. - V. 149. N. 1. - P. 75-86. 96. Jayatilaka N., Nelson W.H. Structure of Radicals from X-irradiated Guanine Derivatives: an Experimental and Computational Study of Sodium Guanosine Dihydrate Single Crystals // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - V. 111. - N. 4. - P. 800-810. 97. Adhikary A., Kumar A., Khanduri D., Sevilla M.D. Effect of Base Stacking on the Acid-Base Properties of the Adenine Cation Radical [A.+] in Solution: ESR and DFT Studies // Journal of the American Chemical Society. - 2008. - V. 130. - N. 31. - P. 10282-10292. 98. Adhikary A., Kumar A., Becker D., Sevilla M.D. The Guanine Cation Radical: Investigation of Deprotonation States by ESR and DFT // Journal of Physical Chemistry B. - 2006. - V. 110. - N. 47. - P. 24171-24180. 99. Bachler V., Hildenbrand K. EPR-detection of the guanosyl radical cation in aqueous solution. Quantum chemically supported assignment of nitrogen and proton hyperfine couplings // Radiation Physics and Chemistry. - 1992. - V. 40. - N. 1. - P. 59-68. 100. Langman S.R., Shohoji M.C.B.L., Telo J.P., Vieira A.J.S.C., Novais H.M. EPR Spectroscopic Study of the Radical Oxidation of Hydroxypurines in Aqueous Solution: Acid-base Properties of the Derived Radicals // Journal of the Chemical Society-Perkin Transactions 2. - 1996. - V. 2. - N. 7. - P. 1461-1465. 101. Beckert D., Fessenden R.W. Time-Resolved ESR Study of Spin Exchange Processes in the Photoreduction of 9,10-Anthraquinone-1,5-disulfonate // Journal of Physical Chemistry. - 1996. - V. 100. - N. 5. - P. 1622-1629. 102. Saeuberlich J., Beckert D. Photoionization of benzophenonecarboxylic acids in twophoton process. A Fourier transform EPR study // Journal of Physical Chemistry. 1995. - V. 99. - N. 33. - P. 12520-12524. 103. Morozova O.B., Ivanov K.L., Kiryutin A.S., Sagdeev R.Z., Kochling T., Vieth H.M., Yurkovskaya A.V. Time-resolved CIDNP: an NMR way to determine the EPR parameters of elusive radicals // Physical chemistry chemical physics. - 2011. - V. 13. - N. 14. - P. 6619-6627. 104. Kaptein R., Oosterhoff L.J. Chemically induced dynamic nuclear polarization. III. Anomalous multiplets of radical coupling and disproportionation products // Chemical Physics Letters. - 1969. - V. 4. - N. 4. - P. 214-216. 111 105. Adrian F.J. Theory of anomalous electron spin resonance spectra of free radicals in solution. Role of diffusion-controlled separation and reencounter of radical pairs // Journal of Chemical Physics. - 1971. - V. 54. - N. 9. - P. 3918-3923. 106. Closs G.L. Mechanism explaining nuclear spin polarizations in radical combination reactions // Journal of the American Chemical Society. - 1969. - V. 91. - N. 16. - P. 4552-4554. 107. Yurkovskaya A., Morozova O., Gescheidt G. Structures and Reactivity of Radicals Followed by Magnetic Resonance / Encyclopedia of Radicals in Chemistry, Biology and Materials. Ed. by C. Chatgilialoglu and A. Studer // New York: John Wiley & Sons, Ltd, 2012. -P 201-232. - 2324 P. 108. Goez M. Elucidating Organic Reaction Mechanisms Using Photo-CIDNP Spectroscopy // Topics in Current Chemistry. - 2013. - V. 338. - - P. 1-32. 109. Goez M. Photo-CIDNP Spectroscopy // Annual Reports on Nmr Spectroscopy, Vol 66. - 2009. - V. 66. - - P. 77-147. 110. Mok K.H., Hore P.J. Photo-CIDNP NMR methods for studying protein folding // Methods (San Diego, CA, United States). - 2004. - V. 34. - N. 1. - P. 75-87. 111. Salikhov K.M., Molin Y.N., Sagdeev R.Z., Buchachenko A.L. Spin Polarization and Magnetic Effects in Chemical Reactions //Amsterdam: Elsevier, 1984. - 419 P. 112. Грагеров И.П., Киприанова Л.А., Левит А.Ф. Химическая поляризация ядер в исследовании механизма реакций органических соединений // Киев: Наукова думка, 1985. - 310 c. 113. Kaptein R. Simple rules for chemically induced dynamic nuclear polarization // Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. - 1971. - - N. 14. - P. 732-733. 114. Кирютин А.С., Иванов К.Л., Морозова О.Б., Юрковская А.В., Фит Х.М., Пирогов Ю.А., Сагдеев Р.З. Метод времяразрешенной химической поляризации ядер как инструмент для количественного анализа сверхтонких взаимодействий в короткоживущих радикалах // Доклады Академии наук. 2009. - Т. 428. - N. 3. - С. 342-348. 115. Morozova O.B., Kiryutin A.S., Yurkovskaya A.V. Electron Transfer between Guanosine Radicals and Amino Acids in Aqueous Solution. II. Reduction of Guanosine Radicals by Tryptophan // Journal of Physical Chemistry B. - 2008. - V. 112. - N. 9. - P. 2747-2754. 112 116. Morozova O.B., Kiryutin A.S., Sagdeev R.Z., Yurkovskaya A.V. Electron Transfer between Guanosine Radical and Amino Acids in Aqueous Solution. 1. Reduction of Guanosine Radical by Tyrosine // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - V. 111. - N. 25. - P. 7439-7448. 117. Morozova O.B., Saprygina N.N., Fedorova O.S., Yurkovskaya A.V. Deprotonation of Transient Guanosyl Cation Radical Catalyzed by Buffer in Aqueous Solution: TRCIDNP Study // Applied Magnetic Resonance. - 2011. - V. 41. - N. 2-4. - P. 239-250. 118. Ivanov K.L., Lukzen N.N., Vieth H.-M., Grosse S., Yurkovskaya A.V., Sagdeev R.Z. Investigation of the magnetic field dependence of CIDNP in multinuclear radical pairs. 1. Photoreaction of histidine and comparison of model calculation with experimental data // Molecular Physics. - 2002. - V. 100. - N. 8. - P. 1197-1208. 119. Ivanov K.L., Vieth H.-M., Miesel K., Yurkovskaya A.V., Sagdeev R.Z. Investigation of the magnetic field dependence of CIDNP in multi-nuclear radical pairs.Part II. Photoreaction of tyrosine and comparison of model calculation with experimental data // Physical chemistry chemical physics. - 2003. - V. 5. - N. 16. - P. 3470-3480. 120. Ivanov K.L., Yurkovskaya A.V., Vieth H.-M. Coherent transfer of hyperpolarization in coupled spin systems at variable magnetic field // Journal of Chemical Physics. 2008. - V. 128. - N. 15. - P. 154701-154714. 121. Кирютин А.С. (2009) Развитие и применение метода ХПЯ для изучения спинселективных реакций радикалов биологически важных молекул в водных растворах. к.х.н (Новосибирский государственный университет, Новосибирск). 122. Truong N.X. (2012) Photoinduced electron transfer reactions between 2,2'-dipyridyl, 3,3',4,4'-benzophenone tetracarboxylic acid and various DNA-bases and amino acids in aqueous solution of different pH. . Dr.techn. (TU Graz, Graz). 123. Krezel A., Bal W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O // Journal of Inorganic Biochemistry. - 2004. - V. 98. - N. 1. - P. 161-166. 124. Markley J.L., Bax A., Arata Y., Hilbers C.W., Kaptein R., Sykes B.D., Wright P.E., Wuthrich K. Recommendations for the presentation of NMR structures of proteins and nucleic acids // Journal of Biomolecular NMR. - 1998. - V. 12. - N. 1. - P. 1-23. 125. Becke A.D. Density-Functional Thermochemistry .3. The Role of Exact Exchange // Journal of Chemical Physics. - 1993. - V. 98. - N. 7. - P. 5648-5652. 126. Lee C., Yang W., Parr R.G. Development of the Colle-Salvetti correlation-energy formula into a functional of the electron density // Physical Review B: Condensed Matter. - 1988. - V. 37. - N. 2. - P. 785-789. 113 127. Tomasi J., Mennucci B., Cammi R. Quantum mechanical continuum solvation models // Chemical Reviews (Washington, DC, United States). - 2005. - V. 105. - N. 8. - P. 2999-3093. 128. M.J. Frisch G.W.T., H.B. Schlegel, G.E. Scuseria, M.A. Robb, J.R. Cheeseman, J.A. Montgomery, Jr., T. Vreven, K.N. Kudin, J.C. Burant, J.M. Millam, S.S. Iyengar, J. Tomasi, V. Barone, B. Mennucci, M. Cossi, G. Scalmani, N. Rega, G.A. Petersson, H. Nakatsuji, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, M. Klene, X. Li, J.E. Knox, H.P. Hratchian, J.B. Cross, V. Bakken, C. Adamo, J. Jaramillo, R. Gomperts, R.E. Stratmann, O. Yazyev, A.J. Austin, R. Cammi, C. Pomelli, J.W. Ochterski, P.Y. Ayala, K. Morokuma, G.A. Voth, P. Salvador, J.J. Dannenberg, V.G. Zakrzewski, S. Dapprich, A.D. Daniels, M.C. Strain, O. Farkas, D.K. Ma-lick, A.D. Rabuck, K. Raghavachari, J.B. Foresman, J.V. Ortiz, Q. Cui, A.G. Baboul, S. Clifford, J. Cioslowski, B.B. Stefanov, G. Liu, A. Liashenko, P. Piskorz, I. Komaromi, R.L. Martin, D.J. Fox, T. Keith, M.A. Al-Laham, C.Y. Peng, A. Nanayakkara, M. Challacombe, P.M.W. Gill, B. Johnson, W. Chen, M.W. Wong, C. Gonzalez, J.A. Pople (2004) Gaussian 03 (Gaussian, Inc., Wallingford CT). 129. Bansal K.M., Fessenden R.W. Pulse Radiolysis Studies of the Oxidation of Phenols by SO4- and Br2- in Aqueous Solutions // Radiation Research. - 1976. - V. 67. - N. 1. - P. 1-8. 130. Santus R., Bazin M., Aubailly M., Guermonprez R. Influence of Energy Transfer on the Photoionization of Tryptophan and Tyrosine in Basic Media // Photochemistry and Photobiology. - 1972. - V. 15. - N. 1. - P. 61-69. 131. Baugher J.F., Grossweiner L.I. Photolysis mechanism of aqueous tryptophan // Journal of Physical Chemistry. - 1977. - V. 81. - N. 14. - P. 1349-1354. 132. Yurkovskaya A.V., Snytnikova O.A., Morozova O.B., Tsentalovich Y.P., Sagdeev R.Z. Time-resolved CIDNP and laser flash photolysis study of the photoreaction between triplet 2,2'-dipyridyl and guanosine-5'-monophosphate in water // Physical chemistry chemical physics. - 2003. - V. 5. - N. 17. - P. 3653-3659. 133. Lehninger Principles of Biochemistry. Ed. by Nelson D.L., Michael C.M. // New York: Worth Publishers, 2000. - 1200 Р. 134. Vollenweider J.K., Fischer H. Absolute chemically induced nuclear polarizations and yields from geminate radical-pair reactions. A test of high-field radical-pair theories // Chemical Physics. - 1988. - V. 124. - N. 3. - P. 333-345. 114 135. Morozova O.B., Kaptein R., Yurkovskaya A.V. Reduction of Guanosyl Radical by Cysteine and Cysteine-Glycine Studied by Time-Resolved CIDNP // Journal of Physical Chemistry B. - 2012. - V. 116. - N. 28. - P. 8058–8063. 136. Weber O.A. Stability of Proton and Cu(II) Complexes of Some Tyrosine and Tryptophan Derivatives // Journal of Inorganic and Nuclear Chemistry. - 1974. - V. 36. - N. 6. - P. 1341-1347. 137. Saprygina N.N., Morozova O.B., Gritsan N.P., Fedorova O.S., Yurkovskaya A.V. 1H CIDNP study of the kinetics and the mechanism of the reversible photoinduced oxidation of tryptofyl-tryptophan dipeptide in aqueous solution // Russian Chemical Bulletin. - 2011. - V. 12. - - P. 2530-2537. 138. Evans R.F., Ghiron C.A., Volkert W.A., Kuntz R.R. Flash Photolysis of N-Acetyl-LTryptophanamide; Acid-Base Equilibrium of the Radical Transients // Chemical Physics Letters. - 1976. - V. 42. - N. 1. - P. 43-45. 139. Inbar S., Linschitz H., Cohen S.G. Nanosecond flash studies of reduction of benzophenone by aliphatic amines. Quantum yields and kinetic isotope effects // Journal of the American Chemical Society. - 1981. - V. 103. - N. 5. - P. 1048-1054. 140. Sauberlich J., Brede O., Beckert D. Investigation of Coulomb-coupled radical ion pairs of benzophenonetetracarboxylic acid and triethylamine by laser photolysis Fourier transform electron spin resonance // Acta Chemica Scandinavica. - 1997. - V. 51. - N. 5. - P. 602-609. 141. Morozova O.B., Yurkovskaya A.V., Vieth H.-M., Sagdeev R.Z. Intramolecular Electron Transfer in Tryptophan-Tyrosine Peptide in Photoinduced Reaction in Aqueous Solution // Journal of Physical Chemistry B. - 2003. - V. 107. - N. 4. - P. 1088-1096. 142. Morozova O.B., Yurkovskaya A.V., Sagdeev R.Z. Reversibility of Electron Transfer in Tryptophan-Tyrosine Peptide in Acidic Aqueous Solution Studied by TimeResolved CIDNP // Journal of Physical Chemistry B. - 2005. - V. 109. - N. 8. - P. 3668-3675. 143. Morozova O.B., Korchak S.E., Sagdeev R.Z., Yurkovskaya A.V. Time-Resolved Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization Studies of Structure and Reactivity of Methionine Radical Cations in Aqueous Solution as a Function of pH // Journal of Physical Chemistry A. - 2005. - V. 109. - N. 45. - P. 10459-10466. 115 144. Morozova O.B., Yurkovskaya A.V. Aminium cation radical of glycylglycine and its deprotonation to aminyl radical in aqueous solution // Journal of Physical Chemistry B. - 2008. - V. 112. - N. 40. - P. 12859-12862. 145. Saprygina N.N., Morozova O.B., Grampp G., Yurkovskaya A.V. Effect of Amino Group Charge on the Photooxidation Kinetics of Aromatic Amino Acids // Journal of Physical Chemistry A. - 2014. - V. 118. - N. 2. - P. 339-349. 146. Farrell D., Miranda E.S., Webb H., Georgi N., Crowley P.B., McIntosh L.P., Nielsen J.E. Titration_DB: storage and analysis of NMR-monitored protein pH titration curves // Proteins. - 2010. - V. 78. - N. 4. - P. 843-857. 147. Markley J.L. Nuclear magnetic resonance studies of trypsin inhibitors. Histidines of virgin and modified soybean trypsin inhibitor (Kunitz) // Biochemistry. - 1973. - V. 12. - N. 12. - P. 2245-2250. 148. Bobrowski K., Poznanski J., Holcman J., Wierzchowski K.L. Pulse Radiolysis Studies of Intramolecular Electron Transfer in Model Peptides and Proteins. 8. Trp[NH.bul.+] -> Tyr[O.bul.] Radical Transformation in H-Trp-(Pro)n-Tyr-OH, n = 3-5, Series of Peptides // Journal of Physical Chemistry B. - 1999. - V. 103. - N. 46. P. 10316-10324. 149. DeFelippis M.R., Faraggi M., Klapper M.H. Evidence for through-bond long-range electron transfer in peptides // Journal of the American Chemical Society. - 1990. V. 112. - N. 14. - P. 5640-5642. 150. Jovanovic S.V., Harriman A., Simic M.G. Electron-transfer reactions of tryptophan and tyrosine derivatives // Journal of Physical Chemistry. - 1986. - V. 90. - N. 9. - P. 1935-1939. 151. Adrian F.J. Role of diffusion-controlled reaction in chemically induced nuclear-spin polarization. II. General theory and comparison with experiment // Journal of Chemical Physics. - 1971. - V. 54. - N. 9. - P. 3912-3917. 152. Grosse S. (2000) CIDNP-Untersuchungen an photoinduzierten RadikalpaarReaktionen mit Feldzyklisierung im Magnetfeldbereich von 0 bis 7 Tesla. PhD degree (Freien Universitat Berlin, Berlin). 153. Grosse S., Yurkovskaya A.V., Lopez J., Vieth H.-M. Field Dependence of Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization (CIDNP) in the Photoreaction of N-AcetylHistidine with 2,2'-Dipyridyl in Aqueous Solution // Journal of Physical Chemistry A. - 2001. - V. 105. - N. 26. - P. 6311-6319. 116 154. Kiryutin A.S., Morozova O.B., Kuhn L.T., Yurkovskaya A.V., Hore P.J. 1H and 13C Hyperfine Coupling Constants of the Tryptophanyl Cation Radical in Aqueous Solution from Microsecond Time-Resolved CIDNP // Journal of Physical Chemistry B. - 2007. - V. 111. - N. 38. - P. 11221-11227. 155. Christensen J.J., Rytting J.H., Izatt R.M. Thermodynamic pK, delta H-o, delta S-o, and delta Cp-o Values for Proton Dissociation from Several Purines and their Nucleosides in Aqueous Solution // Biochemistry. - 1970. - V. 9. - N. 25. - P. 49074913. 156. Scheek R.M., Stob S., Schleich T., Alma N.C.M., Hilbers C.W., Kaptein R. PhotoCIDNP study of adenosine 5'-monophosphate. Pair-substitution effects due to cation radical deprotonation // Journal of the American Chemical Society. - 1981. - V. 103. - N. 19. - P. 5930-5932. 157. Stob S., Scheek R.M., Kaptein R. Photo-Cidnp in Guanine Nucleic-Acid Derivatives - a Mechanistic Study // Photochemistry and Photobiology. - 1989. - V. 49. - N. 6. P. 717-723.
